CN105535940A - 一种治疗多发性骨髓瘤的Vγ9Vδ2T细胞制剂的制备方法 - Google Patents

一种治疗多发性骨髓瘤的Vγ9Vδ2T细胞制剂的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种治疗多发性骨髓瘤的Vγ9Vδ2T细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：步骤1）：分离患者外周血单个核细胞；步骤2）：Vγ9Vδ2T细胞刺激及扩增培养；步骤3）：对培养到第11或12天的Vγ9Vδ2T细胞进行细胞数量、活率、无菌、内毒素、抗酸、免疫表型的检测；步骤4）：第13或14天收集Vγ9Vδ2T细胞，并加入5-15ng/ml的IL-12佐剂，即可得到Vγ9Vδ2T细胞制剂。本发明可明显提高细胞毒性和肿瘤杀伤能力，本发明用于治疗多发性骨髓瘤的药物或者生物制品中。

Description

一种治疗多发性骨髓瘤的Vγ9Vδ2T细胞制剂的制备方法
技术领域
本发明属于细胞免疫学技术领域，具体的说是一种治疗多发性骨髓瘤的Vγ9Vδ2T细胞制剂及其有效制备方法。
背景技术
今年来，随着免疫学技术的发展，研究发现非特异性免疫细胞可以有效杀伤癌细胞，并能够杀伤癌干细胞，防止癌细胞的复发和转移。γδT细胞兼具先天免疫和获得性免疫的特性，其对肿瘤细胞的特异性识别和杀伤作用，成为近些年来肿瘤免疫治疗研究的热点。目前，以γδT细胞为基础的过继性免疫治疗在临床上取得了很大的进展，γδT细胞用于肿瘤免疫治疗主要有2中策略：1、体内诱导γδT细胞的激活和增殖；2、体外激活和修饰γδT细胞，并直接回输的过继性免疫治疗。一系列的研究表明，过继性免疫治疗以及体内扩增Vγ9Vδ2T细胞都是安全的治疗方法，在肿瘤中治疗能够引起客观的临床反应。
越来越多的研究显示，γδT细胞主要通过多种途径发挥对肿瘤的细胞毒作用,但也能够分泌IL-4、IL-10、TGF-?以及抑制T细胞增殖,从而下调抗肿瘤反应。γδT细胞存在一定程度的可塑性，不同的细胞因子和γδTCR刺激，Vγ9Vδ2T细胞能够分化成不同功能的细胞，从而发挥不同的作用。
PD-1在活化和凋亡T细胞中高表达，并能够抑制T细胞的增殖及活性，损害抗肿瘤免疫反应。目前普遍认为，肿瘤细胞表面的PD-L1与T细胞上的PD-1相互作用，导致肿瘤特异性T细胞凋亡，是PD-L1介导肿瘤免疫逃逸的主要机制。
γδT细胞因其在体内数量很低，其功能的多样性（包括正向和负向的抗肿瘤作用）以及因PD-1介导的肿瘤免疫逃逸而导致γδT细胞的无能限制了其在临床上的应用推广。因此，如何提高γδT细胞增殖能力，进一步提高γδT细胞的细胞毒作用和抗肿瘤作用，是目前急需要解决的问题。
发明内容
为解决现有技术的问题和缺陷，即Vγ9Vδ2T细胞存在的下调抗肿瘤反应和PD-1介导的肿瘤免疫逃逸而导致的Vγ9Vδ2T细胞无能，本发明通过优化细胞培养方案，制备更高细胞毒作用和肿瘤杀伤能力的Vγ9Vδ2T细胞，并联合IL-12佐剂治疗多发性骨髓瘤，进一步提高Vγ9Vδ2T细胞分泌INF-γ的能力和细胞毒活性，发挥更强的肿瘤杀伤能力。
本发明的目的是提供治疗多发性骨髓瘤的一种有效的γ9Vδ2T细胞制剂。
上述治疗多发性骨髓瘤的细胞制剂，由γ9Vδ2T细胞，少量CD3+T细胞和CD56+NK细胞和IL-12佐剂，人血白蛋白以及分散介质组成。
上述细胞制剂的中免疫细胞的来源是人外周血或人脐带血的任意一种。
上述细胞制剂的终细胞浓度为109～1010cell/ml，其中γ9Vδ2T细胞占比在70%以上。
上述细胞制剂的IL-12的浓度为5-15ng/ml。
上述制剂中的人血白蛋白与分散介质的体积比在3%-10%之间。
上述制剂中的分散介质是生理盐水。
同时，本发明提供了一种制备上述治疗多发性骨髓瘤的细胞制剂的方法，包括以下步骤：
步骤一、分离患者外周血单个核细胞：采集患者外周静脉血，500g，离心7分钟，吸取血浆层，56℃灭活至少30分钟后离心备用；用生理盐水对倍稀释下层血细胞，加入含淋巴细胞分离液的离心管中，680g，离心20分钟，吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，即得到外周血单个核细胞PBMCs。
步骤二、Vγ9Vδ2T细胞刺激及扩增培养：将单个核细胞PBMCs接种于细胞培养基中，初始培养的PBMCs的密度为1-2×106cell/ml，培养基中刺激剂Mtb-Hag的浓度为5-10ug/ml，细胞因子rhIL-2的浓度为500-1500IU/ml，rhIL-12的浓度为5-20ng/ml，PD-1抗体的浓度为0.5-10ug/ml。每2天根据细胞生长情况补充新鲜扩增培养基，RPMI1640扩增培养基中含有10ng/ml的rhIL-12，0.5-10ug/ml的PD-1抗体以及500-1500IU/ml的IL-2，并控制补液后细胞的密度在1-2×106cell/ml。
步骤三、对培养到第11或12天的Vγ9Vδ2T细胞进行细胞数量、活率、无菌、内毒素、抗酸、免疫表型的检测：细胞计数仪计数细胞密度，台盼蓝染色计数细胞活率，梅里埃全自动微生物检测系统检测细菌和真菌，肺炎支原体检测试剂盒检测肺炎支原体，鲎试剂检测内毒素，抗酸染色试剂盒检测抗酸杆菌，流式细胞仪检测细胞表型（抗CD3-PerCP、抗TCRγδ-PE、抗Vδ2TCR-FITC）。
步骤四、第13或14天收集Vγ9Vδ2T细胞，并加入IL-12佐剂，即可得到Vγ9Vδ2T细胞制剂：500g，离心7分钟收集细胞，用生理盐水洗涤细胞2次，用100ml生理盐水重悬细胞，加入人血白蛋白，加入IL-12佐剂，充分混匀，即得到Vγ9Vδ2T细胞制剂。所述的细胞数量在109-1010cell，加入的人血白蛋白占生理盐水的体积比为3%-10%，加入的IL-12的浓度为5-15ng/ml。
与现有产品和技术相比，本发明具有以下优点：
（1）本发明制备方法简单，能够快速得到数量足够，毒性高的，可适用于临床的Vγ9Vδ2T细胞。
（2）本发明采用IL-12和PD-1抗体的处理，提高了INF-γ分泌能力，增强了细胞毒活性和对肿瘤细胞的杀伤能力。
（3）本发明在收集细胞前两天检测细胞密度、细胞活率、无菌、内毒素含量、抗酸染色以及细胞表型来确定最终回输的细胞的安全和质量。
（4）本发明所制备的细胞制剂为细胞悬液形式，并辅助IL-12佐剂，能够提高Vγ9Vδ2T细胞在体内的抗肿瘤作用，静脉滴注的细胞悬液能够很快到达全身，有利于对肿瘤细胞的杀伤和清除。
附图说明
附图1：从外周血分离得到的单个核细胞图片；
附图2：培养到第13天的Vγ9Vδ2T细胞图片；
附图3：培养到第11天的Vγ9Vδ2T细胞表型检测图片；
附图4：Vγ9Vδ2T细胞制剂细胞因子分泌图片；
附图5：Vγ9Vδ2T细胞制剂肿瘤杀伤能力分析。
以下通过一些实例，对上述治疗多发性骨髓瘤的细胞制剂及其制备方法做进一步的详细说明。
实例1
实例1是通过患者外周血分离单个核细胞PBMCs：
在无菌条件下用50ml注射器采集患者外周静脉血，用肝素钠抗凝。将抗凝的外周血转移到50ml离心管中，500g/分钟，离心7分钟，吸取上层血浆层，56℃灭活30分钟后900g/分钟，10分钟，上清血浆备用；用生理盐水对倍稀释下层血细胞，人淋巴细胞分离液与稀释血液按照1:2的比例加入离心管中，680g/分钟，离心20分钟，吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，转速分别为500g/分钟，410g/分钟，均离心7分钟，得到外周血单个核细胞（PBMCs）。
实例2
实例2是体外刺激并扩增培养Vγ9Vδ2T细胞：
将分离的PBMCs置于含有1-10ug/ml的Mtb-Hag、100-1500IU/ml的rhIL-2和1%-10%自体血浆的RPMI1640、GT-T551或AIM-V中，并加入5-20ng/ml的rhIL-12，0.5-10ug/ml的PD-1抗体，调整细胞密度为1-2×106cell/ml。优选的刺激剂和细胞因子的浓度分别为：5ug/ml的Mtb-Hag、500IU/ml的rhIL-2和5%自体血浆，优选的rhIL-12的浓度为10ng/ml，优选的PD-1抗体的浓度为1ng/ml，细胞的初始密度为1.5×106cell/ml，转入细胞培养板、细胞培养瓶或细胞培养袋，于37℃、5%CO2和饱和湿度的培养箱内培养，72小时后补加含有等量浓度IL-2、PD-1抗体和rhIL-12的培养基，以后根据细胞生长状态，每2-3天补加含有等量浓度IL-2、PD-1抗体和rhIL-12的培养基，并维持补液后细胞的密度为1-2×106cell/ml。
实例3
实例3是对培养的细胞进行质量检测
对培养到第11或12天的Vγ9Vδ2T细胞进行细胞数量、活率、无菌、内毒素、抗酸、免疫表型的检测：细胞计数仪计数细胞密度，台盼蓝染色计数细胞活率，梅里埃全自动微生物检测系统检测细菌和真菌，肺炎支原体检测试剂盒检测肺炎支原体，鲎试剂检测内毒素，抗酸染色试剂盒检测抗酸杆菌，流式细胞仪检测细胞表型（抗CD3-PerCP、抗TCRγδ-PE、抗Vδ2TCR-FITC）。经检测，在第11或12天，细胞的数量达到3.1×109cell（n=10），台盼蓝染色计数细胞活率为98.4（n=10）,全自动细菌分析仪检测细菌、真菌、支原体均为阴性（n=10），内毒素含量≤0.5EU/ml（n=10），抗酸杆菌检测为阴性（n=10），细胞表型检测CD3+T细胞比例为96.9%，Vγ9Vδ2T细胞比例为79.4%（n=10）。
实例4
实例4是收集获得Vγ9Vδ2T细胞制剂
第13或14天收集Vγ9Vδ2T细胞，并加入IL-12佐剂，即可得到Vγ9Vδ2T细胞制剂：500g，离心7分钟收集细胞，用生理盐水洗涤细胞2次，用100ml生理盐水重悬细胞，加入5ml人血白蛋白，加入5-15ng/ml的IL-12佐剂，充分混匀，即得到Vγ9Vδ2T细胞制剂。
实例5
实例5是体外检测Vγ9Vδ2T细胞制剂IFN-γ的分泌能力
取Vγ9Vδ2T细胞制剂，调整细胞密度为1×106cell/ml，将细胞铺于24孔板，按照下表加入相应的试剂，37℃孵育4小时。（其中“-”为不加试剂，“+”为加试剂）
分组 空白对照组 激活对照组 阻断对照组 实验组
Iomonycin（1ug/ml） - + - +
PMA 10ng/ml - + - +
BFA 5ug/ml - - + +
将细胞从24孔板转移到1.5mlEP管中，离心收集细胞，用PBS重悬，向激活对照组、阻断对照组和实验组分别加入抗CD3-PerCP、抗Vδ2TCR-FITC，室温避光孵育30分钟。向阻断对照组和实验组加入cytofix/cytoperm，4℃孵育10分钟，加入wash/perm洗涤细胞2次，将细胞重悬于100ulPBS中，加入胞内因子荧光抗体IFN-γ-PE，室温避光孵育30分钟，流式上机检测。结果显示本发明制备的Vγ9Vδ2T细胞制剂，其IFN-γ的分泌能力为41.7%（n=10）。
实例6是体外检测Vγ9Vδ2T细胞制剂的细胞毒活性
取对数期生长的K562细胞株作为靶细胞，用PBS调整细胞密度为1-2×106cell/ml，加入calcein-AM，37度培养箱避光孵育30分钟。离心，收集细胞沉淀，用PBS洗涤细胞2次，最后用含5%血清的1640培养基重悬，分别调整细胞密度为1×105cell/ml、5×104cell/ml、2.5×104cell/ml，各取100ul铺于96孔培养板中，培养24小时。取本发明制备的Vγ9Vδ2T细胞制剂（调整细胞密度为1×106cell/ml），加入96孔板培养板中，每孔加入1ml，效靶比分别为10:1，20:1，40:1，各效靶比设3个复孔，并分别设置空白对照，放置在37度培养箱中，共同培养4小时。收集细胞，用流式细胞缓冲液洗涤细胞2次，并用100ul缓冲液重悬，加入2ul的PI染色15分钟，流式上机检测细胞杀伤效率，杀伤活性计算公式为：杀伤活性（%）=PI阳性率/（calcein阳性率+PI阳性率）。结果显示本发明制备的Vγ9Vδ2T细胞对K562细胞株具有很高的杀伤活性，杀伤率平均为68.7%（n=10）。
具体实施方式
为了克服现有γδT细胞过继性免疫治疗存在的细胞毒性较低，肿瘤微环境诱导的γδT细胞无能，以及存在的负向抗肿瘤作用，使γδT细胞不能充分发挥其对肿瘤的特异性识别和杀伤能力。本实例提供了一种治疗多发性骨髓瘤的细胞制剂，该制剂适用于多发性骨髓瘤的术后肿瘤清除和杀伤以及无法手术和放化疗治疗的的多发性骨髓瘤的治疗，适用于患者症状的缓解，改善患者生活质量，延长生存期。
治疗多发性骨髓的细胞制剂，包括细胞、IL-12佐剂、人血白蛋白以及分散介质。其中涉及的细胞绝大部分为Vγ9Vδ2T细胞，另外还有少量的CD3+细胞和CD56+NK细胞。
所使用的人血白蛋白的占分散介质的比例为3%-10%之间。
所使用的IL-12佐剂的浓度为5-15ng/ml。
分散介质使用的是生理盐水。
上述治疗多发性骨髓瘤的细胞制剂的制备包括以下步骤：分离患者外周血单个核细胞；Vγ9Vδ2T细胞刺激及扩增培养；对培养到第11或12天的Vγ9Vδ2T细胞进行细胞数量、活率、无菌、内毒素、抗酸、免疫表型的检测；第13或14天收集Vγ9Vδ2T细胞，并加入IL-12佐剂，即可得到Vγ9Vδ2T细胞制剂。
步骤一、分离患者外周血单个核细胞：采集患者外周静脉血，500g，离心7分钟，吸取血浆层，56℃灭活至少30分钟后离心备用；用生理盐水对倍稀释下层血细胞，加入含淋巴细胞分离液的离心管中，680g，离心20分钟，吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，即得到外周血单个核细胞PBMCs。
步骤二、Vγ9Vδ2T细胞刺激及扩增培养：将单个核细胞PBMCs接种于细胞培养基中，初始培养的PBMCs的密度为1-2×106cell/ml，培养基中刺激剂Mtb-Hag的浓度为5-10ug/ml，细胞因子rhIL-2的浓度为500-1500IU/ml，rhIL-12的浓度为5-20ng/ml，PD-1抗体的浓度为0.5-10ug/ml。每2天根据细胞生长情况补充新鲜扩增培养基，RPMI1640扩增培养基中含有10ng/ml的rhIL-12，0.5-10ug/ml的PD-1抗体以及500-1500IU/ml的IL-2，并控制补液后细胞的密度在1-2×106cell/ml。
步骤三、对培养到第11或12天的Vγ9Vδ2T细胞进行细胞数量、活率、无菌、内毒素、抗酸、免疫表型的检测：细胞计数仪计数细胞密度，台盼蓝染色计数细胞活率，梅里埃全自动微生物检测系统检测细菌和真菌，肺炎支原体检测试剂盒检测肺炎支原体，鲎试剂检测内毒素，抗酸染色试剂盒检测抗酸杆菌，流式细胞仪检测细胞表型（抗CD3-PerCP、抗TCRγδ-PE、抗Vδ2TCR-FITC）。
步骤四、第13或14天收集Vγ9Vδ2T细胞，并加入IL-12佐剂，即可得到Vγ9Vδ2T细胞制剂：500g，离心7分钟收集细胞，用生理盐水洗涤细胞2次，用100ml生理盐水重悬细胞，加入人血白蛋白，加入IL-12佐剂，充分混匀，即得到Vγ9Vδ2T细胞制剂。所述的细胞数量在109-1010cell，加入的人血白蛋白占生理盐水的体积比为3%-10%，加入的IL-12的浓度为5-15ng/ml。

Claims (9)

1.一种治疗多发性骨髓瘤的Vγ9Vδ2T细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1）：分离患者外周血单个核细胞；
步骤2）：Vγ9Vδ2T细胞刺激及扩增培养；
步骤3）：对培养到第11或12天的Vγ9Vδ2T细胞进行细胞数量、活率、无菌、内毒素、抗酸、免疫表型的检测；
步骤4）：第13或14天收集Vγ9Vδ2T细胞，并加入5-15ng/ml的IL-12佐剂，即可得到Vγ9Vδ2T细胞制剂。
2.根据权利1所述一种治疗多发性骨髓瘤的Vγ9Vδ2T细胞制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中，具体包括以下步骤：采集患者外周静脉血，300-500g，离心5-7分钟，吸取血浆层，56℃灭活至少30分钟后离心备用；用生理盐水对倍稀释下层血细胞，加入含淋巴细胞分离液的离心管中，600-680g，离心15-20分钟，吸取白膜层，用生理盐水洗涤2-3次，即得到外周血单个核细胞PBMCs。
3.根据权利1所述一种治疗多发性骨髓瘤的Vγ9Vδ2T细胞制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中，初始培养的PBMCs的密度为1-2×106cell/ml，刺激剂Mtb-Hag的浓度为5-10ug/ml，细胞因子rhIL-2的浓度为500-1500IU/ml，rhIL-12的浓度为5-20ng/ml，PD-1抗体的浓度为0.5-10ug/ml。
4.根据权利1所述一种治疗多发性骨髓瘤的Vγ9Vδ2T细胞制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中，扩增培养的RPMI1640培养基中含有5-15ng/ml的rhIL-12，0.5-10ug/ml的PD-1抗体以及500-1500IU/ml的IL-2，并控制补液后细胞的密度在1-2×106cell/ml。
5.根据权利1所述一种治疗多发性骨髓瘤的Vγ9Vδ2T细胞制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤3）中，细胞计数仪计数细胞密度，台盼蓝染色计数细胞活率，梅里埃全自动微生物检测系统检测细菌和真菌，肺炎支原体检测试剂盒检测肺炎支原体，鲎试剂检测内毒素，抗酸染色试剂盒检测抗酸杆菌，流式细胞仪检测细胞表型。
6.根据权利1所述一种治疗多发性骨髓瘤的Vγ9Vδ2T细胞制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤4）中，具体包括以下步骤：500g，离心7分钟收集细胞，用生理盐水洗涤细胞2-3次，用生理盐水重悬细胞，加入人血白蛋白，加入5-15ng/ml的IL-12佐剂，充分混匀，即得到Vγ9Vδ2T细胞制剂。
7.根据权利6所述一种治疗多发性骨髓瘤的Vγ9Vδ2T细胞制剂的制备方法，其特征在于：所加入的白蛋白的量为3%-10%。
8.根据权利6所述一种治疗多发性骨髓瘤的Vγ9Vδ2T细胞制剂的制备方法，其特征在于：所加入的IL-12佐剂的量为5-15ng/ml。
9.根据权利6所述一种治疗多发性骨髓瘤的Vγ9Vδ2T细胞制剂的制备方法，其特征在于：收集所得到的细胞的数量为2-4×109cell，CD3+T细胞的比例在95%以上，Vγ9Vδ2T细胞的纯度在70%以上。
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CN201511027166.3A Pending CN105535940A (zh) 2015-12-31 2015-12-31 一种治疗多发性骨髓瘤的Vγ9Vδ2T细胞制剂的制备方法

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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109810945A (zh) * 2019-01-31 2019-05-28 金浩范 一种自体γδ-Τ细胞制备方法及实施该方法的试剂盒
CN112867922A (zh) * 2018-10-03 2021-05-28 国立大学法人长崎大学 免疫检查点抑制剂的效果预测方法
GB2595372B (en) * 2018-12-24 2023-11-08 Guangdong GD Kongming Biotech LLC HUMAN V(gamma)9V(delta)2T CELL PROLIFERATION CULTURE METHOD AND CULTURE MEDIUM

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Application publication date: 20160504

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