CN104928243A - 实体瘤患者自体nk细胞分离、活化扩增及活性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明技术中的NK细胞分离、培养扩增方法能够从外周血分离获得高活性的淋巴细胞群，体外经过一系列细胞因子的刺激，NK细胞（CD3-CD56+）得到纯化、活化和大量扩增，达到应用于临床治疗肿瘤的水平。本发明技术中NK细胞活性检测方法不仅能在免疫细胞和肿瘤细胞的混合细胞液中特异性地分析效应细胞对靶细胞的杀伤率，避免了效应细胞对检测结果的干扰，而且能分析早期凋亡和晚期凋亡靶细胞，其方法简便易行、灵敏度高，可以在单个细胞水平检测细胞的杀伤功能，在过继免疫细胞治疗肿瘤的临床应用前基础研究和临床应用中质控方面具有重要意义。
Description
技术领域
本发明技术主要涉及一种实体瘤患者自体外周血来源NK细胞体外分离培养、活化扩增和细胞毒活性检测方法。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK) 又称天然杀伤细胞，其抗病毒感染、抗肿瘤无MHC限制性，已作为临床细胞免疫治疗肿瘤的一个重要治疗手段。NK细胞作为机体天然免疫细胞，主要通过直接杀伤肿瘤细胞和分泌细胞因子调节其他免疫细胞两种途径杀死肿瘤细胞、病毒和清除非己细胞。Rosenberg等在应用IL-2活化的LAK细胞治疗肿瘤过程中发现：其中以CD3-CD16+细胞(natural killer cell，NK)为特征的细胞发挥抗肿瘤的主要作用，NK细胞是主要的效应细胞。从此，研究者们将肿瘤免疫细胞治疗的研究重点从LAK细胞转向NK细胞，将NK细胞作为肿瘤免疫治疗的一种重要手段。到目前为止，NK细胞治疗肿瘤已经取得了很好的临床效果，尤其是在血液肿瘤方面。同种异体NK细胞在杀伤血液病细胞的同时，可以促进造血干细胞植入、降低GVHD的发生以及增强移植物抗白血病（GVL）效应。同种异体NK细胞已成为临床移植辅助治疗的一种重要手段。
NK细胞治疗过程主要包括三个步骤：采集分离、纯化、活化扩增。目前治疗血液肿瘤所用到的NK细胞主要通过磁珠分选的方法，这种方法不适合自体NK细胞治疗实体瘤。主要原因是：①治疗血液肿瘤一般选择健康的供者，可以提取到大量的细胞，不需要体外长时间的培养扩增就已经能够达到治疗所需要的数量，可以直接将提取出的高纯度NK细胞经过检测后静脉回输给患者，采集患者自体外周血中的NK细胞比例低，并且受到自身肿瘤细胞的免疫耐受，分离以后需要经过长时间的刺激、培养、扩增的过程，达到一定数量和比例才能给患者回输；②由于在磁珠分选的过程中细胞的活性受到影响，不适合在体外长时间的培养。密度梯度离心法是利用细胞的物理特性——血液中各种细胞的密度不同分离所需要的细胞的方法，由于是物理的方法，对细胞的损伤比较小，不影响细胞活性。密度梯度离心法分离过程中的试剂目前已经由临床级别的，这种方法分离外周血中NK细胞是一种适合实体瘤患者自体NK细胞治疗的经济实用方法。
NK细胞纯化的方法主要包括物理方法和化学方法。物理方法有：Percoll不连续密度梯度离心法、两步黏附法；化学方法有：去除单核细胞、绵羊红细胞花环法、磁珠分选法、补体依赖的细胞毒法。活化和扩增过程主要是加入的不同刺激因子，通过这些刺激因子促进NK细胞的快速增殖，而降低非NK细胞增殖速度。主要刺激因子有：丝裂原、细胞因子、饲养细胞等。
Grzywacz等从脐带血提取造血干细胞，然后经过分化和诱导扩增得到大量NK细胞，虽然脐带血的来源比较丰富，但存在伦理问题。Berg等使用100Gy照射后的EB病毒转化的B淋巴母样细胞（EBV-LCL）作为饲养细胞，与PBMC中分选的NK细胞共培养培养21d后，可使NK细胞扩增（490±260）倍。Imai等使用照射过的K562-mb15-41BBL细胞株作为饲养细胞，3周后可使PBMCs中CD3-CD56+NK细胞扩增1000多倍。饲养细胞可提高NK细胞扩增效率、纯度与杀伤活性均较高，但存在安全性问题。随着生物技术的发展，现在已较少使用饲养细胞，更侧重于细胞因子的组合体外活化和扩增NK细胞。临床级磁珠分选仪随着干细胞的研究已经逐步进入了临床，其设备及其附属耗材价格昂贵。自体NK细胞首先经过临床级磁珠分选仪纯化后，需要扩增和增殖，这将增加治疗成本，临床病人难以接受。目前临床级磁珠分选仪在我国还没有得到相关部门的认证用于临床。
已知许多细胞因子单独或组合能有效地诱导、刺激NK细胞增殖和促进其分化成熟，如 IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、Flt-3L、SCF等，其中IL-2和IL-15的作用尤为明显。IL-2是一种具有多种生物学活性的细胞因子，主要由CD4+T、CD8+T细胞以及NK，LAK细胞产生，在免疫应答网络中起重要作用。IL-2能刺激NK细胞增殖，并增强NK细胞杀伤功能，是体外NK细胞扩增体系中最早也是最常用的细胞因子。
目前，国内外很多文献和专利关于NK细胞分离提取和活化扩增的方法，但是存在一些缺点，实际应用到临床上的并不多。①细胞数量：临床治疗需要的NK细胞数量大，而采集50ml患者自体外周血中NK细胞的含量比较少；②细胞纯度：需要NK细胞纯度高，而外周血中NK细胞约占淋巴细胞的5%～10%；③细胞来源：目前治疗实体瘤NK细胞的主要来源是有患者本人的外周血，治疗血液病的NK细胞可以来源于健康志愿者（患者的父母子女或兄弟姐妹）。同种异体NK细胞治疗实体瘤还处于临床试验阶段；④添加因子：在培养的过程中，不能加入动物源性和其它在细胞回输后对人体产生负作用的添加剂；⑤操作过程：繁琐的操作步骤将增加污染的几率；⑥体外培养时间：免疫细胞在体外培养时间的长或短决定了回输到体内免疫细胞的活性。如果培养时间太短，细胞还没有扩增到一定数量，如果时间太长，细胞量虽然较多，但细胞表现为复制性衰老(replicative senescence)，绝大多数细胞已经开始凋亡，不论是从细胞总数和活性还是从细胞比例都会有下降的趋势，而且将这种状态的细胞回输到体内后，绝大多数细胞会死亡，这提示我们必须选择合适的培养时间；⑦成本：如果培养过程中使用一些非常昂贵的试剂或仪器设备，超出了一般患者所能够承受的经济范围。NK细胞的体外分离和高效扩增方案成为NK细胞临床治疗中需要迫切解决的一个关键问题。
按照我国相关规定，在过继免疫细胞临床应用前和应用过程中，应检测免疫细胞的细胞毒作用。有报道指出，由于两种细胞混合在一起培养，互相之间有抑制对方生长的细胞因子的分泌，在效应细胞杀伤肿瘤细胞的同时，肿瘤细胞对效应细胞也会有抑制生长和促进凋亡的作用。目前常用检测凋亡的方法MTT法和LDH法只能从整体水平判断凋亡率，而不能从单细胞水平检测免疫细胞的细胞毒作用，并且这些方法容易受到背景信号的干扰，因此其检测结果广受质疑。51Cr释放实验一直被认为是检测NK细胞活性的标准方法，但作为放射性核元素，51Cr的应用具有一定的限制性。TUNEL法能准确地反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度高，但只能标记中晚期凋亡细胞，并受效应细胞和靶细胞自发死亡和非特异性杀伤的存在会造成很强的背景信号的影响，而且方法操作繁琐。Annexin-V/PI流式细胞分析法是目前研究免疫细胞细胞毒作用最常用的流式方法，能检测早期凋亡细胞，与51Cr释放实验结果一致。这种方法适用于一种作用因素（化疗药或其他非细胞物质）对一种靶细胞的作用研究。检测免疫细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用时，两种细胞混合在一起，效应细胞和靶细胞同时都有凋亡，流式细胞仪分析时无法区分效应细胞和靶细胞，结果中包括靶细胞和效应细胞共同的凋亡率。如果效应细胞和靶细胞的体积相差比较大时，能通过FSC/SSC圈门将两种细胞区分开；当靶细胞和效应细胞体积相当时，在所分析的靶细胞区域中混有效应细胞，最终得出的凋亡率将会受到效应细胞的影响。
荧光染料CFSE是一种可对活细胞进行荧光标记的新型染料，具有很高的荧光活性，被激发后能产生绿色荧光。近年来，CFSE作为一种安全、无放射性、无污染、细胞毒性小的细胞标记物，应用于淋巴细胞亚群的增殖、抗原特异性效应与记忆淋巴细胞的体内分布及其活化、增殖、分化，细胞毒性检测等方面。其特点主要包括：①能够轻易穿透细胞膜但自身不发荧光，进入细胞后荧光不受内环境影响，对细胞生理活动没有任何影响；②可以随细胞分裂平均到达两个子代细胞；③标记的荧光时间长达数周；④操作简单、经济实惠。
Annexin-V是一种分子量为35-36kD的Ca依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的，在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，当细胞发生凋亡的早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，Annexin-V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。放线菌素D（7-amino-actinomycin D，7-AAD）是一种广泛应用于细胞凋亡研究的染料，其可与凋亡细胞浆内的DNA 结合。
发明内容
本发明旨在克服现有的实体瘤患者自体NK细胞体外分离培养、活化扩增和细胞毒活性检测方法的不足，对NK细胞采集分离、活化扩增和细胞毒活性检测等步骤进行改进和优化。
由于实体瘤患者自身免疫细胞的功能被破坏或抑制，体外经过分离培养获得的NK细胞比例低、数量少，并且培养过程耗时长，培养所需试剂等刺激因子成本高和存在不安全因素等缺点。本发明在传统方法基础上经过改进和优化，总结出一种分离培养操作步骤简单，经济高效的方法，不仅避免了由于操作繁琐而发生污染，而且在培养过程中所需要的试剂和耗材成本低，使用该方法培养出的NK细胞扩增倍数多、纯度高和活性好，此技术方法适合应用于临床过继免疫细胞治疗肿瘤。
同时建立一种了基于流式细胞染色检测技术，三种荧光染料CFSE/Annexin-V/7-AAD联合标记，分析NK细胞的细胞毒活性。该方法避免放射性试剂，减少了同位素的污染，操作简单，结果重复性好，敏感性和特异性高。根据研究的不同要求和目的，CFSE可分别标记靶细胞和效应细胞，分析靶细胞对效应细胞的细胞毒作用和分析效应细胞对靶细胞的细胞毒作用。
本发明是采用如下技术方案实现的：
一种实体瘤患者自体NK细胞分离、活化扩增方法，包括如下步骤：
（1）、NK细胞的采集分离：
1.1、外周血采集：采集实体肿瘤患者外周血40~60ml。
1.2、NK细胞分离：
1.2a、将采集的外周血装入离心管中，离心条件：离心力500g，离心时间10min。吸出血浆装入另一只离心管中于56℃水浴锅中灭活30min后离心，离心条件：离心力850g，离心时间10min。离心后取上清装入离心管中放入4℃冰箱中备用。
1.2b、将沉淀的红细胞层与生理盐水按照1:1混合，缓慢加入装有分离液的离心管中，在移动或装入离心机时动作要轻柔，防止血细胞层与分离液层混合，离心条件：离心力700g，离心时间15min，离心温度20~25℃。将上述分离后的白膜层移至另一离心管中，再加入同等量生理盐水，洗涤两次，第一次洗涤时离心条件：离心力750g，离心时间5min；第二次洗涤时离心条件：离心力500g，离心时间5min。
（2）、NK细胞活化扩增：
2.1、取CD16mAb（克隆号：3G8）加入装有PBS的培养瓶中，使抗体终浓度为1-10ug/mL（最佳浓度为1ug/mL），将培养瓶放于4℃冰箱中，包被抗体至少三天以上，用PBS洗两遍备用。
2.2、将步骤（1）分离获得的细胞洗涤后计数，加入新鲜培养液，该新鲜培养液为临床级无血清培养基，所述临床级无血清培养基含IL-2和10%自体血浆，加入培养新鲜培养液的体积根据细胞浓度而定，细胞浓度为1×106/mL~2×106/mL；转入已包被抗体的培养瓶中并加入IFN-γ；IFN-γ浓度为100~1000U/mL，最适浓度为1000U/mL，IL-2浓度为1000U/mL~2000U/mL，最适浓度为2000U/mL。
2.3、NK细胞培养扩增
2.3a、培养第3天观察细胞状态，加入等倍体积新鲜培养液，该新鲜培养液为临床级无血清培养基，所述临床级无血清培养基含IL-2和10%自体血清，新鲜培养液中IL-2的浓度为1000U/mL~2000U/mL，最适浓度为2000U/mL。
2.3b、第5天观察细胞状态，加入2倍体积新鲜培养液，该新鲜培养液为含IL-2的临床级无血清培养基，新鲜培养液中IL-2的浓度为1000U/mL~2000U/mL，最适浓度为2000U/mL。
2.3c、之后，隔天加入等倍体积的新鲜培养液，该新鲜培养液为含IL-2的临床级无血清培养基，新鲜培养液中IL-2的浓度为1000U/mL~2000U/mL，最适浓度为2000U/mL。
培养至第17或18天，获得处于对数生长期的NK细胞。
在实体瘤患者自体NK细胞分离、活化扩增的基础上，进行细胞杀伤活性检测方法使用三种荧光染料，分别是CFSE、PE-Annexin-V、7-AAD，CFSE用于标记靶细胞，PE-Annexin-V用于检测早期凋亡细胞，7-AAD用于检测中晚期凋亡细胞。
（3）、NK细胞杀伤活性检测：
3.1、CFSE标记靶细胞：
收集生长状况良好的肿瘤细胞，加入PBS缓冲液，离心条件为离心力300g，室温离心5min。洗涤2次，台盼蓝计数并用PBS缓冲液重悬细胞；
将预温好的CFSE-PBS液加入细胞团中，其中CFSE终浓度为2umol/L；37℃放置5~10min；
加入含10%已灭活胎牛血清（FBS）的1640培养基终止反应；
离心细胞，加入含10% FBS的1640培养基，37℃放置10min，PBS洗涤2次，最后用含10% FBS的1640培养基重悬细胞。
3.2、收集效应细胞及制备效靶比梯度：
收集步骤（2）中对数期生长的效应细胞，加入PBS缓冲液，离心条件为离心力300g，室温离心5min。洗涤2次，台盼蓝计数并用含10% FBS的1640培养基重悬细胞。
3.3、效靶细胞共培养：
将处理好的效应细胞与标记好的靶细胞按效靶比10:1~50:1，加入24孔无菌细胞培养板中；
并设只加靶细胞和效应细胞作为对照孔，用于检测靶细胞和效应细胞的自发死亡率；
用含10% FBS的1640培养基补齐每孔体积；
将细胞培养板轻轻混匀，离心条件为离心力300g室温离心3min，以使效应细胞和靶细胞紧密接触；
5% CO2、37℃培养箱孵育4h。
3.4、流式细胞仪分析细胞杀伤率：
将细胞收集于流式管中，台盼蓝计数，加入PBS缓冲液，离心条件为离心力300g，室温离心5min；
加入PBS缓冲液和PE-Annectin-V，避光孵育10min；
加入PBS缓冲液，离心条件为离心力300g，室温离心5min；
离心后加入PBS缓冲液和7-AAD，4h之内流式细胞仪检测；同时设定阴性对照管：未标记CFSE管、不加抗体管、只加PE-Annectin-V管、只加7-AAD管；
所有标本使用FACSCalibur仪检测，用CellQuest获取和分析数据。
计算公式：杀伤细胞毒性（%）=（靶细胞死亡率-靶细胞自发死亡率）/（100-靶细胞自发死亡率）×100%。
与现有技术相比，具有的优点如下：
1、本发明方法只需要采集实体肿瘤患者外周血40~60ml，经过体外一系列刺激因子的活化和扩增培养后，NK细胞的纯度及数量能够达到临床治疗的水平，无需特殊的仪器设备，也不需要特殊的处理过程，操作简便，降低了操作过程中污染发生的机率。培养过程中采用一次性耗材、无血清培养基和临床级药品重组人IL-2和重组人IFN-γ，增加了NK细胞临床应用过程中的安全性。
2、本发明方法是研究小组将不同刺激因子和其组合对NK细胞体外扩增效果进行大量筛选而总结出的最佳方案。若在培养过程中增加一种细胞因子就会增加一部分不可控因素，若缺乏某种细胞因子，有可能细胞的数量和纯度达不到要求，因此目前本发明方法的刺激因子组合及其所用剂量为最佳组合和最佳刺激剂量。
3、流式细胞术目前已广泛应用于免疫学研究，其可检测到单细胞水平，因此较其他检测方法更为准确。本发明方法中NK细胞细胞毒活性的检测方法是将流式细胞仪检测技术基础上，联合CFSE、Annexin-V与7-AAD三种荧光染料，根据荧光染料的特性和细胞凋亡过程的细胞膜和细胞核的变化特点的检测技术，采用PE-Annectin-V和7-AAD联合染色，PE-Annectin-V会结合发生早期凋亡细胞的膜磷脂酰丝氨酸，7-AAD与核酸结合；此技术方法不仅能从混合细胞中特异性地区分靶细胞和效应细胞，而且能检测到早期凋亡靶细胞，即CFSE+Annexin-V-7-AAD-单阳性细胞为活性正常靶细胞，CFSE+Annexin-V+7-AAD-双阳性细胞为凋亡早期靶细胞，CFSE+Annexin-V+7-AAD+三阳性细胞为凋亡晚期或已经死亡有完整细胞结构的靶细胞；由于流式细胞术分析细胞的优势，当靶细胞数目少，其他方法无法检测时，亦可采用此方法进行检测；本发明方法中采用存活的靶细胞的比较和计算（详见计算公式），扣除了在细胞培养期间发生自然凋亡的靶细胞的信号干扰。
本发明设计合理，在实验过程中不断改变思路和改进方法，经过不断试验和验证，利用本发明方法能够从实体瘤患者自体外周血中分离获得高活性的淋巴细胞群，然后体外经过一系列细胞因子的刺激，NK细胞（CD3-CD56+）得到活化和大量扩增，达到了临床治疗肿瘤水平。
一种基于流式细胞术的免疫细胞介导的细胞毒作用检测方法——CFSE/Annexin-V/7-AAD三联染色法。NK细胞的细胞毒活性检测方法不仅能在免疫细胞和肿瘤细胞的混合细胞群中特异性地分析效应细胞对靶细胞的细胞毒作用，并且能分析早期凋亡和晚期凋亡靶细胞，避免了效应细胞和靶细胞的自然凋亡与效应细胞和靶细胞混合培养过程中靶细胞作用于效应细胞而导致的效应细胞死亡对检测结果的干扰。其方法简便易行、灵敏度高，可以在单个细胞水平检测细胞的细胞毒活性，在过继免疫细胞治疗肿瘤的临床应用前基础研究和临床应用中质控方面具有重要意义。
附图说明
图1表示随着培养天数变化两组细胞中NK细胞（CD3-CD56+）比例变化趋势图。
图2表示随着培养天数的变化两组细胞总数趋势图。
图3表示培养不同天数检测两组细胞中NK细胞（CD3-CD56+）的流式图。
图4a表示E组中外周血NK细胞IFN-γ分泌功能流式细胞图。
图4b表示E组中培养17天NK细胞IFN-γ分泌功能流式细胞图。
图5a表示CFSE/Annexin-v/7-AAD组合染色分析E组细胞与K562细胞效靶比为10:1、20:1、40:1时的杀伤结果。
图5b表示CFSE/Annexin-v/7-AAD组合染色分析C组细胞与K562细胞效靶比为10:1、20:1、40:1时的杀伤结果。
图5c表示CFSE/Annexin-v/7-AAD组合染色分析单纯效应细胞自然凋亡结果。
图5d表示CFSE/Annexin-v/7-AAD组合染色分析E组细胞与K562细胞效靶比为10:1时的杀伤结果，此组靶细胞未经过CFSE染色。
图5e表示CFSE/Annexin-v/7-AAD组合染色分析单纯靶细胞自然凋亡结果。
图6a表示E组中培养第0天NK细胞活化性受体流式结果。
图6b表示E组中培养第17天NK细胞活化性受体流式结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施例进行详细说明。
实施例1
一种实体瘤患者自体NK细胞分离、活化扩增方法，包括如下步骤：
（1）、NK细胞的采集分离：
1.1、外周血采集：来源实体肿瘤患者外周血40~60ml，最适为50ml。采集装置为一次性100ml注射器，内装有10ml生理盐水和50unit/ml的肝素钠抗凝剂，根据采集血液的体积计算肝素钠的用量。抽取2ml外周血上流式细胞仪检测淋巴细胞亚群。
1.2、NK细胞分离：
1.2a、将采集的外周血装入50ml离心管中，离心条件：离心力500g，离心时间10min。用吸管吸出血浆装入另一只离心管中，于56℃水浴锅中灭活30min后离心，离心条件：离心力850g，离心时间10min。离心后取上清装入离心管中放入4℃冰箱中备用。
1.2b、将沉淀的红细胞层与生理盐水按照1:1混合，缓慢加入装有20ml分离液的50ml离心管中，在移动或装入离心机时动作应轻柔，防止血细胞层与分离液层混合，离心条件：离心力700g，离心时间15min，离心温度20-25℃，最适温度为25℃。将上述分离后的白膜层移至另一50ml离心管中，每管最多加入25ml上述吸出液，再加入同等量生理盐水，洗涤两次，第一次洗涤时离心条件：离心力750g，离心时间5min，第二次洗涤时离心条件：离心力500g，离心时间5min。
上述离心条件中一律采用离心力。白膜层的最佳离心条件是离心力700g，离心时间15min，离心温度为25℃。两次洗涤最佳离心条件为：离心力750g，离心时间5min和离心力500g，离心时间5min。
表1 外周血经密度梯度离心后淋巴细胞回收率
（2）、NK细胞活化扩增：
2.1、包被抗体：
一份外周血样本分为C、E两组，两组除了包被的抗体的不同以外，培养步骤、条件及细胞因子使用量均相同。E组包被MAbCD16抗体，作为本发明方法。C组包被MAbCD16和OKT3两种抗体，作为本发明方法的对照组。
取MAbCD16和OKT3按照分组要求分别加入装有2ml PBS缓冲液的75cm2培养瓶中，使抗体终浓度分别为：MAbCD16组为1ug/mL和OKT3组为50ng/mL，将培养瓶放于4℃冰箱中，包被抗体至少三天以上，PBS洗两遍备用。
2.2、将步骤（1）分离获得的细胞洗涤后计数，加入新鲜培养液，该新鲜培养液为临床级无血清培养基，所述临床级无血清培养基含IL-2（优选重组人白细胞介素2，rhIL-2）和10%自体血浆，加入培养新鲜培养液的体积根据细胞浓度而定，最佳细胞浓度为1×106/mL~2×106/mL；然后，分别转入已包被抗体的C组和E组培养瓶中并加入IFN-γ（优选重组人干扰素-γ，rhIFN-γ）；IFN-γ浓度为1000U/mL；IL-2浓度为2000U/mL。
2.3、NK细胞培养扩增
2.3a、培养第3天观察细胞状态，根据细胞生长情况加入等倍体积新鲜培养液，该新鲜培养液为临床级无血清培养基，所述临床级无血清培养基含IL-2和10%自体血清，新鲜培养液中IL-2的浓度为2000U/mL。
2.3b、第5天观察细胞状态，根据细胞生长情况加入2倍体积新鲜培养液，该新鲜培养液为含IL-2的临床级无血清培养基，新鲜培养液中IL-2的浓度为2000U/mL；并由75cm2培养瓶转入175cm2培养瓶。
2.3c、之后，隔天加入等倍体积的新鲜培养液，该新鲜培养液为含IL-2的临床级无血清培养基，新鲜培养液中IL-2的浓度为2000U/mL。
第7天转入培养袋中培养。
根据细胞生长情况，确认细胞回输时间，如果第17、18天回输细胞，应该在第14天抽取适量培养液做检测，包括细菌检测、真菌检测、内毒素检测、支原体检测、流式细胞仪分析淋巴细胞亚群。
培养至第17或18天，C组和E组培养结束。为验证最佳培养时间，培养至第21天。
表2 培养第0、8、12、17天C组和E组细胞中NK（CD3-CD56+）细胞比例变化
表3 培养第0天与第17天E组NK（CD3-CD56+）细胞活化性受体比例变化
如图6a所示，E组中培养第0天NK细胞活化性受体流式结果。
如图6b所示，E组中培养第17天NK细胞活化性受体流式结果。
如图4a所示， E组中培养第0天外周血NK细胞IFN-γ分泌功能流式细胞图。
如图4b所示，E组中培养17天NK细胞IFN-γ分泌功能流式细胞图。
（3）、流式细胞检测淋巴细胞亚群：
分别收集第0、8、12、17、21天的C组和E组细胞，调整细胞密度为1×105/ml，采用抗体如下：PerCP-CD3、FITC-CD4、PE-CD8、PE-CD56，各指标设同型对照，CD3+为T淋巴细胞、CD3+CD8+为CD8+T淋巴细胞、CD3+CD4+为CD4+T淋巴细胞、CD3+CD56+为NK细胞样T淋巴细胞、CD3-CD56+为NK细胞。上流式细胞仪检测，CellQuest软件分析细胞表型。
如图1所示，随着培养天数变化两组细胞中NK细胞（CD3-CD56+）比例变化趋势图。
如图2所示，随着培养天数的变化两组细胞总数趋势图。
如图3所示，培养不同天数检测两组细胞中NK细胞（CD3-CD56+）的流式图。
实施例2
一种实体瘤患者自体NK细胞的细胞毒作用检测方法，包括如下步骤：
3.1、CFSE标记靶细胞：
肿瘤细胞培养：将肿瘤细胞株（K562细胞）加入含10%已灭活胎牛血清（FBS）的1640培养基悬浮，置于37℃，5% CO2，饱和湿度条件下传代培养。
CFSE标记靶细胞：收集生长状况良好的肿瘤细胞，用PBS缓冲液，离心条件为离心力300g，室温离心5min。洗涤2次，台盼蓝计数并用PBS缓冲液重悬细胞。将预温好的CFSE-PBS液加入细胞团中（CFSE终浓度为2umol/L），轻轻吹打悬浮细胞（细胞浓度1×106/mL）。37℃放置细胞5-10min。加入10 mL含10% FBS的1640培养基终止反应。离心细胞，加入10mL含10% FBS的1640培养基，37℃放置10min，PBS洗涤2次，最后用10% FBS的1640培养基重悬细胞，细胞终浓度为1×105/mL。如果靶细胞为贴壁细胞需要胰酶消化时，使用不含EDTA的胰酶消化，减少细胞膜受到破坏，影响Annexin-v检测结果。CFSE染色浓度过高和过低都会影响流式细胞术分析时荧光补偿的调节。工作浓度过高，标记荧光强度过大，在与其他荧光抗体同时标记细胞时不利于在流式仪测定时进行补偿；工作浓度过低，无法区分增殖次数较多的细胞和未标记的阴性对照。经过试验确定其终浓度根据所使用的流式细胞仪和具体实验条件在2~5umol/L之间选择，最适CFSE染色浓度为2umol/L。
3.2、收集效应细胞及制备效靶比梯度：
取C组和E组的第17或18天培养的对数期生长的效应细胞，加入PBS缓冲液，离心条件为离心力300g，室温离心5min。洗涤2次，台盼蓝计数并用10% FBS的1640培养基重悬细胞，调整效应细胞浓度分别为1×106/mL、2×106/mL、4×106/mL。设定效靶比依次为10:1、20:1和40:1。效靶比可以为10:1~50:1，例如：也可以设定效靶比依次为12.5:1、25:1和50:1三个梯度值。
实验证实，效靶比为40:1与80:1相比，效靶比为50:1与100:1比较，其杀伤效率并无明显提高，差异无统计学意义。由于检测免疫细胞杀伤活性的主要目的是检测靶细胞的凋亡率，而效应细胞和靶细胞比例越高，靶细胞死亡的比例就越高，凋亡的细胞是完整的细胞，而死亡的细胞其细胞膜已经受到破坏，部分细胞甚至已经分解为细胞碎片，这种碎片不被流式细胞仪检测。
3.3、效靶细胞共培养：
将处理好的效应细胞与标记好的靶细胞按效靶比10:1、20:1、40:1，加入24孔无菌细胞培养板中，每孔加入效应细胞和靶细胞各100ul；并设只加靶细胞和效应细胞作为对照孔，用于检测靶细胞和效应细胞的自发死亡率；最后用含10% FBS的1640培养基补齐每孔体积至2mL。将细胞培养板轻轻混匀，离心条件为离心力300g，室温离心3min，以使效应细胞和靶细胞紧密接触；5% CO2、37℃培养箱孵育4h；效应细胞和靶细胞共培养的最佳时间是4h。
3.4、流式细胞仪分析细胞杀伤率：
将细胞收集于流式管中，台盼蓝计数，加入PBS缓冲液，离心条件为离心力300g，室温离心5min。加入100ul PBS缓冲液和5ul PE-Annectin-V，避光孵育10min。加入PBS缓冲液，离心条件为离心力300g，室温离心5min。
离心后加入100ul PBS缓冲液和5ul 7-AAD，4h之内流式细胞仪检测；同时设定阴性对照管：未标记CFSE管、不加抗体管、只加PE-Annectin-V管、只加7-AAD管。
所有标本使用FACSCalibur仪检测，用CellQuest获取和分析数据。检测过程大致如下：FL1荧光通道检测CFSE的荧光强度，FL2荧光通道检测PE-Annectin-V的荧光强度，FL3荧光通道检测7-AAD的荧光强度；通过阴性对照管调节电压和补偿，设立双阴性区；检测实验组先以FCS/SSC在扣除细胞碎片的前提下，圈定所有的效应细胞和靶细胞；以CFSE阳性标记的靶细胞设门为R1，收集10000个靶细胞；在PE-Annectin-V和7-AAD双标记的散点图中，进一步分析R1门中的靶细胞，采用CFSE、PE-Annectin-V和7-AAD三标记能有效分离各组细胞群。分析时，首先利用CFSE染色将效应细胞和靶细胞区分开，CFSE+为靶细胞；在CFSE+细胞群中，PE-Annectin-V和7-AAD双标记将靶细胞分为Annectin-V-7-AAD-、Annectin-V+7-AAD-、Annectin-V+7-AAD+3个组群，其中CFSE+Annectin-V-7-AAD-为正常的靶细胞，CFSE+Annectin-V+7-AAD-为早期凋亡的靶细胞， CFSE+Annectin-V+7-AAD+为中晚期凋亡的靶细胞；
计算公式：杀伤细胞毒性（%）=（靶细胞死亡率-靶细胞自发死亡率）/（100-靶细胞自发死亡率）×100%。
表4 CFSE/Annexin-v/7-AAD三联染色分析两组细胞对K562细胞的细胞毒作用
如图5a所示，CFSE/Annexin-v/7-AAD组合染色分析E组细胞与K562细胞效靶比为10:1、20:1、40:1时的杀伤结果。
如图5b所示，CFSE/Annexin-v/7-AAD组合染色分析C组细胞与K562细胞效靶比为10:1、20:1、40:1时的杀伤结果。
如图5c所示，CFSE/Annexin-v/7-AAD组合染色分析单纯效应细胞自然凋亡结果。
如图5d所示，CFSE/Annexin-v/7-AAD组合染色分析E组细胞与K562细胞效靶比为10:1时的杀伤结果，此组靶细胞未经过CFSE染色。
如图5e所示，CFSE/Annexin-v/7-AAD组合染色分析单纯靶细胞自然凋亡结果。
图5a至图5e，散点图中横坐标“FL1-H”为CFSE染色，横坐标“2”为Annexin-v-PE染色，纵坐标“3”为7-AAD染色。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照本发明实施例进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明的技术方案的精神和范围，其均应涵盖本发明的权利要求保护范围中。
Claims (5)
1.一种实体瘤患者自体NK细胞分离、活化扩增方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）、NK细胞的采集分离：
1.1、外周血采集：来源实体肿瘤患者自体外周血40~60ml；
1.2、NK细胞分离：
1.2a、将采集的外周血装入离心管中，离心条件：离心力500g，离心时间10min；吸出血浆装入另一只离心管，于56℃水浴锅中灭活30min后离心，离心条件：离心力850g，离心时间10min；离心后取上清装入离心管中放入4℃冰箱中备用；
1.2b、将沉淀的红细胞层与生理盐水按照1:1混合，缓慢加入装有分离液的离心管中，在移动或装入离心机时防止血细胞层与分离液层混合，离心条件：离心力700g，离心时间15min，离心温度20~25℃；将上述分离后的白膜层移至另一离心管，再加入同等量生理盐水，洗涤两次，第一次洗涤时离心条件：离心力750g，离心时间5min；第二次洗涤时离心条件：离心力500g、离心时间5min；
（2）、NK细胞活化扩增：
2.1、取CD16mAb加入装有PBS的培养瓶中，使抗体终浓度为1~10ug/mL，将培养瓶放于4℃冰箱中，包被抗体至少三天以上，用PBS洗两遍备用；
2.2、将步骤（1）分离获得的细胞洗涤后计数，加入新鲜培养液，该新鲜培养液为临床级无血清培养基，所述临床级无血清培养基含IL-2和10%自体血浆，细胞浓度为1×106/mL~2×106/mL；转入已包被抗体的培养瓶中并加入IFN-γ；IFN-γ浓度为100~1000U/mL，IL-2浓度为1000~2000U/mL；
2.3、NK细胞培养扩增
2.3a、培养第3天观察细胞状态，加入等倍体积新鲜培养液，该新鲜培养液为临床级无血清培养基，所述临床级无血清培养基含IL-2和10%自体血清，新鲜培养液中IL-2的浓度为1000U/mL~2000U/mL；
2.3b、第5天观察细胞状态，加入2倍体积新鲜培养液，该新鲜培养液为含IL-2的临床级无血清培养基，新鲜培养液中IL-2的浓度为1000U/mL~2000U/mL；
2.3c、之后，隔天加入等倍体积的新鲜培养液，该新鲜培养液为含IL-2的临床级无血清培养基，新鲜培养液中IL-2的浓度为1000U/mL~2000U/mL；
培养至第17或18天，获得处于对数生长期的NK细胞。
2.根据权利要求1所述的实体瘤患者自体NK细胞分离、活化扩增方法，其特征在于：所述IL-2选择rhIL-2；所述IFN-γ选择rhIFN-γ。
3.根据权利要求1或2所述的实体瘤患者自体NK细胞分离、活化扩增方法，其特征在于：步骤2.1中，单克隆抗体CD16终浓度为1ug/mL。
4.根据权利要求3所述的实体瘤患者自体NK细胞分离、活化扩增方法，其特征在于：步骤2.2中，IFN-γ浓度为1000U/mL，IL-2浓度为2000U/mL。
5.一种实体瘤患者自体NK细胞的活性检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）、NK细胞的采集分离：如权利要求1所述的步骤（1）；
（2）、NK细胞活化扩增：如权利要求1所述的步骤（2）；
（3）、NK细胞杀伤活性检测：
3.1、CFSE标记靶细胞：
收集生长状况良好的肿瘤细胞，加入PBS缓冲液，离心条件为离心力300g，室温离心5min；洗涤2次，台盼蓝计数并用PBS缓冲液重悬细胞；
将预温好的CFSE-PBS液加入细胞团中，其中CFSE终浓度为2umol/L；37℃放置5~10min；
加入含10% FBS的1640培养基终止反应；
离心细胞，加入含10% FBS的1640培养基，37℃放置10min，PBS洗涤2次，最后用10% FBS的1640培养基重悬细胞；
3.2、收集效应细胞及制备效靶比梯度：
收集步骤（2）中对数期生长的效应细胞，加入PBS缓冲液，离心条件为离心力300g，室温离心5min；洗涤2次，台盼蓝计数并用含10% FBS的1640培养基重悬细胞；
3.3、效靶细胞共培养：
将处理好的效应细胞与标记好的靶细胞按效靶比10~50:1，加入24孔无菌细胞培养板中；
并设只加靶细胞和效应细胞作为对照孔，用于检测靶细胞和效应细胞的自发死亡率；
用含10% FBS的1640培养基补齐每孔体积；
将细胞培养板轻轻混匀，离心条件为离心力300g，室温离心3min，以使效应细胞和靶细胞紧密接触；
5% CO2、37℃培养箱孵育4h；
3.4、流式细胞仪分析细胞杀伤率：
将细胞收集于流式管中，台盼蓝计数，加入PBS缓冲液，离心条件为离心力300g，室温离心5min；
加入PBS缓冲液和PE-Annectin-V，避光孵育10min；
加入PBS缓冲液，离心条件为离心力300g，室温离心5min；
离心后加入PBS缓冲液和7-AAD，4h之内流式细胞仪检测；同时设定阴性对照管：未标记CFSE管、不加抗体管、只加PE-Annectin-V管、只加7-AAD管；
所有标本使用FACSCalibur仪检测，用CellQuest获取和分析数据；
计算公式：杀伤细胞毒性（%）=（靶细胞死亡率-靶细胞自发死亡率）/（100-靶细胞自发死亡率）×100%。
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