CN105754942A - 一种体外扩增nk细胞的方法及其获得的nk细胞 - Google Patents

一种体外扩增nk细胞的方法及其获得的nk细胞 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种体外扩增NK细胞的方法及其获得的NK细胞，以外周血中分离出的单个核细胞(PBMC)作为种子细胞，通过在诱导培养开始及每次扩大培养时，将细胞加入到预先包被CD16Mab的培养瓶中，对细胞进行连续刺激并最终制备大量高纯度NK细胞的方法以及获得的NK细胞。本发明在不使用滋养层细胞进行刺激的情况下，通过CD16Mab包被进行连续刺激的方法最终获得大量、高纯度的NK细胞，并且降低了细胞因子的使用量。

Description

一种体外扩增NK细胞的方法及其获得的NK细胞
技术领域
本发明涉及一种体外扩增NK细胞的方法，尤其是以外周血单个核细胞(PBMC)作为种子细胞，通过在诱导培养开始及每次扩大培养时，将细胞加入到预先包被CD16Mab的培养瓶中，对细胞进行连续刺激并最终制备大量高纯度NK细胞的方法及其获得的NK细胞。
背景技术
肿瘤是目前困扰人类的最为重大的疾病，无论发病率和死亡均高居第一。肿瘤的免疫疗法作为肿瘤治疗的第四种手段正逐渐被人们所接受，NK细胞作为肿瘤免疫治疗技术中一个非常重要的组成部分，因其细胞毒性强、起效迅速且无抗原抑制性等优点而得到广泛的重视。并且，除了肿瘤细胞杀伤的功能外，NK细胞还具有抗病毒感染这一特有属性。目前，困扰NK细胞大规模应用的最大问题是其体外扩增困难，且制备成本较高。而以肿瘤滋养层促进NK细胞扩增的方法虽然能够获得大量的高纯度的的细胞，但是安全性问题却是其无法绕过的门槛。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种体外扩增NK细胞的方法及其获得的NK细胞，以外周血中分离获得的单个核细胞作为种子细胞，通过以CD16Mab包被培养瓶进行连续刺激的方法最终制备大量高纯度NK细胞的方法以及获得的NK细胞。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种体外扩增NK细胞的方法，包括以下步骤：
1)以外周血中分离获得的单个核细胞PBMC作为种子细胞；
2)配制NK细胞完全培养基：含有体积分数5-8％的FBS，以及终浓度500-1000IU/ml的IL-2、终浓度20-100IU/ml的IL-12、终浓度20-100IU/ml的IL-15的免疫细胞培养基；
3)以NK细胞完全培养基配制CD16Mab包被液：NK细胞完全培养基中含有4-8ug/ml的CD16Mab；
4)在细胞培养瓶中加入1-5mlCD16Mab包被液，包被4-24h；
5)将单个核细胞按照3-8*105/ml的细胞终浓度接种到预包被CD16Mab的细胞培养瓶中，加入NK细胞诱导培养基以及终浓度500-1000IU/ml的IFN-r,诱导扩增NK细胞；
6)每3-4天将每瓶细胞悬液平均分配到2个以CD16Mab包被液预包被4-24h的细胞培养瓶中，并补加1-2倍体积的NK细胞诱导培养基；
7)培养的第19-20天收集所有细胞培养瓶中的全部细胞。
具体地说，包括以下步骤：
1)以Ficoll淋巴细胞分离液从外周血中分离获得单个核细胞；
2)配制NK细胞完全培养基：含有体积分数5-8％的FBS，以及终浓度500-1000IU/ml的IL-2、终浓度20-100IU/ml的IL-12、终浓度20-100IU/ml的IL-15的免疫细胞培养基；
3)CD16Mab包被液的配制：NK细胞完全培养基中含有4-8ug/ml的CD16Mab；
4)将步骤1)获得的细胞按照3-8*105/ml的细胞终浓度接种到提前加入了5mlCD16Mab包被液，在4℃条件下包被了4-24h的T-175细胞培养瓶中，加入NK细胞完全培养基至培养体系为50-100ml,并按照终浓度500-1000IU/ml加入IFN-r，开始诱导培养；
5)诱导培养的第4天，在培养体系中加入等体积的NK细胞完全培养基继续培养；
6)培养的第6天，取2个新的T-175细胞培养瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被4-24h；
7)培养的第7天，将诱导培养的NK细胞悬液混合均匀后平均加入到2个包被好的T-175细胞培养瓶中，并加入等体积的NK细胞完全培养基继续培养；
8)培养的第9天，取4个新的T-175细胞培养瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被4-24h；
9)培养的第10天，将诱导培养的NK细胞悬液混合均匀后平均加入到4个包被好的T-175细胞培养瓶中，并加入等体积的NK细胞完全培养基继续培养；
10)培养的第12天，取8个新的T-175细胞培养瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被4-24h；
11)培养的第13天，将诱导培养的NK细胞悬液混合均匀后平均加入到8个包被好的T-175细胞培养瓶中，并加入等体积的NK细胞完全培养基继续培养；
12)培养的第15天，取16个新的T-175细胞培养瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被4-24h；
13)培养的第16天，将诱导培养的NK细胞悬液混合均匀后平均加入到16个包被好的T-175细胞培养瓶中，并加入等体积的NK细胞完全培养基继续培养；
14)培养的第19-20天收集所有细胞培养瓶中的全部细胞。
上述的体外扩增NK细胞的方法获得的NK细胞。
本发明的有益效果是：在不使用滋养层细胞进行刺激的情况下，通过CD16Mab包被进行连续刺激的方法最终获得大量、高纯度的NK细胞，并且降低了细胞因子的使用量。
附图说明
图1是培养中的NK细胞图。
图2是培养第20天的NK细胞的流式检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
本发明的体外扩增NK细胞的方法，包括以下步骤：
1)以外周血中分离获得的单个核细胞PBMC作为种子细胞；
2)配制NK细胞完全培养基：含有体积分数5-8％的FBS，以及终浓度500-1000IU/ml的IL-2、终浓度20-100IU/ml的IL-12、终浓度20-100IU/ml的IL-15的免疫细胞培养基；
3)以NK细胞完全培养基配制CD16Mab包被液：NK细胞完全培养基中含有4-8ug/ml的CD16Mab；
4)在细胞培养瓶中加入1-5mlCD16Mab包被液，包被4-24h；
5)将单个核细胞按照3-8*105/ml的细胞终浓度接种到预包被CD16Mab的细胞培养瓶中，加入NK细胞诱导培养基以及终浓度500-1000IU/ml的IFN-r,诱导扩增NK细胞；
6)每3-4天将每瓶细胞悬液平均分配到2个以CD16Mab包被液预包被4-24h的细胞培养瓶中，并补加1-2倍体积的NK细胞诱导培养基；
7)培养的第19-20天收集所有细胞培养瓶中的全部细胞。
具体地说，包括以下步骤：
1)以Ficoll淋巴细胞分离液从外周血中分离获得单个核细胞；
2)配制NK细胞完全培养基：含有体积分数5-8％的FBS，以及终浓度500-1000IU/ml的IL-2、终浓度20-100IU/ml的IL-12、终浓度20-100IU/ml的IL-15的免疫细胞培养基；
3)CD16Mab包被液的配制：NK细胞完全培养基中含有4-8ug/ml的CD16Mab；
4)将步骤1)获得的细胞按照3-8*105/ml的细胞终浓度接种到提前加入了5mlCD16Mab包被液，在4℃条件下包被了4-24h的T-175细胞培养瓶中，加入NK细胞完全培养基至培养体系为50-100ml,并按照终浓度500-1000IU/ml加入IFN-r，开始诱导培养；
5)诱导培养的第4天，在培养体系中加入等体积的NK细胞完全培养基继续培养；
6)培养的第6天，取2个新的T-175细胞培养瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被4-24h；
7)培养的第7天，将诱导培养的NK细胞悬液混合均匀后平均加入到2个包被好的T-175细胞培养瓶中，并加入等体积的NK细胞完全培养基继续培养；
8)培养的第9天，取4个新的T-175细胞培养瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被4-24h；
9)培养的第10天，将诱导培养的NK细胞悬液混合均匀后平均加入到4个包被好的T-175细胞培养瓶中，并加入等体积的NK细胞完全培养基继续培养；
10)培养的第12天，取8个新的T-175细胞培养瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被4-24h；
11)培养的第13天，将诱导培养的NK细胞悬液混合均匀后平均加入到8个包被好的T-175细胞培养瓶中，并加入等体积的NK细胞完全培养基继续培养；
12)培养的第15天，取16个新的T-175细胞培养瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被4-24h；
13)培养的第16天，将诱导培养的NK细胞悬液混合均匀后平均加入到16个包被好的T-175细胞培养瓶中，并加入等体积的NK细胞完全培养基继续培养；
14)培养的第19-20天收集所有细胞培养瓶中的全部细胞。
上述的体外扩增NK细胞的方法获得的NK细胞。
实施例1
1)配制NK细胞完全培养基：含有体积分数6％的FBS，以及终浓度1000IU/ml的IL-2、终浓度50IU/ml的IL-12、终浓度50IU/ml的IL-15的免疫细胞培养基；
2)以NK细胞完全培养基配制CD16Mab包被液：NK细胞完全培养基中含有8ug/ml的CD16Mab；
3)在T-175细胞培养瓶中加入5mlCD16Mab包被液，包被24h；
4)将外周血中分离获得的PBMC按照5*105/ml的细胞终浓度接种到提前包被好的细胞培养瓶中，加入NK细胞完全培养基至培养体系为50ml，按照终浓度1000IU/ml加入IFN-r，开始诱导培养；
5)诱导培养的第4天，在培养体系中加入50mlNK细胞完全培养基继续培养；
6)培养的第6天，取2个新的T-175细胞培养瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被24h；
7)培养的第7天，将诱导培养的NK细胞悬液混合均匀后平均加入到2个包被好的T-175细胞培养瓶中，并各加入50ml的NK细胞完全培养基继续培养；
8)培养的第9天，取4个新的T-175细胞培养瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被24h；
9)培养的第10天，将2个培养瓶中诱导培养的NK细胞悬液混合均匀后平均加入到4个包被好的T-175细胞培养瓶中，并各加入50ml的NK细胞完全培养基继续培养；
10)培养的第12天，取8个新的T-175细胞培养瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被24h；
11)培养的第13天，将4个培养瓶中诱导培养的NK细胞悬液混合均匀后平均加入到8个包被好的T-175细胞培养瓶中，并各加入50ml的NK细胞完全培养基继续培养；
12)培养的第15天，取16个新的T-175细胞培养瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被24h；
13)培养的第16天，将8个培养瓶中诱导培养的NK细胞悬液混合均匀后平均加入到16个包被好的T-175细胞培养瓶中，并各加入50ml的NK细胞完全培养基继续培养；
14)培养的第20天收集所有细胞培养瓶中的全部细胞，共获得3.5*109个细胞(图1)，其中NK细胞的比例(CD3-CD56+细胞)达到83％(图2)。
实施例2
1)配制NK细胞完全培养基：含有体积分数5％的FBS，以及终浓度500IU/ml的IL-2、终浓度20IU/ml的IL-12、终浓度20IU/ml的IL-15的免疫细胞培养基；
2)以NK细胞完全培养基配制CD16Mab包被液：NK细胞完全培养基中含有4ug/ml的CD16Mab；
3)在T-75细胞培养瓶中加入1mlCD16Mab包被液，包被4h；
4)将外周血中分离获得的PBMC按照3*105/ml的细胞终浓度接种到提前包被好的细胞培养瓶中，加入NK细胞完全培养基至培养体系为20ml，按照终浓度500IU/ml加入IFN-r，开始诱导培养；
5)诱导培养的第4天，在培养体系中加入20mlNK细胞完全培养基继续培养；
6)培养的第7天，取2个新的T-75细胞培养瓶，每瓶加入1mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被4h；
7)培养的第7天，将诱导培养的NK细胞悬液混合均匀后平均加入到2个包被好的T-75细胞培养瓶中，并各加入20ml的NK细胞完全培养基继续培养；
8)培养的第10天，取4个新的T-75细胞培养瓶，每瓶加入1mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被4h；
9)培养的第10天，将2个培养瓶中诱导培养的NK细胞悬液混合均匀后平均加入到4个包被好的T-75细胞培养瓶中，并各加入20ml的NK细胞完全培养基继续培养；
10)培养的第13天，取8个新的T-75细胞培养瓶，每瓶加入1mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被4h；
11)培养的第13天，将4个培养瓶中诱导培养的NK细胞悬液混合均匀后平均加入到8个包被好的T-75细胞培养瓶中，并各加入20ml的NK细胞完全培养基继续培养；
12)培养的第16天，取16个新的T-75细胞培养瓶，每瓶加入1mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被4h；
13)培养的第16天，将8个培养瓶中诱导培养的NK细胞悬液混合均匀后平均加入到16个包被好的T-75细胞培养瓶中，并各加入20ml的NK细胞完全培养基继续培养；
14)培养的第19天收集所有细胞培养瓶中的全部细胞，共获得1.2*109个细胞。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (3)

1.一种体外扩增NK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以外周血中分离获得的单个核细胞PBMC作为种子细胞；
2)配制NK细胞完全培养基：含有体积分数5-8％的FBS，以及终浓度500-1000IU/ml的IL-2、终浓度20-100IU/ml的IL-12、终浓度20-100IU/ml的IL-15的免疫细胞培养基；
3)以NK细胞完全培养基配制CD16Mab包被液：NK细胞完全培养基中含有4-8ug/ml的CD16Mab；
4)在细胞培养瓶中加入1-5mlCD16Mab包被液，包被4-24h；
5)将单个核细胞按照3-8*105/ml的细胞终浓度接种到预包被CD16Mab的细胞培养瓶中，加入NK细胞诱导培养基以及终浓度500-1000IU/ml的IFN-r,诱导扩增NK细胞；
6)每3-4天将每瓶细胞悬液平均分配到2个以CD16Mab包被液预包被4-24h的细胞培养瓶中，并补加1-2倍体积的NK细胞诱导培养基；
7)培养的第19-20天收集所有细胞培养瓶中的全部细胞。
2.根据权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以Ficoll淋巴细胞分离液从外周血中分离获得单个核细胞；
2)配制NK细胞完全培养基：含有体积分数5-8％的FBS，以及终浓度500-1000IU/ml的IL-2、终浓度20-100IU/ml的IL-12、终浓度20-100IU/ml的IL-15的免疫细胞培养基；
3)CD16Mab包被液的配制：NK细胞完全培养基中含有4-8ug/ml的CD16Mab；
4)将步骤1)获得的细胞按照3-8*105/ml的细胞终浓度接种到提前加入了5mlCD16Mab包被液，在4℃条件下包被了4-24h的T-175细胞培养瓶中，加入NK细胞完全培养基至培养体系为50-100ml,并按照终浓度500-1000IU/ml加入IFN-r，开始诱导培养；
5)诱导培养的第4天，在培养体系中加入等体积的NK细胞完全培养基继续培养；
6)培养的第6天，取2个新的T-175细胞培养瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被4-24h；
7)培养的第7天，将诱导培养的NK细胞悬液混合均匀后平均加入到2个包被好的T-175细胞培养瓶中，并加入等体积的NK细胞完全培养基继续培养；
8)培养的第9天，取4个新的T-175细胞培养瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被4-24h；
9)培养的第10天，将诱导培养的NK细胞悬液混合均匀后平均加入到4个包被好的T-175细胞培养瓶中，并加入等体积的NK细胞完全培养基继续培养；
10)培养的第12天，取8个新的T-175细胞培养瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被4-24h；
11)培养的第13天，将诱导培养的NK细胞悬液混合均匀后平均加入到8个包被好的T-175细胞培养瓶中，并加入等体积的NK细胞完全培养基继续培养；
12)培养的第15天，取16个新的T-175细胞培养瓶，每瓶加入5mlCD16Mab包被液，4℃条件下包被4-24h；
13)培养的第16天，将诱导培养的NK细胞悬液混合均匀后平均加入到16个包被好的T-175细胞培养瓶中，并加入等体积的NK细胞完全培养基继续培养；
14)培养的第19-20天收集所有细胞培养瓶中的全部细胞。
3.如权利要求1或2所述的体外扩增NK细胞的方法获得的NK细胞。
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