CN104711224A - 一种提高人Vδ2T细胞扩增效率的体外培养方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高人Vδ2T细胞扩增效率的体外培养方法及应用；分离外周血单个核细胞并使用培养基(AIMU+10％FBS)制成细胞悬液，加入唑来膦酸进行外体刺激；唑来膦酸刺激一天后，每天加入细胞因子rhIL-2；人外周血单个核细胞培养72-96小时，培养液微变黄后半量或2/3量更换培养液；96小时后培养液颜色变黄就进行半量换液；培养到第11-14天中，当扩增的Vδ2 T细胞频率和绝对数均达到要求时，收获细胞。本发明的Vδ2 T细胞纯度即达到90％以上。该方法培养方法简单，需要外周血量少，诱导细胞数量多，扩增效率极高，有望提高目前Vδ2 T细胞免疫治疗肝癌疗效，具有很好的应用潜能。

Description

一种提高人Vδ2T细胞扩增效率的体外培养方法及应用

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域。具体的，本发明涉及一种天然免疫细胞Vδ2 T的扩增培养数量的提高及方案的优化，是应用唑来膦酸与细胞因子联合诱导人Vδ2 T细胞的培养方法，可为该类细胞更广泛应用于临床肝癌细胞治疗提供坚实基础。

背景技术

γδT细胞是T淋巴细胞的一大类，是Brenner于1986年应用T细胞受体的γ基因序列编码肽段所制备的抗体中首先发现的。γδΤ细胞主要分布于皮肤和粘膜组织,而在健康人外周血中γδT细胞占淋巴细胞的1％～5％,其中Vδ2 T细胞亚群主要占γδT细胞的50％-90％(经常和Vγ9配对形成Vγ9Vδ2 T细胞)，Vδ1 T细胞亚群则占γδT细胞的10％-50％。该类细胞具有特异性识别抗原而无MHC限制性。人们发现γδT细胞，特别是其亚群Vδ2 T细胞的(大多数是以Vγ9Vδ2T细胞状态存在时),在肿瘤免疫和抗感染免疫中发挥了重要作用，成为重要的天然免疫防线。但由于γδT细胞在外周血或组织中含量不高,要获得大量高细胞毒活性的γδT细胞必须进行体外的培养扩增。

人们发现磷酸化抗原或小分子可以激活Vδ2 T细胞亚群，而该亚群在动物模型和多种难治性实体瘤以及病毒慢性感染疾病中被证明有杀伤肿瘤和抗病毒的作用。由于体外磷酸化抗原等小分子可以在体内外激活γδT细胞特异性杀伤肿瘤细胞，它们已经应用到临床成为治疗肿瘤的一种新方式，免疫治疗安全性好并且可以延长肿瘤患者生存期，具有显著的疗效。

虽然有临床试验证明唑来膦酸联合rhIL-2直接输入癌症患者体内可以提高患者机体的免疫力。但是为了达到该类细胞治疗理想的效靶比和长期有效性，还是有必要在体外大量扩增后，进行多次回输。因此，有必要针对目前的体外诱导方案进行患者自身的外周血单个核细胞的体外扩增，并通过联合加入rhIL-2提高其扩增效率和活性。目前使用的γδTCR抗体体外刺激γδΤ细胞扩增的研究中，抗体价格昂贵，成本高，需要的外周血量大，初始需要上亿个外周血单个核细胞进行扩增才能达到较好扩增效果；IPP的诱导则需要在不同的时2-3次加入IPP，成本不高，但是扩增数量较低，扩增频率不高；结核杆菌耐热性抗原体外诱导Vδ2 T细胞的专利中指出其扩增后Vδ2 T细胞纯度平均达80％；用唑来膦酸联合IL-2和达沙替尼的专利中指出改良后Vδ2 T细胞纯度仅平均达80％，绝对数量平均达到7X10⁶。总之，虽然Vδ2 T细胞的体外扩增技术有了较大发展，但是不同方法中仍存在成本较高，需要患者血液量大和扩增效率有限或者纯度不高等缺点，制约了该类细胞免疫治疗的推广。

众所周知，rhIL-2是维持和扩增细胞的重要细胞因子。在Vδ2 T细胞不同的体外培养方案中，其加入的时点和量也有所差别。若过早加入rhIL-2则会使Vδ2 T细胞以外的细胞在早期大量扩增，加入过晚或是量不足则影响Vδ2 T细胞的扩增效率和数量。因此rhIL-2加入的时和剂量需要进一步摸索和确定。

综上所述，如能在提高Vδ2 T细胞扩增数量和功能的基础上，减少患者采血量，降低成本，克服目前面临的主要障，将使该类细胞的免疫治疗手段进一步推广，更广泛地应用于临床。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有Vδ2 T细胞体外扩增方案中扩增效率有限，需血量大等缺点，提供一种高效的体外大量扩增外周血Vδ2 T细胞的方法，克服现有制备Vδ2 T细胞数量不足、扩增效率低、成本高的限制。为进一步提高Vδ2 T细胞为基础的抗肿瘤免疫治疗疗效提供支持。

本发明通过以下步骤实现：

一种提高人Vδ2 T细胞扩增效率的体外培养方法，包括如下步骤：

(1)分离外周血单个核细胞并使用培养基(AIMV+10％FBS)制成细胞悬液，加入唑来膦酸进行体外刺激；

(2)唑来膦酸刺激一天后，每天加入细胞因子rhIL-2；

(3)人外周血单个核细胞培养72-96h，培养液微变黄后半量或2/3量更换培养液；

(4)96h后，培养液颜色变黄就进行半量换液；培养到第11-14天中，当扩增的Vδ2 T细胞频率和绝对数均达到要求时，收获细胞。

所述唑来膦酸的使用浓度为3-10uM唑来膦酸加于1ml单个核细胞培养液悬液中，细胞浓度为300-500万/ml。

所述细胞培养当天加入唑来膦酸刺激，22-26h后加入rhIL-2，随后每天加入rhIL-2。

所述rhIL-2的使用浓度为每ml单个核细胞悬液中加入50-200IU rhIL-2。

所述细胞培养72-96小时之进行半量到2/3量更换培养液，并加入对应量的rhIL-2；优选每ml细胞悬液50-200IU。

96h后，所述根据细胞生长状态及培养液颜色变化进行半量换液,同时并补加对应量的rhIL-2；优选每ml细胞悬液50-200IU。当Vδ2 T细胞频率达到90％以上，绝对细胞数达到3亿以上时即可收获细胞，一般是在第11-14天完成。

在上述发明方法的基础上，我们针对上述的细胞扩增效率和纯度进行了评测：

Vδ2 T细胞扩增频率检测:使用流式的方法，检测第0、3、6、9、12天时Vδ2 T细胞扩增纯度；

Vδ2 T细胞扩增绝对数。检测第0、3、6、9、12天时Vδ2 T细胞绝对数，对不同天数总的活细胞进行计数，乘以对应天数的Vδ2 T细胞纯度，将上述两数相乘即得到Vδ2 T细胞的绝对数量。

经过技术改进，我们发现，发明方案中唑来膦酸使用浓度为5uM/ml，rhIL-2使用浓度为100IU/ml时，在培养的第12天时Vδ2 T细胞纯度即达到93％以上，收获时总细胞均能数达到3X10⁸以上。以初始Vδ2 T细胞绝对数为基数，扩增效率达到2300倍。(纯度和绝对数量远远大于其他专利中描述的细胞平均纯度(80％)和绝对计数(7X10⁶)增殖情况，且培养时较某些专利研究中的培养时(14-20天不等)缩短。

在上述结果的基础上，我们将该项发明应用在乙肝肝癌患者中进行了体外细胞扩增并进行了细胞特性的检测：

我们检测了健康人和乙肝肝癌患者扩增后Vδ2 T细胞表面活化分子、凋亡、NK类似分子、颗粒酶、穿孔素及细胞因子分泌：于第12天收集体外培养的细胞,采用流式细胞术检测两组人群扩增后，Vδ2 T细胞表面活化分子：CD38、CD69；NK类似分子：CD56、CD16、NKG2D、NKG2A；杀伤性颗粒：颗粒酶A、颗粒酶B、穿孔素；细胞因子IFN-γ、TNF-α分泌表达情况。以Vδ2 T细胞CD38阳性为例,计算公式为：CD38⁺Vδ2 T细胞表达(％)＝CD38⁺Vδ2 T细胞/总Vδ2 T细胞X100％；

总之，本发明通过应用和调整唑来膦酸和rhIL-2浓度和培养方案在体外诱导人Vδ2 T细胞的扩增，得到了诱导效率更高及活性更高的Vδ2 T细胞。该方法具有如下特点：培养方法简单，需要外周血量少，诱导细胞数量多，扩增效率极高，重复性好，经体外培养后得到的细胞数量、活性以及功能上都与健康人扩增后无差异。有望提高目前Vδ2 T细胞免疫治疗肝癌疗效,具有很好的应用潜能。

附图说明

图1：实施例1中，唑来膦酸和rhIL-2诱导人Vδ2 T细胞体外扩增，不同天数Vδ2 T细胞占总细胞的频率。第0、3、6、9、12天使用流式细胞仪进行检测Vδ2 T细胞纯度结果如图，第十二天时即可达到90％以上。

图2：实施例1中，唑来膦酸和rhIL-2诱导人外周血单个核细胞后，第0、3、6、9、12天Vδ2 T细胞的绝对计数图，显示的是不同培养时 Vδ2 T细胞的绝对数量统计分析图。

图3：健康人(10个)和乙肝肝癌患者(10个)同样按实施例1方案条件扩增后，第十二天收获细胞，进行不同的检测指标对比。包括活化指标、NK相关分子表达、颗粒酶穿孔素分 泌、干扰素和肿瘤坏死因子分泌。结果显示各指标均无显著差异。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明：

基本方法如下：

1、取10-15ml肝素钠抗凝外周血标本，应用人淋巴细胞分离液分离分离外周血单个核细胞，使用培养基(AIMV+10％FBS)制成细胞悬液，细胞浓度为300-500万/ml。将细胞悬液接种于24孔板中，加入唑来膦酸(每ml细胞悬液加入3-10uM)进行体外刺激，将孔板置于培养箱中培养；

2、以接种天数为第0天，唑来膦酸刺激22-26小时后，细胞形态出现小团的细胞簇形态时，以每ml细胞悬液50-200IU的浓度加入rhIL-2，此后每天以此浓度加入细胞因子rhIL-2；

3、人外周血单个核细胞培养72-96h小时后，细胞出现大量细胞簇形态，培养液微变黄后进行半量到2/3量更换培养液，并加入对应量的rhIL-2(每ml细胞悬液50-200IU rhIL-2)；

4、96h后，所述根据细胞生长状态及培养液颜色变化(1-2天)进行半量换液,同时并补加对应量的rhIL-2(每ml细胞悬液50-200IU)。培养液颜色变黄就进行半量换液。当细胞的形态大部分为长条状，Vδ2 T细胞频率达到93％以上，绝对细胞数达到3亿以上时即可收获细胞，一般是第11-14天。

本实验所用外周血均来自天津市第一中心医院，本实验入组了十个健康人外周血标本和十个乙肝肝癌患者的外周血标本。

实施例1：Vδ2 T细胞体外刺激扩增

1.将获取的15ml肝素钠抗凝外周血1500rpm 10min离血浆后，使用等量PBS缓冲液充分混匀剩余的静脉血；在15ml离心管中小心加入4ml淋巴细胞提取液(注意不要沾到管壁上)，再将已经混匀的人血稀释液加入15ml离心管中，每管加入6ml；室温，600g，30min，离心(离心机升速度设为6，降速度设为2)；小心吸取中乳白色单个核细胞层(通常称为白膜层)；使用PBS重悬后，离心2000rpm 15min；弃上清，使用PBS重悬后再次离心，1500rpm 10min，弃上清。使用AIMV+10％FBS培养基调整细胞密度到3-5百万细胞/ml。以每孔1.5ml的量将细胞悬液加入24孔板中，加入唑来膦酸(5uM/ml)放入37℃孵箱培养。

2.唑来膦酸刺激24小时后，细胞出现多个小的成簇的细胞群落，加入rhIL-2(每ml细胞悬液100IU rhIL-2)，由于加入rhIL-2,48小时后，细胞群落逐渐变大。此后培养的每 一天都加入rhIL-2(每ml细胞悬液中加入100IU rhIL-2)。

3.人外周血单个核细胞培养72-96小时后，细胞出现大量细胞簇形态且细胞刺激变大后呈长条状，培养液微变黄后进行半量到2/3量更换培养液，将细胞从24孔板重悬后使用800rpm离心5min，保留部分原来培养上清重悬细胞，补足培养基，并补加入对应量的rhIL-2(每ml细胞悬液100IU rhIL-2)并将细胞培养于6孔板中。

4.96小时后，根据细胞生长状态及培养液颜色变化(1-2天)进行半量换液,换液离心速度1000rpm，5min，离心后按照不同的细胞数量将其培养与合适大小的培养瓶中，同时并补加对应量的rhIL-2(每ml细胞悬液100IU)。培养到12天后，大部分的细胞的成悬浮形态、呈现被激活的长条状。这时检测Vδ2 T细胞纯度，平均达到90％以上(个别达到95％以上)，绝对细胞数平均达到3.5亿,此时即可收获细胞。

实施例2：Vδ2 T细胞体外刺激扩增(刺激剂浓度培养时 不同)

1.将获取的15ml肝素钠抗凝外周血1500rpm 10min离血浆后，使用等量PBS缓冲液充分混匀剩余的静脉血；在15ml离心管中小心加入4ml淋巴细胞提取液(注意不要沾到管壁上)，再将已经混匀的人血稀释液加入15ml离心管中，每管加入6ml；室温，600g，30min，离心(离心机升速度设为6，降速度设为2)；小心吸取中乳白色单个核细胞层；使用PBS重悬后，离心2000rpm 15min；弃上清，使用PBS重悬后再次离心，1500rpm 10min，弃上清。使用AIMV+10％FBS培养基调整细胞密度到3-5百万细胞/ml。以每孔1.5ml的量将细胞悬液加入24孔板中，加入唑来膦酸(3uM/ml)放入37℃孵箱培养。

2.唑来膦酸刺激26小时后，细胞出现多个小的成簇的细胞群落，加入rhIL-2(每ml细胞悬液200IU rhIL-2)，由于加入rhIL-2,48小时后，细胞群落逐渐变大。此后培养的每一天都加入rhIL-2(每ml细胞悬液中加入200IU rhIL-2)。

3.人外周血单个核细胞培养72小时后，细胞出现大量细胞簇形态且细胞刺激变大后呈长条状，培养液微变黄后进行半量到2/3量更换培养液，将细胞从24孔板重悬后使用800rpm离心5min，保留部分原来培养上清重悬细胞，补足培养基，并补加入对应量的rhIL-2(每ml细胞悬液200IU rhIL-2)并将细胞培养于6孔板中。

4.96小时后，根据细胞生长状态及培养液颜色变化(1-2天)进行半量换液,换液离心速度1000rpm，5min，离心后按照不同的细胞数量将其培养与合适大小的培养瓶中，同时并补加对应量的rhIL-2(每ml细胞悬液200IU)。培养到14天后，大部分的细胞的成悬浮形态、呈现被激活的长条状。这时检测Vδ2 T细胞纯度，平均达到90％以上， 绝对细胞数平均可达到3亿,此时即可收获细胞。

实施例3：Vδ2 T细胞体外刺激扩增(刺激剂浓度培养时 不同)

1.将获取的15ml肝素钠抗凝外周血1500rpm 10min离血浆后，使用等量PBS缓冲液充分混匀剩余的静脉血；在15ml离心管中小心加入4ml淋巴细胞提取液(注意不要沾到管壁上)，再将已经混匀的人血稀释液加入15ml离心管中，每管加入6ml；室温，600g，30min，离心(离心机升速度设为6，降速度设为2)；小心吸取中乳白色单个核细胞层；使用PBS重悬后，离心2000rpm 15min；弃上清，使用PBS重悬后再次离心，1500rpm 10min，弃上清。使用AIMV+10％FBS培养基调整细胞密度到3-5百万细胞/ml。以每孔1.5ml的量将细胞悬液加入24孔板中，加入唑来膦酸(10uM/ml)放入37℃孵箱培养。

2.唑来膦酸刺激22小时后，细胞出现多个小的成簇的细胞群落，加入rhIL-2(每ml细胞悬液50IU rhIL-2)，由于加入rhIL-2，48小时后，细胞群落逐渐变大。此后培养的每一天都加入rhIL-2(每ml细胞悬液中加入50IU rhIL-2)。

3.人外周血单个核细胞培养72-96小时后，细胞出现大量细胞簇形态且细胞刺激变大后呈长条状，培养液微变黄后进行半量到2/3量更换培养液，将细胞从24孔板重悬后使用800rpm离心5min，保留部分原来培养上清重悬细胞，补足培养基，并补加入对应量的rhIL-2(每ml细胞悬液50IU rhIL-2)并将细胞培养于6孔板中。

4.96小时后，根据细胞生长状态及培养液颜色变化(1-2天)进行半量换液,换液离心速度1000rpm，5min，离心后按照不同的细胞数量将其培养与合适大小的培养瓶中，同时并补加对应量的rhIL-2(每ml细胞悬液50IU)。培养到14-15天后，大部分的细胞的成悬浮形态、大部呈现被激活的长条状。这时检测Vδ2 T细胞纯度，平均达到90％以上，绝对细胞数平均达到3亿,此时即可收获细胞。

实施例4：Vδ2 T细胞体外扩增频率和绝对计数

1.在实施例1的条件培养条件下，将不同天数(0、3、6、9、12天)培养的细胞收集后进行总的活细胞计数。

2.将不同天数收集后的细胞离心，1000rpm 5min，使用PBS重悬，以5X10⁵个细胞/管悬于200ul PBS中。

3.加入3ul抗人Vδ2 TCR FITC抗体和1ul抗人CD3 APC抗体(见表一染色方案的频率指标)，4℃避光染色20min。

4.染色完毕后，使用1ml PBS 1500rpm 5min洗两次，使用200ul PBS重悬。

5.使用流式细胞仪Cell-Quest软件收集细胞，计算Vδ2 T细胞占外周血单个核细胞的百分含 量。人Vδ2 T细胞不同天数体外扩增频率流式结果见图1。

6.Vδ2 T细胞绝对数量检测：将50ul细胞悬液与50ul台盼蓝溶液1:1混匀后,加入10ul于计数专用板中，计算样本的活细胞数。Vδ2 T细胞绝对数量＝Vδ2 T细胞占总细胞比例X总体活细胞数量。人Vδ2 T细胞不同天数扩增绝对计数统计结果见图2。

实施例5：Vδ2 T细胞的表型检测：

1.收集第12天乙肝肝癌患者和健康人扩增细胞悬于流式管中(100万细胞/0.3ml PBS)，按表一中抗体组合和剂量加入抗体，进行避光染色20min；

表一：细胞表面染色方案

注：括号内数值为所加抗体量，单位微升

2.染色完毕后加1mlPBS，1500rpm离心5min；

3.弃上清，加入PBS洗涤一次，1500rpm离心5min；

4.弃上清，用1％的多聚甲醛固定。上机使用Cell-Quest软件收获10万细胞。

5.活化分子或NK相关分子阳性率计算。以Vδ2 T细胞CD38阳性为例,计算公式为：CD38⁺Vδ2 T细胞表达(％)＝CD38⁺Vδ2 T细胞/总Vδ2 T细胞X100％；

6.健康人和乙肝肝癌患者活化因子及NK相关分子表达统计学结果见图3，结果显示无显著差异。

实施例6：Vδ2 T细胞穿孔素颗粒酶的胞内染色：

1.分别收集第12天乙肝肝癌患者和健康人扩增细胞分别悬于4个流式管中(100万细胞/0.3ml PBS)。

2.细胞中加入表面染色抗体CD3 APC(1ul)和Vδ2 PE(3ul)，避光染色20min。

3.染色完毕后加入1ml PBS，1500rpm离心5min。

4.弃上清后加入300ul BD破膜液，4℃避光破膜50min。

5.加入1ml破膜洗液，1500rpm离心5min，弃上清。 

6.加入同型对照或是胞内抗体颗粒酶A FITC、颗粒酶B FITC或穿孔素FITC抗体(共四个流式管)，4℃避光染色30min。

7.染色完毕后，加入1ml破膜洗液，1500rpm离心5min，弃上清。 

8.加入用1％的多聚甲醛固定。上机使用Cell-Quest软件收获10万细胞。

9.颗粒酶或穿孔素阳性率计算。以Vδ2 T细胞穿孔素阳性为例,计算公式为：穿孔素阳性Vδ2 T细胞(％)＝穿孔素阳性Vδ2 T细胞/总Vδ2 T细胞X100％；

10.健康人和乙肝肝癌患者颗粒酶和穿孔素表达统计学结果见图3，结果显示无显著差异。

实施例7：Vδ2 T细胞细胞因子分泌检测：

1.向96孔板中加入第12天乙肝肝癌患者和健康人扩增后细胞40万/孔。

2.向孔内加入5ul PMA(5ng/ul)和5ul离子霉素(100ng/ul)，补加加入培养基(1640+10％FBS)至0.2ml。

3.37℃培养箱中孵育一小时后，加入Golgi plug阻断剂(1ul)。

4.继续培养5小时后，收细胞。

5.加入1ml PBS，1500rpm 5分钟离心，弃上清。

6.加入表面染色抗体CD3 PerCP(5ul)和Vδ2 FITC(5ul)，避光染色20min。

7.染色完毕后，加入1ml PBS，1500rpm离心5min。

8.弃上清后加入300ul BD破膜液，避光破膜20min。

9.加入1ml洗液，1500rpm离心5min，弃上清。 

10.加入胞内抗体IFN-γAPC(2ul)和TNF-αPE(5ul),避光染色20min。

11.染色完毕后，加入1ml破膜洗液，1500rpm离心5min，弃上清。 

12.加入用1％的多聚甲醛固定。上机使用Cell-Quest软件收获20万细胞。

13.细胞因子分泌阳性率计算。以Vδ2 T细胞IFN-γ阳性为例,计算公式为：IFN-γ⁺Vδ2 T细胞表达(％)＝IFN-γ⁺Vδ2 T细胞/总Vδ2 T细胞X100％；

乙肝肝癌患者和健康人IFN-γ和TNF-α表达统计学结果见图3，结果显示无显著差异。

为了有助于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。

除非另外指出，本文min指示分钟

除非另外指出，本文rpm指示每分钟的转数

除非另外指出，本文ml指示毫升

除非另外指出，本文FBS指示胎牛血清 

除非另外指出，本文PBS指示磷酸盐缓冲液

除非另外指出，本文CD指示白细胞分化抗原

除非另外指出，本文FITC指示异硫氰酸荧光素

除非另外指出本文PE指示藻红蛋白 

除非另外指出本文PerCp指示藻多甲素-叶绿素蛋白 

除非另外指出本文APC指示藻蓝蛋白 

除非另外指出本文IFN-γ指示γ干扰素

除非另外指出本文TNF-α指示肿瘤坏死因子α

除非另外指出本文NKG2指示自然杀伤细胞组2成员

除非另外指出本文IL-2指示白介素2。

Claims (8)

1.一种提高人Vδ2T细胞扩增效率的体外培养方法，其特征在于步骤如下：

(1)分离外周血单个核细胞并使用培养基(AIMV+10％FBS)制成细胞悬液，加入唑来膦酸进行体外刺激；

(2)唑来膦酸刺激一天后，每天加入细胞因子rhIL-2；

(3)人外周血单个核细胞培养72-96h，培养液微变黄后，更换培养液2/3～1/2；

(4)96h后，培养液颜色变黄就进行半量换液；培养到第11-14天中，当扩增的Vδ2T细胞频率和绝对数均达到要求时，收获细胞。

2.根据权利要求1所述方法，其特征是所述步骤(1)唑来膦酸的使用浓度为3-10uM唑来膦酸加于1ml单个核细胞培养液悬液中，细胞浓度为300-500万/ml。

3.根据权利要求1所述方法，其特征是所述步骤(2)细胞培养当天加入唑来膦酸刺激，22-26h后加入rhIL-2，随后每天加入rhIL-2。

4.根据权利要求1所述方法，其特征是所述步骤(2)rhIL-2的使用浓度为每ml单个核细胞悬液中加入50-200IU rhIL-2。

5.根据权利要求1所述方法，其特征是所述步骤(3)细胞培养72-96小时，进行半量到2/3量更换培养液并加入对应量的rhIL-2；。

6.根据权利要求1所述方法，其特征是所述步骤(4)中，96h后，所述根据细胞生长状态及培养液颜色变化1-2天进行半量换液，同时并补加对应量的rhIL-2；当Vδ2T细胞频率达到90％以上，绝对细胞数达到3亿以上时即可收获细胞。

7.根据权利要求6所述方法，其特征是所述rhIL-2为每ml细胞悬液50-200IU。

8.应用在乙肝肝癌患者中进行了体外Vδ2T细胞扩增。