CN108893443A - 一种细胞因子诱导脐带血自然杀伤细胞的高效扩增方法 - Google Patents

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Abstract

一种细胞因子诱导脐带血自然杀伤细胞的高效扩增方法，包括以下步骤：一、试剂的准备；二、自体血浆的制备；三、单个核细胞的制备，淋巴细胞采用样本密度分离液密度梯度离心法进行分离。四、自然杀伤细胞(Nature killer cell，NK)的扩增培养，采用细胞因子诱导法。本发明的NK细胞扩增方法在分离过程中加入了红细胞沉降液，去除红细胞干净，临床应用降低患者产生排异反应，扩增效率高，所得Nk细胞的纯度高，且无需滋养层细胞，操作简单，通用性好，所用试剂不含动物源成分，安全性好。

Description

一种细胞因子诱导脐带血自然杀伤细胞的高效扩增方法
技术领域
本发明涉及一种自然杀伤细胞的扩增方法，具体涉及一种细胞因子诱导脐带血自然杀伤细胞的高效扩增方法，属于生物技术领域。
背景技术
自然杀伤细胞(Nature killer cell，NK)是除T、B细胞之外的第三类淋巴细胞，与T淋巴细胞不同，NK细胞无需预先接触抗原刺激就即可杀伤靶细胞(如病毒感染的宿主细胞和肿瘤细胞)，由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制，因此称为自然杀伤活性。NK细胞作为人体天然免疫的重要组成部分，是机体抗御感染和防止细胞恶性转化的重要免疫调节细胞，在免疫监视、免疫防御中起着十分重要的作用。2012年美国疾病控制中心报告NK细胞的活力和数量是人体健康的重要保证，几乎所有疾病的发病都与NK细胞的活性明显不足有关。随着对NK细胞生物功能及活化机制的了解，利用NK细胞为靶点的免疫治疗对疾病的早期预防、控制和治疗具有重要意义。
近年来，免疫治疗己经成为继手术、放化疗之后的第四大治疗模式，并逐渐受到重视。过继性细胞免疫治疗法作为免疫治疗方法的一种，在临床研究方面取得了较大的进展。其中自体和异体外周血单核细胞(PBMC)来源NK细胞均被用于回输，但自体来源NK细胞的临床研究结果显示其抗肿瘤效果非常有限。主要原因可能包括:
(1)自体NK细胞KIR与肿瘤细胞HLA相匹配，“自我”识别信号抑制NK细胞活化；NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力依赖于NK细胞表面活化受体和抑制性受体见得信号平衡；
(2)患者自体NK细胞在免疫抑制环境下发育异常，功能受损，难以通过体外诱导达到较好的杀伤能力。有学者研究发现异体NK细胞回输具有较好的耐受性和安全性，并未引起严重的副作用和移植物抗宿主反应(GVHD)。另外异体NK细胞的供体选择广泛，细胞来源广泛(包括外周血来源、脐血来源、胚胎干细胞来源等)。
因此相对自体来源NK细胞，健康异体来源NK细胞展示出更好的抗肿瘤效果，并成为近来临床研究的主流。异体NK细胞回输已被用于包括白血病、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌等在内的多种肿瘤治疗的临床研究中。
但由于NK细胞的生产工艺不同，导致细胞成分和NK纯度、活性差异显著，其疗效差异也较大。因此，NK细胞的体外生产工艺也是目前NK治疗应用推广的关键因素。
脐血作为异质性资源，来源丰富，无伦理问题，目前在NK细胞回输免疫治疗的研究中占了相当大的比例。但NK细胞在脐血细胞中所占比例较低，数量少，功能不成熟，需要经过体外分离及扩增培养，获得大量高纯度的NK细胞才能满足临床应用。因此，如何获得高质量、高纯度的NK细胞成为NK细胞临床应用最为关键的问题之一。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种细胞因子诱导脐带血自然杀伤细胞的高效扩增方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。
本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：
一种细胞因子诱导脐带血自然杀伤细胞的高效扩增方法，包括：
一、试剂的准备；
1.基础培养基
无血清培养基：GT-T551购自日本TaKaRa公司；
2.添加组分
在所述基础培养液，即无血清培养基中加入1％-10％的自体血浆，200-1000IU/ml的IL-2，10-50ng/ml的IL-15和10-50ng/ml IL-21，IL-2、IL-15、IL-21、IL-12购自PeproTech公司；
3.红细胞沉降液：6％羟乙基淀粉(HES)；
4.样本密度分离液购自天津市灏洋生物制品有限公司；
5.台盼蓝拒染试剂盒；
6.FITC标记CD3、CD8同型对照IgG2α，PE-CD16和PE-CD56抗体购自美国BD公司；
二、自体血浆的制备
1)在生物安全柜内，将血液分装到50ml离心管中，每管血液大约30ml，离心2500rpm，10min；
所述血液为脐血或外周血；
2)离心后，将上层血浆置于新的50ml离心管中，56℃水浴灭活30min，3500rpm，离心5min；
3)上清液转移到新的50ml离心管中，丢掉下层絮状沉淀，自体血浆于-20℃冰箱放置15min，3500rpm，离心5min；
4)上清液转移到新的50ml离心管中，弃掉下层絮状沉淀，自体血浆于4℃冰箱保存，以备细胞培养中添加使用；
三、单个核细胞的制备
淋巴细胞采用样本密度分离液密度梯度离心法进行分离；
具体步骤为：
1)用生理盐水按照1:1的比例稀释上述用于血浆分离后的下层血细胞，然后以5：1的体积比加入红细胞沉降液，摇匀后静置，待分层后吸取上层细胞液，分装至50ml离心管中，2200rpm，10min，收集下层细胞；
2)将步骤1)得到的下层细胞用生理盐水充分混悬；
3)将混悬液加入到样本密度分离液中，离心2100rpm，20min；
4)离心后液面将分为4层，从底部分别为红细胞、淋巴分离液层、白膜层和上清液层，吸弃上清液层，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中；
5)将白膜层细胞加生理盐水混匀，2200rpm，8min；
6)离心后弃上清，用生理盐水重悬细胞沉淀，2000rpm，8min；
7)重复1800rpm，8min离心步骤一次，弃上清得到单个核细胞(PBMC)；
8)用培养基重悬，细胞计数、活率及表型检测；
四、自然杀伤细胞(Nature killer cell，NK)的扩增培养，采用细胞因子诱导法：
单个核细胞(PBMC)接种密度为1.0-2.0×106cell/ml，在混合培养基中连续培养15-20天左右，培养条件为、37℃、5.0％CO2培养箱中培养，培养过程每2-3天进行一次补液；
所述混合培养基组成如下：在所述无血清培养基的基础上添加1％-10％自体血浆(分离工艺中获得的自体血浆)，200-1000IU/ml的IL-2，10-50ng/ml的IL-15、10-50ng/mlIL-21和10-50ng/ml IL-12；IL-2、IL-15、IL-21、IL-12购自Pepro Tech公司；
所述无血清培养基为GT-T551购自日本TaKaRa公司。
还包括流式检测NK细胞的纯度的步骤：
1)取单细胞悬液，离心1200rpm，5miml；
2)用PBS重悬细胞沉淀，调节细胞浓度为1.0×106cell/100ul；
3)加抗体CD56、CD3，轻轻吹打混匀，4℃避光孵育30min，同时设置同型对照；
4)加1mlPBS于流式检测管中，1200rpm，5min，弃上清；
5)加100ulPBS,轻轻吹打混匀，上机检测；
结果扩增培养的NK细胞纯度达到80％-90％。(说具体数值范围，不说以上)
本发明的有益效果：
本发明的NK细胞扩增方法与现有技术相比最突出的特点是：选择异体健康脐血作为NK细胞来源，因为患者自体NK细胞在免疫抑制环境下发育异常，功能受损，难以通过体外诱导达到较好的杀伤能力。在分离过程中加入了红细胞沉降液，去除红细胞干净，扩增效率高，所得Nk细胞的纯度高，且无需滋养层细胞，操作简单，通用性好，所用试剂不含动物源成分，安全性好。通过该方法获得的NK细胞，将在肿瘤免疫治疗中发挥作用。
本发明红细胞去除干净，临床应用会降低患者产生排异反应的概率。
附图说明
图1为流式检测图，表示流式细胞仪检测本发明实例二中在Ⅰ组细胞因子组合中培养20天后，NK细胞表型结果图。
图2为流式检测图，表示流式细胞仪检测本发明实例二中在Ⅱ组细胞因子组合中培养20天后，NK细胞表型结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1
一种细胞因子诱导脐带血自然杀伤细胞的高效扩增方法，包括：
一、试剂的准备；
1.基础培养基
无血清培养基：GT-T551购自日本TaKaRa公司；
2.添加组分
在所述基础培养液，即无血清培养基中加入1％-10％的自体血浆，200-1000IU/ml的IL-2，10-50ng/ml的IL-15和10-50ng/ml IL-21，IL-2、IL-15、IL-21、IL-12购自PeproTech公司；
3.红细胞沉降液：6％羟乙基淀粉(HES)；
4.样本密度分离液购自天津市灏洋生物制品有限公司；
5.台盼蓝拒染试剂盒；
6.FITC标记CD3、CD8同型对照IgG2α，PE-CD16和PE-CD56抗体购自美国BD公司；
二、自体血浆的制备
1)在生物安全柜内，将血液分装到50ml离心管中，每管血液大约30ml，离心2500rpm，10min；
所述血液为脐血；
2)离心后，将上层血浆置于新的50ml离心管中，56℃水浴灭活30min，3500rpm，离心5min；
3)上清液转移到新的50ml离心管中，丢掉下层絮状沉淀，自体血浆于-20℃冰箱放置15min，3500rpm，离心5min；
4)上清液转移到新的50ml离心管中，弃掉下层絮状沉淀，自体血浆于4℃冰箱保存，以备细胞培养中添加使用；
三、单个核细胞的制备
淋巴细胞采用样本密度分离液密度梯度离心法进行分离；
具体步骤为：
1)用生理盐水按照1:1的比例稀释上述用于血浆分离后的下层血细胞，然后以5：1的体积比加入红细胞沉降液，摇匀后静置，待分层后吸取上层细胞液，分装至50ml离心管中，2200rpm，10min，收集下层细胞；
2)将步骤1)得到的下层细胞用生理盐水充分混悬；
3)将混悬液加入到样本密度分离液中，离心2100rpm，20min；
4)离心后液面将分为4层，从底部分别为红细胞、淋巴分离液层、白膜层和上清液层，吸弃上清液层，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中；
5)将白膜层细胞加生理盐水混匀，2200rpm，8min；
6)离心后弃上清，用生理盐水重悬细胞沉淀，2000rpm，8min；
7)重复1800rpm，8min离心步骤一次，弃上清得到单个核细胞(PBMC)；
8)用培养基重悬，细胞计数、活率及表型检测；
实施例2
自然杀伤细胞(Nature killer cell，NK)的扩增培养，采用细胞因子诱导法：
细胞因子组合优化实验
细胞因子组合分为2组：(Ⅰ)在无血清培养基的基础上添加1％-10％自体血浆(分离工艺中获得的自体血浆)，200-1000IU/ml的IL-2，10-50ng/ml的IL-15、10-50ng/ml IL-21；(Ⅱ)在无血清培养基的基础上添加1％-10％自体血浆(分离工艺中获得的自体血浆)，200-1000IU/ml的IL-2，10-50ng/ml的IL-15、10-50ng/ml IL-21、IL-12。
将实施例1中获得的单个核细胞分别悬浮于相应培养液中，调整细胞密度为1.5×106cell/ml，在37℃、5.0％CO2培养箱中培养，培养过程每2-3天进行一次补液，连续培养15-20天。第14天、18天、20天进行显微镜下观察细胞形态，进行细胞计数，活率，PE-CD56及FITC-CD3的抗体进行双重染色，细胞流式法检测细胞表型。
图1表示细胞在Ⅰ组细胞因子组合中培养20天后NK细胞阳性比率。CD3-CD56+阳性比率为53.3％；图2表示细胞在Ⅱ组细胞因子组合中培养20天后NK细胞阳性比率，CD3-CD56+阳性比率为90.27％；
图1和图2显示，在Ⅱ组细胞因子组合中NK阳性比率明显比Ⅰ组高，NK细胞纯度高于现有技术(比如CN104789527A公开的方法)因此选择Ⅱ组细胞因子体系诱导NK细胞大量扩增。
所述无血清培养基为GT-T551购自日本TaKaRa公司。
本发明的NK细胞扩增方法与现有技术相比最突出的特点是在分离过程中加入了红细胞沉降液，去除红细胞干净(红细胞去除不净，临床应用会导致患者产生排异反应)，扩增效率高，所得Nk细胞的纯度高，且无需滋养层细胞，操作简单，通用性好，所用试剂不含动物源成分，安全性好。通过该方法获得的NK细胞，将在肿瘤免疫治疗中发挥作用。
以上对本发明的具体实施方式进行了说明，但本发明并不以此为限，只要不脱离本发明的宗旨，本发明还可以有各种变化。

Claims (6)

1.一种细胞因子诱导脐带血自然杀伤细胞的高效扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
一、试剂的准备；
二、自体血浆的制备；
三、单个核细胞的制备，淋巴细胞采用样本密度分离液密度梯度离心法进行分离；
四、自然杀伤细胞(Nature killer cell，NK)的扩增培养，采用细胞因子诱导法。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：一、试剂的准备，包括以下步骤：
1.基础培养基
无血清培养基：GT-T551购自日本TaKaRa公司；
2.添加组分
在所述基础培养液，即无血清培养基中加入1％-10％的自体血浆，200-1000IU/ml的IL-2，10-50ng/ml的IL-15和10-50ng/ml IL-21，IL-2、IL-15、IL-21、IL-12购自Pepro Tech公司；
3.红细胞沉降液：6％羟乙基淀粉(HES)；
4.样本密度分离液购自天津市灏洋生物制品有限公司；
5.台盼蓝拒染试剂盒；
6.FITC标记CD3、CD8同型对照IgG2α，PE-CD16和PE-CD56抗体购自美国BD公司。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：二、自体血浆的制备，包括以下步骤：
1)在生物安全柜内，将血液分装到50ml离心管中，每管血液大约30ml，离心2500rpm，10min；
所述血液为脐血或外周血；
2)离心后，将上层血浆置于新的50ml离心管中，56℃水浴灭活30min，3500rpm，离心5min；
3)上清液转移到新的50ml离心管中，丢掉下层絮状沉淀，自体血浆于-20℃冰箱放置15min，3500rpm，离心5min；
4)上清液转移到新的50ml离心管中，弃掉下层絮状沉淀，自体血浆于4℃冰箱保存，以备细胞培养中添加使用。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：三、单个核细胞的制备，淋巴细胞采用样本密度分离液密度梯度离心法进行分离，具体步骤为：
1)用生理盐水按照1:1的比例稀释上述用于血浆分离后的下层血细胞，然后以5：1的体积比加入红细胞沉降液，摇匀后静置，待分层后吸取上层细胞液，分装至50ml离心管中，2200rpm，10min，收集下层细胞；
2)将步骤1)得到的下层细胞用生理盐水充分混悬；
3)将混悬液加入到样本密度分离液中，离心2100rpm，20min；
4)离心后液面将分为4层，从底部分别为红细胞、淋巴分离液层、白膜层和上清液层，吸弃上清液层，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中；
5)将白膜层细胞加生理盐水混匀，2200rpm，8min；
6)离心后弃上清，用生理盐水重悬细胞沉淀，2000rpm，8min；
7)重复1800rpm，8min离心步骤一次，弃上清得到单个核细胞(PBMC)；
8)用培养基重悬，细胞计数、活率及表型检测。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：四、自然杀伤细胞(Nature killer cell，NK)的扩增培养，采用细胞因子诱导法，具体步骤为：
单个核细胞(PBMC)接种密度为1.0-2.0×106cell/ml，在混合培养基中连续培养15-20天左右，培养条件为、37℃、5.0％CO2培养箱中培养，培养过程每2-3天进行一次补液；
所述混合培养基组成如下：在所述无血清培养基的基础上添加1％-10％自体血浆，200-1000IU/ml的IL-2，10-50ng/ml的IL-15、10-50ng/ml IL-21和10-50ng/ml IL-12；IL-2、IL-15、IL-21、IL-12购自Pepro Tech公司。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：还包括流式检测NK细胞的纯度的步骤：
1)取单细胞悬液，离心1200rpm，5miml；
2)用PBS重悬细胞沉淀，调节细胞浓度为1.0×106cell/100ul；
3)加抗体CD56、CD3，轻轻吹打混匀，4℃避光孵育30min，同时设置同型对照；
4)加1mlPBS于流式检测管中，1200rpm，5min，弃上清；
5)加100ulPBS,轻轻吹打混匀，上机检测；
结果扩增培养的NK细胞纯度达到80％-90％。
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