CN111548994A - 一种细胞培养基及其培养nk细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种细胞培养基及其培养NK细胞的方法，所述一种细胞培养基，其特征在于，所述培养基为含有体积百分比为10％的灭活血浆，以及500～1500U/mL IL‑2的ALyS505NK‑AC培养基；本发明用于培养NK细胞的培养基使用灭活血浆，并创造性只使用一种细胞因子(IL‑2)，能够大大降低NK细胞培养中的成本。本发明培养基用于培养NK细胞，操作步骤更简单，用时短，并能获得数量充足的细胞数量，扩增数量能达到2×10⁹以上；此外，本发明不仅仅局限于扩增NK细胞，还能够全方位提高NK细胞的生物活性。

Description

一种细胞培养基及其培养NK细胞的方法

技术领域

本发明属于再生医学和生物学技术领域，涉及NK细胞的培养及制剂制备的方法，尤其是一种细胞培养基及其培养NK细胞的方法。

背景技术

自然杀伤细胞(Natural killer cells，NK cells)是一群不同于T、B淋巴细胞的大颗粒淋巴细胞，分布于外周各淋巴器官及血液循环系统，无需抗原的预先刺激与活化即可发挥细胞毒效应，并可分泌多种细胞因子及趋化因子，是机体天然免疫的主要承担者，也是获得性细胞免疫的核心调节细胞，在肿瘤免疫、抗病毒感染及清除非己细胞中发挥重要作用。NK细胞过继性免疫治疗是目前临床上肿瘤细胞免疫治疗的重要手段。由于外周血中NK细胞含量少(约占淋巴细胞的5％一10％)，体外扩增高效的NK细胞则成为NK细胞治疗的关键问题之一。

许多体外研究均显示IL-2、IL-12、IL-15对促进NK细胞的成熟、活化、增殖及细胞毒活性有重要作用。但经过研究发现，使用IL-2、IL-12、IL-15等细胞因子的不同组合在一定程度上可以扩增体外的NK细胞，但是外周血样品年龄、是否化疗等条件直接影响了NK细胞的体外扩增成功与否，说明了现有培养体系的稳定性较差。本发明对现有技术进行了培养体系的优化改进，仅使用的1-2细胞因子，结合新的培养基，保证各类型血液样品都能扩增成功，年龄段因此我们首先从方法学角度探索提高NK细胞纯度的方法并采用IL-2、IL-12、IL-15等细胞囚子的不同组合，以期提高NK细胞体外扩增的效率及纯度，并进一步从NK细胞穿孔素、颗粒酶B mRNA的表达水平及IFN的分泌水平评价扩增后NK细胞的功能变化，为进一步的临床应用奠定基础。

目前NK细胞的培养体系复杂，添加的细胞因子种类繁多，且细胞扩增效果还有待提高。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术的不足之处而提供一种培养体系更简单，且能稳定扩增NK细胞，并提高其活性的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种细胞培养基，所述培养基为含有体积百分比为5～20％的灭活血浆，以及500～1500U/mL IL-2的ALyS505NK-AC培养基。

体外细胞培养使会加入一定量的血清，一般为胎牛血清，其含有丰富的细胞生长必须的营养成份，对细胞的正常生长具有重要的作用。然后，胎牛血清价格昂贵，且还可能由于处理过程不规范带来污染或者牛源性病毒污染，影响后续的细胞培养。使用灭活血浆价格相对更便宜，且血浆的灭活方法简单，能大大节省成本，并减少污染的发生。

另外，一般NK细胞培养需要IL-2和IL-12、IL-15等多种细胞因子，本发明培养基仅涉及IL-2一种细胞因子，成本更低，操作更简单。

作为本发明的优选实施方式，所述培养基中IL-2的浓度为1000U/mL。

作为本发明的优选实施方式，所述灭活血浆的制备方法为：将血样于2000rpm离心15min，吸取上层血浆至新的离心管中；密封好置于56℃灭活20～50min；2500～3500rpm离心15min，取上层溶液即为所述灭活血浆。

本发明还要求保护所述培养基在诱导PBMC分化成NK细胞的用途。

本发明的培养基用于NK细胞的培养所获得的细胞数量充足，细胞活性高。

本发明还提供了所述培养基用于培养NK细胞的培养方法，包括以下步骤：

1)在培养容器中孵育15～20min的Lymactin-NK抗体，然后丢弃Lymactin-NK抗体液

2)在步骤1)所述的容器中加入本发明所述培养基，并将PBMC接种于所述培养基中，该操作时间计为第0天；

3)于第3、5天进行补液，补加含有500～1500U/mL IL-2的ALyS505NK-AC培养基；

4)在第7天进行补液，补加含有500～1500U/mL IL-2的ALyS505NK-EX培养基；

5)在第9、11天进行补液，补加含有1000U/mLIL-2的ALyS505NK-EX培养基，即得到NK细胞。

本方法操作工程简单有效，能显著提高NK细胞的培养成功率；培养过程中，必要时需要将细胞转移至更大的容器中进行培养。

作为本发明的优选实施方式，所述步骤3)～5)中补加的培养基与步骤2)培养基的体积比为1:1。

作为本发明的优选实施方式，所述培养基用于培养NK细胞的培养方法的所述步骤2)中，PBMC的接种密度不低于1×10⁶cells/mL。

作为本发明的优选实施方式，所述培养基用于培养NK细胞的培养方法的所述步骤2)中，所述培养基中使用的灭活血浆与所述PBMC来源于同一供体。

使用自体灭活血浆，代替胎牛血清或异源供体灭活血浆，可有效避免牛源性病毒污染或者其他供体中含有的病毒污染。灭活血浆可在制备PBMC的过程获得，更节约成本。

作为本发明的优选实施方式，所述培养基用于培养NK细胞的培养方法还包括利用ficoll密度梯度离心法分离血样中PBMC的过程。

作为本发明的优选实施方式，所述用于制备PBMC的血样为外周血。

作为本发明的优选实施方式，所述ficoll密度梯度离心法分离血样中PBMC的过程如下：

1)抽取外周血30mL，2000rpm离心15min；

2)吸取离心后的血样的下层血细胞层，并用一次性移液管加入等量生理盐水稀释，混合均匀；

3)另取新的离心管，加入淋巴细胞分离液，并将稀释后的下层血细胞溶液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面，所述下层血细胞溶液：淋巴分离液的体积比为1:1；

4)2000rpm，离心15min；

5)离心后将上层含有PBMC层液体吸出，转移至另一支离心管中，注意不要将红细胞层一并吸出；

6)用一次性移液管加RPMI 1640培养基重悬PBMC，500g离心5min，弃上清，即得所述PBMC。

步骤6)中使用RPMI1640培养基重悬细胞，有利于保证细胞活性。

本发明用于培养NK细胞的培养基使用灭活血浆，并创造性只使用一种细胞因子(IL-2)，能够大大降低NK细胞培养中的成本。本发明培养基用于培养NK细胞，操作步骤更简单，用时短，通过使用Lymactin-NK抗体进行细胞纯化培养，结合IL-2对细胞进行刺激增殖，扩增数量能达到2×10⁹以上，获得的细胞数量充足；此外，本发明不仅仅局限于扩增NK细胞，还能够全方位提高NK细胞的生物活性，显著提高NK细胞的培养成功率，对NK细胞的培养具有重要的意义。

附图说明

图1为本发明方法制备的细胞中CD3^-、CD56⁺的细胞含量的流式检测结果。

图2为本发明方法制备的NK细胞杀伤效果。

图3为专利CN201710876924.1方法制备的NK细胞杀伤效果。

图4为专利CN201610905270.6方法制备的NK细胞杀伤效果。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1本发明用于培养NK细胞的培养基及其培养方法的实施例(一)制备PBMC和灭活血浆

1)抽取健康青年供者外周血30mL，用巴氏吸管抽取2mL外周血分装于两个EP管中，一个进行细菌、真菌的检测，一个留样；

2)2000rpm离心15min剩余的外周血血样；

3)吸取步骤2)离心后的血样的上层血浆至新的离心管中，密封好置于56℃灭活30min，冷却至室温后3000rpm离心15min，转移上层溶液至新的离心管中，即得灭活血浆，置于4℃保存备用；

4)吸取步骤2)离心后的血样的下层血细胞层，并用一次性移液管加入等量生理盐水稀释(按体积比，浓缩血液层：生理盐水＝1.5:1)，混合均匀；

5)另取新的50mL离心管，加入25mL淋巴细胞分离液，将步骤4)稀释后的下层血细胞溶液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面，按体积比，下层血细胞溶液：淋巴分离液＝1:1；

6)将步骤5)的溶液离心15min，转速2000rpm；

7)离心后将上层含有PBMC层液体吸出，转移至另一支50mL离心管中，注意不要将红细胞层一并吸出；

8)用一次性移液管加RPMI 1640培养基重悬PBMC至40mL，500g离心5min；

9)离心结束后弃上清，用RPMI 1640培养基充分重悬细胞后，进行细胞计数。

(二)NK细胞培养

1)在培养容器中孵育15～20min的Lymactin-NK抗体，然后丢弃Lymactin-NK抗体液；

2)将PBMC按照不小于1×10⁶cells/mL的密度接种于步骤1)的容器中，所述容器含有体积百分比为10％的灭活血浆，以及500～1500U/mL IL-2的ALyS505NK-AC培养基中，该操作时间计为第0天；

3)于第3、5天进行补液，补加含有500～1500U/mL IL-2的ALyS505NK-AC培养基；

4)在第7天进行补液，补加含有500～1500U/mL IL-2的ALyS505NK-EX培养基，并将细胞转移至一个1L的细胞培养袋中；

5)在第9、11天进行补液，补加含有1000U/mLIL-2的ALyS505NK-EX培养基，即得到NK细胞。

步骤(3)～(5)中加入培养基与原培养基的体积比为1:1。

实施例2NK细胞表明抗原检测

取1～3×10⁶个细胞进行流式检测：取细胞悬液用含5％FBS的PBS清洗两遍，并用含有10％FBS的PBS重悬；将重悬的细胞液分成两管细胞：其中一管(样品组)加入2.5uLCD3、CD56的抗体，充分混匀；另一管(对照组)添加同型对照抗体。同时避光孵育30min，孵育完毕后用10％FBS的PBS洗两遍，并用1640基础培养基重悬。将各组细胞液通过流式仪检测CD3^-、CD56⁺的细胞含量。检测结果如图1。

从图1流式结果来看，本发明方法所扩增出来的NK细胞(CD3^-、CD56⁺)含量达90.1％；上述数据说明了本发明方法能稳定的扩增出NK细胞，且获得的NK细胞纯度高。

实施例3NK细胞的数量获取及活力检测

按照本发明方法、专利申请号为CN201710876924.1的方法、专利申请号为CN201610905270.6的方法，对等量的PBMC细胞进行培养，统计最终的NK的数量并检测其细胞存活率。

检测方法为：分别调整各方法得到的细胞密度为1×10⁶cell/mL。按细胞悬液：0.4％台盼蓝＝3:1(v:v)充分混匀，取20μL细胞混匀液加入细胞计数板中，用Countstar细胞计数器进行细胞活率及数量检测。结果如表1。

表1不同方法进行NK细胞培养的结果

从上表可知，本发明的细胞均能扩增至2.25×10⁹cells以上，细胞活率在95％以上；专利(CN201710876924.1)的细胞数量仅有本发明的1/2左右，细胞活率同样在95％左右；专利(CN201610905270.6)的细胞扩增数量更低，仅在1.0×10⁹cells左右，细胞活率90.0％以下；由此可见，本发明相对于现有技术的方法，培养得到的NK细胞无论细胞数量和细胞存活率均更佳。

进一步检测本发明细胞的杀伤效果，步骤如下：

(1)分别收集实施例2中三种不同方法培养的NK细胞，重悬于1640培养基中，并调整其密度，得到密度分别为4×10⁶cells/mL、2×10⁶cells/mL和1×10⁶cells/mL的细胞悬液；

(2)培养并收集HL60细胞调整其密度至1×10⁵/mL；

(3)将细胞加入96孔板中，分为实验组、效应对照组、靶细胞对照组和阳性对照组；实验组为50μL效应细胞+50μL靶细胞(每种方法培养的细胞的每个浓度分别试验)；效应细胞对照组为50μL效应细胞+50μL培养基，阳性对照组、靶细胞对照组为50μL效应细胞+50μL培养基；

(4)混匀各孔细胞；250g，离心4min；

(5)将96孔板放入培养箱培养3小时15分钟；

(6)取出96孔板，阳性对照组中加入10μL细胞裂解液(10×)，放回培养箱继续培养45分钟；

(7)取出96孔板，400g，离心5min，各孔取50μL上清液分别转移至酶标板对应的反应孔中；

(8)各反应孔中分别加入50μL反应酶，混匀，室温避光反应30min后各反应孔分别加入50μL终止液终止反应；

(9)上机，酶标仪设置震板20s，检测490nm时各孔的吸光值；

(10)按照下列公式计算得出各孔细胞的杀伤率：

杀伤率％＝(各实验孔细胞吸光度-效应细胞对照组吸光度-靶细胞对照组吸光度)/(阳性对照组吸光度-靶细胞对照组吸光度)×100％

不同培养方法得到的NK细胞的杀伤率测试结果如图2～4。

从图2～4的杀伤结果可知，本发明的细胞效靶比40：1、20：1、10：1时，杀伤率分别为60.74％、46.14％、34.89％；相同效靶比下，均高于专利(CN201710876924.1)和专利(CN201610905270.6)的细胞杀伤率；由此可见，本发明相对于现有技术的方法，培养得到的NK细胞杀伤性更佳。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种细胞培养基，其特征在于，所述培养基为含有体积百分比为5～20％的灭活血浆，以及500～1500U/mL IL-2的ALyS505NK-AC培养基。

2.如权利要求1所述培养基，其特征在于，所述培养基中IL-2的浓度为1000U/mL。

3.如权利要求1所述培养基，其特征在于，所述灭活血浆的制备方法为：将血样于2000rpm离心15min，吸取上层血浆至新的离心管中；密封好置于56℃灭活20～50min；2500～3500rpm离心15min，取上层溶液即为所述灭活血浆。

4.如权利要求1所述培养基在诱导PBMC分化成NK细胞的用途。

5.一种NK细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)在培养容器中孵育15～20min的Lymactin-NK抗体，然后丢弃Lymactin-NK抗体液；

2)在步骤1)所述的容器中加入如权利要求1所述的培养基，并将PBMC接种于所述培养基中，该操作时间计为第0天；

3)于第3、5天进行补液，补加含有500～1500U/mL IL-2的ALyS505NK-AC培养基；

4)在第7天进行补液，补加含有500～1500U/mL IL-2的ALyS505NK-EX培养基；

5)在第9、11天进行补液，补加含有1000U/mLIL-2的ALyS505NK-EX培养基，即得到NK细胞。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤2)PBMC的接种密度不低于1×10⁶cells/mL。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述培养基中的灭活血浆与所述PBMC来源于同一供体。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括利用ficoll密度梯度离心法分离血样中PBMC的过程。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述血样为外周血。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述ficoll密度梯度离心法分离血样中PBMC的过程如下：

1)抽取外周血30mL，2000rpm离心15min；

2)吸取离心后的血样的下层血细胞层，并用一次性移液管加入等量生理盐水稀释，混合均匀；

3)另取新的离心管，加入淋巴细胞分离液，并将稀释后的下层血细胞溶液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面，所述下层血细胞溶液：淋巴分离液的体积比为1:1；

4)2000rpm，离心15min；

5)离心后将上层含有PBMC层液体吸出，转移至另一支离心管中，注意不要将红细胞层一并吸出；

6)用一次性移液管加RPMI 1640培养基重悬PBMC，500g离心5min，弃上清，即得所述PBMC。

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