CN106350487A - 联合制备car‑nk细胞和car‑nkt细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种联合制备CAR‑NK细胞和CAR‑NKT细胞的方法，该方法包括以下步骤：1)将外周血单个核细胞加入细胞培养基中，预活化其中的NK细胞和NKT细胞，再选择性体外活化扩增NK细胞和NKT细胞；2)用携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体转导步骤1)所得混合细胞。该方法使用健康供者的NK和NKT可以进行标准化和批量化制备；另外本申请中NK细胞和NKT细胞的纯度无需纯化即可分别达到60％和30％以上，因此可以避免预先纯化；使用该方法联合制备的CAR‑NK细胞和CAR‑NKT细胞可通过临床用药来控制其在体内的活化增殖程度及存续时间。

Description

联合制备CAR-NK细胞和CAR-NKT细胞的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种联合制备CAR-NK细胞和CAR-NKT细胞的方法。
背景技术
B细胞恶性肿瘤包括多种类型的异质性肿瘤，如：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(B-ALL)和慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)等。B细胞恶性肿瘤的治疗包括化疗、放疗、骨髓移植以及外周血干细胞移植等，但大多数患者仍无法治愈。
CAR-T技术全称是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，其中CAR表示Chimeric antigenreceptor，即嵌合抗原受体。该技术是通过嵌合抗原受体的基因修饰的T细胞来抵抗肿瘤细胞，其将抗原受体对肿瘤抗原的高亲和性和T细胞的杀伤机制结合在一起，可通过携带特定抗原受体基因的载体转染T淋巴细胞而获得。嵌合抗原受体可以特异性识别肿瘤相关抗原靶点，识别结合后将激活增殖T细胞的信号传递至胞内，引起T细胞激活和增殖，从而有效杀伤肿瘤细胞。CAR-T主要由两部分构成：负责抗原特异性识别的胞外抗体部分和负责细胞持续激活的胞内区域，胞内区域在胞外抗体部分和靶抗原结合后能启动细胞活化所必需的信号。Sadelain等将包含CD28信号传导区的CAR-T细胞回输给患者后，5位复发的B-ALL患者体内白血病细胞被快速清除，病情得到了完全缓解；在16例复发或难治的B-ALL患者参与的临床试验中，完全缓解的患者比例也高达88％。Rosenberg用CAR-T细胞进行的临床试验中，8位晚期的血液恶性肿瘤患者(4位B-CLL和4位淋巴瘤患者)在回输CAR-T细胞后，有6位患者病情出现缓解，其中4位患者获得了长期缓解；在对21例ALL和NHL患者开展的临床试验中，13例CD19阳性患者病情得到了完全缓解。
当前CAR-T制备主要采集的是患者自身的T细胞，自体CAR-T疗法是一种“个性化”疗法，细胞制品仅适用于患者自身，只能“个性化”定制，对于自体CAR-T产品的商业化来说，产品质量的“标准化”和产品生产的“批量化”是其亟待解决的两大瓶颈，这些瓶颈的突破可能需要借助于异体CAR-T产品。但目前的技术中异体CAR-T的转导效率还不是很高，并且使用异体CAR-T还存在着很大的免疫排斥的危险。同时用于制备CAR-T的来自PBMCs的T细胞中包含有不同的T细胞亚群，其中真正用于制备CAR-T的CD8+T细胞的比例往往很低，严重影响CAR-T的疗效。另外CAR-T临床应用上往往会出现极其严重的致死性细胞因子风暴，因此寻求一种可替代CAR-T的更安全可靠的CAR技术便显得更加重要。
CD19是一个分子量为95kDa的糖蛋白，其表达于B淋巴细胞发育的早期至晚期的浆细胞阶段。CD19的表达仅限于B细胞，包括B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、ALL、CLL、毛细胞白血病以及一部分急性髓细胞白血病的癌细胞上，因此CD19是一个很理想的免疫治疗靶点。在大多数的正常组织表面不表达CD19，多能造血干细胞也不表达CD19，这就意味着CD19是一个引发自体免疫疾病风险小和不可逆骨髓毒性低的安全靶标。
NK细胞为CD3-CD56+的淋巴细胞，属于固有免疫应答细胞，其对肿瘤细胞的杀伤活性不受细胞MHC限制，能快速溶解靶细胞。NK与CD8+细胞毒性T淋巴细胞不同，其抗肿瘤杀伤毒性不需要事先致敏，并且可消除MHC-I阴性的肿瘤细胞。NK和NKT细胞对肿瘤的杀伤无特异性，对不同个体的不同类型的肿瘤杀伤具有普适性。但体内自体NK细胞对肿瘤的杀伤也存在着耐受性，因此通常使用体外活化的自体NK细胞，同种异体NK细胞，基因修饰的NK细胞，以更好的提高NK细胞的抗肿瘤效应。体内、体外实验证明了CAR-NK在抗多发性骨髓瘤和胶质母细胞瘤具有显著作用。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种联合制备CAR-NK细胞和CAR-NKT细胞的方法。通过体外特异性的活化扩增外周血PBMC中的NK和NKT细胞，该方法可以在不需要纯化T细胞的情况下获得高纯度的、用于给携带有嵌合抗原受体的基因序列的重组慢病毒载体转导的、包含NK细胞和NKT细胞的混合细胞(以下简称NK/NKT细胞)，既步骤简单又可节约昂贵的纯化成本；并且该方法可同时制备包含CAR-NK细胞和CAR-NKT细胞的混合细胞(以下简称CAR-NK/NKT细胞)，不管是转导成功的CAR-NK细胞和CAR-NKT细胞还是一小部分未转导成功的NK细胞和NKT细胞都是非MHC限制性的识别和杀伤肿瘤，而不会像αβT那样因MHC限制性而产生免疫排斥反应，因此CAR-NK/NKT可非“个性化”的提前大规模制备并满足不同个体的需要；另外CAR-NK/NKT安全有效且作用温和不会产生严重的细胞因子风暴。使用该方法制备的CAR-NK/NKT细胞可用于B细胞白血病和淋巴瘤的靶向治疗。
本发明的具体技术方案如下：
一种联合制备CAR-NK细胞和CAR-NKT细胞的方法，包括以下步骤：
1)从患者的自体外周血、健康供者的外周血或婴儿脐带血中分离得到外周血单个核细胞(PBMC)；将所得外周血单个核细胞加入可用于淋巴细胞、树突状细胞或DC细胞的无血清细胞培养基中，再全部转移到培养瓶中，所述培养瓶含滋养细胞或是被抗CD16单克隆抗体或抗CD52单克隆抗体包被，在所述培养瓶中进行外周血单个核细胞中的NK细胞和NKT细胞的预活化，之后再加入IL-2和/或IL-15进行NK细胞和NKT细胞的选择性体外活化扩增，得到包含NK细胞和NKT细胞的混合细胞(以下简称NK/NKT细胞)；
2)用携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体转导步骤1)所得包含NK细胞和NKT细胞的混合细胞，即得包含CAR-NK细胞和CAR-NKT细胞的混合细胞(以下简称CAR-NK/NKT细胞)，其中嵌合抗原受体与靶向表面抗原可特异性结合。
上述方法在另一种实现方式中，采用人淋巴细胞分离液从患者的自体外周血、健康供者的外周血或婴儿脐带血中分离得到外周血单个核细胞，人淋巴细胞分离液可采用GE公司的Ficoll paque plus或Ficoll paque premium。
上述方法在另一种实现方式中，所述无血清细胞培养基选自德国Cellgenix公司的cellgrowSCGM，日本TAKARA公司的GT-T551H3，日本KOHJIN公司的KBM581，美国GIBCO公司的AIM-V、瑞士LONZA公司的X-Vivo15中的一种或几种。
上述方法在另一种实现方式中，将所得外周血单个核细胞加入可用于淋巴细胞、树突状细胞或DC细胞的无血清细胞培养基中，使外周血单个核细胞在无血清细胞培养基中的浓度为(1-9)×106个/ml。
上述方法在另一种实现方式中，预活化前所述无血清细胞培养基中还加入血浆，使血浆在无血清细胞培养基中的浓度为2-10％，且所述血浆与外周血单个核细胞来自于同一血液供体。即如果外周血单个核细胞来源于某一特定患者的外周血，血浆也来源于该特定患者的外周血；如果外周血单个核细胞来源于血库中某一健康供者的外周血，血浆也来源该健康供者的外周血；如果外周血单个核细胞来源于血库中某一婴儿脐带血，血浆也来源于该婴儿脐带血。本申请方法中使用的每份从血库获得的健康供者的外周血和从血库获得的婴儿脐带血都是采集单个供体的。
上述方法在另一种实现方式中，用于包被培养瓶的抗CD16单克隆抗体的浓度为18-25μg/ml，优选20μg/ml；用于包被培养瓶的抗CD52单克隆抗体的浓度为8-15μg/ml，优选10μg/ml，更优选的是抗CD52单克隆抗体与8-12ng/ml，优选10ng/ml的抗CD3单克隆抗体联用；所述滋养细胞在无血清细胞培养基中的浓度为(1-5)×105个/ml。
上述方法在另一种实现方式中，预活化后加入IL-2使其在细胞培养基中的浓度为300-2000U/ml，优选为1000U/ml，并加入IL-15使其在细胞培养基中的浓度为10-50ng/ml。
上述方法在另一种实现方式中，NK细胞和NKT细胞的选择性体外活化扩增中，每隔2-3天补充新鲜得所述无血清细胞培养基、血浆、IL-2和/或IL-15，以保证其在体系中浓度。
上述方法在另一种实现方式中，所述预活化、选择性体外活化扩增的条件均为在37℃、5％二氧化碳的培养箱中进行。
上述方法在另一种实现方式中，预活化12-36h后加入IL-2和IL-15，选择性体外活化扩增NK细胞和NKT细胞7天以上。当体外活化扩增7天后，NK细胞和NKT细胞的比例可分别达到60％和30％以上。
上述方法在另一种实现方式中，所述携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体是通过以下步骤构建的：采用全基因合成的方法合成可与靶向表面抗原特异性结合的嵌合抗原受体的基因序列，将该嵌合抗原受体基因序列亚克隆到慢病毒表达载体中，载体经测序验证序列准确无突变后，得到携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体，即重组慢病毒载体。
上述方法在另一种实现方式中，所述靶向表面抗原为CD19，与CD19特异性结合的嵌合抗原受体的基因序列如SEQ ID:1所示，与CD19特异性结合的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID:2所示，，氨基酸序列SEQ ID:2是基因序列SEQ ID:1经转录翻译所得。
上述方法在另一种实现方式中，所述慢病毒表达载体为美国SBI公司的pCDH载体，如:pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro。
上述方法在另一种实现方式中，重组慢病毒载体在进行转导前还需要进行扩增以方便转导中的大规模使用，重组慢病毒载体的扩增方法为：
包被病毒颗粒：1)在HEK293T新鲜培养基中培养HEK293T细胞，24h细胞密度达到90％左右；2)在100mm平板中，向上述HEK293T细胞中加入10μg所得重组慢病毒、5μg PLP1、5μg PLP2，5μg PLP/VSVG,75μl转染试剂Lipofectamine 2000，按照PLP1、PLP2和PLP/VSVG的说明书以及转染试剂Lipofectamine 2000的说明书进行操作；3)4hr后除去含转染试剂的HEK293T培养基，加入10ml HEK293T新鲜培养基；4)37℃孵育48h，收集含病毒颗粒的上清，并对上清进行4℃、2000×g的离心10min，除去细胞碎片，得到上清；
超速法浓缩病毒颗粒：1)超速离心“包被病毒颗粒”步骤所得上清，4℃、60000×g离心150min后弃上清，将离心管口倒置除去残留培养基；2)用普通培养基重悬病毒颗粒；3)操作完成后，将含病毒的离心管冰上放置3h；4)病毒上清以0.1～1ml体积进行分装，-80度冻存。
上述方法在另一种实现方式中，重组慢病毒载体转导步骤1)所得NK/NKT细胞的具体步骤为：收集NK/NKT细胞，调整NK/NKT细胞的浓度至5×106个/ml，重组慢病毒载体和NK/NKT细胞以1:4的体积比混合静置6-12h；收集细胞并用PBS缓冲液清洗，换可用于淋巴细胞、树突状细胞或DC细胞的新鲜无血清细胞培养基保持72小时。之后可以使用流式细胞免疫荧光染色，分析转导效率。
上述方法在另一种实现方式中，该方法还包括对CAR19-NK/NKT细胞的体外抗肿瘤活性进行试验验证的步骤：以转导后所得CAR19-NK/NKT细胞作为效应细胞，以表达CD19的Raji肿瘤细胞作为靶细胞进行毒杀伤试验验证，体外采用cytotox96试剂盒检测细胞毒杀伤效果，按照不同的效靶比，建立CAR-NK/NKT细胞与靶向肿瘤细胞的共培养体系，检测培养基上清中由被裂解的肿瘤细胞释放的LDH含量，以此反应CAR-NK/NKT细胞在体外杀伤肿瘤细胞的能力。当效靶比E:T＝5：1时，对CD19+Raji细胞杀伤效率＞70％为合格。
上述方法在另一种实现方式中，CAR19-NK/NKT细胞的体外抗肿瘤活性验证合格后还包括将CAR-NK/NKT细胞在体外进一步扩增的步骤，当扩增到一定细胞数量时，即可回输给患者发挥抗肿瘤作用，CAR-NK/NKT细胞在体外进一步扩增的方法与步骤1)中选择性体外活化扩增的方法相同；如：加入到可用于淋巴细胞、树突状细胞或DC细胞的无血清细胞培养基中，调整细胞浓度为2×106个/ml，加入终浓度为1000U/ml的IL-2、终浓度为10ng/ml的IL-15和终浓度为10％的血浆，于37℃和5％的二氧化碳培养箱中继续培养，每隔2-3天补充新鲜的无血清细胞培养基、IL-2、IL15及血浆,以保持其各自的浓度。
上述方法在另一种实现方式中，CAR-NK/NKT细胞在体外进一步扩增至细胞数量达到(1-20)×107个/ml时还包括进行细胞质控检测的步骤：细胞活力＞90％且细菌、真菌、支原体和内毒素检结果为阴性，视为合格。
上述方法在另一种实现方式中，细胞质控检测合格后还包括以下步骤：开始收集细胞，用生理盐水1500rpm×10min离心洗涤一次，弃掉上清，然后用100ml生理盐水悬浮细胞并加入终浓度为1％的人血白蛋白。
然后交给医护人员给患者回输到体内，回输到患者体内的CAR19-NK/NKT细胞可以直接发挥抗肿瘤作用；也可以在体外，在IL-2、IL-15等细胞因子作用下继续活化扩增持续具有抗肿瘤作用。
上述方法在另一种实现方式中，还包括使用流式细胞分析检测重组CAR-NK/NKT细胞表面的嵌合抗原受体表达水平的步骤。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明采用体外特异性活化扩增技术使PBMC中的NK细胞和NKT细胞得到优势活化扩增，经过活化扩增后混合细胞中NK细胞的纯度可达60％以上，NKT纯度可达30％以上，因此在用携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体转导之前不需要预先纯化免疫细胞NK细胞和NKT细胞，省时省力又可节约昂贵的纯化成本。
2.本发明可同时制备CAR-NK细胞和CAR-NKT细胞，因为NK细胞和NKT细胞是自身固有免疫细胞而且是非MHC限制性的识别和杀伤肿瘤，不管是转导成功的CAR-NK/NKT细胞还是小部分未转导成功的NK细胞和NKT细胞，都不会像αβT那样因MHC限制性个体不同而产生免疫排斥反应，因此CAR-NK/NKT细胞对不同个体的不同肿瘤类型均有普适性，可提前大规模制备并满足不同个体的需求；当然针对CD19制备获得的CAR19-NK/NKT细胞还具有CAR-T对肿瘤杀伤的靶向性，对CD19+的恶性肿瘤杀伤更有效。
3.针对CD19制备获得的CAR19-NK/NKT在体内一般存活2周以上，不需要抗原介导活化，也不会在体内长期存在，因此抗肿瘤作用不仅有效而且更安全，不会引起严重的细胞因子风暴和肿瘤溶解综合症等副作用。
4、特殊转导技术转导慢病毒载体也大大提高了转导效率，另外CAR19-NK/NKT细胞在体内外通过细胞因子或滋养细胞的刺激还可进一步扩增，发挥持续的抗肿瘤作用。
附图说明
图1从左到右分别是实施例1中PBMC预活化前NK细胞和NKT细胞的免疫表型分析，选择性体外活化扩增7天后NK细胞和NKT细胞的免疫表型分析和重组慢病毒载体转导后所得CAR19-NK细胞和CAR19-NKT细胞的免疫表型分析，同时具备CD3-CD16+CD56+为NK细胞或CAR19-NK细胞，同时具备CD3+CD56+为NKT细胞或CAR19-NKT细胞；
图2从左到右分别是实施例2中PBMC预活化前NK细胞和NKT细胞的免疫表型分析，选择性体外活化扩增7天后NK细胞和NKT细胞的免疫表型分析和重组慢病毒载体转导后所得CAR19-NK细胞和CAR19-NKT细胞的免疫表型分析，同时具备CD3-CD16+CD56+为NK细胞或CAR19-NK细胞，同时具备CD3+CD56+为NKT细胞或CAR19-NKT细胞；
图3从左到右分别是实施例3中PBMC预活化前NK细胞和NKT细胞的免疫表型分析，选择性体外活化扩增7天后NK细胞和NKT细胞的免疫表型分析和重组慢病毒载体转导后所得CAR19-NK细胞和CAR19-NKT细胞的免疫表型分析，同时具备CD3-CD16+CD56+为NK细胞或CAR19-NK细胞，同时具备CD3+CD56+为NKT细胞或CAR19-NKT细胞；
图4是实施例1-3中所得CAR19-NK/NKT细胞和NK/NKT细胞对CD19+Raji细胞体外杀伤实验的效果对比图，图中每个实施例左边的柱状代表CAR19-NK/NKT细胞的杀伤效果，每个实施例右边的柱状代表NK/NKT细胞的杀伤效果。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
在GMP实验室的超净工作台内用人淋巴细胞分离液Ficoll paque plus(GE)从健康供者的80ml外周血中分离得到PBMC并计数，PBMC培养前取少量样品进行免疫表型分析，参见图1；将PBMC悬浮后加入到含有10％血浆(血浆与外周血来自于同一健康供者)的无血清细胞培养基AIM-V(美国GIBCO公司)中，将细胞浓度用上述含有血浆的无血清细胞培养基调整至2×106个/ml，再全部转入到被20μg/ml的抗CD16单克隆抗体包被的培养瓶中，于37℃、5％二氧化碳的培养箱中预活化NK细胞和NKT细胞，预活化24h后加入IL-2使其在无血清细胞培养基中的浓度为1000U/ml，并加入IL-15使其在无血清细胞培养基中的浓度为10ng/ml，继续于37℃、5％二氧化碳的培养箱中选择性体外活化扩增NK/NKT细胞，以后每隔2-3天补充新鲜培养基、血浆、IL-2和IL-15使其保持浓度，经过7天的选择性体外活化扩增后NK细胞的比例达到56.30％，NKT细胞的比例达到22.31％，参见图1；携带有可与CD19特异性结合的嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体转导活化后的NK/NKT细胞，NK细胞和NKT细胞的转导效率分别为37.74％和18.32％，参见图1；CAR19-NK/NKT对CD19+靶细胞Raji细胞毒实验，当效靶比E:T＝5：1时，对靶细胞的杀伤为75％，如图4所示；CAR19-NK/NKT细胞体外进一步扩增，即：将CAR19-NK/NKT细胞加入到含有10％血浆(血浆与外周血来自于同一健康供者)的无血清细胞培养基AIM-V(美国GIBCO公司)中，将细胞浓度调整至2×106个/ml，加入终浓度为1000U/ml的IL-2和终浓度为10ng/ml的IL-15，于37℃和5％的二氧化碳培养箱中继续培养，每隔2-3天补充新的无血清细胞培养基、IL-2、IL-15及血浆使其保持浓度；当CAR19-NK/NKT细胞数量达到(1-20)×107时；进行CAR19-NK/NKT质量控制检测，细胞活力＞90％且细菌、真菌、支原体和内毒素检测皆为阴性为合格；合格后离心洗涤收集CAR19-NK/NKT细胞，用50ml氯化钠注射液和含有1％的人血白蛋白悬浮细胞装于输液袋中并贴上标签；回输前患者化疗预处理，回输治疗及疗效监测和副作用处理。
实施例1：活化扩增前后及重组慢病毒表达载体转导后的流式检测结果
实施例2
在GMP实验室的超净工作台内用人淋巴细胞分离液Ficoll paque premium(GE)从健康供者的80ml外周血中分离得到PBMC并计数，PBMC培养前取少量样品进行免疫表型分析，参见图2；将PBMC悬浮后加入到含有10％血浆(血浆与外周血来自于同一健康供者)的无血清细胞培养基AIM-V(美国GIBCO公司)中，将细胞浓度用上述含有血浆的无血清细胞培养基调整至2×106个/ml，再全部转入到被10ng/ml的抗CD3单克隆抗体和10μg/ml的抗CD52单克隆抗体共同包被的培养瓶中，于37℃、5％二氧化碳的培养箱中预活化NK细胞和NKT细胞，预活化24h后加入IL-2使其在无血清细胞培养基中的浓度为1000U/ml并加入IL-15使其在无血清细胞培养基中的浓度为10ng/ml，继续于37℃、5％二氧化碳的培养箱中选择性体外活化扩增NK/NKT细胞，以后每隔2-3天补充新鲜培养基、血浆、IL-2和IL-15使其保持浓度，，经过7天的选择性体外活化扩增后NK细胞的比例可达到63.35％，NKT细胞的比例达到29.60％，参见图2；携带有可与CD19特异性结合的嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体转导活化后的NK/NKT细胞，NK细胞和NKT细胞的转导效率分别为38.27％和20.80％，参见图2；CAR19-NK/NKT对CD19+靶细胞Raji细胞毒实验，当效靶比E:T＝5：1时，对靶细胞的杀伤达到83％，如图4所示；CAR19-NK/NKT细胞体外进一步扩增，即：将CAR19-NK/NKT细胞加入到含有10％血浆(血浆与外周血来自于同一健康供者)的无血清细胞培养基AIM-V(美国GIBCO公司)中，将细胞浓度调整至2×106个/ml，加入终浓度为1000U/ml的IL-2和终浓度为10ng/ml的IL-15，于37℃和5％的二氧化碳培养箱中继续培养，每隔2-3天补充新的无血清细胞培养基、IL-2、IL-15及血浆使其保持浓度；当CAR19-NK/NKT细胞数量达到(1-20)×107时，进行CAR19-NK/NKT质量控制检测，细胞活力＞90％且细菌、真菌、支原体和内毒素检测皆为阴性为合格；合格后离心洗涤收集CAR19-NK/NKT细胞，用50ml氯化钠注射液和含有1％的人血白蛋白悬浮细胞装于输液袋中并贴上标签；回输前患者化疗预处理；回输治疗和疗效监测副作用处理。
实施例2：活化扩增前后及重组慢病毒表达载体转导后的流式检测结果
实施例3
在GMP实验室的超净工作台内用人淋巴细胞分离液Ficoll paque premium(GE)从健康供者的80ml外周血中分离得到PBMC并计数，PBMC培养前取少量样品进行免疫表型分析，参见图3；将PBMC悬浮后加入到含有10％血浆(血浆与外周血来自于同一患者)的无血清细胞培养基AIM-V(美国GIBCO公司)中，将细胞浓度用上述含有血浆的无血清细胞培养基调整至2×106个/ml，再全部转入至培养瓶内，再在培养瓶中加入滋养细胞K562-4-1BB-Mil-21(购自友康生物)使其在无血清细胞培养基的终浓度为1×105个/ml于37℃、5％二氧化碳的培养箱中预活化NK细胞和NKT细胞，预活化24h后加入IL-2使其在无血清细胞培养基中的浓度为1000U/ml，并加入IL-15使其在无血清细胞培养基中的浓度为10ng/ml，继续于37℃、5％二氧化碳的培养箱中选择性体外活化扩增NK/NKT细胞，以后每隔2-3天补充新鲜培养基、血浆、IL-2和IL-15使其保持浓度，经过7天的选择性体外活化扩增后NK细胞的比例可达到61.90％，NKT细胞的比例可达到30.03％，参见图3；携带有可与CD19特异性结合的嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体转导活化后的NK/NKT细胞，NK细胞和NKT细胞的转导效率分别为34.41％和21.57％，参见图3；CAR19-NK/NKT对CD19+靶细胞Raji细胞毒实验，当效靶比E:T＝5：1时，对靶细胞的杀伤为73％，如图4所示；CAR19-NK/NKT细胞体外进一步扩增，即：将CAR19-NK/NKT细胞加入到含有10％血浆(血浆与外周血来自于同一健康供者)的无血清细胞培养基AIM-V(美国GIBCO公司)中，将细胞浓度调整至2×106个/ml，加入终浓度为1000U/ml的IL-2和终浓度为10ng/ml的IL-15，于37℃和5％的二氧化碳培养箱中继续培养，每隔2-3天补充新的无血清细胞培养基、IL-2、IL-15及血浆使其保持浓度；当CAR19-NK/NKT细胞数量达到(1-20)×107时，进行CAR19-NK/NKT质量控制检测，细胞活力＞90％且细菌，真菌，支原体和内毒素检测皆为阴性为合格；合格后离心洗涤收集CAR19-NK/NKT细胞，用50ml氯化钠注射液和含有1％的人血白蛋白悬浮细胞装于输液袋中并贴上标签；回输前患者化疗预处理；回输治疗和疗效监测副作用处理。
实施例3：活化扩增前后及重组慢病毒表达载体转导后的流式检测结果
实施例4
(1)实施例1-3中携带有可与CD19特异性结合的嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体是通过以下步骤构建的：采用全基因合成的方法合成靶向表面抗原CD19对应的嵌合抗原受体基因，其基因序列如SEQ ID:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID:2所示，将该嵌合抗原受体基因亚克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro(SBI公司)中，载体经测序验证序列准确无突变后，得到携带有嵌合抗原受体基因的慢病毒表达载体，即重组慢病毒。
(2)实施例1-3中将上述所得重组慢病毒进行扩增以用于大量的转导实验，方法如下：
一、包被病毒颗粒：1)在HEK293T新鲜培养基中培养HEK293T细胞，24h细胞密度达到90％左右；2)在100mm平板中，向上述HEK293T细胞中加入10μg所得重组慢病毒、5μgPLP1、5μg PLP2，5μg PLP/VSVG,75μl转染试剂Lipofectamine 2000，按照PLP1、PLP2和PLP/VSVG的说明书以及转染试剂Lipofectamine 2000的说明书进行操作；3)4hr后除去含转染试剂的HEK293T培养基，加入10ml HEK293T新鲜培养基；4)37℃孵育48h，收集含病毒颗粒的上清，并对上清进行4℃、2000×g的离心10min，除去细胞碎片，得到上清；
二、超速法浓缩病毒颗粒：1)超速离心步骤一所得上清，4℃、60000×g离心150min后弃上清，将离心管口倒置除去残留培养基；2)用普通培养基重悬病毒颗粒；3)操作完成后，将含病毒的离心管冰上放置3h；4)病毒上清以0.5ml体积进行分装，-80度冻存。
(3)实施例1-3中重组慢病毒转导NK/NKT细胞的方法为：收集NK/NKT细胞，调整NK/NKT细胞的浓度至5×106个/ml，扩增后的重组慢病毒和NK/NKT细胞以1:4的体积比混合静置8h；收集细胞并用PBS缓冲液清洗，换可用于淋巴细胞、树突状细胞或DC细胞的新鲜细胞培养液后保持72小时。之后可以使用流式细胞免疫荧光染色，分析转导效率。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种联合制备CAR-NK细胞和CAR-NKT细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)从患者的自体外周血、健康供者的外周血或婴儿脐带血中分离得到外周血单个核细胞(PBMC)；将所得外周血单个核细胞加入可用于淋巴细胞、树突状细胞或DC细胞的无血清细胞培养基中，再全部转移到培养瓶中，所述培养瓶含滋养细胞或所述培养瓶被抗CD16单克隆抗体或抗CD52单克隆抗体包被，在所述培养瓶中进行外周血单个核细胞中的NK细胞和NKT细胞的预活化，之后再加入IL-2和/或IL-15进行NK细胞和NKT细胞的选择性体外活化扩增，得到包含NK细胞和NKT细胞的混合细胞；
2)用携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体转导步骤1)所得包含NK细胞和NKT细胞的混合细胞，即得包含CAR-NK细胞和CAR-NKT细胞的混合细胞，其中嵌合抗原受体与靶向表面抗原可特异性结合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述所述无血清细胞培养基选自德国Cellgenix公司的cellgrowSCGM，日本TAKARA公司的GT-T551H3，日本KOHJIN公司的KBM581，美国GIBCO公司的AIM-V、瑞士LONZA公司的X-Vivo15中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所得外周血单个核细胞加入可用于淋巴细胞、树突状细胞或DC细胞的无血清细胞培养基中，使外周血单个核细胞在无血清细胞培养基中的浓度为(1-9)×106个/ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，预活化前所述无血清细胞培养基中还加入血浆，使血浆在无血清细胞培养基中的浓度为2-10％，且所述血浆与外周血单个核细胞来自于同一血液供体。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于包被培养瓶的抗CD16单克隆抗体的浓度为18-25μg/ml，优选20μg/ml；用于包被培养瓶的抗CD52单克隆抗体的浓度为8-15μg/ml，优选10μg/ml，更优选的是抗CD52单克隆抗体与8-12ng/ml，优选10ng/ml的抗CD3单克隆抗体联用；所述滋养细胞在无血清细胞培养基中的浓度为(1-5)×105个/ml。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，预活化后加入IL-2使其在细胞培养基中的浓度为300-2000U/ml并加入IL-15使其在细胞培养基中的浓度为10-50ng/ml。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预活化、选择性体外活化扩增的条件均为在37℃、5％二氧化碳的培养箱中进行；优选的预活化12-36h后加入IL-2和IL-15，选择性体外活化扩增NK细胞和NKT细胞7天以上。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶向表面抗原为CD19。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，可与CD19特异性结合的嵌合抗原受体的基因序列如SEQ ID:1所示，优选的可与CD19特异性结合的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQID:2所示。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体转导步骤1)所得包含NK细胞和NKT细胞的混合细胞的具体步骤为：收集包含NK细胞和NKT细胞的混合细胞，调整包含NK细胞和NKT细胞的混合细胞的浓度至5×106个/ml，携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体和混合细胞以1:4的体积比混合静置6-12h；收集细胞并用PBS缓冲液清洗，换可用于淋巴细胞、树突状细胞或DC细胞的新鲜无血清细胞培养基保持72小时。
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