CN108300698A - 一种car-nk细胞及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种CAR‑NK细胞及其制备方法与应用，包括：S1：合成CAR序列；S2：将其整合进慢病毒目的载体质粒中，得到目的质粒；S3：将目的质粒与293T细胞混合并进行培养，收集病毒液，浓缩，得目的质粒的病毒浓缩液；S4：收集自体血浆以及外周血单个核细胞PBMC，用活化培养基调整细胞密度并进行细胞培养；转移到新的细胞培养袋中继续培养，并补充增殖培养基；培养完毕后得到NK细胞；S5：在NK细胞中加入目的质粒的病毒浓缩液进行孵育，得到CAR‑NK细胞。本发明的CAR‑NK细胞具有非常强的因子分泌能力和抑瘤能力，且制备CAR‑NK细胞的转染方法高效、稳定。

Description

一种CAR-NK细胞及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种CAR-NK细胞及其制备方法与应用。
背景技术
自然杀伤细胞(Nature killer cell,NK细胞)是一种机体内重要的天然免疫系统淋巴细胞。其表型一般为CD3-CD16+CD56+，主要来源于骨髓CD34+淋巴细胞。NK细胞不受MHC的限制，无需抗原致敏即可以识别并且杀伤肿瘤细胞。同时，NK细胞可以分泌多种细胞因子来调节获得性免疫应答，是连接固有免疫应答和获得性免疫应答的桥梁，所以NK细胞在抗肿瘤和抗病毒感染的免疫应答中起重要作用，被称为人类健康的第一道防线。
NK细胞对肿瘤细胞的识别主要依赖于细胞表面的受体，而不受MHC限制。当识别肿瘤细胞之后，NK细胞通过释放穿孔素和颗粒酶使肿瘤细胞凋亡。除此之外，NK细胞还可以通过TNF凋亡信号通路和抗体依赖的细胞毒作用等多种途径杀伤肿瘤细胞。但是，由于肿瘤逃逸机制的存在，以及患者体内NK细胞数量、质量的下降等原因，NK细胞在体内的抗肿瘤功能未能得到充分发挥。
近年来，嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)修饰的T细胞(CAT-T)在血液肿瘤研究中取得了重大的技术突破，为人类攻克癌症带来了新的希望。但是，CAR-T疗法也存在着一些目前难以克服的问题，比如对实体瘤疗效不显著、细胞因子风暴、脱靶效应、插入突变等。因此，研发新型的具有强大抗肿瘤效应的细胞具有极其重要的理论和应用价值。NK细胞因其特殊的靶细胞识别机制、广谱抗瘤能力等优势，被视为有潜力通过CAR修饰来增强其抗肿瘤效应的细胞。通过CAR修饰NK细胞有望增强其靶向杀伤肿瘤细胞的能力。
CAR修饰NK细胞的目的是通过基因编辑技术来建立一条活化NK细胞的激活通路并增强其靶向抗肿瘤效应。CAR-NK的基本结构框架和转染方式均源于CAR-T。CAR的主要结构同样包括胞外抗原结合区、跨膜区和胞内信号区，这三部分构成的基本结构框架决定了CAR-NK的特异性和功能性。胞外抗原结合区主要由单链可变区片段(Single-chainvariable fragment，scFv)组成，能够识别肿瘤细胞表面表达的肿瘤相关抗原并与其结合，是决定CAR-NK细胞靶向性的关键所在。目前，应用于CAR-T的scFv均可直接应用于CAR-NK，如CD19、Her2、CD20等。跨膜区是将膜外信号传导到细胞内，与CAR-T类似，常用的跨膜区为CD3ζ和CD8的跨膜序列。胞内信号区含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，其组成为D/ExxYxxL/I，是CAR-NK和CAR-T细胞活化信号强弱的关键。当胞外抗原识别区与肿瘤相关抗原相互作用时，ITAM被铬氨酸激酶磷酸化而传递胞外的活化信号。在CAR-T细胞中，CD3ζ胞内信号段是最经典，也是最常用的胞内信号段。目前，CAR-NK中所用到的CAR的结构模式基本沿用的是CAR-T的设计，包括胞外抗原结合区、跨膜区和胞内信号区，未能充分发挥NK细胞的特点。因此，根据NK细胞的特点，有针对性的设计CAR就显得尤为必要。
另一方面，CAR-NK除了基本结构继承了CAR-T外，其转染方式也与CAR-T一致。事实上，NK细胞比T细胞更难以转染。脂质体转染和电穿孔转染的转导效率均不足10％，慢病毒转染的效率为12％～73％，并不稳定。事实上，目前有研究报道一些细胞因子和多肽可以促进慢病毒对NK细胞的转染效率，如IL-15等。
基于以上原因，本发明开发了一种新的CAR-NK细胞的制备方法，有效提高病毒对NK细胞的转染效率，增强CAR-NK的杀瘤能力。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种CAR-NK细胞及其制备方法与应用，以解决了现有技术中的不足。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种CAR-NK细胞的制备方法，所述制备方法包括以下步骤；
S1：以FcεRIγ的胞内信号段作为CAR的胞内信号段，以CD28作为跨膜区，4-1BB为共刺激因子，构建靶向CD19的CAR，并人工合成CAR序列CD19scFv--CD28--4-1BB--FcεRIγ；
S2：将步骤S1中所合成的CAR序列CD19scFv--CD28--4-1BB--FcεRIγ整合进慢病毒目的载体质粒中，得到目的质粒；
S3：取对数生长期的细胞接种于细胞培养皿中；将步骤S2中所得到的目的质粒连同包装质粒和包膜质粒加入所述细胞中包装出病毒，最后收集病毒液，浓缩，检测浓缩病毒的滴度，即得目的质粒的病毒浓缩液；
S4：①取外周血进行离心，收集分离液上层的自体血浆并进行灭活，并收集吸取中间云雾层细胞即分离外周血单个核细胞PBMC，洗涤，将自体血浆与单个核细胞PBMC混合，并用活化培养基调整细胞密度为(1～3)×106个/ml，然后进行细胞培养8～12天；②将①中整个细胞培养体系(包括细胞PBMC、自体血浆与活化培养基等)一起转移到新的细胞培养袋中继续培养4～10天，并在后续培养过程中补充增殖培养基，补充增殖培养基时维持细胞密度为(1～2)×107个/ml；③培养完毕后，检测NK细胞表型，CD3-CD16+CD56+细胞比例达88％，无需分选，直接用于CAR-NK的制备；
S5：取步骤S4中培养完毕后的NK细胞，分别加入步骤S3中所得到的目的质粒的病毒浓缩液，加入改良型的多肽，使其终浓度为20～70ng/μL；然后再37℃孵育4-6h后，收集细胞，600～1000g/min离心4～7min，弃病毒液，PBS洗涤，1640培养基重悬细胞，得到CAR-NK细胞；所述改良型的多肽的序列为：Ac-KKKNWFDWTNWLWYWK-NH2。
进一步地，步骤S2中，所述目的载体质粒为pWPXL-GFP，整合CAR序列后所得的目的质粒记为pWPXL-FcεRIγ。
进一步地，在步骤S3中，所述细胞为293T细胞，该293T细胞的接种于细胞培养皿中的量为(4～6)x106个；然后在步骤S2中所得到的目的质粒中加入CaCl2，得混合液，并将该混合液加入293T细胞中，在培养箱中培养以使慢病毒包装。
进一步地，步骤S3中，慢病毒包装的具体方法为：
(1)取400～500μl ddH2O加入无菌EP管中，并加入目的质粒8～12μg、包装质粒5～8μg和包膜质粒3～4μg；所述目的质粒为pWPXL-FcεRIγ；
(2)缓慢加入45～55μl CaCl2，轻轻混匀，得混合液；然后将含有CaCl2和质粒的混合液加入到2xHBS中，轻轻混匀，室温静置10～20min；
(3)取对数生长期293T细胞(4～6)x106个接种于细胞培养皿中，24h后待细胞融合度达80％时，更换为新鲜的DMEM完全培养基；
(4)将步骤(2)中所得的混合液加入到步骤(3)所得的接种有293T细胞的DMEM完全培养基中，37℃、5％CO2培养箱中培养；
(5)24h后待细胞融合度达80％时，更换为新鲜培养基，继续培养；
(6)48h后收集第一批病毒液，并加入新鲜培养基继续培养；
(7)72h后收集第二批病毒液；
(8)将收集的病毒液置于超滤管中，浓缩，收集病毒浓缩液，-80℃保存备用；
(9)倍数稀释法检测浓缩病毒的滴度。
进一步地，步骤(1)中，所加入的包装质粒为质粒PMD2.G，所述包膜质粒为质粒PSPAX2。
进一步地，步骤S4中，所述活化培养基的配置为：以无血清RPMI1640培养基为基础培养基，往基础培养基中加入抗CD16单克隆抗体、IL-2、抗坏血酸、TGF-β1和胸腺肽，混匀，使抗CD16单克隆抗体、IL-2、抗坏血酸、TGF-β1和胸腺肽在活化培养基中的终浓度分别为60ng/ml、250U/ml、2ng/ml、60ng/ml和2ng/ml；
所述增殖培养基的配置为：以无血清RPMI1640培养基为基础培养基，往基础培养基中加入IL-1α、IL-2、抗坏血酸、IL-21、IL-7和41-BBL。混匀，使IL-1α、IL-2、抗坏血酸、IL-21、IL-7和41-BBL在无血清RPMI1640培养基的终浓度分别为50ng/ml、500U/ml、2ng/ml、60ng/ml、2ng/ml和10ng/ml。
进一步地，步骤S4的①中，培养的天数为10天，在培养的第3、6、8天均补充活化培养基，补充活化培养基时维持细胞密度为1×106个/ml～2×106个/ml，并维持自体血浆在活化培养基培养中的体积百分比为4％。
步骤S4的②中，培养的天数为6天，在培养的第10、12、14天对新的细胞培养袋中补充增殖培养基，补充增殖培养基时维持细胞密度为(1.2～1.7)×107个/ml。
进一步地，步骤S5中，所述目的质粒的病毒浓缩液的滴度为MOI＝30IU/ml；所述改良型的多肽的加入量为使其终浓度为50ng/μL为止。
一种由上述所述的CAR-NK细胞的制备方法所制备的CAR-NK细胞。
一种CAR-NK细胞在CAR-NK细胞的因子分泌能力和抑制肿瘤方面的应用。
本发明至少具有以下有益效果：
本发明给出了一种CAR-NK细胞及其制备方法与应用，①该特定序列以及特定制备方法的CAR-NK细胞具有非常强的CAR-NK细胞的因子分泌能力和抑瘤能力，比CD3ζ显著提高，具有极其重要的临床应用价值；②本发明通过CAR-NK细胞方法上的改进以及对多肽的改进(Ac-KKKNWFDWTNWLWYWK-NH2)，使得本发明制备细胞的转染效率达95％以上，且该转染效率稳定，不会出现忽高忽低的情况，无论转染效率还是稳定性均远远高出现有技术。基于以上两点使得本发明具有极佳的工业应用和临床应用价值。
附图说明
图1是本发明实施例中所述的细胞散射信号图；
图2是本发明实施例所述的以淋巴细胞划门的示意图；
图3是本发明实施例所述的以CD3-细胞划门的示意图；
图4是本发明实施例所述的CD3-CD16+CD56+细胞含量示意图；
图5是本发明实施例所述的多肽终浓度为0ng/μL时的转染效率示意图；
图6是本发明实施例所述的多肽终浓度为5ng/μL时的转染效率示意图；
图7是本发明实施例所述的多肽终浓度为10ng/μL时的转染效率示意图；
图8是本发明实施例所述的本发明的多肽终浓度为50ng/μL时的转染效率示意图；
图9是本发明实施例所述的多肽终浓度为100ng/μL时的转染效率示意图；
图10是本发明实施例所述的CAR-NK与293T细胞共培养时三组试验对比图；
图11是本发明实施例所述的CAR-NK与K562细胞共培养时三组试验对比图；
图12是本发明实施例所述的三组试验的细胞抑制率示意图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通方法人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种CAR-NK细胞的制备方法，其制备方法包括以下步骤；
S1：人工合成CAR序列CD19scFv--CD28--4-1BB--FcεRIγ，该序列如序列表中CD19scFv---CD28---4-1BB---FcεRIγ碱基序列所示；即以FcεRIγ的胞内信号段作为CAR的胞内信号段，以CD28作为跨膜区，4-1BB为共刺激因子，构建靶向CD19的CAR；
S2：将步骤S1中所合成的CAR序列CD19scFv--CD28--4-1BB--FcεRIγ整合进慢病毒目的载体质粒pWPXL-GFP中，得到目的质粒，记为pWPXL-FcεRIγ；
S3：(1)取450μl ddH2O加入1.5ml无菌EP管，分别加入目的质粒pWPXL-FcεRIγ10μg、包装质粒pMD2.G 6.5μg、包膜质粒PSPAX2 3.5μg；(2)缓慢加入50μl CaCl2，轻轻混匀，得混合液；然后将含有CaCl2和质粒的混合液加入到500μl 2x HBS中，轻轻混匀，室温静置15min；(3)取对数生长期293T细胞5x106个接种于细胞培养皿中，24h后待细胞融合度达80％时，更换为6ml新鲜的DMEM完全培养基；(4)将步骤(2)中所得的混合液加入到步骤(3)所得的接种有293T细胞的DMEM完全培养基中，37℃、5％CO2培养箱中培养；(5)24h后待细胞融合度达80％时，更换为6ml新鲜培养基，继续培养；(6)48h后收集第一批病毒液，并加入6ml新鲜培养基继续培养；(7)72h后收集第二批病毒液；(8)将收集的病毒液置于超滤管中，5000rpm/min 4℃浓缩离心40min，收集病毒浓缩液，-80℃保存备用；(9)倍数稀释法检测浓缩病毒的滴度，即得目的质粒的病毒浓缩液；
S4：①将健康人的外周血进行离心，收集分离液上层血浆(即自体血浆)并56℃灭活30min，小心吸取中间云雾层细胞即分离外周血单个核细胞PBMC，用生理盐水洗涤2次；细胞计数后用活化培养基调整细胞密度为2×106个/ml，然后进行细胞培养10天；②将细胞与活化培养基一起转移到新的细胞培养袋中继续培养6天，并在后续培养过程中补充增殖培养基，补充增殖培养基时维持细胞密度为1.5×107个/ml；③培养完毕后，检测NK细胞表型，CD3-CD16+CD56+细胞比例达88.5％，无需分选，直接用于CAR-NK的制备；
S5：取步骤S4中培养完毕后的NK细胞，分别加入步骤S3中所得到的目的质粒pWPXL-FcεRIγ的病毒浓缩液(MOI＝30IU/ml)，再加入改良型的多肽，使多肽的终浓度为50ng/μL；37℃孵育5h后，收集细胞，750g/min离心5min，弃病毒液，PBS洗涤2次后，1640培养基重悬细胞，得到CAR-NK细胞；所述改良型的多肽序列为：Ac-KKKNWFDWTNWLWYWK-NH2。
步骤S2中，CAR序列CD19scFv--CD28--4-1BB--FcεRIγ整合进慢病毒目的载体质粒pWPXL-GFP中的方法：(1)BamHI/MluI双酶切pWPXL-GFP；(2)BamHI/MluI双酶切人工合成的CAR序列；(3)T4DNA连接酶连接双酶切后的pWPXL-GFP和CAR，即把CAR整合进pWPXL-GFP载体中。
上述步骤S4中，所述活化培养基的配置为：以无血清RPMI1640培养基为基础培养基，往基础培养基中加入抗CD16单克隆抗体、IL-2、抗坏血酸、TGF-β1和胸腺肽，混匀，使抗CD16单克隆抗体、IL-2、抗坏血酸、TGF-β1和胸腺肽在活化培养基中的终浓度分别为60ng/ml、250U/ml、2ng/ml、60ng/ml和2ng/ml。
所述增殖培养基的配置为：以无血清RPMI1640培养基为基础培养基，往基础培养基中加入IL-1α、IL-2、抗坏血酸、IL-21、IL-7和41-BBL。混匀，使IL-1α、IL-2、抗坏血酸、IL-21、IL-7和41-BBL在无血清RPMI1640培养基的终浓度分别为50ng/ml、500U/ml、2ng/ml、60ng/ml、2ng/ml和10ng/ml；
实施例2
1、以NK细胞活化型受体FcεRIγ的胞内信号段作为CAR的胞内信号段，以CD28作为跨膜区，4-1BB为共刺激因子，构建靶向CD19的CAR，结构设计为CD19scFv---CD28---4-1BB---FcεRIγ，并构建一个以CD3ζ为胞内信号段的CAR：CD19scFv---CD28---4-1BB---CD3ζ作为对照。人工合成CD19scFv---CD28---4-1BB---FcεRIγ和CD19scFv---CD28---4-1BB---CD3ζ后，CD19scFv---CD28---4-1BB---CD3ζ的序列如序列表中CD19scFv---CD28---4-1BB---CD3ζ碱基序列所示，将这两个序列整合进慢病毒目的载体质粒pWPXL-GFP中，分别命名为目的质粒pWPXL-FcεRIγ和目的质粒pWPXL-CD3ζ。
2、取对数生长期293T细胞5x106个接种于100mm细胞培养皿中，24h后待细胞融合度达80％时，更换为6ml新鲜的DMEM完全培养基，4h后开始慢病毒包装，具体如下：
①取450μl ddH2O加入1.5ml无菌EP管，分别加入目的质粒10μg、包装质粒pMD2.G6.5μg、包膜质粒PSPAX2 3.5μg；目的质粒分别为pWPXL-FcεRIγ和pWPXL-CD3ζ，并用一个空的pWPXL-GFP质粒载体作为空白对照，即做三组实验，分别是实验组pWPXL-FcεRIγ、对照组pWPXL-CD3ζ以及空白对照pWPXL-GFP质粒。
②缓慢加入50μl CaCl2，轻轻混匀；
③将上述含有CaCl2和质粒的混合液加入500μl 2x HBS中，轻轻混匀，室温静置15min；
④将上述混合液加入到接种有293T细胞的DMEM完全培养基中，37℃、5％CO2培养箱中培养24h；
⑤24h后更换为6ml新鲜培养基，继续培养；
⑥48h后收集第一批病毒液，并加入6ml新鲜培养基继续培养；
⑦72h后收集第二批病毒液；
⑧将收集的病毒液置于超滤管中，5000rpm/min 4℃浓缩离心40min，收集病毒浓缩液，-80℃保存备用；
⑨倍数稀释法检测浓缩病毒的滴度，分别得到pWPXL-FcεRIγ的病毒浓缩液、pWPXL-CD3ζ的病毒浓缩液以及pWPXL-GFP的病毒浓缩液。
3、采集健康人外周血50ml，按照文献报道的方法使用淋巴细胞分离液(购自天津灏洋)分离外周血PBMC，即离心后收集分离液上层血浆(即自体血浆)并56℃灭活30min；小心吸取中间云雾层细胞即分离外周血单个核细胞PBMC，用生理盐水洗涤2次。细胞计数后用活化培养基调整细胞密度使其密度为2×106个/ml进行培养，然后分别在细胞培养的第3、6、8天补充活化培养基，补充至细胞密度为1.2×106个/ml为止，并维持自体血浆在活化培养基培养中的体积百分比为4％。
细胞培养至第10天时，将细胞与活化培养基一起转移到新的细胞培养袋中继续培养，并在培养的第10、12、14天在新的细胞培养袋中的NK细胞与活化培养基中补充增殖培养基，快速增殖阶段细胞密度增大，补充增殖培养基时维持细胞密度为1.8×107个/ml。
细胞培养至第16天时收集细胞，流式检测NK细胞表型，图1为细胞散射信号图，其上显示信号正常；图2和图3分别为以淋巴细胞和CD3-细胞划门的示意图，图4显示了CD3-CD16+CD56+细胞的比例，且比例达88.5％，其无需分选，直接用于CAR-NK的制备。
上述的活化培养基和增殖培养基的成分以及配制方法与实施例1一致。
4、取培养至第16天的NK细胞，分为5组，每组均加入pWPXL-FcεRIγ的病毒浓缩液(MOI＝30IU/ml)，并加入改良型的多肽，该多肽的序列为Ac-KKKNWFDWTNWLWYWK-NH2，使多肽的终浓度分别为0ng/μL、5ng/μL、10ng/μL、50ng/μL和100ng/μL。37℃孵育4-6h，荧光显微镜下观察转染效率。结果显示，如图5～9所示，多肽浓度为0时，转染效率最低，多肽浓度为50ng/μL时，转染效率最高，选5个视野仔细观察计数发现，转染效率高达95％。
5、取培养至第16天的NK细胞，分别加入pWPXL-GFP、pWPXL-FcεRIγ和pWPXL-CD3ζ的病毒浓缩液(MOI＝30IU/ml)，加入改良型的多肽，使多肽的终浓度为50ng/μL。37℃孵育5h后，收集细胞，750g/min离心5min，弃病毒液，PBS洗涤2次后，采用1640培养基重悬细胞，得到CAR-NK细胞。
6、取对数生长期的293T细胞和K562细胞，设置效靶比为1:1，一组为CAR-NK与293T细胞共培养，一组为CAR-NK细胞与K562细胞共培养，4h后检测细胞因子分泌及肿瘤细胞死亡情况。如图10～12所示，由于293T细胞不表达CD19，pWPXL-GFP、pWPXL-FcεRIγ和pWPXL-CD3ζ三组CAR-NK在细胞因子的分泌和肿瘤细胞的抑制率方面均无明显差异。K562细胞表达CD19，pWPXL-FcεRIγ和pWPXL-CD3ζ在细胞因子的分泌和肿瘤细胞的抑制率方面均要高于pWPXL-GFP修饰的CAR-NK。pWPXL-FcεRIγ和pWPXL-CD3ζ两组之间的对比发现，pWPXL-FcεRIγ的CAR-NK细胞的细胞因子分泌能力和抑瘤能力更高，结果表明，相比于CD3ζ，以FcεRIγ作为胞内信号段构建的CAR结构，使CAR-NK细胞的因子分泌能力和抑瘤能力显著增强，对于临床具有极其重要的应用价值。
实施例3
将实施例1或实施例2中的多肽序列修改为Ac-NIFDITNILIYIK-NH2，其他任何步骤、试剂、参数等均不改变，则其转染率仅有20～40％左右。
在本发明中，CD19scFv---CD28---4-1BB---FcεRIγ碱基序列所表达的氨基酸序列如序列表中“CD19scFv---CD28---4-1BB---FcεRIγ所表达的氨基酸序列”所示，CD19scFv---CD28---4-1BB---CD3ζ碱基序列所表达的氨基酸序列如序列表中“CD19scFv---CD28---4-1BB---CD3ζ所表达的氨基酸序列”所示。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种改动和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市泰华细胞工程有限公司
<120> 一种CAR-NK细胞及其制备方法与应用
<130> DA1700340
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1720
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cgcggatcca tggaactggt gctgacccag agcccggcga gcctggcggt gagcctgggc 60
cagcgcgcga ccattagctg caaagcgagc cagagcgtgg attatgatgg cgatagctat 120
ctgaactggt atcagcagat tccgggccag ccgccgaaac tgctgattta tgatgcgagc 180
aacctggtga gcggcattcc gccgcgcttt agcggcagcg gcagcggcac cgattttacc 240
ctgaacattc atccggtgga aaaagtggat gcggcgacct atcattgcca gcagagcacc 300
gaagatccgt ggacctttgg cggcggcacc aaactggaaa ttaaacgccg cagcggtggt 360
ggtggttcag gtggtggtgg ttcaggtggt ggtggttcac aggtgcagct gctggaaagc 420
ggcgcggaac tggtgcgccc gggcagcagc gtgaaaatta gctgcaaagc gagcggctat 480
gcgtttagca gctattggat gaactgggtg aaacagcgcc cgggccaggg cctggaatgg 540
attggccaga tttggccggg cgatggcgat accaactata acggcaaatt taaaggcaaa 600
gcgaccctga ccgcggatga aagcagcagc accgcgtata tgcagctgag cagcctgcgc 660
agcgaagata gcgcggtgta tagctgcgcg cgccgcgaaa ccaccaccgt gggccgctat 720
tattatgcga tggattattg gggccagggc accaccgtga ccttcgtgcc ggtcttcctg 780
ccagcgaagc ccaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 840
tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 900
acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 960
ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca accacaggaa caggagtaag 1020
aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc 1080
cgcaagcatt accagcccta tgccccacca cgcgacttcg cagcctatcg ctcccgtttc 1140
tctgttgtta aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga 1200
ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa 1260
ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 1320
ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 1380
gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgcagagaag gaagaaccct 1440
caggaaggcc tgtatccagc agtggtcttg ctcttactcc ttttggttga acaagcagcg 1500
gccctgggag agcctcagct ctgctatatc ctggatgcca tcctgtttct gtatggaatt 1560
gtcctcaccc tcctctactg tcgactgaag atccaagtgc gaaaggcagc tataaccagc 1620
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actctgaagc atgagaaacc accacagtag agacgcgtcg 1720
<210> 2
<211> 1627
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
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cgcgtcg 1627
<210> 3
<211> 566
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Met Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu
1 5 10 15
Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr
20 25 30
Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro
50 55 60
Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile
65 70 75 80
His Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser
85 90 95
Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro
130 135 140
Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser
145 150 155 160
Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu
165 170 175
Trp Ile Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly
180 185 190
Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr
195 200 205
Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
210 215 220
Ser Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala
225 230 235 240
Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Phe Val Pro Val Phe
245 250 255
Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
275 280 285
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
290 295 300
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
305 310 315 320
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Ser
325 330 335
Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
340 345 350
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
355 360 365
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg
370 375 380
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
385 390 395 400
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
405 410 415
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
420 425 430
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
435 440 445
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
450 455 460
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
465 470 475 480
Leu Tyr Pro Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Glu Gln Ala
485 490 495
Ala Ala Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu
500 505 510
Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile
515 520 525
Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val
530 535 540
Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys
545 550 555 560
His Glu Lys Pro Pro Gln
565
<210> 4
<211> 535
<212> PRT
<213> 人工合成
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Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro
35 40 45
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85 90 95
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100 105 110
Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro
130 135 140
Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser
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Trp Ile Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly
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Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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Claims (10)

1.一种CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤；
S1：以FcεRIγ的胞内信号段作为CAR的胞内信号段，以CD28作为跨膜区，4-1BB为共刺激因子，构建靶向CD19的CAR，并人工合成CAR序列CD19scFv--CD28--4-1BB--FcεRIγ；
S2：将步骤S1中所合成的CAR序列CD19scFv--CD28--4-1BB--FcεRIγ整合进慢病毒目的载体质粒中，得到目的质粒；
S3：取对数生长期的细胞接种于细胞培养皿中；将步骤S2中所得到的目的质粒连同包装质粒和包膜质粒一同加入所述细胞中包装出病毒，最后收集病毒液，浓缩，检测浓缩病毒的滴度，即得目的质粒的病毒浓缩液；
S4：①取外周血进行离心，收集分离液上层的自体血浆并进行灭活，并收集吸取中间云雾层细胞即分离外周血单个核细胞PBMC，洗涤，将自体血浆与单个核细胞PBMC混合，并用活化培养基调整细胞密度为(1～3)×106个/ml，然后进行细胞培养8～12天；②将①中整个细胞培养体系一起转移到新的细胞培养袋中继续培养4～10天，并在后续培养过程中补充增殖培养基，补充增殖培养基时维持细胞密度为(1～2)×107个/ml；③培养完毕后，检测NK细胞表型，CD3-CD16+CD56+细胞比例达88％，无需分选，直接用于CAR-NK的制备；
S5：取步骤S4中培养完毕后的NK细胞，分别加入步骤S3中所得到的目的质粒的病毒浓缩液，加入改良型的多肽，使其终浓度为20～70ng/μL；然后在37℃孵育4-6h后，收集细胞，600～1000g/min离心4～7min，弃病毒液，PBS洗涤，1640培养基重悬细胞，得到CAR-NK细胞；所述改良型的多肽的序列为：Ac-KKKNWFDWTNWLWYWK-NH2。
2.根据权利要求1所述的CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述目的载体质粒为pWPXL-GFP，整合CAR序列后所得的目的质粒记为pWPXL-FcεRIγ。
3.根据权利要求1所述的CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于：在步骤S3中，所述细胞为293T细胞，该293T细胞的接种于细胞培养皿中的量为(4～6)x106个；然后在步骤S2中所得到的目的质粒中加入CaCl2，得混合液，并将该混合液加入293T细胞中，在培养箱中培养以使慢病毒包装。
4.根据权利要求3所述的CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于：步骤S3中，慢病毒包装的具体方法为：
(1)取400～500μl ddH2O加入无菌EP管中，并加入目的质粒8～12μg、包装质粒5～8μg和包膜质粒3～4μg；所述目的质粒为pWPXL-FcεRIγ；
(2)缓慢加入45～55μl CaCl2，轻轻混匀，得混合液；然后将含有CaCl2和质粒的混合液加入到2xHBS中，轻轻混匀，室温静置10～20min；
(3)取对数生长期293T细胞(4～6)x106个接种于细胞培养皿中，24h后待细胞融合度达80％时，更换为新鲜的DMEM完全培养基；
(4)将步骤(2)中所得的混合液加入到步骤(3)所得的接种有293T细胞的DMEM完全培养基中，37℃、5％CO2培养箱中培养；
(5)24h后待细胞融合度达80％时，更换为新鲜培养基，继续培养；
(6)48h后收集第一批病毒液，并加入新鲜培养基继续培养；
(7)72h后收集第二批病毒液；
(8)将收集的病毒液置于超滤管中，浓缩，收集病毒浓缩液，-80℃保存备用；
(9)倍数稀释法检测浓缩病毒的滴度。
5.根据权利要求4所述的CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所加入的包装质粒为质粒PMD2.G，所述包膜质粒为质粒PSPAX2。
6.根据权利要求5所述的CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于：步骤S4中，所述活化培养基的配置为：以无血清RPMI1640培养基为基础培养基，往基础培养基中加入抗CD16单克隆抗体、IL-2、抗坏血酸、TGF-β1和胸腺肽，混匀，使抗CD16单克隆抗体、IL-2、抗坏血酸、TGF-β1和胸腺肽在活化培养基中的终浓度分别为60ng/ml、250U/ml、2ng/ml、60ng/ml和2ng/ml；
所述增殖培养基的配置为：以无血清RPMI1640培养基为基础培养基，往基础培养基中加入IL-1α、IL-2、抗坏血酸、IL-21、IL-7和41-BBL。混匀，使IL-1α、IL-2、抗坏血酸、IL-21、IL-7和41-BBL在无血清RPMI1640培养基的终浓度分别为50ng/ml、500U/ml、2ng/ml、60ng/ml、2ng/ml和10ng/ml。
7.根据权利要求6所述的CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于：步骤S4的①中，培养的天数为10天，在培养的第3、6、8天均补充活化培养基，补充活化培养基时维持细胞密度为1×106个/ml～2×106个/ml，并维持自体血浆在活化培养基培养中的体积百分比为4％；
步骤S4的②中，培养的天数为6天，在培养的第10、12、14天对新的细胞培养袋中补充增殖培养基，补充增殖培养基时维持细胞密度为(1.2～1.7)×107个/ml。
8.根据权利要求1所述的CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于：步骤S5中，所述目的质粒的病毒浓缩液的滴度为MOI＝30IU/ml；所述改良型的多肽的加入量为使其终浓度为50ng/μL为止。
9.一种由权利要求1～8中任意一项所述的方法所制备的CAR-NK细胞。
10.一种CAR-NK细胞在CAR-NK细胞的因子分泌能力和抑制肿瘤方面的应用。
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