CN105949325A - 包含cd27胞内结构域的嵌合抗原受体、慢病毒载体及其应用 - Google Patents

包含cd27胞内结构域的嵌合抗原受体、慢病毒载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体、慢病毒载体及其应用，包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体的免疫受体酪氨酸活化基序含有CD27分子胞内信号域和与T细胞共刺激信号分子；通过将CD27分子胞内信号域与T细胞活化相关的刺激信号连接，可显著增加T细胞体外增殖和凋亡作用，提升CAR‑T细胞中起体内治疗作用的幼稚样Tscm细胞(CD45RA+CD62L+)和中心记忆细胞(CD45RO+CD62L+)细胞的比例；降低抑制免疫作用的IL‑10因子的表达，对CAR‑T(T细胞嵌合抗原受体)细胞治疗效果的具有显著提升作用，为CAR‑T细胞治疗领域提供一种新的思路和选择。

Description

包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体、慢病毒载体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体，还涉及包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体的慢病毒载体和应用。
背景技术
过继细胞治疗(adoptive cell therapy，ACT)是生物治疗技术的一种，对自体免疫细胞(主要是T细胞)进行体外扩增，然后将其回输给肿瘤患者以达到治疗目的的方法，被认为是继手术、放、化疗后的第4种治疗方式，在临床治疗中受到广泛应用。过继细胞治疗广泛应用的主要是：淋巴因子活化的杀伤细胞(lymphokine activated killer cell，LAK)与IL-2联合治疗晚期恶性肿瘤取得了一定疗效；肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TIL)临床试验中治疗转移性黑色素瘤取得了较好的效果；细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinduced killer cell，CIK)，目前国内开展较多的临床试验，对肝癌、肺癌等肿瘤取得了显著的效果。但是目前上述三种治疗方法均需活化T细胞，T细胞活化需要两种活化信号，即T细胞表面的TCR-CD3与MHC-Ⅰ分子结合为活化的第一信号，决定T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性；T细胞表面的共刺激分子与相应配体结合为活化的第二信号，决定T细胞增殖。但肿瘤细胞、肿瘤微环境可下调MHC、配体分子，从而抑制T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。因此需要可进行基因改造，主要有两种方式：基因转导TCR(T cell receptor，TCR)和嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)。
CAR是模拟TCR功能的人工受体，由抗原识别域、铰链区和跨膜区及胞内信号域依次连接组成，胞内信号域通常为CD3ζ链或FcRγ，或与一种或多种共刺激分子相连，如4-1BB(CD137)，CD28，ICOS(CD278)。肿瘤细胞表面的抗原(受体)与嵌合抗原受体的抗体(配体)结合时，通过铰链区和跨膜区将信号传递至胞内，胞内信号域将信号转化为活化信号，激活效应细胞，效应细胞增殖、产生细胞因子从而杀伤肿瘤细胞。嵌合抗原受体较TCR改造更具优势：(1)特异性：抗体(配体)特异性识别抗原(受体)；(2)效率高：不会出现转基因TCR与患者内源性TCR发生错配；(3)非MHC-Ⅰ限制性：不需要与MHC-Ⅰ分子结合，可克服肿瘤细胞、肿瘤微环境下调MHC-Ⅰ分子造成的免疫逃逸；(4)抗原选择范围广：抗原可以是糖类、脂类、蛋白质。目前CAR修饰的免疫细胞治疗的临床试验大量开展，其中，抗CD19、CD20 CAR修饰的T细胞治疗B系肿瘤效果显著。实体肿瘤临床试验则有抗叶酸嵌合抗原受体治疗卵巢癌，抗碳酸酐酶Ⅸ(CAⅨ)嵌合抗原受体治疗肾癌，抗二唾液酸神经节苷脂(GD2)嵌合抗原受体治疗经母细胞瘤等。
人记忆性干细胞样T细胞(Tscm)是新发现的一个T细胞亚群。这一类群的细胞具有干细胞的特征，具有较强的多向分化潜能，Tscm细胞能够分化为中枢性记忆性T细胞(Tcm)，效应性记忆性T细胞(Tem)和效应性T细胞(Tef)，在分化的同时又能够维持自我更新。研究显示这群细胞是T细胞发挥体内抗肿瘤活性的重群体，因此如何在获得高比例的Tscm群体的CAR-T细胞是目前学界追逐的热点与难点。
人CD27基因定位于12号染色体短臂1区1带(12pl1)，是由二硫键连接的相对分子量为55000的单体组成的二聚体跨膜糖蛋白，相对分子量为12000，是一类I型跨膜，CD27及其配体CD70是TNF.TNFR超家族的两个重要成员，两者之间的相互作用可以调节T、B及NK细胞的增殖和分化。糖蛋白CD27所用的信号机制将不同于免疫球蛋白家族所用到的CD28和TCR。它们通过链接TRAF家族成员。TRAF2和TRAF5，诱导NF-κB和c-Jun-N末端激酶信号通路，从而促进T细胞的增殖及相应细胞因子的分泌。研究显示CD27-CD70信号对T细胞在体内长期存活具有重要作用，因此联想到CD27-CD70信号通路是否对T细胞形成或维持Tscm具有重要作用。
目前还没有使用CD27分子与其他共刺激分子共同组合用于嵌合抗原受体的构建，也没有报道显示CD27分子对Tscm的形成具有促进作用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体；本发明的目的之二在于提供表达包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体的慢病毒载体；本发明的目的之三在于提供所述包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体或所述的慢病毒载体在制备包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体的免疫细胞中的应用；本发明的目的之四在于提供利用所述包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体或所述的慢病毒载体制备的表达包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体的免疫细胞；本发明的目的之五在于提供所述包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体或所述的慢病毒载体在制备包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体靶向肿瘤细胞的药物中的应用。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
1、包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的免疫受体酪氨酸活化基序含有CD27分子胞内信号域和与T细胞共刺激信号分子，所述CD27分子胞内信号域的氨基序列如SEQ ID NO.20所示，所述T细胞共刺激信号分子为CD137、CD28和CD278中的一种或多种组合。
本发明中，所述免疫受体酪氨酸活化基序包含CD28与CD27，CD137与CD27，CD134与CD27，CD278与CD27和CD28、CD137与CD27的组合。
本发明中，所述免疫受体酪氨酸活化基序还包括信号传导结构域，所述信号传导结构域可以为CD3ζ或FcεRIγ信号链，优选为CD3ζ信号链。
本发明中，所述嵌合抗原受体依次由前导肽、单链抗体ScFv、CD8a铰链区、跨膜区和包含CD27胞内结构域的免疫受体酪氨酸活化基序，所述包含CD27胞内结构域的免疫受体酪氨酸活化基序的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
本发明中单链抗体ScFv可以是靶向任意抗原的单链抗体ScFv，如靶向CEA抗原CEA基因家族成员5，CEACAM5(CD66e)，靶向CD19分子、靶向CD20分子、靶向EGFR分子等任意单链抗体，实施列中为靶向CEA抗原CEA基因家族成员5来源的单链抗体；氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示
本发明中，所述前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述CD8a铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或如SEQ ID NO.10所示。
2、表达包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体的慢病毒载体，所述慢病毒载体的启动子与终止子之间依次连有前导肽、单链抗体ScFv、CD8a铰链区、跨膜区和含有CD27胞内结构域的免疫受体酪氨酸活化基序，所述前导肽位于所述启动子下游，所述含有CD27胞内结构域的免疫受体酪氨酸活化基序的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
优选的，所述前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述单链抗体ScFv为抗人CEA抗原的单链抗体ScFv，所述抗人CEA抗原的单链抗体ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述CD8a铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述跨膜区的氨基酸序列如SEQID NO.8所示或如SEQ ID NO.10所示。
3、所述包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体或所述的慢病毒载体在制备包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体的免疫细胞中的应用。
本发明中免疫细胞可以为T细胞、B淋巴细胞，NK淋巴细胞，CIK细胞、单核细胞或中性粒细胞，优选的所述免疫细胞为外周血来源的T细胞
4、利用所述包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体或所述的慢病毒载体制备的表达包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体的免疫细胞。
5、所述包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体或所述的慢病毒载体在制备包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体靶向肿瘤细胞的药物中的应用。
本发明中，所述肿瘤包括急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、髓系白血病、淋巴瘤、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、前列腺癌、小肠腺癌、口腔癌或鼻咽癌等。
其原理是免疫细胞(如T细胞)感染表达嵌合抗原受体的病毒后能够促进免疫细胞增殖克隆，能够促进幼稚T细胞(CD45RA+CD62L+)和中心记忆细胞(CD45RO+CD62L+细胞)形成；提高免疫细胞的抗凋亡作用；促进免疫细胞(如T细胞)在IL-2和靶向抗原刺激下的增殖能力；并在靶向抗原刺激下提高IFN-γ和IL-2的分泌水平。
本发明中术语“嵌合抗原受体”是人工改造受体，能够将识别肿瘤抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。
本发明中术语“T细胞活化相关信号”是指与T细胞活化所需要两个信号，即T细胞表面TCR-CD3复合体与抗原肽-MHC分子结合，提供T细胞活化的第一信号，决定T细胞的杀伤特异性。
本发明中术语“共刺激信号分子”(Co-stimulating molecule)是指免疫细胞表面的一些粘附分子，如CD27、CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、CD40等，通过与其配体结合，激活免疫细胞的第二信号，增强免疫细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，延长活化免疫细胞的存活时间。
本发明中术语“免疫受体酪氨酸活化基序”(immunoreceptor tyrosine-base activationmotifs，ITAM)是指免疫细胞活化相关受体(如BCR/Igα/Igβ，TCR/CD3、FcαR和FcRγ等)胞浆区所共有的以酪氨酸残基(tyrosine，Y)为基础的氨基酸序列基序，具体为：两个酪氨酸残基被大约13外其它氨酸残基隔开(…YXX[L/V]X 7-11YXX[L/V]…)，其中酪氨酸是蛋白激酶磷酸化位点，被磷酸化后能够与信号转导途径下游的信号分子结合，导致细胞的活化。
发明中术语“肿瘤特异性抗原”(tumor specific antigen，TSA)是肿瘤细胞特有的或只存在于某种肿瘤细胞而不存在于正常细胞的新抗原。
发明中术语“肿瘤相关抗原”(tumor-associated antigen，TAA)是指非肿瘤细胞所特有的、正常细胞和其他组织上也存在的抗原，只是其含量在细胞癌变时明显增高的抗原。
发明中术语“单链抗体”(single-chain antibody variable region fragment，scFv)是指由抗体VL区氨基酸序列和VH区氨基酸序列经Linker连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。
本发明的有益效果在于：本发明公开了包含CD27胞内结构域的嵌合抗原(chimeric antigenreceptor，CAR)，其包括前导肽、单链抗体(single-chain antibody variable region fragment,scFv)、连接ScFv所用的铰链区、跨膜结构域和免疫受体酪氨酸活化基序；将该嵌合抗原受体在免疫细胞中表达后，可有效杀伤抗原阳性的肿瘤细胞，而对抗原阴性的细胞无毒副作用，因此能够用于肿瘤的靶向治疗。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为含有不同刺激信号组合的病毒载体。
图2为CAR-T细胞感染病毒14天后通过流式细胞仪检测T细胞表面识别CEACAM5抗原的CAR结构的表达阳性率，结果显示Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD3(CEA1)病毒感染组阳性率80.1％、Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD3(CEA2)病毒感染组阳性率为52.6％、Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD137-CD3(CEA3)病毒感染组阳性率为61.7％、Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD137-CD27-CD3(CEA4)病毒感染组阳性率为37.2％。
图3为CAR-T细胞感染病毒后细胞增殖情况；A表示不同CAR-T细胞在感染病毒后的11天内的细胞增殖曲线；B表示不同CAR-T细胞在感染病毒后的11天内的细胞增殖倍数；结果显示感染Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD137-CD27-CD3(CEA4)病毒的T细胞较感染Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD3(CEA1)病毒、Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD3(CEA2)病毒、Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD137-CD3(CEA3)病毒的T细胞具有更强的增殖能力。
图4为不同组的CAR-T细胞表型检测；A表示流式细胞技术检测各组CAR-T细胞CD45RA，CD45RO及CD62L的表达，CD45RA+CD62L+为幼稚的T细胞，CD45RO+CD62L+为中心记忆细胞，CD45RO+CD62L-为效应记忆细胞，CD45RA+CD62L-为效应T细胞；B表示不同组的CAR-T细胞CD45RA+CD62L+，CD45RO+CD62L+，CD45RO+CD62L-，CD45RA+CD62L-的比例；结果显示CD28TM-CD28-CD137-CD27-CD3信号组较其他组的CAR-T细胞含有更高比例的CD45RA+CD62L+，CD45RO+CD62L+细胞。
图5为不同组的CAR-T细胞刺激前后凋亡比例的检测；A表示流式细胞技术检测各组CAR-T细胞刺激前凋亡的比例,统计各组CAR-T细胞在刺激前各个凋亡时期的比例情况；B表示流式细胞技术检测CAR-T细胞在CEA-Fc蛋白刺激24h后各组的凋亡情况，统计总凋亡比例。
图6为不同组的CAR-T细胞在IL-2和抗原刺激下的增殖情况；A表示培养至14天的CAR-T细胞在含500IU/ml IL-2的培养基中的增殖情况；B表示培养至14天的各组CAR-T细胞在不含IL-2的情况下，在CEA-Fc抗原刺激的情况下细胞的增殖情况，箭头表示CEA-Fc刺激的时间。
图7为不同组的CAR-T细胞在抗原刺激下IL-2，IFN-γ，IL-10的分泌情况；A表示不同组CAR-T在CEA-Fc抗原刺激下IFN-γ的分泌情况；B表示不同组CAR-T在CEA-Fc抗原刺激下IL-2的分泌情况；C表示不同组CAR-T在CEA-Fc抗原刺激下IL-10的分泌情况。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、含有CD28-CD137-CD27-CD3这4个刺激信号的CAR病毒的构建
为证明同时含有CD28-CD137-CD27-CD3这4个刺激信号的CAR-T细胞较以往已报道的含有CD28-CD137-CD3这3个刺激信号、CD28-CD3这两个刺激信号和单CD3刺激信号的CAR-T细胞更具有优势，因此需要分别构建含有不同刺激信号组合的病毒载体。本实施例中以靶向癌胚抗原(CEA)的单链抗体为统一的胞外识别抗原的结构，分别需要构建如下4个嵌合抗原受体(图1)：
LP-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD3(CEA1)；
LP-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD3(CEA2)；
LP-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD137-CD3(CEA3)；
LP-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD137-CD27-CD3(CEA4)。
1)合成含有不同胞内刺激信号的靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体的基因序列
合成依次含前导肽(又称信号肽)(简称LP)、抗人CEA抗原的单链抗体ScFv(简称CEA(scfv))，CD8a铰链区(简称CD8a)、CD28跨膜区或CD8跨膜区(简称为TM)，其结构如图1所示。其中前导肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；抗人CEA抗原的单链抗体ScFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示；CD8a铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6；CD28跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；CD8跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；免疫受体酪氨酸活化基CD3的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；免疫受体酪氨酸活化基CD28-CD3组合的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；免疫受体酪氨酸活化基CD28-CD137-CD3组合的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；免疫受体酪氨酸活化基CD28-CD137-CD27-CD3组合的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；免疫受体酪氨酸活化基CD27的核苷酸序列SEQ ID NO.19；免疫受体酪氨酸活化基CD27的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。
2)构建表达嵌合抗原受体的慢病毒载体
1)设计如下引物，并将其由南京金斯瑞生物科技公司合成，具体引物如下：
引物1：5’-aggctagcatgggatggagctgtatcat-3’(SEQ ID NO.21)，下划线为NheI限制性内切酶位点；
引物2：5’-gattgtcgacttagcgagggggcagggcctgcatgtga-3’(SEQ ID NO.22)，下划线为SalI限制性内切酶位点。
然后以SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示序列为引物，上述合成的各嵌合抗原受体序列为模板进行PCR扩增，反应体系按KOD FX NEO DNA聚合酶(购自TOYOBO公司)说明书加样，PCR反应条件为95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火15s，68℃延伸30s，30个循环。将扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行鉴定。结果显示，扩增获得约2000bp的DNA片段，然后用回收试剂盒(Promega公司)进行DNA片段回收，具体方法见说明书，回收获得嵌合抗原受体，将DNA回收片段送南京金斯瑞生物科技公司测序。
将克隆获得的编码嵌合抗原受体的基因序列用限制性内切酶NheI和SalI(购自Thermo公司)双酶切，同时用限制性内切酶NheI和SalI酶切慢病毒表达载体pCDH-EF1(购至addgenePlasmid#72266)，酶切反应按说明书进行。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒进行DNA片段回收，然后将的目的片段和载体片段通过T4连接酶(购自Promega公司)进行连接，获得表达嵌合抗原受体的慢病毒载体，命名为Lv-scFv(CEA)。将慢病毒载体取5μl转化大肠杆菌TOP10，30℃培养16h后挑取单克隆，挑取的单克隆在30℃条件下培养12h后用质粒抽提试剂盒(Invitrogen公司)抽提质粒，具体方法见说明书。
按照如上方法分别构建pCDH-EF1a-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD3(CEA1)；pCDH-EF1a-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD3(CEA2)；pCDH-EF1a-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD137-CD3(CEA3)和pCDH-EF1a-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD137-CD27-CD3(CEA4)慢病毒载体。
3)慢病毒的包装
本实施例包装慢病毒采用磷酸钙法，具体步骤如下：用含10％(wt)FBS的DMEM培养基培养293T细胞，至较佳状态；然后将293T细胞以1×105/cm2的密度传至1个75cm2的培养瓶中培养22h，保证转染时细胞汇合度为70-80％；再用预热的含2％(wt)FBS的DMEM培养基换液，培养2h，备用；将680μl ddH2O、20μg慢病毒载体、20μg pMDLg/pRRE质粒、20μg pRSV–Rev和10μg pMD2.G质粒、100μl 2.5mM CaCl2加入15ml离心管中，混合均匀，混匀后用移液器向混合液中逐滴加入2×HBS，同时用10ml移液器吹打混匀，混匀后室温静置15min，然后将混合液逐滴加入上述制备的细胞中，继续培养12-16h后，用含10％FBS(wt)的DMEM培养基更换培液，继续培养48h、72h后分别收集细胞上清并用于病毒纯化。
(2)慢病毒的纯化
将病毒上清收集在50ml离心管中，3000r/min离心10min；然后用0.45μm过滤膜过滤，滤液在3000r/min离心10min至新的50ml离心管；然后根据病毒上清量，分别加入质量分数为50％的PEG6000和4M NaCl，再用医用盐水定容至35mL，使PEG6000终浓度为8.5％，NaCl终浓度为0.3M，定溶后于4℃冰箱静置90min，30min/次颠倒混匀；然后于4℃、5000r/min条件下离心30min，弃尽上清，用200μl含10％FBS的DMEM培养基重悬病毒，1.5mlEP管分装，每管40μl，-80℃保存备用。制得病毒分别命名为Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD3(CEA1)、Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD3(CEA2)、Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD137-CD3(CEA3)、Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD137-CD27-CD3(CEA4)。
(3)慢病毒滴度测定
1)病毒感染293T细胞
感染前将293T细胞以铺24孔板中，取已纯化的病毒1μl，用医用生理盐水稀释10倍，再向每孔细胞中加入1μl聚凝胺(Polybrene)溶液，然后将1μl和9μl稀释后的病毒液分别加到293T细胞中，24h后用含10％FBS(wt)的DMEM培养基换液，感染72h后于1000r/min条件下离心5min以收集细胞，抽提基因组。
2)抽提基因组
基因组抽提试剂盒为QIAamp DNA Blood Mini Kit购于Qiagen公司(货号511004)，按试剂盒说明书操作，具体如下：将收集的细胞用PBS重悬，1000r/min离心5min，弃尽上清，重复1次；再用200μL PBS重悬细胞，并加入20μl蛋白酶K，200μl AL裂解液，吹打混匀，56℃孵育10min；然后加入200μl预冷的乙醇，上下颠倒混匀，将溶液转移至过滤柱中，室温静置1min，8000r/min离心1min，弃尽上清；接着加入700μl AW1溶液，8000r/min离心1min，弃尽上清；再加入500μlAW2溶液，8000r/min离心1min，弃尽上清，将过滤柱转移至新的1.5mlEP管中，开盖静置1min以挥发乙醇；加入50μl灭菌ddH2O(60℃预热)，静置2min，12000g/min离心1min。
3)qRT-PCR测定病毒滴度
反应体系如下：Premix Ex TaqTM II(2×)10μl，上游引物(GAG up)1μl，下游引物(GAG dn)1μl，抽提的基因组1μl，RNase-Free dH2O 7μl，每个样品、标准品至少3个重复孔。然后按如下程序进行扩增：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，反应结束后，用分析软件分析数据，根据标准曲线计算病毒滴度。计算结果显示，病毒滴度为1×108TU/ml。
实施例2、病毒感染T细胞
1)T细胞的分离活化及病毒感染
(1)人外周血单核细胞的分离
用加有抗凝剂的采血管采集外周血约60ml，分装于50ml离心管各30ml，加入7.5ml羟乙基淀粉稀释；室温(18～25℃)自然沉降约30min，收集上层血浆，将收集的上层血浆于1400rpm/min条件下离心15min；然后用生理盐水重悬沉淀，按体积比为1:1加到淋巴细胞分离液上，梯度离心，400g/min，离心机降速设置为1，离心20min；离心后，离心管由上至下分为：第一层：血浆层；第二层：环状乳白色淋巴细胞层；第三层：透明分离液层；第四层：红细胞层；取第二层白色淋巴细胞层，并用生理盐水洗涤2次，第一次400g/min，离心10min，第二次1100rpm/min，离心5min，生理盐水重悬细胞，加入含有10％FBS的RPMI 1640完全培养基培养，得人外周血单核细胞。
(2)慢病毒载体感染T淋巴细胞
用含10％胎牛血清的RPMI 1640完全培养基培养新制备的单个核细胞PBMC，第1天加入抗CD3单克隆抗体活化；前3天进行慢病毒感染；加入5MOI对应的慢病毒载体，未感染的T淋巴细胞作为空白对照；24h后将培养基更换为含有500IU/ml重组人IL-2的RPMI 1640完全培养基，继续培养10-20天。
2)CAR分子的检测
将培养至14天的已感染病毒的T细胞，300g/min，离心5min，弃尽上清以收集细胞；用含有体积分数1％胎牛血清的PBS溶液重悬细胞，并将细胞调整密度为1×106个/ml；将收集的细胞分装为6管，每管100μl，向每管细胞中加入5μl浓度为0.3μg/ml的His标记的重组人CEACAM5蛋白(北京义翘神州公司)，4℃孵育30min，PBS溶液洗涤2次，再加入AF647标记的小鼠抗His抗体(南京金斯瑞公司)，4℃孵育30min，PBS溶液洗涤2次，上流式细胞仪进行检测，结果如图2所示。结果显示经过14天的培养，CAR-T细胞CAR的阳性率：Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD3(CEA1)病毒感染组阳性率80.1％、Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD3(CEA2)病毒感染组阳性率为52.6％、Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD137-CD3(CEA3)病毒感染组阳性率为61.7％、Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD137-CD27-CD3(CEA4)病毒感染组阳性率为37.2％。
实施例3、病毒感染CAR-T细胞对细胞增殖的影响
各组病毒感染完T细胞后，将T细胞用含体积分数10％胎牛血清的含有500IU/ml重组人IL-2的RPMI 1640完全培养基，继续培养10天，每2-3天计数一次。然后观察T淋巴细胞生长情况，结果如图3所示。结果显示：细胞在感染表达CAR的病毒后，依然能够形成典型的增殖克隆团，通过对细胞进行计数，绘制细胞增殖曲线可见，感染Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD137-CD27-CD3(CEA4)病毒的T细胞增殖较感染Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD3(CEA1)病毒、Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD3(CEA2)病毒、Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD137-CD3(CEA3)病毒及未感染病毒的T细胞要更好。
实施例4、检测感染病毒的CAR-T细胞中CD45RA，CD45RO和CD62L
将培养至14天的已感染病毒的T细胞，300g/min，离心5min，弃尽上清以收集细胞；用含有1％胎牛血清的PBS溶液重悬细胞，并将细胞调整密度为1×106个/ml；将收集的细胞分装为6管，每管100μl，向每管细胞中同时加入10μl Brilliant Violet 421荧光标记的小鼠抗人CD45RA抗体(BD PharmingenTM公司)，10μl percep-cy5.5荧光标记的小鼠抗人CD45RO抗体(BD PharmingenTM公司)，10μl PE荧光标记的小鼠抗人CD62L抗体(BD PharmingenTM公司)。4℃孵育30min，PBS溶液洗涤2次，上流式细胞仪进行检测。结果如图4所示。结果显示CD28TM-CD28-CD137-CD27-CD3信号组较其他组的CAR-T细胞含有更高比例的CD45RA+CD62L+，CD45RO+CD62L+细胞。
实施例5、检测感染病毒的CAR-T细胞的抗凋亡能力
1)检测培养14天的不同组CAR-T细胞的凋亡情况
样品染色，具体步骤如下：
(1)收集CAR-T细胞，于300g，4℃离心5min收集细胞；
(2)配制1×Binding Buffer：用去离子水4倍稀释4×Binding Buffer(4ml结合缓冲液+12ml去离子水)；
(3)用4℃预冷的PBS洗涤细胞2次，每次均需300g，4℃离心5min；
(4)加入250μl 1×Binding Buffer重悬细胞，调节其浓度为1×106细胞/ml；
(5)取100μl细胞悬液于5ml流式管中，加入5μl Annexin V/PE和10μl 7-AAD，轻轻混匀；
(6)避光、室温反应15min；
(7)加入400μl 1×Binding Buffer，混匀，样品在1小时内检测；
观察检测
(1)用流式细胞仪检测，激发波长Ex＝488nm；发射波长Em＝578nm，Annexin V-PE的橙红色荧光建议使用FL2通道检测；激发波长Ex＝546nm；发射波长Em＝647nm，7-AAD红色荧光建议使用FL3通道检测。用FlowJo软件进行分析，绘制双色散点图(two-color dotplot)，PE为横坐标，7-AAD为纵坐标。每个样采集10，000events。典型的实验中，细胞可以分成三个亚群，活细胞仅呈很低强度的背景荧光，早期凋亡细胞仅呈较强的橙红色荧光，晚期凋亡细胞呈橙红和红色荧光双重染色。
(2)荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。
检测结果如图5中A所示，结果显示培养14天的不同组别的CAR-T细胞中，含有CD28-CD137-CD27-CD3信号组合的CAR-T细胞具有最少的细胞凋亡率。
2)通过CEA-Fc蛋白刺激不同组别的CAR-T细胞，24h后检测各组的凋亡水平
CEA-Fc蛋白刺激，具体步骤如下：
(1)CEA-Fc蛋白包被，用生理盐水稀释重组人CEACAM5-Fc蛋白(义翘神州公司)至1ug/ml，取200ul稀释蛋白至24孔板中，于4℃下放置过夜；
(2)CAR-T细胞刺激，将CAR-T细胞稀释至4×105/ml，于CEACAM5-Fc蛋白包被的24孔板中每孔加入500μl稀释后的细胞，于37℃下培养24h。
样品染色，具体步骤如下：
(1)收集CAR-T细胞，于300g，4℃离心5min收集细胞；
(2)配制1×Binding Buffer：用去离子水4倍稀释4×Binding Buffer(4ml结合缓冲液+12ml去离子水)。
(3)用4℃预冷的PBS洗涤细胞2次，每次均需300g，4℃离心5min。
(4)加入250μl 1×Binding Buffer重悬细胞，调节其浓度为1×106细胞/ml。
(5)取100μl细胞悬液于5ml流式管中，加入5μl Annexin V/PE和10μl 7-AAD，轻轻混匀。
(6)避光、室温反应15min。
(7)加入400μl 1×Binding Buffer，混匀，样品在1小时内检测。
观察检测
(1)用流式细胞仪检测，激发波长Ex＝488nm；发射波长Em＝578nm，Annexin V-PE的橙红色荧光建议使用FL2通道检测；激发波长Ex＝546nm；发射波长Em＝647nm，7-AAD红色荧光建议使用FL3通道检测。用FlowJo软件进行分析，绘制双色散点图(two-color dotplot)，PE为横坐标，7-AAD为纵坐标。每个样采集10,000events。典型的实验中，细胞可以分成三个亚群，活细胞仅呈很低强度的背景荧光，早期凋亡细胞仅呈较强的橙红色荧光，晚期凋亡细胞呈橙红和红色荧光双重染色。
(2)荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。
结果如图5中B所示。结果显示，CEACAM5-Fc蛋白刺激24h后不同组别的CAR-T细胞中，含有CD28-CD137-CD27-CD3信号组合的CAR-T细胞具有最少的细胞凋亡率。
实施例6、检测CAR-T细胞在IL-2和抗原刺激下的增殖能力
1)检测培养14天的不同组CAR-T细胞在IL-2刺激下的增殖能力
培养至14天的各组CAR-T细胞稀释浓度至1×106/ml，将稀释后的T细胞用含体积分数10％胎牛血清的含有500IU/ml重组人IL-2的RPMI 1640完全培养基重悬并置于24孔板中，每孔500μl细胞悬液，继续培养25天，每2-3天计数一次。然后观察T淋巴细胞生长情况，结果如图6中A所示。结果显示CD28-CD137-CD27-CD3信号组合组CART细胞增殖较其他组的细胞增殖具有显著差异，增殖倍数和增殖时间均较其他各组更好。
2)检测培养14天的不同组CAR-T细胞在CEA抗原刺激下的增殖能力
CEA-Fc蛋白刺激，具体步骤如下：
(1)CEA-Fc蛋白包被，用生理盐水稀释重组人CEACAM5-Fc蛋白(义翘神州公司)至1ug/ml，取200μl稀释蛋白至24孔板中，于4℃下放置过夜；
(2)CAR-T细胞刺激，将CAR-T细胞稀释至4×105/ml，于CEACAM5-Fc蛋白包被的24孔板中每孔加入500μl稀释后的细胞，于37℃下继续培养，细胞每3天计数一次，每7天重新进行一次新的刺激。每2-3天计数一次，然后观察T淋巴细胞生长情况，结果如图6中B所示。结果显示，CD28-CD137-CD27-CD3信号组合组CART细胞增殖较其他组的细胞增殖具有显著差异，细胞在3次刺激下仍显示出增殖能力。
实施例7、检测病毒感染CAR-T细胞细胞因子
抗原刺激，具体步骤如下：
(1)CEA-Fc蛋白包被，用生理盐水稀释重组人CEACAM5-Fc蛋白(义翘神州公司)至1μg/ml，取200μl稀释蛋白至24孔板中，于4℃下放置过夜；
(2)CAR-T细胞刺激，将CAR-T细胞稀释至4×105/ml，于CEACAM5-Fc蛋白包被的24孔板中每孔加入500μl稀释后的细胞，于37℃下继续培养。24h后于300g，4℃离心5min收集上清。
细胞因子检测
(1)细胞因子检测采用Elisa的方法，使用BD公司试剂盒进行。
(2)标准品的稀释：准备小试管6只，依次编好号码，先在各小试管中加入标准品稀释液100μl，然后取原浓度标准品100μl加入一只已编好号的试管中，充分混匀；再在该试管中取100μl加入第二支试管中，充分混匀；再在该试管中取100μl加入第三只试管中，充分混匀；再在该试管中取100μl加入第四只试管中，充分混匀；再在该试管中取100μl加入第五只试管中，充分混匀；然后在该试管中取100μl，弃掉；第六只试管作为0号标准品。
(3)在酶标包被板上设标准品孔，依次加入不同浓度的标准品50μl，每个浓度做2个平行孔。
(4)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品、酶标试剂及生物素标记的抗体，其余各步操作相同)、待测样品孔；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品40μl，然后再加生物素标记的抗体10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
(5)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
(6)配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；
(7)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
(8)加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；
(9)温育：操作同3；
(10)洗涤：操作同5；
(10)显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
(11)终止：每孔加终止液50μl，终止反应；
(12)测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加终止液后15分钟以内进行。
检测结果如图7所示。结果显示，CD28-CD137-CD27-CD3联合信号的CAR-T在CEA-Fc抗原刺激下IFN-γ，和IL-2的分泌水平较CD28-CD137-CD3联合信号的CAR-T分泌的量有少量增高，但未达到显著水平。CD28-CD137-CD27-CD3，CD28-CD137-CD3，和CD28-CD3信号组的分泌量较单CD3组的CAR-T分泌有显著提升。IL-10在CD28-CD137-CD27-CD3和CD28-CD137-CD3较CD28-CD3组显著降低。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体的免疫受体酪氨酸活化基序含有CD27分子胞内信号域和与T细胞共刺激信号分子，所述CD27分子胞内信号域的氨基序列如SEQ ID NO.20所示，所述T细胞共刺激信号分子为CD137、CD28和CD278中的一种或多种组合。
2.根据权利要求1所述包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体，其特征在于：所述免疫受体酪氨酸活化基序包含CD28与CD27，CD137与CD27，CD134与CD27，CD278与CD27或CD28、CD137与CD27的组合。
3.根据权利要求1所述包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体，其特征在于：所述免疫受体酪氨酸活化基序还包括信号传导结构域，所述信号传导结构域为CD3δ或FcεRIγ信号链。
4.根据权利要求1～3任一项所述包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体依次由前导肽、单链抗体ScFv、CD8a铰链区、跨膜区和包含CD27胞内结构域的免疫受体酪氨酸活化基序，所述包含CD27胞内结构域的免疫受体酪氨酸活化基序的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
5.根据权利要求4所述包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体，其特征在于：所述前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述单链抗体ScFv为抗人CEA抗原的单链抗体ScFv，所述抗人CEA抗原的单链抗体ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述CD8a铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或如SEQID NO.10所示。
6.表达包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体的慢病毒载体，其特征在于：所述慢病毒载体的启动子与终止子之间依次连有前导肽、单链抗体ScFv、CD8a铰链区、跨膜区和含有CD27胞内结构域的免疫受体酪氨酸活化基序，所述前导肽位于所述启动子下游，所述含有CD27胞内结构域的免疫受体酪氨酸活化基序的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
7.根据权利要求6所述的慢病毒载体，其特征在于：所述前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述单链抗体ScFv为抗人CEA抗原的单链抗体ScFv，所述抗人CEA抗原的单链抗体ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述CD8a铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或如SEQ ID NO.10所示。
8.权利要求1～5任一项所述包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体或权利要求6或7所述的慢病毒载体在制备包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体的免疫细胞中的应用。
9.利用权利要求1～5任一项所述包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体或权利要求6或7所述的慢病毒载体制备的表达包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体的免疫细胞。
10.权利要求1～5任一项所述包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体或权利要求6或7所述的慢病毒载体在制备包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体靶向肿瘤细胞的药物中的应用。
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