CN111683971A - 医药重组受体组成物及方法 - Google Patents

医药重组受体组成物及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111683971A
CN111683971A CN201880082548.1A CN201880082548A CN111683971A CN 111683971 A CN111683971 A CN 111683971A CN 201880082548 A CN201880082548 A CN 201880082548A CN 111683971 A CN111683971 A CN 111683971A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
sequence
chimeric antigen
cell
region
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880082548.1A
Other languages
English (en)
Inventor
庞德玲
柯名津
戴忆涵
赖羿廷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yuyue Biomedical Technology Co ltd
Original Assignee
Yuyue Biomedical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yuyue Biomedical Technology Co ltd filed Critical Yuyue Biomedical Technology Co ltd
Publication of CN111683971A publication Critical patent/CN111683971A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70525—ICAM molecules, e.g. CD50, CD54, CD102
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)

Abstract

本发明提供了一种重组嵌合抗原受体(CAR)蛋白，其包含CD19抗原结合片段、跨膜区域、以及讯息区域。该CD19抗原结合片段是一具有特定氨基酸序列的单链变异区片段(scFv)。本发明还提供了该重组嵌合抗原受体的表现载体和包含该重组嵌合抗原受体或该表现载体的医药组成物。

Description

医药重组受体组成物及方法
技术领域
本发明涉及一种医药重组受体组成物。更具体地，是一种包含重组嵌合抗原受体19的医药组成物以及其制造方法。
背景技术
癌症是指一种疾病用以形容细胞的生长以及扩散是不受控制的。而细胞的扩散不受控制时，其最终可能会导致宿主死亡。已有许多研究指出，癌症的成因可归于外在因子(例如：吸烟、病原体感染、不当饮食等)或内在因子(例如：遗传基因突变、荷尔蒙、免疫状态等)。而上述这些因子可能是一起协同作用或独自作用而导致癌症的发生。然而从一开始疾病的始发到症状开始显现，中间所经过的时间往往超过数十年。目前用来治疗癌症的方法包含：手术、放射疗法、化学疗法、贺尔蒙疗法、免疫疗法以及标靶治疗(用药物干扰或抑制癌细胞的生长)。
白血病(又称血癌)可以分成四种类别，分别为：急性骨髓性白血病(AcuteMyeloblastic Leukemia；AML)、慢性骨髓性白血病(Chronic Myeloblastic Leukemia；CML)、急性淋巴性白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia；ALL)、慢性淋巴性白血病(Chronic Lymphoblastic Leukemia；CLL)。而上述这四种不同型态的白血病其主要差异为好发病程速度与好发原位。根据中国台湾儿童癌症基金会的报导指出，白血病占幼童罹患癌症中的31％。更进一步，其中上述白血病又有95％是急性白血病。
而依据所罹患白血病的种类不同(例如：AML、CML、ALL、CLL)，其所采用的治疗方法也不尽相同。而治疗方法如同前述的化学疗法、标靶治疗，放射疗法、造血干细胞移植、支持疗法等等。然而，往往在治疗之后仍会有些许难以侦测的癌细胞残存。而这些残存的癌细胞往往又会导致癌症的复发。此外，癌细胞对于传统化学疗法也逐渐产生了抗性。
白血病的治疗方法如同前述的化学疗法、标靶治疗，放射疗法、造血干细胞移植、支持疗法等等。但是由于癌症的复发以及癌细胞逐渐产生抗性，因此近年来免疫疗法逐渐普遍成为取代传统化学疗法的治疗方式。其中一种免疫疗法为利用基因改良T细胞来使T细胞上具有对癌症细胞抗原具有高度专一性的重组嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptors；CARs)。重组嵌合抗原受体是一种以基因工程方式装载于人类淋巴球细胞上，而用以精准辨识癌细胞的受体。于2011年，首度由美国宾州大学Carl June医师成功地以带有重组嵌合抗原受体的T细胞治愈白血病患者，并将其临床研究成果刊载于《新英格兰医学期刊》。(Porter et al.,N Engl J Med,2011；365:725-733)
近期的研究指出，大多数的癌症目前还未有专一且高度特异性的抗原被发现。但是在B淋巴性白血病中，CD19却是一个目前被大家公认有效作为目标的抗原。而根据研究指出，CD19只在正常及恶性B淋巴球上表现。(Uckun,et al.Blood,1988,71:13-29)并且，某些研究又更进一步指出，可以将CD19作为标靶而有效消除B淋巴性白血病。(例如：Salem etal.,Indian J Hematol Blood Transfus,2012,28(2):89-96以及Schewe et al.,Blood,2017-01-764316；and Seidel et al.,Mol Ther.,2016,24(9):1634-43)
因此，本发明的主旨是设计一种有效的医疗重组嵌合抗原受体医疗组成物，并且其具有较小蛋白质和对于CD19抗原具有高度专一性。另外，同时间也提供一种制造方法用以生产上述的医疗重组嵌合抗原受体医疗组成物。
发明内容
本发明提供一种重组嵌合抗原受体(CAR)蛋白质，其包括三个部分，分别为CD19抗原结合片段、跨膜区域、讯息区域。其中，CD19抗原结合片段是单链变异区片段(single-chain variable fragment；scFv)，并且其中还包括重链变异区片段和轻链变异区片段。更进一步地，重链变异区片段包括第一氨基酸序列，而序列选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12或上述序列任意的组合；而轻链变异区片段包括第二氨基酸序列，其选自SEQID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或上述序列任意的组合。而跨膜区域包括：CD28、IgG1、CD4、CD8α的跨模区域或上述任意的组合。而讯息区域则包括免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)、共同刺激分子(CM)或上述任意的组合。
在一些实施例中，其中重组嵌合抗原受体中的跨膜区域是CD8α的跨膜区域。
在一些实施例中，其中重组嵌合抗原受体中共同刺激分子的数目为至少两个。
在一些实施例中，其中重组嵌合抗原受体中讯息区域上的免疫受体酪氨酸激活基序为CD3 zeta。
在一些实施例中，其中重组嵌合抗原受体中讯息区域上的共同刺激分子包括：CD27、CD28、CD30、4-1BB/CD137、OX40、herpesvirus entry mediator(HVEM)或上述任意的组合。
在一些实施例中，其中重组嵌合抗原受体中讯息区域上的共同刺激分子包括4-1BB/CD137。
本发明还提供一种用以表现重组嵌合抗原受体(CAR)的载体(vector)，其包括：重组哺乳动物细胞。此外，其中重组哺乳动物细胞包括至少一个如前面的重组嵌合抗原受体，其包括：CD19抗原结合片段、跨膜区域以及讯息区域。此外，CD19抗原结合片段是单链变异区片段，并且单链变异区片段包括重链变异区域以及轻链变异区域。其中，重链变异区域包括第一氨基酸序列选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12或上述任意的组合，以及轻链变异区域包括第二氨基酸序列选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或上述任意的组合。跨膜区域包括：CD28、IgG1、CD4、CD8α或上述任意的组合。讯息区域包括免疫受体酪氨酸激活基序、共同刺激分子或上述任意的组合。
本发明还提供一种医疗组成物，其包含一群修饰的细胞。更明确来说，重组细胞包含至少一种人工重组嵌合抗原受体(CAR)蛋白、至少一种人工重组嵌合抗原受体(CAR)表现载体或上述的组合，并且上述两者均具有如前述的特征。
在一些实施例中，该医药组成物中的重组细胞是哺乳动物细胞。
在一些实施例中，该医药组成物中的重组哺乳动物细胞是淋巴球。
在一些实施例中，该医药组成物中的淋巴球是T细胞或是NK细胞。
本发明还提供一种治疗方法，其用以治疗一个患有大量表现CD19抗原的疾病、失调或症状的哺乳动物。更明确地，该治疗方法包括以下步骤：步骤(a)从哺乳动物供体中分离出外围血液；步骤(b)从外围血液中分离出淋巴球；步骤(c)产生一种医药组成物具有至少一个人工重组嵌合抗原受体蛋白、至少一个人工重组嵌合抗原受体载体或上述两者组合于淋巴球上；步骤(d)将至少一种化学治疗剂施用于哺乳动物受体；以及步骤(e)将该医药组成物注射至哺乳动物受体。
在一些实施例中，步骤(c)还包含扩增表现嵌合抗原受体的淋巴球的步骤。
在一些实施例中，该医药组成物对于哺乳动物供体和哺乳动物受体是自体的。
在一些实施例中，该医药组成物对于哺乳动物供体和哺乳动物受体是异体的。
在一些实施例中，淋巴球是T细胞或NK细胞。
附图说明
附图图片中通过示例而非局限性方法展示出了一个或多个实施例，其中具有相同参考数字标识的组件始终表示类似组件。附图并非等比例图，除非另有披露。
图1A～1B为一系列的示意图揭示了基因转殖用的载体图谱与细胞(外外围血单核细胞(PBMCs)与淋巴球)纯化实验的纯度测试结果。图1A揭示了一个慢病毒载体(pLAS5w.PeGFP-I2-Puro)的基因图谱用以将特定基因转殖至T细胞。上述图谱中也揭示了各遗传因子的主要功能。简而言之，上述慢病毒载体包含：一个可以直接用以表现辨认CD19抗原的单链变异区片段(由小鼠或人类单株抗体中产生)、一个人类CD8α的跨模区域、一个由人类4-1BB/CD137的共同刺激分子与CD3 zeta所组成的讯息区域。持续性表现此慢病毒载体主要是由延长因子1α(EF-1α)的启动子所驱动，另外其他遗传基因所代表意义如下：长末端重复序列(LTR)、Rev响应组件(RRE)、内部核糖体进入位点(IRES)、绿色荧光蛋白(eGFP)、土拨鼠肝炎病毒转录调控组件(WPRE)。图1B揭示了纯化后外外围血单核细胞与T淋巴球上的CD3与CD56抗原的表面染色结果。并且，FACS染色图中向上偏移(依Y轴方向)的细胞族群代表的是表现CD3的细胞群，而向右偏移(依X轴方向)的细胞族群则是代表表现CD56的细胞群。
图2A～2C为一系列的示意图揭示了UW022-CAR、UW024-CAR、UW026-CAR转殖至纯化的CD3淋巴球并在其表面表现的能力，以及该三种改良CD3淋巴球的增殖能力。图2A与图2B揭示了在转殖后的改良CD3淋巴球上Fab与绿荧光蛋白(GFP)的表现状况。并且如图2A所示，FACS染色图中向上偏移(依Y轴方向)的细胞族群代表的是表现Fab的细胞群(即代表CD19-CAR)，而向右偏移(依X轴方向)的细胞族群代表的是表现绿荧光蛋白的细胞群(即带有慢病毒载体的细胞)。图2B则是一统计数据用于揭示图2A中转殖后的改良CD3淋巴球上Fab与绿荧光蛋白(GFP)的表现状况。每笔数据代表三重复实验并平均后的数值。图2C是另一笔统计资料用以揭示转殖后的各种改良CD3淋巴球在不同时间点细胞数量增值的倍数。如同上述，每笔资料代表三重复实验并平均后的数值。
图3A～3F为一系列的示意图揭示了各种重组嵌合抗原受体19(CAR19)改良CD3淋巴球对于两种带有CD19抗原的血癌细胞株RS4；11与淋巴癌细胞株Raji的毒杀能力。图3A与图3B为细胞表面染色图用以揭示将上述不同重组嵌合抗原受体19改良CD3淋巴球与两种带有CD19抗原的癌细胞株一起培养24小时后，最后所残存的癌细胞数量。明确来说，FACS染色图中而向右偏移的细胞族群代表的是表现CD19阳性的细胞群(即RS4；11细胞或Raji细胞)。而图3C与图3D则统计资料用于揭示上述图3A与图3B的残存细胞数量。而每笔数据代表三重复实验并平均后的数值。图3E与3F则为酵素免疫吸附实验(ELISA)结果，其主要用于揭示将上述不同重组嵌合抗原受体19改良CD3淋巴球与两种带有CD19抗原的淋巴癌细胞一起培养24小时后，不同改良CD3淋巴球所分泌至培养液中的干扰素-γ(INF-γ)含量。其中，每笔数据代表三重复实验并平均后的数值。
图4A～4B为一系列的示意图揭示了各种重组嵌合抗原受体19改良CD3淋巴球对于带有CD19抗原的淋巴癌细胞株(RS4；11与Raji)的毒杀能力是与改良CD3淋巴球数目呈正相关。进一步说明，图4A揭示了以不同比例的各种重组嵌合抗原受体19改良CD3淋巴球与癌细胞株一起培养4小时，以测试改良CD3淋巴球的同种异体毒杀能力。其中该淋巴癌细胞包含具有CD19抗原(RS4；11与Raji细胞)与不具CD19抗原(K562细胞)的癌细胞株。并且，每笔数据代表三重复实验并平均后的数值。另外，图4B主要揭示了UW022转殖的改良CD3淋巴球与FMC63、UW024及UW026相比，具有能最佳的细胞毒杀能力，不论是针对RS4；11细胞或Raji细胞一起共同培养4小时后均有相同的结果。
图5A～5C为一系列的示意图揭示了活体内(in vivo)毒杀能力实验的设计以及各种重组嵌合抗原受体19改良CD3淋巴球的活体内毒杀能力。其中，图5A揭示了活体内(invivo)毒杀能力实验的各时间点所应执行的特定步骤。更进一步说明，NOD/SCID小鼠于起始日(Day 0)时注射淋巴癌细胞(Raji/Luc+细胞)。另外，各种重组嵌合抗原受体19改良CD3淋巴球则于Day7注射至小鼠中，之后每周进行活体影像照射。而图5B是活体影像系统照射结果，其用于揭示在不同时间点小鼠体内的淋巴癌(Raji/Luc+细胞)的生长情形。图5C则是统计数据用于揭示以活体影像系统侦测肿瘤大小所呈现出的生物冷光强度(BLI)，并用其结果来定量肿瘤的大小。并且每笔数据代表五重复实验并平均后的数值。
附图仅为示意图，且无限制。在附图中，为达到说明目的，一些组件的尺寸可能过大，且未按比例绘制。该尺寸和相对尺寸不一定对应于本发明的实际实施方式。本发明中的所有参考标记不得解释为对本发明中权利要求范围的限制。
具体实施方式
下文详细讨论了本发明说明中的实施例的制造和使用。然而，应当理解，以下实施例提供了许多可实施的概念，此类概念可能体现在各类具体情况中。以下所讨论的具体实施例仅说明了制造和使用实施例的具体方式，且未限制本发明说明的范围。
本发明内容主要有关于一种应用于治疗疾病或症状的医疗组成物及其制造方法，例如癌症但是不限于血液科恶性肿瘤(hematologic malignancies)或实质固体瘤(solidtumors)。更进一步地，本发明主要关于一种组成物包含重组嵌合抗原受体蛋白、用于表现重组嵌合抗原受体的载体以及具有蛋白或载体或两者的细胞。并且重组嵌合抗原受体分子具有如同抗体一样可对特定抗原有专一性的特性，并且在与特定抗原结合后可进一步透过其T细胞受体活化的区域去活化抗肿瘤的细胞免疫反应(cellular immune activity)。
此外，本发明内容的嵌合抗原受体蛋白主要为一种基因改造后的重组嵌合抗原受体蛋白。并且，重组嵌合抗原受体蛋白对于CD19抗原具有高度的专一性。因此，在本发明内容中的重组嵌合抗原受体蛋白即为重组嵌合抗原受体19或抗CD19的重组嵌合抗原受体。
本发明组成物中重组嵌合抗原受体19蛋白基本上包含三个主要区域，且分别位于细胞外区域(extracellular area)、细胞膜区域(cell membrane area)以及细胞内区域(intracellular area)。并且上述三个区域分别为：CD19抗原结合片段、跨膜区域以及讯息区域。一方面，CD19抗原结合片段是单链变异区片段，因此单链变异区片段具有一重链变异区域、轻链变异区域以及连接前述两者区域的连接序列。此外，重链变异区域包含第一氨基酸序列，而第一氨基酸序列选自SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12。而轻链变异区域包含第二氨基酸序列，而第二氨基酸序列选自SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:11。另一方面，跨模区域包含：CD28或IgG1或CD4或CD8α的跨模区域。又另一方面，讯息区域包含至少一个免疫受体酪氨酸激活基序或至少一个共同刺激分子。
在一些实施例中，本发明中重组嵌合抗原受体19蛋白仅由CD19抗原结合片段、跨膜区域以及讯息区域三个部分所构成。换句话说，重组嵌合抗原受体19蛋白只具有上述三个区域而不包含其他任何区域。并且，单链变异区片段仅只具有一个重链变异区域、一个轻链变异区域以及一个用于连接前述两者区域的连接序列。同样地，重链变异区域中的第一氨基酸序列为选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12三者其中一个；而轻链变异区域中的第二氨基酸序列为选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11三者其中一个。另一方面，跨模区域也仅只有包含CD28的、IgG1的、CD4的、CD8α的跨模区域中的其中一个。又另一方面，讯息区域也仅只包含免疫受体酪氨酸激活基序或共同刺激分子两者其中一个。
在一些实施例中，CD19抗原结合片段上的单链变异区片段还包含一连接序列，而连接序列选自SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16。在另一实施例中，本发明的组成物中的重组嵌合抗原受体19蛋白还包含至少一个连接序列位于两个蛋白区域之间，并且上述两个蛋白区域指的为单链变异区片段以外的其他蛋白区域。而连接序列包含一个序列选自SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16。
在一些实施例中，CD19抗原结合片段上单链变异区片段的数目为至少两个。换句话说，CD19抗原结合片段上有至少两个单链变异区片段。重链变异区片段上的第一氨基酸序列可为重复序列或任意组合的序列，且上述重复序列或任意组合序列可选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12。并且，轻链变异区片段上的第二氨基酸序列可为重复序列或任意组合的序列，且上述重复序列或任意组合序列可选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11。
在一实施例中，在本发明组成物中重组嵌合抗原受体19上单链变异区片段包含一特定第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的组合：SEQ ID NO：8与SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：10与SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：12与SEQ ID NO：11。
在一较佳实施例中，重组嵌合抗原受体19蛋白中所包含的重链变异区片段中的第一氨基酸序列是SEQ ID NO：8，而轻链变异区片段中的第二氨基酸序列是SEQ ID NO：7。
在一较佳实施例中，重组嵌合抗原受体19蛋白中的跨膜区域是CD8α的跨膜区域。
在一实施例中，重组嵌合抗原受体19蛋白中的讯息区域包含免疫受体酪氨酸激活基序和共同刺激分子两者。在另一实施例中，重组嵌合抗原受体19蛋白中的讯息区域的组合包含至少一个免疫受体酪氨酸激活基序和至少一个共同刺激分子。
在一实施例中，重组嵌合抗原受体19蛋白中至少一个免疫受体酪氨酸激活基序为CD3 zeta。
在一实施例中，重组嵌合抗原受体19蛋白中的讯息区域上的共同刺激分子包含CD27或CD28或CD30或4-1BB/CD137或OX40或HVEM的共同刺激分子。在一较佳实施例中，重组嵌合抗原受体19蛋白中的讯息区域上的共同刺激分子是4-1BB/CD137或CD28的共同刺激分子。
本发明还提供一个表现载体，其用于稳定表现上述重组嵌合抗原受体19蛋白。重组嵌合抗原受体19表现载体的骨架是选自专门应用于哺乳动物中的载体表现系统。较佳地，表现载体是慢病毒载体。并且，重组嵌合抗原受体19表现载体包含：CD19抗原结合片段序列、跨膜区域序列、讯息区域序列。一方面，CD19抗原结合片段序列还包含：重链变异区域、轻链变异区域、连接序列的三者核苷酸序列。进一步来说，重链变异区域的核苷酸序列包含：SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6三者其中一个。而轻链变异区域的核苷酸序列包含：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5，三者其中一个。在另一方面，跨模区域序列包含：CD28或IgG1或CD4或CD8α的跨模区域序列。又另一方面，讯息区域包含：免疫受体酪氨酸激活基序或共同刺激分子序列。
在一些实施例中，重组嵌合抗原受体19表现载体由一个骨架序列、一个CD19抗原结合片段序列、一个跨膜区域序列以及一个讯息区域序列。换句话说，重组嵌合抗原受体19表现载体仅只包含上述四个核苷酸序列而不包含其他任何核苷酸序列。此外，CD19抗原结合片段序列也仅只由三个核苷酸序列所构成。换句话说，CD19抗原结合片段序列只有重链变异区片段序列、轻链变异区片段序列以及连接序列。跨模区域序列也仅由一个序列所构成，即CD28或IgG1或CD4或CD8α的跨模区域序列，四者其中一个。讯息区域序列也同样只由一个序列所构成，即免疫受体酪氨酸激活基序或共同刺激分子序列，两者其中一个。
在一些实施例中，重组嵌合抗原受体19表现载体包含超过一个(即至少两个)重链变异区片段和轻链变异区片段核苷酸序列。换句话说，重链变异区片段核苷酸序列可为重复序列或任意组合的序列，且上述重复序列或任意组合序列可选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6。并且，轻链变异区片段核苷酸序列可为重复序列或任意组合的序列，且上述重复序列或任意组合序列可选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5。
在一些实施例中，重组嵌合抗原受体19表现载体包含特定的重链变异区片段和轻链变异区片段核苷酸序列组合，而该组合为：SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：1为一组；SEQ IDNO：4与SEQ ID NO：3为一组；以及SEQ ID NO：6与SEQ ID NO：5为一组。
在一较佳实施例中，重组嵌合抗原受体19表现载体中的重链变异区片段和轻链变异区片段核苷酸序列分别为SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：1。
在一些实施例中，重组嵌合抗原受体19表现载体包含至少两个跨膜区域序列。因此，跨膜区域序列可为重复序列或任意组合的序列，且重复序列或任意组合的序列是选自CD28或IgG1或CD4或CD8α的跨模区域序列。
在一些实施例中，讯息区域序列可为重复序列或任意组合的免疫受体酪氨酸激活基序或共同刺激分子序列。换句话说，免疫受体酪氨酸激活基序或共同刺激分子序列的数目为至少两个。
在一较佳实施例中，重组嵌合抗原受体19表现载体的跨模区域序列为CD8α的跨模区域序列。
在一较佳实施例中，重组嵌合抗原受体19表现载体的讯息区域序列中的免疫受体酪氨酸激活基序是CD3 zeta。
在一些实施例中，重组嵌合抗原受体19表现载体中的共同刺激分子序列包含：CD27的或CD28的或CD30的或4-1BB/CD137的或OX40的或HVEM的共同刺激分子序列。在另一实施例中，讯息区域中的共同刺激分子的数目为至少两个，因此，共同刺激分子序列可为重复序列或任意组合的CD27的或CD28的或CD30的或4-1BB/CD137的或OX40的或HVEM的共同刺激分子序列。在一较佳实施例中，重组嵌合抗原受体19表现载体中的共同刺激分子序列仅只有一个，即4-1BB/CD137或CD28的共同刺激分子序列。
本发明还提供一个医药组成物，包含一群基因改造的细胞，且上述基因改造细胞可以稳定表现至少一个如上述的具有特定组成的重组嵌合抗原受体19蛋白或表现载体。在另一实施例中，该医药组成物中的基因改造细胞同时具有至少一个如上述的具有特定组成的重组嵌合抗原受体19蛋白或表现载体。
在另一实施例中，本发明所提供的一个医药组成物，仅只由一群基因改造细胞所组成，而基因改造细胞可以稳定表现至少一个如上述的具有特定组成的重组嵌合抗原受体19蛋白，或是具有至少一个如上述的具有特定组成的重组嵌合抗原受体19表现载体。换句话说，此医药组成物中仅只有基因改造细胞而不包含其他医药成分(例如：抗癌药)。更进一步，基因改造细胞身上仅只具有重组嵌合抗原受体19蛋白、重组嵌合抗原受体19表现载体或同时包含以上两者。
在一些实施例中，该医药组成物中的改造细胞为哺乳动物细胞。在另一实施例中，该医药组成物中的改造细胞为淋巴球细胞。更进一步地，在一较佳实施例中，该医药组成物中的改造细胞为带有CD3的淋巴球细胞(例如：T细胞)。
本发明更提供一种治疗方法，其主要用于治疗疾病或症状，而该疾病或症状主要特征为患者大量表现某特定抗原。一方面来说，该疾病较佳是癌症，例如：慢性淋巴性白血病。在另一方面，大量表现的抗原为CD19。而该治疗法包括下述步骤：在步骤(a)中从至少一个哺乳动物供体中分离出外围血液，并且淋巴球被进一步地从外围血液中分离出于步骤(b)中。在步骤(c)中通过分离出的淋巴球被用于产生医药组成物。在步骤(d)中以至少一种化学治疗剂施用于至少一个哺乳动物受体。接下来，将该医药组成物注射至哺乳动物受体。明确来说，本方法中的医疗组成物为一群基因改造淋巴球细胞，并且其身上可表现至少一个如前述的重组嵌合抗原受体19蛋白，或是带有至少一个如前述的重组嵌合抗原受体19重组载体。在另一实施例中，该医疗组成物中的基因重组淋巴球上不仅只具有如前述的重组嵌合抗原受体19蛋白，还带有如前述的重组嵌合抗原受体19重组载体。
在另一实施例中，该治疗方法仅包含如前述的步骤(a)至(e)，换句话说，用于治疗一个患有所述疾病(例如癌症)的哺乳动物的方法仅只有5个步骤。
在一实施例中，该治疗方法中的步骤(c)还包含扩增表现嵌合抗原受体(CAR)的淋巴球的步骤。
在一实施例中，用于该治疗方法中的医疗组成物对于哺乳动物供体和哺乳动物受体是自体的。换句话说，该医疗组成物中的重组细胞是从一个哺乳动物供体上分离出来的，并且在人工重组后再注射回哺乳动物供体中。在另一个实施例中，用于该治疗方法中的医疗组成物对于哺乳动物供体和哺乳动物受体是异体的。换句话说，哺乳动物供体和哺乳动物受体不是同一个。
在一个较佳实施例中，用于该治疗方法中医疗组成物的淋巴球细胞为带有CD3的淋巴球细胞(即T细胞)或是带有CD56的淋巴球细胞(即NK细胞)。
定义说明
在各类图示和说明性实施例中，类似的参考数字用于表示类似组件。接下来我们将详细参考附图中所示的典型实施例。附图和描述中尽可能使用相同的参考数字来表示相同或相似部件。在附图中，出于清晰和方便目的，形状和厚度可能会放大。根据本发明说明，本发明说明的描述将特别针对构成装置的一部分、或直接与装置一同工作的组件。应当理解，对于未具体表示或描述的组件，其形式可能多种多样。本发明说明中，「一项实施例」或「某一实施例」的引用是指关于该实施例所描述的某一特定特征、结构、或特性包括于至少一项实施例中。因此，本发明说明中不同位置出现的短语「在一项实施例中」或「在某一实施例中」不一定均指同一实施例。此外，上述特定特征、结构或特性可通过任何适宜方式在一项或多项实施例中进行组合。应当理解，以下附图未按比例绘制；更准确地说，此类附图仅可用于说明。
在附图的各类视图中，类似参考编号用于标示相同或相似的组件，同时表示和描述了本发明说明的说明性实施例。附图不一定按比例绘制，且在某些情况下，为达到说明目的，附图已放大和/或简化。本领域中的普通技术人员根据本发明说明的以下说明性实施例来理解本发明说明的多种可能的应用和变体。
除非另有定义，否则本文使用的所有术语(包括科技术语)的意义与本发明说明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。应当进一步理解，常用词典中定义的术语的含义应当与相关领域和本发明说明的上下文中的含义一致，且不会解释地过于理想化或过于正式，除非本文中明确定义。
当本文在叙述一个可测量的数值时(例如：数量或周期等等)，本文所使用的「大约」是指数值±20％或是±10％，其较佳范围为±5％，而更佳范围为±1％。并且进一步更佳范围为一个特定数值的±0.1％，因为数值范围适合实施本发明的内容。
本文中所使用的「活化」是用来形容一个T细胞的状态，且该状态是指T细胞已接受充分的刺激而产生可被侦测的细胞增殖。并且，活化还可伴随着诱导性细胞激素的产生，以及可被侦测的作用功能。除此之外，「活化T细胞」是指T细胞可以进行细胞分裂。
本文中所使用的「抗体」是指一个免疫球蛋白分子，且其可专一性的与一个特定抗原结合。抗体的来源可以自然产生的或是通过重组方法所产生的完整分子或是具有免应反应能力的部分。典型的抗体为四聚体的免疫球蛋白。本发明中的抗体可以以不同的形式存在，例如：多株抗体、单株抗体、变异区片段(Fv)、抗原结合区片段(Fab)、双抗原结合区片段(Fab)2、单链抗体以及拟人化抗体。
本文中所使用的「抗体片段」是指一个完整抗体的一部分，并且是指完整抗体的抗原决定变异区域。举例来说(但不限定本发明)，抗体片段包括：抗原结合区片段(Fab)、双抗原结合区片段(Fab)2、变异区片段(Fv)、线型抗体、单链变异区片段抗体(scFv)以及由不同抗体片段所形成的多专一性抗体。
本文中所使用的抗体「重链」是指在所有抗体自然构型存在的状况下，抗体中的两种多胜肽中较大的多胜肽。
本文中所使用的抗体「轻链」是指在所有抗体自然构型存在的状况下，抗体中的两种多胜肽中较小的多胜肽。κ链和λ链则是抗体轻链主要存在的两种构型。
本文中所使用的「合成抗体」是指一个通过重组基因技术所产生出来的抗体，举例来说：例如本文所揭示的利用噬菌体所表现的抗体。另外，「合成抗体」也可理解为一个抗体是通过一段可以转译出抗体的基因序列而产生，或是由一段可以转录出抗体的氨基酸序列而产生。其中，该基因序列或是氨基酸序列可通过此领域的通常知识的基因或氨基酸序列合成技术而获得。
本文中所使用的「抗原」是指一个可以引起免疫反应的分子。免疫反应可能包括：抗体的产生、特定免疫活性细胞或是同时包括上述两者反应。此领域的通常知识者可以了解任何巨分子(包括几乎所有的蛋白质或是胜肽)可做为抗原。此外，抗原可由重组基因或遗传体基因(genomic DNA)衍生而来。此领域的通常知识者可以了解本文中所使用的「抗原」包括任何基因(包括一个完整的或是部分的核苷酸序列)所形成的一个可以引起免疫反的蛋白质。更进一步，此领域的通常知识者也可以了解抗原不限于需要将一个核苷酸序列全部编译出。明显地，本发明包括(但不限于)使用一种基因以上的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种排列组合以引起所需的免疫反应。此外，此领域的通常知识者可以了解抗原可以完全不需要由「基因」产生。明显地，抗原也可以是合成出来的或是由生物样品中所衍生出来的。而生物样品可包括(但不限于)组织样品、肿瘤样品、细胞或是生物液体。
本文中所使用的「抗肿瘤能力」是指一个生物能力包括：减小肿瘤体积、减少肿瘤细胞数目、减少转移细胞数目、延长生命周期或是改善与肿瘤相关的各种生理学症状。「抗肿瘤能力」也可指本发明中胜肽、多核苷酸、细胞或是抗体在第一时间防止肿瘤发生的能力。
本文中所使用的「自体的(autologous)」是指来自于相同个体的任何物质，并且随后其再次进入个体。
本文中所使用的「异体的(allologous)」是指来自于不同个体的任何物质，并且随后其再次进入个体。
本文中所使用的「同种异体的(allogeneic)」是指接受由相同物种但不同动物所衍生的移植物。
本文中所使用的「异种异体的(xenogeneic)」是指接受由不同物种且不同动物所衍生的移植物。
本文中所使用的「癌症(cancer)」是用于定义一种疾病，其特征在于细胞的生长是快速且不受控制的。癌症细胞可以在局部扩散或通过血液和淋巴系统扩散到身体的其他部位。癌症举例来说(但不限制)包括：乳癌，前列腺癌，卵巢癌，子宫颈癌，皮肤癌，胰腺癌，结肠直肠癌，肾癌，肝癌，脑癌，淋巴癌，白血病，肺癌等等。
本文中所使用的「共刺激配体(co-stimulatory ligand)」是指抗原呈现细胞(APCs；例如：树突细胞、B细胞等等)上的一种分子，而该分子可以与T细胞上的一个同源共刺激分子专一性结合而产生一个讯息。并且，除了T细胞受体(TCR)/CD3与载有胜肽的一个主要组织兼容性复合物(MHC)分子结合而产生的第一讯息之外，该讯息也可调节T细胞的反应。该反应包括(但不限于)细胞增生、活化、分化等等。共刺激配体可包括(但不限于)：CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、ICOS-L、ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、LT-βR、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、可与类铎受体(TLRs)结合的活化剂或抗体、可与B7-H3专一性结合的配体。共刺激配体还包括可与T细胞上的共刺激分子专一性结合的抗体，例如(但不限于)：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、可与CD83专一性结合的配体。
本文中所使用的「共刺激分子(co-stimulatory molecular)」是指T细胞上可与共刺激配体专一性结合的同源结合配偶体，且通过调控T细胞的共刺激反应，例如(但不限于)：细胞增生。
本文中所使用的「共刺激讯息(co-stimulatory signal)」是指一个讯号，包括：一个引导T细胞增生的第一讯息(例如：T细胞受体与CD3的接合)和/或正向调节或负向调节的关键分子。
本文中所使用的「疾病」是用以形容动物的健康状态呈现无法维持体内平衡(homeostasis)，并且其中如果疾病没有改善，则动物的健康将继续恶化。相对地，「失调」是用以形容动物的健康状态是呈现可维持体内平衡，但是动物现阶段的健康状态不如没有失调(disorder)时的状态。然而，若继续不治疗则不一定会进一步导致动物的健康状况下降。
本文中所使用的「有效数量(effective amount)」是指一个数量可以提供一个具有治疗或预防的效果。
本文中所使用的「编译(encoding)」是指多核苷酸(例如：基因、互补脱氧核糖核酸(cDNA)或讯息核糖核酸(mRNA))中特定核苷酸序列的固有特性，用以作为合成其它聚合物和大分子的模板于生物过程中。该模板具有特定的核苷酸序列(例如：核糖体核糖核酸(rRNA)，转移核糖核酸(tRNA)和讯息核糖核酸)或是特定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性。如果相对应于基因的讯息核糖核酸被转译且转录出蛋白质在一个细胞或生物系统中，则一个基因编译出一个蛋白质。
本文中所使用的「外源的(exogenous)」是指任何物质由一个生物体外、细胞外、组织外、系统外而来，或是产生出来。
本文中所使用的「表现」是用以定义一个特定的核苷酸序列由其启动子所驱动而发生转录和/或转译。
本文中所使用的「表现载体」是指一个载体包括一个重组的多核苷酸用(其包括与待表达的核苷酸序列有效连接的表达控制序列)。表现载体包括足够用以表现的顺式作用(cis-acting)组件；而其他用以表现的组件可以由宿主细胞或一个体外表现系统所提供。表现载体包括此领域所属通常知识可思及的载体，例如：黏性质体(cosmid)、质体(plasmid)(例如：裸露的或包括在微脂体中)和包括重组多核苷酸的病毒(例如：慢病毒、反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
本文中所使用的「免疫球蛋白(immunoglobulin)或(Ig)」是指一种类型的蛋白质，其具有抗体的功能。由B淋巴球所表现的抗体，在些许情况中是指B细胞受体(BCR)或抗原受体。而上述此种类型蛋白质可分为五种，其分别为：免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白E(IgE)。其中，免疫球蛋白A主要是存在于身体的分泌物中，例如：唾液、眼泪、乳液、消化系统中分泌物以及黏液。免疫球蛋白G则是最常见的循环抗体。免疫球蛋白M则是大多数动物体中初次免疫反应中主要的免疫球蛋白，并且也是在凝集反应(agglutination)、补体结合(complement fixation)或其他抗体反应中最有效率的免疫球蛋白。而且在对抗细菌或是病毒的免疫反应中，免疫球蛋白M也扮演最重要的脚色。免疫球蛋白D的功能虽尚未被透彻了解，但是已知的是其也可以作为一种抗原受体。免疫球蛋白E则是在调控过敏反应(hypersensitivity)中扮演重要的角色。其主要透过聚集肥大细胞(mast cells)以及嗜碱性球(basophils)与过敏原(allergen)反应。
本文中所使用的「分离(Isolated)」是指变更(altered)或移出一个原本常态的状态。举例来说，核苷酸或胜肽自然存在一活体中并非一「分离」状态，但是上述同样的核苷酸或胜肽若是「部分地」或「完全地」从与其共同存在的常态物质中分离出，此一状态即为「分离」状态。一个分离的核苷酸或胜肽可存在于一实质的纯化状态，或存在一非自然状态的环境，例如：宿主细胞中。
本揭示的以下内文中的缩写为此领域的通常知识者用以代表特定核苷酸的缩写，其中「A」指的是腺嘌呤核苷酸、「C」指的是胞嘧啶核苷酸、「G」指的是鸟嘌呤核苷酸、「T」指的是胸腺嘧啶核苷酸、「U」指的是尿嘧啶核苷酸。
除非有特别说明，本文中的「一个用以编译氨基酸的核苷酸序列」是包含彼此简并(degenerate)形式并编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。而「一个用于编译蛋白质(protein)或核糖核酸(RNA)的核苷酸序列」其中也可能包含内含子(introns)以延长核苷酸序列。因此，在某些状态之下用以表现某些蛋白质或核糖核酸的核苷酸序列包含内含子序列。
本文中所使用的「慢病毒(lentivirus)」是指反转录病毒科家族(Retroviridaefamily)中的一类。反转录病毒是一种独特的病毒可以感染非分裂中(non-dividing)的细胞。并且其可以将显著数量的遗传讯息插入宿主的脱氧核醣核酸(DNA)中，因此其为一非常有效的工具用于作为基因载体。而常用的型态包含：HIV、SIV、FIV等等。而从慢病毒所衍伸出的基因载体提供了一个非常有效的工具将基因转入活体(invivo)中。
本文中的「大量表现(hyperexpression)」癌症蛋白质主要是指在一病患中特定器官或是组织上的细胞所带有的癌症抗原表现量明显超高于或多于其相对存在一正常人中的表现水平。而病患是否患有硬质瘤或是恶性血液肿瘤可通过标准测试侦测癌症抗原是否大量表现为该领域所属通常知识者所熟知。
本文中的「注射(administration or administering)」免疫性的组成物包含：皮下注射(s.c.)、静脉注射(i.v.)、肌肉注射(i.m.)、脑池内注射(intrasternal injection)或点滴注射(infusion technique)。
本文中的「病人(patient)、受试者(subject)或个体(individual)」或其他类似的用词为彼此涵义相同，因此可以互相替换。并且，也可以代表任何动物或是其身上的可通过本文所提供的方法而修改的细胞(无论是试管中(invitro)或是原位(in suit)的状态)，在某些实施例中但非限制，病人或个体指的为人类。
本文中的「多核苷酸(polynucleotide)」指的为一个链状的核苷酸。此外核酸(nucleic acids)为核苷酸的多聚体。因此，据上述本文中的多核苷酸与核酸为可互相替换的用词。而此领域的通常知识者也可以理解核酸与多核苷酸为相等的用词，且可以被水解成核苷酸。而本文所使用的多核苷酸(但非限定)指的是所属领域通过各种方式所获得的核酸序列，其包含(但非限定)：重组方式(recombinant means)，举例来说为从一个重组基因库(recombinant library)或一个细胞的基因体(genome)利用习知的复制技术(cloningtechnology)或是聚合酶连锁反应技术(PCR)复制出核酸序列，或是利用合成技术而合成出核酸序列。
本文中的「胜肽(peptide)、多胜肽(polypeptide)以及蛋白质(protein)」为互相可替换的用词，其所指的为一种成分包含氨基酸残基(residues)且彼此之间的胜肽键是以共价键连方式连结(covalently linked)。一个蛋白质或是胜肽必须包含至少两个氨基酸，并且不限制蛋白质序列或是胜肽序列中氨基酸的最大数目。多胜肽包含任何胜肽或是蛋白质其具有至少两个或多个彼此以胜肽键连结的氨基酸。而本文中所指的是两短链，举例来说即习知的胜肽、单胜肽、寡胜肽(oligopeptides)以及单体(oligomers)，并且较长链通常为指习知的蛋白质，而其也具有多种存在型式，例如：具有生物活性的片段、实质同源的多胜肽、寡胜肽、同源二聚体(homodimers)、异源二聚体(heterodimers)、变种胜肽(variantsof polypeptides)、重组胜肽(modified polypeptides)、衍生物(derivatives)、类似物(analogs)、融合蛋白(fusion proteins)等等。多胜肽也包含自然的胜肽、重组的胜肽、合成的胜肽以及组合的胜肽。
本文中的「专一性结合(specifically binds)」为关于抗体。其主要用以形容一个抗体辨认一个特定的抗原，并且实质上也可与其他的相类似的抗原结合。举例来说，一个抗体与一个物种中的一特定抗原专一性结合，则该抗体也可以与其他物种中相同的抗原产生专一性结合。然而，跨物种辨识结合反应性本身并不会改变抗体的分类。在另一个例子中，一个抗体可与一个抗原专一性结合也可以与不同对偶的(allelic)抗原结合。并且上述的跨物种辨识结合反应性本身也不会改变抗体的分类。而在一些示例中，「专一性结合」也可以用于形容抗体、蛋白质或胜肽与一个第二化学物质之间的作用，即「专一性结合」是指透过化学物质上的一种特定结构(例如：抗原决定区(antigenic determinant)或是(epitope))；因此抗体会辨认具有特定结构的化学物质而非普遍性对蛋白质就会产生结合作用。若是某特定抗体会与抗原决定区域A而结合，而将该抗体与三种分子(分别为：不具有A、具有未标记的A以及有标记的A)反应，则该抗体与分子带有标记的A的结合量会相较于带有未标记的A来的少。
本文中的「刺激(stimulation)和扩增(amplification)」是指特定分子与刺激分子(例如：T细胞受体复合体(TCR/CD3 complex))结合后所诱导的初级反应(primaryresponse)，并且其伴随着讯息传递例如(但不限制)：由T细胞受体复合体所诱导的讯息传递。此外，本文中的「刺激(stimulate)或扩增(amplify)」用来描述刺激配体(stimulatoryligand)启动主要反应的过程。更进一步地，「刺激」与「扩增」可互相交替使用。而「刺激」也可以调控一个分子使其表现受到抑制，例如：抑制(down-regulation)转化生长因子β(TGF-β)的表现，和/或重新排列细胞骨架的结构等等。
本文中的「产生(generating)和扩增(amplifying)」一个组成物是指增加组成物的数量(例如：细胞数目)。因此，「产生」和「扩增」可互相交替使用。
本文中的「刺激分子(stimulatory molecule)」是指T细胞身上的分子，且其可以与抗原呈现细胞(antigen presenting cell)上的刺激配体产生专一性结合。
本文中的「刺激配体(stimulatory ligand)」是指一个由抗原呈现细胞(APC)(例如：树突细胞(dendritic cell)、B细胞(B cell)等等)所表现的配体(ligand)，而刺激配体可以与T细胞上的刺激分子作专一性结合并且进一步诱导初级免疫反应，例如(但是不限制)：活化、启动免疫反应、增生等等反应。所属领域的通常技术人员可以理解刺激配体特别是指：主要组织兼容性复合体Ⅰ(MHCⅠ)上装载着一个胜肽、一个可辨认CD3的抗体、一个超级激动剂(superagonist)可辨认CD28的抗体以及一个超级激动剂可辨认CD2的抗体。
本文中的「受试者(subject)」是包含在免疫反应中可被诱导(elicited)的活体组织，例如：人。而受试者还可包含：人、狗、猫、小鼠、大鼠、基因转殖物种等等。
本文中的「分离、纯化(purified)」是指一种细胞从一群混合细胞组成中被分离出。此外，本文中的「分离、纯化」也可指一种细胞从一群混合细胞所自然存在环境中被分离出。在一些示例中，一群被分离出的细胞为一均匀的细胞群。在其他示例中，「分离、纯化」仅用以形容一个细胞被从其自然状态的细胞群中被分离出来。在一些实施例中，细胞是被培养在试管中(invitro)环境。在其他实施例中，细胞并非被培养于试管中(invitro)环境。
本文中的「医药用(therapeutic)」是指包含治疗(treatment)以及预防(prophylaxis)。而医药用效果是指可抑制(suppression)、减缓(remission)或消除(eradication)一个疾病的症状。
本文中的「治疗(treat)」疾病是指减轻受试者身上因为疾病所产生的至少一个病征程度或是严重度。
本文中的「转染(transfected)、转型(transformed)或转导(transduced)」是指一个程序用以将外源(exogenous)核酸传送(transferred)或是导入(introduced)宿主细胞中。因此，以上三个词在用以形容此程序时是可以相互替换使用的。一个「转染的(transfected)、转型的(transformed)或转导的(transduced)」细胞是指一个已经将外源核酸导进细胞内的细胞。而细胞包含受试者的细胞及其后续所分裂出的细胞。
本文中的「载体(vector)」是指一种组成物包含：分离的核酸和可被用以作为传输体而将分离核酸送入目标细胞中的核酸。习知的数种载体包含(但不限制)：线型多核苷酸、多核苷酸与离子或是亲水物质的混合物、质体以及病毒。因此，「载体」包含一个可自动复制的质体或是病毒。而「载体」也可被解释为包含非质体或非病毒的物质而该物质可以驱使核酸进入细胞中，例如：聚赖氨酸(polylysine)物质、微脂体(liposomes)等等。而病毒载体举例来说包含(但不限制)：腺病毒载体(adenoviral vectors)、腺相关病毒载体(AAV)、反转录病毒载体(retroviral vectors)等等。
详细说明
本发明提供一种组成物用以治疗一种疾病、失调或症状以及组成物的制造方法。更明确地，该疾病包含癌症(例如：恶性血液肿瘤、硬质瘤、原位肿瘤或是转移肿瘤等)。较佳地，癌症为恶性血液肿瘤。更佳地，癌症为慢性淋巴性白血病。而其他疾病也可通过注射本发明的组成物，例如：病毒感染、细菌感染、寄生虫感染或是自体免疫疾病等等。
蛋白组成(Protein Composition)
本发明中一个医药组成物是一种重组嵌合抗原受体蛋白，并且其主要包含三个部分：细胞外区域(extracellular domain)、跨模区域(transmembrane domain)、细胞内区域(intracellular domain)。其中，细胞外区域包含一个能与目标专一性结合的组件，若没有特别说明则是指抗原结合区域(antigenbinding moiety)。跨模区域是用以链接细胞外区域与细胞内区域，并且支持细胞外区域立于细胞表面。细胞内区域或细胞质区域(cytoplasmic domain)还包含一个讯息区域。而讯息区域还进一步包含：至少一个免疫受体酪氨酸激活基序部分、至少一个共同刺激分子部分或是者两者任意的组合。共同刺激分子分子是一个非抗原受体的细胞蛋白，并且其在淋巴球与抗原的有效反应中扮演不可或缺的角色。
而在重组嵌合抗原受体蛋白的细胞内区域或细胞质区域，或是细胞外区与跨模区域之间，或是细胞质区域与跨模区域之间均可包含至少一个连接序列(linker)，或是换句话说至少一个间隙子区域(spacer domain)。本文中的「连接序列」基本上是指任何可以在任何蛋白质区域间以胜肽键作为连接功用的寡胜肽(oligopeptide)或是多胜肽(polypeptide)。因此，连接序列包含约300个氨基酸，较佳为约10～100个氨基酸，更佳为约10～50个氨基酸，最佳为约25～50个氨基酸。
抗原结合区域(Antigen Binding Moiety)
在一实施例中，本发明中的重组嵌合抗原受体包含一个与目标专一性结合的组件，若本文中无特别说明即指可被合成抗体所辨认的抗原结合区域。而抗原结合区域的选择主要是依据目标细胞表面上的配体数目及种类。举例来说，抗体结合区域的选择是为了要辨认目标细胞的表面标记(surface marker)，而该细胞与某特定疾病状态有关连。因此，上述例子中的细胞表面标记为一个配体用以作为本发明中重组嵌合抗原受体可辨识的抗原结合区域，其包含：病毒、细菌、寄生虫感染、自体免疫疾病以及癌症细胞。
在一实施例中，本发明中的重组嵌合抗原受体可被修改(engineered)而进一步标记一个欲了解的肿瘤抗原，其中主要方式为修改欲了解抗原的抗原结合区域，以使重组嵌合抗原受体可与肿瘤细胞上的抗原产生专一性地结合。而在本文中，「肿瘤抗原」或「大量表现失调的抗原」或「与大量表现失调症有关的抗原」指的是特定抗原与大量表显失调的疾病有关，例如：癌症。而本文中所讨论的抗原仅是众多中一示例，而并不局限本发明仅用于本文所揭露的范围。该领域所属通常知识者所依据本发明的发明而可易于思即的范围，本发明也涵盖的范围。
肿瘤抗原为肿瘤细胞所分泌出来并用以抑制免疫反应(例如：T细胞所调控的免疫反应)的蛋白质。而本发明中所选择的抗原结合区域是依据所欲治疗的癌症作为选择基础。在一实施例中，肿瘤抗原包含一个或多个与哺乳动物癌症有关的抗原结合区域(epitope)。通常，肿瘤会表现数种蛋白质且可用来作为免疫攻击的抗原。而这些分子包含(但是并不局限)：具组织专一性的抗原，举例来说，在黑色素瘤(melanoma)中为MART-1、tyrosinase、GP100；在摄护腺癌(prostate cancer)中为PAP、PSP。而其他目标分子则属于一群转型有关的分子(transformation-related molecules)例如：致癌基因HER-2/Neu/ErbB-2。另一群的目标抗原属于癌胚抗原(onco-fetal antigens)例如：CEA。在B淋巴瘤中，肿瘤专一性的个体遗传型(idiotype)免疫球蛋白包含：一个真正的肿瘤专一性免疫球蛋白抗原，且其在不同肿瘤中为不相同的。B细胞分化抗原，例如：流感病毒的血球凝集素、hen egg lysozyme、白蛋白、CD19、CD20、CD37等其他可以用来标定B淋巴癌的抗原。而上述的抗原中(CEA、HER-2、CD19、CD20、idiotype)已经些许被用以作为目标来生产单株抗体已引起被动免疫治疗(passive immunotherapy)，但是只有少部份成功的例子。
本发明中肿瘤抗原的种类也可以指肿瘤特异抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。肿瘤特异抗原仅只表现在肿瘤细胞中，而不表现在身体其他细胞中。而肿瘤相关抗原并非仅只表现在肿瘤细胞，而在正常细胞上也会表现。并且肿瘤相关抗原会表现于正常细胞上是因为当正常细胞无法引起免疫耐受性(immunologic tolerance)时。前述抗原仅在当免疫系统与抗原有反应时于肿瘤细胞上表现。肿瘤相关抗原仅在胎儿发育时(fetaldevelopment)表现于正常细胞上，并且该时期的免疫系统并未发展健全以及无法反应，或是抗原是以非常低的表现量存在于细胞表面。然而，肿瘤相关抗原在肿瘤细胞上的表现量则是非常高的。
本发明中的重组嵌合抗原受体可以依据感兴趣且欲标记的抗原而包含一合适的抗原结合区域，其可专一性的辨认抗原结合区域。举例来说，若感兴趣的抗原为CD19(即CD19为目标抗原)，则一个可以辨认CD19的抗体即可作为抗原结合区域而被包含进本发明的重组嵌合抗原受体。
跨膜区域(Transmembrane Domain)
关于跨膜区域，重组嵌合抗原受体可被设计成包含一个跨膜区域，且该跨膜区域是与细胞外区域(抗原结合区域)融合在在一起。在一些示例中，可以通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免这些结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化与受体复合物的其他部分产生相互作用。在另一实施例中，跨膜区域并不直接与抗原结合区域的任一区域直接连接。因此据上述，跨膜区域与抗原结合区域之间存在只少一个短胜肽(例如连接序列)。
跨膜区域的来源可以是自然存在的或是以合成方式产生出来的。其中，若是选择自然存在的，则跨膜区域可以是由任何与膜结合的蛋白或是膜蛋白。本发明中使用的跨膜区域可由或至少包含下述的T细胞α、β、ζ链、CD28、CD3 epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、IgG1、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154任一或任意组合的跨膜区域。或是，跨膜区域可通过合成方式，且合成跨模区域主要是疏水性残基(hydrophobicresidues)例如：白氨酸、缬草氨酸。较佳的为在每个跨膜区域尾端带有由苯丙氨酸、色氨酸以及缬草氨酸三个连续氨基酸序列。可选择地，一个短寡胜肽连接序列或多胜肽连接序列(较佳地为2～10个氨基酸长度)在重组嵌合抗原受体的跨膜区域以及细胞质的讯息区域间做为连接序列。另外，甘氨酸与丝氨酸组成的连续氨基酸序列为一较合适的连接序列。
在一实施例中，本发明中重组嵌合抗原受体的跨膜区域为CD28、IgG1、CD4、CD8α其中一个，或是这四个任意的组合。在另一较佳实施例中，重组嵌合抗原受体的跨膜区域较佳为CD8α的跨膜区域。
讯息区域(Signaling domain)
本发明中重组嵌合抗原受体的讯息区域或是细胞质区域，若本文无特别限定则是指负责活化免疫细胞中至少一个正常功能的区域。本文中「有效功能」是指某一特定免疫细胞的免疫功能。淋巴球的有效功能(特别是指CD3淋巴球)举例来说为毒杀作用(cytolyticactivity)或是辅助作用(helper activity)，其中辅助作用包含：分泌细胞激素(cytokines)。因此「讯息区域」代表的是蛋白质的一特定部分，其用以传递有效功能的讯息并且引导细胞展现的功能。通常来说，整个细胞内讯息区域会完整使用，然而在一些示例中使用完整的细胞内讯息区域是不必要的。针对作为讯息区域的传递部分的区域，传递部分的区域可以用来代替整个蛋白质。因此，讯息区域代表包含任何讯息传递部分的区域可以被来传递有效功能的讯息。
本发明的一较佳的示例，重组嵌合抗原受体包含T细胞受体的细胞膜部分序列，以及其共同受体(co-receptor)。此两个区域均作为在抗原受体与配体接触后启动后续讯息传递的作用。另外只要是相似的序列或是通过合成相似的序列均可达成相同的讯息传递的作用。
目前已知为仅只靠T细胞受体(TCR)是无法达成T细胞完整的活化，所以第二讯息(secondary signal)或是共同刺激讯息(co-stimulatory signal)也是必要的。因此，T细胞的活化是透过两个不同的讯息讯列：一个为透过T细胞受体(即主要讯息序列)而启动抗原依赖主要活化(antigen-dependentprimary activation)，以及透过非抗原依赖方式(antigen-independent manner)而提供第二讯息或共同讯息。
主要讯息区域调控T细胞受体复合体的主要活化，不论于受到刺激的过程或是受到抑制的过程。主要讯息区域在受到刺激的过程中还可以包含讯息区域(即为已知的免疫受体酪氨酸激活基序)。此外，第二讯息区域或共同讯息区域在上述刺激过程中还可包含一个讯息区域(即为已知的共同刺激分子)。
而本发明中示例的免疫受体酪氨酸激活基序所包含的主要讯息区域则可选自TCRzeta、FcR gamma、FcR beta、CD3 gamma、CD3 delta、CD3 epsilon、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d。此外，本发明中较佳的讯息区域中的免疫受体酪氨酸激活基序是CD3 zeta。
在一较佳实施例中，在重组嵌合抗原受体中讯息区域中的免疫受体酪氨酸激活基序可设计成为CD3 zeta的讯息区域本身或是包含如本文其他细胞质区域的部分。举例来说，重组嵌合抗原受体的细胞质区域除了包含CD3 zeta的部分外，还包含共同刺激讯息区域。而共同刺激区域则是指重组嵌合抗原受体具有共同刺激分子的细胞内区域。共同刺激分子是一个细胞表面分子，但细胞表面分子不包含抗原受体或其相对应的配体，并且受体是指淋巴球与抗原反应时所必须的受体。而上述分子举例来说可包含：CD27、CD28、4-1BB/CD137、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、HVEM、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、可与CD83专一性结合的配体等等。因此，当本专利说明以4-1BB/CD137作为共同刺激讯息分子时，其他如上所示或是本领域的通常知识者通过本发明而能得知的分子均在本发明范围之内。
本发明重组嵌合抗原受体其细胞质讯息区域的免疫受体酪氨酸激活基序与共同刺激分子的排列顺序可以为任意方式或是有特定序列。可选择地，短胜肽连接序列或是多胜肽序列(较佳为约2～10氨基酸长度)可作为上述两者之间的连接序列。而甘氨酸与丝氨酸双体则为较合适的连接序列。
在一实施例中，讯息区域并不只有免疫受体酪氨酸激活基序，还具有共同刺激分子(例如：CD27、CD28、CD30、4-1BB/CD137、OX40、HVEM或上述任一的组合。在另一实施例中，重组嵌合抗原受体细胞内区域的共同刺激分子包含4-1BB/CD137。而在一较佳实施例中，讯息区域包含免疫受体酪氨酸激活基序和共同刺激分子。其中免疫受体酪氨酸激活基序为CD3 zeta，而共同刺激分子则为4-1BB/CD137的共同刺激分子部分。
载体(Vectors)
本发明中还提供一个基因载体，其包含重组嵌合抗原受体的核酸序列。更进一步，核酸序列包含抗原结合片段核酸序列可操作地与跨膜区域的核酸序列以及讯息区域的核酸序列连结。而上述用以产生所预期分子的核酸序列可通过目前习知重组技术来达成，举例来说，通过筛选一个细胞的表达基因库、或是表达一个基因在体且其带有如上所述的基因、或直接由细胞或组织中直接分离出来等等。此外，基因也可以通过合成方式直接合成或选殖(clone)出。
因此本发明所提供的载体可以带有本发明分子的DNA。而载体是由反转录病毒(例如：慢病毒(lentivirus))所产生，因为其为一较佳工具用以将基因长时间表现于一特定细胞。主要原因为通过反转录病毒送至细胞的基因可长时间并且稳定的表现于目标细胞及其子代细胞中。而从慢病毒衍生出的载体相较于由原致癌反转录病毒(onco-retroviruses，例如：MLV)所衍生出的载体还具有一优势，即可将目标基因送入一个不分裂(non-dividing)的细胞，例如：肝细胞(hepatocytes)。并且，它们还具有低致免疫性(lowimmunogenicity)的优势。
简而言之，表现一个可编译出重组嵌合抗原受体的自然或是合成的核酸，可通过操作性连结该核酸和启动子，且将该建构物纳入表现载体。表现载体适合进行复制于真核细胞(eukaryote)中或被包含于真核细胞中。典型的选殖表现载体包含：转录(transcription)或转译终止子(translation terminator)、启动序列(initiationsequences)以及用以调节欲表现核酸序列的启动子(promoter)。
本发明中所揭露的表现载体也可用于核酸疫苗(nucleic acid immunization)或是基因疗法(gene therapy)并搭配标准基因转殖方法。因此在一实施例中，本发明提供了一个基因治疗表现载体。
而上述的核酸可被选殖进一些不同型态的表现载体。举例来说，核酸可被选殖至(但不限制)：plasmid、phagemid、phage derivative、animal virus、cosmid。而表现载体又可以依据不同用途分为：表现载体(expressionvectors)、复制载体(replicationvector)、探针制备载体(probe generation vector)、定序载体(sequencing vector)。
更进一步，本文中表现载体备用以感染细胞时是以病毒载体的形式。而病毒载体的技术是所属技术领域的通常知识者所习知的技术。病毒被用于携带表现载体包含(但并不限制)：反转录病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)、腺微小病毒(AAV)、疱疹病毒(herpes viruses)、慢病毒(lentivirus)。通常来说，一个和是表现载体包含一个原位复制起始子适于至少一个特定物种、一个激活子序列、通用的限制内切酶切位以及一个或多个筛选基因。
一些病毒为基础的方则是因应要将核酸转殖入哺乳动物细胞中而产生的。举例来说，反转录病毒提供了一个通用的平台用以转殖基因。一个选择的基因可被插入表现载体中并且进一步包裹成病毒颗粒已为一习知技术。重组病毒可被分离出并送至特定个体的细胞中于活体外(ex vivo)或活体中。部分反转录病毒方法为习知技术。在一实施例中，慢病毒方法被用于将表现载体送至细胞中。
由于为了侦测重组嵌合抗原受体的表现量，因此被转殖入细胞的表现载体也同时具有一个筛选记号基因(selectable marker gene)、报导基因(reporter gene)或同时具有以上两者。且上述两者可进一步用于从一大群混合的细胞中辨识和筛选出带有表现载体的细胞。在另一方面，筛选记号基因还可带有用于共同转殖过程步骤的DNA。筛选记号基因与报导基因均与些许调控基因连接着，因此使其可以于宿主细胞中被表现。有用的筛选记号基因包含(并不限制)：抗药性基因(antibiotic-resistance genes)，例如：neo或其他类似功能的基因等等。
报导基因被使用于鉴别有被转殖入基因的细胞以及评估特定基因上的调节功能。大体来说，报导基因是一段不会被宿主器官或组织所表现的基因，并且其会编译出一段具有可被轻易侦测出特性(例如：酵素活性)的多胜肽。而侦测报导基因的时间为在将基因转殖入宿主细胞后的一特定时间。适合的报导基因可包含基因可编译出luciferase、beta-galactosidase、chloramphenicol acetyl transferase、secreted alkalinephosphatase、the green fluorescentprotein(GFP)gene。而其合适的表现系统为习知的知识，并且可使用目前习知技术来制备或是可直接通过市售获得。大体上来说，载体的结构包含一段一定的5’flanking region，且5’flanking region具有高度表现报导基因的能力，因此结构基因可视为启动子。启动子区域可与一个报导基因相连接，并且可被一种药剂所诱导而表现(即启动子驱动的转录)。在一实施例中，报导基因是使用GFP。
用以将基因导入以及表现于细胞中的方法是属于习知的知识。而在本文中所使用的表现载体可被轻易地通过各种习知技术转殖入宿主细胞(例如：哺乳动物、细菌、酵母菌或是昆虫细胞)。举例来说，表现载体可以转殖入宿主细胞通过物理性的、化学性的或生物性的方法。
将一段多核酸转殖入一个宿主细胞的物理性的方法包含：calcium phosphateprecipitation、lipofection、particle bombardment、microinjection、electroporation、gene gun等等。另外，用以制造细胞包含载体和/或多核酸的方法为所属领域的通常知识。其中，用以将一段多核酸转殖入宿主细胞的较佳方法为electroporation转殖法。
将一段多核酸转殖入一个宿主细胞的生物性的方法包含使用DNA载体或是RNA载体。病毒载体(更具体而言为反转录病毒载体)为目前最被广泛使用的方法用以将基因插入哺乳动物中(例如人类细胞)。而其他种类病毒载体可以由慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ、腺病毒、腺相关病毒(AAV)等等病毒衍生出。
将一段多核酸转殖入一个宿主细胞的化学性的方法包含：胶体分散系统(colloidal dispersion system)例如：macromolecule complexes、nanocapsules、microspheres、beads；以及脂质系统(lipid-based systems)例如：oil-in-wateremulsions、micelles、mixed micelles、liposomes。其中，一个用以运送囊泡于试管中或活体中的胶体分散系统的示例为liposomes(例如：人工膜囊泡)。
不论使用哪种方法将外源核酸引入宿主细胞均可已使用多种检测方法来确认宿主细胞中重组DNA序列的存在。而检测方法包含：举例来说，分子生物学检测方法为所属领域的习知技术(例如：Southern、Northern blotting、RT-PCR、PCR)；生化检测方法为侦测一个特定胜肽的存在或是减少(例如：通过免疫检测方法，即ELISA以及Westernblot)或是通过本文中的药剂来检测的方法均视为落入本发明的范围。
医药组成物(Pharmaceutical Composition)
本发明还提供一个医药组成物包含一群细胞(例如：淋巴球)，且细胞表现至少一个重组嵌合抗原受体蛋白或是具有至少一个重组嵌合抗原受体的DNA载体。因此，该细胞具有抗肿瘤的特性。
细胞的来源
在扩增和基因重组本发明中具有CD3的淋巴球前，具有CD3的淋巴球是从一个受试者中所获得。更进一步，具有CD3的淋巴球的来源为多种，包含：周边血中单核球细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、受到感染的组织、腹水、胸膜渗出液、脾脏组织、肿瘤等等。在本发明的某些实施例中，习知的具有CD3的淋巴球的数目均可被使用。在本发明的某些实施例中，具有CD3的淋巴球是从受试者血液中通过习知的方法(例如：FicollTM分离法)所分离出来。在一较佳实施例中，从一个体循环血液中所分离出的淋巴球是从血液分离产物获得。血液分离产物基本上为淋巴球，其包含：T细胞、单核球、颗粒性白血球、B细胞、其他种类白血球、红血球、血小板。在一实施例中，从血液分离产物中获得的血球可通过冲洗而去除血浆部分，并且将剩余细胞保存于合适的缓冲液或培养液中以进行后续步骤。在本发明中一实施例，是利用PBS冲洗该细胞并且将细胞保存于PBS中。在冲洗过后，细胞被重新均匀分散于数种生物兼容缓冲液中，举例来说，不含钙离子和镁离子的PBS，或其他生理食盐水(其可包含或不包含缓冲溶液)。另外，血液分离产物中不需要的物质在被分离出后，所剩下的细胞可以直接重新均匀分散于培养液中。
在另一实施例中，T细胞可通过将周边血的淋巴球中红血球溶解并去除单核球细胞后而被分离出，举例来说，通过使用PERCOLLTM梯度并搭配离心。T细胞中特别的次族群(例如：带有CD2和CD3)可以通过更进一步的正选(positive selection)或负选(negativeselection)技术而获得。举例来说，在一实施例中T细胞通过与具有anti-CD14、anti-CD16、anti-CD19、anti-CD36、anti-CD56、anti-CD123、anti-Glycophorin A的磁珠(即
Figure GDA0002616681450000421
Pan T Cell Isolation Kit II)反应一段时间，最后以负选技术而筛选出所要的T细胞。在一特定实施例中，较佳的分离出目标的T细胞是以「负选」的方式来筛选以进一步后续的活化(activation)和扩增程序。而且负选出的细胞也还可以进一步的再次进行筛选。
另外一种以负选技术来筛选出所要的目标细胞是通过抗体，而抗体是辨认负选细胞上所没有的细胞表面记号(cell surface marker)。而将细胞分离(sorting)和/或筛选出通过负选磁珠系统或是流式细胞仪的技术是使用单株抗体鸡尾酒(cocktail ofmonoclonal antibodies)，且其可以直接与复选目标细胞上的细胞表面记号结合而作为标记。
而依据本发明的内容，扩增的目标细胞来源可在任何必要的时间点收集，并且进一步分离和冷冻该细胞，例如：T细胞，即本文中的用于随后T细胞治疗中的任何数量的T细胞。在一实施例中，血液样本和血液分离产物是从一健康受试者上所分离出。在另一实施例中，血液样本和血液分离产物是从一健康受试者上所分离出，但是其具有潜在风险好发一特定疾病却尚未明显产生病征，并且所分离出的细胞先进行冷冻以供后续使用。在某些特定实施例中，T细胞首先进行扩增而随后被冷冻保存以供后续进一步使用。在某些特定实施例中，前述血液样本是从一病人身上所分离出来，且分离时间为于病人被诊断出患有本发明中所述疾病但是在施行治疗之前时。更进一步地，在一实施例中，目标细胞是从受试者的血液样本或血液分离产物中所筛选出来，且受试者还未接受任何的治疗，其包含但是不限定于natalizumab、efalizumab、antiviral agents、chemotherapy、radiation、immunosuppressive agents(包含：cyclosporin,azathioprine、methotrexate、mycophenolate、FK506、CAMPATH、anti-CD3 antibodies、cytoxan、fludarabine、cyclosporin、rapamycin、steroids、FR901228、irradiation)。更进一步地，在一实施例中细胞是从一病人身上所分离出来并且直接冷冻以供后续疗程使用(在刺激之前或是接续)，而疗程是指骨髓移植、干细胞移植、T细胞烧灼术(T cell ablative therapy)即使用化疗药剂例如：fludarabine、体外放射治疗(XRT)、cyclophosphamide、抗体(例如：OKT3、CAMPATH)。在另一实施例中，该细胞是事先被分离出来并冷冻保存而以利于之后治疗弹性使用，而治疗是指B细胞烧灼术(B cell ablative therapy)，并且其所使用的药剂为可与CD20反应的药剂，例如：Rituxan。
活化和扩增T细胞
无论是在利用基因重组T细胞来表现目标重组受体组成物之前或之后，T细胞可通过以下的方法来进一步活化以及扩增。
本发明中T细胞的扩增是通过一药剂与其细胞表面接触而刺激T细胞表面的CD3/TCR复合体与共同刺激分子。具体来说，本文的T细胞族群可使用以下方法刺激，例如：与anti-CD3抗体接触、anti-CD3的抗体结合片段、将anti-CD2抗体固定于T细胞表面、与protein kinase C activator(例如：bryostatin)结合calcium ionophore接触。而针对T细胞表面上的共同刺激分子，则是使用可与共同刺激分子结合的配体。举例来说，T细胞可与anti-CD3抗体与anti-CD28抗体接触，因而提供T细胞一适合的条件促使其开始增生(proliferation)。无论是刺激具有CD4或是具有CD8的T细胞进行增生，均可以使用anti-CD3抗体与anti-CD28抗体来达成。目前习知可以用来刺激T细胞增生活化的anti-CD3抗体，包含：HIT3a、UCHT1、OKT3(BD PharmingenTM,USA)(Kemper et al.,Nature 421.6921:388-92.2003；Li et al.,J.Immunother.35(2):189-95,2012)。另外，目前习知可以用来刺激T细胞增生活化的anti-CD28抗体，包含：CD28.2、L293、clone 15E8(BD PharmingenTM,USA)。并且使用上述抗体来刺激T细胞的方法为所属领域的通常知识者所习知的技术。
在另一实施例中，anti-CD3抗体与anti-CD28抗体被固定于磁珠上(可以于相同磁珠上即顺式(cis)刺激；或不同磁珠上即顺式(trans)刺激)。举例来说，用来作为提供第一活化信号(primary activation signal)的药剂为anti-CD3抗体或anti-CD3抗体结合片段，以及另外用来作为提供共同刺激活化信号(co-stimulatory signal)的药剂为anti-CD28抗体或anti-CD28抗体结合片段。并且，两个药剂均被固定于相同一个磁珠上以相同比例的数量。
在本发明中的进一步实施例中，该细胞(例如：T细胞)包含如前述具有药剂处理过的磁珠，而磁珠与细胞是彼此分散的，并且细胞进一步培养于细胞与磁珠混合液中。在另一实施例中，在培养之前，上述细胞与磁珠并不是彼此分开的而是混合在一起的。更进一步，在另一实施例中，细胞与磁珠被通过一额外应力(例如：磁力)而浓缩聚集，而增加了细胞表面记号的链接(ligation)，因此也诱导细胞的刺激。
在本发明的一实施例中，前述磁珠与细胞混合液培养时间从几小时(约3小时)至约14天，或是任何小时数之间的整数值。在另一实施例中，混合液的培养时间为21天。在另一实施例中，本发明中的T细胞与磁珠共同培养了2至3天。依据不同需求也可能需要数个刺激周期，使得T细胞的培养时间可以为60天或更长。适合于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如：RPMI Media 1640或是LGM-3TM Lymphocyte Growth Medium(Lonza)或是AIM-V)，其还可具有增加增生和活性所必需的要素，包括血清(例如；胎牛血清或人类血清)、白血球介素2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、白血球介素4(IL-4)、白血球介素7(IL-7)、颗粒单核球群落刺激生长因子(GM-CSF)、白血球介素10(IL-10)、白血球介素12(IL-12)、白血球介素15(IL-15)、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或是其他习知可以刺激细胞生长的物质。而其他习知用以刺激细胞生长物质包含但是不限定：surfactant、plasmanate、reducing agents(例如：N-acetyl-cysteine、2-mercaptoethanol)。而培养基可以包含：RPMI 1640、DMEM、MEM、α-MEM、F-12，另外可选择性地，培养基还可以包含氨基酸、丙酮酸钠、维他命、可包含血清或不含血清、荷尔蒙、细胞激素(cytokine)等可促使T细胞生长和扩增。抗生素(antibiotics)(例如：青霉素、链霉素)只用于实验过程中，若是细胞会进一步输入一受试者时，其细胞培养过程中并不会使用抗生素。而细胞均维持在支持其生长所需的条件下，例如：其合适温度(37℃)和大气环境(一般空气含有5％二氧化碳)。
T细胞在接受不同刺激时间下可能会产生不同特性。举例来说，典型血液或是周边血分离出的单核球产物中具有较多的辅助型T细胞族群(TH；CD4+)相较于毒杀型或抑制型T细胞(TC；CD8+)。透过刺激CD3和CD28受体达成活体外(Ex vivo)扩增T细胞所产生的T细胞族群，于刺激8至9天前主要是辅助型T细胞族群，而在8至9天后所产生的细胞族群则是毒杀型T细胞较多。因此，取决于治疗的目的，而决定使用何种主要T细胞族输入受试者是较有利的。类似地，如果已分离出抗原专一性的毒杀型T细胞，则较有利的是将细胞扩增至较大的程度。
治疗应用(Therapeutic Application)
本发明还包含一种转殖了慢病毒载体(LV)的细胞(例如：T细胞)。举例来说，慢病毒载体可编译出重组嵌合抗原受体，其受体包含：单链变异区域的抗原辨识区域、CD8α的跨膜区域、CD3 zeta或4-1BB/CD137或CD28或以上两者的讯息区域。因此，在一些条件下，转殖后的T细胞具有重组嵌合抗原受体诱导的T细胞反应。
本发明提供了一种利用重组嵌合抗原受体而使初代(primary)T细胞可以辨认特定肿瘤抗原。因此，本发明也提供一种方法用以针对某特定细胞族群或是组织而刺激产生T细胞所诱导的免疫反应，而该方法包含一个步骤将一种可表现重组嵌合抗原受体的T细胞注射至哺乳动物中。
在一实施例中，本发明中包含一种制造方法，其主要用以生产治疗哺乳动物患有大量表现CD19抗原的疾病、失调或症状的医药组成物。其中该制造方法包含：(a)如同前述的从至少一个哺乳动物的捐赠者(即捐赠人)中分离出外围血液；(b)从捐赠者的外围血液中分离出淋巴球；以及(c)通过所分离出的淋巴球依照前述的方法产生的医药组成物。其中，该医药组成物为CD3+淋巴球且该淋巴球包含如前述的重组嵌合抗原受体19蛋白或重组嵌合抗原受体19表现载体或是同时具有两者。在另一实施例中，本发明中的制造方法如同上述的步骤，但是其所产生的医药组成物中仅只有CD3+淋巴球，且CD3+淋巴球只具有重组嵌合抗原受体19蛋白或重组嵌合抗原受体19表现载体两者中的一种。又在另一实施例中，本发明中的制造方法如同上述的步骤，但是在步骤(c)中除了通过所分离出的淋巴球依照前述的方法产生的医药组成物，还进一步包含扩增表现嵌合抗原受体(CAR)的淋巴球的步骤。并且，扩增方法包含：磷酸钙处理法、基因枪注射法、病毒感染法、电穿孔法、显微注射法和脂质体处理法。
在一实施例中，本发明中包含一种细胞疗法，其中T细胞通过基因修饰以表现重组嵌合抗原受体，并且具有重组嵌合抗原受体的T细胞被注射至有需要的受试者。而上述被注射至受试者的细胞具有杀死受试者体内的肿瘤细胞的能力。与抗体疗法不同，上述基因修饰的T细胞可以在体内(invivo)不断复制而具有长期持续性，且可持续地控制肿瘤。
在一实施例中，本发明中的具有重组嵌合抗原受体的T细胞可以稳定地在活体内扩增，并且可以持续较长的时间。在另一实施例中，具有重组嵌合抗原受体的T细胞可以演变成可被再活化，以及抑制任何另外的肿瘤生成的特异性记忆性T细胞(memory T cells)。此外，由具有重组嵌合抗原受体的T细胞所引起的抗肿瘤免疫反应可以是主动(active)免疫反应或被动(passive)免疫反应。并且，重组嵌合抗原受体所调节的免疫反应可以是被动免疫疗法(adoptive immunotherapy)中的一部分，而其主要透过重组嵌合抗原受体上的抗原结合区域，并且驱使具有重组嵌合抗原受体的T细胞产生免疫反应。举例来说，一个具有重组嵌合抗原受体19的T细胞会对一个表现CD19(CD19阳性)的细胞产生免疫反应。
虽然本发明的慢病毒载体包含：衍生自单克隆抗体的CD19抗原结合片段、人类CD8α的跨膜区域、以及人类4-1BB/CD137和CD3 zeta信息区域，但应解释为包括本文中所述载体的每种组分的任何数目变化。也就是说，本发明包含使用任何抗原结合区域以产生对抗原结合区域专一性的重组嵌合抗原受体诱导的T细胞反应。举例来说，本发明的重组嵌合抗原受体上的抗原结合区域可用于针对治疗癌症的肿瘤抗原。
而本发明所可以应用治疗的肿瘤，包括未血管化(vascularized)或尚未实质上血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。并且，肿瘤还包含：非固态肿瘤(non-solid tumor)例如：血液肿瘤(例如：白血病、淋巴癌)，或可以包括固态瘤(solidtumor)。
在一实施例中，本发明中重组嵌合抗原受体的抗原结合区域是设计针对特定肿瘤。举例来说，重组嵌合抗原受体是针对CD19，因此可以用来治疗肿瘤或不适应症包含但是不限于pre-B ALL、adult ALL、mantle cell lymphoma、diffuse large B-cell lymphoma、salvage post allogenic bone marrow transplantation等。在另一实施例中，上述肿瘤或不适应症也可通过可与CD19、CD20、CD22、ROR1专一性结合的重组嵌合抗原受体而进行如前述的免疫疗法。
本发明中的重组嵌合抗原受体T细胞还可以作为哺乳动物活体外免疫(ex vivoimmunization)和/或活体内治疗(in vivo therapy)的一种疫苗。较佳地，哺乳动物为人。
活体外(ex vivo)程序为习知的技术，并且在以下内容做更完整的揭露。简而言之，首先将细胞从哺乳动物(较佳是人)中分离出，并且利用如前述所揭露的重组嵌合抗原受体的载体进行基因修饰(即在体外转殖或转染)。前述的具有重组嵌合抗原受体的细胞可以注射于哺乳动物受试者以提供其治疗益处。其中，哺乳动物受试者可以是人，并且修饰的细胞可以是来自于受试者本身的细胞。或者，相对于受试者，修饰的细胞可以是同种异体的(allogeneic)、同基因的(syngeneic)或异种异体的(xenogeneic)。
除了在体外免疫方面使用基于细胞型(cell-based)疫苗外，本发明还提供用于体内免疫的组合物和方法，以诱导针对患者抗原的免疫反应。
通常来说，如本文中上述活化和扩增的细胞可用于治疗和预防在免疫功能降低的个体中出现的疾病。特别地，本发明中的重组嵌合抗原受体T细胞可用于治疗慢性淋巴性白血病。在某些实施例中，本发明中的细胞用于治疗患有慢性淋巴性白血病风险的患者。因此，本发明还提供了用于治疗或预防慢性淋巴性白血病的方法，其包含向有需要的受试者注射有效治疗量的重组嵌合抗原受体T细胞。
本发明的重组嵌合抗原受体T细胞可以单独施用，也可以作为与稀释剂和/或其它成分(例如：白血球介素2、其它细胞因子、细胞群组合的药物等)一起施用。简而言之，本发明的医药组成物包含本文中的细胞群、一种或多种医药上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。而该组成物还可以包含：缓冲液(例如：中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等)。
本发明中的药物组成物可以较合适的方式给药以进行治疗(或预防)疾病。而给药的剂量和频率则将由患者的状况、类型和严重性等因素决定，尽管适当的剂量也可以通过临床试验来确定。特定类型患者的最佳剂量和治疗方案可通过医学领域的技术人员透过监测患者的疾病迹象并相对应地调整治疗来决定。
在特定实施例中，较佳地将活化的T细胞注射至受试者中，随后重新取血(或进行血液分离术)及依据本发明中前述的内容活化T细胞，并且再次注射这些活化和扩增的T细胞至受试者体内。而此一过程可以每几周进行一次。
将本发明中的医药组成物注射至受试者中的方式可通过任何方便的方式进行，包括通过气溶胶吸入(aerosol inhalation)、注射(injection)、摄取(ingestion)、输血(transfusion)、植入(implantation)或移植(transplantation)。注射方式包含：通过静脉内(i.v.)、腹膜内(i.p.)、皮下(subcutaneously)、皮内(intradermally)、肿瘤内(intratumorally)、肌肉(intramuscularly)等注射方式。在一实施例中，重组嵌合抗原受体T细胞组成物是透过皮内或皮下注射至受试者中。在另一实施例中，T细胞组成物也可以直接注射至肿瘤、淋巴结或感染部位中。
在更进一步的实施例中，本发明中具有重组嵌合抗原受体的T细胞可以与化学疗法、放射疗法、免疫抑制剂(例如：cyclosporin、azathioprine、methotrexate、mycophenolate、FK506)，抗体或其它免疫去除剂(immunoablative agents)(例如：CAMPATH、anti-CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素(cytoxin)、fludaribine、rapamycin、mycophenolic acid、类固醇、FR901228、细胞激素(cytokines)等等)一起使用。在另一实施例中，该细胞组成物与骨髓移植以及免疫去除疗法联合施行(例如：同时或之后)于患者中，其中并搭配使用化疗药物(例如：fludarabine、external-beam radiation therapy(XRT)、cyclophosphamide、抗体(例如：OKT3或CAMPATH))。在另一实施例中，本发明中细胞组成物于B细胞去除治疗(例如：通过与CD20有反应的药剂，即Rituxan)后才注射至受试者中。在另一实施方案中，所使用的化疗方法可从以下程序中选择出较佳的方式：(A)Flu/Cy-A：每日注射Fludarabine 30mg/m2持续3天，以及每日注射Cyclophosphamide 300mg/m2持续3天；(B)Flu/Cy-B：每日注射Fludarabine 30mg/m2持续4天，每日注射Cyclophosphamide500mg/m2持续2天；或(C)Flu/Cy-C：每日注射Fludarabine 25mg/m2持续3天，每日注射Cyclophosphamide 60mg/m2持续1天。
另外，上述给予受试者的治疗剂量将依据所治疗疾病和受试者的的确切状态而改变。并且给药剂量的增减可以根据所属领域的通常知识而进一步决定。
实验示例(EXPERIMENTAL EXAMPLE)
本发明进而透过以下实验示例进一步详细描述本发明实验过程。因此，以下的示例仅为了说明的目的而提供，除非另有规定，否则并不限制本发明的范围。因此，本发明绝不应被解释为仅限于以下的示例，而应理解为包括本发明中所提供的教示，以及其他对所属领域的通常知识者显而易见的任何变化。
不透过进一步的揭露，相信所属领域的通常知识者技术人员仍可以通过本发明中前述的内容和以下说明实施例进一步制备和利用本发明的目标，并且实践所要求保护的方法。因此，以下实验实施例具体指出了本发明中较佳的实施方式，但是其不应被解释为以任何方式限制本发明的其余部分。
以下揭露本发明的实验中所使用的材料和方法。
材料及方法(MATERIAL AND METHOD)
制备Anti-CD19 CAR慢病毒载体
mouse anti-human CD19 scFvs的抗体株是由Uwell Biopharma所制造。其中anti-CD19 scFv的序列经过进一步选择而增加其表现能力于人类细胞中。Anti-CD19 CAR基因载体(anti-CD19-scFv-CD8α-CD137-CD3ζ)，则是依据NCBI GenBank中所提供的基因序列而设计出。而整个Anti-CD19 CAR基因载体则进一步通过DNA定序(Genomics,Taiwan)确认所有基因编码是正确的。
产生慢病毒并测量病毒含量(viral titer)
首先，将DNA载体转殖至HEK 293T细胞中，其中搭配包裹殖体pCMVdeltaR8.91以及pMD.G(Academia Sinica,Taiwan)通过X-tremeGENE 9(Roche,Basel,Switzerland)。而具有病毒颗粒的悬浮液则进一步被收集，且透过Lenti-X Concentrator(ClontechLaboratories,Mountain View,CA)浓缩。浓缩后的病毒在分装后，随即置于-80℃中保存以供后续使用。本实验中所使用的所有慢病毒均是从上述冷冻保存原液中而来。慢病毒含量的检测则是透过SUP-T1细胞，并且是以三倍稀释为基础来检测。简而言之，50ul的三倍稀释浓度的慢病毒从1：3连续稀释至1：2,187/well的稀释慢病毒且再与SUP-T1细胞(20,000个/100ul/well)一起培养于96微孔盘中，并且培养至隔日。转殖两日后，SUP-T1细胞则通过Biotin-SP-conjugated AffiniPure Goat anti-mouse IgG,F(ab’)2fragment specific(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)抗体，并搭配PE-conjugated streptavidin(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)抗体进行染色。随后，带有CAR的细胞则是使用流式细胞仪(FACSCalibur cytometer,Becton Dickinson)进行检测，并搭配软件FlowJo进行分析。其中，仅需1～20％的CAR阳性细胞的稀释液进行含量计算。则计算方式为将CAR阳性细胞的百分比乘以每孔接种的细胞数(20,000个)，然后除以加入的上清液的实际体积(ml)，以确定上清液中转殖的慢病毒含量(单位/ml)。病毒感染剂量(MOI)的定义为病毒颗粒的转殖单位与目标T细胞数目的比率。
细胞株
HEK293T细胞和人类白血病细胞株(SUP-T1、Raji、RS4；11)均购自American TypeCulture Collection(ATCC；Rockville,MD)。其中，SUP-T1用于测量病毒含量试验中。另外，人类白血病细胞株K562购自Bioresource Collection and Research Center(BCRC；Hsinchu,Taiwan)。而Raji、RS4；11、SUP-T1、K562细胞均培养于RPMI-1640(Invitrogen,Carlsbad,CA)培养基中，而HEK 293T细胞则培养于DMEM(HyClone；GE Healthcare,SouthLogan,UT)培养基中；而上述两种培养基均添加10％胎牛血清(FBS；Gibco,Carlsbad,CA)和100mg/ml penicillin/streptomycin(Gibco,Carlsbad,CA)。
制备荧光肿瘤细胞
为了增加注射于免疫缺陷小鼠中的肿瘤细胞的视觉辨识率，因此进一步将Lentivirus-EF1alpha-MCS-IRES-Luciferase plasmid(Addgene，Cambridge，MA)转殖入Raji细胞中，随后具有较高Luc表现量的Raji-Luc细胞则通过FACSAria流式细胞分选仪(BDBiosciences,San Jose,CA)分选出。
转殖人类T细胞
周边血是从健康成年捐赠者的血液样本中获得，而该样本为从高雄荣民总医院机构审查委员会所准予(计划编号：VGHKS13-CT6-11)。首先，利用Lymphoprep密度梯度离心法(Nycomed，Oslo，Norway)从样品中分离出单核细胞，并且使用培养基洗涤两次。人类T细胞则是进一步使用抗体(CD14、CD16、CD19、CD36、CD56、CD123、CD235a)搭配磁珠套件(Pan TCell Isolation Kit II；Miltenyi Biotec)并进行负选(negitive selection)而纯化出。另外，T细胞上的CD3和CD56的表现百分比是通过CD3-PerCP和CD56-FITC抗体进行染色(BDBiosciences，San Jose，CA)并且搭配流式细胞仪(FACSCalibur，Becton Dickinson)测定。纯化的T细胞将培养于含有10％FBS、重组人类白血球介素2(rHuIL-2，50IU/ml；Proleukin，Novartis Pharma)、anti-CD3和anti-CD28磁珠(Thermo Fisher Scientific，Carlsbad，CA)的RPMI-1640培养基中，直到进行病毒转殖。在24小时内，使用相同MOI的慢病毒转殖上述的T细胞，以产生具有不同单链变异区片段所衍生的结合区域的重组嵌合抗原受体T细胞。每2天更换一次新的培养基且总共培养8天，第5天时将细胞转移到G-Rex 24微孔盘(Wolson Wolf Manufacturing，Sanit Paul,MN)中，至第8天细胞收成。最后，上述T细胞通过Biotin-SP-conjugated AffiniPure Goat anti-mouse IgG,F(ab’)2fragmentspecific抗体(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)与PE-conjugatedstreptavidin抗体(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)进行染色，以进一步检测具有重组嵌合抗原受体的T细胞的百分比为多少。
试管中功能试验(In vitro functional assays)
为了进一步检测anti-CD19重组嵌合抗原受体T细胞对B细胞恶性肿瘤的专一性抗肿瘤能力，因此以CD19阳性的RS4；11细胞和Raji细胞作为目标细胞，而CD19阴性的K562细胞则是作为对照细胞。将anti-CD19重组嵌合抗原受体T细胞(以E代表)和目标细胞(以T代表)依指定的比例(E：T)共同培养于96微孔盘中。培养24小时后，收集所以细胞并洗涤，且以PE-conjugated mouse anti-human CD19抗体(BD Biosciences,San Jose,CA)进行染色。最后透过FACSCalibur流式细胞仪分析CD19阳性细胞的百分比，即代表剩余的白血病细胞数量。
而前述培养细胞的上清液也被进一步收集，并且搭配使用酵素免疫分析法(ELISA)套件(R&D Systems Inc,Minneapolis,MN)以检测重组嵌合抗原受体在接触白血病细胞后所产生干扰素γ(IFN-γ)的含量。更明确地，使用微孔盘侦测仪(Anthos 2010,Biochrom Ltd.,Cambridge,UK)来测量每个孔中在波长450nm的吸亮度。细胞毒杀检验则是用以检测重组嵌合抗原受体T细胞的抗白血病的能力(anti-leukemia ability)。目标细胞(代表符号为T)首先被均匀悬浮于培养基RPMI-1640(含10％FBS)中，并且进一步以CalceinAM(BD Biosciences,San Jose,CA)标记细胞，最后平均分散于96孔平底微孔盘(Costar,Corning,NY)中。而重组嵌合抗原受体T细胞(代表符号为E)一样也是平均悬浮于培养基RPMI-1640(含10％FBS)中，并且以不同的细胞数量比例(E:T ratios)与目标细胞混合，并且共同培养4小时。之后，上述的混合细胞进一步以propidium iodide(PI)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)染色，而重组嵌合抗原受体T细胞的毒杀能力最后通过流式细胞仪FACSCalibur(Becton Dickinson)进一步检测，更明确地，是通过目标细胞中有多少细胞为呈现CalceinAM阳性和propidium-iodide阴性的状态，即呈现活细胞状态。
流式细胞仪检测
实验中的细胞均可通过流式细胞检测方法检测其细胞特性，无论细胞是通过Ficoll-Paque分离法所刚分离出的，或是先前冷冻保存的。而细胞的多维免疫免疫表型分析(Multi-parametric immunophenotyping)是以每种条件下以4×106个细胞去进行分析。另外，染色条件如以下内容所示，将细胞以每100ul中含1×106个细胞的浓度回溶于PBS中并至于冰上，之后使用抗体以制造商所推荐的试剂浓度在冰上进行染色30分钟。染色完毕再使用PBS洗涤。最后以流式细胞仪LSRII(BD Immunocytometry systems)(其内置蓝光雷射(488nm)、紫光雷射(405nm)、绿光雷射(532nm)、红光雷射(633nm)以及相对应合适的滤镜组合)以进一步分析经由上述染色过程处理后的细胞。其中，本实验中每次染色至少需要100,000个CD3+细胞。而在功能试验中，细胞同样经由上述过程进行洗涤、表面染色；而在此实验中每次染色至少需要50,000个CD3+细胞。荧光补偿值(compensation values)则是使用单抗体染色剂建立，并且使用流式细胞仪自动计算和应用。而数据的分析则是使用软件FlowJo(Version 8.8.4,Treestar)。
淋巴瘤动物实验(Xenogeneic Lymphoma Models)
我们使用联合免疫缺陷(SCID)－淋巴瘤人异种移植模式实验来测试不同的重组嵌合抗原受体(UW022、UW026和FMC63)修饰的CD3+淋巴球细胞在活体内的持久性和抗肿瘤作用。因此，免疫缺陷小鼠(简称ASID小鼠；品系：NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/YckNarl)则用于上述实验中，并且相关实验均依照高雄荣民总医院机构动物护理和使用委员会的要求而进行。
而本实验的第一步是将Raji/Luc+细胞植入小鼠中。因此，在第0天(Day 0)时将Raji/Luc+细胞(每只小鼠5×105个细胞)通过腹腔内注射(i.p.)注射ASID小鼠(8～10周龄；中国台湾实验动物中心)的腹膜内。而植入的Raji/Luc+细胞所形成的肿瘤则使用如下的体内成像系统进一步测量。简而言之，将D-luciferin potassium salt(剂量：3mg/小鼠；Perkin Elmer,Waltham,MA)利用腹腔内注射(i.p.)注射至小鼠的腹膜内，之后在每次需要检测时使用活体影像检测仪IVIS Spectrum(Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA)进行分析。从表现luciferase的细胞发出的光子(photon)则可以通过Living Image 3.0软件做进一步的定量。当小鼠所发出的光子达到1×1010个光子/秒时，则小鼠将进行安乐死，或者如果它们生理数值提早显示需要进一步提早安乐死的征兆，则小鼠将提早进行安乐死。
为了进一步测试具有不同anti-CD19的重组嵌合抗原受体(UW022、UW026和FMC63)修饰的CD3+淋巴球细胞的抗肿瘤作用，因此将上述不同修饰的淋巴细胞先进行扩增置所需数量。随后，将上述不同的anti-CD19重组嵌合抗原受体(UW022，UW026和FMC63)转殖的T细胞和模拟转殖的T细胞悬浮于培养基RPMI-1640(含10％FBS)中并扩增培养8天，之后，在Raji-Luc注射至小鼠后7天时(即Day 7)利用腹腔内注射(i.p.)注射(每只小鼠1×107个细胞)至小鼠腹膜内。在另一个实验控制组中，注射至小鼠中的是培养基而不是T细胞。
统计分析
本实验中的统计分析则是使用学生T检验(Student's t-test)来统计样本之间差异的显著性，并且当P<0.05则代表两者间具有显著差异。在淋巴瘤动物实验中的生物冷光影像结果，则是使用平均值±s.d来总结每组小鼠于不同时间点时期所发出的信号强度。
实验(EXAMPLES)
以下实验则是主要作为实例的提供，并不意图以任何方式限制本发明的范围。
实验一：不同重组嵌合抗原受体19的T细胞均呈现相似增生能力
三种具有不同的重组嵌合抗原受体表达载体(即UW022、UW024和UW026)通过前述的方法而构建出。进一步地，由UW022、UW024和UW026所形成的重组嵌合抗原受体19均具有类似结构组合，包含CD19抗原结合片段中的单链变异区片段(scFv)、CD8α的跨膜结构区域、信号结构区域由CD3ζ链(即免疫受体酪氨酸激活基序)和4-1BB/CD137(即共同刺激分子)所构成的讯息区域。此外，UW022、UW024和UW026重组嵌合抗原受体19中单链变异片段的重链和轻链的氨基酸组合有三种，分别是：SEQ ID NO：8与SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：10与SEQ IDNO：9；SEQ ID NO：12与SEQ ID NO：11。UW022、UW024和UW026中重组嵌合抗原受体19中单链变异区片段的重链和轻链的核酸序列组合是：SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：4与SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：6与SEQ ID NO：5。而在本实验中，另一个重组嵌合抗原受体19(FMC63)则用以作为对照比较。而UW022、UW024和UW026载体的转殖效率则可以通过载体上的GFP以及anti-Fab抗体来检测。根据图2A和图2B中GFP阳性的CD3+淋巴球细胞(即T细胞)的定量结果，转殖UW022载体的T细胞比其他细胞呈现具有最多的GFP阳性细胞(约29.71％)(如图所揭示UW024：9.67％；UW026：12.86％；FMC63：6.32％)。因此，有上述结果得知UW022表现载体相较于其他的重组嵌合抗原受体19表现载体(UW024、UW026和FMC63)具有最高的转殖效率。另外，根据图2A和2B中所揭示的初代(primary)人类CD3+淋巴球细胞上Fab表现的定量结果，其中转殖UW022载体的细胞有21.6％表现Fab、转殖UW024载体的细胞有9.77％表现Fab、转殖UW026载体的细胞有10.1％表现Fab、转殖FMC63载体的细胞有2.22％表现Fab，根据上述的定量结果均显示UW022载体、UW024载体和UW026载体相较于FMC63载体有较高的转染效率和高表达效率。更进一步地，其中值得注意的是在图2B中显示，UW022载体相较于FMC63载体呈现显著性较高的效率可被转殖进人类CD3+淋巴球细胞中并且进一步诱导CD3+淋巴球细胞表现重组嵌合抗原受体19蛋白。尽管UW024载体和UW026载体都显示出较少的转染和表达能力相较于UW022载体，但与FMC63相比，它们仍然表现出较高的能力。此外，UW024载体和UW026载体均呈现了相似的能力(即转染效率和表达效率)。为了进一步确认具有UW022载体、UW024载体、UW026载体或FMC63载体的修饰T细胞(以下本文则分别以「UW022-T」细胞、「UW024-T」细胞、「UW026-T」细胞或「FMC63」细胞代替)的生物活性(即增殖能力/速率)与上述结果相似或相关。换而言之，UW022-T细胞相较于UW026-T细胞或FMC63-T细胞是否具有最高的增殖能力？因此，首先将UW022-T细胞、UW024-T细胞、UW026-T细胞或FMC63-T细胞中GFP和Fab双重阳性的细胞纯化出，并且进一步培养。培养至第2、5、8天时透过细胞计数以检测各组细胞的增殖能力。根据图2C所揭示，UW022-T细胞、UW024-T细胞、UW026-T细胞或FMC63-T细胞的细胞生长速度相似，因此其增殖能力均相似。
实验二：UW022-T细胞对CD19阳性的肿瘤细胞具有高毒杀能力
为了进一步评估每个重组嵌合抗原受体19细胞(即：UW022-T细胞、UW024-T细胞、UW026-T细胞或FMC63-T细胞)对于CD19阳性的肿瘤细胞的毒杀能力，重组嵌合抗原受体19T细胞与RS4；11细胞或Raji细胞共同培养于指定时间。随后，通过流式细胞仪分析于共培养实验后所剩余的CD19阳性细胞的数量。由图3A和图3B的结果显示，尽管重组嵌合抗原受体19T细胞均显示可以杀死前述两种CD19阳性的肿瘤细胞(即RS4；11细胞或Raji细胞)，但是其中UW024-T细胞相较于其他细胞其显示具有最高的肿瘤细胞毒杀能力(在RS4；11细胞组别中仅残存4.01％的RS4；11细胞；在Raji细胞组别中仅残存0.41％的Raji细胞)。由图3A和图3C的结果显示，虽然UW024-T细胞(残存41.7％的RS4；11细胞)、UW026-T细胞(残存38.5％的RS4；11细胞)、FMC63-T细胞(残存45.1％的RS4；11细胞)三者均显示比UW022-T细胞仅具有较低的细胞毒杀能力，但是UW024-T细胞和UW026-T细胞仍然比FMC63-T细胞对RS4；11肿瘤细胞具有较高的毒杀能力。由图3B和图3D的结果显示，重组嵌合抗原受体19T细胞对Raji细胞均呈现显著的细胞毒杀能力，然而，其中UW022-T细胞(残存0.41％的Raji细胞)、UW024-T细胞(残存2.60％的Raji细胞)、UW026-T细胞(残存5.16％的Raji细胞)三者仍高于FMC63-T细胞(残存7.42％的Raji细胞)。
为了进一步证实图3A～3D的细胞毒杀能力的结果，因此通过酵素免疫分析法(ELISA)分析由重组嵌合抗原受体19T细胞分泌至培养基中IFN-γ的含量而进一步验证。根据图3E和3F的结果显示，UW022-T细胞相对于其他重组嵌合抗原受体19T细胞无论对于RS4；11细胞或Raji细胞均可释放出最高量的IFN-γ。更进一步地，其中值得注意的是相比于MOCK组别，UW022-T细胞可以对RS4；11细胞或是Raji细胞分泌显著性较多的IFN-γ。因此，重组嵌合抗原受体19T细胞确实对CD19阳性的肿瘤细胞(例如：RS4；11细胞和Raji细胞)具有细胞毒杀能力。此外，UW022-T细胞与其他细胞相比更呈现显著的细胞毒杀能力。
为了进一步评估每种重组嵌合抗原受体19T细胞的细胞毒杀能力的最大效用，我们以不同比例的肿瘤细胞与重组嵌合抗原受体19T细胞共同培养(例如：CAR19T细胞相对于肿瘤细胞以1：1、2：1、5：1或是10：1的比例)。此外，本文所使用的肿瘤细胞包括两个CD19阳性的肿瘤细胞(即：RS4；11细胞和Raji细胞)和一个CD19阴性的肿瘤细胞(即：K562细胞)。在针对K562细胞毒杀能力实验的结果中，而四种重组嵌合抗原受体19T细胞(UW022-T细胞、UW024-T细胞、UW026-T细胞、FMC63-T细胞)均呈现类似的细胞毒杀能力，并且毒杀能力与细胞数量相关。然而，增加细胞数量仅稍微增加了毒杀能力(即供体1：约7～17％；供体2：约24～40％)。
由RS4；11细胞和Raji细胞的实验结果显示，所有四种重组嵌合抗原受体19T细胞(UW022-T细胞、UW024-T细胞、UW026-T细胞、FMC63-T细胞)显示其细胞毒杀能力与细胞数量呈正相关。根据表一和图4A的揭露，UW022-T细胞是所有重组嵌合抗原受体19T细胞中对RS4；11细胞或Raji细胞的细胞毒杀能力最高。然而，增加UW022-T细胞的细胞数(从5：1变成10：1)仅略微增强对CD19阳性肿瘤细胞的毒杀作用。另一方面，若增加其他重组嵌合抗原受体19T细胞(UW024-T细胞或UW026-T细胞)数量可增强对肿瘤细胞的细胞毒杀。例如，将供体1组的UW026-T细胞倍增可将其毒杀能力从19.79％增加至53.30％。然而，只有UW022-T细胞可以以不同的比例对不同的肿瘤细胞产生最高的细胞毒杀能力。
表一：不同比例的重组嵌合抗原受体19T细胞对肿瘤细胞的细胞毒杀能力
Figure GDA0002616681450000641
Figure GDA0002616681450000651
同样地，我们还使用流式细胞仪来确认先前的实验结果。首先，将细胞以PI和calcein-AM进行双重染色，随后再将染色的细胞通过流式细胞仪进行分析。PI和calcein-AM分别用于以染色区别活细胞和死细胞。calcein-AM染料仅可染色于活细胞上，PI仅可染色于死细胞上(即坏死细胞(necrosis cells))。根据图4B的结果，UW022-T细胞比FMC63-T细胞更能促使大量的PI阳性且calcein-AM阴性的细胞。也就是说，UW022-T细胞可以有效地诱导肿瘤细胞坏死，更具体地说是CD19阳性的肿瘤细胞。
实验三：重组嵌合抗原受体19T细胞可增强对CD19阳性肿瘤细胞的细胞毒杀于体内状态下
为了进一步评估重组嵌合抗原受体19T细胞于体内(in vivo)环境下的持续性，我们则通过ASID小鼠淋巴瘤异种移植实验和生物活体影像系统(即IVIS系统)来做进一步证实。ASID小鼠淋巴瘤异种移植实验设计如图5A所揭示。首先，我们一开始以FFLuc标记Raji细胞，随后将标记的Raji细胞在第0天时(即Day 0时)以腹腔内注射方式将肿瘤植入小鼠中。在将FFLuc标记的Raji细胞打入ASID小鼠中后，我们则利用IVIS系统监测ASID小鼠中FFLuc标记Raji细胞的生长于第6、14、21、28、34天(即在Day 6、14、21、28、34)。在植入之后，我们发现Raji细胞(5×105个)主要分布在淋巴结和腹腔内(如图5B中控制组所揭示)。在设定肿瘤植入的时间和位置之后，我们进一步评估了T细胞对肿瘤于体内的持续性。将标记的Raji细胞移植至小鼠体内后，更进一步将对照T细胞和三种重组嵌合抗原受体19T细胞(FMC63-T、UW022-T、UW026-T)(1×107个细胞/小鼠)注射入小鼠体内。更明确来说，本实验首先将FFLuc标记Raji细胞于第0天时(即Day 0时)以腹腔内注射方式植入小鼠中以建立肿瘤模式。当Raji细胞注射至小鼠体内6天后(即于第6天时(Day 6))，则进一步以生物活体影像仪拍摄接种的小鼠以确定Raji细胞有成功于小鼠上形成预期大小的肿瘤。进一步地，于第七天时(即在Day 7时)再将对照T细胞和三种重组嵌合抗原受体19T细胞(FMC63-T、UW022-T、UW026-T)分别注射至小鼠中，之后则每7天(即在Day 14、21、28、34时)利用生物活体影像仪观察小鼠上肿瘤大小变化状况。简而言之，FFLuc标记Raji细胞与T细胞均分别均只被接种至小鼠身上一次。
图5B和图5C揭示了在注入各种重组嵌合抗原受体19T细胞后，移植的Raji肿瘤细胞的发展和变化。一方面，Raji细胞在植入小鼠体内6天后(如图5B中Day 6所示的影像)即可容易检测到由Raji细胞所产生的生物冷光(bioluminescence)。另一方面，在所有注射T细胞的组别(包含对照T细胞和三种重组嵌合抗原受体19T细胞(FMC63-T、UW022-T、UW026-T))均显示其组别老鼠体内Raji细胞所产生的生物冷光信号低于无治疗组。然而，在UW026-T细胞处理组中有两个个体显示出相反的结果(即有较多的Raji肿瘤细胞增生)。如图5B和图5C所示，与无治疗组相比mock-T细胞也可以减少和推迟肿瘤发展。然而，FMC63-T细胞注射组和UW022-T细胞注射组都显著抑制肿瘤细胞发育。更重要的是，UW022-T细胞注射组数据显示出UW022-T细胞相较于FMC63-T细胞具有最佳的能力于抑制Raji细胞发育。并且，于UW022-T细胞注射至小鼠后，在后续各观察时间点下Raji肿瘤细胞的生物冷光信号几乎不增加且相对于其他治疗组(Mock-T、FMC63-T、UW022-T、UW026-T)或非治瞭组(None)则其冷光强度是非常微弱。换句话说，注射UW022-T细胞的小鼠相对于其他组别中的小鼠，其身上的肿瘤大小并无明显增加的趋势，且有略微减小。更进一步地，UW022-T细胞在小鼠体内也比FMC63-T细胞呈现更高的细胞毒杀能力，如同前面试管中实验的结果。
虽然以上内容已经详细描述了本发明及其优点，但是应当理解的是，在不脱离由本发明范围所要求限定的本发明中所揭露的精神和范围的情况下，可以在本文中进行各种改变、替换和更改。例如：上述的讨论中的许多过程可以以不同的方法实现，并被其他过程或其组合替代。
此外，本发明的范围不限于本发明说明中描述的方法、制造、组合物、方法和步骤的特定实施例。如同本领域的普通技术人员将可通过本发明说明的公开内容、目前存在或将来开发的方法、制造、组合物、方法和步骤而轻易理解到，根据本发明说明的展示内容，可实质上执行或实现与本发明说明的相应实施例实质相同的功能或结果。因此，随附的权利要求范围旨在将此类方法、制造、组合物、方法或步骤包含在其范围内。
序列表
<110> 宇越生医科技股份有限公司
<120> 医药重组受体组成物及方法
<130> UWBI-1PCT
<150> 62/610,156
<151> 2017-12-23
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 322
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 1
gagatcgtgc tgacacagtc cccagccacc ctgtctctga gccctggaga gagggccacc 60
ctgtcctgct ctgccagctc cagcgtgagc tacatgcact ggtatcagca gaagccagga 120
caggcaccaa ggctgctgat ctacgacaca tctaagctgg ccagcggaat cccagcacgg 180
ttcagcggat ccggatctgg aaccgacttc accctgacca tcagctccct ggagccagag 240
gacgtggccg tgtactattg cttccagggc agcgtgtatc ccttcacatt tggccagggc 300
accaagctgg agatcaagag at 322
<210> 2
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 2
caggtgcagc tgcaggagag cggaccagga ctggtgaagc cttcccagac actgtctctg 60
acatgtaccg tgtccggcgg cagcatctcc acctctggca tgggagtggg atggatcagg 120
cagcaccctg gcaagggcct ggagtggatc ggccacatct ggtgggacga tgacaagcgg 180
tacaacccag ccctgaagtc ccgggtgaca atcagcgtgg atacctccaa gaatcagttc 240
tctctgaagc tgtcctctgt gacagccgcc gacaccgccg tgtactattg cgcccgcatg 300
gagctgtggt cctactattt tgattattgg ggccagggca cactggtgac cgtgagctcc 360
<210> 3
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 3
gacatcctgc tgacccagac acctgcctcc ctggccgtgt ctctgggaca gagggcaacc 60
atcagctgca aggcctccca gtctgtggac tatgatggcg actcctatct gaactggtac 120
cagcagatcc caggccagcc ccctaagctg ctgatctacg atgccagcaa tctggtgtcc 180
ggaatcccac cacgcttcag cggatccgga tctggaaccg acttcaccct gaacatccac 240
cctgtggaga aggtggacgc cgccacctac cactgccagc agtccaccga ggatccatgg 300
acattcggcg gcggcaccaa gctggagatc aag 333
<210> 4
<211> 373
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 4
caggtgcagc tgcagcagag cggagcagag ctggtgcgcc caggctctag cgtgaagatc 60
tcttgtaagg ccagcggcta tgccttttcc tcttactgga tgaattgggt gaagcagagg 120
ccaggacagg gactggagtg gatcggacag atctggccag gcgatggcga cacaaactat 180
aatggcaagt tcaagggcaa ggccaccctg acagccgacg agagctcctc taccgcctat 240
atgcagctga gctccctggc ctctgaggat agcgccgtgt acttttgcgc ccggagagag 300
accacaaccg tgggcagata ctattacgcc atggactact ggggccaggg cacctccgtg 360
acagtgtcta gca 373
<210> 5
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 5
gagatcgtgc tgacacagag ccctgacttt cagtccgtga ccccaaagga gaaggtgaca 60
atcacctgca gggcctccga gtctgtggac accttcggca tctcttttat gaactggttc 120
cagcagaagc cagatcagag ccccaagctg ctgatccacg cagcctccaa tcagggatct 180
ggagtgccta gccgctttag cggatccgga tctggcacag acttcacact gaccatcaac 240
tccctggagg ccgaggatgc cgccacctac tattgccagc agtctaagga ggtgccattc 300
acatttggcg gcggcaccaa ggtggagatc aag 333
<210> 6
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 6
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgcggctg 60
tcttgtgccg ccagcggctt caccttttct agctcctgga tgaattgggt gagacaggca 120
ccaggcaagg gactggagtg ggtgggaagg atctaccctg gcgacggcga tacaaactat 180
aatggcaagt ttaagggccg cttcaccatc agccgggacg attctaagaa cagcctgtac 240
ctgcagatga attccctgaa gacagaggac accgccgtgt actattgcgc ccgctctggc 300
tttatcacca cagtgctgga cttcgattat tggggccagg gcacactggt gaccgtgtct 360
agc 363
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 7
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Val Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 8
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Met Glu Leu Trp Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 9
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 10
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 11
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 12
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Leu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 13
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 14
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr
1 5 10
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 15
Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe
1 5 10
<210> 16
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 16
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
20 25 30
Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
35 40 45

Claims (21)

1.一种重组嵌合抗原受体，其特征在于，其包含：
CD19抗原结合片段，
其中，所述CD19抗原结合片段是单链变异区片段，并且所述单链变异区片段包含重链变异区域、轻链变异区域和连接序列，
其中，所述重链变异区域包含第一胺基酸序列，其选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12或上述任意的组合，并且所述轻链变异区域包含第二胺基酸序列，其选自SEQID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或上述任意的组合；跨膜区域，其包含CD28、IgG1、CD4、CD8α的跨膜区域或上述任意的组合；以及
讯息区域，其包含免疫受体酪氨酸激活基序、共同刺激分子或上述的组合。
2.如权利要求1所述的重组嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜区域是CD8α的跨膜区域。
3.如权利要求1所述的重组嵌合抗原受体，其特征在于，所述共同刺激分子的数目为至少二个。
4.如权利要求1所述的重组嵌合抗原受体，其特征在于，所述免疫受体酪氨酸激活基序包含CD3 zeta。
5.如权利要求1所述的重组嵌合抗原受体，其特征在于，所述共同刺激分子包含CD27的、CD28的、CD30的、4-1BB/CD137的、OX40的或herpesvirus entry mediator的共同刺激分子或上述任意的组合。
6.如权利要求1所述的重组嵌合抗原受体，其特征在于，所述共同刺激分子包含4-1BB/CD137的共同刺激分子。
7.一个重组嵌合抗原受体的表现载体，其特征在于，其包含：CD19抗原结合片段序列，
其中，所述CD19抗原结合片段序列包含重链变异区域的核苷酸序列、轻链变异区域的核苷酸序列和连接序列的核苷酸序列，
其中，所述重链变异区域的核苷酸序列选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或上述任意的组合，并且所述轻链变异区域的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或上述任意的组合；
跨膜区域序列，其包含CD28的、IgG1的、CD4的或CD8α的跨膜区域序列或上述任意的组合；以及
讯息区域序列，其包含免疫受体酪氨酸激活基序序列、共同刺激分子序列或上述的组合。
8.如权利要求7所述的表现载体，其特征在于，所述跨膜区域序列为CD8α的跨膜区域序列。
9.如权利要求7所述的表现载体，其特征在于，所述至少一个共同刺激分子的数目为至少两个。
10.如权利要求7所述的表现载体，其特征在于，所述至少一个免疫受体酪氨酸激活基序序列包含CD3 zeta。
11.如权利要求7所述的表现载体，其特征在于，所述至少一个共同刺激分子序列包含：CD27、CD28、CD30、4-1BB/CD137、OX40或herpesvirus entry mediator的共同刺激分子的序列或上述任意的组合。
12.如权利要求7所述的表现载体，其特征在于，所述至少一个共同刺激分子序列包含4-1BB/CD137的共同刺激分子的序列。
13.一种医药组成物，其特征在于，其包含一群重组细胞，所述重组细胞包含如权利要求1所述的重组嵌合抗原受体、如权利要求7所述的重组嵌合抗原受体的表现载体或上述任意的组合。
14.如权利要求13所述的医药组成物，其特征在于，所述重组细胞是哺乳动物细胞。
15.如权利要求13所述的医药组成物，其特征在于，所述重组细胞是哺乳动物淋巴球。
16.如权利要求13所述的医药组成物，其特征在于，所述重组细胞是T细胞或NK细胞。
17.一种治疗哺乳动物患有与大量表现CD19抗原相关的疾病、失调或症状的方法，其特征在于，其包含：
(a)从哺乳动物供体中分离出外围血液；
(b)从所述外围血液中分离出多个淋巴球；
(c)通过所述淋巴球产生如权利要求13所述的医药组成物；
(d)将化学治疗剂施用于哺乳动物受体；以及
(e)将所述医药组成物施用于所述哺乳动物受体。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)还包含扩增所述医药组成物。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述医药组成物对于所述哺乳动物供体和所述哺乳动物受体是自体的。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述医药组成物对于所述哺乳动物供体和所述哺乳动物受体是异体的。
21.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述淋巴球是T细胞或NK细胞。
CN201880082548.1A 2017-12-23 2018-08-09 医药重组受体组成物及方法 Pending CN111683971A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762610156P 2017-12-23 2017-12-23
US62/610,156 2017-12-23
PCT/CN2018/099502 WO2019119822A1 (en) 2017-12-23 2018-08-09 Pharmaceutical chimeric receptor composition and method thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111683971A true CN111683971A (zh) 2020-09-18

Family

ID=66994362

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880082548.1A Pending CN111683971A (zh) 2017-12-23 2018-08-09 医药重组受体组成物及方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11672827B2 (zh)
EP (1) EP3728330A4 (zh)
CN (1) CN111683971A (zh)
TW (1) TWI800522B (zh)
WO (1) WO2019119822A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201918586D0 (en) 2019-12-17 2020-01-29 Patterson James Engineered platelets for targeted delivery of a therapeutic agent
WO2022234158A1 (es) * 2021-05-06 2022-11-10 Institut D'investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer (Idibaps) Terapia de células t con receptor de antígeno quimérico específico de cd19

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101903403A (zh) * 2007-10-19 2010-12-01 西雅图基因公司 Cd19结合剂及其应用
CN103561759A (zh) * 2010-10-22 2014-02-05 西雅图遗传学公司 以奥里斯他汀(AURISTATIN)为主的抗体药物结合物与PI3K-AKT mTOR路径抑制剂之间的协同作用
CN103694349A (zh) * 2006-09-08 2014-04-02 米迪缪尼有限公司 人源化抗cd19抗体及其在治疗癌症、移植病和自身免疫病中的应用
CN104718284A (zh) * 2012-05-25 2015-06-17 塞勒克提斯公司 工程化用于免疫疗法的异体和免疫抑制耐受性t细胞的方法
CN105392888A (zh) * 2013-03-16 2016-03-09 诺华股份有限公司 使用人源化抗cd19嵌合抗原受体治疗癌症
CN105535967A (zh) * 2005-02-15 2016-05-04 杜克大学 抗cd19抗体及其在肿瘤学中的应用
CN106132434A (zh) * 2014-04-07 2016-11-16 西雅图基因公司 抗‑cd19抗体和抗体‑药物偶联物的稳定制剂
CN106170300A (zh) * 2014-04-08 2016-11-30 西雅图基因公司 Cd19‑抗体药物偶联物的优化给药
CN106279438A (zh) * 2016-08-24 2017-01-04 胜武（北京）生物科技有限公司 新型嵌合抗原受体及其用途
WO2017172981A2 (en) * 2016-03-29 2017-10-05 University Of Southern California Chimeric antigen receptors targeting cancer
CN107383196A (zh) * 2017-08-30 2017-11-24 广州百暨基因科技有限公司 人源化抗cd19的抗原结合片段
CN107406507A (zh) * 2015-02-12 2017-11-28 西雅图基因公司 使用cd19‑adc和长春新碱的组合疗法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201113376A (en) 2009-09-01 2011-04-16 Basf Agrochemical Products Bv Herbicide-tolerant plants
PL2997141T3 (pl) * 2013-05-13 2023-02-06 Cellectis Chimeryczny receptor antygenowy swoisty względem cd19 i jego zastosowania
MX2016002306A (es) 2013-08-22 2016-07-08 Du Pont Promotor u6 de polimerasa iii de soja y metodos de uso.
WO2015164594A1 (en) * 2014-04-23 2015-10-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric antigen receptors (car) for use in therapy and methods for making the same

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105535967A (zh) * 2005-02-15 2016-05-04 杜克大学 抗cd19抗体及其在肿瘤学中的应用
CN103694349A (zh) * 2006-09-08 2014-04-02 米迪缪尼有限公司 人源化抗cd19抗体及其在治疗癌症、移植病和自身免疫病中的应用
CN101903403A (zh) * 2007-10-19 2010-12-01 西雅图基因公司 Cd19结合剂及其应用
CN103561759A (zh) * 2010-10-22 2014-02-05 西雅图遗传学公司 以奥里斯他汀(AURISTATIN)为主的抗体药物结合物与PI3K-AKT mTOR路径抑制剂之间的协同作用
CN104718284A (zh) * 2012-05-25 2015-06-17 塞勒克提斯公司 工程化用于免疫疗法的异体和免疫抑制耐受性t细胞的方法
CN105392888A (zh) * 2013-03-16 2016-03-09 诺华股份有限公司 使用人源化抗cd19嵌合抗原受体治疗癌症
CN106132434A (zh) * 2014-04-07 2016-11-16 西雅图基因公司 抗‑cd19抗体和抗体‑药物偶联物的稳定制剂
CN106170300A (zh) * 2014-04-08 2016-11-30 西雅图基因公司 Cd19‑抗体药物偶联物的优化给药
CN107406507A (zh) * 2015-02-12 2017-11-28 西雅图基因公司 使用cd19‑adc和长春新碱的组合疗法
WO2017172981A2 (en) * 2016-03-29 2017-10-05 University Of Southern California Chimeric antigen receptors targeting cancer
CN106279438A (zh) * 2016-08-24 2017-01-04 胜武（北京）生物科技有限公司 新型嵌合抗原受体及其用途
CN107383196A (zh) * 2017-08-30 2017-11-24 广州百暨基因科技有限公司 人源化抗cd19的抗原结合片段

Also Published As

Publication number Publication date
US20210069244A1 (en) 2021-03-11
EP3728330A1 (en) 2020-10-28
TW201927812A (zh) 2019-07-16
EP3728330A4 (en) 2021-12-08
TWI800522B (zh) 2023-05-01
WO2019119822A1 (en) 2019-06-27
US11672827B2 (en) 2023-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2018204208B2 (en) Method and compositions for cellular immunotherapy
US20210277114A1 (en) Car based immunotherapy
JP7372728B2 (ja) 改変ｔ細胞に関する方法および組成物
US9272002B2 (en) Fully human, anti-mesothelin specific chimeric immune receptor for redirected mesothelin-expressing cell targeting
TW201940520A (zh) 攝護腺特異性膜抗原嵌合抗原受體及其用途
EP3592839B1 (en) Mr1 restricted t cell receptors for cancer immunotherapy
AU2018246143A1 (en) Methods to protect transplanted tissue from rejection
AU2015380397A1 (en) Compositions and methods for T cell delivery of therapeutic molecules
EP3217989B1 (en) Compositions and methods of stimulating and expanding t cells
JP2017522859A (ja) グリピカン３に特異的なｔ細胞受容体、及び肝細胞癌の免疫療法のためのその使用
US20210269501A1 (en) Compositions and methods of nkg2d chimeric antigen receptor t cells for controlling triple-negative breast cancer
CN110819596A (zh) 具有增强的迁移能力的修饰的细胞
CN111683971A (zh) 医药重组受体组成物及方法
CN115916963A (zh) 白血病来源的经修饰细胞用于增强过继性细胞治疗的效力的离体用途
US20220233596A1 (en) Modified NK-92 cells, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO2023019128A1 (en) Optimizing t cell differentiation state with micrornas
NZ714574B2 (en) Method and compositions for cellular immunotherapy
NZ714574A (en) Method and compositions for cellular immunotherapy
NZ726162B2 (en) Method and compositions for cellular immunotherapy

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200918