CN107383196A

CN107383196A - 人源化抗cd19的抗原结合片段

Info

Publication number: CN107383196A
Application number: CN201710766521.1A
Authority: CN
Inventors: 李光超; 邱玉信; 丁雯; 莫文俊
Original assignee: Guangzhou Bio Gene Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Bio Gene Technology Co Ltd
Priority date: 2017-08-30
Filing date: 2017-08-30
Publication date: 2017-11-24
Anticipated expiration: 2037-08-30
Also published as: CN107383196B

Abstract

本发明提供用于治疗CD19表达相关疾病的组合物和方法。本发明还涉及应用低免疫原性的人源化的抗CD19的单链抗体作为CD19抗原抗原结合片段，用于构建特异于CD19的嵌合抗原受体(CAR)、编码其的载体和包含抗CD19CAR的重组T细胞。本发明还包括施用表达包含人源化的抗CD19抗原结合片段的CAR的遗传修饰T细胞的方法。

Description

人源化抗CD19的抗原结合片段

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种人源化的抗CD19嵌合抗原受体修饰的T细胞制备方法及用途。

背景技术

近几年，肿瘤免疫治疗进入了快速发展阶段，CAR-T疗法作为其中一种重要的方法在血液学恶性肿瘤治疗中取得了非常令人鼓舞的结果。目前，国内越来越的企业、医院及学术机构加入到这一研究领域中，共同推进CAR-T疗法的发展，探索更为广泛的潜在应用价值。

目前大多数靶向CD19的CAR-T技术中抗体识别序列都来自于鼠源，这会使得回输到人体后可能产生较强的免疫原性，容易被自身免疫细胞识别并清除，影响CAR-T细胞在体内的长期疗效，增加了复发的几率。据报道，接受鼠源CAR-T回输治疗后，约有一半的患者在1年内再次复发。

为了降低鼠源抗体的免疫原性，目前，已有技术针对鼠源抗体进行人源化改造。一般对鼠源抗体进行人源化改造是不对CDR区进行改动的，因为CDR区是抗原抗体结合区，是非常特异性的。除非是在知道该抗原抗体相互结合模式的情况下，才去有选择的改动，因为在这种情况下，你可以知道CDR区哪些氨基酸残基参与了抗原抗体结合，哪些氨基酸不参与抗原抗体的结合，这种情况下改动不参与抗原抗体结合的氨基酸残基才能够确保抗体的特异性不丢失，否则很容易使抗体失去特异性。第一代人源化抗体是简单的嵌合抗体，即用人源基因代鼠源mAb的Fc区域。这样构建的嵌合抗体即可保留抗原抗体结合的特异性，又大大降低了鼠源mAb的免疫原性。由于鼠源性抗体V区中的框架区(FR区)仍残留一定的免疫原性，这种抗体还远非真正的人源化抗体，有些还能产生很强的抗独特型反应，为减少鼠源成分，人们进一步用人的FR替代鼠FR，形成更为完全的人源化抗体，即除了3个互补决定区(CDR区)是鼠源的外，其余全部是人源化结构，又称CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)或改型抗体(reshapedAb)。

但是对于特定的抗原分子来讲，框架区(FR)并不是可以随意替代的。具有支持作用的FR区不仅为CDR的构象提供了环境，有时还参与抗体结合位点正确构象的形成，甚至参与抗原的结合。例如，当我们对FR区进行改动时，要确保CDR区的构象尽可能的不发生改变，这就需要对CDR区的构象进行模拟，每变换一次FR区，哪怕是一个氨基酸残基，都需要考量一次CDR区构象的变化情况，理论上改动FR区时CDR区构象变动越少越好。简单的CDR移植往往降低或丧失原亲本抗体的亲和力。越来越多的研究结果表明，框架区部分对于抗体CDR的三维结构的维持和整个抗体的亲和常数仍起着很大作用，如何在FR中、FR和CDR之间进行操作，目前主要有4种策略：①模板替换：使用与鼠对应部分有较大同源性的人FR替换鼠FR；②表面重塑：对鼠CDR和FR表面残基进行镶饰(veneering)或重塑(resurfacing)，以使类似于人抗体CDR的轮廓(profile)或人FR的型式；③补偿变换：关键作用的残基进行改变，以补偿完全的CDR移植；④定位保留(positional consensusmethod)：人源化mAb以人FR保守序列为模板进行人源化，但保留了鼠源mAb可变区中参与抗原结合的氨基酸残基，包括CDR和FR中的一些关键残基。

目前全球注册的50余项靶向CD19的CAR-T临床试验中，仅有一项靶向CD19人源化CAR-T的临床试验。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人源化抗CD19的抗原结合片段及含有该抗CD19的抗原结合片段的嵌合抗原受体CAR以及嵌合抗原受体CAR修饰的T细胞。

本发明的目的还在于提供一种免疫原性低的人源化抗CD19的抗原结合片段及含有该抗CD19的抗原结合片段的嵌合抗原受体CAR以及嵌合抗原受体CAR修饰的T细胞。

本发明的目的还在于提供一种能够降低疾病复发性的人源化抗CD19的抗原结合片段及含有该CD19的抗原结合片段的嵌合抗原受体CAR以及嵌合抗原受体CAR修饰的T细胞。

本发明的上述目的通过以下技术手段实现：

一方面，本发明提供了一种人源化抗CD19的抗原结合片段，所述的人源化抗CD19的抗原结合片段含有如Seq ID No:31所示的轻链框架区1(L FR1)，如Seq ID No:32或SeqID No:33所示的轻链框架区2(L FR2)，如Seq ID No:34或Seq ID No:35所示轻链框架区3(L FR3)，和如Seq ID No:36或Seq ID No:37所示轻链框架区4(L FR4)中的一个或多个；以及含有如Seq ID No:38或Seq ID No:39所示重链可变区1(H FR1)，如Seq ID No:40所示重链框架区2(H FR2)，如Seq ID No:41或Seq ID No:42或Seq ID No:43所示重链框架区3(HFR3)，和如Seq ID No:44或Seq ID No:45所示重链框架区4(H FR4)的一个或多个。

进一步地，所述的人源化抗CD19的抗原结合片段为ScFv。该人源化抗CD19的抗原结合片段的至少一个框架区的序列经过人源化改造。作为优选的实施方式，人源化抗CD19的抗原结合片段的轻链和重链的框架区1-3均经过人源化改造。

具体地，人源化改造后的轻链框架区1(L FR1)的氨基酸序列如Seq ID No:31所示，轻链框架区2(L FR2)的氨基酸序列如Seq ID No:32或Seq ID No:33所示，轻链框架区3(L FR3)的氨基酸序列如Seq ID No:34或Seq ID No:35所示。

具体地，人源化改造后的重链框架区1(H FR1)的氨基酸序列如Seq ID No:38或Seq ID No:39所示。重链框架区2(H FR2)的氨基酸序列如Seq ID No:40所示，重链框架区3(H FR3)的氨基酸序列如Seq ID No:41或Seq ID No:42或Seq ID No:43所示。

所述的人源化抗CD19的抗原结合片段ScFv的轻链框架区4(L FR4)和重链框架区4(H FR4)的序列无特别限制，现有技术中的鼠源抗CD19的抗体的框架区序列4即可，作为一种优选的实施方式，所述的轻链框架区4(L FR4)的氨基酸序列在现有的鼠源框架区序列上进行突变优化，优化后的轻链框架区4(L FR4)如Seq ID No:36或Seq ID No:37所示；优化后的重链框架区4(H FR4)的氨基酸序列如Seq ID No:44或Seq ID No:45所示。

如上述的一种人源化抗CD19的抗原结合片段，其特征在于还含有轻链互补决定1区(L CDR1)，轻链互补决定区2(L CDR2)，轻链互补决定3区(L CDR3)，以及重链互补决定1区(H CDR1)，重链互补决定2区(H CDR2)，重链互补决定2区(H CDR2)。

所述的人源化抗CD19的抗原结合片段的轻链或重链互补决定区的序列无特别限制，现有技术中的抗CD19抗体中的互补决定区序列即可。

作为一种优选的实施方式，本发明的人源化抗CD19的抗原结合片段，其轻链可变区含有如Seq ID No:12、Seq ID No:13、Seq ID No:14或Seq ID No:15所示的氨基酸序列中的任意一条，其重链可变区含有如Seq ID No:25、Seq ID No:26、Seq ID No:27或Seq IDNo:28所示的氨基酸序列中的任意一条。

作为优选的实施方式，所述的人源化抗CD19的抗原结合片段，其轻链可变区含有Seq ID No:12所示的氨基酸序列，其重链可变区含有如Seq ID No:26所示的氨基酸序列；

或者优选地，所述的人源化抗CD19的抗原结合片段，其轻链可变区含有如Seq IDNo:15所示的氨基酸序列，其重链可变区含有如Seq ID No:27所示的氨基酸序列；

或者优选地，所述的人源化抗CD19的抗原结合片段，其轻链可变区含有Seq IDNo:13所示的氨基酸序列，其重链可变区含有如Seq ID No:28所示的氨基酸序列；

或者优选地，所述的人源化抗CD19的抗原结合片段，其轻链可变区含有Seq IDNo:14所示的氨基酸序列，其重链可变区含有如Seq ID No:26所示的氨基酸序列；

或者优选地，所述的人源化抗CD19的抗原结合片段，其轻链可变区含有Seq IDNo:14所示的氨基酸序列，其重链可变区含有如Seq ID No:27所示的氨基酸序列。

本发明的人源化抗CD19的抗原结合片段为ScFv。本领域公知，ScFv的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)之间，还具有连接序列。本发明中的人源化抗CD19的抗原结合片段ScFv，其VL和VH之间的连接序列无特别限制，现有技术中ScFv的连接序列即可，如(gly4ser)3、GGGS、RTGSTSGSGKPGSGEGS等等。在本发明一个示范性的实施例中，所述的连接序列为(gly4ser)3。

作为一种示范性的实施方式，本发明中，所述的人源化抗CD19的抗原结合片段，其选自如Seq ID No:46-50所示的氨基酸序列中的一条。

另一方面，本发明还提供了编码上述任一框架区氨基酸序列的核酸序列。

另一方面，本发明还提供了编码上述任一所述轻链可变区和/或重链可变区，或者完整的人源化抗CD19的抗原结合片段(即scFv)的核酸序列。作为一种示范性的实施方式，本发明中，所人源化抗CD19的抗原结合片段，其具有Seq ID No:51-55所示的核酸序列中的一条。

另一方面，本发明还提供了包含上述任一所述的框架区、轻链可变区、重链可变区，或者完整的人源化抗CD19的抗原结合片段的核酸序列中至少一个的载体。

另一方面，本发明还提供了包含上述载体的细胞。

另一发明，本发明还提供了一种嵌合抗原受体CAR，所述的嵌合抗原受体CAR含有人源化抗CD19的抗原结合片段，所述的人源化抗CD19的抗原结合片段含有如Seq ID No:31所示的轻链框架区1(L FR1)，如Seq ID No:32或Seq ID No:33所示的轻链框架区2(LFR2)，如Seq ID No:34或Seq ID No:35所示轻链框架区3(L FR3)，和如Seq ID No:36或SeqID No:37所示轻链框架区4(L FR4)中的一个或多个；以及含有如Seq ID No:38或Seq IDNo:39所示重链可变区1(H FR1)，如Seq ID No:40所示重链框架区2(H FR2)，如Seq ID No:41或Seq ID No:42或Seq ID No:43所示重链框架区3(H FR3)，和如Seq ID No:44或Seq IDNo:45所示重链框架区4(H FR4)的一个或多个。

作为优选的实施方式，所述的嵌合抗原受体CAR的人源化抗CD19的抗原结合片段含有如Seq ID No:31所示的轻链框架区1(L FR1)，如Seq ID No:32或Seq ID No:33所示的轻链框架区2(L FR2)，如Seq ID No:34或Seq ID No:35所示轻链框架区3(L FR3)，和如SeqID No:36或Seq ID No:37所示轻链框架区4(L FR4)；以及含有如Seq ID No:38或Seq IDNo:39所示重链可变区1(H FR1)，如Seq ID No:40所示重链框架区2(H FR2)，如Seq ID No:41或Seq ID No:42或Seq ID No:43所示重链框架区3(H FR3)，和如Seq ID No:44或Seq IDNo:45所示重链框架区4(H FR4)。

作为更优选的实施方式，所述的嵌合抗原受体CAR的人源化抗CD19的抗原结合片段的轻链可变区含有如Seq ID No:12、Seq ID No:13、Seq ID No:14或Seq ID No:15所示的氨基酸序列中的任意一条，其重链可变区含有如Seq ID No:25、Seq ID No:26、Seq IDNo:27或Seq ID No:28所示的氨基酸序列中的任意一条。

作为另一种优选的实施方式，所述的嵌合抗原受体CAR的人源化抗CD19抗原结合片段，其轻链可变区含有Seq ID No:12所示的氨基酸序列，其重链可变区含有如Seq IDNo:26所示的氨基酸序列；更优选地，所述的嵌合抗原受体CAR的人源化抗CD19抗原结合片段，其具有Seq ID No:46所示的氨基酸序列。

作为另一种优选的实施方式，所述的嵌合抗原受体CAR的人源化抗CD19的抗原结合片段，其轻链可变区含有Seq ID No:15所示的氨基酸序列，其重链可变区含有如Seq IDNo:27所示的氨基酸序列；更优选地，所述的嵌合抗原受体CAR的人源化抗CD19的抗原结合片段，其具有Seq ID No:47所示的氨基酸序列。

作为另一种优选的实施方式，所述的嵌合抗原受体CAR的人源化抗CD19的抗原结合片段，其轻链可变区含有如Seq ID No:13所示的氨基酸序列，其重链可变区含有如SeqID No:28所示的氨基酸序列；更优选地，所述的嵌合抗原受体CAR的人源化抗CD19的抗原结合片段，其具有Seq ID No:48所示的氨基酸序列。

作为另一种优选的实施方式，所述的嵌合抗原受体CAR的人源化抗CD19的抗原结合片段，其轻链可变区含有Seq ID No:14所示的氨基酸序列，其重链可变区含有如Seq IDNo:26所示的氨基酸序列；更优选地，所述的嵌合抗原受体CAR的人源化抗CD19的抗原结合片段，其具有Seq ID No:49所示的氨基酸序列。

作为另一种优选的实施方式，作为另一种优选的实施方式其轻链可变区含有SeqID No:14所示的氨基酸序列，其重链可变区含有如Seq ID No:27所示的氨基酸序列。更优选地，所述的嵌合抗原受体CAR的人源化抗CD19的抗原结合片段，其具有Seq ID No:50所示的氨基酸序列。

此外，嵌合抗原受体CAR还含有跨膜结构域、和包含刺激结构域的胞内信号传导结构域。作为优选的实施方式，所述的CAR含有由胞外结构域、铰链区、跨膜结构域和胞内结构域依次串联组成。作为示范性的实施方式，所述的嵌合抗原受体CAR包括依次串联的人CD8α信号肽、scFv、人CD8α铰链区、人CD8α跨膜区、4-1BB胞内刺激域、人CD3ζ胞内区结构域。作为优选的实施方式，所述的嵌合抗原受体CAR选自如Seq ID.No.56-60所示的氨基酸序列中的任意一条；更为优选自如Seq ID.No.61或65所示的氨基酸序列中的任意一条。

另一方面，本发明还提供了含有编码上述嵌合抗原受体CAR的核酸的序列。作为优选的实施方式，所述的嵌合抗原受体CAR的核酸的序列选自如Seq ID.No.57-61所示的核酸序列中的任意一条。

另一方面，本发明还提供了含有上述嵌合抗原受体CAR核酸序列的载体。所述的载体选自现有技术中的核酸载体即可，如选自转座子、质粒、慢病毒、腺病毒、逆转录病毒等。作为优选的实施方式，所述的载体选自慢病毒。

另一方面，本发明还提供了包含上述载体的细胞。进一步地，所述的细胞是T细胞。作为优选的实施方式，所述的细胞是人T细。

另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，其含有上述的人源化抗CD19的抗原结合片段/核酸序列/载体/细胞/嵌合抗原受体CAR中的任意一种。

另一方面，本发明还提供上述人源化抗CD19的抗原结合片段/核酸序列/载体/细胞/嵌合抗原受体CAR/试剂盒在制备治疗CD19表达相关疾病的药物中的应用。

本发明中，所述的CD19表达相关疾病包括但不限于与CD19表达相关的疾病或与表达CD19的细胞相关的病症，包括，例如增生性疾病，例如癌症或恶性肿瘤或癌前病症，例如骨髓增生异常(myelodysplasia)、骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndrome)或白血病前期(preleukemia)；或与表达CD19的细胞相关的非癌相关适应症。一方面，与CD19表达相关的癌症是血液癌症(hematolicalcancer)。一方面，血液癌症(hematolical cancer)是白血病或淋巴瘤。一方面，CD19表达相关癌症包括癌症和恶性肿瘤，包括但不限于，例如一种或多种急性白血病，包括但不限于，例如，B细胞急性淋巴样白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴样白血病(“TALL”)、急性淋巴样白血病(“ALL”)；一或多种慢性白血病，包括但不限于，例如，慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)。其它与CD19表达相关的癌症或血液学病症，包括但不限于，例如，B细胞早幼淋巴细胞样白血病(Bcellprolymphocyticleukemia)、母细胞性浆细胞

样树突状细胞肿瘤(blasticplasmacytoiddendriticcellneoplasm)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuselargeBcelllymphoma)、滤泡性淋巴瘤(follicularlymphoma)、毛细胞性白血病(hairycellleukemia)、小细胞或大细胞性-滤泡性淋巴瘤(smallcell-oralargecell-follicularlymphoma)、恶性淋巴组织增生病症(malignantlymphoproliferativeconditions)、MALT淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤(mantlecelllymphoma)、边缘带淋巴瘤(Marginalzonelymphoma)、多发性骨髓瘤(multiplemyeloma)、骨髓增生异常(myelodysplasia)和骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndrome)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’slymphoma)、浆母细胞性淋巴瘤(plasmablasticlymphoma)、浆细胞样树突状细胞肿瘤(plasmacytoiddendriticcellneoplasm)、Waldenstrom巨球蛋白血症(Waldenstrommacroglobulinemia)、和“白血病前期”(通过髓系血液细胞的无效生产(或发育异常)而统一在一起的一系列各种各样血液学病症)，等等。其它与CD19表达相关的疾病，包括但不限于，例如，与CD19表达相关的非典型和/或非经典的癌症、恶性肿瘤、癌前病症、或增生性疾病。与CD19表达相关的非癌相关适应症包括，但不限于，例如，自身免疫病(例如，狼疮)、炎性病症(变态反应和哮喘)和移植。

本发明的有益效果：

本发明将单链抗体(scFv)序列经过人源化改造，具有体内免疫源性低，不宜被自身免疫系统识别，体内存活时间长等特点。使用的人源化scFv(抗CD19单链抗体)构建制备的CAR-T细胞有助于降低回输后产生的免疫原性，有助于延长缓解期。

附图说明

图1.鼠源抗体FMC63序列搜索结果；

图2.FMC63抗体轻链和重链的三维模型；

图3拉氏构象图；

图4FMC63轻链可变区的FR1序列相似的人胚(germline)抗体可变区相对应的FR1序列；

图5FMC63轻链可变区的FR2序列相似的人胚(germline)抗体可变区相对应的FR2序列；

图6FMC63轻链可变区的FR3序列相似的人胚(germline)抗体可变区相对应的FR3序列；

图7FMC63重链可变区的FR1序列相似的人胚(germline)抗体可变区相对应的FR1序列；

图8FMC63重链可变区的FR2序列相似的人胚(germline)抗体可变区相对应的FR2序列；

图9FMC63重链可变区的FR3序列相似的人胚(germline)抗体可变区相对应的FR3序列；

图10人源化与鼠源抗体CDR区叠合；

图11各型CAR-T细胞表面CAR表达(protein L)比例；

图12各型CAR-T细胞体外肿瘤杀伤能力评估；

图13各型CAR-T细胞IL-2分泌情况；

图14各型CAR-T细胞IFN-γ分泌情况。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1鼠源抗体FMC63scFv链的同源建模

a.同源建模的原理是序列相似则结构相似，结构的保守性远大于序列的保守性。

(1)首先在NCBI数据库中通过同源序列的搜索比对，选择与FMC63scFv链氨基酸序列同源性较高的序列作为同源模版，选择的序列应至少满足以下的3个条件：①序列的相似性应大于30％；②具有较高的序列等同性并且E值要够小(<1×10-5)；③一个理想的同源模版需要涵盖目标蛋白序列的长度；若有多条模板(模板之间相似度不能太高)与目标蛋白的氨基酸序列具有同源性，可以使用多模板来构建同源模型(因为这些模板在核心区域一般都高度保守，而在一些loop区的构象上则有所不同。目标蛋白序列可以与其中某个模板在某loop区匹配，而与另一个模板在另一loop区匹配。因此，使用多模板可使建模过程中模型的每个部分都能找到最合适的模板)。FMC63scFv链氨基酸同源序列的搜索结果如图1所示。

本发明中选择的同源模板是家鼠单克隆抗体Fab的晶体结构，PDB数据库编号为：4EDX。

序列比对完成后使用MOE软件的Antibody Modeler模块对FMC63scFv链进行同源建模，力场选择AMBER99。(建模过程中，Antibody Modeler首先会提取模板(template)的几何特性，然后根据PDF(probability density function)函数来定义蛋白结构中的键长、键角、二面角等几何特性。接着对PDF函数施加一定的约束条件，并以此来构建目的蛋白的3D结构。PDF的函数值可以直接反应所构建模型的好坏。一般，PDF Total Energy越小，表明模型能更好的满足所提取的同源约束条件，模型的可信度越大)

FMC63的三维模型如图2所示。

b.鼠源抗体FMC63三维结构的优化和评估

(1)将鼠源抗体FMC63三维结构以PDB的形式导入Accelrys Discovery Studio2.5软件，用DS软件的Verify Protein(Profiles-3D)算法对初始模型进行评估，结果如下所示：初始模型的Verify Score值为104.08，优化后最终模型的Verify Score值为114.03。

拉氏构象图3所示：初始模型合理二面角的氨基酸占比为96.03％；优化后最终模型合理二面角的氨基酸占比为97％。

用DS软件的Minimization算法对初始模型进行优化，经过3轮优化之后最终模型的评估如上所示。

C.Canonical Residues分析

靠近CDR区并且包埋于蛋白内部的残基以及与CDR区有直接相互作用的残基，相互作用包括：疏水相互作用/氢键/盐桥，这两类残基对于保持CDR区构象非常重要。在DS软件中分析FMC63氨基酸残基的溶剂可及表面积，溶剂可及表面积小于10％最大溶剂可及表面积的氨基酸界定为包埋残基。距离CDR区5埃内的氨基酸界定为靠近CDR区残基。

包埋于蛋白内部的氨基酸残基有：

①L链：Cys23、Trp35、Tyr36、Leu46、Leu47、Ile48、Tyr71、Phe87、Cys88、Gly99；

②H链：Leu4、Cys22、Trp36、Ile37、Arg38、Trp47、Leu48、Gly49、Ile69、Val78、Met82、Asp89、Tyr93。

靠近CDR区并且包埋于蛋白内部的氨基酸残基有：

①L链：Tyr71、Phe87；

②H链：Ile37、Leu48、Ile69、Val78、Met82。

与CDR区有相互作用的氨基酸残基有：H链：Leu48、Ile69、Lys71、Asn83、Lys97。

实施例2.IgBlast分析与抗原亲和性预测

a.以下为鼠抗CD19抗体FMC63的轻链可变区的序列，下划横线线部分为鼠抗框架序列(FR序列)，加粗部分为CDR区序列。

Seq ID No:29

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT

通过分析鼠抗CD19抗体FMC63的轻链可变区序列，根据其轻链可变区FR1，FR2，FR3和FR4以及整条轻链序列分别对人胚系抗体基因库(NCBI IgBLAST)进行比较，找出与鼠抗CD19轻链可变区FR1，FR2，FR3和FR4序列相似的人胚系(germline)抗体(比成熟抗体免疫原性更低)可变区相对应序列。图4为与鼠抗CD19抗体FMC63轻链可变区的FR1(Seq ID No:1，即DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISC)序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应的FR1序列，找出的5个有相似的FR1序列的人胚系(germline)抗体含有1个不同序列，即：Seq IDNo:2，DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC。

经过in silicon分析所述序列与HLA-DR分子(主要是DRB1_0101,DRB1_1501,DRB1_0301,DRB1_0401,DRB1_0404,DRB1_0405,DRB1_0701,DRB1_0802,DRB1_0901,DRB1_1101,DRB1_1302,DRB3_0101,DRB4_0101,DRB5_0101,DQB1_0301,DQB1_0302。因为这些分子代表全世界绝大多数的II型HLA分子)结合的亲和性，原始鼠源FR1(Seq ID No:1)序列含有1个潜在的HLA-DR结合位点，人源序列Seq ID No:2含有1个潜在的HLA-DR结合位点。选择Seq ID No:2为人源化的重链可变区FR1的框架序列。

同样，图5为与鼠抗CD19抗体FMC63轻链可变区的FR2(Seq ID No:3，即WYQQKPDGTVKLLIY)序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应的FR2序列，找出的5个有相似的FR2序列的人胚系(germline)抗体含有2个不同序列，分别为：

Seq ID No:4，WYQQKPDQSPKLLI

Seq ID No:5，WYQQKPGKAPKLLIY

经过in silicon分析所述序列与HLA-DR分子的亲和性，Seq ID No:4和Seq IDNo:5亲和性均低于鼠源FR2序列，选出亲和性较低的Seq ID No:4和Seq IDNo:5为人源化的重链可变区FR2的框架序列。

图6为与鼠抗CD19抗体FMC63轻链可变区的FR3(Seq ID No:6，即GVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFC)序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应的FR3序列，找出的5个有相似的FR3序列的人胚系(germline)抗体含有4个不同序列，分别为：

Seq ID No:7，GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYC

Seq ID No:8，GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC

Seq ID No:9，GVPSRFSGSGSGTEFTLTISNLQPEDFATYYC

Seq ID No:10，GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC

经过in silicon分析所述序列与HLA-DR分子的亲和性，Seq ID No:7和Seq IDNo:10亲和性均低于鼠源FR3序列，选出亲和性较低的Seq ID No:7和Seq IDNo:10为人源化的重链可变区FR3的框架序列。

没有找到与鼠抗CD19抗体FMC63轻链可变区的FR4(Seq ID No:11，即FGGGTKLEIT)序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应的FR4序列。

通过上述分析，选出亲和性较低的框架序列，从而确立轻链可变区FR1，FR2，FR3和FR4的人源化序列分别为FR1：Seq ID.No.2；FR2：Seq ID.No.4或Seq ID.No.5；FR3：SeqID.No.7或Seq ID.No.10，FR4：Seq ID.No.11。

进一步地，在此框架的基础上，综合考虑Canonical Residues的分析结果，保留框架上靠近CDR区并且包埋于蛋白内部的鼠源氨基酸残基以及与CDR区有相互作用的鼠源氨基酸残基，发明人进一步设计出最终经过人源改造的轻链可变区的框架区，其序列具体如下所示：

L FR1

Seq ID.No.31

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC

L FR2

Seq ID.No.32

WYQQKPDQSPKLLIY

或Seq ID.No.33

WYQQKPGKAPKLLIY

L FR3

Seq ID.No.34

GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFC

或Seq ID.No.35

GVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYFC

L FR4

Seq ID.No.36

FGGGTKLEIT

或Seq ID.No.37

FGQGTKLEIT

通过上述的轻链框架区1-4的序列，结合鼠抗CD19抗体FMC63的轻链可变区的抗原结合区(CDR)，可组合出8种轻链可变区。发明人进一步优选设计出4种不同组合的人源化FMC63抗体轻链可变区其序列如Seq ID.No.12-Seq ID.No.15所示。

Seq ID.No.12

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPDQSPKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT

Seq ID.No.13

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT

Seq ID.No.14

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPDQSPKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIT

Seq ID.No.15

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT

b.以下为鼠抗CD19抗体FMC63的重链可变区的序列，下划线部分为鼠抗框架序列(FR序列)，加粗部分为CDR区序列。

Seq ID No:29

EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVS WIRQPPRKGLEWLG RLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAK WGQGTSVTVSS

通过分析鼠抗CD19抗体FMC63的重链可变区序列，根据其重链可变区FR1，FR2，FR3和FR4以及整条重链序列分别对人抗体基因序列库(NCBIIgBLAST)进行比较，找出与鼠抗CD19重链可变区FR1，FR2，FR3和FR4序列相似的人胚系(germline)抗体(比成熟抗体免疫原性更低)可变区相对应序列。图7为与鼠抗CD19抗体FMC63重链可变区FR1(Seq ID No:16，即EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVS)序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应的FR1序列，找出的5个有相似的FR1序列的人胚系(germline)抗体含有2个不同序列，即：

Seq ID No:17，QVRLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVS

Seq ID No:18，QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVS

经过in silicon分析所述序列与HLA-DR分子的亲和性，Seq ID No:17和SeqIDNo:18亲和性均低于鼠源FR1序列，选出亲和性较低的Seq ID No:17和Seq ID No:18为人源化的重链可变区FR1的框架序列。

同样，图8为与鼠抗CD19抗体FMC63重链可变区的FR2(Seq ID No:19，即WIRQPPRKGLEWLG)序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应的FR2序列，找出的5个有相似的FR2序列的人胚系(germline)抗体含有1个不同序列，即

Seq ID No:20，WIRQPPGKGLEWIG

经过in silicon分析所述序列与HLA-DR分子的亲和性，原始鼠源FR2(SeqID No:19)序列含有0个潜在的HLA-DR结合位点，人源序列Seq ID No:20含有0个潜在的HLA-DR结合位点。选择Seq ID No:20为人源化的重链可变区FR2的框架序列。

图9为与鼠抗CD19抗体FMC63重链可变区的FR3(Seq ID No:21，即RLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAK)序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应的FR3序列，找出的5个有相似的FR3序列的人胚系(germline)抗体含有2个不同序列，即

Seq ID No:22，RFTISRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCAK

Seq ID No:23，RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK

经过in silicon分析所述序列与HLA-DR分子的亲和性，Seq ID No:22亲和性低于鼠源FR3序列，因此选择亲和性较低的Seq ID No:22为人源化的重链可变区FR3的框架序列。

没有找到与鼠抗CD19抗体FMC63重链可变区的FR4(Seq ID No:24，即WGQGTSVTVSS)序列相似的人胚系(germline)抗体可变区相对应的FR4序列。

通过上述分析，选出亲和性较低的框架序列，从而确立重链可变区FR1，FR2，FR3和FR4的人源化序列分别为FR1：Seq ID.No.17或Seq ID.No.18；FR2：Seq ID.No.20；FR3：SeqID.No.22；FR4：Seq ID.No.24。

进一步地，在此框架的基础上，综合考虑Canonical Residues的分析结果，保留框架上靠近CDR区并且包埋于蛋白内部的鼠源氨基酸残基以及与CDR区有相互作用的鼠源氨基酸残基。发明人进一步设计出最终经过人源改造的重链可变区的框架区，其序列具体如下所示：

H FR1

Seq ID.No.38

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS

或Seq ID.No.39

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVS

H FR2

Seq ID.No.40

WIRQPPGKGLEWLG

H FR3

Seq ID.No.41

RFTISKDNSKNSVYLQMNSLRTEDTALYYCAK

或Seq ID.No.42

RVTISKDTSKNQVSLKMNSVTAADTAVYYCAK

或Seq ID.No.43

RFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAK

H FR4

Seq ID.No.44

WGQGTSVTVSS

或Seq ID.No.45

WGQGTLVTVSS

通过上述的重链框架区1-4的序列，结合鼠抗CD19抗体FMC63的重链可变区的抗原结合区(CDR)，可组合出12种重链可变区，发明人进一步优化设计出4种不同组合的人源化FMC63抗体重链可变区序列，其序列Seq ID.No.25，Seq ID.No.26-Seq ID.No.28所示。

Seq ID.No.25

QVRLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSALKSRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS

Seq ID.No.26

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRFTISKDNSKNSVYLQMNSLRTEDTALYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS

Seq ID.No.27

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRVTISKDTSKNQVSLKMNSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS

Seq ID.No.28

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS

c.根据上面的实验结果，其中人源化FMC63抗体轻链可变区序列选自SeqID.No.12，Seq ID.No.13，Seq ID.No.14和Seq ID.No.15中的任意一条；重链可变区序列选自Seq ID.No.25，Seq ID.No.26，Seq ID.No.27和Seq ID.No.28中的任意一条，得到16种组合。

应用DS软件将鼠源单链抗体FMC63分别进行以上组合的氨基酸虚拟突变，构建人源化单链抗体FMC63轻链和重链随机组合的三维结构，将这些人源化抗体三维结构与鼠源结构进行叠合，计算其RMSD值，分析人源化结构与鼠源结构CDR区构象RMSD值的差异。某种人源化结构与鼠源结构CDR区构象的RMSD值差异越小，说明FR框架区的该种氨基酸虚拟突变后对CDR区的结构影响越小。

结果显示，不同组合得到的ScFv，RMSD值有差异(16种组合的RMSD图下表1所示)。

表1 16种组合与鼠源结构CDR区构象的RMSD值差(单位：埃)

从上表可知，以下5种组合RMSD值最小，其α碳原子叠合后构象如图10所示，人源化结构与鼠源结构CDR区构象基本完全重合，说明这5种经过人源化改造的组合对CDR影响甚微。另分析出S115L(第115位的丝氨酸突变为亮氨酸)氨基酸残基可能支持CDR的构型。综上所述，本专利具体得到的人源化抗体有以下5种组合：

人源化序列一(H 1)：

FMC63_Humanzied1_L:(Seq ID.No.12)

FMC63_Humanzied1_H(Seq ID.No.26)

人源化序列二(H 2)：

FMC63_Humanzied2_L:(Seq ID.No.15)

FMC63_Humanzied2_H:(Seq ID.No.27)

人源化序列三(H 3)：

FMC63_Humanzied3_L(Seq ID.No.13)

FMC63_Humanzied3_H(Seq ID.No.28)

人源化序列四(H 4)：

FMC63_Humanzied4_L(Seq ID.No.14)

FMC63_Humanzied4_H(Seq ID.No.26S115L)

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRFTISKDNSKNSVYLQMNSLRTEDTALYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS

人源化序列五(H 5)：

FMC63_Humanzied5_L(Seq ID.No.14)

FMC63_Humanzied5_H(Seq ID.No.27S115L)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRVTISKDTSKNQVSLKMNSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS

实施例3CAR基因的合成和载体的构建

选择实施例2中的五个人源化序列，依次在VL和VH之间加入连接序列(gly4ser)3，故设计构建到嵌合抗原受体的scFv部分的结构为：VL-(gly4ser)3-VH。具体地，得到的五个ScFv的氨基酸序列依次如Seq ID.No.46-Seq ID.No.50所示；其分别对应的核酸序列如SeqID.No.51-Seq ID.No.55所示。具体如下：

人源化序列一(H1)所对应的scFv的氨基酸序列如Seq ID.No.46所示。

人源化序列二(H2)所对应的scFv的氨基酸序列如Seq ID.No.47所示。

人源化序列三(H3)所对应的scFv的氨基酸序列如Seq ID.No.48所示。

人源化序列四(H4)所对应的scFv的氨基酸序列如Seq ID.No.49所示。

人源化序列五(H5)所对应的scFv的氨基酸序列如Seq ID.No.50所示。

人源化序列一(H1)所对应的scFv的核苷酸序列如Seq ID.No.51所示。

人源化序列二(H2)所对应的scFv的核苷酸序列如Seq ID.No.52所示。

人源化序列三(H3)所对应的scFv的核苷酸序列如Seq ID.No.53所示。

人源化序列四(H4)所对应的scFv的核苷酸序列如Seq ID.No.54所示。

人源化序列五(H5)所对应的scFv的核苷酸序列如Seq ID.No.55所示。

将得到的5个人源化scFv的氨基端序列与和鼠源的scFv进一步设计成嵌合抗原受体(CAR)的串联结构。CAR的串联顺序依次为人CD8α信号肽、scFv、人CD8α铰链区、人CD8α跨膜区、4-1BB胞内刺激域、人CD3ζ胞内区结构域。在OptimumGeneTM基因设计软件内输入CAR的氨基酸序列，密码子偏爱性参数选择人，软件计算出优化CAR的核酸序列。五种人源化抗体对应的CAR的氨基酸序列依次如Seq ID.No.56-Seq ID.No.60所示；其分别对应的核酸序列如Seq ID.No.61-Seq ID.No.65所示。具体如下：

人源化序列一(H1)所对应的CAR的氨基酸序列如Seq ID.No.56所示。

人源化序列二(H2)所对应的CAR的氨基酸序列如Seq ID.No.57所示。

人源化序列三(H3)所对应的CAR的氨基酸序列如Seq ID.No.58所示。

人源化序列四(H4)所对应的CAR的氨基酸序列如Seq ID.No.59所示。

人源化序列五(H5)所对应的CAR的氨基酸序列如Seq ID.No.60所示。

人源化序列一(H1)所对应的CAR的核苷酸序列如Seq ID.No.61所示。

人源化序列二(H2)所对应的CAR的核苷酸序列如Seq ID.No.62所示。

人源化序列三(H3)所对应的CAR的核苷酸序列如Seq ID.No.63所示。

人源化序列四(H4)所对应的CAR的核苷酸序列如Seq ID.No.64所示。

人源化序列五(H5)所对应的CAR的核苷酸序列如Seq ID.No.65所示。

进行序列优化后，全基因合成上述五种CAR核酸序列，通过EcoRI和BamHI酶切位点构建至慢病毒载体pCDH-EF1α-MCS上。具体的步骤参照申请号为201510272570.0的专利中的记载。

实施例4慢病毒包装

分别对实施例中的3种载体进行慢病毒包装。使用四质粒系统进行慢病毒包装。四质粒系统分别表达慢病毒载体包装所需的gag/pol、Rev、VSV-G及工程稳定的单链抗体构成的人工嵌合抗原受体。将四质粒按比较进行瞬时转染。总质量为10μg。将上述质粒加入至一定体积的无菌水中，而后加入62.5μL的2M CaCl₂溶液，最后加入500μL 2×HBS(pH＝7.05)缓冲液。将上述溶液加入至铺有细胞的10cm培养皿中，轻轻混匀。于37℃、5％CO₂细胞培养箱培养6h。6h后更换新鲜培养基，继续进行培养。并且加入10mM的丁酸钠溶液。59-72小时后收集慢病毒的培养上清进行纯化检测。

实施例4T细胞的扩增

每位志愿者采30ml的全血。将外周血与生理盐水1:1进行稀释，在离心管内加入Ficoll，缓缓加入稀释后的外周血。1500rpm离心30min轻轻吸取PBMC层移入另一离心管内。用生理盐水洗涤PBMC多次，转入X-VIVO培养基(含50ng/mL的OKT3，300IU/mL的IL-2)中进行培养。PBMC分离后，需要用含50ng/mL的OKT3，300IU/ml的IL-2的X-VIVO进行激活，2日后将培养基更换成含300IU/mL的X-VIVO进行扩大培养，而后每两天进行一次计数并更换含300IU/mL的X-VIVO，并且将细胞浓度维持在0.5×106-1×106/mL。连续观察10天。

实施例5慢病毒感染T细胞

利用RetroNectin提高慢病毒对T细胞的感染效率。将30μg的RetroNectin，包被于6孔板内。放于37℃细胞培养箱2h。吸取RetroNectin，利用含2.5％BSA的Hank’s溶液封闭包被后的6孔板。放于37°细胞培养箱0.5h。吸取封闭液，利用含2％Hepes的Hank’s溶液洗涤6孔板。加入X-VIVO培养基，加入适量的慢病毒溶液，2000g，离心2h。弃上清，加入1×106的T细胞(CD3阳性>90％)，1000g，离心10min。于37℃、5％CO2和一定湿度的细胞培养箱内培养，第二日重复上述过程。

感染5天后测定scFv的表达，利用Protein L与Kappa轻链的结合，通过流式细胞仪检测scFv的表达。结果显示，H2和H5构建的CAR的表达阳性率较高且优于鼠源的scFv(来自FMC63)构建的CAR，如图11所示。考虑到CAR-T细胞发挥功能CAR需要CAR的有效表达，后续实施例中我们将选用H2和H5构建的CAR进行相关试验。

实施例6细胞毒性检测

采用H2和H5构建的CAR进行细胞毒性检测实验，并用FMC63构建的CAR和空白对照NC(未转染的T细胞)作为对照。利用LDH检测CAR-T细胞对K562、K562-CD19(稳定表达CD19的K562细胞)和Nalm-6细胞的毒性。将各种细胞离心后，用无血清无酚红的，RPMI1650培养基多次洗涤后计数。取1×10⁶的K562，K562-CD19和Nalm-6各50uL，铺板于96孔板内，作为靶细胞。按靶细胞：效应细胞＝1:1,1:3,1:10,1:30。分别加入未转染的T细胞和各CAR-T细胞。于37℃、5％CO₂和一定湿度的细胞培养箱内培养5h。加入裂解液作为阳性对照，而后250g离心5min。每孔取100uL培养上清，加入新的96孔板内。加入20uL反应液。放于暗室中反应20-30min。

酶标仪590nm测定。根据公式计算溶解百分率：细胞毒性(％)＝[(D实验孔－D培养基背景孔)－(D效应细胞自发LDH释放孔－D培养基背景孔)－(D靶细胞自发LDH释放孔－D培养基背景孔)]/[(D靶细胞最大LDH释放孔－D体积校正孔)－(D靶细胞自发LDH释放孔－D培养基背景孔)]×100％。

具体的步骤参照申请号为201510362935.5的专利《CD33特异性嵌合抗原受体及其应用》。

结果如图12显示，FMC63、H2及H5CAR-T细胞都能特异性的杀伤CD19阳性细胞(K562-CD19和Nalm-6)，而对CD19阴性细胞(K562)几乎没有杀伤能力。说明我们制备的人源化的H2和H5CAR-T细胞具有杀伤CD19阳性细胞的功能。

实施例7ELISA检测细胞系与CAR-T细胞共培养上清中细胞因子IL-2和IFN-γ的水平

分别将K562、K562-CD19和Nalm-6细胞系按照5×10⁵细胞/孔接种25孔板。按每孔5×10⁵细胞分别加入CAR-T、未转染的T细胞(NC)细胞，补充培养液至1.5mL，于孵箱中共培养12小时后。采用人IL-2、IFN-γELISA检测试剂盒(欣博盛生物)，对共培养上清进行检测(具体步骤见ELISA检测试剂盒说明书)。表达CD19的细胞(K562-CD19和Naml-6)在与CAR-T共培养上清中IL-2(图13)和IFN-γ(图14)细胞因子水平均较K562组有显著性升高。相较于未转染组(NC)，转染鼠源FMC63和人源化H2/H5的CAR-T细胞在表达CD19的细胞系刺激下，能够分泌细胞因子IL-2和IFN-γ，且非显而易见地，人源化H2/H5的CAR-T细胞分泌的细胞因子的量显著高于转染鼠源FMC63的CAR-T，表明本发明的人源化抗体可能具有更强的肿瘤细胞杀伤力。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

序列表

<110> 广州百暨基因科技有限公司

<120> 人源化抗CD19的抗原结合片段

<130> PT20171453-DD-P

<160> 65

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys

20

<210> 2

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

20

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 3

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

1 5 10

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 6

<211> 32

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 6

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys

20 25 30

<210> 7

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 8

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 9

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 10

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 11

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

1 5 10

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

100 105

<210> 13

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

100 105

<210> 14

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

100 105

<210> 15

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

100 105

<210> 16

<211> 25

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 16

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser

20 25

<210> 17

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser

20 25

<210> 18

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser

20 25

<210> 19

<211> 14

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 19

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

1 5 10

<210> 20

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 21

<211> 32

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 21

Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys

20 25 30

<210> 22

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys

20 25 30

<210> 23

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

20 25 30

<210> 24

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 24

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 25

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 26

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Ser Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 27

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 28

<211> 120

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 28

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 29

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 29

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

100 105

<210> 30

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 31

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

20

<210> 32

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 33

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 34

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys

20 25 30

<210> 35

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr

1 5 10 15

Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys

20 25 30

<210> 36

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

1 5 10

<210> 37

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

1 5 10

<210> 38

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser

20 25

<210> 39

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser

20 25

<210> 40

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

1 5 10

<210> 41

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Ser Val Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys

20 25 30

<210> 42

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys

1 5 10 15

Met Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

20 25 30

<210> 43

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

20 25 30

<210> 44

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 45

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 46

<211> 242

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 46

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Asn Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

195 200 205

Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser

<210> 47

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser

180 185 190

Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Met Asn Ser Val Thr

195 200 205

Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser

<210> 48

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

195 200 205

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser

<210> 49

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Asn Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

195 200 205

Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser

<210> 50

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser

180 185 190

Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Met Asn Ser Val Thr

195 200 205

Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser

<210> 51

<211> 930

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

gccgccacca tggcactgcc tgttactgct ctcctcctgc cactcgcact gctgctccat 60

gcagctagac ctgatattca gatgacccag tcacctagct ctctcagcgc ctccgtcgga 120

gatagagtca caatcacatg tcgcgcttct caggacatct ccaagtacct gaattggtac 180

cagcagaaac ccgatcaatc tcccaaactc ctgatatatc acactagtcg gctgcattca 240

ggcgtgccct caaggttctc tgggtccgga tcaggcaccg attataccct cacaatcagc 300

tccctgcagc ccgaagactt cgccacctac ttctgtcagc aagggaacac actgccatat 360

acctttggag gtgggaccaa actggagatc actggtggcg gaggttctgg cggcggagga 420

agcggcggag gtggctcaca agtccagctg caagagtcag gaccaggcct cgtcaagcca 480

tcacaaacac tgtccctcac ctgcactgtg agcggcgtga gtctgcccga ttatggagtg 540

tcatggatac ggcagccacc aggaaaaggg ctggagtggc tgggcgtgat ctggggttct 600

gaaaccacat actataactc cgcactgaag agccgcttca caatcagcaa ggataactca 660

aagaactctg tgtacctgca gatgaactcc ctccgcaccg aagatacagc tctgtattac 720

tgtgccaaac attactacta cggaggaagc tatgcaatgg actattgggg acagggcact 780

tcagtgaccg tctcaagtac aaccacaccc gctcccaggc ctccaactcc cgctcctacc 840

atcgcttccc aaccactgag cctgaggccc gaggcatgca gacctgcagc cggaggtgcc 900

gtgcacacca gaggactgga cttcgcatgt 930

<210> 52

<211> 930

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

gccgccacca tggcactgcc tgttactgct ctcctcctgc cactcgcact gctgctccat 60

gcagctagac ctgatattca gatgacccag tcacctagct ctctcagcgc ctccgtcgga 120

gatagagtca caatcacatg tcgcgcttct caggacatct ccaagtacct gaattggtac 180

cagcagaaac ccggaaaagc ccccaaactc ctgatatatc acactagtcg gctgcattca 240

ggcgtgccct caaggttctc tgggtccgga tcaggcaccg attatacctt cacaatcagc 300

tccctgcagc ccgaagacat tgccacctac ttctgtcagc aagggaacac actgccatat 360

acctttggag gtgggaccaa actggagatc actggtggcg gaggttctgg cggcggagga 420

agcggcggag gtggctcaca agtccagctg caagagtcag gaccaggcct cgtcaagcca 480

tcagaaacac tgtccctcac ctgcactgtg agcggcgtga gtctgcccga ttatggagtg 540

tcatggatac ggcagccacc aggaaaaggg ctggagtggc tgggcgtgat ctggggttct 600

gaaaccacat actataactc cgcactgaag agccgcgtca caatcagcaa ggatacctca 660

aagaaccaag tgtccctgaa aatgaactcc gtcaccgcag cagatacagc tgtctattac 720

tgtgccaaac attactacta cggaggaagc tatgcaatgg actattgggg acagggcact 780

tcagtgaccg tctcaagtac aaccacaccc gctcccaggc ctccaactcc cgctcctacc 840

atcgcttccc aaccactgag cctgaggccc gaggcatgca gacctgcagc cggaggtgcc 900

gtgcacacca gaggactgga cttcgcatgt 930

<210> 53

<211> 930

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

gccgccacca tggcactgcc tgttactgct ctcctcctgc cactcgcact gctgctccat 60

gcagctagac ctgatattca gatgacccag tcacctagct ctctcagcgc ctccgtcgga 120

gatagagtca caatcacatg tcgcgcttct caggacatct ccaagtacct gaattggtac 180

cagcagaaac ccggaaaagc ccccaaactc ctgatatatc acactagtcg gctgcattca 240

ggcgtgccct caaggttctc tgggtccgga tcaggcaccg attataccct cacaatcagc 300

tccctgcagc ccgaagactt cgccacctac ttctgtcagc aagggaacac actgccatat 360

acctttggag gtgggaccaa actggagatc actggtggcg gaggttctgg cggcggagga 420

agcggcggag gtggctcaca agtccagctg caagagtcag gaccaggcct cgtcaagcca 480

tcacaaacac tgtccctcac ctgcactgtg agcggcgtga gtctgcccga ttatggagtg 540

tcatggatac ggcagccacc aggaaaaggg ctggagtggc tgggcgtgat ctggggttct 600

gaaaccacat actataactc cgcactgaag agccgcttca caatcagcaa ggataactca 660

aagaacaccg tgtacctgca gatgaactcc ctccgcgcag aagatacagc tgtctattac 720

tgtgccaaac attactacta cggaggaagc tatgcaatgg actattgggg acagggcact 780

tcagtgaccg tctcaagtac aaccacaccc gctcccaggc ctccaactcc cgctcctacc 840

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acccaggagg aggacggctg cagctgtcgg ttcccagagg aggaggaggg aggatgtgag 1260

ctgagggtga agttttctcg gagcgccgat gcaccagcat atcagcaggg acagaatcag 1320

ctgtacaacg agctgaatct gggcaggcgc gaggagtacg acgtgctgga taagcggaga 1380

ggcagagatc ccgagatggg aggcaagcca aggaggaaga accctcagga gggcctgtat 1440

aatgagctgc agaaggacaa gatggccgag gcctactctg agatcggcat gaagggagag 1500

cggagaaggg gcaagggaca cgatggcctg tatcagggcc tgagcacagc caccaaggac 1560

acctacgatg cactgcacat gcaggccctg ccacctaggt agtaa 1605

<210> 63

<211> 1605

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

gccgccacca tggcactgcc tgttactgct ctcctcctgc cactcgcact gctgctccat 60

gcagctagac ctgatattca gatgacccag tcacctagct ctctcagcgc ctccgtcgga 120

gatagagtca caatcacatg tcgcgcttct caggacatct ccaagtacct gaattggtac 180

cagcagaaac ccggaaaagc ccccaaactc ctgatatatc acactagtcg gctgcattca 240

ggcgtgccct caaggttctc tgggtccgga tcaggcaccg attataccct cacaatcagc 300

tccctgcagc ccgaagactt cgccacctac ttctgtcagc aagggaacac actgccatat 360

acctttggag gtgggaccaa actggagatc actggtggcg gaggttctgg cggcggagga 420

agcggcggag gtggctcaca agtccagctg caagagtcag gaccaggcct cgtcaagcca 480

tcacaaacac tgtccctcac ctgcactgtg agcggcgtga gtctgcccga ttatggagtg 540

tcatggatac ggcagccacc aggaaaaggg ctggagtggc tgggcgtgat ctggggttct 600

gaaaccacat actataactc cgcactgaag agccgcttca caatcagcaa ggataactca 660

aagaacaccg tgtacctgca gatgaactcc ctccgcgcag aagatacagc tgtctattac 720

tgtgccaaac attactacta cggaggaagc tatgcaatgg actattgggg acagggcact 780

tcagtgaccg tctcaagtac aaccacaccc gctcccaggc ctccaactcc cgctcctacc 840

atcgcttccc aaccactgag cctgaggccc gaggcatgca gacctgcagc cggaggtgcc 900

gtgcacacca gaggactgga cttcgcatgt accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 960

ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 1020

gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 1080

cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaag 1140

agaggcagga agaagctgct gtacatcttc aagcagccct tcatgcgccc cgtgcagaca 1200

acccaggagg aggacggctg cagctgtcgg ttcccagagg aggaggaggg aggatgtgag 1260

ctgagggtga agttttctcg gagcgccgat gcaccagcat atcagcaggg acagaatcag 1320

ctgtacaacg agctgaatct gggcaggcgc gaggagtacg acgtgctgga taagcggaga 1380

ggcagagatc ccgagatggg aggcaagcca aggaggaaga accctcagga gggcctgtat 1440

aatgagctgc agaaggacaa gatggccgag gcctactctg agatcggcat gaagggagag 1500

cggagaaggg gcaagggaca cgatggcctg tatcagggcc tgagcacagc caccaaggac 1560

acctacgatg cactgcacat gcaggccctg ccacctaggt agtaa 1605

<210> 64

<211> 1605

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

gccgccacca tggcactgcc tgttactgct ctcctcctgc cactcgcact gctgctccat 60

gcagctagac ctgatattca gatgacccag tcacctagct ctctcagcgc ctccgtcgga 120

gatagagtca caatcacatg tcgcgcttct caggacatct ccaagtacct gaattggtac 180

cagcagaaac ccgatcaatc tcccaaactc ctgatatatc acactagtcg gctgcattca 240

ggcgtgccct caaggttctc tgggtccgga tcaggcaccg attataccct cacaatcagc 300

tccctgcagc ccgaagactt cgccacctac ttctgtcagc aagggaacac actgccatat 360

acctttggac aggggaccaa actggagatc actggtggcg gaggttctgg cggcggagga 420

agcggcggag gtggctcaca agtccagctg caagagtcag gaccaggcct cgtcaagcca 480

tcacaaacac tgtccctcac ctgcactgtg agcggcgtga gtctgcccga ttatggagtg 540

tcatggatac ggcagccacc aggaaaaggg ctggagtggc tgggcgtgat ctggggttct 600

gaaaccacat actataactc cgcactgaag agccgcttca caatcagcaa ggataactca 660

aagaactctg tgtacctgca gatgaactcc ctccgcaccg aagatacagc tctgtattac 720

tgtgccaaac attactacta cggaggaagc tatgcaatgg actattgggg acagggcact 780

ctggtgaccg tctcaagtac aaccacaccc gctcccaggc ctccaactcc cgctcctacc 840

atcgcttccc aaccactgag cctgaggccc gaggcatgca gacctgcagc cggaggtgcc 900

gtgcacacca gaggactgga cttcgcatgt accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 960

ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 1020

gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 1080

cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaag 1140

agaggcagga agaagctgct gtacatcttc aagcagccct tcatgcgccc cgtgcagaca 1200

acccaggagg aggacggctg cagctgtcgg ttcccagagg aggaggaggg aggatgtgag 1260

ctgagggtga agttttctcg gagcgccgat gcaccagcat atcagcaggg acagaatcag 1320

ctgtacaacg agctgaatct gggcaggcgc gaggagtacg acgtgctgga taagcggaga 1380

ggcagagatc ccgagatggg aggcaagcca aggaggaaga accctcagga gggcctgtat 1440

aatgagctgc agaaggacaa gatggccgag gcctactctg agatcggcat gaagggagag 1500

cggagaaggg gcaagggaca cgatggcctg tatcagggcc tgagcacagc caccaaggac 1560

acctacgatg cactgcacat gcaggccctg ccacctaggt agtaa 1605

<210> 65

<211> 1605

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

gccgccacca tggcactgcc tgttactgct ctcctcctgc cactcgcact gctgctccat 60

gcagctagac ctgatattca gatgacccag tcacctagct ctctcagcgc ctccgtcgga 120

gatagagtca caatcacatg tcgcgcttct caggacatct ccaagtacct gaattggtac 180

cagcagaaac ccgatcaatc tcccaaactc ctgatatatc acactagtcg gctgcattca 240

ggcgtgccct caaggttctc tgggtccgga tcaggcaccg attataccct cacaatcagc 300

tccctgcagc ccgaagactt cgccacctac ttctgtcagc aagggaacac actgccatat 360

acctttggac aggggaccaa actggagatc actggtggcg gaggttctgg cggcggagga 420

agcggcggag gtggctcaca agtccagctg caagagtcag gaccaggcct cgtcaagcca 480

tcagaaacac tgtccctcac ctgcactgtg agcggcgtga gtctgcccga ttatggagtg 540

tcatggatac ggcagccacc aggaaaaggg ctggagtggc tgggcgtgat ctggggttct 600

gaaaccacat actataactc cgcactgaag agccgcgtca caatcagcaa ggatacctca 660

aagaaccaag tgtccctgaa aatgaactcc gtcaccgcag cagatacagc tgtctattac 720

tgtgccaaac attactacta cggaggaagc tatgcaatgg actattgggg acagggcact 780

ctggtgaccg tctcaagtac aaccacaccc gctcccaggc ctccaactcc cgctcctacc 840

atcgcttccc aaccactgag cctgaggccc gaggcatgca gacctgcagc cggaggtgcc 900

gtgcacacca gaggactgga cttcgcatgt accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 960

ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 1020

gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 1080

cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaag 1140

agaggcagga agaagctgct gtacatcttc aagcagccct tcatgcgccc cgtgcagaca 1200

acccaggagg aggacggctg cagctgtcgg ttcccagagg aggaggaggg aggatgtgag 1260

ctgagggtga agttttctcg gagcgccgat gcaccagcat atcagcaggg acagaatcag 1320

ctgtacaacg agctgaatct gggcaggcgc gaggagtacg acgtgctgga taagcggaga 1380

ggcagagatc ccgagatggg aggcaagcca aggaggaaga accctcagga gggcctgtat 1440

aatgagctgc agaaggacaa gatggccgag gcctactctg agatcggcat gaagggagag 1500

cggagaaggg gcaagggaca cgatggcctg tatcagggcc tgagcacagc caccaaggac 1560

acctacgatg cactgcacat gcaggccctg ccacctaggt agtaa 1605

Claims

1.一种人源化抗CD19的抗原结合片段，所述的人源化抗CD19的抗原结合片段含有如Seq ID No:31所示的轻链框架区1(L FR1)，如Seq ID No:32或Seq ID No:33所示的轻链框架区2(L FR2)，如Seq ID No:34或Seq ID No:35所示轻链框架区3(L FR3)，和如Seq IDNo:36或Seq ID No:37所示轻链框架区4(L FR4)中的一个或多个；以及含有如Seq ID No:38或Seq ID No:39所示重链可变区1(H FR1)，如Seq ID No:40所示重链框架区2(H FR2)，如Seq ID No:41或Seq ID No:42或Seq ID No:43所示重链框架区3(H FR3)，和如Seq IDNo:44或Seq ID No:45所示重链框架区4(H FR4)的一个或多个。

2.根据权利要求1所述的人源化抗CD19的抗原结合片段，其特征在于，所述的人源化抗CD19的抗原结合片段含有如Seq ID No:31所示的轻链框架区1(L FR1)，如Seq ID No:32或Seq ID No:33所示的轻链框架区2(L FR2)，如Seq ID No:34或Seq ID No:35所示轻链框架区3(L FR3)，和如Seq ID No:36或Seq ID No:37所示轻链框架区4(L FR4)；以及含有如SeqID No:38或Seq ID No:39所示重链可变区1(H FR1)，如Seq ID No:40所示重链框架区2(HFR2)，如Seq ID No:41或Seq ID No:42或Seq ID No:43所示重链框架区3(H FR3)，和如SeqID No:44或Seq ID No:45所示重链框架区4(H FR4)。

3.根据权利要求1或2所述的人源化抗CD19的抗原结合片段，其是ScFv。

4.根据权利要求3所述的人源化抗CD19的抗原结合片段，其特征在于，所述的人源化抗CD19的抗原结合片段，其轻链可变区含有如Seq ID No:12、Seq ID No:13、Seq ID No:14或Seq ID No:15所示的氨基酸序列中的任意一条，其重链可变区含有如Seq ID No:25、SeqID No:26、Seq ID No:27或Seq ID No:28所示的氨基酸序列中的任意一条；

优选地，所述的人源化抗CD19的抗原结合片段，其轻链可变区含有Seq ID No:12所示的氨基酸序列，其重链可变区含有如Seq ID No:26所示的氨基酸序列；更优选地，所述的人源化抗CD19的抗原结合片段，其具有Seq ID No:46所示的氨基酸序列；

或者优选地，所述的人源化抗CD19的抗原结合片段，其轻链可变区含有Seq ID No:15所示的氨基酸序列，其重链可变区含有如Seq ID No:27所示的氨基酸序列；更优选地，所述的人源化抗CD19的抗原结合片段，其具有Seq ID No:47所示的氨基酸序列；

或者优选地，所述的人源化抗CD19的抗原结合片段，其轻链可变区含有如Seq ID No:13所示的氨基酸序列，其重链可变区含有如Seq ID No:28所示的氨基酸序列；更优选地，所述的人源化抗CD19的抗原结合片段，其具有Seq ID No:48所示的氨基酸序列；

或者优选地，所述的人源化抗CD19的抗原结合片段，其轻链可变区含有Seq ID No:14所示的氨基酸序列，其重链可变区含有如Seq ID No:26所示的氨基酸序列；更优选地，所述的人源化抗CD19的抗原结合片段，其具有Seq ID No:49所示的氨基酸序列；

或者优选地，所述的人源化抗CD19的抗原结合片段，其轻链可变区含有Seq ID No:14所示的氨基酸序列，其重链可变区含有如Seq ID No:27所示的氨基酸序列；更优选地，所述的人源化抗CD19的抗原结合片段，其具有Seq ID No:50所示的氨基酸序列。

5.编码权利要求1中任一所述的框架区的核酸序列。

6.编码权利要求4中所述的轻链可变区和/或重链可变区或人源化抗CD19的抗原结合片段的核酸序列；优选地，所述的人源化抗CD19的抗原结合片段的核酸序列选自如SeqID.No.51-55所示的序列中的任意一条。

7.包含权利要求5或6所述核酸序列中至少一条的载体。

8.包含权利要求5或6所述载体的细胞。

9.嵌合抗原受体CAR，所述的嵌合抗原受体CAR含有权利要求1-4任一所述的人源化抗CD19的抗原结合片段；优选地，嵌合抗原受体CAR还含有跨膜结构域和包内信号传导结构域；更优选地，所述的嵌合抗原受体CAR选自如Seq ID.No.56-60所示的氨基酸序列中的任意一条；更优选的，选自如Seq ID.No.57或60所示的氨基酸序列中的任意一条。

10.编码权利要求9所述的嵌合抗原受体CAR的核酸序列；优选地，所述的嵌合抗原受体CAR的核酸序列选自如Seq ID.No.61-65所示的核酸序列中的任意一条。

11.包含权利要求10所述的嵌合抗原受体CAR的核酸序列的载体；优选地，所述的载体选自转座子、质粒、慢病毒、腺病毒或逆转录病毒；更优选地，所述的载体选自慢病毒。

12.包含权利要求11所述载体的细胞；优选地，所述的细胞是T细胞；更优选地，所述的细胞是人T细胞。

13.一种试剂盒，含有权利要求1-12任一所述的人源化抗CD19的抗原结合片段/核酸序列/载体/细胞/嵌合抗原受体CAR。

14.权利要求1-13任一所述的人源化抗CD19的抗原结合片段/核酸序列/载体/细胞/嵌合抗原受体CAR/试剂盒在制备治疗CD19表达相关疾病的药物中的应用；优选地，所述的CD19表达相关疾病选自癌症、恶性肿瘤、癌前病症、或增生性疾病中的一种或几种组合；

更优选地，所述的CD19表达相关疾病选自骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期，或是与CD19表达相关的非癌相关适应症；或者更优选地，所述的CD19表达相关疾病选自血液学癌症；

更优选地，所述的CD19表达相关疾病选自B细胞急性淋巴样白血病(BALL)、T细胞急性淋巴样白血病(TALL)、急性淋巴样白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞早幼淋巴细胞样白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞性白血病、小细胞或大细胞性-滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生病症、MALT淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、边缘带淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、和白血病前期中的一种或几种。