CN111542541B - 特异性识别恶性b细胞的抗体或其抗原结合片段、包含其的嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有通过靶向恶性B细胞来治疗癌的用途的新型抗体或其抗原结合片段、包含其的嵌合抗原受体及它们的用途。本发明的抗体是特异性结合在癌细胞(尤其，血液癌)高表达的CD19的抗体，与现有的CD19靶抗体的互补决定区(CDR)序列相比，同源性非常低，其序列具有独特性，用于表达包含本发明的抗CD19抗体或抗原结合片段的嵌合抗原受体的细胞通过与表达CD19的阳性细胞株进行反应来诱导免疫细胞活性，因此可有效地用作CAR‑免疫细胞治疗剂。

Description

特异性识别恶性B细胞的抗体或其抗原结合片段、包含其的嵌 合抗原受体及其用途
技术领域
本发明在韩国多部门的支援下通过课题编号9991006240来完成的，上述课题的研究管理专门机构为(财)各部门新药开发事业团，研究事业名称为“各部门全周期新药开发”、研究课题名称为“开发基于新型CD19抗体的CAR-T治疗剂”，主管机构为“abclon(株)”，研究期间为2018年02月01日至2019年01月31日。
本专利申请要求于2017年12月22日向韩国专利厅提交的韩国专利申请第10-2017-0178559号的优先权，上述专利申请的公开内容通过引用合并入本说明书中。
本发明涉及通过靶向恶性B细胞来治疗癌的用途的新型抗体或其抗原结合片段、包含其的嵌合抗原受体及它们的用途。
背景技术
恶性B细胞(B cell malignancy)是指构成人体免疫系统的细胞系中源自B细胞的肿瘤。由于这些恶性B细胞会破坏正常的免疫系统，因此通过降低对从外部侵入抗原的免疫性来导致患者死亡。例如，作为恶性B细胞之一的急性淋巴细胞白血病是淋巴细胞类白细胞变成恶性细胞，在骨髓中增值并扩散到外周血，从而侵袭肝脏、脾脏、淋巴系统、大脑、小脑和脊髓等的疾病。预计到2015年全球急性淋巴细胞白血病发病数将达到161000人，死亡人数将达到110000人，急性淋巴细胞白血病是一种男性的发病及死亡均高于女性的疾病。作为治疗这种急性淋巴细胞白血病的代表性方法有化学疗法(chemotherapy)、靶向疗法(targeted therapy)、同种异体干细胞移植(allogeneic stem cell transplantation)，其治疗法得到了改善，在儿童患者的存活率超过85％。但是，仍然有一些患者对现有的治疗剂无反应或存在复发的患者，这成为儿童癌症死亡的主要原因。
由于大多数源自急性淋巴细胞白血病及恶性B细胞的淋巴瘤/白血病(lymphoma/leukemia)在细胞表面表达CD19，因此已经尝试了各种基于其识别CD19的治疗法。在这些CD19靶向治疗剂领域中，具有CAR-T治疗剂、双特异性抗体(bispecific antibody)、抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate)、免疫毒素(immunotoxin)、Fc-工程改造(Fc-engineered)抗体等。在这些CD19靶向治疗剂领域中，CAR-T治疗剂(嵌合抗原受体T细胞免疫疗剂)通过激活靶细胞的细胞毒性来诱导细胞凋亡的机制，将其应用于血液癌治疗中，其以对现有治疗没有应答的急性白血病患者为对象，据报道，由此获得治愈率高的临床试验结果(30名中27名得到治愈)。
在这种背景下，本发明人开发了选择性识别恶性B细胞中CD19的抗体片段及包含其的嵌合抗原受体，并确认表达其嵌合抗原受体的细胞毒性T细胞具有细胞毒性。
发明内容
技术问题
作为用于治疗恶性B细胞的方法，本发明人致力于开发与CD19特异性结合的新型抗体及利用其的嵌合抗原受体。其结果，确认本发明的CD19_8.1抗体选择性地与CD19相结合，表达包含其抗体的片段的嵌合抗原受体的细胞毒性T细胞拥有细胞毒性活性，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供新型抗CD19抗体或其抗原结合片段。
本发明的再一目的在于，提供一种嵌合抗原受体，包含细胞外结构域(extracellular domain)、跨膜结构域(transmembrane domain)及细胞内信号传导结构域，所述细胞外结构域包含抗CD19抗体或其抗原结合片段。
本发明的另一目的在于，提供表达上述嵌合抗原受体的细胞。
本发明的还有一目的在于，提供包含上述抗CD19抗体、其的抗原结合片段或用于表达嵌合抗原受体的细胞的药剂学组合物。
本发明的又一目的在于，提供编码上述抗CD19抗体、其抗原结合片段或嵌合抗原受体的核酸分子。
本发明的又一目的在于，提供包含用于编码上述抗CD19抗体、其抗原结合片段或嵌合抗原受体的核酸分子的重组载体。
本发明的又一目的在于，提供上述抗CD19抗体、其的抗原结合片段或用重组载体转化的宿主细胞。
技术方案
在本说明书要求保护以下1～35的发明。
1.一种抗CD19抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)重链可变区(heavy chain variable region，VH)，包含由下述通式1表示的氨基酸序列组成的CDRH2，
通式1：GIYYDX6X7X8X9X10X11X12X13SVKG；
在上述通式中，X6为G、A或S；X7为S、T、I、A、D、F、L或H；X8为A、T、S、Q、W、I、V、M、N、Y或H；X9为R、KS、V、A、Q、L、T、E、D、M、L、F或P；X10为Y、G、S或T；X11为Y、W、M或L；X12为A、S、T或L；X13为D、S、G、N或P；以及
(b)轻链可变区(light chain variable region，VL)，包含由下述通式2表示的氨基酸序列组成的CDRL1，
通式2：X1GX3X4SNIGSX10X11X12Y；
上述X1为V、A、G、S、W、N、Y、K、T、H、R、Q、E或D；X3为G、H、D、L、T、Q、K、N、S或M；X4为V、Y、I、P、V、M、A、L、F或S；X10为N或A；X11为A或P；X12为V、T或L。
2.根据1所述的抗CD19抗体或其抗原结合片段，上述重链可变区包含由下述通式1-1表示的氨基酸序列组成的CDRH2，
通式1-1：GIYYDX6X7X8X9YYADSVKG；
在上述通式中，X6为G、A或S；X7为S、T、I、A、D、F、L或H；X8为A、T、S、Q、W、I、V、M、N、Y或H；X9为R、KS、V、A、Q、L、T、E、D、M、L、F或P。
3.根据1所述的抗CD19抗体或其抗原结合片段，上述轻链可变区包含由下述通式2-1表示的氨基酸序列组成的CDRL1，
通式2-1：X1GX3X4SNIGSNAVY；
上述X1为V、A、G、S、W、N、Y、K、T、H、R、Q、E或D；X3为G、H、D、L、T、Q、K、N、S或M；X4为V、Y、I、P、V、M、A、L、F或S。
4.根据1所述的抗CD19抗体或其抗原结合片段，上述重链可变区(VH)还包含序列表中第1序列的CDRH1及序列表中第3序列的CDRH3；上述轻链可变区(VL)还包含序列表中第5序列的CDRL2及序列表中第6序列的CDRL3。
5.根据4所述的抗CD19抗体或其抗原结合片段，上述CDRH2包含选自由序列表中第2序列、第7序列至第48序列组成的组中的氨基酸序列。
6.根据4所述的抗CD19抗体或其抗原结合片段，上述CDRL1包含选自由序列表中第4序列、第49序列至第90序列组成的组中的氨基酸序列。
7.根据4所述的抗CD19抗体或其抗原结合片段，上述CDRH2及上述CDRL1分别包含序列表中第2序列及第4序列、第7序列及第49序列、第8序列及第50序列、第9序列及第51序列、第10序列及第52序列、第11序列及第53序列、第12序列及第54序列、第13序列及第55序列、第14序列及第56序列、第15序列及第57序列、第16序列及第58序列、第17序列及第59序列、第18序列及第60序列、第19序列及第61序列、第20序列及第62序列、第21序列及第63序列、第22序列及第64序列、第23序列及第65序列、第24序列及第66序列、第25序列及第67序列、第26序列及第68序列、第27序列及第69序列、第28序列及第70序列、第29序列及第71序列、第30序列及第72序列、第31序列及第73序列、第35序列及第74序列、第33序列及第75序列、第34序列及第76序列、第35序列及第77序列、第36序列及第78序列、第37序列及第79序列、第38序列及第80序列、第39序列及第81序列、第40序列及第82序列、第41序列及第83序列、第42序列及第84序列、第43序列及第85序列、第44序列及第86序列、第45序列及第87序列、第46序列及第88序列、第47序列及第89序列或第48序列及第90序列的氨基酸序列。
8.根据1所述的抗CD19抗体或其抗原结合片段，上述重链可变区包含选自由序列表中第91序列至第133序列组成的组中的氨基酸序列。
9.根据1所述的抗CD19抗体或其抗原结合片段，上述轻链可变区(VL)包含选自由序列表中第134序列至第176序列组成的组中的氨基酸序列。
10.根据1所述的抗CD19抗体或其抗原结合片段，上述重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)分别包含序列表中第91序列及第134序列、第92序列及第135序列、第93序列及第136序列、第94序列及第137序列、第95序列及第138序列、第96序列及第139序列、第97序列及第140序列、第98序列及第141序列、第99序列及第142序列、第100序列及第143序列、第101序列及第144序列、第102序列及第145序列、第103序列及第146序列、第104序列及第147序列、第105序列及第148序列、第106序列及第149序列、第107序列及第150序列、第108序列及第151序列、第109序列及第152序列、第110序列及第153序列、第111序列及第154序列、第112序列及第155序列、第113序列及第156序列、第114序列及第157序列、第115序列及第158序列、第116序列及第159序列、第117序列及第160序列、第118序列及第161序列、第119序列及第162序列、第120序列及第163序列、第121序列及第164序列、第122序列及第165序列、第123序列及第166序列、第124序列及第167序列、第125序列及第168序列、第126序列及第169序列、第127序列及第170序列、第128序列及第171序列、第129序列及第172序列、第130序列及第173序列、第131序列及第174序列、第132序列及第175序列或第133序列及第176序列的氨基酸序列。
11.根据1所述的抗CD19抗体或其抗原结合片段，上述CDRH2包含序列表中第190序列的氨基酸序列，上述CDRL1包含序列表中第199序列或第200序列的氨基酸序列。
12.根据11所述的抗CD19抗体或其抗原结合片段，还包含含有序列表中第191序列至第198序列的氨基酸序列的CDRH3。
13.根据11所述的抗CD19抗体或其抗原结合片段，还包含序列表中第一序列的CDRH1、序列表中第5序列的CDRL2及序列表中第6序列的CDRL3。
14.一种核酸分子，编码1至13之任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
15.一种重组载体，包含14的核酸分子。
16.一种用15的重组载体转化的宿主细胞。
17.一种CD19特异性嵌合抗原受体，包含：
(a)细胞外结构域(Extracellular domain)，包含1至13之任一项所述的抗CD19抗体或其抗原结合片段；
(b)跨膜结构域(transmembrane domain)；以及
(c)细胞内信号传导结构域。
18.根据17所述的CD19特异性嵌合抗原受体，上述跨膜结构域为选自由T-细胞受体、CD27、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8(CD8α)、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154的α、β或ζ链组成的组中的蛋白质的跨膜结构域。
19.根据17所述的嵌合抗原受体，上述细胞内信号传导结构域为来源于CD3ζ(CD3ζ)链的结构域。
20.根据17所述的嵌合抗原受体，其中所述细胞内信号传导结构域还包含选自由OX40(CD134)、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)及4-1BB(CD137)组成的组中的共刺激分子(costimulatory molecule)。
21.一种细胞，表达17至20之任一项所述的嵌合抗原受体。
22.根据21所述的表达嵌合抗原受体细胞，其中所述细胞为选自由树突状细胞、杀伤性树突状细胞、肥大细胞、NK-细胞、B-细胞或炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助性T淋巴组成的组中的免疫细胞。
23.一种药剂学组合物，用于预防或治疗与表达包含1至13之任一项所述的抗体或其抗原结合片段的CD19的细胞有关的疾病、自身免疫性疾病或炎症性疾病。
24.根据23所述的药剂学组合物，与表达上述CD19的细胞有关的疾病为选自由慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、急性淋巴细胞白血病(acutelymphocytic leukemia，ALL)、前淋巴细胞白血病(pro-lymphocytic leukemia)、毛细胞白血病(hairy cell leukemia)、常见急性淋巴细胞白血病(common acute lymphocyticleukemia，CALLA)、无急性淋巴细胞白血病(Null-acute lymphoblastic leukemia)、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma)、脾淋巴瘤(splenic lymphoma)、边缘区淋巴瘤(marginal zone lymphoma)、套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)、惰性B细胞淋巴瘤(indolent B cell lymphoma)以及霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)组成的组中的B细胞恶性肿瘤(B cell malignancy)。
25.根据23所述的药剂学组合物，上述自身免疫疾病或炎症性疾病为选自由多发性硬化症、类风湿关节炎及系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)组成的组中的疾病。
26.一种药剂学组合物，用于预防或治疗与表达包含21或22所述的细胞的CD19的细胞有关的疾病、自身免疫性疾病或炎症性疾病。
27.根据26所述的药剂学组合物，与表达上述CD19的细胞有关的疾病为选自由慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、前淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、常见急性淋巴细胞白血病、无急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、脾淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性B细胞淋巴瘤以及霍奇金淋巴瘤组成的组中的B细胞恶性肿瘤。
28.根据26所述的药剂学组合物，其中所述自身免疫疾病或炎症性疾病为选自由多发性硬化症、类风湿关节炎及系统性红斑狼疮组成的组中的疾病。
29.一种核酸分子，编码17至20的嵌合抗原受体。
30.一种重组载体，包含26的核酸分子。
31.一种宿主细胞，用27的重组载体转化。
32.一种与表达CD19的细胞有关的疾病、自身免疫性疾病或炎症性疾病的治疗方法，包括向需要治疗的对象给药23至28之任一项所述的组合物的步骤。
33.根据32所述的治疗方法，与表达上述CD19的细胞有关的疾病为选自由慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、前淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、常见急性淋巴细胞白血病、无急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、脾淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性B细胞淋巴瘤以及霍奇金淋巴瘤组成的组中的B细胞恶性肿瘤。
34.根据32所述的治疗方法，上述自身免疫疾病或炎症性疾病为选自由多发性硬化症、类风湿关节炎及系统性红斑狼疮组成的组中的疾病。
35.根据32所述的治疗方法，上述对象为哺乳动物或人。
在说明书中，根据本发明一实施方式的抗体为CD19_8.1抗体及经亲和度成熟的它们的修饰的抗体。
本发明的CD19_8.1抗体、其变形抗体或它们的抗原结合片段与现有的嵌合抗原受体中使用的抗体的FMC63相同，对CD19具有特异结合能力。
在说明书中，“FMC63”抗体为鼠抗CD19单克隆抗体的一例(Nicholson et al.，Molecular Immunology，34(16-17)：1157-1165(1997))。FMC63单克隆抗体的可变区使用了用于临床试验中的嵌合抗原受体(CAR)(例如，参照文献[Kochenderfer et al.，NatureReview Clinical Oncol.，10(5)；267-276(2013)；Porter et al.，New Eng.J.Med.，365(8)：725-733(2011)；Kalos et al.，Science Translational Medicine，3(95)：95ra73(2011)；Kochenderfer et al.，Blood，116(20)：4099-4102(2010)；and Kochenderfer etal.，Blood，119(12)：2709-2720(2012)])。
本发明的抗体特异性结合在与上述FMC63抗体相同的CD19的表位。
在本发明中，术语“抗体(antibody)”是CD19特异性抗体，不仅包括完全抗体形态，而且还包括抗体分子的抗原结合片段(antigen binding fragment)。
完全抗体是具有2个全长轻链和2个全长重链的结构，每个轻链通过二硫键与重链连接。重链恒定区具有伽玛(γ)、缪(μ)、阿尔法(α)、德尔塔(δ)及伊普西龙(ε)类型，子类有伽玛1(γ1)、伽玛2(γ2)、伽玛3(γ3)、伽玛4(γ4)、阿尔法1(α1)以及阿尔法2(α2)。轻链的恒定区具有卡帕(κ)及兰姆达(λ)类型。
在本发明中，术语“抗原结合片段(antigen binding fragment)”是指保留抗原结合功能的片段，包括Fab、F(ab')、F(ab')2及Fv等。抗体片段中Fab(片段抗原结合)具有轻链及重链的可变区和轻链的恒定区及重链第一恒定区(CH1)的结果，并具有1个抗原结合位点。Fab'与Fab的不同之处在于，具有在重链CH1结构域的C-末端包含1个以上半胱氨酸残基的铰链区(hinge region)。F(ab')2抗体是通过Fab'的铰链区的半胱氨酸残基形成二硫键而产生的。Fv是仅具有重链可变位点及轻链可变位点的最小抗体片，并且用于产生Fv片段的重组技术公知于本领域中。双链可变区(two-chain Fv)是通过非共价连接重链可变位点和轻链可变位点，单链可变区(single-chin variable fragment，scFv)通常由肽连接子重链的可变区和单链的可变区通过共价键连接或直接连接在C-末端，因此可形成类似于双链可变区的二聚体结构。可以使用蛋白水解酶获得这种抗体(例如，若用木瓜蛋白酶限制性切割整个抗体，则可获得Fab，若用胃蛋白酶限制性切割，则可获得F(ab')2片段)，或者可通过基因重组技术来制备。
因此，在本发明中，具体地，抗体包括单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链可变区、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键Fvs(sdFv)及抗独特型(抗-Id)抗体及上述抗体的表位-结合片段等，但并不限定于此。
在本发明中，术语“重链”是指所有包含可变区结构域VH及3个恒定区结构域CH1、CH2及CH3的全长重链及其片段，所述可变区结构域VH包含具有足以赋予抗原特异性的可变区序列的氨基酸序列。并且，在本说明书中，术语“轻链”是指所有包含可变区结构域VL及恒定区结构域CL的全长轻链及其片段，所述可变区结构域VH包含具有足以赋予抗原特异性的可变区序列的氨基酸序列。
在本发明中，术语“可变区(variable region)”或“可变结构域(variabledomain)”是指涉及抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然(Native)抗体的重链及轻链的可变结构域(分别为VH及VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含4个保守框架区(framework regions，FR)及3个高变区(hypervariable regions，HVR)。(Kindt et al.，Kuby Immunology，第六版，W.H.Freeman and Co.，page 91(2007))。
在本发明中，术语“互补决定区(CDR，complementarity determining region)”是指免疫球蛋白重链及轻链的高变区(hypervariable region)的氨基酸序列(Kabat etal.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，4th Ed.，U.S.Department ofHealth and Human Services，National Institutes of Health(1987))。重链(CDRH1、CDRH2及CDRH3)及轻链(CDRL1、CDRL2及CDRL3)分别包含3个互补决定区。互补决定区为抗体提供主要的接触残基以结合抗原或表位。
在本发明中，术语“框架(Framework)”或“FR”是指除高变区(hypervariableregion，HVR)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由4个FR结构域FR1、FR2、FR3以及FR4组成。因此，HVR及FR序列通常在VH中按以下顺序出现：
FRH1(轻链框架区1)-CDRH1(轻链互补决定区1)-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4；
并且，HVR及FR序列通常在VL(或Vk)中按以下顺序出现：
FRL1(轻链框架区1)-CDRL1(轻链互补决定区1)-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4。
在本发明中，术语“特异性结合”或等同于其的术语是指抗体或其抗原结合片段或单链可变区等其他构建体在生理条件下与相对稳定的抗原形成复合体。特异性结合可通过至少约1×10-6M以下的平衡解离常数(例如，小于此的KD表示更牢固的结合)来表征。确认2个分子是否特异性结合的方法在本领域中是众所周知的，例如，包括平衡透析、表面等离子体激元共振等。
在本发明中，术语“亲和度(Affinity)”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合伴(例如，抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另有规定，否则“结合亲和力(binding affinity)”是指反映结合对(例如，抗体及抗原)的成员之间1：1的相互作用的内在结合(intrinsic)结合亲和力。分子X和其配偶体Y的亲和度通常可以用解离常数(Kd)表示。亲和度可通过本领域已知的常规方法来测量，包括本说明书中所述的那些。
并且，在本说明书中，术语“人抗体(human antibody)”或“人源化抗体(humanizedantibody)”是指由人或人细胞产生的抗体、或使用人抗体所组成部分(repertoires)或其他人抗体编码序列来源的非人来源的抗体，它保留了相应于氨基酸序列的氨基酸序列。
在本说明书中，术语“嵌合(chimeric)抗体”是指部分重链和/或轻链来源于特定的来源(source)或物种(species)，而重链和/或轻链的的其余部分来源于不同的来源或物种的抗体。
如普通技术人员所认知，本发明的抗CD19抗体或其抗原结合片段在能够特异性识别CD19的范围内可包括氨基酸序列的变体。例如，可以改变抗体的氨基酸序列以改善抗体的结合亲和度和/或其他生物学特性。这些修饰包括例如抗体的氨基酸序列残基的缺失、插入和/或取代。
这些氨基酸突变是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如疏水性、亲水性、电荷、大小等。通过分析氨基酸侧链取代基的大小、形状及种类，可知精氨酸、赖氨酸和组氨酸均为带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的大小相似；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似的形状。因此基于这些考虑，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸在生物学上是可以是等同物。
对于引入突变，可考虑氨基酸的疏水指数(hydropathic idex)。根据疏水性和电荷的每个氨基酸的疏水性指数如下：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。
对于赋予蛋白质相互作用生物学功能(interactive biological function)，疏水性氨基酸指数非常重要。众所周知，只有用具有相似的疏水性指数的氨基酸取代，才能保留生物活性。在通过参照疏水性指数来引入突变的情况下，优选地，在具有±2之内，更优选地，±1之内，进一步优选地，±0.5之内的疏水性指数差异的氨基酸之间进行取代。
另一方面，还众所周知，具有相似的亲水性值(hydrophilicity value)的氨基酸之间的取代产生具有相同生物学活性的蛋白质。如美国专利第4554101号中公开，每个氨基酸残基的亲水性值如下：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
在参照亲水性值引入突变的情况下，优选地，在具有±2之内，更优选地，±1之内，进一步优选地，±0.5之内的亲水性值差异的氨基酸之间进行取代。
不完全改变分子活性的蛋白质中的氨基酸交换是本领域已知的(H.Neurath，R.L.Hill，The Proteins，Academic Press，New York，1979)。最常见的交换是氨基酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly之间的交换。
根据本发明的一实施方式，本发明提供的抗CD19或其抗原结合片段，包含：
(a)重链可变区(heavy chain variable region，VH)，包含由下述通式1表示的氨基酸序列组成的CDRH2，
通式1：GIYYDX6X7X8X9X10X11X12X13SVKG；
在上述通式中，X6为G、A或S；X7为S、T、I、A、D、F、L或H；X8为A、T、S、Q、W、I、V、M、N、Y或H；X9为R、KS、V、A、Q、L、T、E、D、M、L、F或P；X10为Y、G、S或T；X11为Y、W、M或L；X12为A、S、T或L；X13为D、S、G、N或P；以及
(b)轻链可变区(light chain variable region，VL)，包含由下述通式2表示的氨基酸序列组成的CDRL1，
通式2：X1GX3X4SNIGSX10X11X12Y；
上述X1为V、A、G、S、W、N、Y、K、T、H、R、Q、E或D；X3为G、H、D、L、T、Q、K、N、S或M；X4为V、Y、I、P、V、M、A、L、F或S；X10为N或A；X11为A或P；X12为V、T或L。
在说明书中使用的“Xn”及“Xm”等符号用于表示位于以上定义的通式中n及m位的氨基酸。其中，n及m是表示从上述序列的N末端计算的上述序列中的氨基酸位置的整数。例如，X1及X6分别表示上述序列的N末端第1位及第6位的氨基酸。
在本发明一实例的情况下，从上述通式中的Xn或Xm可独立地选自所有可能的可能氨基酸残基的组中。普通技术人员可以理解，Xn可选自列出可能残基的组中的一种，而这种选择独立于Xm的氨基酸选择，其中n与m不同。因此，在上述通式中，在Xn位中列出的任何可能氨基酸残基可以独立地与在其他多种位置(Xm位)列出的可能氨基酸残基组合。
如下述实施例详细记载，特异性结合在本发明的CD19的抗CD19抗体、其变形抗体或它们的抗原结合片段的CDRH2及CDRL1分别由上述通式1或通式1-1、通式2或通式2-1表示，上述通式基于对许多随机变形抗体的统计分析结果制定。通过重复选择试验确认与CD19的相互作用，从而选择了特异性结合在上述CD19的CD19_8.1抗体或抗原结合片段和它们的变形抗体。
在本发明的具体实例中，本发明抗CD19抗体或其抗原结合片段包含的重链可变区包含由下述通式1-1表示的氨基酸序列组成的CDRH2。
通式1-1：GIYYDX6X7X8X9YYADSVKG；
在上述通式中，X6为G、A或S；X7为S、T、I、A、D、F、L或H；X8为A、T、S、Q、W、I、V、M、N、Y或H；X9为R、KS、V、A、Q、L、T、E、D、M、L、F或P。
在本发明的其他具体实例中，本发明抗CD19抗体或其抗原结合片包含的轻链可变区包含由下述通式2-1表示的氨基酸序列组成的CDRL1。
通式2-1：X1GX3X4SNIGSNAVY；
上述X1为V、A、G、S、W、N、Y、K、T、H、R、Q、E或D；X3为G、H、D、L、T、Q、K、N、S或M；X4为V、Y、I、P、V、M、A、L、F或S。
在本发明的实施例中，本发明抗CD19抗体或其抗原结合片段包含的上述重链可变区(VH)还包含序列表中第1序列的CDRH1及序列表中第3序列的CDRH3；上述轻链可变区(VL)还包含第5序列的CDRL2及第6序列的CDRL3。
在本发明的实施例中，由上述通式表示的CDRH2的氨基酸序列对应于选自由序列表中第2序列、第7序列至第48序列组成的组中氨基酸序列。
并且，在本发明实施例中，由上述通式表示的CDRL1的氨基酸序列对应于选自由序列表中第4序列、第49序列至第90序列组成的组中氨基酸序列。
在本发明的一实施例中，本发明的抗CD19抗体或其抗原结合片段的上述CDRH2及CDRL1分别包含序列表中第2序列及第4序列、第7序列及第49序列、第8序列及第50序列、第9序列及第51序列、第10序列及第52序列、第11序列及第53序列、第12序列及第54序列、第13序列及第55序列、第14序列及第56序列、第15序列及第57序列、第16序列及第58序列、第17序列及第59序列、第18序列及第60序列、第19序列及第61序列、第20序列及第62序列、第21序列及第63序列、第22序列及第64序列、第23序列及第65序列、第24序列及第66序列、第25序列及第67序列、第26序列及第68序列、第27序列及第69序列、第28序列及第70序列、第29序列及第71序列、第30序列及第72序列、第31序列及第73序列、第35序列及第74序列、第33序列及第75序列、第34序列及第76序列、第35序列及第77序列、第36序列及第78序列、第37序列及第79序列、第38序列及第80序列、第39序列及第81序列、第40序列及第82序列、第41序列及第83序列、第42序列及第84序列、第43序列及第85序列、第44序列及第86序列、第45序列及第87序列、第46序列及第88序列、第47序列及第89序列或第48序列及第90序列的氨基酸序列。
在本发明再一实施例中，本发明的抗CD19抗体或其抗原结合片段的重链可变区(VH)包含选自由序列表中第91序列至第133序列组成的组中氨基酸序列，和/或上述轻链可变区(VL)包含选自由序列表中第134序列至第176序列组成的组中氨基酸序列，但并不限定于此。
在本发明的另一实施例中，本发明的抗CD19抗体或其抗原结合片段的上述重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)分别包含序列表中第91序列及第134序列、第92序列及第135序列、第93序列及第136序列、第94序列及第137序列、第95序列及第138序列、第96序列及第139序列、第97序列及第140序列、第98序列及第141序列、第99序列及第142序列、第100序列及第143序列、第101序列及第144序列、第102序列及第145序列、第103序列及第146序列、第104序列及第147序列、第105序列及第148序列、第106序列及第149序列、第107序列及第150序列、第108序列及第151序列、第109序列及第152序列、第110序列及第153序列、第111序列及第154序列、第112序列及第155序列、第113序列及第156序列、第114序列及第157序列、第115序列及第158序列、第116序列及第159序列、第117序列及第160序列、第118序列及第161序列、第119序列及第162序列、第120序列及第163序列、第121序列及第164序列、第122序列及第165序列、第123序列及第166序列、第124序列及第167序列、第125序列及第168序列、第126序列及第169序列、第127序列及第170序列、第128序列及第171序列、第129序列及第172序列、第130序列及第173序列、第131序列及第174序列、第132序列及第175序列或第133序列及第176序列的氨基酸序列。
除了上述抗CD19抗体或其抗原结合片段外，本发明人为了开发对CD19抗原的亲和度得以增强的额外抗体，基于以往开发的CD19_8.1_2F1制备了修饰CDRH2、CDRH3及CDRL1的子库，其结果，还得出了亲和度得以改善的8种抗体，各个抗体的氨基酸序列在本发明的实施例及序列表中列出。
基于CD19_8.1_2F1得出上述8种额外抗体，其包含序列表中第1序列的CDRH1、序列表中第5序列的CDRL2及序列表中第6序列的CDRL3。
根据本发明的一实例，上述抗CD19抗体或其抗原结合片段包含含有序列表中第190序列的氨基酸序列的CDRH2以及含有序列表中第199序列或第200序列的氨基酸序列的CDRL1。
根据本发明的其他实例，上述抗CD19抗体或其抗原结合片段包含选自序列表中第191序列至第198序列中的氨基酸序列。
本发明的抗CD19抗体或其抗原结合片段包括包含对上述氨基酸序列的小幅度改变，即，对三维结构及抗体功能几乎不产生影响的修饰的抗CD19抗体或其抗原结合片段。因此，在某种实例的情况下，即使与上述序列不相同，也可具有至少90％、93％、95％或98％以上的相似性。
根据本发明的一实例，本发明的抗CD19抗体或其抗原结合片段包括包含上述序列的CDR的重链可变区及轻链可变区的单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链可变区、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键Fvs(sdFv)及抗独特型(抗-Id)抗体及上述抗体的表位-结合片段等，但并不限定于此。
在本发明的还有一实例中，本发明的抗CD19抗体或其抗原结合片段为抗-CD19单链可变区。在本发明的具体实例中，本发明的抗CD19抗体或其抗原结合片段为抗CD19单链可变区(scFv)。在本发明的具体实例中，包含在上述抗体或其抗原结合片段的重链可变区及轻链可变区通过(Gly-Ser)n、(Gly2-Ser)n、(Gly3-Ser)n或(Gly4-Ser)n等的连接子来连接。其中，n为1至6的整数，具体为3至4，但并不限定于此。上述单链可变区的轻链可变区及重链可变区例如能够以如下取向存在，即，轻链可变区-连接子-重链可变区或重链可变区-连接子-轻链可变区。
另一方面，与现有抗CD19抗体或包含它们的嵌合抗原受体的互补决定区序列相比，本发明的抗体互补决定区序列的同源性(similarity)非常低，因此其序列独特。例如，针对于本发明的CD19_8.1抗体，进行BLAST搜索，结果发现，同源性最高的美国专利公开公报第2016/0090427A1号中公开的抗体(序列表中第173序列)与本发明的CD19_8.1抗体仅有88.5％的互补决定区(CDR)序列同源性，进而，在上述美国专利公开公报中描述的抗体为血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子受体(C-MET)、或特异性结合在血管内皮生长因子和肝细胞生长因子受体的双特异性抗体，其靶标及类型与本发明的抗体不同。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供用于编码上述抗CD19抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
在本说明书中，术语“核酸分子”是指全面涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(基因组脱氧核糖核酸(gDNA)及互补脱氧核糖核酸(cDNA))和核糖核酸(RNA)分子的意义，在核酸分子中，作为基本结构单位的核苷酸不仅包括天然核苷酸，而且还包括糖或碱基位点被修饰的类似物(analogue)(Scheit，Nucleotide Analogs，John Wiley，New York(1980)；Uhlman及Peyman，Chemical Reviews，90：543-584(1990))。
本发明的上述抗体或其抗原结合片段或编码上述嵌合抗原受体多肽的核苷酸序列足以作为编码构成上述嵌合抗原受体分子的氨基酸序列的核苷酸序列，对于本领域技术人员显而易见的是，其不限于任何特定的核苷酸序列。
这是因为，即使核苷酸序列发生突变，当将突变的核苷酸序列表达为蛋白质时，还存在蛋白质序列不会发生改变的情况。这称为密码子的简并性。因此，上述核苷酸序列包括含有编码功能上等同的密码子或相同的氨基酸密码子(例如，由于密码子的简并性，有关精氨酸或丝氨酸的密码子为6个)或编码生物学上等同的氨基酸的密码子的核苷酸序列。
根据本发明的具体实例，形成本发明的有关CD19的上述抗体或其抗原结合片段的重链互补决定区、轻链互补决定区、重链可变区、轻链可变区、重链或形成轻链的多肽序列在本文所附序列表中列出。
编码抗CD19抗体或其抗原结合片段的本发明的核酸分子也被解释为包括与上述核苷酸序列具有实质相同性的核苷酸序列。上述实质相同性是意味着以尽可能对应的方式比对本发明的上述核苷酸序列与任何其他序列，并通过常用于本领域的算法来分析比对的序列的情况时，至少具有80％的同源性，优选地，至少具有90％的同源性，最优选地，至少具有95％的同源性的核苷酸序列。
若考虑具有所述生物学等同活性的突变，本发明的抗体或抗原结合片段；或者编码嵌合抗原受体多肽的核酸分子被解释为还包括与序列表中列出的序列具有实质相同性(substantial identity)的序列。上述实质相同性是意味着以尽可能对应的方式比对本发明的上述核苷酸序列与任何其他序列，并通过常用于本领域的算法来分析比对的序列的情况时，至少具有61％的同源性，优选地，至少具有70％的同源性，更优选地，至少具有80％的同源性，最优选地，至少具有90％的同源性的序列。用于序列比较的比对方法是本领域已知的。有关比对的各种方法及算法在Smith and Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)；Needleman and Wunsch，J.Mol.Bio.48：443(1970)；Pearson and Lipman，Methods inMol.Biol.24：307-31(1988)；Higgins and Sharp，Gene 73：237-44(1988)；Higgins andSharp，CABIOS 5：151-3(1989)；Corpet et al.，Nuc.Acids Res.16：10881-90(1988)；Huang et al.，Comp.Appl.BioSci.8：155-65(1992)and Pearson et al.，Meth.Mol.Biol.24：307-31(1994)中公开。可以从国家生物信息中心(National Centerfor Biological Information，NBCI)等访问NCBI基本局部比对搜索工具(NCBI BasicLocal Alignment Search Tool，BLAST)(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-10(1990))，它可以与网上的blastp、blastn、blastx、tblastn及tblastx等序列分析程序结合使用。可以通过ncbi网站的BLAST页面访问BLAST。使用此程序的序列同源性比较方法可在ncbi网站的BLAST辅助页面上确认。
根据本发明的还有一实施方式，本发明提供包含用于编码上述抗CD19抗体或其抗原结合片段的核酸分子的重组载体。
根据本发明的又一实施方式，本发明包括用上述重组载体转化的宿主细胞。
能够稳定地连续克隆并表达本发明的载体的宿主细胞可使用本领域中公知的任何宿主细胞，例如，上述载体的合适的真核细胞宿主细胞包括猴肾细胞7(COS7：monkeykidney cells)、NSO细胞、SP2/0、中国仓鼠卵巢(CHO：Chinese hamster ovary)细胞、W138、小仓鼠肾(BHK：baby hamster kidney)细胞、MDCK、骨髓流细胞株、HuT 78细胞及HEK-293细胞，但并不限定于此。
根据本发明的又一实施方式，本发明提供CD19特异性嵌合抗原受体，包含：
(a)细胞外结构域，包含上述抗CD19抗体或其抗原结合片段；
(b)跨膜结构域；以及
(c)细胞内信号传导结构域。
在本发明中，术语“嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)”是一种人工制备的杂交蛋白质或多肽，包含与T-细胞信号传导或T-细胞活化结构域连接的抗体的抗原结合结构域(例如，含单链可变片段(单链可变区))。嵌合抗原受体利用单克隆抗体的抗原-结合性质，通过非-MHC-限制性方式重新诱导T-细胞特异性和对选定靶标及反应性的能力。非-MHC-限制的抗原识别对表达嵌合抗原受体的T-细胞能提供够独立于抗原处理而识别抗原的能力，从而避免了肿瘤逃逸的主要机制。并且，当嵌合抗原受体在T-细胞中表达时，有利地，它不与内在性T-细胞受体(TCR)α链及β链进行二聚化。
本发明的嵌合抗原受体包含细胞外结构域，所述细胞外结构域包含针对公知为B淋巴细胞抗原的CD19诱导的抗体或其抗原结合片段。在本发明中，针对上述CD19诱导的抗体或其抗原结合片段是所述抗CD19抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的一实例，本发明的嵌合抗原受体在细胞的表面表达。因此，可包含跨膜结构域。上述跨膜结构域可来源于本领域已知的天然来源或合成来源。例如，上述跨膜结构域可以为选自由T-细胞受体、CD27、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8(CD8α)、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154的α链、β链或ζ链组成的组中的蛋白质的跨膜结构域，但并不限定于此。
根据本发明的具体实例，上述跨膜结构域是由包含序列表中第177序列的核苷酸序列编码的CD8来源铰链/膜滚筒结构域。
在本发明中，术语“细胞内信号传导结构域”是指通过产生第二信使(2ndmessenger)或通过响应上述第二信使而充当效应子，从而通过将信息传递到细胞中以调节经规定的信号传导途径的细胞活性而起作用的蛋白质的功能性部分。
根据本发明的再一实例，本发明的嵌合抗原受体可包含细胞内信号传导结构域。上述细胞内信号传导结构域在激活免疫细胞及免疫反应的靶标(例如，CD19)结合上述细胞外结构域后，细胞内信号传导的原因。即，细胞内信号传导结构域成为激活免疫细胞的至少一种正常效应子(effector)功能的原因。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞毒性活性或辅助活性，包括包含细胞因子的分泌。作为用于嵌合抗原受体的信号转导结构域的优选例，可以是在抗原受体结合(engagement)后为启动信号转导协同起作用的T细胞受体及共受体的细胞质序列，以及具有相同功能能力的此类序列的任何衍生物或变体及任何合成序列。
根据本发明的具体实例，上述嵌合抗原受体的细胞内信号传导结构域是来源于CD3ζ链的结构域。
根据本发明的进一步具体实例，来源于上述CD3ζ链的结构域是由包含序列表中第180序列的碱基序列编码的CD3ζ结构域。
根据本发明的再一具体实例，上述嵌合抗原受体的细胞内信号传导结构域还包含选自由OX40(CD134)、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)及4-1BB(CD137)组成的组中的共刺激分子(costimulatory molecule)。除了所述结构域以外，上述细胞内信号传导结构域可得自或源自本领域已知的其他细胞内信号传导分子，并且可包含来源于细胞内信号传导结构域的分子的全部或其片段。
根据本发明的具体一实例，上述共刺激分子(结构域)可以是得自选自由CD28、OX40、4-1BB(CD137)和/或ICOS(CD278)组成的蛋白质的功能性信号传导结构域，更具体地，可以是CD28和/或OX40的功能性信号传导结构域。
根据本发明的再一实例，上述细胞内信号传导结构域是4-1BB、CD28、OX40、CD3ζ的功能性信号传导结构域或它们的组合。最为具体地，上述细胞内信号传导结构域是CD3ζ的功能性信号传导结构域。
根据本发明的进一步具体实例，包含上述CD137的共刺激分子是由包含序列表中第179序列的碱基序列编码的CD3ζ结构域。
本发明的嵌合抗原受体的跨膜结构域及细胞内信号传导结构域可以包含在选自所述具体的跨膜结构域及细胞内信号传导结构域中的一个以上的组合。例如，本发明的嵌合抗原受体可包含CD8α跨膜结构域及CD28及CD3ζ的细胞内信号传导结构域。
根据本发明的又一实施方式，本发明提供编码所述嵌合抗原受体的核酸分子。
在本发明中，所述抗CD19抗体或其抗原结合片段(多肽)和编码其的核酸分子，包含抗CD19抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体及编码其的核酸分子处于分离的状态。
在本发明中，术语“分离的”是指从自然/天然状态发生变形或去除。例如，自然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是部分或完全分离出的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质能够以实质上纯化的形态存在，或者，例如，可存在于宿主细胞等非天然环境中。
根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含所述核酸分子的重组载体。在本说明书中，针对于后述的“载体”，有关所述的抗体或其抗原结合片段或编码嵌合抗原受体的核酸分子共同适用。
在本说明书中，术语“载体”包括传递载体和表达载体。
在本说明书中，术语“传递载体”是指包含分离的核酸并且可以用于将分离的核酸转移到细胞中的物质的组成。包括线性多核苷酸、与离子或两性化合物连接的多核苷酸、质粒及病毒，但并不限定于此。进一步具体地，上述传递载体包括自主复制质粒或病毒。上述术语应解释为进一步包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒传递载体包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体及慢病毒载体，但并不限定于此。
在本说明书中，术语“表达载体”是指包含重组核苷酸的载体，所述重组核苷酸包含可操作地连接至待表达的核苷酸序列以在宿主细胞中表达目的基因的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用因子(cis-acting element)，用于表达的其他因素可以由宿主细胞或试管内表达系统提供。上述表达载体包括包含重组多核苷酸的质粒载体；粘粒载体；以及病毒载体，如噬菌体载体、腺病毒载体、慢病毒、逆转录病毒载体及腺相关病毒载体。根据本发明的具体实例，在本发明的载体中编码上述开关分子的核酸分子与载体启动子可操作地连接(operatively linked)。在本发明中，术语“可操作地连接”是指核酸表达调节序列(例：启动子、信号序列或转录调节因子结合位置的陈列)与其他核酸序列之间的功能性结合，由此上述调节序列调节上述另一序列的转录和/或翻译。
可通过本领域公知的各种方法来构建本发明的重组载体系统，有关其的具体方法公开在Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press(2001)中，此文献作为参照并入本文。
本发明的载体可以构建为用于克隆基因的载体、用于表达蛋白质的载体或者用于传递基因的载体。并且，可使用原核或真核细胞作为宿主来构建本发明的载体。
例如，本发明的载体为表达载体，在以真核细胞为宿主的情况下，可利用来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例：金属硫氨酸启动子、β-肌动蛋白启动子、人血红蛋白启动子及人肌肌酸启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例：腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒启动子、单纯疱疹病毒(HSV)的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、艾滋病病毒(HIV)的LTR启动子、莫洛尼病毒的启动子、埃博拉病毒(EBV)的启动子及呼吸道合胞病毒(RSV)的启动子)，它们通常具有聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。
根据本发明的一实例，在上述载体传递载体的情况下，可以为“逆转录病毒载体”。逆转录病毒为基因传递系统提供便利的平台。将选择用于基因传递的基因插入逆转录病毒载体中并可包装成逆转录病毒粒子内。然后，重组逆转录病毒可在体内或体外传递至所需宿主细胞。许多逆转录病毒载体是本领域已知的，在本发明的具体实例中，上述逆转录病毒载体是作为基于鼠白血病病毒(MLV)的逆转录病毒载体的pMT逆转录病毒载体，但并不限定于此。
根据本发明的另一实例，上述载体为慢病毒载体、腺病毒载体。
针对于本发明的载体，为了便于纯化由从其达的多肽或蛋白质，可与其他序列进行融合。融合的序列有如谷胱甘肽S-转移酶(美国法玛西亚(Pharmacia，USA))、麦芽糖结合蛋白(美国恩益碧(NEB，USA))、FLAG(美国IBI(IBI，USA))及6xHis(六组氨酸(hexahistidine)；美国Quiagen(Quiagen，USA))等。另一方面，本发明的表达载体可包括可选择的标记基因和/或报道基因作为用于评估本发明可的选择标记基因包括本领域常用的耐生素基因，例如，包括对氨苄西林、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素及四环素具有耐性基因。报道基因包括荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或绿色荧光蛋白基因。
将本发明的重组载体引入并表达到细胞中的方法是相关领域众所周知。通过本领域已知的方法，可以容易地将载体引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可通过物理，化学或生物学手段将载体传递到宿主细胞中。上述物理方式手段包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击(particle bombardment)、显微注射、电穿孔等。上述化学手段包括胶体分散系统，例如，大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，其包括水包油乳液、胶束(micelle)、混合胶束和脂质体。并且，上述生物手段包括使用脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)载体，例如所述慢病毒、逆转录病毒等。
根据本发明的又一实施方式，本发明提供表达所述嵌合抗原受体的细胞。
根据本发明的一实例，上述细胞是指作为免疫细胞负责引发和/或执行先天和/或获得性免疫应答的造血细胞。
根据本发明的上述免疫细胞可来源于干细胞。干细胞可以是成体干细胞、非人类胚胎干细胞、脐带血来源的干细胞、骨髓来源的干细胞、诱导性多能干细胞或造血干细胞。更具体地，上述免疫细胞可以为选自由树突状细胞、杀伤性树突状细胞、肥大细胞、NK-细胞、B-细胞或炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助性T淋巴组成的组中的免疫细胞，但并不限定于此。
在本发明中，表达上述嵌合抗原受体的细胞也被称为效应细胞(effector cell)。上述效应细胞是自体细胞或同种异体细胞的群体。即，上述效应细胞包括表达对本CD19的特异性的CAR的自体细胞或同种异体细胞的群体。
并且，根据本发明的一实例，上述效应细胞包括用包含编码CD19特异性CAR的核酸分子的载体转染或转导的细胞的群体。如上所述，上述转染或转导可以不受限制地通过本领域已知的各种方式来进行。
因此，根据本发明的具体实例本发明的效应细胞被传递到如T淋巴细胞或自然杀伤细胞，CD19特异性CAR编码核酸分子转录成mRNA，从上述mRNA中翻译出CD19特异性CAR多肽并表达在效应细胞的表面。
并且，根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含抗CD19抗体或其抗原结合片段的药剂学组合物，或包含用于表达上述嵌合抗原受体的细胞的药剂学组合物。
能够以包含所述本发明的抗CD19抗体或其抗原结合片段、或用于表达本发明发明的上述嵌合抗原受体的细胞；以及药剂学上可接受的载体的药剂学组合物的形态提供上述药剂学组合物。
在以药剂学组合物的形态给药表达本发明的嵌合抗原受体的细胞的情况下，上述细胞可以是待给药的对象(subject)的同种动物来源或自体来源的细胞。
本发明的药剂学组合物可包含表达本发明的嵌合抗原受体的细胞的群体。
由于本发明的药剂学组合物使用所述本发明的抗CD19抗体或其抗原结合片段、或表达本发明发明的嵌合抗原受体的细胞作为有效成分，因此省略了两者之间的共同的内容的描述以避免本说明书的过度复杂。
如下述实施例证明，在同时培养包含本发明的CD19_8.1抗体片段的嵌合抗原受体T细胞(CD19_8.1CAR-T cell)和表达CD19抗原的细胞株(RaJi)的情况下，通过识别CD19阳性细胞株(RaJi)表面的CD19抗原，诱导嵌合抗原受体细胞的活化，因此预期可有效地用于治疗与CD19抗原相关的疾病。
可通过本发明的药剂学组合物预防或治疗的疾病为与表达CD19的细胞有关的人及哺乳动物的疾病，包括选自由慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、前淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、常见急性淋巴细胞白血病、无急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、脾淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤组成的组中的B细胞恶性肿瘤。
并且，上述疾病包括与不适当或增加的B细胞数量和/或活化有短的自身免疫疾病及炎性疾病。上述自身免疫疾病及炎症性疾病的例，包括多发性硬化症、类风湿关节炎及系统性红斑狼疮。
包含在本发明的药剂学组合物中的药剂学上可接受的载体为制剂时常用，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并不限定于此。除了上述成分以外，本发明的药剂学组合物还可包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、保鲜剂等。合适的药剂学上可接受的载体剂制剂在《雷明顿药物科学》(第19版，1995)(Remington's PharmaceuticalSciences(19th ed.，1995))中有详细描述。
本发明的药剂学组合物可以口服或胃肠外给药，例如，静脉内注入、皮下注入、肌内注入、腹腔注入、胸骨内注入、肿瘤内注入、局部给药、鼻内给药、肺内给药及直肠内给药等。
本发明的药剂学组合物合适剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应敏感性等饮食而不同，通常，熟练的医生可以轻松确定并开出对所需治疗或预防有效的剂量。根据本发明的优选实例，本发明的药剂学组合物的日剂量为0.0001～100mg/kg。在本说明书中，术语“药剂学有效量”是指足以预防或治疗所述疾病的量。
在本说明书中，术语“预防”是指疾病或病症的防止或保护性治疗。在本说明书中，术语“治疗”是指疾病状态的减少、抑制、镇静或消除。
针对于本发明的药剂学组合物，根据本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易地实施的方法，利用药剂学上可接受的载体和/或赋形剂来进行配制，将其制备成单位剂量形态或装入多剂量容器来制备。此时，剂型还可以是油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳液形态或浸膏剂、散剂、栓剂、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，还可包括分散剂或稳定剂。
除了表达所述嵌合抗原受体的细胞以外，本发明的药剂学组合物还包含药剂学活性药剂或药物，例如，化学治疗剂，如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、阿霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春花碱、长春新碱等；靶治疗剂，贝伐单抗(bevacizumab)、奥拉帕尼(olaparib)等剂；或者，免疫检查点抑制剂，如纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)，或者可以与它们联用。
根据本发明的又一实施方式，本发明提供与表达CD19细胞有关的疾病、自身免疫性疾病或炎症性疾病的治疗方法，包括向需要治疗的对象给药包含有关所述CD19的抗体或其抗原结合片段的组合物；或者包含用于表达上述CD19特异性嵌合抗原受体的效应细胞的组合物的步骤。
作为本发明的治疗方法的对象疾病的与表达CD19的细胞有关的疾病、自身免疫性疾病或炎症性疾病定义为与上述药学组合的待治疗疾病有关。
在本发明的一实例中，上述对象为哺乳动物或人。
本发明的癌或炎性疾病的治疗方法是共同使用表达所述抗体或抗原结合片段；或合抗原受体的效应细胞作为有效成分的方法，因此，省略了重复内容的描述，以避免本说明书的过度复杂性。
发明的效果
本发明的抗体是特异性结合在癌细胞(尤其，血液癌)高表达的CD19的抗体，与现有的CD19靶抗体的互补决定区序列相比，同源性非常低，其序列具有独特性，用于表达包含本发明的抗CD19抗体或抗原结合片段的嵌合抗原受体的细胞通过与表达CD19的阳性细胞株进行反应来诱导免疫细胞活性，因此可有效地用作CAR-免疫细胞治疗剂。
附图说明
图1为示出通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析CD19_8.1抗体片段与CD19-ECDFc蛋白结合的结果的图。
图2为示出为了通过变更第2重链与第1轻链互补决定区部位来确保增强亲和度的抗体，通过变更的酶联免疫吸附测定法分析对CD19-ECDFc蛋白结合的结果。
图3为示出通过酶联免疫吸附测定法分析亲和度增强的10种抗体与CD19-ECDFc蛋白结合的结果的图。
图4为示出通过流细胞分析仪分析亲和度增强的3种抗体于作为CD19阳性细胞株的Raji细胞株的结合能力的结果的图。
图5为示出通过利用特殊蛋白检测方法分析连接有开发的抗体片段的嵌合抗原受体的表达的结果的图。
图6为示出通过干扰素γ的分泌量来分析表达连接有开发的抗体片段嵌合抗原受体的细胞毒性T细胞的活性的结果的图。
图7为示出通过酶联免疫吸附测定法分析亲和度增强的8种抗体与CD19-ECDFc蛋白结合的结果的图。
图8为示出通过流细胞分析仪分析作为CD19阳性细胞株的Raji细胞株对于增强亲和度的3种抗体的结合能力的结果的图。
图9为示出通过干扰素γ的分泌量来分析表达CD19_8.1_3C12嵌合抗原受体的细胞毒性T细胞的活性的结果的图。作为靶向细胞使用了CD19阳性细胞的RaJi和CD19阴性细胞的Jurkat，通过以1：5的比例共培养细胞毒性T细胞来测量干扰素γ。
图10为示出在共培养作为CD19阳性细胞株的RaJi-Luc细胞和细胞毒性T细胞后，通过测量存活的RaJi-Luc细胞的萤光素酶(luciferase)来确认细胞毒性的结果的图。
具体实施方式
下面，通过实施例进一步详细说明本发明。这些实施例仅用于更详细地说明，并且对于本领域技术人员显而易见的是，根据本发明要旨，发明的范围不受这些实施例限制。
实施例
实施例1：有关CD19的抗体的开发
为了开发抗体，利用动物细胞生产人CD19蛋白的细胞外结构域(ECD，Extracellular domain)后，将其用作抗原。将细胞外结构的C-末端结合有人免疫球蛋白G1(IgG1)铰链及Fc位点(CH2-CH3)的形态的脱氧核糖核酸(DNA)克隆在pCEP4载体(Invitrogen，美国)。随后，将克隆的上述载体瞬时转化到FreeStyleTM293F(Invitrogen，美国)细胞中，从而获得CD19-ECDFc融合蛋白。通过使用OPLA库与上述CD19-ECDFc融合蛋白进行噬菌体生物淘选(bio-panning)。抗体库使用VCSM13辅助噬菌体(helper phage)以噬菌体形式获得抗体库并用于淘选，最初与抗原结合的库噬菌体的数量为1013。淘选轮(panninground)进行至4轮，作为可以选择性地亲和度高的噬菌体淘选策略，应用随着淘选轮数的增加，减少抗原量并增加清洗次数的方法。针对于与靶抗原结合的噬菌体数量，使用ER2537大肠杆菌(E.coli)如下滴定。使用pH2.2甘氨酸缓冲液洗脱在每轮生物淘选中获得的结合噬菌体(binder phage)使用新鲜的SB培养液将在SB培养液(超级肉汤培养基)中培养过夜的ER2537稀释至1/200来进行传代。接着，在37℃的温度下进一步培养3小时以使其达到原噬菌体(log phage)。将100μl的新鲜ER2537和10μl的稀释的噬菌体混合在1.5ml的试管后，培养30分钟，然后铺在氨苄西林(ampicillin)LB板(溶菌性肉汤琼脂平板)上。接着，通过应用在37℃的温度下培养过夜生成的菌落(colony)数量和稀释因子来测量噬菌体数量。用ER2537大肠杆菌感染在每轮生物淘选中获得的结合噬菌体并保持菌落形态的状态下，以通过酶联免疫吸附测定方法确认是否与各个抗原结合。将通过感染噬菌体获得的菌落接种到SB培养液后，培养至OD600为0.5为止。接着，加入0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)并在30℃的温度下震荡(shaking)培养，以过表达抗体片段蛋白。利用硼酸盐缓冲液(BBS)纯化单链可变区。在涂敷有CD19-ECDFc蛋白的板和作为CD19过表达细胞株的RaJi中处理纯化的抗体片段。处理二抗后，用3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)进行显色反应，并使用酶标仪(Victor X3PerkinElmer)测量OD450值(图1)。针对于所选的特异性结合在CD19的筛选抗体克隆，利用噬菌粒(phagemid)质粒与公知的引物组(Phage display：a laboratorymanual，Carlos Barbas III，et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press)通过测序(sequencing)分析确认可变位点的碱基序列。由此，在所选的抗体中筛选与CD19的结合能力优秀的CD19_8.1，所选的CD19_8.1抗体的可变位点的碱基序列如表1所示。
表1：CD19_8.1抗体的互补决定区(complementarity determining region)的氨基酸序列
为了定量确认所选的CD19_8.1抗体的结合，使用动物细胞生产了抗体片段。将抗体片段的C-末端结合有人卡帕轻链位点的形态的脱氧核糖核酸克隆在pCEP4载体。接着，将上述克隆的载体瞬时转化至FreeStyleTM293F，以获得卡帕轻链融合蛋白形态的抗体。为了测量所选的抗体的结合能力，利用CD19-ECDFc进行酶联免疫吸附测定法。将涂敷有CD19-ECDFc蛋白的板上以浓度依赖性方式处理纯化的抗体片段，处理二抗后，用3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)进行显色反应，并使用酶标仪(Victor X3PerkinElmer)测量OD450值(图1)。
实施例2.增强对所开发的抗体片段的亲和度
为了获得对CD19的结合力优于CD19_8.1的抗体片段，通过组合重链和轻链库来制备新的子库。为了生成子库，使用了含有NNK简并密码子(degenerate codons)的寡核苷酸。将CD19_8.1抗体片段用作模板脱氧核糖核酸(template DNA)。通过聚合酶链式反应(PCR)将随机密码子引入到除HCDR3之外的5个互补决定区(CDR)。扩增的抗体片段用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)(美国，QIAGEN)纯化。用sfiⅠ限制酶切割抗体片段及pComb3XSS载体，连接后通过转染到ER2537来制备噬菌体库。基于制备的噬菌体库，并以与实施例1相同的方法筛选抗体。
为了在所选抗体中筛选亲和度更高的抗体，利用涂敷有CD19板进行了酶联免疫吸附测定法。当进行酶联免疫吸附测定法时，结合抗体片段后，通过在37℃的温度下进一步培养2小时来筛选亲和度提高的抗体。结束培养进行洗涤后，通过进行二抗反应及3，3'，5，5'-四甲基联苯胺显色反应，最终筛选了亲和度增强的抗体。进行酶联免疫吸附测定法的结果，确认到第二重链互补决定区与第一轻链互补决定区对亲和度起着重要的作用。由此，通过制备变更第二重链互补决定区与第一轻链位点的子库，以与上述相同的方法筛选亲和度提高的抗体(图2)。通过碱基分析确认在筛选的菌落中表达的抗体的序列。作为筛选的抗体的可变位点的第二重链互补决定区与第一轻链互补决定区位点的碱基序列如表2所示。
表2：具有增强的亲和度的抗体的第二重链重链互补决定区与第一轻链互补决定去位点的氨基酸序列
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为了对在所选的抗体中亲和度提高的10种抗体进行定量实验，以与上述实施例2相同的方法生产了抗体片段。其结果，针对亲和度提高的抗体，获得卡帕轻链融合蛋白形态的抗体。为了测量所选的抗体的结合能力，利用CD19-ECDFc进行了酶联免疫吸附测定法。在涂敷有CD19-ECDFc蛋白的板上以浓度依赖性方式处理纯化的抗体片段，并处理二抗后用3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)进行显色反应，并使用酶标仪(Victor X3PerkinElmer)测量OD450值(图3)。利用测量OD450值，通过Graphpad Prism分析了对CD19-ECDFc的结合能力(表3)。
表3：亲和度增强的10种抗体片段与CD19-ECDFc的结合能力(EC50)
CD19_8.1 A12 C2 D7 D10 E3 E12 H10 2F1 T3C1 T3H9
EC50(nM) 21.04 2.37 5.81 3.20 2.48 1.87 2.56 3.31 1.60 2.40 2.32
在所选的抗体中，确认对CD19-ECDFc的结合能力优秀的E3、2F1抗体和具有相对较低结合能力的C2抗体与作为CD19阳性细胞株的RaJi细胞株的结合能力。将纯化的抗体片段以浓度依赖性方式处理于作为CD19阳性细胞株的RaJi，并利用抗人IgG-FITC染色与作为CD19阳性细胞株的RaJi结合的抗体片段。针对于与RaJi细胞株结合的抗体片段的分析，通过流细胞分析仪测量(图4)，用Graphpad Prism进行结合能力分析(表4)。从而获得了结合能力比CD19_8.1更高的抗体。
表4：亲和度增强的3种抗体与RaJi细胞株中的结合能力(EC50)
CD19_8.1 C2 E3 2F1
EC50(nM) 57.4 61.2 26.1 10.5
实施例3：包含连接有开发的抗体片段的嵌合抗原受体的慢病毒的制备
利用已开发抗体CD19_8.1开发了嵌合抗原受体。对CD8前导序列、单链可变区(scFv)形态的CD19_8.1、CD8铰链区、CD137跨膜区及CD3ζ的细胞质区进行密码子优化后，通过SpeI/PacI来向pLenti6-V5/DEST慢病毒载体(Invitrogen，美国)切割及连接嵌合抗原受体。通过碱基序列分析确认所制备的构建体(序列表中第181序列)。
将所制备的慢病毒构建体与pCMV-dR8.91一起转导到Lenti-X 293T(Takara BioInc，日本)细胞株中，所述pCMV-dR8.91为包含编码作为病毒壳体蛋白的疱性口炎印第安纳病毒G蛋白(VSV-G，vesicular stomatitis indiana virus G protein)的核酸和gag、pol及rev基因的质粒。使用脂质体2000(Invitrogen，美国)，根据制造商的方案进行转导。72小时后，通过圆心分离型过滤装置(millipore，美国)将含有慢病毒的培养液浓缩至10倍来进行存储。
实施例4.表面呈现包含连接有开发的抗体片段的嵌合抗原受体的胞毒性T细胞的制备
利用在实施例3中制备的病毒，制备了在表面呈现连接有CD19_8.1抗体片段的嵌合抗原受体的细胞毒性T细胞。
首先，分离人的幼稚(naive)T细胞，用DynabeadsTM人类T活化剂CD3/CD28(美国赛默飞世尔科学(Thermofisher scientific))刺激24小时，将包含聚乙烯(美国西格玛奥德里奇)的慢病毒添加到上述细胞中培养24小时并进行转导。然后，将包含白细胞介素-2(美国Gibco)的培养基在5％的CO2、37℃的条件下进行培养。然后，利用构成嵌合抗原受体的CD3z抗体(美国BD)和蛋白质印迹(Western blot)方法分析是否转导含CD19_8.1片段的嵌合抗原受体(图5)。表面呈现有包含这样制备的CD19_8.1抗体片段的嵌合抗原受体的T细胞在制备后24小时内用于后续实验中。
实施例5.表面呈现包含连接有开发的抗体片段的嵌合抗原受体的胞毒性T细胞的活性确认
使用在实施例3中制备的表面呈现嵌合抗原受体的细胞毒性T细胞，使上述T细胞识别细胞表面的CD19，从而确认是否诱导嵌合抗原受体细胞的活化。具体地，在实验中，将作为CD19阳性细胞株的RaJi与作为CD19阴性细胞株的JurkatE6.1细胞株在添加10％的胎牛血清及1％的青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中培养并使用。首先，将CD19阳性或阴性细胞株以每孔3×104的数量分注于圆底96孔板中。去除培养上清液后，添加按照每孔处理比率制备的嵌合抗原受体T细胞，并在5％的CO2及37℃的条件下培养24小时。随后使用酶联免疫吸附测定试剂盒根据制造商的方案测量分泌到培养基的干扰素γ的量，结果如图6所示。在这种情况下，作为对照组，使用向未培养细胞的板中添加嵌合抗原受体T细胞的组(Effector T cell only)和向培养细胞板中不添加任何物质的组(Target cell only)。
如图6所示，从中确认连接有CD19_8.1抗体片段的嵌合抗原受体T细胞和CD19阳性细胞株中干扰素γ的分泌量显著增加。
实施例6.对所开发的抗体片段的亲和度增强抗体的开发
基于CD19_8.1_2F1，通过组合第二重链、第三重链与第一轻链库来制备新的子库。为了生成子库，使用了含有NNK简并密码子的寡核苷酸，此时，使CD19_8.1_2F1的序列保持70％以上。CD19_8.1_2F1抗体片段用作模板脱氧核糖核酸(template DNA)。通过聚合酶链式反应(PCR)将随机密码子引入3个互补决定区中。扩增的抗体片段用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)(美国QIAGEN)纯化。用sfiⅠ限制酶切割抗体片段及pComb3XSS载体，连接后通过转染到ER2537来制备噬菌体库。基于制备的噬菌体库，并以与实施例1相同的方法筛选抗体。已开发的抗体的重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列如表5所示。
表5：从基于2F1子库中得出的抗体的重链互补决定区和轻链互补决定区位点的氨基酸序列
利用FreeStyleTM293F细胞株将所开发的抗体片段生产为卡帕轻链融合蛋白形态，以与实施例2相同的方法确认与CD19-ECD-Fc的结合能力(图7)，并通过Graphpad Prism分析结合能力(表6)。
表6：亲和度增强的抗体与CD19-ECD-Fc的结合能力(EC50)
抗体 EC50(nM)
CD19_8.1_3C12 2.99
CD19_8.1_6F10 14.22
CD19_8.1_7D2 7.68
CD19_8.1_7H11 10.49
CD19_8.1_8E8 9.75
CD19_8.1_10D3 6.98
CD19_8.1_10E5 7.01
CD19_8.1_10H4 13.88
通过流细胞分析法确认亲和度增强的抗体片段与作为CD19阳性细胞株的RaJi细胞株的结合能力。将纯化的抗体片段以浓度依赖性方式处理于作为CD19阳性细胞株的RaJi，并利用抗人卡帕轻链-FITC(BD bioscience，美国)染色结合的抗体片段。在与RaJi细胞株结合的抗体片段中，有关细胞结合能力优秀的3种抗体片段分析，通过流细胞分析仪来测量(图8)，并用Graphpad Prism进行结合能力分析(表7)。从而获得了与CD19_8.1相比结合能力提高的抗体。
表7：亲和度增强的3种抗体片段与RaJi细胞株的结合能力(EC50)
抗体 EC50(nM)
CD19_8.1_3C12 3.89
CD19_8.1_6F10 22.21
CD19_8.1_7D2 10.02
实施例7：包含连接有亲和度增强的抗体片段连接的嵌合抗原受体的慢病毒的制备
在所开发的抗体中，使用亲和度增强的CD19_8.1_3C12来开发了嵌合抗原受体。针对于嵌合抗原受体，使用GeneOptimizer(英杰)算法对CD8前导序列、单链可变区(scFv)形态的开发的抗体、CD8铰链及跨膜区、CD137细胞质区及CD3ζ的细胞质区进行密码子优化后，用SpeI/PacI切割并连接在启动子变为EF-1α的pLenti6.3/V5-TOPO慢病毒载体(美国英杰)。通过碱基序列分析确认所制备的构建体。
将所制备的慢病毒构建体与pCMV-dR8.91一起转导到Lenti-X 293T(Takara BioInc，日本)细胞株中，所述pCMV-dR8.91为包含编码作为病毒壳体蛋白的疱性口炎印第安纳病毒G蛋白(VSV-G，vesicular stomatitis indiana virus G protein)的核酸和gag、pol及rev基因的质粒。使用脂质体2000(Invitrogen，美国)，根据制造商的方案进行转导。将含有慢病毒的培养液使用Lenti-X 293T浓缩器(Takara Bio Inc.日本)来进行浓缩并存储。
实施例8.表面呈现有包含具有亲和度增强的抗体片段的嵌合抗原受体的细胞毒性T细胞的制备及活性确认
利用在实施例7中制备的慢病毒，制备了表面呈现有包含CD19_8.1_3C12抗体片段(scFv)的嵌合抗原受体的细胞毒性T细胞。由此，使用表面呈现有嵌合抗原受体的细胞毒性T细胞，上述T细胞识别细胞表面的CD19，从而确认是否保持嵌合抗原受体细胞的活化。
具体地，在作为CD19阳性细胞株的RaJi中引入慢病毒引入以表达绿色荧光蛋白-荧光素酶(GFP-Luciferase)，从而构建作为基因引入细胞株的RaJi-Luc细胞株并用于实验。首先，将RaJi-Luc细胞株以每孔3×104的数量分注于圆底96孔板中。向分注有RaJi-Luc细胞株的板中添加按照每孔处理比率制备的嵌合抗原受体T细胞，并在5％的CO2及37℃的条件下培养24小时。进行培养后，使用酶联免疫吸附测定试剂盒根据制造商的方案测量分泌到培养基的干扰素γ的量，通过荧光素酶(luciferase)测量(美国Promega Bio-Glo荧光素酶测量系统)来确认细胞毒性T细胞的毒性效果。
如图9所示，在以1：5的比率处理包含本发明的抗体片段的细胞毒性T细胞和RaJi-Luc的实验组中，干扰素γ的分泌显著增加。针对于包含本发明的抗体片段的嵌合抗原受体的细胞毒性效果，在培养细胞毒性T细胞和RaJi-Luc后，用3X裂解缓冲液((Lysis buffer)(75mM的Tris(pH 8.0)、30％的甘油(glycerol)、3％的Triton X100))破碎剩余的RaJi-Luc细胞株，通过将溶解出的荧光素酶(luciferase)与基体(substrate)产生反应来进行确认。以来自使用仅培养Raji-Luc细胞的孔(well)的信号(signal)为100％，确定裂解率。在包含本发明的抗体片段的嵌合抗原受体T细胞中，可根据处理比例确认出现的细胞毒性效果(图10)。
序列表
<110> AbClon Inc.
<120> 特异性识别恶性B细胞的抗体或其抗原结合片段、包含其的嵌合抗原受体及其用途
<130> PP180059
<150> KR 10-2017-0178559
<151> 2017-12-22
<160> 200
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19_8.1 抗体的CDRH1的氨基酸序列
<400> 1
Asp Tyr Tyr Met Ser
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19_8.1 抗体的CDRH2的氨基酸序列
<400> 2
Gly Ile Tyr Tyr Asp Asp Ser Ser Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19_8.1 抗体的CDRH3的氨基酸序列
<400> 3
Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr Ala Met
1 5 10 15
Asp Val
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19_8.1 抗体的CDRL1的氨基酸序列
<400> 4
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19_8.1 抗体的CDRL2的氨基酸序列
<400> 5
Asp Asp Asn His Arg Pro Ser
1 5
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19_8.1 抗体的CDRL3的氨基酸序列
<400> 6
Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr Val
1 5 10
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 2B1的CDRH2的氨基酸序列
<400> 7
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ala Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 B12的CDRH2的氨基酸序列
<400> 8
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ala Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 T2H3的CDRH2的氨基酸序列
<400> 9
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ala Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 T3C1的CDRH2的氨基酸序列
<400> 10
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ala Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 D10的CDRH2的氨基酸序列
<400> 11
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ala Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 F6的CDRH2的氨基酸序列
<400> 12
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ala Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 B2的CDRH2的氨基酸序列
<400> 13
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 B6的CDRH2的氨基酸序列
<400> 14
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 2F1的CDRH2的氨基酸序列
<400> 15
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ser Gln Gly Trp Ser Ser Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 C8的CDRH2的氨基酸序列
<400> 16
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Gln Leu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 D4的CDRH2的氨基酸序列
<400> 17
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ser Gln Ser Met Ala Gly Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 B5的CDRH2的氨基酸序列
<400> 18
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ser Gln Gly Met Thr Asn Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 G4的CDRH2的氨基酸序列
<400> 19
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ser Gln Thr Leu Leu Pro Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 A7的CDRH2的氨基酸序列
<400> 20
Gly Ile Tyr Tyr Asp Ala Ser Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 D12的CDRH2的氨基酸序列
<400> 21
Gly Ile Tyr Tyr Asp Ala Ser Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 E2的CDRH2的氨基酸序列
<400> 22
Gly Ile Tyr Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 T2A1的CDRH2的氨基酸序列
<400> 23
Gly Ile Tyr Tyr Asp Ala Ser Val Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 T3H9的CDRH2的氨基酸序列
<400> 24
Gly Ile Tyr Tyr Asp Ala Ser Ala Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 2G1的CDRH2的氨基酸序列
<400> 25
Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Thr Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 C4的CDRH2的氨基酸序列
<400> 26
Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Met Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 C5的CDRH2的氨基酸序列
<400> 27
Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Met Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 D1的CDRH2的氨基酸序列
<400> 28
Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Ala Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 D2的CDRH2的氨基酸序列
<400> 29
Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Thr Asp Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 E1的CDRH2的氨基酸序列
<400> 30
Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 F3的CDRH2的氨基酸序列
<400> 31
Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Ala Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 T2C1的CDRH2的氨基酸序列
<400> 32
Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Gln Asp Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 T2H1的CDRH2的氨基酸序列
<400> 33
Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Gln Asp Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 T2H5的CDRH2的氨基酸序列
<400> 34
Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Ala Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 T3B8的CDRH2的氨基酸序列
<400> 35
Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Val Met Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 A12的CDRH2的氨基酸序列
<400> 36
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Thr Val Leu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 C2的CDRH2的氨基酸序列
<400> 37
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Thr Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 D7的CDRH2的氨基酸序列
<400> 38
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Thr Ala Phe Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 39
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 E3的CDRH2的氨基酸序列
<400> 39
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Thr Ala Met Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 40
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 H10的CDRH2的氨基酸序列
<400> 40
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Thr Asn Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 41
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 T3F5的CDRH2的氨基酸序列
<400> 41
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Thr Ala Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 A10的CDRH2的氨基酸序列
<400> 42
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ile Tyr Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 T3H1的CDRH2的氨基酸序列
<400> 43
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ala Val Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 B1的CDRH2的氨基酸序列
<400> 44
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Asp Val Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 B7的CDRH2的氨基酸序列
<400> 45
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Phe Ala Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 D8的CDRH2的氨基酸序列
<400> 46
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Leu His Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 E12的CDRH2的氨基酸序列
<400> 47
Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Phe Val Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 T2A12的CDRH2的氨基酸序列
<400> 48
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly His Gln Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 2B1的CDRL1的氨基酸序列
<400> 49
Val Gly Gly Val Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 50
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 B12的CDRL1的氨基酸序列
<400> 50
Ala Gly His Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 51
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 T2H3的CDRL1的氨基酸序列
<400> 51
Gly Gly Gly Ile Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 52
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 T3C1的CDRL1的氨基酸序列
<400> 52
Ser Gly Gly Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 53
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 D10的CDRL1的氨基酸序列
<400> 53
Trp Gly Asp Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 54
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 F6的CDRL1的氨基酸序列
<400> 54
Trp Gly Leu Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 55
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 B2的CDRL1的氨基酸序列
<400> 55
Ala Gly Gly Val Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 56
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 B6的CDRL1的氨基酸序列
<400> 56
Asn Gly Thr Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 57
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 2F1的CDRL1的氨基酸序列
<400> 57
Tyr Gly Gln Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 58
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 C8的CDRL1的氨基酸序列
<400> 58
Lys Gly Gly Met Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 59
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 D4的CDRL1的氨基酸序列
<400> 59
Thr Gly Gly Val Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 60
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 B5的CDRL1的氨基酸序列
<400> 60
His Gly Thr Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 61
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 G4的CDRL1的氨基酸序列
<400> 61
Val Gly Lys Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 62
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 A7的CDRL1的氨基酸序列
<400> 62
Thr Gly Asn Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 63
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 D12的CDRL1的氨基酸序列
<400> 63
Arg Gly Ser Ala Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 64
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 E2的CDRL1的氨基酸序列
<400> 64
Lys Gly Met Ile Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 65
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 T2A1的CDRL1的氨基酸序列
<400> 65
Ala Gly Lys Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 66
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 T3H9的CDRL1的氨基酸序列
<400> 66
Ser Gly Met Leu Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 67
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 2G1的CDRL1的氨基酸序列
<400> 67
Lys Gly Ser Phe Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 68
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 C4的CDRL1的氨基酸序列
<400> 68
Gly Gly Gln Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 69
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 C5的CDRL1的氨基酸序列
<400> 69
Lys Gly Gly Met Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 70
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 D1的CDRL1的氨基酸序列
<400> 70
Ser Gly Gly Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 71
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 D2的CDRL1的氨基酸序列
<400> 71
Gln Gly Gln Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 72
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 E1的CDRL1的氨基酸序列
<400> 72
Thr Gly Asn Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 73
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 F3的CDRL1的氨基酸序列
<400> 73
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Ala Pro Leu Tyr
1 5 10
<210> 74
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 T2C1的CDRL1的氨基酸序列
<400> 74
Arg Gly Gly Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 75
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 T2H1的CDRL1的氨基酸序列
<400> 75
Gln Gly Gly Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 76
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 T2H5的CDRL1的氨基酸序列
<400> 76
Ser Gly Asn Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 77
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 T3B8的CDRL1的氨基酸序列
<400> 77
Glu Gly Ser Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 78
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 A12的CDRL1的氨基酸序列
<400> 78
Gln Gly Gly Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 79
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 C2的CDRL1的氨基酸序列
<400> 79
Thr Gly Gly Leu Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 80
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 D7的CDRL1的氨基酸序列
<400> 80
Glu Gly Gln Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 81
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 E3的CDRL1的氨基酸序列
<400> 81
Ser Gly Gly Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 82
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 H10的CDRL1的氨基酸序列
<400> 82
Leu Gly Gly Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 83
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 T3F5的CDRL1的氨基酸序列
<400> 83
His Gly Gln Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 84
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 A10的CDRL1的氨基酸序列
<400> 84
Ser Gly Asp Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 85
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 T3H1的CDRL1的氨基酸序列
<400> 85
Asp Gly Gly Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 86
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 B1的CDRL1的氨基酸序列
<400> 86
Val Gly Ser Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 87
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 B7的CDRL1的氨基酸序列
<400> 87
Arg Gly Thr Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 88
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 D8的CDRL1的氨基酸序列
<400> 88
Val Gly Asn Leu Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 89
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 E12的CDRL1的氨基酸序列
<400> 89
Ala Gly Ser Ala Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 90
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的克隆 T2A12的CDRL1的氨基酸序列
<400> 90
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Ala Pro Thr Tyr
1 5 10
<210> 91
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19_8.1抗体的重链可变区的氨基酸序列
<400> 91
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Asp Ser Ser Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 92
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的2B1的重链可变区的氨基酸序列
<400> 92
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ala Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 93
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的B12的重链可变区的氨基酸序列
<400> 93
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ala Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 94
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的T2H3的重链可变区的氨基酸序列
<400> 94
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ala Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 95
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的T3C1的重链可变区的氨基酸序列
<400> 95
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ala Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 96
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的D10的重链可变区的氨基酸序列
<400> 96
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ala Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 97
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的F6的重链可变区的氨基酸序列
<400> 97
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ala Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 98
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的B2的重链可变区的氨基酸序列
<400> 98
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 99
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的B6的重链可变区的氨基酸序列
<400> 99
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 100
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的2F1的重链可变区的氨基酸序列
<400> 100
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ser Gln Gly Trp Ser Ser Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 101
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的C8的重链可变区的氨基酸序列
<400> 101
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Gln Leu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 102
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的D4的重链可变区的氨基酸序列
<400> 102
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ser Gln Ser Met Ala Gly Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 103
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的B5的重链可变区的氨基酸序列
<400> 103
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ser Gln Gly Met Thr Asn Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 104
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的G4的重链可变区的氨基酸序列
<400> 104
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ser Gln Thr Leu Leu Pro Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
<210> 105
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的A7的重链可变区的氨基酸序列
<400> 105
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Ala Ser Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 106
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的D12的重链可变区的氨基酸序列
<400> 106
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Ala Ser Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 107
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的E2的重链可变区的氨基酸序列
<400> 107
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 108
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的T2A1的重链可变区的氨基酸序列
<400> 108
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Ala Ser Val Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 109
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的T3H9的重链可变区的氨基酸序列
<400> 109
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Ala Ser Ala Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 110
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的2G1的重链可变区的氨基酸序列
<400> 110
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Thr Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 111
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的C4的重链可变区的氨基酸序列
<400> 111
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Met Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 112
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的C5的重链可变区的氨基酸序列
<400> 112
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Met Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 113
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的D1的重链可变区的氨基酸序列
<400> 113
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Ala Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 114
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的D2的重链可变区的氨基酸序列
<400> 114
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Thr Asp Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 115
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的E1的重链可变区的氨基酸序列
<400> 115
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 116
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的F3的重链可变区的氨基酸序列
<400> 116
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Ala Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 117
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的T2C1的重链可变区的氨基酸序列
<400> 117
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Gln Asp Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 118
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的T2H1的重链可变区的氨基酸序列
<400> 118
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Gln Asp Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 119
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的T2H5的重链可变区的氨基酸序列
<400> 119
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Ala Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 120
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的T3B8的重链可变区的氨基酸序列
<400> 120
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Val Met Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 121
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的A12的重链可变区的氨基酸序列
<400> 121
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Thr Val Leu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 122
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的C2的重链可变区的氨基酸序列
<400> 122
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Thr Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 123
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的D7的重链可变区的氨基酸序列
<400> 123
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Thr Ala Phe Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 124
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的E3的重链可变区的氨基酸序列
<400> 124
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Thr Ala Met Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 125
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的H10的重链可变区的氨基酸序列
<400> 125
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 126
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的T3F5的重链可变区的氨基酸序列
<400> 126
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Thr Ala Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 127
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的A10的重链可变区的氨基酸序列
<400> 127
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ile Tyr Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 128
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的T3H1的重链可变区的氨基酸序列
<400> 128
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ala Val Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 129
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的B1的重链可变区的氨基酸序列
<400> 129
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Asp Val Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 130
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的B7的重链可变区的氨基酸序列
<400> 130
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Phe Ala Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 131
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的D8的重链可变区的氨基酸序列
<400> 131
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Leu His Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 132
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的E12的重链可变区的氨基酸序列
<400> 132
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Phe Val Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 133
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的T2A12的重链可变区的氨基酸序列
<400> 133
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly His Gln Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 134
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19_8.1抗体的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 134
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 135
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的2B1的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 135
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Val Gly Gly Val Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 136
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的B12的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 136
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ala Gly His Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 137
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的T2H3的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 137
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Gly Gly Gly Ile Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 138
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的T3C1的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 138
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 139
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的D10的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 139
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Trp Gly Asp Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 140
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的F6的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 140
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Trp Gly Leu Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 141
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的B2的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 141
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ala Gly Gly Val Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 142
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的B6的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 142
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Asn Gly Thr Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 143
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的2F1的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 143
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Tyr Gly Gln Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 144
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的C8的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 144
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Gly Gly Met Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 145
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的D4的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 145
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Gly Val Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 146
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的B5的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 146
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys His Gly Thr Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 147
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的G4的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 147
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Val Gly Lys Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 148
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的A7的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 148
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Asn Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 149
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的D12的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 149
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Gly Ser Ala Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 150
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的E2的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 150
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Gly Met Ile Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 151
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的T2A1的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 151
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ala Gly Lys Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 152
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的T3H9的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 152
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Met Leu Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 153
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的2G1的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 153
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Gly Ser Phe Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 154
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的C4的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 154
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Gly Gly Gln Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 155
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的C5的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 155
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Gly Gly Met Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 156
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的D1的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 156
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 157
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的D2的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 157
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Gln Gly Gln Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 158
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的E1的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 158
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Asn Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 159
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的F3的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 159
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Ala
20 25 30
Pro Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 160
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的T2C1的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 160
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Gly Gly Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 161
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的T2H1的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 161
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Gln Gly Gly Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 162
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的T2H5的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 162
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Asn Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 163
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的T3B8的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 163
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Glu Gly Ser Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 164
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的A12的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 164
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Gln Gly Gly Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 165
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的C2的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 165
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Gly Leu Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 166
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的D7的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 166
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Glu Gly Gln Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 167
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的E3的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 167
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 168
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的H10的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 168
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Leu Gly Gly Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 169
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的T3F5的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 169
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys His Gly Gln Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 170
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的A10的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 170
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Asp Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 171
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的T3H1的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 171
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Asp Gly Gly Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 172
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的B1的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 172
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Val Gly Ser Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 173
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的B7的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 173
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Gly Thr Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 174
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的D8的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 174
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Val Gly Asn Leu Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 175
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的E12的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 175
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ala Gly Ser Ala Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 176
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和力成熟的T2A12的轻链可变区的氨基酸序列
<400> 176
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Ala
20 25 30
Pro Thr Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 177
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CD8 前导序列的核苷酸序列
<400> 177
atggccctgc ctgtgaccgc tctgctgctg cccctggctc tgctgctgca cgccgctcgc 60
60
<210> 178
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CD8 铰链/跨膜结构域的核苷酸序列
<400> 178
accacaactc cagctccccg gccccctacc cctgcaccaa caatcgccag ccagcctctg 60
tccctgagac cagaggcatg taggccagct gcaggaggag cagtgcatac aagaggcctg 120
gacttcgcct gcgatatcta catttgggct cctctggcag gaacttgtgg cgtgctgctg 180
ctgtctctgg tcatcaccct gtactgc 207
<210> 179
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CD137的细胞间结构域的核苷酸序列
<400> 179
aaaaggggcc gcaagaaact gctgtatatt ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 60
accacacagg aggaagacgg gtgctcctgt agattccccg aggaagagga aggcgggtgt 120
gagctg 126
<210> 180
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CD3-zeta的细胞间结构域的核苷酸序列
<400> 180
cgcgtcaagt tcagccgatc agccgatgct cctgcataca agcagggcca gaatcagctg 60
tataacgagc tgaatctggg gcgccgagag gaatacgacg tgctggataa gcggagaggg 120
agggaccccg aaatgggagg caaacctagg cgcaagaacc cacaggaggg actgtacaat 180
gaactgcaga aggacaaaat ggccgaggct tattccgaaa ttgggatgaa aggagagcga 240
cggagaggga agggacacga tgggctgtat cagggactgt ctaccgccac taaagatacc 300
tacgacgctc tgcacatgca ggctctgcca cctcgc 336
<210> 181
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含CD19_8.1 scFv的CAR 构建体的核苷酸序列
<400> 181
atggccctgc ctgtgaccgc tctgctgctg cccctggctc tgctgctgca cgccgctcgc 60
cccgtggccc aggcggccga ggtgcagctg ttggagtctg ggggaggctt ggtacagcct 120
ggggggtccc tgagactctc ctgtgcagcc tctggattca cctttagcga ttattatatg 180
agctgggtcc gccaggctcc agggaagggg ctggagtggg tctcagggat ctattatgat 240
gatagtagtc aatattacgc tgattctgta aaaggtcggt tcaccatctc cagagacaat 300
tccaagaaca cgctgtatct gcaaatgaac agcctgagag ccgaggacac ggccgtgtat 360
tactgtgcga aaggtcctct tttttgtaat gatcggactt gttcttatta ttatgctatg 420
gacgtctggg gccagggtac actggtcacc gtgagctcag gtggaggcgg ttcaggcgga 480
ggtggatccg gcggtggcgg atcgcagtct gtgctgactc agccaccctc agcgtctggg 540
acccccgggc agagggtcac catctcttgt actggctctt catctaatat tggcagtaat 600
gctgtctact ggtaccagca gctaccagga acggccccca aactcctcat ctatgatgat 660
aatcatcggc caagcggggt ccctgaccga ttctctggct ccaagtctgg cacctcagcc 720
tccctggcca tcagtgggct ccggtccgag gatgaggctg attattactg tggtacctgg 780
gattatagcc tgagtggtta tgtcttaggc ggaggcacca agctgacggt cctaggccag 840
gccggccaga ccacaactcc agctccccgg ccccctaccc ctgcaccaac aatcgccagc 900
cagcctctgt ccctgagacc agaggcatgt aggccagctg caggaggagc agtgcataca 960
agaggcctgg acttcgcctg cgatatctac atttgggctc ctctggcagg aacttgtggc 1020
gtgctgctgc tgtctctggt catcaccctg tactgcaaaa ggggccgcaa gaaactgctg 1080
tatattttca agcagccctt catgcggccc gtgcagacca cacaggagga agacgggtgc 1140
tcctgtagat tccccgagga agaggaaggc gggtgtgagc tgcgcgtcaa gttcagccga 1200
tcagccgatg ctcctgcata caagcagggc cagaatcagc tgtataacga gctgaatctg 1260
gggcgccgag aggaatacga cgtgctggat aagcggagag ggagggaccc cgaaatggga 1320
ggcaaaccta ggcgcaagaa cccacaggag ggactgtaca atgaactgca gaaggacaaa 1380
atggccgagg cttattccga aattgggatg aaaggagagc gacggagagg gaagggacac 1440
gatgggctgt atcagggact gtctaccgcc actaaagata cctacgacgc tctgcacatg 1500
caggctctgc cacctcgc 1518
<210> 182
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CD19_8.1 抗体的CDRH1的核苷酸序列
<400> 182
gattattata tgagc 15
<210> 183
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CD19_8.1 抗体的CDRH2的核苷酸序列
<400> 183
gggatctatt atgatgatag tagtcaatat tacgctgatt ctgtaaaagg t 51
<210> 184
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CD19_8.1 抗体的CDRH3的核苷酸序列
<400> 184
ggtcctcttt tttgtaatga tcggacttgt tcttattatt atgctatgga cgtc 54
<210> 185
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CD19_8.1 抗体的CDRL1的核苷酸序列
<400> 185
actggctctt catctaatat tggcagtaat gctgtctac 39
<210> 186
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CD19_8.1 抗体的CDRL2的核苷酸序列
<400> 186
gatgataatc atcggccaag c 21
<210> 187
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CD19_8.1 抗体的CDRL3的核苷酸序列
<400> 187
ggtacctggg attatagcct gagtggttat gtc 33
<210> 188
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CD19_8.1 抗体的重链可变区的核苷酸序列
<400> 188
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc gattattata tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggg atctattatg atgatagtag tcaatattac 180
gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaggtcct 300
cttttttgta atgatcggac ttgttcttat tattatgcta tggacgtctg gggccagggt 360
acactggtca ccgtgagctc a 381
<210> 189
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CD19_8.1 抗体的轻链可变区的核苷酸序列
<400> 189
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgtactg gctcttcatc taatattggc agtaatgctg tctactggta ccagcagcta 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gatgataatc atcggccaag cggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240
tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt acctgggatt atagcctgag tggttatgtc 300
ttaggcggag gcaccaagct gacggtccta 330
<210> 190
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19_8.1_3C12, 6F10, 7D2, 7H11, 8E8, 10D3, 10E5, 10H4的CDRH2
<400> 190
Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ala Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 191
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19_8.1_3C12的CDRH3
<400> 191
Gly Pro Asn Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr Ala Met
1 5 10 15
Asp Val
<210> 192
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19_8.1_6F10的CDRH3
<400> 192
Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr Ala Met
1 5 10 15
Asp Val
<210> 193
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19_8.1_7D2的CDRH3
<400> 193
Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Asn Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr Ala Met
1 5 10 15
Asp Val
<210> 194
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19_8.1_7H11的CDRH3
<400> 194
Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Asp Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr Ala Met
1 5 10 15
Asp Val
<210> 195
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19_8.1_8E8的CDRH3
<400> 195
Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Asp Cys Ser Tyr Tyr Tyr Ala Met
1 5 10 15
Asp Val
<210> 196
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19_8.1_10D3的CDRH3
<400> 196
Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Met Tyr Tyr Ala Met
1 5 10 15
Asp Val
<210> 197
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19_8.1_10E5的CDRH3
<400> 197
Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Met Tyr Tyr Ala Met
1 5 10 15
Asp Val
<210> 198
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19_8.1_10H4的CDRH3
<400> 198
Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Lys Tyr Tyr Ala Met
1 5 10 15
Asp Val
<210> 199
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19_8.1_3C12, 6F10, 7D2, 7H11, 8E8, 10E5, 10H4的CDRL1
<400> 199
Tyr Gly Gln Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 200
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19_8.1_10D3的CDRL1
<400> 200
Thr Gly Gly Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr
1 5 10

Claims (9)

1.抗CD19抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区，其包含：
序列表中第1序列的CDRH1、
CDRH2、及
CDRH3；
轻链可变区，其包含：
CDRL1、
序列表中第5序列的CDRL2、及
序列表中第6序列的CDRL3，
其中所述CDRH2、CDRH3及CDRL1分别由序列表中下列序列的氨基酸序列组成：
第2序列、第3序列及第4序列、
第10序列、第3序列及第52序列、
第11序列、第3序列及第53序列、
第15序列、第3序列及第57序列、
第24序列、第3序列及第66序列、
第36序列、第3序列及第78序列、
第37序列、第3序列及第79序列、
第38序列、第3序列及第80序列、
第39序列、第3序列及第81序列、
第40序列、第3序列及第82序列、
第47序列、第3序列及第89序列、
第190序列、第191序列及第199序列、
第190序列、第192序列及第199序列、
第190序列、第193序列及第199序列、
第190序列、第194序列及第199序列、
第190序列、第195序列及第199序列、
第190序列、第196序列及第200序列、
第190序列、第197序列及第199序列、或
第190序列、第198序列及第199序列。
2.根据权利要求1所述的抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区及轻链可变区分别由序列表中下列序列的氨基酸序列组成：
第91序列及第134序列、
第95序列及第138序列、
第96序列及第139序列、
第100序列及第143序列、
第109序列及第152序列、
第121序列及第164序列、
第122序列及第165序列、
第123序列及第166序列、
第124序列及第167序列、
第125序列及第168序列、或
第132序列及第175序列。
3.核酸分子，其编码权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段。
4.重组载体，其包含权利要求3所述的核酸分子。
5.宿主细胞，其包含权利要求4所述的重组载体。
6.CD19特异性嵌合抗原受体，其包含：
(a)细胞外结构域，包含权利要求1或2所述的抗CD19抗体或其抗原结合片段；
(b)跨膜结构域；以及
(c)细胞内信号传导结构域。
7.效应细胞，其表达权利要求6所述的嵌合抗原受体。
8.药剂学组合物，其包含权利要求7所述的效应细胞。
9.用于预防或治疗与表达CD19的细胞有关的疾病、自身免疫性疾病或炎症性疾病的药剂学组合物，其包含权利要求1或2所述的抗CD19抗体或其抗原结合片段，
其中所述与表达CD19的细胞有关的疾病是选自由慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、前淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、脾淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性B细胞淋巴瘤以及霍奇金淋巴瘤组成的组中的B细胞恶性肿瘤，且
其中所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是选自由多发性硬化症、类风湿关节炎及系统性红斑狼疮组成的组中的疾病。
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