KR102165934B1 - 악성 b 세포를 특이적으로 인지하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도 - Google Patents

악성 b 세포를 특이적으로 인지하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 악성 B 세포를 표적하여 암을 치료하는 용도의 신규한 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 암 세포(특히, 혈액암)에서 고발현되는 CD19에 특이적으로 결합하는 항체로서 종래의 CD19 타겟 항체들의 CDR 서열과 비교하여 상동성이 매우 낮아, 그 서열의 독특함이 있으며, 본 발명의 항-CD19 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포는 CD19를 발현하는 양성 세포주에 반응하여 면역세포 활성을 유도하므로 CAR-면역 세포 치료제로서 유용하게 사용할 수 있다.

Description

악성 B 세포를 특이적으로 인지하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도{B Cell Malignancy Recognizing Antibody or Antigen Binding Fragment Thereof, Chimeric Antigen Receptor Comprising The Same and Uses Thereof}
본 특허출원은 2017년 12월 22일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허 출원 제10-2017-0178559호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 악성 B 세포를 표적하여 암을 치료하는 용도의 신규한 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이들의 용도에 관한 것이다.
악성 B 세포(B cell malignancy)는 우리 몸의 면역체계를 구성하는 세포계열 중 B 세포에서 생기는 종양을 말한다. 이러한 악성 B 세포는 정상적인 면역체계를 파괴하기 때문에, 외부로부터 침입하는 항원에 대한 면역성을 떨어뜨려 환자가 사망에 이르게 한다. 예를 들어 악성 B 세포 중 하나인 급성림프구성백혈병은 림프구계 백혈구가 악성 세포로 변하여 골수에서 증식하고 말초 혈액으로 퍼지는데 간, 비장, 림프계, 대뇌, 소뇌, 척수 등을 침범하는 질병이다. 급성림프구성백혈병은 2015년 글로벌 ALL 발생수는 161,000명, 사망자 수는 110,000명으로 예상되며, 발생 및 사망 모두 여자보다 남자에서 많이 나타나고 있는 질병이다. 이러한 급성 림프구성백혈병을 치료하는 방법으로 화학요법(chemotherapy), 표적치료법(targeted therapy), 동종 줄기세포 이식(allogeneic stem cell transplantation)이 대표적이며, 그 치료법이 향상되어 소아 환자의 생존율은 85%를 상회하고 있다. 하지만 여전히 기존 치료제에 미반응하는 환자 혹은 재발 환자가 발생하고 있으며, 소아 암 사망의 가장 큰 원인이 되고 있다.
급성림프구성백혈병 뿐만 아니라 악성 B 세포로부터 발생하는 대부분의 림프종/백혈병(lymphoma/leukemia)들은 세포 표면에 CD19을 발현하기 때문에, 이를 바탕으로 CD19을 인식하는 다양한 치료법들이 시도되고 있다. 이러한 CD19 표적치료제 분야에는 CAR-T 치료제, 이중항체 (bispecific antibody), 항체약물복합체 (antibody-drug conjugate), 면역독소 (immunotoxin), Fc-engineered 항체 등이 있다. 이러한 CD19 표적치료제 분야 중, CAR-T 치료제는 기존 치료에 불응하는 급성백혈병 환자를 대상으로 표적세포의 세포독성을 활성화시킴으로써 세포사멸을 유도하는 기작을 통하여 혈액암 치료에 활용되었으며, 이를 통해 높은 완치율(30명중에서 27명 완치)의 임상시험 결과가 보고되었다.
이러한 배경 하에 본 발명자들은, 악성 B 세포 중 CD19을 선택적으로 인식하는 항체 단편 및 이를 포함하는 키메라 항원 수용체를 개발하였으며, 이 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포독성 T세포가 세포독성 활성을 보유하고 있음을 확인하였다.
본 발명자들은 악성 B세포를 치료하기 위한 방법으로 CD19에 특이적으로 결합하는 신규한 항체 및 이를 이용한 키메라 항원 수용체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과 본 발명의 CD19_8.1 항체가 CD19 항원에 선택적으로 결합하며, 이 항체의 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포독성 T세포가 세포독성 활성을 보유함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 신규항 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 세포외 도메인(extracellular domain), 막관통 도메인(transmembrane domain) 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 명세서에서는 하기 제1항 내지 제35항의 발명이 청구된다.
1. 다음을 포함하는 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
(a) 다음 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDRH2를 포함하는 중쇄 가변영역(heavy chain variable region, VH):
일반식 1
GIYYDX6X7X8X9X10X11X12X13SVKG
여기서 X6은 G, A 또는 S이고; X7은 S, T, I, A, D, F, L 또는 H이며; X8은 A, T, S, Q, W, I, V, M, N, Y 또는 H이고; X9는 R, K S, V, A, Q, L, T, E, D, M, L, F 또는 P이며; X10은 Y, G, S 또는 T이고; X11은 Y, W, M 또는 L이며; X12는 A, S, T 또는 L이고; X13은 D, S, G, N 또는 P임; 및
(b) 다음 일반식 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDRL1을 포함하는 경쇄 가변영역(light chain variable region, VL):
일반식 2
X1GX3X4SNIGSX10X11X12Y
상기 X1은 V, A, G, S, W, N, Y, K, T, H, R, Q, E 또는 D이고; X3은 G, H, D, L, T, Q, K, N, S 또는 M이며; X4는 V, Y, I, P, V, M, A, L, F 또는 S이고; X10은 N 또는 A이며; X11은 A 또는 P이고; X12는 V, T 또는 L이다.
2. 제 1 항에 있어서,
상기 중쇄 가변영역은 하기 일반식 1-1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDRH2를 포함하는 것을 특징으로 하는 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
일반식 1-1
GIYYDX6X7X8X9YYADSVKG
여기서 X6은 G, A 또는 S이고; X7은 S, T, I, A, D, F, L 또는 H이며; X8은 A, T, S, Q, W, I, V, M, N, Y 또는 H이고; X9는 R, K S, V, A, Q, L, T, E, D, M, L, F 또는 P이다.
3. 제 1 항에 있어서,
상기 경쇄 가변영역은 하기 일반식 2-1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDRL1을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
일반식 2-1
X1GX3X4SNIGSNAVY
상기 X1은 V, A, G, S, W, N, Y, K, T, H, R, Q, E 또는 D이고; X3은 G, H, D, L, T, Q, K, N, S 또는 M이며; X4는 V, Y, I, P, V, M, A, L, I, F 또는 S이다.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역(VH)은 서열목록 제1서열의 CDRH1 및 서열목록 제3서열의 CDRH3를 더 포함하고; 상기 경쇄 가변영역(VL)은 서열목록 제5서열의 CDRL2 및 서열목록 제6서열의 CDRL3를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 CDRH2는 서열목록 제2서열, 제7서열 내지 제48서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
6. 제 4 항에 있어서, 상기 CDRL1은 서열목록 제4서열, 제49서열 내지 제90서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
7. 제 4 항에 있어서, 상기 CDRH2 및 CDRL1은 각각 서열목록 제2서열 및 제4서열; 제7서열 및 제49서열; 제8서열 및 제50서열; 제9서열 및 제51서열; 제10서열 및 제52서열; 제11서열 및 제53서열; 제12서열 및 제54서열; 제13서열 및 제55서열; 제14서열 및 제56서열; 제15서열 및 제57서열; 제16서열 및 제58서열; 제17서열 및 제59서열; 제18서열 및 제60서열; 제19서열 및 제61서열; 제20서열 및 제62서열; 제21서열 및 제63서열; 제22서열 및 제64서열; 제23서열 및 제65서열; 제24서열 및 제66서열; 제25서열 및 제67서열; 제26서열 및 제68서열; 제27서열 및 제69서열; 제28서열 및 제70서열; 제29서열 및 제71서열; 제30서열 및 제72서열; 제31서열 및 제73서열; 제35서열 및 제74서열; 제33서열 및 제75서열; 제34서열 및 제76서열; 제35서열 및 제77서열; 제36서열 및 제78서열; 제37서열 및 제79서열; 제38서열 및 제80서열; 제39서열 및 제81서열; 제40서열 및 제82서열; 제41서열 및 제83서열; 제42서열 및 제84서열; 제43서열 및 제85서열; 제44서열 및 제86서열; 제45서열 및 제87서열; 제46서열 및 제88서열; 제47서열 및 제89서열; 또는 제48서열 및 제90서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역(VH)은 서열목록 제91서열 내지 제133서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역(VL)은 서열목록 제134서열 내지 제176서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL)은 각각 서열목록 제91서열 및 제134서열; 제92서열 및 제135서열; 제93서열 및 제136서열; 제94서열 및 제137서열; 제95서열 및 제138서열; 제96서열 및 제139서열; 제97서열 및 제140서열; 제98서열 및 제141서열; 제99서열 및 제142서열; 제100서열 및 제143서열; 제101서열 및 제144서열; 제102서열 및 제145서열;제103서열 및 제146서열; 제104서열 및 제147서열; 제105서열 및 제148서열; 제106서열 및 제149서열; 제107서열 및 제150서열; 제108서열 및 제151서열; 제109서열 및 제152서열; 제110서열 및 제153서열; 제111서열 및 제154서열; 제112서열 및 제155서열; 제113서열 및 제156서열; 제114서열 및 제157서열; 제115서열 및 제158서열; 제116서열 및 제159서열; 제117서열 및 제160서열; 제118서열 및 제161서열; 제119서열 및 제162서열; 제120서열 및 제163서열; 제121서열 및 제164서열; 제122서열 및 제165서열; 제123서열 및 제166서열; 제124서열 및 제167서열; 제125서열 및 제168서열; 제126서열 및 제169서열; 제127서열 및 제170서열; 제128서열 및 제171서열; 제129서열 및 제172서열; 제130서열 및 제173서열; 제131서열 및 제174서열; 제132서열 및 제175서열; 또는 제133서열 및 제176서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
11. 제 1 항에 있어서, 상기 CDRH2는 서열목록 제190서열의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 CDRL1은 서열목록 제199서열 또는 제200서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
12. 제 11 항에 있어서, 서열목록 제191서열 내지 제 198서열의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
13. 제 11 항에 있어서, 서열목록 제1서열의 CDRH1, 서열목록 제5서열의 CDRL2 및 서열목록 제6서열의 CDRL3를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자.
15. 제 14 항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
16. 제 15 항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
17. 다음을 포함하는 CD19 특이적 키메라 항원 수용체:
(a) 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 세포외 도메인(Extracellular domain);
(b) 막관통 도메인(transmembrane domain); 및
(c) 세포내 신호전달 도메인.
18. 제17항에 있어서, 상기 막횡단 도메인은 T-세포 수용체, CD27, CD28, CD3 엡실론, CD45, [0011] CD4, CD5, CD8(CD8α), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154의 알파, 베타 또는 제타 사슬로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인인 것을 특징으로 하는 CD19 특이적 키메라 항원 수용체.
19. 제17항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ(CD3 제타) 사슬로부터 유래된 도메인인 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
20. 제17항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 OX40 (CD134), CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18) 및 4-1BB (CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 공동자극 분자(costimulatory molecule)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항의 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포.
22. 제21항에 있어서, 상기 세포는 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만 세포, NK-세포, B-세포 또는 염증성 T-림프구, 세포독성 T-림프구, 조절 T-림프구 또는 헬퍼 T-림프구로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 세포인 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포.
23. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 CD19를 발현하는 세포와 연관된 질환, 자가면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
24. 제23항에 있어서, 상기 CD19를 발현하는 세포와 연관된 질환은 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL), 급성 림프구성 백혈병 (acute lymphocytic leukemia, ALL), 전림프구성 백혈병(pro- lymphocytic leukemia), 털세포 백혈병(hairy cell leukemia), 일반 급성 림프구성 백혈병(common acute lymphocytic leukemia, CALLA), Null-acute lymphoblastic leukemia, 비-호지킨 림프종, 미만성 거대 B세포 림프종(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL), 다발성골수종, 여포 림프종(follicular lymphoma), 비장 림프종(splenic lymphoma), 변연부 림프종(marginal zone lymphoma), 외투세포 림프종(mantle cell lymphoma), 저위험군 B 세포 림프종(indolent B cell lymphoma), 및 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma)으로 이루어진 군으로부터 선택된 B 세포 악성종양(B cell malignancy)인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
25. 제23항에 있어서, 상기 자가면역 질환 또는 염증질환은 다발성 경화증, 류마티스성 관절염 및 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus, SLE)로 이루어진 군으로부터 선택된 질환인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
26. 제21항 또는 제22항의 세포를 포함하는 CD19를 발현하는 세포와 연관된 질환, 자가면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
27. 제26항에 있어서, 상기 CD19를 발현하는 세포와 연관된 질환은 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL), 급성 림프구성 백혈병 (acute lymphocytic leukemia, ALL), 전림프구성 백혈병(pro- lymphocytic leukemia), 털세포 백혈병(hairy cell leukemia), 일반 급성 림프구성 백혈병(common acute lymphocytic leukemia, CALLA), Null-acute lymphoblastic leukemia, 비-호지킨 림프종, 미만성 거대 B세포 림프종(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL), 다발성골수종, 여포 림프종(follicular lymphoma), 비장 림프종(splenic lymphoma), 변연부 림프종(marginal zone lymphoma), 외투세포 림프종(mantle cell lymphoma), 저위험군 B 세포 림프종(indolent B cell lymphoma), 및 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma)으로 이루어진 군으로부터 선택된 B 세포 악성종양(B cell malignancy)인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
28. 제26항에 있어서, 상기 자가면역 질환 또는 염증질환은 다발성 경화증, 류마티스성 관절염 및 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus, SLE)로 이루어진 군으로부터 선택된 질환인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
29. 제17항 내지 제20항의 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자.
30. 제26항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
31. 제27항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
32. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항의 조성물을 치료가 필요한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 CD19를 발현하는 세포와 연관된 질환, 자가면역질환 또는 염증질환의 치료방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 CD19를 발현하는 세포와 연관된 질환은 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL), 급성 림프구성 백혈병 (acute lymphocytic leukemia, ALL), 전림프구성 백혈병(pro- lymphocytic leukemia), 털세포 백혈병(hairy cell leukemia), 일반 급성 림프구성 백혈병(common acute lymphocytic leukemia, CALLA), Null-acute lymphoblastic leukemia, 비-호지킨 림프종, 미만성 거대 B세포 림프종(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL), 다발성골수종, 여포 림프종(follicular lymphoma), 비장 림프종(splenic lymphoma), 변연부 림프종(marginal zone lymphoma), 외투세포 림프종(mantle cell lymphoma), 저위험군 B 세포 림프종(indolent B cell lymphoma), 및 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma)으로 이루어진 군으로부터 선택된 B 세포 악성종양(B cell malignancy)인 것인, 치료방법.
34. 제32항에 있어서, 상기 자가면역 질환 또는 염증질환은 다발성 경화증, 류마티스성 관절염 및 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus, SLE)로 이루어진 군으로부터 선택된 질환인 것인, 치료방법.
35. 제32항에 있어서, 상기 대상체는 포유동물 또는 인간인, 치료방법.
본 명세서에서, 본 발명의 일 양태에 따른 항체는 CD19_8.1 항체 및 친화도 성숙을 거친 이들의 변형 항체이다.
본 발명의 CD19_8.1 항체, 그의 변형 항체 또는 그들의 항원 결합 단편은 종래의 키메라 항원 수용체에 사용되는 항체인 FMC63와 마찬가지로 CD19에 대하여 특이적인 결합능을 가진다.
본 명세서에서 “FMC63” 항체는 뮤린 항-CD19 단일클론 항체의 한 예이다(Nicholson et al., Molecular Immunology, 34(16-17): 1157-1165 (1997)). FMC63 단일클론 항체의 가변 영역들은 임상 시험에서 시험된 CAR에 사용되어 왔다(예를 들어, 문헌[Kochenderfer et al., Nature Review Clinical Oncol., 10(5); 267-276 (2013); Porter et al., New Eng. J. Med., 365(8): 725-733 (2011); Kalos et al., Science Translational Medicine, 3(95): 95ra73 (2011); Kochenderfer et al., Blood, 116(20): 4099-4102 (2010); and Kochenderfer et al., Blood, 119(12): 2709-2720 (2012)] 참조).
본 발명의 항체는 상기 FMC63 항체와 동일한 CD19의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
본 명세서에서, 용어 “항체(antibody)”는 CD19에 대한 특이 항체로서, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편(antigen binding fragment)을 포함한다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
본 명세서에서, 용어 “항원 결합 단편(antigen binding fragment)”은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab(fragment antigen binding)는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chin variable fragment, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
따라서, 본 발명에서 항체는 구체적으로 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFv), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab' )단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFv) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 “중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3 개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한 본 명세서에서 용어“경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "가변 영역(variable region)" 또는 "가변 도메인(variable domain)"은 항체를 항원에 결합시키는 것과 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. Native 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4 개의 보존된 프레임워크 영역 (framework regions, FR) 및 3 개의 초가변 영역 (hypervariable regions, HVR)을 포함한다. (Kindt et al., Kuby Immunology, 제 6 판, W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)).
본 명세서에서, 용어 “CDR(complementarity determining region)”은 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 경쇄(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)에는 각각 3개의 CDRs이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "프레임 워크(Framework)" 또는 "FR"은 초가변 영역 (hypervariable region, HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4 개의 FR 도메인 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH에서 다음의 순서로 나타난다:
FRH1(Framework region 1 of Heavy chain)-CDRH1 (complementarity determining region 1 of Heavy chain)-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4;
또한, HVR 및 FR서열은 일반적으로 VL(또는 Vk)에서 다음의 순서로 나타난다:
FRL1(Framework region 1 of Light chain)-CDRL1(complementarity determining region 1 of Light chain)-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4.
본 명세서에서, 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 이와 같은 것은, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 scFv와 같은 다른 구성물이 생리적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성한다는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1 x 10-6 M이하의 평형 해리 상수 (예를 들어, 이보다 작은 KD는 보다 단단한 결합을 나타냄)로 특성화될 수 있다. 2 개의 분자가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 “친화도(Affinity)"는 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호 작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, "결합 친화력(binding affinity)"은 결합 쌍 (예를 들어, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호 작용을 반영하는 내인성(intrinsic) 결합 친화력을 나타낸다. 분자 X와 그의 파트너 Y의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것들을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다.
또한 본 명세서에서 용어, “인간 항체(human antibody)” 또는 “인간화 항체(humanized antibody)"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체, 또는 인간 항체 레퍼토리(repertoires) 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 이용하는 비인간 근원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유한다.
본 명세서에서 용어, "키메라(chimeric) 항체”는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 근원(source) 또는 종(species)으로부터 유래되고, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 근원 또는 종에서 유래한 항체를 의미한다.
본 발명의 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 통상의 기술자가 인지하는 바와 같이, CD19를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다:
(a) 다음 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDRH2를 포함하는 중쇄 가변영역(heavy chain variable region, VH):
일반식 1
GIYYDX6X7X8X9X10X11X12X13SVKG
여기서 X6은 G, A 또는 S이고; X7은 S, T, I, A, D, F, L 또는 H이며; X8은 A, T, S, Q, W, I, V, M, N, Y 또는 H이고; X9는 R, K S, V, A, Q, L, T, E, D, M, L, F 또는 P이며; X10은 Y, G, S 또는 T이고; X11은 Y, W, M 또는 L이며; X12는 A, S, T 또는 L이고; X13은 D, S, G, N 또는 P임; 및
(b) 다음 일반식 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDRL1을 포함하는 경쇄 가변영역(light chain variable region, VL):
일반식 2
X1GX3X4SNIGSX10X11X12Y
상기 X1은 V, A, G, S, W, N, Y, K, T, H, R, Q, E 또는 D이고; X3은 G, H, D, L, T, Q, K, N, S 또는 M이며; X4는 V, Y, I, P, V, M, A, L, F 또는 S이고; X10은 N 또는 A이며; X11은 A 또는 P이고; X12는 V, T 또는 L이다.
본 명세서에서 사용된 “Xn”및 “Xm”등의 기호는 상기 정의된 일반식에서 위치 n 및 m의 아미노산을 표시하기 위해 사용한 것이다. 여기에서 n 및 m은 상기 서열의 N-말단으로부터 계산되는 상기 서열 내의 아미노산 위치를 표시하는 정수이이다. 예컨대 X1 및 X6은 상기 서열의 N-말단으로부터 각각 1번째 및 6번째 위치의 아미노산을 표시하는 것이다.
본 발명의 일 구현예의 경우, 상기 일반식 내의 Xn 또는 Xm이 될 수 있는 가능한 아미노산 잔기의 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 통상의 기술자는 Xn이 가능한 잔기들의 나열된 그룹들의 어느 하나로부터 선택될 수 있다는 것과 이러한 선택이 Xm의 아미노산의 선택과는 독립적으로 이루어지며, 여기서 n과 m은 다르다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 상기 일반식에서 Xn 위치에서 나열된 가능한 아미노산 잔기들 중 어떤 것이라도 다른 다양한 위치(Xm 위치)에서 나열된 가능한 아미노산 잔기들 중 다른 것과 독립적으로 조합될 수 있다.
하기 실시예에서 상세하게 기재된 바와 같이, 본 발명의 CD19에 특이적으로 결합하는 항-CD19 항체, 그의 변형 항체, 또는 그들의 항원 결합 단편의 CDRH2 및 CDRL1은 각각 상기 일반식 1 또는 1-1, 2 또는 2-1로 표시되며, 상기 일반식은 수많은 랜덤 변형 항체들을 통계적으로 분석한 결과에 기초하여 작성된 것이다. 상기 CD19에 특이적으로 결합하는 CD19_8.1 항체 또는 항원 결합단편과 이들의 변형 항체들은 반복적인 선발 시험에 의해 CD19와의 상호작용이 확인되어 선택되었다.
본 발명의 구체적인 구현예에서, 본 발명의 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 포함하는 중쇄 가변영역은 하기 일반식 1-1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDRH2를 포함한다:
일반식 1-1
GIYYDX6X7X8X9YYADSVKG
여기서 X6은 G, A 또는 S이고; X7은 S, T, I, A, D, F, L 또는 H이며; X8은 A, T, S, Q, W, I, V, M, N, Y 또는 H이고; X9는 R, K S, V, A, Q, L, T, E, D, M, L, F 또는 P이다.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에서, 본 발명의 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 포함하는 경쇄 가변영역은 하기 일반식 2-1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDRL1을 포함한다:
일반식 2-1
X1GX3X4SNIGSNAVY
상기 X1은 V, A, G, S, W, N, Y, K, T, H, R, Q, E 또는 D이고; X3은 G, H, D, L, T, Q, K, N, S 또는 M이며; X4는 V, Y, I, P, V, M, A, L, I, F 또는 S이다.
본 발명의 실시예에서, 본 발명의 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 포함하는 상기 중쇄 가변영역(VH)은 서열목록 제1서열의 CDRH1 및 서열목록 제3서열의 CDRH3를 더 포함하고; 상기 경쇄 가변영역(VL)은 서열목록 제5서열의 CDRL2 및 서열목록 제6서열의 CDRL3를 더 포함한다.
본 발명의 실시예에서, 상기 일반식으로 나타낸 CDRH2의 아미노산 서열은 서열목록 제2서열, 제7서열 내지 제48서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대응된다.
또한, 본 발명의 실시예에서, 상기 일반식으로 나타낸 CDRL1의 아미노산 서열은 서열목록 제4서열, 제49서열 내지 제90서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대응된다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 상기 CDRH2 및 CDRL1은 각각 서열목록 제2서열 및 제4서열; 제7서열 및 제49서열; 제8서열 및 제50서열; 제9서열 및 제51서열; 제10서열 및 제52서열; 제11서열 및 제53서열; 제12서열 및 제54서열; 제13서열 및 제55서열; 제14서열 및 제56서열; 제15서열 및 제57서열; 제16서열 및 제58서열; 제17서열 및 제59서열; 제18서열 및 제60서열; 제19서열 및 제61서열; 제20서열 및 제62서열; 제21서열 및 제63서열; 제22서열 및 제64서열; 제23서열 및 제65서열; 제24서열 및 제66서열; 제25서열 및 제67서열; 제26서열 및 제68서열; 제27서열 및 제69서열; 제28서열 및 제70서열; 제29서열 및 제71서열; 제30서열 및 제72서열; 제31서열 및 제73서열; 제35서열 및 제74서열; 제33서열 및 제75서열; 제34서열 및 제76서열; 제35서열 및 제77서열; 제36서열 및 제78서열; 제37서열 및 제79서열; 제38서열 및 제80서열; 제39서열 및 제81서열; 제40서열 및 제82서열; 제41서열 및 제83서열; 제42서열 및 제84서열; 제43서열 및 제85서열; 제44서열 및 제86서열; 제45서열 및 제87서열; 제46서열 및 제88서열; 제47서열 및 제89서열; 또는 제48서열 및 제90서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에서, 본 발명의 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역(VH)은 서열목록 제91서열 내지 제133서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 상기 경쇄 가변영역(VL)은 서열목록 제134서열 내지 제176서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 본 발명의 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 상기 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL)은 각각 서열목록 제91서열 및 제134서열; 제92서열 및 제135서열; 제93서열 및 제136서열; 제94서열 및 제137서열; 제95서열 및 제138서열; 제96서열 및 제139서열; 제97서열 및 제140서열; 제98서열 및 제141서열; 제99서열 및 제142서열; 제100서열 및 제143서열; 제101서열 및 제144서열; 제102서열 및 제145서열;제103서열 및 제146서열; 제104서열 및 제147서열; 제105서열 및 제148서열; 제106서열 및 제149서열; 제107서열 및 제150서열; 제108서열 및 제151서열; 제109서열 및 제152서열; 제110서열 및 제153서열; 제111서열 및 제154서열; 제112서열 및 제155서열; 제113서열 및 제156서열; 제114서열 및 제157서열; 제115서열 및 제158서열; 제116서열 및 제159서열; 제117서열 및 제160서열; 제118서열 및 제161서열; 제119서열 및 제162서열; 제120서열 및 제163서열; 제121서열 및 제164서열; 제122서열 및 제165서열; 제123서열 및 제166서열; 제124서열 및 제167서열; 제125서열 및 제168서열; 제126서열 및 제169서열; 제127서열 및 제170서열; 제128서열 및 제171서열; 제129서열 및 제172서열; 제130서열 및 제173서열; 제131서열 및 제174서열; 제132서열 및 제175서열; 또는 제133서열 및 제176서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명자들은 상술한 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편들 외에 CD19 항원에 대한 친화도가 증진된 추가적인 항체를 개발하고자, 기존에 개발한 CD19_8.1_2F1을 기반으로 CDRH2, CDHR3 및 CDRL1을 변형시킨 서브 라이브러리를 제작하였다. 그 결과, 친화도가 향상된 8종의 항체를 추가적으로 도출하였으며, 각 항체의 아미노산 서열을 본 발명의 실시예 및 서열목록에 수록하였다.
상기 8종의 추가항체는 CD19_8.1_2F1을 기반으로 도출되었으므로, 서열목록 제1서열의 CDRH1, 서열목록 제5서열의 CDRL2 및 서열목록 제6서열의 CDRL3를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열목록 제190서열의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2을 포함하고; 서열목록 제199서열 또는 제200서열의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1을 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열목록 제191서열 내지 제 198서열 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3를 포함한다.
본 발명의 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상술한 아미노산 서열에 대하여 소폭의 변화, 즉, 3차 구조 및 항체의 기능에 거의 영향을 미치지 않는 변형을 포함하는 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 따라서 어떤 구현예의 경우 상술한 서열과 일치하지 않더라도 적어도 90%, 93%, 95% 또는 98% 이상의 유사성을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상술한 서열의 CDR을 포함하는 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFv), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에서 본 발명의 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 항-CD19 scFv이다. 본 발명의 구체적인 구현예에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 포함되는 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역은 (Gly-Ser)n, (Gly2-Ser)n, (Gly3-Ser)n 또는 (Gly4-Ser)n 등의 링커에 의해 연결된다. 여기서 n은 1 내지 6의 정수이고, 구체적으로는 3 내지 4이나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 scFv의 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역은 예를 들어 다음의 배향으로 존재할 수 있다: 경쇄가변영역-링커-중쇄가변영역 또는 중쇄가변영역-링커-경쇄가변영역.
한편, 본 발명의 항체 CDR 서열은 종래 항-CD19 항체 또는 이들을 포함하는 키메라 항원 수용체들의 CDR 서열과 비교하여 상동성(similarity)이 매우 낮아, 그 서열의 독특함이 있다. 예를 들어, 본 발명의 CD19_8.1 항체에 대하여 BLAST 검색을 한 결과, 상동성이 가장 높은 것으로 나온 미국 특허공개공보 제2016/0090427 A1호에 개시된 항체(서열목록 제173서열)는 본 발명의 CD19_8.1 항체와 CDR 서열 상동성이 88.5% 에 불과하며, 더욱이 상기 미국 특허공개공보에 기재된 항체는 VEGF, C-MET, 또는 VEGF와 C-MET에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체(bispecific antibody)로서, 본 발명의 항체와 그 타겟 및 유형이 상이하다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기의 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "핵산 분자"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 상기 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 키메라 항원 수용체 분자를 구성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것으로 족하며, 어느 특정 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는 다는 것은 당업자에게 자명하다.
이는 뉴클레오티드 서열의 변이가 발생하더라도 변이된 뉴클레오타이드 서열을 단백질로 발현하면 단백질 서열에서 변화를 가져오지 않는 경우도 있기 때문이다. 이를 코돈의 축퇴성이라고 한다. 따라서 상기 뉴클레오타이드 서열은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 본 발명의 CD19에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄 CDR, 경쇄 CDR, 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역, 중쇄, 또는 경쇄를 이루는 폴리펩티드의 서열은 본 명세서의 첨부된 서열목록에 수록되어 있다.
항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편; 또는 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 ncbi 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 ncbi 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주세포를 포함한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주 세포는 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK-293 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 CD19 특이적 키메라 항원 수용체를 제공한다:
(a) 상기의 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 세포외 도메인(Extracellular domain);
(b) 막관통 도메인(transmembrane domain); 및
(c) 세포내 신호전달 도메인.
본 명세서에서, 용어 “키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)”는 T-세포 신호전달 또는 T-세포 활성화 도메인에 연결된 항체의 항원 결합 도메인(예를 들어, 단일쇄 가변 단편(scFv))을 함유하는 인공적으로 제작된 하이브리드 단백질 또는 폴리펩타이드이다. 키메라 항원 수용체는 단일클론 항체의 항원-결합 성질을 이용하여 비-MHC-제한 방식으로, 선택된 표적에 대한 T-세포 특이성 및 반응성을 재유도하는 능력을 갖는다. 비-MHC-제한된 항원 인식은 CAR을 발현하는 T-세포에게 항원 처리와 무관하게 항원을 인식하는 능력을 제공하여, 종양 도피의 주요 메카니즘을 회피시킨다. 또한, CAR은 T-세포에서 발현될 때, 유리하게는 내재성 T-세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 사슬과 이량체화되지 않는다.
본 발명의 키메라 항원 수용체는 B 림프구 항원으로 알려진 CD19에 대해 유도된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 본 발명에서 상기 CD19에 대해 유도된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상술한 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 세포의 표면에서 발현된다. 따라서 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 상기 막관통 도메인은 당해 분야에서 공지된 천연 공급원으로부터 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 상기 막관통 도메인은 예를 들어 T-세포 수용체, CD27, CD28, CD3 엡실론, CD45, [0011] CD4, CD5, CD8(CD8α), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154의 알파, 베타 또는 제타 사슬로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막관통 도메인일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 막관통 도메인은 서열목록 제177서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 CD8 유래 힌지/막관통 도메인이다.
본 명세서에서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 이차전령(2nd messenger)를 생성하거나 또는 상기 이차전령에 반응하여 이펙터로서 기능함으로써 규정된 신호전달 경로를 통한 세포 활성을 조절하기 위해 정보를 세포 내로 전달함으로써 작용하는 단백질의 기능성 부분을 의미한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 상기 세포내 신호전달 도메인은 면역 세포 및 면역 반응의 활성화를 야기시키는 타겟(예컨대 CD19)에 상기 세포외 도메인을 결합시킨 후 세포내 신호전달의 원인이 된다. 즉, 세포내 신호전달 도메인은 면역 세포의 정상 이펙터(effector) 기능들 중 적어도 하나의 활성화의 원인이 된다. 예를 들어, T 세포의 이펙터 기능은 사이토카인의 분비를 포함하는 세포독성 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 키메라 항원 수용체에서 사용하기 위한 신호 변환 도메인의 바람직한 예는 항원 수용체 결합(engagement) 후 신호 변환을 개시하기 위해 협력하여 작용하는 T 세포 수용체 및 공동-수용체의 세포질 서열, 뿐만 아니라 동일한 기능적 능력을 갖는 이러한 서열의 임의 유도체 또는 변형체 및 임의 합성 서열일 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 키메라 항원 수용체의 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ(CD3 제타) 사슬로부터 유래된 도메인이다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 상기 CD3ζ(CD3 제타) 사슬로부터 유래된 도메인은 서열목록 제180서열을 포함하는 염기서열에 의해 인코딩되는 CD3ζ 도메인이다.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 키메라 항원 수용체의 세포내 신호전달 도메인은 OX40 (CD134), CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18) 및 4-1BB (CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 공동자극 분자(costimulatory molecule)를 추가적으로 포함한다. 상기 세포내 신호전달 도메인은 상술한 도메인 외에도 당해 분야에서 공지된 다른 세포내 신호전달 분자로부터 수득되거나 유래될 수 있고, 세포내 신호전달 도메인이 유래되는 분자의 전체 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에 따르면, 상기 공동자극 분자(도메인)은 CD28, OX40, 4-1BB (CD137), 및/또는 ICOS (CD278)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 수득된 기능적 신호전달 도메인일 수 있고, 보다 구체적으로는 CD28 및/또는 OX40의 기능적 신호전달 도메인일 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 상기 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB, CD28, OX40, CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인, 또는 이들의 조합이다. 상기 세포내 신호전달 도메인은 가장 구체적으로는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인이다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 상기 CD137을 포함하는 공동자극 분자는 서열목록 제179서열을 포함하는 염기서열에 의해 인코딩되는 CD3ζ 도메인이다.
본 발명의 키메라 항원 수용체의 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인은 상술한 구체적인 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인들 중 1 이상 선택된 조합으로 포함될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 키메라 항원 수용체는 CD8α 막관통 도메인 및 CD28 및 CD3ζ의 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일양태에 따르면, 본 발명은 상술한 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 상술한 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편(폴리펩타이드)와 이를 인코딩하는 핵산 분자, 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이를 인코딩하는 핵산 분자는 단리된 상태이다.
본 명세서에서, 용어 "단리된"은 자연/천연 상태로부터 변형되거나 제거됨을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩타이드는 "단리된" 것이 아니지만, 그로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩타이드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 또는 예를 들어 숙주 세포와 같은 비-천연 환경에 존재할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 명세서에서 후술되는 “벡터”에 대해서는 상술한 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자와 관련하여 공통적으로 적용된다.
본 명세서에서 용어 “벡터”는 전달 벡터와 발현 벡터를 포함한다.
본 명세서에서 용어 “전달 벡터”는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포 내부로 전달하는데 사용될 수 있는 물질의 조성을 지칭한다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 연결된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로 상기 전달 벡터는 자가 복제성 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 세포 내로의 핵산의 전이를 촉진시키는 비-플라스미드 및 비-바이러스성 화합물, 예컨대 폴리리신 화합물, 리포솜 등을 추가적으로 포함할 수 있는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스성 전달 벡터는 아데노 바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 “발현 벡터”는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위하여, 발현시킬 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스 작용 인자(cis-acting element)를 포함하고, 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포 또는 시험관 내 발현 시스템에 의해 제공될 수 있다. 상기 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 상기 스위치 분자를 코딩하는 핵산 분자는 상기 벡터의 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다. 본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 유전자 클로닝을 위한 벡터, 단백질의 발현을 위한 벡터, 또는 유전자의 전달을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터, 엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 이들은 일반적으로 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 벡터가 전달 벡터인 경우 “레트로바이러스 벡터”일 수 있다. 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 유전자 전달을 위해 선택된 유전자는 레트로바이러스 벡터 내에 삽입되고, 레트로바이러스 입자 내에 패키징될 수 있다. 이어서 재조합된 레트로바이러스는 인 비보, 또는 인 비트로에서 목적하는 숙주 세포로 전달될 수 있다. 많은 레트로바이러스 벡터가 관련 기술분야에 알려져 있으며, 본 발명의 구체적인 구현예에서 상기 레트로바이러스 벡터는 MLV-기반의 레트로바이러스벡터인 pMT 레트로바이러스 벡터이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터이다.
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 폴리펩타이드 또는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다. 한편, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 CAR 폴리펩티드의 발현을 평가하기 위한 선택표지로서 선택가능 마커 유전자 및/또는 리포터 유전자를 포함할 수 있다. 선택가능 마커 유전자로는 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다. 리포터 유전자로는 루시페라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 또는 녹색형광 단백질 유전자를 포함한다.
본 발명의 재조합 벡터를 세포 내로 도입하고 발현시키는 방법은 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 벡터는 당업계에 공지된 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 박테리아, 효모, 또는 곤충 세포 내로 쉽게 도입될 수 있다. 예를 들면, 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 상기 물리적 수단은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 폭격(particle bombardment), 미세주입, 전기천공 등을 포함한다. 상기 화학적 수단은 콜로이드 분산액 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노 캡슐, 마이크로스피어, 비드, 및 수중유 에멀젼, 마이셀 (micelle), 혼합된 마이셀, 및 리포좀을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 또한, 상기 생물학적 수단은 상술한 렌티바이러스, 레트로바이러스 등, DNA 또는 RNA 벡터의 사용을 포함한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 세포는 면역세포로서 선천성 및/또는 후천성 면역 반응의 개시 및/또는 실행을 담당하는 조혈기원의 세포를 지칭한다.
본 발명에 따른 상기 면역 세포는 줄기세포로부터 유래될 수 있다. 줄기 세포는 성체 줄기세포, 비-인간 배아 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포, 골수유래 줄기세포, 유도만능 줄기세포, 또는 조혈 줄기 세포일 수 있다. 보다 구체적으로는 상기 면역세포는 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만 세포, NK-세포, B-세포 또는 염증성 T-림프구, 세포독성 T-림프구, 조절 T-림프구 또는 헬퍼 T-림프구로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 세포일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포는 효과기 세포(effector cell)라고도 불리운다. 상기 효과기 세포는 자가 세포 또는 동종이형 세포의 집단을 포함한다. 즉, 상기 효과기 세포는 본 CD19에 특이적인 CAR를 발현하는 자가 세포 또는 동종이형 세포의 집단을 포함한다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 효과기 세포는 CD19 특이적 CAR를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질감염 또는 형질 도입된 세포의 집단을 포함한다. 상기 형질 감염 또는 형질 도입은 상술한 바와 같이 당업계에 알려진 다양한 수단에 의해 제한없이 이루어질 수 있다.
따라서, 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면 본 발명의 효과기 세포, 예컨대 T 림프구, 또는 자연살해 세포로 전달되고, CD19 특이적 CAR 코딩 핵산 분자는 mRNA로 전사되며, 상기 mRNA로부터 CD19 특이적 CAR 폴리펩티드가 번역되어 효과기 세포의 표면에 발현된다.
또한 본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물, 또는 상기 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 상기 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포가 약제학적 조성물의 형태로 투여되는 경우, 상기 세포는 투여되는 대상체(subject)에 대해 동종동물 유래 또는 자가유래 세포일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포의 집단을 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포를 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 CD19_8.1 항체 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 T 세포(CD19_8.1 CAR-T cell)는 CD19 항원을 발현하는 세포주(RaJi)와 동시 배양하는 경우 CD19 양성 세포주(RaJi) 표면의 CD19 항원을 인식함으로써, 키메라 항원 수용체 세포의 활성화를 유도하므로 CD19 항원과 관련된 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 약제학적 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질환으로는 CD19를 발현하는 세포와 연관된 인간 및 포유동물의 질환으로서, 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL), 급성 림프구성 백혈병 (acute lymphocytic leukemia, ALL), 전림프구성 백혈병(pro- lymphocytic leukemia), 털세포 백혈병(hairy cell leukemia), 일반 급성 림프구성 백혈병(common acute lymphocytic leukemia, CALLA), Null-acute lymphoblastic leukemia, 비-호지킨 림프종, 미만성 거대 B세포 림프종(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL), 다발성골수종, 여포 림프종(follicular lymphoma), 비장 림프종(splenic lymphoma), 변연부 림프종(marginal zone lymphoma), 외투세포 림프종(mantle cell lymphoma), 저위험군 B 세포 림프종(indolent B cell lymphoma), 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma)으로 이루어진 군으로부터 선택된 B 세포 악성종양(B cell malignancy)을 포함한다.
또한 상기 질환은 부적절하거나 증강된 B 세포수 및/또는 활성화와 연관된 자가면역 질환 및 염증 질환을 포함한다. 상기 자가면역 질환 및 염증질환의 예로는 다발성 경화증, 류마티스성 관절염 및 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus, SLE)를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 흉골내 주입, 종양내 주입, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 질환을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 명세서에서 용어 “예방”은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적인 치료를 의미한다. 본 명세서에서 용어 “치료”는 질환상태의 감소, 억제, 진정 또는 근절을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 상술한 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포 이외에 다른 약제학적 활성 약제 또는 약물, 예를 들어, 아스파라기나제, 부설판, 카보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 빈크리스틴 등의 화학치료제; 베바시주맙(bevacizumab), 올라파립(olaparib) 등의 표적치료제; 또는 니볼루맙(nivolumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab)과 같은 면역관문억제제를 포함하거나, 이들과 함께 병용투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 CD19에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물; 또는 상기의 CD19 특이적 키메라 항원 수용체를 발현하는 효과기 세포를 포함하는 조성물을 치료가 필요한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 CD19를 발현하는 세포와 연관된 질환, 자가면역질환 또는 염증질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 치료방법의 대상 질병인 CD19를 발현하는 세포와 연관된 질환, 자가면역질환 또는 염증질환은 상기 약학적 조성물의 치료 대상 질병과 관련하여 정의한 것과 같다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 대상체는 포유동물 또는 인간이다.
본 발명의 암 또는 염증성 질환의 치료방법은 유효성분으로서 상술한 항체 또는 항원 결합 단편; 또는 키메라 항원 수용체를 발현하는 효과기 세포를 공통적으로 사용하는 방법이므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 항체는 암 세포(특히, 혈액암)에서 고발현되는 CD19에 특이적으로 결합하는 항체로서 종래의 CD19 타겟 항체들의 CDR 서열과 비교하여 상동성이 매우 낮아, 그 서열의 독특함이 있으며, 본 발명의 항-CD19 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포는 CD19를 발현하는 양성 세포주에 반응하여 면역세포 활성을 유도하므로 CAR-면역 세포 치료제로서 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 CD19_8.1 항체 단편에 대한 CD19-ECD Fc 단백질에 대한 결합을 ELISA로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 제2중쇄와 제1경쇄 CDR부위를 변경하여 친화도가 증진된 항체를 확보하기 위하여, CD19-ECD Fc 단백질에 대한 결합을 변경된 ELISA 방법으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 친화도가 증진된 10종 항체에 대한 CD19-ECD Fc 단백질에 대한 결합을 ELISA로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 친화도가 증진된 3종 항체에 대한 CD19 양성 세포주인 RaJi 세포주에 대한 결합능을 유세포 분석기를 통하여 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 개발된 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체의 발현을 특수 단백질 검출 검사 방법을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 개발된 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포독성 T 세포의 활성을 인터페론 감마 분비량으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 친화도가 증진된 8종 항체에 대한 CD19-ECD Fc 단백질에 대한 결합을 ELISA로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 친화도가 증진된 3종 항체에 대한 CD19 양성 세포주인 RaJi 세포주에 대한 결합능을 유세포 분석기를 통하여 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 CD19_8.1_3C12의 키메라 항원 수용체가 발현되는 세포독성 T세포의 활성을 인터페론 감마의 양으로 확인한 결과이다. 표적 세포로 CD19 양성 세포인 RaJi와 CD19 음성 세포인 Jurkat을 사용하였으며, 세포독성 T세포와 1:5의 비율로 공동배양하여 인터페론 감마를 측정하였다.
도 10은 CD19 양성 세포주인 RaJi-Luc세포와 세포독성 T세포를 공동 배양한 후, 살아남은 RaJi-Luc세포의 luciferase를 측정하여 세포독성을 확인한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: CD19에 대한 항체 개발
항체 개발을 위해 인간 CD19 단백질의 세포 외부 도메인(Extracellular domain, ECD)을 동물세포를 이용하여 생산한 후 항원으로 이용하였다. ECD의 C-말단에 인간 IgG1의 힌지 및 Fc 부위(CH2-CH3)가 결합된 형태의 DNA를 pCEP4 벡터(Invitrogen, 미국)에 클로닝하였다. 이어서, FreeStyleTM 293F(Invitrogen, 미국) 세포에 상기 클로닝된 벡터를 일시적으로 형질전환시켜, CD19-ECD Fc 융합 단백질을 확보하였다. 상기 CD19-ECD Fc 융합 단백질과 오팔 라이브러리를 이용하여 파지 바이오-패닝(bio-panning)을 실시하였다. 항체 라이브러리는 VCSM13 헬퍼 파지(helper phage)를 이용하여 파지 형태로 수득하여 패닝에 이용하였다. 처음 항원과 결합시키는 라이브러리 파지의 수는 1013을 이용하였다. 패닝 라운드(panning round)는 4 라운드까지 실시하였으며, 친화도가 높은 파지가 선택적으로 잘 선별될 수 있는 패닝 전략으로 패닝 라운드 횟수가 늘어감에 따라 항원의 양을 줄이고 세척 횟수는 늘리는 방법을 적용하였다. 타겟 항원에 결합한 파지의 수는 ER2537 이. 콜라이(E. coli)를 이용하여 하기와 같이 적정하였다. 바이오-패닝 각 라운드에서 얻은 바인더 파지(binder phage)를 pH2.2 글라이신 완충액으로 용출하였다. SB 배양액에서 하룻밤동안 배양한 ER2537을 새로운 SB 배양액을 이용하여 1/200으로 희석하여 계대하였다. 이어서, 3시간 동안 37℃에서 추가 배양하여 로그 파지(log phage)에 도달하도록 하였다. 100 ㎕의 신선한 ER2537과 10 ㎕의 희석된 파지를 1.5 ㎖ 튜브에서 혼합한 다음, 30분 동안 배양한 후 암피실린(ampicillin) LB 플레이트에 도말하였다. 이어서, 37℃에서 하룻밤동안 배양하여 생성된 콜로니(colony) 수와 희석 인자를 적용하여 파지 수를 측정하였다. 바이오-패닝 각 라운드에서 얻은 바인더 파지는 ER2537에 감염시켜 콜로니 형태로 유지한 상태에서 ELISA 방법으로 각 항원에 대한 결합여부를 확인하였다. 바인더 파지를 감염시켜 얻은 콜로니를 SB 배양액에 접종한 다음 OD600에서 0.5가 될 때까지 배양하였다. 이어서, 0.5 mM의 IPTG를 넣고 30℃에서 셰이킹(shaking) 배양하여 항체 단편 단백질이 과발현되도록 하였다. BBS 완충액을 이용하여 scFv 단백질을 정제하였다. 정제된 항체 단편을 CD19-ECD Fc 단백질이 코팅된 플레이트와 CD19 과발현 세포주인 RaJi에 처리하였다. 2차 항체를 처리한 후, TMB로 발색반응을 발생시켜 ELISA 리더기(Victor X3 PerkinElmer)를 이용하여 OD450 값을 측정하였다. CD19에 특이적으로 결합하는 것으로 선별된 항체 클론은 파지미드(phagemid) 플라스미드와 공지된 프라이머 세트(Phage display: a laboratory manual, Carlos Barbas III, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press)를 이용하여 시퀀싱(sequencing) 분석을 통해 가변부위의 염기서열을 확인하였다. 선별된 항체 중 CD19에 대한 결합능이 우수한 CD19_8.1을 선별하였으며, 선별된 CD19_8.1 항체의 가변부위의 염기서열은 표 1과 같다.
CD19_8.1 항체의 CDR(complementarity determining region)의 아미노산 서열
경쇄 중쇄
CDR1 TGSSSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 4) DYYMS (SEQ ID NO: 1)
CDR2 DDNHRPS (SEQ ID NO: 5) GIYYDDSSQYYADSVKG (SEQ ID NO: 2)
CDR3 GTWDYSLSGYV (SEQ ID NO: 6) GPLFCNDRTCSYYYAMDV (SEQ ID NO: 3)
선별된 CD19_8.1 항체의 결합을 정량적으로 확인하기 위해서 항체 단편을 동물세포를 이용하여 생산하였다. 항체 단편의 C-말단에 인간 카파 경쇄 부위가 결합된 형태의 DNA를 pCEP4 벡터에 클로닝하였다. 이어서, FreeStyleTM 293F 세포에 상기 클로닝된 벡터를 일시적으로 형질전환시켜, 카파 경쇄 융합 단백질 형태의 항체를 확보하였다.
선별된 항체의 결합능을 측정하기 위하여 CD19-ECD Fc를 이용한 ELISA를 진행하였다. CD19-ECD Fc 단백질이 코팅된 플레이트에 정제된 항체 단편을 농도 의존적으로 처리하였으며, 2차 항체를 처리한 후 TMB로 발색반응을 발생시켜 ELISA 리더기(Victor X3 PerkinElmer)를 이용하여 OD450 값을 측정하였다(도 1).
실시예 2. 개발된 항체 단편에 대한 친화도 증진
CD19에 대하여 CD19_8.1대비 우수한 결합력을 가진 항체 단편을 확보하기 위하여 을 중쇄와 경쇄 라이브러리를 조합하여 새로운 서브 라이브러리를 제작하였다. 서브 라이브러리를 생성하기 위하여, NNK 동의 코돈(degenerate codons)을 함유하는 올리고뉴클레오티드가 사용되었다. CD19_8.1 항체 단편은 template DNA로 사용되었다. 무작위 코돈은 PCR에 의해 HCDR3만을 제외하고 5개의 CDR에 도입되었다. 증폭된 항체 단편은 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, 미국)에 의해 정제되었다. 항체 단편 및 pComb3XSS 벡터는 sfiⅠ 제한 효소로 절단되었고 라이게이션 후 ER2537에 형질 주입하여 파지 라이브러리를 제작하였다. 제작된 파지 라이브러리를 기반으로 실시예 1과 동일한 방법으로 항체를 선별하였다.
선별된 항체 중 친화도가 보다 향상된 항체를 선별하기 위하여 CD19이 코팅된 플레이트를 이용한 ELISA를 진행하였다. ELISA 수행 시, 항체 단편의 결합 후 37℃에서 2시간동안 추가 배양하여 친화도가 향상된 항체를 선별하고자 하였다. 배양이 끝나고 세척을 수행한 후, 2차 항체 반응 및 TMB 발색을 진행하여 친화도가 증진된 항체를 최종 선별하였다. ELISA 수행 결과, 제2중쇄 CDR과 제1경쇄 CDR이 친화도에 중요하다는 것을 확인하였다. 이에 따라, 제2중쇄 CDR과 제1경쇄 CDR 부위를 변경하는 서브 라이브러리를 제작하여 위와 동일한 방법으로 친화도가 향상된 항체를 선별하였다(도 2). 선별된 콜로니에서 발현되는 항체의 서열을 염기분석을 통하여 확인하였다. 선별된 항체의 가변부위인 제2중쇄 CDR과 제1경쇄 CDR 부위의 염기서열은 표 2와 같다.
친화도 증진이 진행된 항체의 제2중쇄 CDR과 제1경쇄 CDR부위의 아미노산 서열
항체 제2중쇄 제1경쇄
2B1 GIYYDGSARYYADSVKG (SEQ ID NO: 7) VGGVSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 49)
B12 GIYYDGSAKYYADSVKG (SEQ ID NO: 8) AGHYSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 50)
T2H3 GIYYDGSAKYYADSVKG (SEQ ID NO: 9) GGGISNIGSNAVY (SEQ ID NO: 51)
T3C1 GIYYDGSASYYADSVKG (SEQ ID NO: 10) SGGPSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 52)
D10 GIYYDGSAVYYADSVKG (SEQ ID NO: 11) WGDYSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 53)
F6 GIYYDGSAKYYADSVKG (SEQ ID NO: 12) WGLPSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 54)
B2 GIYYDGSTKYYADSVKG (SEQ ID NO: 13) AGGVSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 55)
B6 GIYYDGSTAYYADSVKG (SEQ ID NO: 14) NGTPSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 56)
2F1 GIYYDGSSQGWSSSVKG (SEQ ID NO: 15) YGQPSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 57)
C8 GIYYDGSQLYYADSVKG (SEQ ID NO: 16) KGGMSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 58)
D4 GIYYDGSSQSMAGSVKG (SEQ ID NO: 17) TGGVSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 59)
B5 GIYYDGSSQGMTNSVKG (SEQ ID NO: 18) HGTPSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 60)
G4 GIYYDGSSQTLLPSVKG (SEQ ID NO: 19) VGKPSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 61)
A7 GIYYDASWTYYADSVKG (SEQ ID NO: 20) TGNPSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 62)
D12 GIYYDASTKYYADSVKG (SEQ ID NO: 21) RGSASNIGSNAVY (SEQ ID NO: 63)
E2 GIYYDASIRYYADSVKG (SEQ ID NO: 22) KGMISNIGSNAVY (SEQ ID NO: 64)
T2A1 GIYYDASVKYYADSVKG (SEQ ID NO: 23) AGKPSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 65)
T3H9 GIYYDASAEYYADSVKG (SEQ ID NO: 24) SGMLSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 66)
2G1 GIYYDSSTRYYADSVKG (SEQ ID NO: 25) KGSFSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 67)
C4 GIYYDSSMRYYADSVKG (SEQ ID NO: 26) GGQPSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 68)
C5 GIYYDSSMRYYADSVKG (SEQ ID NO: 27) KGGMSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 69)
D1 GIYYDSSAKYYADSVKG (SEQ ID NO: 28) SGGPSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 70)
D2 GIYYDSSTDYYADSVKG (SEQ ID NO: 29) QGQPSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 71)
E1 GIYYDSSVTYYADSVKG (SEQ ID NO: 30) TGNPSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 72)
F3 GIYYDSSARYYADSVKG (SEQ ID NO: 31) TGSSSNIGSAPLY (SEQ ID NO: 73)
T2C1 GIYYDSSQDYYADSVKG (SEQ ID NO: 32) RGGPSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 74)
T2H1 GIYYDSSQDYYADSVKG (SEQ ID NO: 33) QGGYSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 75)
T2H5 GIYYDSSAKYYADSVKG (SEQ ID NO: 34) SGNPSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 76)
T3B8 GIYYDSSVMYYADSVKG (SEQ ID NO: 35) EGSPSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 77)
A12 GIYYDGTVLYYADSVKG (SEQ ID NO: 36) QGGPSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 78)
C2 GIYYDGTNQYYADSVKG (SEQ ID NO: 37) TGGLSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 79)
D7 GIYYDGTAFYYADSVKG (SEQ ID NO: 38) EGQPSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 80)
E3 GIYYDGTAMYYADSVKG (SEQ ID NO: 39) SGGYSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 81)
H10 GIYYDGTNVYYADSVKG (SEQ ID NO: 40) LGGYSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 82)
T3F5 GIYYDGTAKYYADSVKG (SEQ ID NO: 41) HGQPSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 83)
A10 GIYYDGIYRYYADSVKG (SEQ ID NO: 42) SGDPSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 84)
T3H1 GIYYDGAVQYYADSVKG (SEQ ID NO: 43) DGGYSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 85)
B1 GIYYDGDVRYYADSVKG (SEQ ID NO: 44) VGSPSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 86)
B7 GIYYDGFAPYYADSVKG (SEQ ID NO: 45) RGTPSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 87)
D8 GIYYDGLHQYYADSVKG (SEQ ID NO: 46) VGNLSNIGSNAVY (SEQ ID NO: 88)
E12 GIYYDSFVPYYADSVKG (SEQ ID NO: 47) AGSASNIGSNAVY (SEQ ID NO: 89)
T2A12 GIYYDGHQQYYADSVKG (SEQ ID NO: 48) TGSSSNIGSAPTY (SEQ ID NO: 90)
선별된 항체 중에서 친화도가 향상된 10종 항체에 대한 정량 실험을 위해서 항체 단편에 대한 생산을 실시예 2에 언급된 방법과 동일하게 진행하였다. 그 결과, 친화도가 향상된 항체에 대해, 카파 경쇄 융합 단백질 형태의 항체로 확보하였다.
선별된 항체의 결합능을 측정하기 위하여 CD19-ECD Fc를 이용한 ELISA를 진행하였다. CD19-ECD Fc 단백질이 코팅된 플레이트에 정제된 항체 단편을 농도 의존적으로 처리하였으며, 2차 항체를 처리한 후 TMB로 발색반응을 발생시켜 ELISA 리더기(Victor X3 PerkinElmer)를 이용하여 OD450 값을 측정하였다(도 3). 측정된 OD450 값을 이용하여 CD19-ECD Fc에 대한 결합능을 Graphpad Prism으로 분석하였다(표 3).
친화도 증진된 10종 항체 단편의 CD19-ECD Fc에 대한 결합능(EC50)
CD19_8.1 A12 C2 D7 D10 E3 E12 H10 2F1 T3C1 T3H9
EC50
(nM)		 21.04 2.37 5.81 3.20 2.48 1.87 2.56 3.31 1.60 2.40 2.32
선별된 항체 중, CD19-ECD Fc에 대한 결합능이 우수한 E3, 2F1 항체와 상대적으로 낮은 C2항체에 대해 CD19 양성 세포주인 RaJi 세포주에 대한 결합능을 확인하였다. 정제된 항체 단편을 CD19 양성 세포주인 RaJi에 농도 의존적으로 처리하고, CD19 양성 세포주인 RaJi에 결합한 항체 단편은 항-인간 IgG-FITC를 이용하여 염색하였다. RaJi 세포주에 결합한 항체 단편에 대한 분석은 유세포 분석기를 통하여 측정하였으며(도 4), 결합능의 분석은 Graphpad Prism으로 수행하였다(표 4). 이를 통해서 CD19_8.1 대비 결합능이 향상된 항체들을 확보하였다.
친화도 증진된 항체 단편 3종에 대한 RaJi 세포주에서의 결합능(EC50)
CD19_8.1 C2 E3 2F1
EC50
(nM)		 57.4 61.2 26.1 10.5
실시예 3: 개발된 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체를 포함하는 렌티바이러스의 제작
개발된 항체 CD19_8.1을 이용하여 키메라 항원 수용체를 개발하였다. 키메라 항원 수용체는 CD8 리더, scFv 형태의 CD19_8.1, CD8 힌지 영역, CD137 막관통 영역 및 세포질 영역, 및 CD3제타의 세포질 영역을 코돈 최적화한 후 pLenti6-V5/DEST 렌티바이러스 벡터 (Invitrogen, 미국)에 SpeI/XhoI으로 절단 및 결찰시켰다. 제조된 컨스트럭트(서열목록 제181서열)는 염기서열 분석을 통해 확인하였다.
제조된 렌티바이러스 컨스트럭트를 바이러스 외피 단백질인 VSV-G(vesicular stomatitis indiana virus G protein)를 코딩하는 핵산과 gag, pol 및 rev 유전자를 포함하는 플라스미드인 pCMV-dR8.91과 함께 Lenti-X 293T(Takara Bio Inc., 일본) 세포주에 형질도입시켰다. 형질도입은 리포펙타민 2000(Invitrogen, 미국)을 사용하여 제조사의 프로토콜대로 수행하였다. 72시간 후, 렌티바이러스가 함유된 배양액을 원심분리형 필터장치(Millipore, 미국)를 사용하여 10배 농축하여 보관하였다.
실시예 4. 개발된 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체가 표면에 제시된 세포독성 T 세포의 제조
실시예 3에서 제조된 바이러스를 이용하여, CD19_8.1 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체가 표면에 제시된 세포독성 T 세포를 제조하였다.
먼저, 인간의 naive T 세포를 분리하여 Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28(Thermofisher scientific, 미국)로 24시간 동안 자극하고, 폴리브렌(Sigma-Aldrich, 미국)이 포함된 렌티바이러스를 상기 세포에 첨가하여 24시간 동안 배양하며 형질도입 시킨다. 이후, 인터루킨-2(Gibco, 미국)가 포함된 배지로 교체하여 5% CO2, 37℃의 조건에서 배양하였다. 그 후, CD19_8.1 단편이 연결된 키메라 항원 수용체의 형질 도입을 키메라 항원 수용체를 구성하는 CD3z 항체(BD, 미국)와 특수 단백질 검출 검사(Western blot) 방법을 이용하여 분석하였다(도 5). 이렇게 제조된 CD19_8.1 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체가 표면에 제시된 T 세포는, 제조 후 24시간 이내로 이후의 실험에 사용하였다.
실시예 5. 개발된 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체가 표면에 제시된 세포독성 T 세포의 활성 확인
실시예 3에서 제조한 키메라 항원 수용체가 표면에 제시된 세포독성 T세포를 사용하여, 상기 T 세포가 세포 표면의 CD19을 인식함으로써, 키메라 항원 수용체 세포의 활성화를 유도하는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 실험은 CD19 양성 세포주인 RaJi와 CD19 음성 세포주인 Jurkat E6.1 세포주를 10% 소태아혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 RPMI-1640배지에 배양하여 사용하였다. 먼저, CD19 양성 혹은 음성 세포주를 바닥이 둥근 형태의 96-웰 플레이트에 웰 당 3x104개가 되도록 분주하였다. 배양 상등액을 제거한 뒤, 웰 당 처리 비율에 맞게 제조한 키메라 항원 수용체 T세포를 첨가하고, 5% CO2 및 37℃의 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 그 결과, 배지에 분비된 인터페론 감마의 양을 ELISA 키트를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 측정하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 이때, 대조군으로서 세포를 배양하지 않은 플레이트에 키메라 항원 수용체 T 세포를 첨가한 군(Effector T cell only), 세포를 배양한 플레이트에 아무것도 첨가하지 않은 군(Target cell only)을 사용하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, CD19_8.1 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체 T 세포와 CD19 양성 세포주에서 인터페론 감마의 분비가 유의적으로 증가함을 확인하였다.
실시예 6. 개발된 항체 단편에 대한 친화도 증진 항체 개발
CD19_8.1_2F1를 기반으로 제 2,3중쇄와 제 1경쇄 라이브러리를 조합하여 새로운 서브 라이브러리를 제작하였다. 서브 라이브러리를 생성하기 위하여, NNK 동의 코돈(degenerate codons)을 함유하는 올리고뉴클레오티드가 사용되었으며, 이 때 CD19_8.1_2F1의 서열이 70% 이상 유지되도록 하였다. CD19_8.1_2F1 항체 단편을 template DNA로 사용하였다. 동의 코돈을 이용한 다양성은 PCR에 의해 3개의 CDR에 도입되었다. 증폭된 항체 단편은 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, 미국)에 의해 정제되었다. 항체 단편 및 pComb3XSS 벡터는 sfiⅠ 제한 효소로 절단되었고 라이게이션 후 ER2537에 형질 주입하여 파지 라이브러리를 제작하였다. 제작된 파지 라이브러리를 기반으로 실시예 1과 동일한 방법으로 항체를 선별하였다. 개발된 항체들의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역의 아미노산 서열은 표 5와 같다.
2F1 기반 서브 라이브러리로부터 도출된 항체의 중쇄 CDR과 경쇄 CDR부위의 아미노산 서열
항체 제2중쇄 제3중쇄 제1경쇄
CD19_8.1_3C12 GIYYDGSAKYYADSVKG
(SEQ ID NO: 190)		 GPNFCNDRTCSYYYAMDV
(SEQ ID NO: 191)		 YGQPSNIGSNAVY
(SEQ ID NO: 199)
CD19_8.1_6F10 GIYYDGSAKYYADSVKG GPLFCNDRTCSYYYAMDV
(SEQ ID NO: 192)		 YGQPSNIGSNAVY
CD19_8.1_7D2 GIYYDGSAKYYADSVKG GPLFCNDNTCSYYYAMDV
(SEQ ID NO: 193)		 YGQPSNIGSNAVY
CD19_8.1_7H11 GIYYDGSAKYYADSVKG GPLFCNDDTCSYYYAMDV
(SEQ ID NO: 194)		 YGQPSNIGSNAVY
CD19_8.1_8E8 GIYYDGSAKYYADSVKG GPLFCNDRDCSYYYAMDV
(SEQ ID NO: 195)		 YGQPSNIGSNAVY
CD19_8.1_10D3 GIYYDGSAKYYADSVKG GPLFCNDRTCSMYYAMDV
(SEQ ID NO: 196)		 TGGPSNIGSNAVY
(SEQ ID NO: 200)
CD19_8.1_10E5 GIYYDGSAKYYADSVKG GPLFCNDRTCSMYYAMDV
(SEQ ID NO: 197)		 YGQPSNIGSNAVY
CD19_8.1_10H4 GIYYDGSAKYYADSVKG GPLFCNDRTCSKYYAMDV
(SEQ ID NO: 198)		 YGQPSNIGSNAVY
개발된 항체 단편들을 카파 경쇄 융합 단백질 형태로 FreeStyleTM 293F 세포주를 이용하여 생산하였으며, 실시예 2와 동일한 방법으로 CD19-ECD-Fc에 대한 결합능을 확인하였으며(도 7), 결합능의 분석은 Graphpad Prism으로 수행하였다(표 6).
친화도 증진된 항체의 CD19-ECD-Fc에 대한 결합능(EC50)
항체 EC50 (nM)
CD19_8.1_3C12 2.99
CD19_8.1_6F10 14.22
CD19_8.1_7D2 7.68
CD19_8.1_7H11 10.49
CD19_8.1_8E8 9.75
CD19_8.1_10D3 6.98
CD19_8.1_10E5 7.01
CD19_8.1_10H4 13.88
친화도 증진이 이루어진 항체 단편에 대해 CD19 양성 세포주인 RaJi 세포주에 대한 결합능을 유세포분석법으로 확인하였다. 정제된 항체 단편을 CD19 양성 세포주인 RaJi에 농도 의존적으로 처리하고, 결합한 항체 단편은 항-인간 카파 경쇄-FITC (BD bioscience, 미국)를 이용하여 염색하였다. RaJi 세포주에 결합한 항체 단편 중, 세포 결합능이 우수한 3종에 대한 분석은 유세포 분석기를 통하여 측정하였으며(도 8), 결합능의 분석은 Graphpad Prism으로 수행하였다(표 7). 이를 통해서 CD19_8.1 대비 결합능이 향상된 항체들을 확보하였다.
친화도 증진된 3종 항체 단편의 RaJi 세포주에서의 결합능(EC50)
항체 EC50 (nM)
CD19_8.1_3C12 3.89
CD19_8.1_6F10 22.21
CD19_8.1_7D2 10.02
실시예 7: 친화도 증진이 이루어진 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체를 포함하는 렌티바이러스의 제작
개발된 항체 중 친화도가 향상된 CD19_8.1_3C12를 이용하여 키메라 항원 수용체를 개발하였다. 키메라 항원 수용체는 CD8 리더, scFv 형태의 개발된 항체, CD8 힌지 및 막관통 영역, CD137 세포질 영역, 및 CD3제타의 세포질 영역을 GeneOptimizer(Invitrogen) 알고리즘을 이용하여 코돈 최적화한 후 프로모터가 EF-1 alpha로 변경된 pLenti6.3/V5-TOPO 렌티바이러스 벡터 (Invitrogen, 미국)에 SpeI/PacI으로 절단 및 결찰시켰다. 제조된 컨스트럭트는 염기서열 분석을 통해 확인하였다.
제조된 렌티바이러스 컨스트럭트를 바이러스 외피 단백질인 VSV-G(vesicular stomatitis indiana virus G protein)를 코딩하는 핵산과 gag, pol 및 rev 유전자를 포함하는 플라스미드인 pCMV-dR8.91과 함께 Lenti-X 293T(Takara Bio Inc., 일본) 세포주에 형질도입시켰다. 형질도입은 리포펙타민 2000(Invitrogen, 미국)을 사용하여 제조사의 프로토콜대로 수행하였다. 렌티바이러스가 함유된 배양액을 Lenti-X concentrator(Takara Bio Inc., 일본)를 사용하여 농축하여 보관하였다.
실시예 8. 친화도 증진이 이루어진 항체 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체가 표면에 제시된 세포독성 T 세포의 제조 및 활성 확인
실시예 7에서 제조된 렌티바이러스를 이용하여, CD19_8.1_3C12 항체 단편(scFv)을 포함하는 키메라 항원 수용체가 표면에 제시된 세포독성 T 세포를 제조하였다. 이를 통하여 키메라 항원 수용체가 표면에 제시된 세포독성 T세포들을 사용하여, 상기 T 세포가 세포 표면의 CD19을 인식함으로써, 키메라 항원 수용체 세포의 활성화를 유도하는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, CD19 양성 세포주인 RaJi에 GFP-Luciferase가 발현되도록 렌티바이러스를 도입하여 유전자 도입 세포주인 RaJi-Luc 세포주를 구축하여 실험에 사용하였다. 먼저, RaJi-Luc 세포주를 바닥이 둥근 형태의 96-웰 플레이트에 웰 당 3x104개가 되도록 분주하였다. RaJi-Luc 세포주가 분주된 플레이트에 웰 당 처리 비율에 맞게 제조한 세포독성 T세포를 첨가하고, 5% CO2 및 37℃의 조건으로 24시간 동안 같이 배양하였다. 배양 후, 배지에 분비된 인터페론 감마의 양을 ELISA 키트를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 측정하였고, 세포독성 T세포의 독성 효과를 luciferase 측정(Bio-Glo Luciferase assay system, Promega, 미국)을 통하여 확인하였다.
도 9에 나타난 바와 같이, 본 발명의 항체 단편을 포함하는 세포독성 T 세포와 RaJi-Luc가 1:5의 비율로 처리된 실험군에서 인터페론 감마의 분비가 유의적으로 증가함을 확인하였다. 본 발명의 항체 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체의 세포 독성 효과는 세포독성 T 세포와 RaJi-Luc의 배양 후, 남아있는 RaJi-Luc 세포주를 3X Lysis buffer(75 mM Tris(pH8.0), 30% glycerol, 3% Triton X100)로 파쇄하여 용출되어 나오는 luciferase를 substrate와 반응시켜 확인하였다. Raji-Luc 세포만 배양한 well에서 나오는 signal을 100%로 하여 lysis 비율을 결정하였다. 본 발명의 항체 단편이 포함된 키메라 항원 수용체 T 세포에서는 처리 비율에 따라 세포 독성 효과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다 (도 10).
<110> AbClon Inc. <120> B Cell Malignancy Recognizing Antibody or Antigen Binding Fragment Thereof, Chimeric Antigen Receptor Comprising The Same and Uses Thereof <130> PN170346P <150> KR 10-2017-0178559 <151> 2017-12-22 <160> 200 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRH1 of CD19_8.1 antibody <400> 1 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRH2 of CD19_8.1 antibody <400> 2 Gly Ile Tyr Tyr Asp Asp Ser Ser Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRH3 of CD19_8.1 antibody <400> 3 Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr Ala Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRL1 of CD19_8.1 antibody <400> 4 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRL2 of CD19_8.1 antibody <400> 5 Asp Asp Asn His Arg Pro Ser 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRL3 of CD19_8.1 antibody <400> 6 Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRH2 of affinity matured clone 2B1 <400> 7 Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ala Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRH2 of affinity matured clone B12 <400> 8 Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ala Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRH2 of affinity matured clone T2H3 <400> 9 Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ala Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRH2 of affinity matured clone T3C1 <400> 10 Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ala Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRH2 of affinity matured clone D10 <400> 11 Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ala Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRH2 of affinity matured clone F6 <400> 12 Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ala Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRH2 of affinity matured clone B2 <400> 13 Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRH2 of affinity matured clone B6 <400> 14 Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 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Asp Gly Ser Ser Gln Thr Leu Leu Pro Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRH2 of affinity matured clone A7 <400> 20 Gly Ile Tyr Tyr Asp Ala Ser Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRH2 of affinity matured clone D12 <400> 21 Gly Ile Tyr Tyr Asp Ala Ser Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRH2 of affinity matured clone E2 <400> 22 Gly Ile Tyr Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRH2 of affinity matured clone T2A1 <400> 23 Gly Ile Tyr Tyr Asp Ala Ser Val Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRH2 of affinity matured clone T3H9 <400> 24 Gly Ile Tyr Tyr Asp Ala Ser Ala Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRH2 of affinity matured clone 2G1 <400> 25 Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Thr Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRH2 of affinity matured clone C4 <400> 26 Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Met Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRH2 of affinity matured clone C5 <400> 27 Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Met Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRH2 of affinity matured clone D1 <400> 28 Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Ala Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 29 <211> 17 <212> PRT 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Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRL1 of affinity matured clone C8 <400> 58 Lys Gly Gly Met Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr 1 5 10 <210> 59 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRL1 of affinity matured clone D4 <400> 59 Thr Gly Gly Val Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr 1 5 10 <210> 60 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRL1 of affinity matured clone B5 <400> 60 His Gly Thr Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr 1 5 10 <210> 61 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRL1 of affinity matured clone G4 <400> 61 Val Gly Lys Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr 1 5 10 <210> 62 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRL1 of affinity matured clone A7 <400> 62 Thr Gly Asn Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr 1 5 10 <210> 63 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRL1 of affinity matured clone D12 <400> 63 Arg Gly Ser Ala Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr 1 5 10 <210> 64 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRL1 of affinity matured clone E2 <400> 64 Lys Gly Met Ile Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr 1 5 10 <210> 65 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRL1 of affinity matured clone T2A1 <400> 65 Ala Gly Lys Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr 1 5 10 <210> 66 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRL1 of affinity matured clone T3H9 <400> 66 Ser Gly Met Leu Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr 1 5 10 <210> 67 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRL1 of affinity matured clone 2G1 <400> 67 Lys Gly Ser Phe Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr 1 5 10 <210> 68 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRL1 of affinity matured clone 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Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRL1 of affinity matured clone A10 <400> 84 Ser Gly Asp Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr 1 5 10 <210> 85 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRL1 of affinity matured clone T3H1 <400> 85 Asp Gly Gly Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr 1 5 10 <210> 86 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRL1 of affinity matured clone B1 <400> 86 Val Gly Ser Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr 1 5 10 <210> 87 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRL1 of affinity matured clone B7 <400> 87 Arg Gly Thr Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr 1 5 10 <210> 88 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRL1 of affinity matured clone D8 <400> 88 Val Gly Asn Leu Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr 1 5 10 <210> 89 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRL1 of affinity matured clone E12 <400> 89 Ala Gly Ser Ala Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr 1 5 10 <210> 90 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDRL1 of affinity matured clone T2A12 <400> 90 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Ala Pro Thr Tyr 1 5 10 <210> 91 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of heavy chain variable region of CD19_8.1 antibody <400> 91 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Asp Ser Ser Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Ala Met Asp Val 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<210> 124 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of heavy chain variable region of affinity matured clone E3 <400> 124 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Thr Ala Met Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 125 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of heavy chain variable region of affinity matured clone H10 <400> 125 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser 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128 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of heavy chain variable region of affinity matured clone T3H1 <400> 128 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ala Val Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 129 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of heavy chain variable region of affinity matured clone B1 <400> 129 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys 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<211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of heavy chain variable region of affinity matured clone E12 <400> 132 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Tyr Tyr Asp Ser Phe Val Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 133 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of heavy chain variable region of affinity matured clone T2A12 <400> 133 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys 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<400> 148 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Asn Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 149 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region of affinity matured clone D12 <400> 149 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Gly Ser Ala Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser 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clone T2A1 <400> 151 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ala Gly Lys Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 152 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region of affinity matured clone T3H9 <400> 152 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Met Leu Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 153 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region of affinity matured clone 2G1 <400> 153 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Gly Ser Phe Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 154 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region of affinity matured clone C4 <400> 154 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Gly Gly Gln Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 155 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region of affinity matured clone C5 <400> 155 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Gly Gly Met Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 156 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region of affinity matured clone D1 <400> 156 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 157 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region of affinity matured clone D2 <400> 157 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Gln Gly Gln Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 158 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region of affinity matured clone E1 <400> 158 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Asn Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 159 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region of affinity matured clone F3 <400> 159 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Ala 20 25 30 Pro Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 160 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region of affinity matured clone T2C1 <400> 160 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Gly Gly Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 161 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region of affinity matured clone T2H1 <400> 161 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Gln Gly Gly Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 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variable region of affinity matured clone T3B8 <400> 163 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Glu Gly Ser Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 164 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region of affinity matured clone A12 <400> 164 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Gln Gly Gly Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 165 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region of affinity matured clone C2 <400> 165 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Gly Leu Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 166 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region of affinity matured clone D7 <400> 166 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Glu Gly Gln Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 167 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region of affinity matured clone E3 <400> 167 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 168 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region of affinity matured clone H10 <400> 168 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Leu Gly Gly Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 169 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region of affinity matured clone T3F5 <400> 169 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys His Gly Gln Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 170 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region of affinity matured clone A10 <400> 170 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Asp Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg 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Amino acid sequence of light chain variable region of affinity matured clone B1 <400> 172 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Val Gly Ser Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 173 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region of affinity matured clone B7 <400> 173 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Gly Thr Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn 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<223> Amino acid sequence of light chain variable region of affinity matured clone E12 <400> 175 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ala Gly Ser Ala Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 176 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region of affinity matured clone T2A12 <400> 176 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Ala 20 25 30 Pro Thr Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 177 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for encoding CD8 leader <400> 177 atggccctgc ctgtgaccgc tctgctgctg cccctggctc tgctgctgca cgccgctcgc 60 60 <210> 178 <211> 207 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for encoding CD8 hinge/transmembrain domain <400> 178 accacaactc cagctccccg gccccctacc cctgcaccaa caatcgccag ccagcctctg 60 tccctgagac cagaggcatg taggccagct gcaggaggag cagtgcatac aagaggcctg 120 gacttcgcct gcgatatcta catttgggct cctctggcag gaacttgtgg cgtgctgctg 180 ctgtctctgg tcatcaccct gtactgc 207 <210> 179 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for encoding intracellular domain of CD137 <400> 179 aaaaggggcc gcaagaaact gctgtatatt ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 60 accacacagg aggaagacgg gtgctcctgt agattccccg aggaagagga aggcgggtgt 120 gagctg 126 <210> 180 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for encoding intracellular domain of CD3-zeta <400> 180 cgcgtcaagt tcagccgatc agccgatgct cctgcataca agcagggcca gaatcagctg 60 tataacgagc tgaatctggg gcgccgagag gaatacgacg tgctggataa gcggagaggg 120 agggaccccg aaatgggagg caaacctagg cgcaagaacc cacaggaggg actgtacaat 180 gaactgcaga aggacaaaat ggccgaggct tattccgaaa ttgggatgaa aggagagcga 240 cggagaggga agggacacga tgggctgtat cagggactgt ctaccgccac taaagatacc 300 tacgacgctc tgcacatgca ggctctgcca cctcgc 336 <210> 181 <211> 1518 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of CAR construct comprising CD19_8.1 scFv <400> 181 atggccctgc ctgtgaccgc tctgctgctg cccctggctc tgctgctgca cgccgctcgc 60 cccgtggccc aggcggccga ggtgcagctg ttggagtctg ggggaggctt ggtacagcct 120 ggggggtccc tgagactctc ctgtgcagcc tctggattca cctttagcga ttattatatg 180 agctgggtcc gccaggctcc agggaagggg ctggagtggg tctcagggat ctattatgat 240 gatagtagtc aatattacgc tgattctgta aaaggtcggt tcaccatctc cagagacaat 300 tccaagaaca cgctgtatct gcaaatgaac agcctgagag ccgaggacac ggccgtgtat 360 tactgtgcga aaggtcctct tttttgtaat gatcggactt gttcttatta ttatgctatg 420 gacgtctggg gccagggtac actggtcacc gtgagctcag gtggaggcgg ttcaggcgga 480 ggtggatccg gcggtggcgg atcgcagtct gtgctgactc agccaccctc agcgtctggg 540 acccccgggc agagggtcac catctcttgt actggctctt catctaatat tggcagtaat 600 gctgtctact ggtaccagca gctaccagga acggccccca aactcctcat ctatgatgat 660 aatcatcggc caagcggggt ccctgaccga ttctctggct ccaagtctgg cacctcagcc 720 tccctggcca tcagtgggct ccggtccgag gatgaggctg attattactg tggtacctgg 780 gattatagcc tgagtggtta tgtcttaggc ggaggcacca agctgacggt cctaggccag 840 gccggccaga ccacaactcc agctccccgg ccccctaccc ctgcaccaac aatcgccagc 900 cagcctctgt ccctgagacc agaggcatgt aggccagctg caggaggagc agtgcataca 960 agaggcctgg acttcgcctg cgatatctac atttgggctc ctctggcagg aacttgtggc 1020 gtgctgctgc tgtctctggt catcaccctg tactgcaaaa ggggccgcaa gaaactgctg 1080 tatattttca agcagccctt catgcggccc gtgcagacca cacaggagga agacgggtgc 1140 tcctgtagat tccccgagga agaggaaggc gggtgtgagc tgcgcgtcaa gttcagccga 1200 tcagccgatg ctcctgcata caagcagggc cagaatcagc tgtataacga gctgaatctg 1260 gggcgccgag aggaatacga cgtgctggat aagcggagag ggagggaccc cgaaatggga 1320 ggcaaaccta ggcgcaagaa cccacaggag ggactgtaca atgaactgca gaaggacaaa 1380 atggccgagg cttattccga aattgggatg aaaggagagc gacggagagg gaagggacac 1440 gatgggctgt atcagggact gtctaccgcc actaaagata cctacgacgc tctgcacatg 1500 caggctctgc cacctcgc 1518 <210> 182 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for encoding CDRH1 of CD19_8.1 antibody <400> 182 gattattata tgagc 15 <210> 183 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for encoding CDRH2 of CD19_8.1 antibody <400> 183 gggatctatt atgatgatag tagtcaatat tacgctgatt ctgtaaaagg t 51 <210> 184 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for encoding CDRH3 of CD19_8.1 antibody <400> 184 ggtcctcttt tttgtaatga tcggacttgt tcttattatt atgctatgga cgtc 54 <210> 185 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for encoding CDRL1 of CD19_8.1 antibody <400> 185 actggctctt catctaatat tggcagtaat gctgtctac 39 <210> 186 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for encoding CDRL2 of CD19_8.1 antibody <400> 186 gatgataatc atcggccaag c 21 <210> 187 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for encoding CDRL3 of CD19_8.1 antibody <400> 187 ggtacctggg attatagcct gagtggttat gtc 33 <210> 188 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for encoding heavy chain variable region of CD19_8.1 antibody <400> 188 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc gattattata tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggg atctattatg atgatagtag tcaatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaggtcct 300 cttttttgta atgatcggac ttgttcttat tattatgcta tggacgtctg gggccagggt 360 acactggtca ccgtgagctc a 381 <210> 189 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for encoding light chain variable region of CD19_8.1 antibody <400> 189 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtactg gctcttcatc taatattggc agtaatgctg tctactggta ccagcagcta 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gatgataatc atcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt acctgggatt atagcctgag tggttatgtc 300 ttaggcggag gcaccaagct gacggtccta 330 <210> 190 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of CD19_8.1_3C12, 6F10, 7D2, 7H11, 8E8, 10D3, 10E5, 10H4 <400> 190 Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Ala Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 191 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of CD19_8.1_3C12 <400> 191 Gly Pro Asn Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr Ala Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 192 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of CD19_8.1_6F10 <400> 192 Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr Ala Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 193 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of CD19_8.1_7D2 <400> 193 Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Asn Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr Ala Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 194 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of CD19_8.1_7H11 <400> 194 Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Asp Thr Cys Ser Tyr Tyr Tyr Ala Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 195 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of CD19_8.1_8E8 <400> 195 Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Asp Cys Ser Tyr Tyr Tyr Ala Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 196 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of CD19_8.1_10D3 <400> 196 Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Met Tyr Tyr Ala Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 197 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of CD19_8.1_10E5 <400> 197 Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Met Tyr Tyr Ala Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 198 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of CD19_8.1_10H4 <400> 198 Gly Pro Leu Phe Cys Asn Asp Arg Thr Cys Ser Lys Tyr Tyr Ala Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 199 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of CD19_8.1_3C12, 6F10, 7D2, 7H11, 8E8, 10E5, 10H4 <400> 199 Tyr Gly Gln Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr 1 5 10 <210> 200 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of CD19_8.1_10D3 <400> 200 Thr Gly Gly Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Tyr 1 5 10

Claims (20)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. (a) 서열목록 제1서열의 CDRH1, CDRH2, 및 서열목록 제3서열의 CDRH3를 포함하는 중쇄가변영역; 및
    (b) CDRL1, 서열목록 제5서열의 CDRL2 및 서열목록 제6서열의 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 있어서,
    상기 CDRH2 및 CDRL1은 각각 제7서열 및 제49서열; 제8서열 및 제50서열; 제9서열 및 제51서열; 제10서열 및 제52서열; 제11서열 및 제53서열; 제12서열 및 제54서열; 제13서열 및 제55서열; 제14서열 및 제56서열; 제15서열 및 제57서열; 제16서열 및 제58서열; 제17서열 및 제59서열; 제18서열 및 제60서열; 제19서열 및 제61서열; 제20서열 및 제62서열; 제21서열 및 제63서열; 제22서열 및 제64서열; 제23서열 및 제65서열; 제24서열 및 제66서열; 제25서열 및 제67서열; 제26서열 및 제68서열; 제27서열 및 제69서열; 제28서열 및 제70서열; 제29서열 및 제71서열; 제30서열 및 제72서열; 제31서열 및 제73서열; 제35서열 및 제74서열; 제33서열 및 제75서열; 제34서열 및 제76서열; 제35서열 및 제77서열; 제36서열 및 제78서열; 제37서열 및 제79서열; 제38서열 및 제80서열; 제39서열 및 제81서열; 제40서열 및 제82서열; 제41서열 및 제83서열; 제42서열 및 제84서열; 제43서열 및 제85서열; 제44서열 및 제86서열; 제45서열 및 제87서열; 제46서열 및 제88서열; 제47서열 및 제89서열; 또는 제48서열 및 제90서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 4 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역(VH)은 서열목록 제92서열 내지 제133서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  9. 제 4 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역(VL)은 서열목록 제135서열 내지 제176서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  10. 제 4 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL)은 각각 서열목록 제92서열 및 제135서열; 제93서열 및 제136서열; 제94서열 및 제137서열; 제95서열 및 제138서열; 제96서열 및 제139서열; 제97서열 및 제140서열; 제98서열 및 제141서열; 제99서열 및 제142서열; 제100서열 및 제143서열; 제101서열 및 제144서열; 제102서열 및 제145서열;제103서열 및 제146서열; 제104서열 및 제147서열; 제105서열 및 제148서열; 제106서열 및 제149서열; 제107서열 및 제150서열; 제108서열 및 제151서열; 제109서열 및 제152서열; 제110서열 및 제153서열; 제111서열 및 제154서열; 제112서열 및 제155서열; 제113서열 및 제156서열; 제114서열 및 제157서열; 제115서열 및 제158서열; 제116서열 및 제159서열; 제117서열 및 제160서열; 제118서열 및 제161서열; 제119서열 및 제162서열; 제120서열 및 제163서열; 제121서열 및 제164서열; 제122서열 및 제165서열; 제123서열 및 제166서열; 제124서열 및 제167서열; 제125서열 및 제168서열; 제126서열 및 제169서열; 제127서열 및 제170서열; 제128서열 및 제171서열; 제129서열 및 제172서열; 제130서열 및 제173서열; 제131서열 및 제174서열; 제132서열 및 제175서열; 또는 제133서열 및 제176서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  11. (a) 서열목록 제1서열의 CDRH1, 서열목록 제190서열의 CDRH2, 및 CDRH3를 포함하는 중쇄가변영역; 및
    (b) CDRL1, 서열목록 제5서열의 CDRL2 및 서열목록 제6서열의 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 있어서,
    상기 CDRH3는 서열목록 제191서열 내지 제198서열의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 CDRL1은 서열목록 제199서열 또는 제200서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제4항, 및 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자.
  15. 제 14 항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  16. 제 15 항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  17. 다음을 포함하는 CD19 특이적 키메라 항원 수용체:
    (a) 제4항, 및 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 세포외 도메인(Extracellular domain);
    (b) 막관통 도메인(transmembrane domain); 및
    (c) 세포내 신호전달 도메인.
  18. 제17항의 키메라 항원 수용체를 발현하는 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만 세포, NK-세포, B-림프구, 세포독성 T-림프구, 조절 T-림프구 및 헬퍼 T-림프구로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인간으로부터 단리된 효과기 세포.
  19. 제18항의 세포를 포함하는 B 세포 악성종양(B cell malignancy), 자가면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  20. 제4항, 및 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항-CD19 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 B 세포 악성종양(B cell malignancy), 자가면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
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