KR102114631B1 - 폐렴연쇄상구균의 Pep27에 특이적인 단일클론 항체 - Google Patents

폐렴연쇄상구균의 Pep27에 특이적인 단일클론 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폐렴연쇄상구균의 Pep27의 에피토프인 폴리펩타이드 및 이에 특이적으로 결합하는 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 상기 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 에피토프 영역에 특이적으로 결합하며, 다른 항체들에 비해 결합 친화도가 우수하므로, 다른 불변 부위와 결합하여 사용하거나, 유사 항체로도 이용할 수 있다. 따라서, 폐렴연쇄상구균 감염증의 예방 또는 치료에 효과적이므로 관련 약학 산업에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

폐렴연쇄상구균의 Pep27에 특이적인 단일클론 항체{MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST PEP27 OF STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE}
본 발명은 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae)의 Pep27 단백질의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드 및 상기 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
지난 수십년에 걸쳐, 항미생물 내성의 빈도 및 심각한 감염성 질환과의 그의 관련성이 놀라운 비율로 증가된 바 있다. 미국에서 매년 발생하는 2백만건을 초과하는 병원내 감염 중에서, 50 내지 60%는 박테리아의 항미생물제-내성 균주로 인한 것이다. 통상적으로 사용되는 항박테리아제에 대한 내성의 높은 비율은 병원내 감염과 연관된 이환율, 사망률 및 비용을 증가시킨다.
폐렴연쇄상구균(S. pneumoniae)은 건강한 성인의 대략 5-10% 및 건강한 아동의 20-40%에서 비인두(nasopharynx)에 콜로니를 형성하는 그람-양성 피포된 구균이다. 통상의 콜로니화는 폐렴연쇄상구균(S. pneumoniae)이 유스타키오관, 비강, 폐, 혈류, 뇌막, 관절 공간, 뼈 및 복강 내로 운반될 때 감염성이 된다. 폐렴연쇄상구균(S. pneumoniae)은 면역계를 회피할 수 있게 하는 여러 독성 인자(virulence factor)를 갖는다. 실례에는 숙주 면역 세포에 의한 식작용(phagocytosis)을 예방하는 다당류 캡슐, 보체-매개된 옵소닌화(complement-mediated opsonization)를 저 해하는 프로테아제, 그리고 숙주 세포의 용해를 유발하는 단백질이 포함된다. 다당류 캡슐 내에서, 복잡한 다당류의 존재는 폐렴연쇄상구균을 상이한 혈청형(serotype)으로 분류하기 위한 기초를 제공한다. 현재까지, 폐렴연쇄상구균(S. pneumoniae)의 93가지 혈청형이 확인되었다. 폐렴연쇄상구균은 대표적인 지역감염성（Community-acquired) 폐렴을 일으키는 균으로서, 조건에 따라 치사율이 30％ 이상의 치명적인 질환 원인균으로서 가장 검출빈도가 높은 균이며, 일본뿐만이 아니라 전세계적으로도 이환율(morbidity), 사망률이 높은 원인균 중 하나이다. 폐렴연쇄상구균은 중이염, 정맥동염, 만성기관지염의 급성적 악화 및 세균성 폐렴을 포함하는 호흡기계 감염증의 가장 공통적인 세균원이고, 폐렴, 뇌수막염, 균혈증, 열성 세균혈증, 중이염, 부비강염 및 기관지염의 원인으로 알려져 있다. 매년, 수백만 건의 폐렴(pneumonia), 수막염(meningitis), 균혈증(bacteremia), 그리고 중이염(otitis media) 사례가 병원균 폐렴연쇄상구균(Streptococcus Pneumoniae)으로 감염에 기인한다. 폐렴연쇄상구균 감염증은 빈도가 높을 뿐만 아니라 쉽게 중증화하기 때문에, 치료 개시시의 적절한 항균약 선택이 중요하다. 또, 감염증 치료의 원칙에서 보아도 원인균을 가능한 한 조기에 확정하는 것은 적확한 치료법을 조기에 선택할 수가 있으므로, 예후의 개선, 의료비용의삭감, 내성균 발현 방지로 이어 지기 때문에 중요하다. 또한, 이에, 약 50여년 동안 폐렴연쇄상구균의 치료를 위해서 강력한 항생제들이 용이하게 이용되어 왔지만, 전신적 감염증의 이환율 및 사망율은 특히 노인 환자들에서는 거의 그대로 유지되고 있다. 또한, 폐렴연쇄상구균 감염은 공통적으로 재발성이다. 현재 폐렴연쇄상구균의 치료는 시험관내 활성, 항 미생물 내성, 및 감염에 대한 증가된 감수성을 갖는 약제의 제한된 효능으로 인하여 문제가 되고 있다.
폐렴연쇄상구균의 구조에 대해서는 Sorensen 등에 의해 상세히 보고되어 있다 (Sorensen, Danish Medical Bulletin 42:47-53(1995)). 균의 가장 외측에는 협막(capsular)이 위치하고, 협막에는 협막다당이라고 하는 다당항원이 결찰(Ligate)된다. 이 협막다당의 구조의 차이에 근거하여 수십 종류 이상의 혈청형이 보고되어 있다. 한편, 협막의 안쪽에는 세포벽(Cell wall) 및 세포막(Plasma membrane)이 순차적으로 위치하고 있고, 세포벽에는 C-ps(C-polysaccharide)가, 또 세포막에는 F항원(antigen)이라고 하는 테이코산 또는 리포테이코산이 각각 결찰하고 있다. Cps는 모든 폐렴연쇄상구균에서 보존되어 있는 공통 항원으로 알려져 있고, 또 F-항원의 다당 부분은 C-ps와 동일한 당의 서열을 갖는다는 것이 보고되어 있다. Pep27은 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae)에 감염된 숙주에서 생산되는 자가분해-유도 인자(autolysis-inducing factor)로 Vex(ABCtransporter)에 의해 세포 밖으로 운송되며, VncS(Input sensing domain)의 활성화를 유도하고, 활성화된 VncS이 VncR(Regulator of LytA)를 탈인산화(dephosphorylation)시킴으로써 자기분해효소(autolysin)인 LytA를 활성화시키고, 자가분해되어 폐렴연쇄상구균용혈소(pneumolysin)와 같은 유독성 인자를 방출한다. 즉, Pep27은 폐렴연쇄상구균의 병독성에 필수적이다.
한편, 항체의약품은 높은 치료 효과 및 표적 치료성 등으로 인해 바이오 의약품 분야에서도 가장 급속도로 성장 중이다. 항체의약품의 세계 시장 규모는 연평균 10-15%의 성장을 지속하고 있는 가운데, 2010년 447억 달러의 시장을 형성한 것으로 알려져 있다. 항체의약품의 주요 표적이 되는 질환은 대부분이 난치성암(49%) 및 면역질환(35%)과 같이 특정 질환 적응증에 집중되어 있어, 유사 적응증 제품간의 판매경쟁이 치열한 상황이다. 그럼에도 불구하고, 질환들 내 세분화되는 치료 표적들이 존재하기 때문에 향후에도 항암용 항체치료제 개발 분야는 성장세를 지속할 것으로 판단된다.
파지 디스플레이(Phage display), 이스트 디스플레이(Yeast display) 및 리보솜 디스플레이(Ribosomal display) 등의 항체 절편 디스플레이 기술은 인간화 항체의 개발 연구와 맞물려, 항체 후보물질을 발굴하기 위해 현재까지 다양한 전략으로 접근되는 방법이다. 1990년대 후반부터 인간항체 파지 라이브러리(Human Antibody Phage Library) 기술이 개발되어 지금까지 다양한 항체 개발 연구에 이용되고 있다. 이 중, 파지 디스플레이는 박테리오파지의 표면에 항체단편을 발현시켜 항체를 스크리닝하는 기술이며, 기존의 항체개발 기술(하이브리도마를 이용한 키메릭/인간화 항체 개발, 유전자 이식 트랜스제닉 마우스를 이용한 항체 개발)에 비해 단시간에 항원 특이적 항체를 동정할 수 있다는 장점이 있다. 높은 다양성의 라이브러리가 확보되어야 효과적인 항체를 동정할 수 있다는 단점이 있지만, 최근의 유전자 증폭 기술 및 클로닝 기술의 발달로 인해 라이브러리 확보는 상당 부분 해결되고 있다. 최근에는, 항체의 경쇄와 중쇄의 항원결합부위만을 다양한 사슬로 연결하여 발현시킨 단일 사슬 항체(single-chain fragment variable, scFv)의 연구가 활발히 이루어지고 있다. 단일 사슬 미니항체는 IgG와 달리, 하나의 폴리펩타이드 사슬로 구성되어 있어서, 대장균에서 대량 발현이 가능하고, 엔지니어링이 용이하며, 대규모 스크리닝을 하는데 적합한 시스템이라는 장점이 있기 때문이다. 한 가지의 항원은 수개 많게는 수십 개의 항체결합부위를 갖고 있기 때문에, 특정 항원을 인식할 수 있는 미니항체를 많이 개발하는 것은 항원 타겟 검지 효율을 증가시킬 수 있으므로 매우 중요하다고 할수 있다. 또한 이렇게 개발된 미니항체들은 각종 병원균 센서나 병원균 검지 키트, 의약 개발과 관련된 산업에 중요하게 사용될 수 있다. 이와 같이 scFv 분자를 이용한 선행 특허로는 혈관내피성장인자 수용체를 중화하는 인간 단클론항체에 대한 대한민국 등록특허 (제10-0883430호), 로타바이러스에 대한 단클론 항체에 대한 대한민국 등록특허 (제10-1750168호) 등이 보고되어 있으나, 폐렴연쇄상구균의 Pep27에 대한 항체 개발은 이루어지지 않은 실정이다.
본 발명의 목적은 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae)의 Pep27 단백질의 에피토프로서, 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 항- Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이를 코딩하는 핵산 분자를 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 재조합 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 폐렴연쇄상구균 감염증의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 폐렴연쇄상구균의 Pep27 단백질의 에피토프로서, 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
또한 본 발명은 항- Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
또한 본 발명은 재조합 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또한 본 발명은 폐렴연쇄상구균 감염증의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 폐렴연쇄상구균의 Pep27의 에피토프인 폴리펩타이드 및 이에 특이적으로 결합하는 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 상기 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 에피토프 영역에 특이적으로 결합하며, 다른 항체들에 비해 결합 친화도가 우수하므로, 다른 불변 부위와 결합하여 사용하거나, 유사 항체로도 이용할 수 있다. 따라서, 폐렴연쇄상구균 감염증의 예방 또는 치료에 효과적이므로 관련 약학 산업에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 바이오패닝을 위한 항원으로서 Pep27의 "R6" 및 "p28" 변이체의 아미노산 서열을 나타낸 도이다.
도 2는 5차 패닝 라운드에서 얻어진 양성 파아지 풀에 대한 폴리 파아지 ELISA의 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 5차 패닝 라운드에서 얻어진 양성 파아지 풀에 대한 폴리 파아지 ELISA의 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 scFv인 E2와 Pep27사이의 결합친화도(binding affinity)를 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 scFv인 F9와 Pep27사이의 결합친화도(binding affinity)를 확인한 도이다.
도 6은 scFv인 B12와 Pep27사이의 결합친화도(binding affinity)를 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 scFv E2 및 F9의 교차반응성을 확인하기 위하여, 대조군으로 GST-PspA, ClpL 및 IlvC(다른 폐렴 구균 단백질), MBP 및 BSA 단백질(폐렴 구균과 관련성이 없는 단백질), 항원으로서 정제된 His6-MBP-Pep27에 대한 면역 블로팅을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 scFv E2 및 F9의 항원인 His6-MBP-Pep27에 결합하는 아미노산 부위를 확인하기 위하여, 서열번호 35의 아미노산 서열 중 1-9, 1-14 및 1-18로 제작한 뒤 결합을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 확인한 도이다:
(1-9: Pep27의 1번부터 9번까지의 아미노산으로 이루어진 컨스트럭트(construct); 1-14: Pep27의 1번부터 14번까지의 아미노산으로 이루어진 컨스트럭트; 1-18: Pep27의 1번부터 18번까지의 아미노산으로 이루어진 컨스트럭트; 및
1-27: 전장의 His6-MBP-Pep27).
도 9는 도 7은 본 발명의 scFv E2 및 F9의 항원인 His6-MBP-Pep27에 결합하는 아미노산 부위를 확인한 도이다:
(R19A: His6-MBP-Pep27의 19번째 아미노산 R(arginine)을 A(alanine)로 치환한 컨스트럭트; P20A: His6-MBP-Pep27의 20번째 아미노산 P(proline)을 A로 치환한 컨스트럭트; R22A: His6-MBP-Pep27의 22번째 아미노산 R을 A로 치환한 컨스트럭트; D23A: His6-MBP-Pep27의 23번째 아미노산 D(aspartic acid)을 A로 치환한 컨스트럭트; Y24A: His6-MBP-Pep27의 24번째 아미노산 Y(tyrosine)을 A로 치환한 컨스트럭트; N25A: His6-MBP-Pep27의 25번째 아미노산 N(asparagine)을 A로 치환한 컨스트럭트; R26A: His6-MBP-Pep27의 26번째 아미노산 R을 A로 치환한 컨스트럭트; K27A: His6-MBP-Pep27의 27번째 아미노산 K(lysine)을 A로 치환한 컨스트럭트; 및 WT: 아미노산을 치환하지 않은(wild-type) Pep27.)
도 10a는 scFv인 E2와 Pep27에 대한 에피토프 및 파라토프 영역을 확인하기 위하여, HADDOCK-유래 모델을 나타낸 도이다(초록색: N-터미널 및 C-터미널로서, Pep27의 헬릭스와 함께 라벨됨. 푸른색 : Pep27의 실험적으로 확인된 에피토프. 주황색 : scFv E2의 예측된 파라토프).
도 10b는 scFv인 E2와 Pep27에 대한 에피토프 영역에서 각 잔기를 확인하기 위하여, HADDOCK-유래 모델을 나타낸 도이다(초록색: N-터미널 및 C-터미널로서, Pep27의 헬릭스와 함께 라벨됨. 푸른색 : Pep27의 실험적으로 확인된 에피토프. 주황색 : scFv E2의 예측된 파라토프).
도 11a는 scFv인 F9와 Pep27에 대한 에피토프 및 파라토프 영역을 확인하기 위하여, HADDOCK-유래 모델을 나타낸 도이다(초록색: N-터미널 및 C-터미널로서, Pep27의 헬릭스와 함께 라벨됨. 푸른색 : Pep27의 실험적으로 확인된 에피토프. 주황색 : scFv F9의 예측된 파라토프).
도 11b는 scFv인 F9와 Pep27에 대한 에피토프 영역에서 각 잔기를 확인하기 위하여, HADDOCK-유래 모델을 나타낸 도이다(초록색: N-터미널 및 C-터미널로서, Pep27의 헬릭스와 함께 라벨됨. 푸른색 : Pep27의 실험적으로 확인된 에피토프. 주황색 : scFv F9의 예측된 파라토프).
도 12는 인간 혈청 내에서 scFv E2 및 F9 항체의 결합력을 확인할 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae)의 Pep27 단백질의 에피토프로서, 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.
본 명세서에서 용어, "에피토프(epitope)"는 특정 항체에 의한 인식에 연루된 아미노산 잔기 세트, 또는 T 세포의 정황에 있어서는 T 세포 수용체 단백질 및/또는 주요 조직적합성 복합체(Major Histocompatibility Complex, MHC) 수용체에 의한 인식에 필요한 잔기를 의미한다. 또한, 본 발명의 에피토프 보다 크며 본 발명의 에피토프를 포함하는 단리 또는 정제된 단백질 또는 폴리펩타이드 분자가 여전히 본 발명의 범위에 포함된다.
또한 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
상기 핵산 분자의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 유전자로서 사용될 수 있는 핵산분자는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 35의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 본 발명의 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열 목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
상기 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 도 1에 나타낸 바와 같이, Pep27는 아미노산 잔기 12 및 16가 상이한 "R6"서열(UniProt accession number Q8DQS1)은 R6 균주의 게놈 서열로부터 유도되고, "p28"서열(UniProt accession number Q9S4I9) VncRS 2 성분계(two-component system)를 통해 폐렴 구균(S. pneumonia)의 세포 사멸 프로그램을 개시한다. 따라서, 본 발명의 항체에 대한 바이오패닝을 수행하기 위하여, Pep27 항원으로서 His6-MBP-Pep27R6를 제작하고 합성 Pep27p28를 사용하였다. 또한, R6와 p28 각 아미노산 서열로 이루어진 두 가지 Pep27(서열번호 35 또는 서열번호 36에 해당)를 반응시켜, Pep27 특이적 scFv를 선별하였다.
상기 항원으로서 제작된 서열번호 35로 표시되는 His6-MBP-Pep27R6에 대한 본 발명의 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 특이적으로 결합하는 에피토프를 확인하기 위하여, 각 아미노산 서열 중 1-9, 1-14, 1-18 및 1-27로 나누어 각 9, 14, 18 및 27번째 아미노산을 스탑코돈으로 치환하여 본 발명의 scFv E2 및 F9 항체와의 결합력을 확인하였다. 따라서, 특이적 결합 부위는 18-27번째 아미노산이 최소한의 에피토프 영역임을 확인하였다. 그 중, 본 발명의 scFv E2 및 F9 항체에 대하여 24번 26번, 27번 아미노산이 결합에 중요한 부위임을 확인하였다.
또한 본 발명은 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 Pep27의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항- Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
상기 항체 또는 이의 단편은 서열번호 35로 표시되는 18-27번째 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 35로 표시되는 24번, 26번 또는 27번 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항원 결합 단편은 Fab, Fd, Fab', dAb, F(ab'), F(ab')2, scFv, Fv, 단일쇄 Fv 이량체 및 디아바디(diabody)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항체는 전체(whole) 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain)를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합(disulfide bond)으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 항체 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변영역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변영역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역(CH1)으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward ES et al., Nature 341:544-546 (1989)]; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); (viii) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) WO94/13804) 등을 포함한다.
본 발명에서 용어, 항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 "VH" 및 "VL" 로 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 (동일 부류의기타 항체와 비교 시) 항체의 가장 가변적인 부분이며, 항원 결합 부위를 포함한다.
본 발명에서 용어, "가변"은, 가변 도메인의 특정 분절이 광범위하게 항체의 서열에 대해다르다는 점을 지칭한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하며, 이의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 규정한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 전 범위에 걸쳐 균일하게 분포되는 것은 아니다. 그 대신에, 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 과가변 영역(HVR, hypervariable region)으로 불리우는 3 분절에 집중된다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부위를 골격부 영역(FR)으로 불리운다. 천연 경쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 4 개의 FR 영역을 포함하며, 이는 대개 3 개의 HVR 에 의해 연결되어 루프 연결을 형성하고, 일부의 경우에서는 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 베타-시트 입체구조를 채택한다. 각 쇄에서 HVR 은 근접 위치에서 서로 다른 쇄로부터의 HVR 과 함께 FR 영역에 의해 지탱되고, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat et al, Sequences of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991) 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 관여하는 것이 아니라 항체-의존적 세포 독성에서의 항체의 참여와 같이 다양한 효과와 기능을 나타낸다.
본 발명에서 용어 "scFv(single chain fragment variable)"는 유전자 재조합을 통해 항체의 가변영역만을 발현시켜 만든 단쇄항체를 말하며, 항체의 VH 영역과 VL 영역을 짧은 펩티드 사슬로 연결한 단일쇄 형태의 항체를 말한다. 상기 용어 "scFv"는 달리 명시되지 않거나, 문맥상 달리 이해되는 것이 아니라면, 항원 결합 단편을 비롯한 scFv 단편을 포함하고자 한다. 이는 통상의 기술자에게 자명한 것이다.
본 발명에서 용어, "패닝(panning)"은 파아지의 외벽(coat)에 펩타이드를 발현(display)하는 파아지 라이브러리로부터, 표적 분자(항체, 효소, 세포표면 리셉터 등)와 결합하는 성질을 지닌 펩타이드를 표면에 발현하고 있는 파아지만을 선택해 내는 과정을 말한다. 일반적으로 파아지 디스플레이 기법을 통한 바이오패닝을 실시할 경우 목적하는 타깃과 강한 결합능력을 가지는 파지 개체수가 패닝 횟수를 거듭할수록 증가하기 때문에, 패닝 횟수에 따른 파지 역가의 증가 현상은 파지 디스플레이 실험에 있어서 실험이 의도한 방향으로 진행되고 있는지를 결정하는 기본적인 파라미터로 알려져 있다.
또한 본 발명은 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
(a) 상기 중쇄 가변영역은 HVR(hypervariable region)-H1, HVR-H2 및 HVR-H3를 포함하며,
상기 HVR-H1는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열, HVR-H2는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열 및 HVR-H3은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고,
(b) 상기 경쇄 가변영역은 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3를 포함하며,
상기 HVR-L1는 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열, HVR-L2는 서열번호 14으로 표시되는 아미노산 서열 및 HVR-L3는 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
상기 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본 발명의 scFv E2을 나타내고, 상기 (a) 식: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)에 따라 HVR 사이에 병렬된 가변 영역 중쇄 프레임워크 서열, 및 (b) 식: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)- (HVR-L3)-(LC-FR4)에 따라 HVR 사이에 병렬된 가변 영역 경쇄 프레임워크 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 HC-FR1은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열, HC-FR2는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열, HC-FR3는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열 및 HC-FR4는 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LC-FR1은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열, LC-FR2는 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열, LC-FR3는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열 및 LC-FR4는 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
(a) 상기 중쇄 가변영역은 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3를 포함하며,
상기 HVR-H1는 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열, HVR-H2는 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열 및 HVR-H3는 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고,
(b) 상기 경쇄 가변영역은 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3를 포함하며,
상기 상기 HVR-L1는 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열, HVR-L2는 서열번호 31으로 표시되는 아미노산 서열 및 HVR-L3는 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
상기 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본 발명의 scFv F9을 나타내고, 상기 (a) 식: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)에 따라 HVR 사이에 병렬된 가변 영역 중쇄 프레임워크 서열, 및 (b) 식: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)- (HVR-L3)-(LC-FR4)에 따라 HVR 사이에 병렬된 가변 영역 경쇄 프레임워크 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 HC-FR1은 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열, HC-FR2는 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열, HC-FR3는 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열 및 HC-FR4는 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LC-FR1은 서열번호 28으로 표시되는 아미노산 서열, LC-FR2는 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열, LC-FR3는 서열번호 32으로 표시되는 아미노산 서열 및 LC-FR4는 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 영역 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 영역을 포함하는, 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
상기 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본 발명의 scFv E2의 각각의 중쇄 영역 및 경쇄 영역을 포함하는 것으로, 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명은 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 영역 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 영역을 포함하는, 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
상기 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본 발명의 scFv F9의 각각의 중쇄 영역 및 경쇄 영역을 포함하는 것으로, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
상기 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본 발명의 scFv E2 및F9을 모두 포함하는 아미노산 서열로서, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 아미노산을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 파지미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함되며, 본 발명의 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편 발현 목적을 달성하기 위해서라면, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "작동적으로 결합된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절 인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al.(2001), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli(예컨대, HB101, BL21, DH5α 등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C.(1984), J. Bacteriol., 158:1018-1024) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D.(1980), Ann. Rev. Genet., 14:399-445)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파아지미드(예: pComb3X), 파아지 (예: λgt4·λB, λ-Charon 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 유전체로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 사 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 필요에 따라 다른 서열과 융합될 수도 있으며, 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주 세포를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 숙주세포는 바람직하게는 E. coli이고 보다 바람직하게는 E.coli ER2537, E. coli ER2738, E. coli XL-1 Blue, E. coli BL21(DE3), E. coli JM109, E. coli DH 시리즈, E. coli TOP10, E. coli TG1 및 E. coli HB101이다. 본 발명에서는 E. coli 을 이용하여 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 과발현 시켜 적은 비용으로 대량 생산이 가능하다.
본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al.(1973), Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al.(1973), Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114; 및 Hanahan, D.(1983), J. Mol. Biol., 166:557-580) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al.(1988), Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145) 등에 의해 실시될 수 있다.
숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 본 발명의 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 수득할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는, 폐렴연쇄상구균 감염증의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 폐렴연쇄상구균 감염증은 폐렴연쇄상구균에 의한 폐렴, 수막염, 중이염, 부비강염, 패혈증, 균혈증, 열성 세균혈증, 기관지염, 관절염 및 다발관절염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이나, 본 발명의 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하여 폐렴연쇄상구균 감염증을 예방 및 치료할 수 있는 목적이 달성된다면, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 기능성 분자와 결합 시, 폐렴연쇄상구균 감염증의 예방 및 치료용 약학 조성물로 제공할 수 있으며, 본 발명의 약학 조성물에는 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 효과를 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 단일 도메인 항체 의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에 0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 핵산 분자를 포함하는 상기의 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체로 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> Pep27 특이적 항체 라이브러리 제작
1-1. Pep27의 클로닝, 발현 및 정제
Pep27 특이적으로 결합하는 항체의 항원을 제작하였다. 구체적으로, 도 1에 나타낸 바와 같이, Pep27는 아미노산 잔기 12 및 16가 상이한 서열을 두 가지 버전으로 나타낼 수 있다. "R6"서열 (UniProt accession number Q8DQS1)은 R6 균주의 게놈 서열로부터 유도된다. "p28"서열 (UniProt accession number Q9S4I9)은 "R6"서열의 "돌연변이"로 취급 될 때 D12G 및 T16A로 변형 되더라도 동일한 R6 균주에서 유래된다. "p28"서열은 VncRS 2 성분계(two-component system)를 통해 폐렴 구균(S. pneumonia)의 세포 사멸 프로그램을 개시한다. 따라서, 본 발명의 항체에 대한 Pep27 항원으로서 His6-MBP-Pep27R6 및 합성 Pep27p28를 사용하였다.
"R6"의 Pep27을 항원으로서 이용하기 위하여 His6-MBP-Pep27R6 을 사용하였다. 구체적으로, 도 1에 나타낸 Pep27를 코딩하는 DNA를 His6-MBP 벡터를 이용한다. 상기 벡터는 His6-MBP-Pep27의 융합 단백질 발현을 위하여 BamHI and XhoI 부위의 평형 벡터 시스템을 기초로 변형되었다[P. Sheffield, S. Garrard, Z. Derewenda, Protein Expr. Purif. 15 (1999) 34e39.]. DNA의 시퀀싱을 통하여 컨스트럭트를 확인하였고, 생성된 플라스미드를 E. coil 균주 BL21 (DE3)으로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 50 mg/mL의 암피실린이 포함된 10 mL Luria-Bertani (LB)에 접종하고 밤새 배양하였다. 그 후, 50 mg/mL 암피실린이 포함된 500mL LB 배지에 옮긴 후, OD600가 0.6e1.0로 도달할 때까지 배양하였다. 0.5mM IPTG(isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside)를 배양액에 추가하고, 16도에서 16시간동안 진탕 배양하였다. 배양액을 수득하고 원심분리한 후, 펠렛을 PBS(phosphate-buffered saline)에 재현탁하고, 초음파 처리로 용해시켰다. 세포 파편을 제거하고 상등액을 Ni-NTA Agarose resin (Qiagen)을 첨가하고, 수지를 세척 완충액(PBS pH 7.4 및 20mM imidazole)로 세척하였다. The His6-MBP-Pep27는 용출 완충액(PBS pH 7.4 및 300mM imidazole)로 용출시키고, 4도에서 밤새 투석하였다. 수득한 Pep27를 농축시킨 후, PBS로 미리 평형화시킨 Superdex 70 16/60 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(GE HealthCare)으로 로딩하였다.
또한, "R28"의 Pep27을 항원으로서 이용하기 위하여 Pep27p28는 Anygen에서 구입하여 사용하였다.
1-2. 바이오 패닝
바이오 패닝을 수행하기 위하여, Large Synthetic Human scFv Library (이화여자대학교 심현보 교수님 연구실에서 분양, Yang, Hye Young, et al. "Construction of a large synthetic human scFv library with six diversified CDRs and high functional diversity." Molecules and cells 27.2 (2009): 225.)를 이용한, 7.6 X109의 다양성을 가진 1세트의 scFv 라이브러리 셀 10μg을 라이브러리 파지에 감염시키고, 30℃에서 16시간 동안 배양하여 폴리에틸렌글리콜로 농축한 뒤, PBS 완충용액에 부유시켜 라이브러리 파지를 제작하였다.
항원으로 작용하는 합성 Pep27p28 및 His6-MBP-Pep27R6를 이용하였다. 또한, 항원으로 작용하는 도 1의 R6와 p28 각 아미노산 서열로 이루어진 두 가지 Pep27(서열번호 35 또는 서열번호 36에 해당)를 4℃에서 16시간 반응시켰다. 그 후, 면역튜브(Immunotube)에 상기에서 제작한 라이브러리 파지를 넣었다.
그 후, 1xPBSt로 세척하여 항원에 특이적으로 결합한 단일 사슬 항체-파아지들만 추출하였다. 상기 추출된 파아지를 다시 대장균에 감염시켜 증폭시키는 패닝과정을 수회 반복함으로써 양성 파아지의 풀을 얻었다. 1회차의 패닝에서 증폭된 파아지를 가지고 세척 단계에서 횟수만 늘리고, 나머지는 동일한 방법으로 2회차와 3회차, 4회차에는 도 1의 p28 아미노산(서열번호 36), 5회차는 도 1의 R6 아미노산(서열번호 35)을 사용하여 패닝을 수행하였고, 이를 하기 표 1에 나타냈다.
Figure 112018081116358-pat00001
1-3. Pep27 특이적 scFv 선별
상기 1-2의 실시예의 패닝을 통하여 얻어진 scFv-파아지 항체 풀에 대한 항원 Pep27과의 특이성을 알아보기 위해 scFv 파아지 ELISA를 수행하였다. 구체적으로, 상기에서 5차 패닝을 통해 얻어진 scFv를 LB 플레이트에서 배양하여 96개의 scFv를 선별하였다. 이들을 96-웰 플레이트에서 배양하였고, Pep27이 코팅된 플레이트에 접종하여 ELISA를 수행하였다. 항원이 제시되었지만 scFv를 넣지 않은 H11 및 H12를 ELISA의 음성 대조군으로 사용되었다.
ELISA 수행 방법은 구체적으로, His6-MBP-Pep27를 폴리스틸렌 고 결합 마이크로플레이트(Costar)의 96웰의 Corning®에 넣어 코팅하고 4도로 밤새 배양하였다. 그 후, 세척 완충액(0.1% tween-20이 포함된 PBS)로 3회 세척하고, 블로킹 용액(0.1% tween-20이 포함된 PBS에 5% 스킴밀크)으로 블로킹한 후 1차 항체로서 후보 scFv(0.3 ng/mL ~ 1 mg/mL)로 정제하였다. 그 후, 플레이트를 세척 완충액(0.1% tween-20이 포함된 PBS)로 3회 세척하고, 2차 항체로서 HRP-공여된 항-HA antibody (Santa Cruz Biotechnology, sc-7392; 0.2 mg/mL, 1:3000 dilution)로 희석하였다. 플레이트를 세척 완충액(0.1% tween-20이 포함된 PBS)로 3회 세척하고, SureBlue Reserve? Substrate (KPL)을 첨가한 뒤, 정지 완충액(1M NaOH)을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 최종 신호 판독은 450 nm에서 기록하였다.
상기 폴리 파아지에 대한 ELISA의 결과를 도 2에 나타냈으며, observance값이 높은 10개 중 E2, B12 및 F9을 Pep27에 대한 특이적 scFv로 선별하였다 (도 3).
실시예 2. scFv B12, E2 및 F9 항체의 정제
scFv-발현 E. coli의 단일 콜로니를 선택하여 10mL의 LB/암피실린 배지에 접종한 후, 37도로 밤새 진탕 배양하였다. 다음 날, 배양액을 500mL SB/암피실린 배지에 넣고 37도의 조건으로 OD600가 0.5e0.8로 도달할 때까지 격렬하게 진탕 배양하였다. IPTG를 1mM 최종 농도에서 중간-지수기(mid-log phase)까지 첨가하였다. 상기 배양액을 30도로 밤새 격렬하게 진탕 배양하고, 원심분리한 후 상등액을 제거하였다. 수득한 펠렛을 차가운 1xTES 버퍼에 30분동안 재현탁하고 차가운 0.2xTES 버퍼에 1시간 동안 두었다. MgCl2을 5mM 최종 농도로 첨가하고 혼합하여 EDTA를 차단하였다. 재현탁된 세포를 원심 분리하고 상등액에 Ni-NTA 아가로스 수지에 첨가하였다. 수지를 세척 완충액(PBS pH 7.4, 20mM imidazole 및 0.5mM DTT)으로 세척하고, 용출 완충액(PBS pH 7.4, 300mM imidazole 및 0.5mM DTT)으로 용출시켰다. 용출된 분획을 5mL로 농축시킨 후, PBS로 미리 평형화시킨 Superdex 70 16/60 크기 배제 크로마토 그래피 컬럼 (GE HealthCare)에 로딩하여, 본 발명의 scFv B12, E2 및 F9 항체를 정제하였다.
실시예 3. Pep27 특이적 항체의 결합력 확인
상기 패닝을 통해 얻어진 항체들 중 Pep27에 대한 특이성이 높은 것으로 선별된 E2, B12 및 F9의 항원과의 결합력을 확인하기 위해 ELISA를 진행하여, 각각의 KD값을 구하였다. 구체적으로, Pep27의 농도를 고정하고, 항체의 농도를 변화하면서 ELISA를 진행한 뒤, Graphpad prism ver.4 소프트웨어(CA 92037: Graphpad Software Inc., USA)를 사용하여 KD값을 분석하였다.
scFv 명칭 KD (μM) R2
E2 1.07±0.23 0.9900
F9 0.5±0.186 0.9717
B12 - -
그 결과, 상기 표 2와 같은 KD값을 나타냈으며, E2 및 F9 항체는 Pep27과 결합력이 우수한 것으로 나타났으나, (도 4 및 5), B12는 Pep27과의 결합력이 없는 것으로 나타났다(도 6).
실시예 4. scFv E2 및 F9의 교차반응성(Cross-reactivity) 확인
상기 실시예 3에서 Pep27와 결합력이 우수한 E2 및 F9 항체가 Pep27 단백질 이외에 다른 폐렴 구균 단백질이나, 관련이 없는 단백질과의 반응성 여부를 확인하기 위하여, 교차반응성을 확인하였다. 구체적으로, 면역 블로팅을 수행하기 위하여, 항원으로서 정제된 His6-MBP-Pep27에 대한 SDS-PAGE는 12%겔을 이용하였고, PVDF 멤브레인(45 V, 60 분)으로 옮겼다. 멤브레인은 TBSt를 포함하는 5% 스킴 밀크로 밤새도록 차단하였다. 대조군으로 폐렴구균 단백질 GST-PspA, ClpL 및 IlvC을 준비하였고, 폐렴 구균과 관련성이 없는 MBP 및 BSA 단백질을 준비하였다. 1차 항체로서 0.2 mg/mL의 Anti-Pep27-scFv-E2 및 F9(희석 1:100)를 이용하였다. 2차 항체로서 anti-HA-HRP(Santa Cruz Biotechnology, sc-7392)(0.2 mg/mL, 희석 1:3000)를 이용하여 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 E2 및 F9는 다른 폐렴구균 단백질이나, 폐렴 구균과 관련성이 없는 단백질과 결합하지 않고, 오직 Pep27에만 특이적으로 결합함을 확인하였다(도 7).
실시예 5. scFv E2 및 F9의 서열 확인
Pep27과 결합능이 우수한 것으로 나타난 E2 및 F9의 서열을 확인하기 위하여, scFv 앞쪽 서열중 OMP의 일부 시퀀스(sequence)를 기반으로 하는 OMP primer(aagacagctatcgcgattgcag)를 사용하여 시퀀싱을 진행하였다.
그 결과, scFv E2 및 F9에 대한, 중쇄 및 경쇄 영역과 이의 각 Frame work region 및 HVR의 아미노산 서열을 확인하였다(표 3 및 표 4).
scFv 명칭 영역 아미노산 서열 서열번호
E2 scFv EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVSGISPDDSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDAAVYYCARDVRMCTSMSCSYYYGMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNSVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAVSGLRSEDEADYYCGTWDSSLNAYVFGGGTKLTVLG 1
heavy chain region EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVSGISPDDSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDAAVYYCARDVRMCTSMSCSYYYGMDVWGQGTLVTV 2
heavy chain region HC-FR1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 3
HVR-H1 NYYMS 4
HC-FR2 WVRQAPGKGLEWVS 5
HVR-H2 GISPDDSST 6
HC-FR3 YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDAAVYYCA 7
HVR-H3 RDVRMCTSMSCSYYYGMDV 8
HC-FR4 WGQGTLVTVSS 9
light chain region QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNSVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAVSGLRSEDEADYYCGTWDSSLNAYVFGGGTKLTVLG 10
light chain region LC-FR1 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC 11
HVR-L1 SGSSSNIGSNSVS 12
LC-FR2 WYQQLPGTAPKLLIY 13
HVR-L2 YNSH 14
LC-FR3 RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAVSGLRSEDEADYYC 15
HVR-L3 GTWDSSLNA 16
LC-FR4 YVFGGGTKLTVLG 17
scFv 명칭 영역 아미노산 서열 서열번호
F9 scFv EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSSISPSSGSIYYADSVQGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAIIKCAPDACYYDDGMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSAPGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNAVTWYQQLPGTAPKLLIYANSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDASLNAYVFGGGTKLTVLG 18
heavy chain region EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSSISPSSGSIYYADSVQGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAIIKCAPDACYYDDGMDVWGQGTLVTV 19
heavy chain region HC-FR1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 20
HVR-H1 SYDMS 21
HC-FR2 WVRQAPGKGLEWVS 22
HVR-H2 SISPSSGSI 23
HC-FR3 YYADSVQGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA 24
HVR-H3 KAIIKCAPDACYYDDGMDV 25
HC-FR4 WGQGTLVTVSS 26
light chain region QSVLTQPPSAPGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNAVTWYQQLPGTAPKLLIYANSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDASLNAYVFGGGTKLTVLG 27
light chain region LC-FR1 QSVLTQPPSAPGTPGQRVTISC 28
HVR-L1 SGSSSNIGSNAVT 29
LC-FR2 WYQQLPGTAPKLLIY 30
HVR-L2 ANSH 31
LC-FR3 RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC 32
HVR-L3 GSWDASLNA 33
LC-FR4 YVFGGGTKLTVLG 34
실시예 6. Pep27 특이적 항체 (scFv)의 결합부위 확인
6-1. Pep27과 scFv E2 및 F9 항체에 대한 결합 모델링
본 발명의 scFv E2 및 F9 항체가 폐렴 구균 Pep27에 매우 특이적임을 확인하기 위하여, 본 발명의 항체와 결합하는 Pep27의 에피토프 영역을 분석하였다.
Pep27의 구조를 확인하기 위하여, Robetta server (http://robetta.bakerlab.org)의 아미노산 서열을 이용하여 드 노보(de novo) 구조 예측 모델링을 수행하였다(D.E. Kim, D. Chivian, D. Baker, Nucleic Acids Res. 32 (2004) W526eW531.). Robetta server에서 5개의 최종 모델을 얻었으며, 그 중 6-27번 아미노산은 알파헬릭스 구조를 이루고, 그 부분을 제외한 나머지 부분은 완전한 유동적 부분으로 밝혀졌다.(D.G. Lee, Canc. Cell Int. 5 (2005) 21.). scFvs E2 및 F9의 상동성 모델링을 위하여, SWISS-MODEL server(https://swissmodel.expasy.org)로 주형으로서 scFv 상동성 모델(PDB ID: 4BUH, chain A)을 이용하였다(M. Biasini, Nucleic Acids Res. 42 (2014) W252eW258.). 단백질-단백질 도킹은 HADDOCK server (https://haddock.science.uu.nl)를 이용하여 수행하였다(G.C.P. van Zundert, J. Mol. Biol. 428 (2016) 720e725.). HADDOCK 서버를 이용하기 위해 Pep27의 아미노산 중 15-27번에만 scFv들이 결합을 하도록 하는 랜덤 패치 옵션으로Pep27:scFv 도킹을 용이하게 하였다. 총 12 및 32개의 E2 및 F9의 도킹된 구조는 각각 클러스터 되었다. 클러스터의 Z-score는 하기 표 5에 기재하였고, 그 결과를 분석하였다. Pep27 에피토프 맵핑에 대한 실험 결과와 일치하는 가장 적절한 도킹 모델을 선택하였다.
Figure 112018081116358-pat00002
6-2. 모델링을 이용한 scFv E2 및 F9 항체에 대한 결합 부위 확인
본 발명의 scFv E2 및 F9 항체가 Pep27의 항원으로서 His6-MBP-Pep27에 대한 결합 부위를 확인하기 위해, 서열번호 35로 표시되는 His6-MBP-Pep27의 4개의 결실 변이체를 제작하였으며, 각 아미노산 서열 중 1-9, 1-14, 1-18 및 1-27로 나누어 각 9, 14, 18 및 27번째 아미노산을 스탑코돈으로 치환하였다. 그 후 각 4개의 결실변이체와 scFv E2 및 F9 항체와의 결합을 Immunoblot하여 확인하였다.
그 결과, 1-9, 1-14, 1-18 및 1-27 아미노산 His6-MBP-Pep27 결실 변이체 중 1-9, 1-14, 1-18의 His6-MBP-Pep27 결실 변이체는 scFv E2 및 F9 항체와 결합하지 않아, 상기 아미노산 부위는 결합 부위가 아님을 확인하였다. 또한, 1-27 아미노산 His6-MBP-Pep27 결실 변이체만이 결합함을 확인하였다. 따라서, 서열번호 35의 18-27번째 아미노산은 본 발명의 scFv E2 및 F9에 대한 최소한의 에피토프 영역임을 확인하였다(도 8).
또한, 상기 최소한의 에피토프 영역에서 각 잔기의 역할을 확인하기 위하여, 서열번호 35의 18-27번째 아미노산 중 일부 19-27번째 아미노산 각각을 알라닌으로 치환한 컨스트럭트를 제작하여, 8개의 His6-MBP-Pep27 잔기에 대한 scFv E2 및 F9의 결합을 Immunoblot하여 확인하였다. 또한, 상기 6-1의 방법에 따라, SWISS 모델링을 이용하여 상동성 모델을 얻었고, HADDOCK 서버를 이용하여 Pep27과 E2의 결합력을 예측하였다.
그 결과, 본 발명의 scFv E2 항체에 대하여, 도 1의 His6-MBP-Pep27의 24번 26번 아미노산이 E2의 결합에 중요한 부위임을 확인하였다(도 9, 도 10a, 10b). 또한, scFv F9 항체에 대하여, 도 1의 His6-MBP-Pep27의 27번 아미노산이 F9의 결합에 중요한 부위임을 확인하였다(도 9, 도 11a, 11b).
실시예 7. 인간 혈청 내에서 scFv E2 및 F9 항체의 결합력
Pep27에 특이적으로 결합하는 scFv E2 및 F9 항체에 대한 결합력이 생체 내 환경에서도 동일하게 작용하는지 확인하였다. 구체적으로, 1 mg His6-MBP-Pep27을 1/40으로 희석한 인간 혈청에 섞어주어 in vivo 환경을 모방하였다. 1차 항체로서 본 발명의 scFv E2 및 F9 항체 (0.6 mg/mL, 희석 1:100)를, 2차 항체로서 anti-HA-HRP 항체 (0.2 mg/mL, 희석 1:1000)를 이용하였다. 대조군으로서 His6-MBP를 이용하였다. 그 후, SDS-PAGE를 수행하여 결합력을 확인하였다.
그 결과, 모방된 in vivo 환경에서, 본 발명의 scFv E2 및 F9 항체는 Pep27를 항원으로 정확하게 인식하고 결합력이 있음을 확인하였다(도 12).
<110> Research and Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST PEP27 OF STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE <130> PN1807-225 <150> KR 10-2017-0104502 <151> 2017-08-18 <160> 36 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv E2 <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Pro Asp Asp Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Val Arg Met Cys Thr Ser Met Ser Cys Ser Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser 130 135 140 Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val 145 150 155 160 Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ser Val 165 170 175 Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 180 185 190 Tyr Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 195 200 205 Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Glu 210 215 220 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Asn Ala 225 230 235 240 Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 245 250 <210> 2 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain region of scFv E2 <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Pro Asp Asp Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Val Arg Met Cys Thr Ser Met Ser Cys Ser Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 115 120 125 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain region of scFv E2_ HC-FR1 <400> 3 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain region of scFv E2_ HVR-H1 <400> 4 Asn Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain region of scFv E2_ HC-FR2 <400> 5 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain region of scFv E2_HVR-H2 <400> 6 Gly Ile Ser Pro Asp Asp Ser Ser Thr 1 5 <210> 7 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain region of scFv E2_ HC-FR3 <400> 7 Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 1 5 10 15 Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 20 25 30 Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 35 <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain region of scFv E2_ HVR-H3 <400> 8 Arg Asp Val Arg Met Cys Thr Ser Met Ser Cys Ser Tyr Tyr Tyr Gly 1 5 10 15 Met Asp Val <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain region of scFv E2_ HC-FR4 <400> 9 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain region of scFv E2 <400> 10 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Asn Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 11 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain region of scFv E2_ LC-FR1 <400> 11 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys 20 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain region of scFv E2_ HVR-L1 <400> 12 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ser Val Ser 1 5 10 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain region of scFv E2_ LC-FR2 <400> 13 Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain region of scFv E2_ HVR-L2 <400> 14 Tyr Asn Ser His 1 <210> 15 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain region of scFv E2_ LC-FR3 <400> 15 Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr 1 5 10 15 Ser Ala Ser Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp 20 25 30 Tyr Tyr Cys 35 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain region of scFv E2_ HVR-L3 <400> 16 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Asn Ala 1 5 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain region of scFv E2_ LC-FR4 <400> 17 Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 1 5 10 <210> 18 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv F9 <400> 18 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Ile Ile Lys Cys Ala Pro Asp Ala Cys Tyr Tyr Asp Asp 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser 130 135 140 Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Pro Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val 145 150 155 160 Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val 165 170 175 Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 180 185 190 Ala Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 195 200 205 Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu 210 215 220 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Ala Ser Leu Asn Ala 225 230 235 240 Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 245 250 <210> 19 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain region of scFv F9 <400> 19 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser 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Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Ala Ser Leu 85 90 95 Asn Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 28 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain region of scFv F9_ LC-FR1 <400> 28 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Pro Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys 20 <210> 29 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain region of scFv F9_ HVR-L1 <400> 29 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Thr 1 5 10 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain region of scFv F9_ LC-FR2 <400> 30 Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 31 <211> 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Pep27 <400> 36 Met Arg Lys Glu Phe His Asn Val Leu Ser Ser Gly Gln Leu Leu Ala 1 5 10 15 Asp Lys Arg Pro Ala Arg Asp Tyr Asn Arg Lys 20 25

Claims (21)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    (a) 상기 중쇄 가변영역은 HVR(hypervariable region)-H1, HVR-H2 및 HVR-H3를 포함하며,
    상기 HVR-H1는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열, HVR-H2는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열 및 HVR-H3은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고,
    (b) 상기 경쇄 가변영역은 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3를 포함하며,
    상기 HVR-L1는 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열, HVR-L2는 서열번호 14으로 표시되는 아미노산 서열 및 HVR-L3는 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 (a) 식: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)에 따라 HVR 사이에 병렬된 가변 영역 중쇄 프레임워크 서열, 및
    (b) 식: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)- (HVR-L3)-(LC-FR4)에 따라 HVR 사이에 병렬된 가변 영역 경쇄 프레임워크 서열을 추가적으로 포함하는, 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 HC-FR1은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열, HC-FR2는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열, HC-FR3는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열 및 HC-FR4는 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 LC-FR1은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열, LC-FR2는 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열, LC-FR3는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열 및 LC-FR4는 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    (a) 상기 중쇄 가변영역은 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3를 포함하며,
    상기 HVR-H1는 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열, HVR-H2는 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열 및 HVR-H3는 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고,
    (b) 상기 경쇄 가변영역은 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3를 포함하며,
    상기 상기 HVR-L1는 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열, HVR-L2는 서열번호 31으로 표시되는 아미노산 서열 및 HVR-L3는 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 (a) 식: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)에 따라 HVR 사이에 병렬된 가변 영역 중쇄 프레임워크 서열, 및
    (b) 식: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)- (HVR-L3)-(LC-FR4)에 따라 HVR 사이에 병렬된 가변 영역 경쇄 프레임워크 서열을 추가적으로 포함하는, 항-Pep27 항체 또는 항원 결합 단편.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 HC-FR1은 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열, HC-FR2는 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열, HC-FR3는 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열 및 HC-FR4는 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 LC-FR1은 서열번호 28으로 표시되는 아미노산 서열, LC-FR2는 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열, LC-FR3는 서열번호 32으로 표시되는 아미노산 서열 및 LC-FR4는 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 영역 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 영역을 포함하는, 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 영역 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 영역을 포함하는, 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 삭제
  15. 서열번호 1 또는 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제6항 내지 제13항 및 제15항 중 어느 한 항의 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 아미노산을 코딩하는 핵산 분자.
  17. 제16항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  18. 제17항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 인간을 제외한 형질전환체.
  19. 제6항 내지 제13항 및 제15항 중 어느 한 항의 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는, 폐렴연쇄상구균 감염증의 예방 및 치료용 약학 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 폐렴연쇄상구균 감염증은 폐렴연쇄상구균에 의한 폐렴, 수막염, 중이염, 부비강염, 패혈증, 균혈증, 열성 세균혈증, 기관지염, 관절염 및 다발관절염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  21. 제16항의 핵산 분자를 포함하는 제17항의 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;
    상기 재조합 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체로 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 항-Pep27 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법.
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