KR102142499B1

KR102142499B1 - Ykl-40 표적 인간 단일클론항체

Info

Publication number: KR102142499B1
Application number: KR1020190112572A
Authority: KR
Inventors: 김대영; 강경재; 김윤지; 이세라; 홍진태
Original assignee: 재단법인 오송첨단의료산업진흥재단; 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2019-09-11
Filing date: 2019-09-11
Publication date: 2020-08-10
Also published as: EP4029878A1; JP2022549090A; JP7340895B2; CA3150907A1; EP4029878A4; US20220340649A1; CN114641492A; AU2020347018A1; BR112022004408A2; WO2021049830A1

Abstract

본 발명은 YKL-40에 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 관한 것으로서, 상기 YKL-40의 발현이 높은 경우 암의 증식 및 전이와 관련이 있고, YKL-40에 대한 단일클론항체는 암의 증식 및 전이를 억제하는 효과가 있어, 본 발명의 단일클론항체는 암의 진단, 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

YKL-40 표적 인간 단일클론항체{Human monoclonal antibodies targeting YKL-40}

본 발명은 YKL-40 에 특이적으로 결합하는 단일클론항체; 이를 코딩하는 핵산분자; 상기 단일클론항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 및 상기 단일클론항체를 포함하는 암의 진단용 조성물에 관한 것이다.

항체는 특정 항원과 결합하는 면역 단백질이다. 인간과 마우스를 비롯한 대부분의 포유동물에 있어서, 항체는 중쇄 폴리펩티드와 경쇄 폴리펩티드가 쌍을 이루어 형성된다. 각각의 사슬은 가변 영역 (Fv) 및 불변 영역 (Fc)이라 불리는 2개의 영역으로 이루어져 있다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 분자의 항원 결합 결정기를 포함하며, 표적 항원과의 결합에 관여한다. 불변 영역은 항체의 군(또는 동 기준 표본형)을 한정하며 (예를 들어, IgG), 효과기 작용이라 불리는 일련의 중요한 기능상의 특성들을 부여하는, 다수의 Fc 수용체 및 Fc 리간드와의 결합에 관여한다. 예를 들어, 표적에 대한 특이성, 면역 작용기 기작을 매개하는 능력 및 긴 혈청 반감기와 같은 몇몇 중요한 항체의 특성으로 말미암아 항체는 강력한 치료제로서 사용되고 있다.

파지 디스플레이 기술은 영국의 Medical Research Council에서 1990년 처음 개발된 것으로, 인간 항체 라이브러리(library)를 제조하여 항체절편(Fab, ScFv)의 형태로 박테리오파지의 표면에 발현시켜 특정 항원에 대한 항체 클론들을 선별하는 기술이다. 항원과 특이적으로 반응하는 거의 모든 종류의 인간 재조합 단일클론항체를 단일 pot 항체 라이브러리 시스템으로부터 선별해낼 수 있는 가능성이 제안되었으며, 이는 파지 디스플레이 항체 기술을 활용할 경우 체내 진단이나 치료에 응용할 수 있는 다양한 항체 단편들(Fab 또는 ScFv 형태)을 획득할 수 있다.

미국등록특허 제7,670,599호

본 발명의 목적은 YKL-40 에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 코딩하는 핵산분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 유효성분으로 포함하는 암의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 YKL-40 에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 단일클론항체는 (a) 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 (b) 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것이거나, (a) 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 (b) 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1, 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 단일클론항체는 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 및 (b) 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 것이거나, (a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 및 (b) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 단일클론항체는 인간화 항체인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 단일클론항체를 코딩하는 핵산분자를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 핵산분자는 (a) 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 (b) 서열번호 27의 염기서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 28의 염기서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것이거나, (a) 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 (b) 서열번호 30의 염기서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 31의 염기서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 32의 염기서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 핵산분자는 (a) 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 및 (b) 서열번호 19의 염기서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 것이거나, (a) 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 및 (b) 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단일클론항체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 뇌암, 자궁암, 비인두암, 후두암, 두경부암, 결장암, 난소암, 직장암, 대장암, 질암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 요관암, 요도암, 전립선암, 기관지암, 방광암, 신장암 및 골수암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 단일클론항체를 유효성분으로 포함하는 암의 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 YKL-40은 암의 증식 및 전이와 관련이 있고, YKL-40에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 암의 증식 및 전이를 억제하는 효과가 있어, 본 발명의 단일클론항체는 암의 진단, 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1A는 파지 디스플레이를 통해 인간 YKL-40 (hYKL-40)과 유의적인 결합능을 나타내는 항체를 선별하는 과정을 나타내는 모식도이고, 1B 내지 1D는 각각 Fab-I, Fab-II 및 scFv 에 대한 패닝 적정 (panning titration) 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 파지 디스플레이로부터 선별된 7 개의 hYKL-40에 대한 항체 (3A10-F1 (H1), 3B12-F1 (H2), 3A11-F2 (H3), 3B7-F2 (H4), 3D12-F2 (H5), 3E12-F2 (H6) 및 3G7-F2 (H7))를 나타낸 것이다.
도 3A는 파지 디스플레이를 통해 마우스 YKL-40 (mYKL-40)과 유의적인 결합능을 나타내는 항체를 선별하는 과정을 나타내는 모식도이고, 1B 내지 1D는 각각 Fab-I, Fab-II 및 scFv 에 대한 패닝 적정 (panning titration) 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 파지 디스플레이로부터 선별된 6 개의 mYKL-40에 대한 항체 (4A12-F2 (M1), 4E12-F2 (M2), 4E3-F2 (M3), 4D10-F2 (M4), 4A7-F2 (M5) 및 4A1-F2 (M6))를 나타낸 것이다.
도 5는 hYKL-40 항체를 가지는 6 개의 클론 (3A10-F1 (H1), 3B12-F1 (H2), 3B7-F2 (H4), 3D12-F2 (H5), 3E12-F2 (H6) 및 3G7-F2 (H7))으로부터 IgG 생산을 확인하기 위하여 SDS-PAGE 결과 및 IgG 생산량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 6 개의 hYKL-40 항체에 대한 SEC (size-exclusion chromatography) 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 6 개의 hYKL-40 항체에 대하여 ELISA를 통해 EC50 값을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 mYKL-40 항체를 가지는 4 개의 클론 (4E12-F2 (M2), 4E3-F2 (M3), 4D10-F2 (M4) 및 4A7-F2 (M5))으로부터 IgG 생산을 확인하기 위하여 SDS-PAGE 결과 및 IgG 생산량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 4 개의 mYKL-40 항체에 대한 SEC (size-exclusion chromatography) 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 4 개의 mYKL-40 항체에 대하여 ELISA를 통해 EC50 값을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 hYKL-40 항체인 3A10-F1 (H1) 및 mYKL-40 항체인 4E3-F2 (M3) 클론이 hYKL-40 항원 및 mYKL-40 항원에 교차 결합하는지 여부를 ELISA를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 hYKL-40 항체인 3A10-F1 (H1) 및 mYKL-40 항체인 4E3-F2 (M3)의 hYKL-40 항원 및 mYKL-40 항원에 대한 항원 친화도를 Octet을 통해 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 후보 항체로서 hYKL-40 항체인 3A10-F1 (H1), 3B12-F1 (H2), 3B7-F2 (H4), 3D12-F2 (H5), 3E12-F2 (H6) 및 3G7-F2 (H7)를 A549 세포주 및 H460 세포주에 처리한 후 이동된 세포수(migrated cell number)를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 후보 항체로서 mYKL-40 항체인 4E12-F2 (M2), 4E3-F2 (M3), 4D10-F2 (M4) 및 4A7-F2 (M5)를 A549 세포주 및 H460 세포주에 처리한 후 이동된 세포수(migrated cell number)를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 후보 항체로서 hYKL-40 항체인 3A10-F1 (H1), 3B12-F1 (H2) 및 3B7-F2 (H4); 및 mYKL-40 항체인 E12-F2 (M2) 및 4E3-F2 (M3)를 폐 전이 동물모델에 처리한 후 폐 표면의 종양 넓이 (tumor area)를 측정한 결과를 나타낸 것이다 (n=3).
도 16은 hYKL-40 항체인 3A10-F1 (H1) 및 mYKL-40 항체인 4E3-F2 (M3)를 폐 전이 동물모델에 처리한 후 폐 조직에서 종양 결절 (tumor nodule)의 수를 측정한 결과를 나타낸 것이다 (n=8).

본 발명에서의 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 다클론항체 및 단일클론항체를 모두 포함하는 개념이다. 또한, 상기 용어는 키메라 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다.

본 발명에서의 용어, "단일클론항체"란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피토프(항원결정기)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론 항체와는 다르게, 단일클론항체는 항원상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 단일클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한, 하이브리도마 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.

전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며, 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역 (상기 부위는 "도메인"으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은, "상보성 결정 영역"(complementarity determining region, 이하, "CDR"이라 함)이라고 불리는 3 개의 가변 영역 및 4 개의 "구조 영역" (framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.

상기 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_H 및 3개의 불변 영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 상기 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_L 및 불변 영역 도메인 C_L을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

본 발명에서의 용어, "가변"이란 항체들 간에 특정 영역의 서열이 크게 상이하고 특정 항원에 대해 각각의 특정 항체의 결합 특이성을 나타내는데 사용된다는 것을 일컫기 위해 사용된다. 항체의 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균일하게 분포하는 것이 아니라 CDR에 집중된다. 단클론 항체의 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 가지며 이들 영역이 여드름균의 표면 항원를 인식함으로써 항원-항체 복합체를 형성한다. 이러한 CDR은 각각의 단일클론항체마다 특징적인 서열을 가지며, 하나의 단일클론항체가 특정 에피토프를 인식하기 위해 이들 6 개의 CDR의 일부 또는 모두가 상호작용할 수 있다.

본 발명에서의 용어, "파지 디스플레이 기술"은 파지 라이브러리로부터 표적 항원과 유의적인 결합능을 나타내는 파지만을 선별하는 것을 통해, 항원과의 결합능을 나타내는 항체를 선별하는 기술을 나타낸다. 상기 기술에서, "패닝(panning)"은 파지의 외벽(coat)에 펩타이드를 발현(display)하는 파지 라이브러리로부터 표적 분자(항체, 효소, 세포표면 리셉터 등)와 결합하는 성질을 지닌 펩타이드를 표면에 발현하고 있는 파지만을 선택해 내는 과정을 일컫는다. 이러한 과정을 3 내지 10회 반복하여, 표적 항원에 대하여 유의적인 결합능을 나타내는 항체를 선별할 수 있고, 선별된 항체를 인간화 단일클론항체로 제조할 수 있다.

본 발명의 단일클론항체는 YKL-40 에 특이적으로 결합할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 단일클론항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 단일클론항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 단일클론항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다. 변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathy index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신 (+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5). 단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트 (+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). 친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 단일클론항체 또는 이를 코딩하는 핵산분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61％의 상동성, 보다 바람직하게는 70％의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80％의 상동성, 가장 바람직하게는 90％의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.

본 발명에서의 용어, "핵산분자"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 본 발명의 단일클론항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산분자의 염기서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

본 발명에서 제작되는 벡터는 숙주 세포에서 원하는 유전자를 발현할 수 있도록 구축된다. 일반적으로, 상기 벡터의 업스트림(upstream) 및 다운스트림(downstream)에 각각 작동적으로 결합된 프로모터 및 터미네이터가 위치한다.

본 발명에서의 용어, "프로모터"는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 본 발명의 재조합 벡터에서 목적 염기서열은 상기 프로모터에 작동적으로 연결된다.

본 발명에서의 용어, "작동적으로 결합된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.

본 발명의 벡터를 형질전환체인 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 열쇼크 방법, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 나아가, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 싸이코트리아 루브라 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 용어, "개체"란 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

상기 용어, "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강 상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여는 상기 권장 투여량을 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 파지 디스플레이 라이브러리 패닝 (Phage display library panning)

YKL-40 (Chitinase-3-like protein 1)은 CHI3L1 유전자에 의해 코딩되는 약 40 kDa의 분비 당단백질(secreted glycoprotein)로서, 대식세포(macrophage) 등의 다양한 세포에서 발현되고 분비되는 것으로 알려져 있다. 또한, 최근 연구에 따르면, YKL-40은 암세포의 증식, 생존 및 전이에서 중요한 역할을 하는 것으로 추정되고 있다. 더욱이, 선행 연구에서 YKL-40은 49 개의 질병 중 38 개가 암과 관련되어 발현이 억제되고, 이 중 8 개가 폐암과 관련되어 있음을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 YKL-40의 발현을 억제할 수 있는 항체를 발굴하기 위한 실험을 수행하였다.

YKL-40에 대한 항체는 파지 디스플레이(phage display) 기술을 통해 hYKL-40과 유의적인 결합능을 나타내는 항체를 선별하였다 (도 1). hYKL-40 와의 결합능은 hYKL-40 파지에 대한 ELISA를 통해 확인하였다. 간단히, hYKL-40 항원은 well 당 30 ng씩 고정되었고, 항원이 고정된 well은 MPBS (5% skim milk in PBS)로 블로킹 처리한 뒤, hYKL-40 파지 및 mYKL-40 파지를 첨가하여 반응시켰다. 결합된 파지를 검출하기 위해 PBST (0.05% Tween20 in PBS)로 4 회 세척 후에 Anti-M13-HRP (1:5,000)를 첨가하여 반응시켰다. 마지막으로 PBST로 4 회 세척 후에 TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) 기질을 첨가하여 발색 반응을 유도하였고 2N H2SO4를 첨가하여 반응을 종결시킨 뒤, 파장 450 nm에서 각 well의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, Fab-I 라이브러리 및 Fab-II 라이브러리에서 7 개의 hYKL-40에 대한 항체를 가진 클론이 선별되었고, scFv 라이브러리에서는 클론이 형성되지 않았다 (도 2). Fab-I 라이브러리에서 2 개의 클론은 3A10-F1 (H1) 및 3B12-F1 (H2) 으로 기재하였고, KFab-II 라이브러리에서 5 개의 클론은 각각 3A11-F2 (H3), 3B7-F2 (H4), 3D12-F2 (H5), 3E12-F2 (H6) 및 3G7-F2 (H7) 로 기재하였다.

또한, mYKL-40과 유의적인 결합능을 나타내는 항체를 선별하였으며 (도 3), mYKL-40 와의 결합능은 mYKL-40 파지에 대한 ELISA를 통해 확인하였는데, 간단히 mYKL-40 항원은 well 당 30 ng씩 고정되었고, 항원이 고정된 well은 MPBS (5% skim milk in PBS)로 블로킹 처리한 뒤 hYKL-40 파지 및 mYKL-40 파지를 첨가하여 반응시켰다. 결합된 파지를 검출하기 위해 PBST (0.05% Tween20 in PBS)로 4회 세척 후에 Anti-M13-HRP (1:5,000)를 첨가하여 반응시켰다. 마지막으로 PBST로 4회 세척 후에 TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) 기질을 첨가하여 발색 반응을 유도하였고 2N H2SO4를 첨가하여 반응을 종결시킨 뒤 파장 450nm에서 각 well의 흡광도를 측정하였다. 그 결과, Fab-II 라이브러리에서 6 개의 항체가 선별되었고, Fab-I 또는 scFv 라이브러리에서는 클론이 형성되지 않았다 (도 4). Fab-II 라이브러리에서 6 개의 클론은 각각 4A12-F2 (M1), 4E12-F2 (M2), 4E3-F2 (M3), 4D10-F2 (M4), 4A7-F2 (M5) 및 4A1-F2 (M6) 로 기재하였다.

실시예 2. IgG 생산 및 특성 분석

본 발명자들은 선별된 YKL-40 파지를 인간 항체의 IgG 형태로 전환시키고 이를 검증하는 실험을 수행하였다. 간단히, 선별된 YKL-40 파지는 Expi293 세포주에 형질감염시킨 후 배양하였고, 배양된 Expi293 세포주의 세포배양액 300 ml로부터 IgG를 정제하였다. 정제된 IgG는 SDS-PAGE를 통해 분자량 및 순수 분리도를 확인하였다.

그 결과, hYKL-40 항체를 가지는 6 개의 클론에서 IgG를 생산하였는데, 3A10-F1 (H1) 에서는 최종적으로 0.237 mg의 IgG가 생산되었고, 3B12-F1 (H2) 에서는 최종적으로 1.84 mg의 IgG가 생산되었으며, 3B7-F2 (H4) 에서는 최종적으로 6.5 mg의 IgG가 생산되었고, 3D12-F2 (H5) 에서는 0.3 mg의 IgG가 생산되었으며, 3E12-F2 (H6) 에서는 최종적으로 0.8 mg의 IgG가 생산되었고, 3G7-F2 (H7) 에서는 최종적으로 5.3 mg의 IgG가 생산되었다 (도 5).

또한, 본 발명자들은 SEC (size-exclusion chromatography)를 통해 단일항체 여부를 확인하였고, ELISA 를 통해 각 항체에 대한 EC50 값을 통해 항원 친화도 (affinity) 를 측정하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 3A10-F1 (H1), 3B12-F1 (H2), 3B7-F2 (H4), 3D12-F2 (H5), 3E12-F2 (H6) 및 3G7-F2 (H7)은 모두 SEC 에서 단일 피크(peak)로 나타나 모두 단일항체인 것으로 확인되었다 (도 6). ELISA 결과에서는 3A10-F1 (H1) 에서 EC50 값이 582 pM (0.582 nM)로서 가장 낮은 EC50 값으로 확인되었다 (도 7).

본 발명자들은 선별된 mYKL-40 파지에 대해서도 동일한 실험을 수행하였다. 그 결과, 4E12-F2 (M2) 에서는 최종적으로 1.6 mg의 IgG가 생산되었고, 4E3-F2 (M3) 에서는 최종적으로 3.6 mg의 IgG가 생산되었으며, 4D10-F2 (M4) 에서는 최종적으로 6.3 mg의 IgG가 생산되었고, 4A7-F2 (M5) 에서는 최종적으로 0.7 mg의 IgG가 생산되었다 (도 8).

또한, SEC 결과에서 4E12-F2 (M2), 4E3-F2 (M3), 4D10-F2 (M4) 및 4A7-F2 (M5) 는 모두 단일 피크를 나타내어 모두 단일항체인 것으로 확인되었다 (도 9). ELISA 결과에서 4E3-F2 (M3) 에서 EC50 값이 67 pM (0.067 nM)로서 가장 낮은 EC50 값으로 확인되었다 (도 10).

또한, 본 발명자들은 hYKL-40 및 mYKL-40 에 대해 각각 가장 낮은 EC50 값을 보인 3A10-F1 (H1) 과 4E3-F2 (M3) 클론이 hYKL-40 와 mYKL-40 에 교차 결합하는지를 알아보기 위해 각 항체의 Fab 단백질을 이용한 ELISA를 수행하였다. 그 결과, 3A10-F1 (H1) 은 hYKL-40 에만 결합하는 것으로 나타났고, 4E3-F2 (M3) 는 hYKL-40 와 mYKL-40 에 교차 결합하는 것으로 확인되었다 (도 11).

ELISA 얻어진 EC50 값을 재확인하기 위해 Octet 장비를 사용하여 4E3-F2 (M3)와 3A10-F1 (H1)에 대한 항원 친화도 측정을 수행하였다. 두 항체에 대하여 hYKL-40 와 mYKL-40 를 사용하여 교차 결합 실험을 진행하였다. AR2G (Amine Reactive 2^nd Generation) sensor를 사용하여 각 항원 단백질을 고정하고, 각 항체를 농도별 (0 ~ 1 μM)로 결합시키는 direct immobilization method를 사용하였다. 그 결과, 4E3-F2 (M3)의 경우에는 mYKL-40 및 hYKL-40에 대해서 각각 6.7×10^-8M 및 5.7×10^-8M 의 K _D 값으로 확인되어 마우스와 인간 항원 단백질 모두 유사한 수준으로 결합하는 것을 확인하였다. 3A10-F1 (H1)의 경우에는 mYKL-40 와는 결합하지 않는 것을 확인하였고, hYKL-40 에서는 5.0×10^-11 M의 K _D 값을 확인하였다 (도 12).

실시예 3. 시험관 내( in vitro )에서 후보 항체의 항암 효능 분석

본 발명자들은 YKL-40 에 대한 후보 항체들을 폐암세포주에 처리한 경우 암전이를 억제하는 효과가 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 간단히, 인간 폐암 세포주인 A549 세포주 및 H460 세포주의 이동을 투과성 삽입물 (8 μm pore trans-well; Corning Inc.) 에서 정량적으로 수행하였다. 후보 항체로서 hYKL-40 항체인 3A10-F1 (H1), 3B12-F1 (H2), 3B7-F2 (H4), 3D12-F2 (H5), 3E12-F2 (H6) 및 3G7-F2 (H7); 및 mYKL-40 항체인 4E12-F2 (M2), 4E3-F2 (M3), 4D10-F2 (M4) 및 4A7-F2 (M5)를 각각 폐암세포주인 A549 세포주 및 H460 세포주에 1 μg/ml의 농도로 처리한 다음, 후보 항체로 처리된 A549 및 H460 세포를 각각 well 당 2.0 x 10⁴ 세포가 되도록 넣고 가습 인큐베이터에서 37 ℃, 5 % CO₂ 조건으로 17 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 3.7 % 포름알데히드로 2 분 동안 고정시킨 후, 1× PBS 로 2 회 세척하였다. 이후, 세포를 15 분 동안 100 % 메탄올로 투과시키고 20 분 동안 트리판 블루로 염색하였다. 웰 내부의 이동하지 않은 세포를 면봉으로 제거하고, × 200 배율에서 광학 현미경 (Olympus) 으로 캡처 한 이미지를 NIH ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

그 결과, hYKL-40 에 대한 6 개의 항체를 처리한 경우 A549 세포주 및 H460 세포주 모두에서 대조군에 비해 이동된 세포수가 감소되었음을 확인하였고, 특히, 3A10-F1 (H1), 3B12-F1 (H2) 및 3B7-F2 (H4) 항체를 처리한 경우에는 현저하게 이동된 세포수가 감소되었음을 확인하였다 (도 13). 마찬가지로, mYKL-40 에 대한 4 개의 항체를 처리한 경우 A549 세포주 및 H460 세포주 모두에서 대조군에 비해 이동된 세포수가 감소되었음을 확인하였고, 특히, 4E12-F2 (M2) 및 4E3-F2 (M3) 항체를 처리한 경우에는 현저하게 이동된 세포수가 감소되었음을 확인하였다 (도 14).

상기 결과로부터, 선별된 3A10-F1 (H1), 3B12-F1 (H2), 3B7-F2 (H4), 4E12-F2 (M2) 및 4E3-F2 (M3) 항체의 경우 YKL-40 단백질을 억제하여 폐암세포의 전이를 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 4. 동물실험(in vivo)에서 후보 항체의 항암 효능 분석

본 발명자들은 세포주 실험에서 선별된 5 개의 후보 항체를 폐 전이 동물모델에 처리한 경우 암전이를 억제하는 효과가 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 간단히, 마우스 당 B16F10 마우스 흑색종 세포 (3.75×104 cells)를 꼬리 정맥 주사(tail vein injection) 방식으로 넣어 폐 전이를 시킨 후 일주일에 1번씩 총 3주간 마우스에 hYKL-40 항체인 3A10-F1 (H1), 3B12-F1 (H2) 및 3B7-F2 (H4); 및 mYKL-40 항체인 4E12-F2 (M2) 및 4E3-F2 (M3)를 0.5 mg/kg씩 투여하였다. 흑색종 세포를 투여한지 3주 후 폐를 적출하여 폐 표면에 존재하는 종양의 넓이(tumor area)를 측정하였다.

그 결과, hYKL-40 항체 중 3A10-F1 (H1) 및 mYKL-40 항체 중 4E3-F2 (M3) 를 처리한 경우 대조군에 비해 현저하게 폐 표면의 종양의 넓이가 감소되었음을 확인하였다 (도 15). 이는 세포주에서의 EC50 값을 측정한 결과와 일관된 결과로서, H1 및 M3 항체가 폐암의 전이를 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 상기 결과로부터 선별된 YKL-40 항체인 3A10-F1 (H1) 및 4E3-F2 (M3) 에 대한 검증을 위하여 실험동물의 수를 증가시켜 암전이를 억제하는 효과가 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 3A10-F1 (H1) 및 4E3-F2 (M3) 모두 대조군에서 비해 폐 조직의 표면에서 종양결절(tumor nodule)의 수가 감소되어 폐암의 전이를 억제하는 효과가 있었고, 특히, 3A10-F1 (H1) 항체가 가장 현저하게 종양결절의 수를 억제하는 효과가 있는 것을 확인하였다 (도 16).

상기 결과로부터, YKL-40 에 대한 3A10-F1 (H1) 항체는 폐암을 억제하는 현저한 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 5. 항체 서열 분석

본 발명자들은 상기 결과로부터 암을 억제하는 효과가 있는 3A10-F1 (H1) 항체 및 4E3-F2 (M3) 항체의 서열을 분석하였다. 3A10-F1 (H1) 항체 및 4E3-F2 (M3) 항체에 대한 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 하기 표 1와 같고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 표 2와 같다. 중쇄 가변 영역 중 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열은 하기 표 3과 같고, 경쇄 가변 영역 중 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열은 하기 표 4와 같다.

또한, 상기 항체를 코딩하는 핵산분자에 대한 중쇄 가변 영역의 염기서열은 하기 표 5와 같고, 경쇄 가변 영역의 염기서열은 하기 표 6과 같다. 중쇄 가변 영역 중 CDR1 내지 CDR3을 코딩하는 염기서열은 하기 표 7과 같고, 경쇄 가변 영역 중 CDR1 내지 CDR3을 코딩하는 염기서열은 표 8과 같다.

항체	항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열 (CDR: 밑줄)
3A10-F1 (H1)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS NYAMS WVRQAPGKGLEWVS GISGSGGTTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAG VGTFDV WGQGTLVTVSS (서열번호 1)
4E3-F2 (M3)	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS SYDIH WVRQAPGQGLEWMG IISPYLGITIYAQKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR RYFYYQSEAFDY WGQGTLVTVSS (서열번호 2)

항체	항체의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 (CDR: 밑줄)
3A10-F1 (H1)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQTISSWLN WYQQKPGKAPKLLIY AASRLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSTPLT FGQGTKVEIK (서열번호 3)
4E3-F2 (M3)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISNYLN WYQQKPGKAPKLLIY AASTLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSFPLT FGQGTKVEIK (서열번호 4)

항체	CDRH1	CDRH2	CDRH3
3A10-F1 (H1)	NYAMS (서열번호 5)	GISGSGGTTYYADSVKG (서열번호 6)	VGTFDV (서열번호 7)
4E3-F2 (M3)	SYDIH (서열번호 8)	IISPYLGITIYAQKFQG (서열번호 9)	RYFYYQSEAFDY (서열번호 10)

항체	CDRL1	CDRL2	CDRL3
3A10-F1 (H1)	RASQTISSWLN (서열번호 11)	AASRLQS (서열번호 12)	QQSYSTPLT (서열번호 13)
4E3-F2 (M3)	RASQSISNYLN (서열번호 14)	AASTLQS (서열번호 15)	QQSYSFPLT (서열번호 16)

항체	항체의 중쇄 가변영역의 염기 서열 (CDR: 밑줄)
3A10-F1 (H1)	GAAGTACAGTTGGTCGAAAGTGGCGGTGGCCTCGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGTCTGAGCTGCGCCGCCTCGGGTTTTACTTTCTCT AATTATGCAATGTCT TGGGTTCGTCAGGCGCCGGGCAAGGGTCTCGAATGGGTTTCA GGTATCTCTGGTTCTGGTGGTACTACTTACTATGCCGATTCAGTGAAGGGT CGCTTTACCATTTCCCGTGACAACTCTAAGAATACTCTGTATCTGCAGATGAACTCGCTGCGTGCCGAAGACACGGCCGTCTATTATTGCGCCGGT GTTGGTACTTTCGATGTT TGGGGTCAGGGCACTTTAGTGACCGTCTCATCG (서열번호 17)
4E3-F2 (M3)	CAAGTTCAGCTGGTCCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCAGTTCTGTTAAGGTTTCCTGCAAAGCCTCAGGCGGGACTTTTAGT TCTTACGATATCCAT TGGGTGCGGCAGGCGCCCGGCCAGGGTCTCGAATGGATGGGG ATCATTTCTCCATACCTGGGTATCACCATCTATGCACAAAAATTCCAAGGC CGCGTAACTATTACCGCCGACGAATCAACCTCCACCGCCTACATGGAACTCAGCTCTCTGAGGTCAGAAGACACGGCCGTCTATTATTGCGCCAGA CGTTACTTCTACTACCAGTCTGAAGCATTCGATTAC TGGGGTCAGGGTACTCTGGTTACCGTCTCATCG (서열번호 18)

항체	항체의 경쇄 가변영역의 염기 서열 (CDR: 밑줄)
3A10-F1 (H1)	GACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGT CGCGCTAGCCAGACTATCTCTTCTTGGCTGAAC TGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCGCCAAAATTGCTGATTTAC GCAGCATCCCGTCTGCAGTCT GGTGTACCGTCCCGTTTCTCTGGCAGCGGTTCTGGTACGGATTTTACCCTGACCATCTCAAGCCTCCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTATTGT CAGCAATCTTACTCTACTCCGCTGACG TTCGGGCAGGGAACTAAAGTGGAAATTAAA (서열번호 19)
4E3-F2 (M3)	GACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGT CGCGCTAGCCAGTCTATCTCTAATTACCTGAAC TGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCGCCAAAATTGCTGATTTAC GCAGCATCCACTCTGCAGTCT GGTGTACCGTCCCGTTTCTCTGGCAGCGGTTCTGGTACGGATTTTACCCTGACCATCTCAAGCCTCCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTATTGT CAGCAATCTTACTCTTTTCCGCTGACG TTCGGGCAGGGAACTAAAGTGGAAATTAAA (서열번호 20)

항체	CDRH1	CDRH2	CDRH3
3A10-F1 (H1)	AATTATGCAATGTCT (서열번호 21)	GGTATCTCTGGTTCTGGTGGTACTACTTACTATGCCGATTCAGTGAAGGGT (서열번호 22)	GTTGGTACTTTCGATGTT (서열번호 23)
4E3-F2 (M3)	TCTTACGATATCCAT (서열번호 24)	ATCATTTCTCCATACCTGGGTATCACCATCTATGCACAAAAATTCCAAGGC (서열번호 25)	CGTTACTTCTACTACCAGTCTGAAGCATTCGATTAC (서열번호 26)

항체	CDRL1	CDRL2	CDRL3
3A10-F1 (H1)	CGCGCTAGCCAGACTATCTCTTCTTGGCTGAAC (서열번호 27)	GCAGCATCCCGTCTGCAGTCT (서열번호 28)	CAGCAATCTTACTCTACTCCGCTGACG (서열번호 29)
4E3-F2 (M3)	CGCGCTAGCCAGTCTATCTCTAATTACCTGAAC (서열번호 30)	GCAGCATCCACTCTGCAGTCT (서열번호 31)	CAGCAATCTTACTCTTTTCCGCTGACG (서열번호 32)

<110> KIM, DAEYOUNG <120> Human monoclonal antibodies targeting YKL-40 <130> TY76004K <160> 32 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A10-F1 (H1)_heavy variable chain <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Val Gly Thr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4E3-F2 (M3)_heavy variable chain <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser 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tcttacgata tccattgggt gcggcaggcg 120 cccggccagg gtctcgaatg gatggggatc atttctccat acctgggtat caccatctat 180 gcacaaaaat tccaaggccg cgtaactatt accgccgacg aatcaacctc caccgcctac 240 atggaactca gctctctgag gtcagaagac acggccgtct attattgcgc cagacgttac 300 ttctactacc agtctgaagc attcgattac tggggtcagg gtactctggt taccgtctca 360 tcg 363 <210> 19 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A10-F1 (H1)_light variable chain <400> 19 gacattcaaa tgacgcagag tccctcctca ctgagtgcta gcgtgggcga tcgtgtgaca 60 attacttgtc gcgctagcca gactatctct tcttggctga actggtatca gcagaaaccg 120 ggcaaggcgc caaaattgct gatttacgca gcatcccgtc tgcagtctgg tgtaccgtcc 180 cgtttctctg gcagcggttc tggtacggat tttaccctga ccatctcaag cctccagcct 240 gaagattttg ccacctatta ttgtcagcaa tcttactcta ctccgctgac gttcgggcag 300 ggaactaaag tggaaattaa a 321 <210> 20 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4E3-F2 (M3)_light variable chain <400> 20 gacattcaaa tgacgcagag tccctcctca ctgagtgcta gcgtgggcga tcgtgtgaca 60 attacttgtc gcgctagcca gtctatctct aattacctga actggtatca gcagaaaccg 120 ggcaaggcgc caaaattgct gatttacgca gcatccactc tgcagtctgg tgtaccgtcc 180 cgtttctctg gcagcggttc tggtacggat tttaccctga ccatctcaag cctccagcct 240 gaagattttg ccacctatta ttgtcagcaa tcttactctt ttccgctgac gttcgggcag 300 ggaactaaag tggaaattaa a 321 <210> 21 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A10-F1 (H1)_CDRH1 <400> 21 aattatgcaa tgtct 15 <210> 22 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A10-F1 (H1)_CDRH2 <400> 22 ggtatctctg gttctggtgg tactacttac tatgccgatt cagtgaaggg t 51 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A10-F1 (H1)_CDRH3 <400> 23 gttggtactt tcgatgtt 18 <210> 24 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4E3-F2 (M3)_CDRH1 <400> 24 tcttacgata tccat 15 <210> 25 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4E3-F2 (M3)_CDRH2 <400> 25 atcatttctc catacctggg tatcaccatc tatgcacaaa aattccaagg c 51 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4E3-F2 (M3)_CDRH3 <400> 26 cgttacttct actaccagtc tgaagcattc gattac 36 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A10-F1 (H1)_CDRL1 <400> 27 cgcgctagcc agactatctc ttcttggctg aac 33 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A10-F1 (H1)_CDRL2 <400> 28 gcagcatccc gtctgcagtc t 21 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3A10-F1 (H1)_CDRL3 <400> 29 cagcaatctt actctactcc gctgacg 27 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4E3-F2 (M3)_CDRL1 <400> 30 cgcgctagcc agtctatctc taattacctg aac 33 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4E3-F2 (M3)_CDRL2 <400> 31 gcagcatcca ctctgcagtc t 21 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4E3-F2 (M3)_CDRL3 <400> 32 cagcaatctt actcttttcc gctgacg 27

Claims

YKL-40 에 특이적으로 결합하는 단일클론항체로서,
상기 단일클론항체는 하기의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체:
(1) 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는
(2) 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1, 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역.
삭제
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 단일클론항체는 하기의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 및
(b) 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역.
제 1 항에 있어서,
상기 단일클론항체는 하기의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체:
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 및
(b) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역.
제 1 항에 있어서,
상기 단일클론항체는 인간화 항체인 것을 특징으로 하는 단일클론항체.
제 1 항의 단일클론항체를 코딩하는 핵산분자.
제 7 항에 있어서,
상기 핵산분자는 하기의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
(a) 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
(b) 서열번호 27의 염기서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 28의 염기서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역.
제 7 항에 있어서,
상기 핵산분자는 하기의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
(a) 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
(b) 서열번호 30의 염기서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 31의 염기서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 32의 염기서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역.
제 7 항에 있어서,
상기 핵산분자는 하기의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
(a) 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 및
(b) 서열번호 19의 염기서열로 이루어진 경쇄 가변영역.
제 7 항에 있어서,
상기 핵산분자는 하기의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
(a) 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 및
(b) 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 경쇄 가변영역.
제 7 항의 핵산분자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제 12 항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제 1 항의 단일클론항체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 14 항에 있어서,
상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 뇌암, 자궁암, 비인두암, 후두암, 두경부암, 결장암, 난소암, 직장암, 대장암, 질암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 요관암, 요도암, 전립선암, 기관지암, 방광암, 신장암 및 골수암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항의 단일클론항체를 유효성분으로 포함하는 암의 진단용 조성물.
제 16 항에 있어서,
상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 뇌암, 자궁암, 비인두암, 후두암, 두경부암, 결장암, 난소암, 직장암, 대장암, 질암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 요관암, 요도암, 전립선암, 기관지암, 방광암, 신장암 및 골수암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.