KR101739489B1 - 인간 유래 항-인간 표피 생장인자 수용체 항체 및 그의 코딩 유전자와 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 유래 항-인간EGFR 항체 및 그의 코딩 유전자와 용도에 관한 것이다. 본 발명은 유전자 공정 수단과 박테리오파지 표면 디스플레이 기술을 통하여 완전 합성 단쇄 인간 항체 라이브러리에서 항-인간EGFR의 유전자 공정 단쇄 항체를 선별해낸 후 그의 항체 가변 영역 유전자 서열를 얻은 것을 기초로, 완전 인간 단일클론항체를 구축하였으며 추가적으로 고순도의 항체 단백질을 얻었다. 본 발명의 항체 및 그의 돌연변이체와 인간 EGFR 결합의 친화력은 각각 1nM 미만 및 10nM 미만이며, 또한 항체 단백질 IgG의 면역활성과 생물학적 활성을 검증을 완료하였으며 항체가 EGFR 발현 세포 A431 종양 모델 마우스(tumor-bearing model mouse)의 종양 생장을 억제하는 우수한 생물학적 활성을 갖고 있는 것을 확인하였다. 본 발명은 EGFR 표적 종양 및 기타 질병, 예를 들면 염증과 자가 면역성 질병의 예방과 치료를 위한 특이적 항체 약물을 제공하였다.

Description

인간 유래 항-인간 표피 생장인자 수용체 항체 및 그의 코딩 유전자와 용도{FULLY HUMAN ANTI-HUMAN EPIDEMIC GROWTH FACTOR RECEPTOR ANTIBODIES AND ENCODING GENES AND APPLICATION OF THE ANTIBODIES}
본 발명은 치료용 인간 유전자 재조합 항체의 제조 및 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 인간 표피 생장인자 수용체(epidemic growth factor receptor, EGFR）에 대하여 특이적인 항체 및 그의 코딩 유전자와 용도에 관한 것이다.
표피 생장인자 수용체(EGFR)는 표피 생장 인자 유전자(erbB) 패밀리중의 일원으로 여러가지 종양, 예를 들면 유방암, 결장암, 두경부종양, 신장암, 폐암, 췌장암, 전립선암의 발전에 모두 중요한 영향을 미친다. 국내외 많은 연구에서 EGFR에 대한 항체는 세포외에서 리간드의 결합을 차단함으로써 EGFR 신호 전달 경로를 효과적으로 억제하고, 여러가지 EGFR로 인한 인체 종양의 발현, 특히 두경부 편평 상피세포암(80%~100%), 결직장암(25%~77%), 비소세포형폐암(40%~80%), 췌장암 등에 대하여 비교적 좋은 효과가 있다고 밝혔다. 표피 생장인자 수용체는 최근 비교적 깊은 연구를 거친, 또한 많은 주목을 받고 있는 종양 치료 표적 중의 하나이며, 유전자 재조합 수단을 응용하여 항 EGFR 단일 클론 항체를 연구, 제조하는 것은 현재 종양 치료 R&D의 핫 이슈중의 하나이다.
현재, 2주의 항-EGFR 치료성 항체가 이미 미국 FDA의 인허가를 받았는 바, 각각 EGFR에 대한 마우스-인간 키메라 항체 Cetuximab (상품명: erbitux)와 완전 인간 항체 Panitumumab이며, 결직장암과 두경부 종양치료에 사용된다. 항-EGFR 인간 유래 항체 Nimotuzumab (상품명: 泰欣生)은 2005년에 중국 식약청(CFDA)에서 허가를 받은 I류 신약 증서를 획득하였다. 해당 표적을 연구하고 있는 항체는 인간 유래 단일 클론 항체 Pertuzumab, 인간 유래 항체 Zalutumumab와 Necitumumab 등을 포함한다. 이들이 결합한 항원 에피토프(epitope)가 완전히 일치한 것은 아니지만 모두 EGFR 매개성을 억제하는 생물학적 기능을 발휘할 수 있다.
인간 유래 항체는 치료성 항체 발전의 종국적인 방향이며 임상에서 인간 유래 항체를 응용하면 항체의 면역원성을 최대한도로 감소시키고 체내에서의 항체의 반감기를 연장할 수 있으며, 또한 인간 면역 글로불린 Fc를 사용하여 면역조절, ADCC 및 CDC 효과와 반응을 유도함으로써 항체의 생물학적 효과를 강화시킬 수 있다. 인간 항체의 주요 연구제조 수단으로는 주로 항체 라이브러리 기술과 형질전환 마우스 기술을 포함한다. 현재, 대용량 항체 라이브러리 기술은 이미 완성도가 매우 높으며, 특히 박테리오파지 디스플레이 항체 라이브러리(phage display antibody library) 기술은 이미 성공적으로 여러 주의 완전 인간 유래 항체의 성공적인 출시를 실현하였다. 이미 구축된 대용량 항체 라이브러리 중 CAT사의 반합성 항체 라이브러리와 Marphosys AG사의 완전 합성 항체 라이브러리는 가장 대표성을 갖고 있으며 제일 성공한 사례이다. 특히, Marphosys AG사의 HuCAL GOLD기술을 통하여 이미 수십 주의 개발가치가 있는 후보 항체를 얻었으며 현재 17개의 항목이 임상단계에 진입하였다. 해당 기술의 가장 큰 이점은 합리적인 설계를 통하여 항체 라이브러리를 최적화할 수 있다는 것이며 그 외 항체 프레임 유전자의 구조는 교체 가능한 상자형의 구조이므로 추후의 항체 최적화와 개조에 도움이 된다. 이러한 이점에 기초하여, 현재 HuCAL 라이브러리는 이미 항체 라이브러리를 제3대까지 업그레이드시켰고 라이브러리 용량이 4.5×1010에 달하였으며 항체 라이브러리에서 친화력이 pM수준에 달하는 고친화력의 항체를 선별할 수 있다. 이로 인하여 항체 라이브러리 기술을 이용하여 치료성 인간 유래 항체를 얻는 것은 현재 이미 기술적으로 매우 성숙되었는 바, 현재 가장 성공적인 치료성 항체 개발 수단 중의 하나로 간주되고 있다. 출원인은 기술에 대한 최적화와 탐색을 통하여 고효능 DNA 연결 및 전환방법을 발명하였으며, 이를 대용량 박테리오파지 항체 라이브러리의 구축에 사용하여 라이브러리 용량이 1.35×1010에 달하는 대용량 완전 합성 박테리오파지 단쇄 인간 항체 라이브러리(ZL.200910091261.8)를 구축하였으며, 또한 상기 항체 라이브러리를 이용하여 여러개의 상이한 표적에 대하여 특이적인 항체를 선별하여 얻었다. 본 발명에서 얻은 항체 Ame55는 바로 항체 라이브러리로부터 선별하여 얻은 것이다.
본 발명은 EGFR 발현 관련 질병의 치료 및 예방에 사용되는 항체치료, 특히 EGFR을 발현하는 종양과 자가 면역성 질병의 치료 및 예방에 사용되는 항체치료를 제공하였다.
본 발명의 첫번째 목적은 인간 유래 항-EGFR 항체 및 그의 활성 단편(active fragment)의 아미노산 서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 활성 단편을 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 및 그의 활성 단편의 EGFR를 발현하는 악성 종양과 자가 면역성 질병을 치료하는 약물 중에서의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 박테리오파지 표면 디스플레이 기술을 응용하여 대용량 완전합성 인간 유래 단쇄 항체 라이브러리로부터 수차례의 바이오패닝(bio-panning)을 통하여 특이적인 항-인간EGFR의 단쇄항체(single chain variable fragment, scFv)를 선별하여 얻었다. 본 발명의 실시예에서 상기 항체 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 각각 완전 항체 포유동물 세포의 일과성 발현벡터(transient expression vector) pABL과 pABG1 중에 도입하고 HEK 293T 세포를 공형질도입(cotransfection)하는 것을 통하여 일과성 분비발현을 진행하여 완전 항체 Ame55를 얻었다.
본 발명에서 제공한 항체 가변 영역 아미노산 서열 패턴은 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4이다. 여기서 FR1~4는 4개의 프레임 구역을 표시하고 CDR1~3은 3개의 초가변(hypervariable) 영역을 표시한다. FR1~4는 불변 영역(constant region) 서열로부터 분리하여 얻은 것일 수 있으며(예를 들면, 인간 면역 글로불린의 경중쇄형, 아형 또는 아패밀리에 사용되는 가장 보편적인 아미노산), 각각의 항체 프레임 구역으로부터 분리하여 얻은 것, 또는 상이한 프레임 구역 유전자를 조합하여 얻은 것일수도 있다. 예를 들면, Kabat 등 라이브러리 중에 수록된 수많은 인간 항체 프레임 구역 서열이다.
그 중, 중쇄 가변 영역은 인간 면역 글로불린 아형 인간 중쇄 VH V 패밀리이고 경쇄 가변 구역은 Lambda III 패밀리이다. 경중쇄의 CDR영역에 대하여, 알라닌 스캔 및 기타 같은 형의 아미노산 돌연변이를 통하여 대량의 돌연변이체를 얻는다. 경쇄 CDR1, CDR2과 CDR3의 돌연변이체에 대한 평가결과가 제시하는 바로는 CDRL1서열이 SGDX1LGDKYX2X3 (서열번호 1)이며, 여기에서 X1은 Ala, Gly, Asn, Lys일 수 있으며 바람직하게는 Lys와 Gly이며; X2는 Ala, Val과 Ile 일 수 있으며, 바람직하게는 Ala이며; X3은 Ser과 Tyr일 수 있으며, 바람직하게는 Ser이다. CDR2L 서열은 EDX1KRPS（서열번호 2）이며, 여기에서 X1은 Ser, Thr, Ala와 Gly일 수 있으며 바람직하게는 Ser이다. CDRL3 서열은 X1X2WDX3DWX4MP（서열번호 3）일 수 있으며, 여기에서 X1은 Ser, Ala, Gly, Leu, Asn, Tyr과 Gln이며, 바람직하게는 Ser이며; X2는 Val, Ser, Ala와 Leu일 수 있으며, 바람직하게는 Ser 또는 Ala이며; X3은 Gly, Ala와 Pro일 수 있으며, 바람직하게는 Gly이며; X4는 Gly와 Ser일 수 있으며, 바람직하게는 Gly이다. 중쇄 CDR2와 CDR3의 돌연 변이체에 대한 평가 결과가 표명한 바로는 CDRH2 서열은 X1IIYPX2DSDTRYSPSFQ(서열번호 5)이며, 여기에서 X1은 Gly과 Ser일 수 있으며, 바람직하게는 Gly이며; X2는 Gly 와 Ser일 수 있으며, 바람직하게는 Gly이며; CDR3H서열은 GIIYPSNVX1V（서열번호 6）이며, 여기에서 X1은 Ala, Ser과 Gly일 수 있으며, 바람직하게는 Ser 또는 Ala이다. 상기 항체의 경중쇄 CDR 구역에 대하여 알라닌 스캔을 진행한 결과로부터 알 수 있듯이 경중쇄 CDR3 및 경쇄 CDR1와 중쇄 CDR2가 항체와 EGFR의 결합에 있어서 매우 중요하다. 한 개 아미노산의 변화일지라도 몇 배 내지 몇십 배의 친화력의 변화를 일으킬 수 있으며, 구체적 내용은 실시예 5를 참조할 수 있다.
본 발명에서 제공한 인간 유래 항-인간EGFR 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
추가로, 그의 경쇄 가변 영역은 서열번호 1과 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
추가로, 그의 경쇄 가변 영역은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
추가로, 본 발명에서 제공한 인간 유래 항-인간EGFR 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 5와 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
추가로, 그의 중쇄 가변 영역은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 더 포함한다.
추가로, 그의 중쇄 가변 영역은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에서 제공한 인간 유래 항-인간EGFR 항체는 단쇄 항체, Fab, 마이크로 항체, 키메라 항체 또는 완전항체 면역 글로불린 IgG1, IgG2, IgA, IgE, IgM, IgG4, IgD이다.
본 발명에서 제공한 인간 유래 항-인간EGFR 항체 Ame55의 중쇄 가변 영역은 VH5에서 유래된 것이고 경쇄 가변 영역은 Vl3에서 유래된 것이며 그의 항체 아형은 IgG1이다.
본 발명에서 제공한 인간 유래 항-인간EGFR 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에서 제공한 인간 유래 항-인간EGFR 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 5와 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게, 본 발명에서 제공한 인간 유래 항-인간EGFR 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에서 제공한 인간 유래 항-인간EGFR 항체는 적어도 약 10-8M의 친화력으로 인간 EGFR에 결합된다. 상기 항체는 EGFR 리간드가 인간EGFR에 결합하는 것을 억제한다. 상기 항체는 EGFR을 발현하는 세포에 결합되며; 상기 세포는 인간 피부암 세포, 인간 간암세포, 인간 결장암 세포, 인간 자궁 경부암 세포, 난소암 세포, 인간 폐암세포, 방광암 세포, 유방암 세포, 신장암 세포, 전립선암 세포, 두경부 종양 편평상피세포, 췌장암 세포, 활막 섬유아세포, 또는 각질 형성 세포이다.
본 발명은 상기 항체를 코딩하는 유전자를 제공하였다.
그 중, 경쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:
1) 서열번호 9로 표시되는 DNA서열;
2) 엄격한 조건하에서 1)에서 한정한 DNA서열과 혼성화하고 상기 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드;
3) 1)에서 한정한 DNA서열과 70%이상의 상동성을 갖고 있고 상기 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드.
본 발명 중, "엄격한 조건"이라 함은 (1) 비교적 낮은 이온 강도와 비교적 높은 온도하, 예를 들면, 0.2×SSC, 0.1% SDS, 60℃에서의 혼성화(hybridizing)와 용리(eluting); 또는 (2) 혼성화시 변성제를 첨가하는 것, 예를 들면 50%（V/V）의 포름아미드, 0.1%의 송아지혈청/0.1 Ficoll，42℃ 등; 또는 (3) 두 개 서열간의 상동성이 적어도 70%이상, 바람직하게는 적어도 80%이상, 더욱 바람직하게는 적어도 90%이상, 더더욱 바람직하게는 적어도 95% 이상에서만 혼성화가 발생한다는 것이다.
그 중, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:
1) 서열번호 10으로 표시되는 DNA서열;
2) 엄격한 조건하에서 1)에서 한정한 DNA서열과 혼성화하고 상기 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드;
3) 1)에서 한정한 DNA서열과 70%이상의 상동성을 갖고 있고 상기 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드.
또한, 코돈의 축퇴(Codon degeneracy)를 고려하여 본 발명의 상기 항체를 코딩하는 유전자는 서열번호 9와 서열번호 10일 수 있지만 이에 한정된 것은 아니다. 예를 들면, 코딩 구역에서 아미노산 서열을 변화시키지 않는 조건하에서 상기 항체를 코딩하는 유전자 서열에 대하여 변형을 진행하여 같은 항체를 코딩하는 유전자를 얻을 수 있다. 당업자는 항체의 발현효율을 제고시키기 위하여 항체 숙주를 발현하는 코돈의 선호도에 근거하여 인공합성을 진행하여 유전자를 개조할 수 있다.
본 발명은 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 상기 발현 벡터의 숙주균, 숙주세포 또는 발현 카세트(expression cassette)를 제공한다.
본 발명은 박테리오파지 디스플레이 항체 라이브러리 기술을 이용하여 항-EGFR 특이적 단쇄 항체를 선별하여 상기 항체의 경쇄, 중쇄 가변 영역 유전자를 얻고, 상기 항체 경쇄, 중쇄 가변 영역 유전자를 클로닝하여 완전(intact) 항체 발현 벡터에 도입하고, 포유동물 발현 시스템 또는 기타 발현 시스템을 통해 완전 항체 발현을 진행하여 완전 항체 단백질을 얻는 단계를 포함하는 상기 항체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 상기 항체가 EGFR을 표적으로 하는 질병 치료약물을 제조함에 있어서의 용도를 제공한다.
상기 약물은 항종양약, 항염증약 또는 자가면역성 질병 약물이다.
상기 항체를 포함하는 약물 또는 검출시약도 본 발명의 보호범위에 속한다.
추가로, 상기 항체를 포함하는 약물 또는 검출시약은 다른 한가지 이상의 항체와 본 발명의 항체를 혼합하여 혼합제제를 구성할 수 있다. 상기 항체 혼합물 중의 다른 한가지 이상의 항체는 다른 항원 또는 EGFR의 상이한 에피토프에 대한 기타 항체일 수 있다. 연구에서 증명된 바로는 질병과 관련된 여러개의 표적에 대하여 약을 조합하여 투여하는 것은 치료성 항체의 중요한 연구방향이다. 예를 들면, EGFR 과 VEGFR 두개의 표적에 대하여, EGFR과 ErbB2 두 개 표적의 항체를 조합하여 사용함에 있어서 항종양 시너지 효과가 있고（Pennell NA, Lynch TJ. The Oncologist. 2009, 14: 399-411; Galer CE, Corey CL, Wang ZY, et al. Head Neck. 2011, 33(2): 189-198; Kawaguchi Y, Kono K, Mimura K, et al. British J Cancer, 2007, 97,494-501）； EGFR 의 상이한 에피토프에 대한 항체 연합 사용에 있어서도 명확한 항종양 시너지 효과가 있다（Pedersen MW, Jacobsen HJ, Koefoed K, et al. Cancer Res. 2010, 70: 588-597）. 따라서 본 발명의 항체와 기타 항체의 혼합제제도 보호범위에 속한다.
본 발명은 또한 다양한 연결 형태로 세포 독성제에 연결된 상기 인간 유래 항-EGFR 항체를 포함하는 항체 표적 약물을 제공한다.
상기 다양한 연결 형태는 항체를 표지(labeling)하는 것, 체외가교(in vitro cross-linking) 또는 분자 커플링(molecular coupling)이다.
상기 세포 독성제는 화학분자, 방사성 동위원소, 폴리 펩티드, 독소 및 기타 세포를 사멸시키거나 또는 세포자살(apoptosis)를 유도하는 특성을 갖는 물질이다.
본 발명에서 제공한 항체는 완전 항체 또는 각종 기타 형식의 유전자 재조합 항체이다. 예를 들면, 항-EGFR 항체는 완전 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 항체분자 자체가 치료와 진단에 사용될 수 있다. 항체는 표지될 수 있고, 가교 또는 커플링 및 기타 단백질 또는 폴리 펩티드와 융합하여 발현하여 복합물(예들 들면, 세포 독성 물질, 방사성 독소 및/또는 화학 분자 등)을 형성하여 진단과 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 항체를 코딩하는 단독 유전자, 발현 벡터, 벡터를 숙주세포에 형질주입시키는 것과 관련된 제어 기술 및 숙주세포, 항체 발현 과정 및 세포배양 상청액에서 항체를 회수하는 것을 제공한다. 본 발명은 또한 항체를 포함하는 성분과 약리상에서 허용 가능한 전달분자 또는 용액을 제공한다. 본 치료용 성분은 무균이고, 저온에서 동결건조할 수 있다.
본 발명은 EGFR이 유도하는 한가지 이상의 생물활성을 억제할 수 있는 항-EGFR 항체를 제공한다. 본 항체는 EGFR과 그의 리간드의 결합을 저해하는 것을 통하여 작용을 발휘하며, EGFR을 발현하는 세포를 사멸시키는 것을 통하여 작용을 발휘할 수 있으며, 또는 EGFR과 결합 후 복합물이 내면화(internalization)되어 세포 표면의 EGFR를 소모하는 것을 통하여 작용을 발휘한다. EGFR 길항제가 갖고 있는 모든 간섭기능은 모두 동등하게 본 발명의 목적으로 보아야 할 것이다.
여기에서 공개하고 보호하고자 하는 서열번호 1~8로 표시되는 서열은 "보존된 서열 변형(conserved sequence modification)", 즉 상기 항체 또는 상기 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특징에 대해 큰 영향이 없고 또한 상기 특징이 변화하지 않는 뉴클레오티드와 아미노산 서열 변형을 포함한다. 상기 보존된 서열 변형은 뉴클레오티드 또는 아미노산의 교체, 첨가 또는 결실을 포함한다. 본 분야의 표준기술, 예를 들면 위치지정 돌연변이와 PCR 유도 돌연변이 등으로 변형을 서열번호 1~8중에 도입할 수 있다. 본 발명의 실시예에서와 같이 항체 CDR 구역에 대하여 알라닌 스캔을 진행하고 부분 좌위에 대하여 아미노산 돌연변이를 진행하는 것은 보존된 서열 변형의 실시예이다. 보존된 아미노산의 교체는 아미노산 잔기가 유사한 측쇄(side chain)를 갖는 아미노산 잔기 또는 기타 아미노산 잔기에 의해 교체되는 것을 포함한다. 본 분야에서는 이미 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리에 대하여 정의를 내렸다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(아스파르트산, 글루타민산), 전기를 띄지 않는 극성 측쇄를 갖는 아미노산(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β 분지 측쇄를 갖는 아미노산(트레오닌, 발린, 이소류신)과 방향 측쇄를 갖는 아미노산(타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 그러므로 동일한 측쇄 패밀리에서 유래한 다른 아미노산 잔기로 인간 항-EGFR 항체 중의 필수가 아닌 아미노산을 교체하는 것이 바람직하다.
그러므로, 여기에서 공개한 뉴클레오티드가 코딩한 항체 및/또는 여기에서 공개한 아미노산 서열을 포함한 항체 즉, 보존된 서열로 변형된 것과 유사한 서열로 코딩한 항체, 또는 보존된 서열로 변형된 것과 유사한 서열을 포함하는 항체는 모두 본 발명의 범주에 속한다고 보아야 할 것이다.
본 발명은 본 발명에서 제공한 상기 항체 또는 항체의 항원 결합부위를 포함하는 이중특이성 또는 다중특이성 분자를 제공한다.
본 발명은 본 발명에서 제공한 상기 항체, 및 모종의 기능을 갖고 있는 기타 단백질 또는 폴리페티드 분자의 복합물을 포함하는, 항체와 기타 단백질 및/또는 폴리 펩티드의 융합 단백질을 제공한다.
추가로, 상기 융합 단백질은 항체 유전자와 다른 한가지 항체 또는 항체 단편, 면역 독소 또는 세포 유전자를 연결하여 재조합 발현 벡터를 구축하고, 포유동물 세포 또는 기타 발현 시스템을 통하여 재조합 융합 단백질 분자를 얻는다.
본 발명에서 서술한 항체 Ame55는 양호한 치료 응용 전망을 갖고 있는 바, 이는 주로 재조합 인간 EGFR과 특이적 결합 활성을 갖고 있고 또한 A431 세포 표면의 천연 EGFR와 특이적 결합을 진행하는 것으로 나타난다. 상기 항체는 ELISA와 면역군 실험을 거쳐 특이성의 양호함을 증명하였으며; Western Blot결과가 증명한 바로는 오직 비환원상태의 EGFR와 특이적 결합을 하고, 환원상태 EGFR와 결합하지 않거나 결합이 약하다.
Biacore 시스템을 이용하여 상기 항체가 EGFR와의 다양한 형태의 결합능력에 대해 검출을 진행한 결과가 표명한 바로는 상기 항체와 재조합 EGFR 세포외부부위(extracellular region)-Fc 융합 단백질의 친화력 KD가 0.23nM(Biacore3000)라는 것이다. 유세포 분석을 진행한 결과 상기 항체와 A431세포 표면의 EGFR 결합의 상대 친화력은 시판중의 항체 Nimotuzomab보다 높고 시판중의 항체 Erbitux와 동등하다. 본 발명의 실시예에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 EGFR 항체가 인간 EGFR와의 결합의 친화력은 1nM보다 크지 않고, 그의 돌연변이체 친화력은 10nM보다 크지 않다.
상기 항체는 체외에서 Erbitux과 EGFR의 결합을 억제할 수 있으며, 이와 반대로, Erbitux도 상기 항체와 EGFR의 결합을 억제할 수 있다. 이는 상기 항체가 Erbitux 에피토프와 공간구조상에서 중첩이 있다는 것을 말한다. 상기 항체는 EGF와 EGFR의 결합의 억제를 경쟁할 수 있다.
상기 항체는 A431 세포의 이동활성을 크게 억제할 수 있다. 세포 스크래치 유합(coalescence) 실험 결과는 항체가 5-50mg/ml 농도하에서 A431세포의 스크래치 유합을 크게 억제하는 것을 보여주었다. 동시에 상기 항체는 A431 세포성장에 큰 억제 작용이 있다.
상기 항체는 A431 이식 종양 성장에 뚜렷한 억제작용이 있다. 마우스 당1mg/3d의 량으로 투여할 경우, 종양의 억제율이 90%이상에 달할 수 있고, 마우스 당 0.2mg/3d의 량으로 투여할 경우, 종양 억제율이 60%이상에 달할 수 있다.
항체에 대하여 위치 지정 돌연변이를 진행하여 친화력이 5배이상 제고된 여러 주의 돌연변이체 항체를 얻었다. 돌연변이체 항체의 체내 종양 억제 활성이 추가로 개선되었으며 부분 항체, 예를 들면, AmeA2, AmeA2C3, AmeA2C3-HI2, AmeA2C1, AmeA1C1가 0.2mg/3d의 량으로 사용될 경우 종양 억제율이 80%보다 높다.
본 발명은 대용량 완전 합성 항체 라이브러리 기술을 이용하여 1주의 항-EGFR 완전 인간 유래 항체와 일련의 친화력이 변하지 않거나 제고된 돌연변이체 항체를 선별하여 얻었고, 또한 발명한 항체가 모두 EGFR와 특이적 결합을 하고 그의 생물학적 기능을 억제하는 것을 증명하였다. 상기에서 얻은 완전 인간 유래 항-EGFR 유전자 재조합 항체 가변 영역 유전자 및 항체 유전자 특성하에서의 완전 항체 유전자를 이용하여 원핵세포, 효모세포, 진핵세포 및 임의의 재조합 시스템 중에서 상기 항체를 발현하고 생산할 수 있으며, 혹은 이를 기초로 하여 재건한 후의 상기 항체를 포함하는 임의의 기타 유전자를 사용하여 EGFR를 억제하는 생물 활성을 갖고 있는 항체 산물을 얻을 수 있다; 혹은 체외마커 또는 가교의 방법을 이용하여 얻은 복합물을 사용함으로써, 임상에서 EGFR을 과도발현 또는 돌연변이 발현하는 악성 종양 및/또는 자가 면역성 질병의 치료에 사용되는 특이적 항체 약물을 제조할 수 있다.
도 1은 Ame55 박테리오파지 항체의 특이성 분석을 나타낸 것이다.
도 2는 Ame55가 Protein A 칼럼을 지나 1 단계로 정제한 후의 SDS-PAGE 전기 이동도를 나타낸 것이고, 그 중 1: Pr Marker； 2: Erbitux； 3: Ame55； 4: Nimotuzumab이다.
도 3은 Western Blot로 검증한 Ame55와 EGFR의 결합을 나타낸 것이고, 그 중 1：비변성 EGFR- Erbitux； 2：변성 EGFR- Erbitux； 3：비변성 EGFR-Ame55； 4：변성 EGFR-Ame55； 5：비변성 EGFR-Nimotuzumab； 6：변성 EGFR- Nimotuzumab 이다.
도 4는 Ame55와 A431 세포결합 간접 면역 형광 검사 도면을 나타낸 것이며, 그 중 A : Avastin -A431； B: Ame55-A431； C: Erbitux -A431； D: Nimotuzumab -A431 이다.
도 5는 유세포분석에 따른 Ame55와 A431 세포 표면 EGFR 결합 상황 도면을 나타낸 것이고, 도 5a: 항체 농도：3μg/ml； 도 5b: 항체농도：0.3μg/ml； 도 5c: 항체농도：0.03μg/ml이고，1은 항체 Nimotuzumab; 2는 항체 Ame55，3은 항체 Erbitux이다.
도 6은 Biacore 측정에 따른 Ame55와 EGFR-Fc 친화력 결과 도면을 나타낸 것이다.
도 7은 Ame55와 Erbitux의 상호 경쟁 억제 작용을 나타낸 것이고 그 중
도 7a: 1：EGFR-Fc 결합； 2：PBST 세척； 3：Ame55-결합； 4：PBST 세척；
도 7b: 1：EGFR-Fc 결합； 2：PBST 세척； 3：Erbitux-결합； 4：PBST 세척；
도 7c: 1：EGFR-Fc 결합； 2：PBST 세척； 3：Erbitux-결합； 4：PBST 세척；
도 7d: 1：EGFR-Fc 결합； 2：PBST 세척； 3：Ame55-결합； 4：PBST 세척；
이고, 도 7a와 도 7b의 고정상은 Ame55이고，도 7c과 도 7d의 고정상은 Erbitux이다.
도 8은 Ame55가 EGF와 EGFR 결합에 대한 경쟁 억제 작용 도면을 나타낸 것이고, 1：공백대조군； 2：Ame55와 EGFR 몰비 3:1； 3：Ame55와 EGFR 몰비 2:1； 4：Ame55와 EGFR 몰비 1:1； 5：Ame55； 6：EGFR； 7：Erbitux와 EGFR 몰비 3:1； 8：Erbitux와 EGFR 몰비 2:1； 9：Erbitux와 EGFR 몰비 1:1； 10：Erbitux ； 11：관련이 없는 항체 대조군과 EGFR 몰비 3:1； 12：관련이 없는 항체와 EGFR 몰비 2:1； 13：관련이 없는 항체와 EGFR 몰비 1:1； 14：관련이 없는 항체 대조군이다.
도 9는 Ame55와 Erbitux, Nimotuzumab, adalimumab, 공백 대조군의 A431 세포 이동 능력에 대한 억제 작용 도면을 나타낸 것이다.
도 10은 Ame55와 Erbitux, Nimotuzumab, PBS 대조군의 A431 세포 생장에 대한 억제 작용 도면을 나타낸 것이다.
도 11은 Ame55의 A431 종양 이식 마우스(Mice bearing tumor) 종양 생장에 대한 억제 작용 도면을 나타낸 것이다.
도 12는 Ame55의 A431 종양 이식 마우스의 종양에 대한 억제 작용 도면을 나타낸것이다.
도 13은 Ame55의 A431 종양 이식 마우스의 종양에 대한 억제 작용 도면을 나타낸 것이다.
도 14는 Ame55 및 그의 돌연변이체의 항체 종양 이식 마우스 생장 억제 활성 비교도를 나타낸 것이고, 도 14a: 종양 체적의 동적관측； 도 14b：종양 중량 측정 통계 결과이며, 1：Ame55； 2：AmeA1C1； 3：AmeA1C3； 4：AmeA1C3-HI2； 5：AmeA2； 6：AmeA2C1； 7：AmeA2C3； 8：AmeA2C3-HI2； 9：Erbitux； 10：IgG대조군이다.
도 15는 Ame55 경쇄가 다른 관련이 없는 중쇄와 조합한 돌연변이체 Ame-9B의 친화력 측정 도면을 나타낸 것이며, 그 중 1：Ame55； 2：Ame-9B이다.
도 16은 진핵 일과성 발현 플라스미드 pABL과 pABG1의 벡터 설명도이다.
하기 실시예는 본 발명을 추가로 설명하는데 사용되나 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다. 본 발명의 주지와 실질적 내용을 위배하지 않는 상황하에서 본 발명의 방법, 절차 또는 조건에 대한 수정과 교체는 모두 본 발명의 범위에 속한다.
만약 구체적으로 지적하지 않았다면 실시예 중에서 사용되는 기술수단은 당해 분야의 기술자가 숙지한 통상적인 수단이고, 하기 실시예 중에서 사용한 원료, 시제 등과 관련하여 특별한 설명이 없는 경우, 모두 상업적으로 이용 가능한 상품이다.
[실시예 1] 대용량 박테리오파지 항체 라이브러리로부터 특이적 항체의 선별
ㄱ. 재료와 방법:
1. 원료: 대용량 완전 합성 박테리오파지 단쇄 항체 라이브러리는 중국인민해방군 군사의학과학원에서 구축한 것이며(ZL200910091261.8), 저장 용량은 1.35×1010이다. 항체 라이브러리를 선별하는데 사용한 항원은 구축한 포유동물 세포가 발현하고 정제한 EGFR-Fc 융합 단백질(농도: 1mg/ml)이고, 균주는 XL1-Blue (미국Stratagene); 사용한 박테리오파지는 M13KO7(미국 Invitrogene사)이다. 진핵 발현 벡터pABG1과 pABL는 룸에 저장된 것이고, 벡터 구조 정보는 도 16에 나타나 있으며, 포유동물 세포 HEK293T세포는 invitrogene사로부터 구입된 것이다.
2. 방법
2.1 EGFR-Fc 융합 단백질의 발현과 정제:
EGFR[Sino Biological Inc.로부터 구입; NCBI서열:NM_005228.3]의 세포외부부위(extracellular region)의 전체 길이를 선택하여 대상으로 정하고 서열번호 11과 서열번호 12에서 나타낸 바와 같이 Sense primer와 reverse primer, 즉 EGFRF와 EGFRR를 설계하고, PCR 증폭을 통하여 세포외부부위 영역 전체 길이의 유전자를 얻고, 제한 효소 자리 EcoR I와 Nhe I를 통하여 pABG1진핵 발현 벡터중에 클로닝하여 도입하고, 구축한 재조합 플라스미드는 시퀀스 측정 검증을 거쳐 정확하다고 판단된 후 플라스미드를 추출하고, HEK293T세포를 형질주입하여 일과성 발현을 진행하고, Protein A 친화성 크로마토그래피 칼럼을 거쳐 발현한 상청액에 대하여 정제를 진행하고, 또한 Bradford방법으로 정제산물에 대하여 단백질 정량을 진행한다.
2.2 EGFR-his 발현과 정제
이 단계는 방법 2.1을 기초로 완성되었다. 프라이머 EGFRR1(서열번호 13)을 설계하고 프라이머 EGFRF와 EGFRR1을 이용하여 EGFR 세포외부부위의 전체 길이 유전자를 증폭시키고, 제한 효소 자리 EcoR I와 Nhe I를 통하여 pABG1진핵 발현 벡터 중에 클로닝하여 도입하고, 구축한 재조합 플라스미드는 시퀀스 측정 검증을 거쳐 정확하다고 판단된 후 플라스미드를 추출하고, HEK293T세포를 형질주입하여 일과성 발현을 진행하고, Ni+친화성 크로마토그래피 칼럼을 거쳐 발현한 상청액에 대하여 정제를 진행하고, 또한 Bradford방법으로 정제산물에 대하여 단백질 정량을 진행한다.
2.3 Pharmacia사의 재조합 박테리오파지 선별 사용자 매뉴얼(Cat.NO.XY-040-00-05)을 참조하고 이를 경미하게 변형하여 박테리오파지 항체 라이브러리를 얻었으며 구체적으로는 하기와 같다.
냉동 보존한 항체 라이브러리를 취하여 200ml 2×YTCG(포도당 농도:0.5%) 배지 중에서 37℃하에서 OD600=0.5까지 배양하고, MOI=20:1의 비율로 보조 박테리오파지M13KO7을 첨가하고 실온에서 20min 방치한다. 37℃하에서 150rpm의 속도로 1h 동안 진탕기에서 천천히 진탕배양하고 카나마이신을 농도가 50μg/ml로 될 때까지 첨가하고 IPTG를 농도가 0.1mmol/L로 될 때까지 첨가하며 30℃하에서 220rpm의 속도로 10~12h동안 진탕배양하였다. 다음날, 원심처리를 진행하여 수득한 배양 상청액에1/5체적의PEG8000 buffer（20%PEG+2.5mol/L NaCl）를 첨가하여 혼합한 후 얼음위에 45min 동안 방치하여 박테리오파지를 침전하게 한다. 4℃에서 10000g을 20min 원심처리하여 상청액을 제거한 후 침전을 다시 2% BSA와 15% 글리세린을 함유하는 5ml의 PBS완충용액 중에서 현탁시킨 후, 이를 -70℃하에서 냉동 보존하여 예비용으로 준비해둔다.
2.4 박테리오파지 적정 농도의 측정
숙주균(XL1-Blue) 단일 클론을 선택하여 LB 배지에 접종시키고 37℃에서 대수생장기(OD600=0.5)까지 진탕배양한다. 제조한 박테리오파지 현탁액 50ml를 취하여 LB 배지를 사용하여 계열 10배 gradient dilution을 진행한다. 일정한 배수로 희석한 현탁액에 대수생장기의 숙주균을 첨가하고 37℃하에서 150~180rpm의 속도로 1h동안 진탕배양한다. 배양 후의 균액 100 또는 200ml를 취하여 LB 평판에 도포하고 37℃하에서 하루 밤 배양하여 다음날에 미생물 균락의 수량을 기록하고 적정 농도를 산정한다.
2.5 Pharmacia사의 재조합 박테리오파지 선별 사용자 매뉴얼(Cat.NO.XY-040-00-05)을 참조하고 이를 경미하게 변형하여 항-EGFR 특이적 항체의 바이오패닝을 수행하였으며, 구체적으로 하기와 같다.
재조합 단백질 항원 EGFR-Fc을 코팅액을 사용하여 20μg/ml로 희석하여 면역관을 코팅하고 1ml/관의 량으로 4℃하에서 하룻밤동안 코팅하여 하룻밤 지낸 후 다음날에 PBS로 면역관을 한번에 2min씩 2번 세척한 후 37℃하에서 2% BSA로 2h 블로킹한다. 제조한 박테리오파지 항체 라이브러리를 37℃하에서 블로킹 버퍼(2% BSA, 0.1% 트윈 20)로 30min 블로킹한다. 사전(pre) 블로킹 된 박테리오파지 항체 라이브러리를 블로킹 된 면역관 중에 첨가하여 4℃하에서 하룻밤동안 작용하게 한다. 면역관 중의 용액을 버리고 세척을 진행한다. 제1 라운드에서 매번 5min씩 10번 PBST 세척을 하고 매번 5min씩 5번 PBS 세척을 하며; 제2 라운드에서 매번 5min씩 15번 PBST 세척을 하고 매번 5min씩 10번 PBS 세척을 하며; 제3 라운드에서 매번 5min씩 15번 PBST 세척을 하고 매번 5min씩 15번 PBS+NaCl 세척을 한다. 0.2mol/L의 글리신-염산(pH2.2) 1ml를 첨가하여 용리하고 상온에서 10min 작용한 후 즉시 1mol/L의 Tris로 중화하여 pH가 7.4가 되도록 한다. 제 3라운드 선별 중에서 먼저 0.2mol/L의 글리신-염산(pH4.5) 1ml를 첨가하여 용리한 후 실온에서 10min 작용하도록 하고 용리액을 버리고 매번 3min씩 두번 PBS세척을 진행한다. 그다음 상규적인 방법으로 용리를 진행한다. 중화 후의 용리액을 흡출하고 그 중에 대수성장기의 대장간균 XL1-Blue 9ml를 첨가하고 37℃하에서 천천히 1h동안 진탕배양시키고; 동시에 PBS로 면역관을 한번 세척한 후 대수생장기의 대장간균 XL1-Blue 1ml를 사용하여 직접 감염시키고, 37℃하에서 150rpm의 속도로 1h 진탕배양시키고, 다음 용리 후의 감염균액과 직접 감염된 균액 중에서 각각 1%를 취하여 2×YTCTG 평판에 도포하고 37℃하에서 선명한 미생물 균락이 형성될 때까지 배양하고 클론 수량에 대하여 통계하여 투입 산출비를 산정한다. 동시에 남은 균액을 2×YTCTG 평판에 도포하고 37℃하에서 하룻밤 배양시킨다. 액체 2×YTCTG 배지를 사용하여 미생물 군체를 긁어내고, 적당한 량의 균액을 100ml의 2×YTCTG 액체 배지 중에 투여하고 37℃하에서 OD600=0.5될 때까지 진탕배양하고 MOI=20:1의 비율로 보조 박테리오파지 M13KO7를 첨가하고 실온에서 20min 방치한 후 30℃하에서 150rpm의 속도로 1h동안 진탕배양하여 등체적의 2×YTCTG 배지에 첨가하고 카나마이신을 최종농도가 50mg/ml가 될 때까지 첨가하고 IPTG를 최종농도가 0.15nM 될 때까지 첨가하며, 계속하여 30℃하에서 200rpm의 속도로 10h동안 진탕배양시키고 원심처리를 진행하여 배양 상청액을 수득한 후 1/5 체적의 PEG8000 완충액(20% PEG+2.5mol/L NaCl)에 첨가하고 균일하게 혼합한 후 얼음위에 45min 방치하여 박테리오파지를 침전시킨다. 4℃하에서 10000g을 20min 원심처리하여 상청액을 버리고 침전을 2% BSA를 함유하는 5ml의 PBS 완충용액 중에 다시 현탁시킨 후, 이를 -70℃하에서 냉동 보존하여 예비용으로 준비해 둔다. 3몫의 박테리오파지에 대하여 적정농도를 측정하고 비율에 따라 병합하여 다음 라운드 선별에 투입한다.
2.6 박테리오파지 ELISA에 의한 양성 클론 확인
선별후의 클론을 골라 깊은 96웰 플레이트에 넣고 매개 웰에 250μl 인 2×YTCTG 배지에서 37℃하에서 OD600=0.5일 때까지 진탕배양하고 1×108cfu의 보조 박테리오파지를 첨가하고 상온에서 15min 방치하고, 37℃하에서 150rpm의 속도로 배양기에서 1h 진탕배양한 후 같은 부피의 2×YTCTG(카나마이신 50mg/ml, IPTG 0.2mmol/L)을 첨가하고 30℃하에서 하룻밤 진탕배양한다. 다음날, 원심처리를 통하여 상청액을 수득하고 BSA를 최종농도가 2%가 될 때까지 첨가하고 트윈-20을 최종농도가 0.1% 될때까지 첨가하고 37℃하에서 15min 방치하여 예비용으로 준비해 둔다. 항원(EGFR)을 코팅액으로 1mg/ml까지 희석하고 96웰 ELISA 플레이트에 50μl/웰의 량으로 첨가하고 4℃하에서 코팅하여 하룻밤 지낸다. 다음날, 코팅액을 버리고 ELISA 플레이트를 한번에 3min씩 PBST로 2번 세척하고 PBS로 한번 세척하며 37℃하에서 2% BSA + 0.1% 트윈-20을 사용하여 200μl/웰의 량으로 2h 블로킹한다. 블로킹 용액을 버리고 50μl/웰의 량으로 블로킹된 단일 클론 박테리오파지 항체를 첨가하고 37℃하에서 1h동안 방치한다. 액체를 버리고 200μl/웰의 량으로 매번 5min씩 PBST로 두번 세척하고 PBS로 한번 세척한다. HRP로 마크한 마우스 항 M13 항체를 PBST를 사용하여 1:5000의 희석비율로 희석하고, 동시에 최종농도가 2%인 BSA를 첨가하고 37℃하에서 15min 동안 사전 블로킹한다. 사전 블로킹된 마우스 항 M13항체를 ELISA 플레이트에 50μl/웰의 량으로 첨가하고37℃하에서 30min 방치한다. 액체를 버리고 200μl/웰의 량으로 매번 5min씩 PBST로 ELISA 플레이트를 두번 세척하고 PBS로 한번 세척한다. 세척액을 버리고 OPD 기질 발색액(Color-substrate solution)을 50μl/웰의 량으로 첨가하고 실온에 방치하여 발색하게 한다. H2SO4를 2N사용하여 발색을 정지한다. 마이크로 플레이트 리더(microplate reader)로 광흡수치를 측정한다.
코팅 완충액(pH9.6): Na2CO3 1.59g, NaHCO3 2.93g, double distilled water를 1L 될 때까지 첨가;
블로킹 용액: 1×PBS + 2% BSA + 0.1% 트윈 20; 세척액: 1×PBS + 0.1% 트윈20;
OPD 기질액 희석액: 0.2M Na2HPO4(28.4g/L) 25.7ml, 0.1M 구연산(19.2g/L) 24.3ml, 증류수 50ml.
2.7 박테리오파지 단쇄 항체를 완전 항체로 전환:
벡터 pABG1과 pABBL을 각각 항체 중쇄(서열번호 10)과 경쇄(서열번호 9) 가변 영역 유전자를 클론하는데 사용하고, 각각 프라이머 H5F(서열번호 14)와 HR(서열번호 15)를 사용하여 VH5 가변영역을 증폭하고; L3F(서열번호 16)과 LR(서열번호 17)을 사용하여 Vλ3 가변 영역을 증폭하였다. Vλ3 가변 영역 유전자는 제한효소 절단위치 Bsr GI와 HindIII를 이용하여 PABL에 클론하여 도입시키고 VH5 가변 영역 유전자는 제한효소 절단위치 Af1 II와 NheI을 이용하여 벡터 pABG1에 클론하여 도입시킨다. 재조합 플라스미드는 대장균(E.coli) DH5α를 형질전환시키고 재조합 플라스미드에 대한 균액 PCR 및 서열 확인을 통하여 정확하게 구축된 완전 항체 경쇄, 중쇄 발현 벡터를 얻는다. 플라스미드를 대량 추출한 후 항체 경중쇄를 1:1의 몰비로 하여 HEK293T 세포를 형질감염시켜 완전 항체의 일과성 발현을 진행하고 ProteinA 친화성 크로마토그래피 칼럼을 거쳐 발현한 상청액에 대하여 정제를 진행하고 정제 후의 완전 항체에 대하여 전기영동 분석, 친화력과 특이성 측정 등을 진행한다.
ㄴ. 결과
1. Ame55 박테리오파지 항체의 선별 및 검증
제3라운드에서 선별하여 얻은 단일 클론에 대하여 검증을 진행하여 특이적 박테리오파지 항체를 얻었으며 Ame55 단쇄 항체의 뉴클레오티드화 아미노산 서열은 서열번호 18과 서열번호 19로 표시된다. Ame55 단쇄 항체의 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 9와 서열번호 10으로 표시된다. Ame55 단쇄 항체의 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 20과 서열번호 21로 표시된다.
박테리오파지 수준에서 Ame55의 특이성에 대하여 분석을 진행하고, EGFR-Fc를 양성 항원으로 하고 CD4-D2, AHC, TNF, VEGF, TTC, PBS를 대조항원으로 하여 4℃하에서 ELISA 플레이트를 하룻밤 동안 코팅하고 박테리오파지 상청액을 첨가하고 HRP로 항 M13 항체를 이차항체로 표지하여 Ame55 박테리오파지 상청액의 특이성 결합 활성에 대한 ELISA 검출을 진행하였다. 결과가 표명한 바로는 Ame55가 오직 EGFR-Fc에 대해서만 특이적으로 결합한다(도 1).
2. 완전 항체의 발현 및 정제
박테리오파지 항체 Ame55의 경중쇄 가변 영역 유전자를 완전 항체 일과성 발현 벡터pABL과 pABG1중에 클로닝하여 그의 완전 항체 재조합 발현 벡터를 구축하고, 또한 HEK293T 세포 일과성 발현 시스템을 통하여 포유 동물 세포의 일과성 분비 발현을 실현하였다. ProteinA 칼럼을 거쳐 정제한 후 완전 항체 단백질 견본을 얻었으며 분자량은 대략 150KD이다(도 2).
[실시예 2] Ame55 결합활성의 검측(assay)
ㄱ. 재료와 방법:
1. 재료: 인간 표피 편평상피 암세포 A431은 중국과학원 상하이 세포 라이브러리에서 구입하였고, Erbitux(CT)은 독일 Merck사의 제품이고; Nimotuzumab(Hr-3)은 베이징 Biotech Pharma사에서 출시한 항-EGFR 인간 유래 항체이며; Avastin (Bevacizumab, rhuMAb-VEGF）은 독일Roche사에서 구입하였으며; CM5 칩은 GE사의 제품이며, 항-인간 면역 글로불린Fc 포획센서와 스트렙타아비딘 센서는 모두 상하이아루이생물기술회사에서 구입하였다. 재조합 인간 표피 생장인자(EGF)는 상하이 SinoBio사에서 구입하였다. FreeStyleTM293-F 세포주, 발현배지 및 형질주입 시약는 모두 invitrogen사에서 구입하였다.
2. 방법
2.1 항체와 A431 세포 표면 EGFR 결합 활성의 면역 형광 검측
(1) A431세포를 매개 웰에 104의 량으로 96웰 플레이트에 접종한다.
(2) 하룻밤 배양한 후 배지를 버리고 PBS로 두번 세척한다.
(3) 5% 탈지 분유(PBS 배치)로 37℃하에서 1h 블로킹한 후 4℃ 환경하에서 방치한다.
(4) 측정할 1차 항체를 5% 탈지 분유(PBST 배치)로 1mg/ml까지 희석하고, 37℃하에서 30min 사전 블로킹한 후 4℃ 환경하에서 방치한다. 시판 약물 Erbitux(Ct)와 Nimotuzumab(Hr-3)를 양성 항체 대조군으로 하고 Avastin(Avs)를 음성 대조군으로 한다.
(5) 블로킹 용액을 버리고 블로킹 완료된 항체를 4℃하에서 1h 배양시킨다.
(6) PBST로 240rpm의 속도로 매번 3min씩 3번 세척한다.
(7) 상청액을 버리고 5% 탈지 분유로 사전 블로킹된 FITC-표지된 염소 항-인간 IgG 이차 항체를 첨가하고 4℃하에서 30min 결합한다.
(8) PBST로 240rpm의 속도로 매번 3min씩 3번 세척한다.
(9) 형광 현미경하에서 관찰한다.
2.2 웨스턴 블로팅(Western Blotting)
(1) EGFR-his 항원에 대하여 환원 및 비환원 SDS-PAGE 젤 전기영동을 진행하였으며 젤 분리 농도는 각각 10%이다.
(2) 세미드라이(semi-dry) 전이 방법으로 단백질을 젤로부터 니트로셀룰로스 필터막으로 전이시킨다. 전기영동이 완료된 후 전기영동 겔을 세미드라이 전기 전이 방법으로 200mA에서 2h 영동시킨다. 막에 옮긴후 5% 탈지 분유로 37℃하에서 2h 블로킹하고;
(3) 블로킹한 후에 막을 자르고 10μg/ml의 Ct, hR-3, Ame55를 각각 첨가하고 4℃하에서 하룻밤 동안 결합시키고;
(4) TBST로 한번에 10min씩 4번 세척하고;
(5) 1:5000로 5% 탈지 분유에 희석된 HRP마크의 양 항-인간 IgG(미리 37℃하에서 사전 블로킹을 30min 진행)을 첨가하고 37℃하에서 40min 배양시키고;
(6) 2차 항체를 배양한 후 TBST로 한번에 10min씩 3번 세척하고;
(7) 발색: ECL발광액을 추가하고 암실에서 노출 현상화시킨다.
2.3 Biacore 3000 시스템으로 항체 친화력을 측정
pH4.0, pH4.5, pH5.0, pH5.5인 NaAC 10mM를 준비하여 적당한 배수로 측정할 항체를 희석하고 CM5칩 위에서 사전(pre)-농축을 진행하고 제일 적합한 pH값의 NaAC를 코팅 희석액으로 하는 동시에 코팅하기에 제일 적합한 항체 희석 농도를 분석한다.
코팅: 제일 적합한 pH값의 NaAC를 사용하여 측정할 항체를 희석하고 제일 적합한 희석 농도를 선택하고 CM5칩에서 한개의 채널을 선택하여 커플링에 사용하고 커플링 항체 목적치는 2000RU이며, 또한 다른 채널 하나를 더 선택하여 대조군으로 한다. 시험조건은 25℃이고 흐름 속도는 20μL/min로 하고 완충액은 HBS-EP（pH 7.4，Bia- Certified）이다. 칩 커플링 항체가 목적값에 달한 후 칩 표면을 블로킹한다.
재생 조건 분석: 100nM의 EGFR-Fc이 칩 표면에 흐르게 하여 그와 칩 표면의 항체가 결합되게 하고 안정된 후, pH3.5, pH2.5, pH2.0, pH1.5인 글리신-염산 10mM와 pH8.5인 붕산염 완충액이 가장 우수한 효과가 나타날 때까지 순차적으로 칩 표면에 흐르게 한 후 가장 우수한 재생조건을 확정한다.
항체와 항원 결합의 동적 분석: Broford 방법으로 항원 EGFR-Fc의 농도를 측정하고 HBS-EP 완충액으로 항원 견본을 희석하고, 각각 다른 농도(0~100nM중에서 5개의 상이한 농도를 취함)의 EGFR-Fc가 20μL/min의 유량(flow rate)으로 측정할 항체 채널과 대조 항체 채널을 흐르게 하며 결합시간은 3min이고 안정시간은 1min이며 해리시간은 15min이다. 각 사이클의 재생 조건은 글리신-염산 10mM과 pH1.5와pH8.5의 붕산염 완충액을 포함하며 유량은 20μL/min이고 각 용액은 30s 동안 재생된다.
친화계수(affinity constant) 산정: 얻은 센서 이미지를 Bia-evaluation 분석 소프트웨어 4로 1:1 Langmuir 결합패턴 피팅을 진행하여 항원-항체 결합의 운동 계수(kinetic constant)를 산정한다.
2.4 유세포 분석(flow cytometry)
(1) EDTA를 포함하는 트립신 소화 생장 상태가 양호한 A431 세포를 예비 냉각한 PBS에 재현탁시키고 세척한 후 수치를 기록하며 6×106개/ml의 농도로 배치한다. 1.5ml의 원심관에 100μL/관의 양으로 각각 넣은 후 얼음 위에 놓는다.
(2) 측정할 항체를 예비냉각한 PBS로 150μg/ml, 15μg/ml, 1.5μg/ml, 0.15μg/ml까지 희석하고 각각 100μL씩 취하여 예비냉각한 세포와 혼합하고 얼음위에서 40min 배양시킨다.
(3) 예비냉각한 4℃원심기에서 4000rpm×8min로 원심처리를 진행하여 상청액을 가볍게 배출시키고; 예비냉각한 PBS 용액 1ml를 첨가하고 3번 세척한다.
(4) 매개 관(tube)에 1:100으로 희석한 사전 블로킹된 FITC-토끼 항-인간 IgG 2차 항체를 첨가하고 얼음 위에서 30min 배양시킨다.
(5) 3단계의 내용을 중복 진행하여 3번 세척한다.
(6) 매개 관의 세포 중에 예비냉각한 PBS용액을 500μl씩 첨가하고 가볍게 흔들어 블렌딩하고, 샘플을 얼음 위에 놓고 유세포분석기에서 형광분석을 진행한다. 측정할 항체를 첨가하지 않은 샘플을 대조군으로 한다.
ㄴ. 결과
1. 비변성 EGFR에 대한 항체 Ame55의 특이적 결합
EGFR-his에 대하여 환원과 비환원 SDS-PAGE 젤 전기영동을 진행하고 각각 10μg/ml의 Ame55, Erbitux, Nimotuzumab를 일차 항체로 하고 HRP로 표지한 염소의 항-인간 IgG를 이차 항체로 하여 Western blot 검측을 진행하였으며 결과는 도 3에서 나타낸 바와 같다. Amet55는 비환원 EGFR과만 특이적 결합을 한다.
2. A431 세포 표면의 EGFR에 대한 Ame55의 특이적 결합
EGFR을 발현한 A431 세포를 항원으로 하고 각각 Ame55, 관련이 없는 항체Avastin, 대조항체 Erbitux 및 Nimotuzumab를 일차 항체로 하고 FITC로 마크된 양의 항 인간 IgG를 이차 항체로 하여 세포 면역 형광 검측을 진행하였으며 결과는 도 4에서 나타낸 바와 같다. 결과가 나타내는 바로는, Ame55(도 4B) 및 양성 대조 항체 Erbitux(도 4C)와 Nimotuzumab(도 4D)는 A431 세포 표면의 EGFR에 특이적 결합을 할 수 있으나 음성 대조 항체 Avastin(도 4A)는 EGFR과 결합이 없다. 추가로 유세포분석기를 사용하여 그와 A431 세포의 결합을 분석하였으며, 결과가 나타내는 바로는 해당 항체는 일정한 농도 범위내에서 A431 세포와 투여량에 의존하는 결합을 한다. 농도가 1μg/ml인 경우, 형광 강도는 대조군 Erbitux와 Nimotuzumab 사이에 있다(도 5a, 5b, 5c).
3. Biacore 3000으로 EGFR-Fc에 대한 Ame55의 친화력을 측정
Ame55를 CM5칩 표면에 코팅시키고 부동한 농도의 EGFR-Fc를 이동상으로 하고 Biacore 3000 시스템을 사용하여 해당 항체와 EGFR-Fc의 친화력을 측정하였으며 결과는 도 6에서 나타낸 바와 같으며 매칭 후 친화력 KD는 0.231nM이고 그중 Ka=4.21×105, Kd=9.73×10-5이다.
[실시예 3] Ame55의 체외활성 및 에피토프 분석
ㄱ.방법
1. 항체의 경쟁적 결합의 억제 실험
Ame55를 고정상으로 하여 CM5칩에 코팅하고 코팅과 재생조건은 실시예 2의 방법을 참조하였고, 50nM의 EGFR-Fc를 제1 이동상으로 하여 3min 동안 샘플 채널을 통과하여 흐르게 하고 PBS-T로 3min 세척한 후 1000nM의 Erbitux를 제2이동상으로 하여 3min 동안 샘플 채널을 통과하여 흐르게 한 후 PBST로 3min 세척하였다. 또한, 마찬가지로 1000nM의 Ame55를 제2이동상으로 하여 상술한 실험을 진행하였고 자가 경쟁 억제 대조군으로 하였다. 마찬가지로 Erbitux를 고정상으로 하여 상술한 실험을 반복하였다.
2. EGFR에 대한 EGF의 결합의 경쟁적 억제 실험
EGF를 1μg/웰의 량으로 96웰 플레이트에 코팅시키고 4℃하에서 코팅하여 하룻밤 지낸다. Ame55와 양성 대조 항체 Erbitux 및 관련이 없는 대조 항체(본 발명에서 선별한 항 IL-6R 항체)를 각각 3:1, 2:1, 1:1의 몰비로 2.5μg/웰의 EGFR-Fc와 혼합하고 37℃하에서 30min 사전 블로킹 후 블로킹된 EGF을 코팅한 ELISA 플레이트에 첨가하고 37℃하에서 1h 결합하고 한번에 5min씩 PBST로 3번 세척하고 PBS로 한번 세척한 후 사전 블로킹한 HRP 로 표기한 염소 항-인간IgG를 2차항체로 하고 37℃에서 30min 작용한 후 PBST 및 PBS로 세척하고 OPD 기질 발색액을 첨가하여 발색을 진행하고 2N의 H2SO4 로 반응을 정지시킨 후 OD450nm에서의 광흡수치를 측정하였다.
3. A431 세포 스크래치 유합 실험
6웰 플레이트의 밑부분에 직선을 긋고 매개 웰이 5등분을 차지하도록 등분표기를 하였다. A431세포를 105/웰세포의 량으로 마크를 한 6웰 플레이트에 접종하였다. 세포가 대수생장기까지 자랐을 시 200μL의 피펫을 사용하여 직선표기와 수직되도록 세포 표면에 선을 그었다. 선을 그은 후 PBS로 2번 세척하고 매개 웰에 농도가 25μg/ml가 될 때까지 측정 할 항체 Ame55, 양성 대조 항체 Erbitux, 음성 대조 항체 Adalimumab(미국 Abbott사 제품)을 첨가하였고 별도로 한개의 공백 웰을 공백 대조군으로 정하였다. 각각 0h, 12h, 24h를 관찰시점으로 정하고 직선 표기로 위치를 고정하고 동적 변화 과정을 사진으로 찍었다.
4. A431 세포 생장 억제 실험
(1) 세포의 접종: 트립신으로 A431 세포를 소화하고 불려서 충분히 흐트러지게 한 후 수치를 기록하고; 0.5% 신생 송아지 혈청을 함유하는 1640 배지를 5000개/ml의 세포 농도로 조절하고 6개의 96웰 플레이트에 매개 웰에 200μL (최종적으로 매개 웰에 800-1000개 세포가 균일하게 분포)씩 첨가하고 37℃, 5% CO2 조건하에서 세포가 완전히 늘어져 벽에 붙을 때까지 24h 배양시켰다.
(2) 측정할 항체를 추가한 후의 배양: 96웰 플레이트 중의 상청액을 버리고 PBS로 한번 세척하고; Erbitux(CT), Nimotuzumab(hR3), Ame55를 각각 200nM씩 배합제조하고 PBS를 대조군으로 하여 매개 웰에 200μl의 양으로 96웰 플레이트에 첨가하고 매개 농도의 물질을 3개 콤플랙 웰, 5개 96웰 플레이트에 평행으로 첨가하고 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양을 진행하였고; 각각 제3일과 제5일에 액체를 교환하였다. 제0,3,4,5,6,7일에 각각 임의로 한개 플레이트를 취하여 염색을 진행하였다.
(3) 크리스탈 바이올렛 염색: 96웰 플레이트 중의 배지를 제거하여 PBS로 한번 세척하고; 매개 웰에 4% 파라포름알데히드를 100μL씩 추가하고 실온에서 15min 방치하여 고정하고; 포름알데히드를 버리고 100μL/웰의 량으로 PBS로 희석한 0.5% 크리스탈 바이올렛 용액(무수에탄올로 배제한 5% 크리스탈 바이올렛 모액을 10배로 희석)을 첨가하고 실온에서 15min 방치하여 염색하였고; 크리스탈 바이올렛 용액을 버리고 수돗물로 침수시켜 여러번 씻어내고; 상온에서 증류수로 침수시키고 560회/min의 속도로 수평 진탕기에서 15min 세척하고; 수분을 제어 드라이(control dry)하고 공기중에서 하룻밤 건조시킨다.
(4) 세포 밀도 검측: 제0일 내지 제7일의 6개 96웰 플레이트를 수집하고 동일한 batch에 탈색과 OD값 검측을 진행하고; 매개 웰에 sorenson's 용액을 200μL 첨가하고, 400회/min의 속도로 수평 진탕기에서 30min 탈색시키고; 매개 웰에서 100μL을 취하여 새로운 96웰 플레이트로 옮기고 630nm의 광흡수치를 참고로 하여 590nm의 광흡수치를 측정하였다. 세포생장 곡선을 작성하였다.
Sorenson's 용액 배제방법: A액: 구연산나트륨 8.967g을 305ml의 초순수(ultrapure water)에 용해; B액: 0.1N HCl 195ml(38% HCl 1.6ml를 193.4ml의 초순수에 첨가, "산을 물에 첨가"하는 것으로 알려짐); C액: 95% 에탄올 500ml(무수에탄올 475ml중에 25ml의 초순수를 첨가); A+B+C을 총 1L로 혼합한다.
ㄴ. 결과
1. Ame55 및 Erbitux의 EGFR에 대한 결합의 상호 경쟁적 억제작용
Ame55를 고정상으로 하고 EGFR을 제1 이동상으로 하며(1), PBST로 얼마간의 시간동안 세척하고 (2), Ame55(A)와 Erbitux(B)를 제2 이동상으로 하고 (3), 다음 다시 PBST로 세척하고 (4); 이와 반대로 Erbitux를 고정상으로 하고 EGFR을 제1 이동상으로 하며 (1), PBST로 얼마간의 시간동안 세척하고(2), Ame55(D)와 Erbitux(C)를 제2 이동상으로 하고 (3), 다음 다시 PBST로 세척하였다 (4); 상기 조건들을 포함하여 두개의 항체의 에피토프에 대하여 기본적인 분석을 진행하였으며 결과는 도 7a, 7b, 7c, 7d에서 나타내는 바와 같고, Ame55와 결합한 EGFR은Erbitux와 추가로 결합할 수 없으며(도 7b, 7a는 Ame55 자가억제 대조군임), 즉 Ame55는 EGFR과 Erbitux의 결합을 억제할 수 있고, 이와 반대로 EGFR과 Erbitux가 결합한 후에도 Ame55와 다시 결합할 수 없으며(도 7d, 7c는 Erbitux 자가 억제 대조군임), 즉 Erbitux도 EGFR와 Ame55의 결합을 억제할 수 있다. 해당 결과는 두 개 항체간에 항원 에피토프의 상호 경쟁적 억제 작용이 존재할 수 있고 두 개 항원 에피토프가 구조상에서 근접하거나 같다는 것을 제시한다.
2. EGF와 EGFR의 결합에 대한 Ame55의 경쟁적 억제 작용
경쟁적 ELISA방법을 사용하여 EGF와 EGFR 결합에 대한 Ame55의 경쟁적 억제 작용을 분석하였다. 결과가 나타내는 바로는 EGFR와 항체의 몰비가 1:1, 1:2과 1:3인 조건하에서 Ame55 는 EGFR과 EGF의 결합을 크게 억제하였지만 음성 대조 항체는 억제작용이 없다는 것이다. Ame55의 억제 활성이 같은 농도의 대조 항체 Erbitux보다 낮다(도 8을 참조).
3. A431 세포전이에 대한 Ame55의 억제 작용
본 실시예 방법 3에서 서술한 바에 따라 25μL/ML 실험항체군의 세포 스크래치 유합 상황에 대하여 24h동안 고정위치의 동적 변화를 관찰하였고(도 9), A431세포 전이 활성을 억제하는 방면에서 Ame55는 Erbitux와 같은 억제 활성을 나타냈다. 그러나 다른 하나의 음성대조 항체 adalimumab은 A431세포 전이의 활성에 대해 억제 활성이 없으며 adalimumab는 출시한 TNFα에 대한 항체약물이다. 해당 결과는 Ame55가 확실히 EGFR 생물학 활성을 억제하는 기능을 갖고 있고 임상의 전이 종양의 치료와 응용 중에서 비교적 좋은 작용을 가질 수 있다는 것을 제시한다.
4. A431세포 생장에 대한 Ame55의 억제 작용
A431 등 EGFR을 발현하는 세포는 자체가 분비한 EGF를 그의 EGFR수용체에 작용하는 것을 통하여 하류 루트를 활성화하여 수용체의 탈인산화를 초래하여 그의 세포 생장과 전이 등을 촉진하였다. 따라서, 추가로 A431 세포 증식 실험을 통하여 Ame55의 EGFR을 발현하는 세포 생장에 대한 영향을 평가하였으며 연속적으로 세포의 생장 추세를 관찰하였다. 본 실시예 방법 4에서 진행한 실험에 따라 결과는 도 10에서와 같고 Ame55는 A431 세포 생장을 억제하는 작용이 있으나 억제 강도가 대조 항체 Erbitux보다 약하며 다른 한주의 대조 항체 Nimotuzumab에 상당하였다.
[실시예 4] Ame55의 체내에서의 종양 활성 억제 측정
20g 정도의 암컷 누드 마우스 47마리의 등의 피하에 농도가 5×107인 A431 세포 100μL를 접종하고 종양이 50~150mm3만큼 자랄 시 마우스 체중을 측정하고 종양 크기를 측정한 후에 군을 나누었다. 모두 4개조를 포함하며 각각 생리식염수군, Erbitux 대조군, adalimumab 대조군과 Ame55 대조군이다. 그 중 Erbitux는 시판되고 있는 항-EGFR 단일 클론 항체이며 이를 양성 대조군으로 하고, adalimumab는 시판하고 있는 TNFα에 대한 항체 약물이며 이를 음성 대조군으로 하며, 생리식염수를 종양 대조군으로 하며 항체 투여량은 모두 1mg/마리이고 3일에 한번씩 투여하며, 매번 투여전에 체중과 종양의 크기를 측정한다. 종양의 산정방법은 π/6*장직경*단직경2이다. 36일 후 마우스를 죽이고 종양을 꺼내어 종양의 중량을 측정하고 통계학적 분석을 진행하였다.
A431 세포 이식 종양을 연구대상으로 하여 종양 마우스에 대한 Ame55의 억제작용을 평가하였다. 실험결과가 표명한 바로는 Ame55는 1mg/마리의 투여량의 조건하에서 A431이식 종양의 생장에 대하여 뚜렷한 억제 작용이 있고(도 11), 연속 6번 투여하고 약을 끊고 4주 후의 종양의 중량을 관찰한 결과가 표명한 바로는 대조군의 평균 종양 중량은 3.65g이고 Ame55군의 평균 종양 중량은 0.32g이며 종양 억제율은 90%이였다(도 12,13).
[실시예 5] Ame55 경중쇄 가변 영역 돌연변이체 평가 방법
1. 알라닌 스캔
위치-지정 돌연변이(site-directed mutagenesis) 프라이머쌍 CDRL1, CDRL3, CDRH2, CDRH3를 각각 설계하여 알라닌 스캔을 진행하며, 만약 그가 해당 위치에서 알라닌이면 그를 Gly와 Ser로 변이시킨다. 방법은 플라스미드 위치지정 돌연변이의 방법으로 진행하였으며 문헌[王榮浩，陳瑞川，劉潤忠。快速點突變의優化方法。廈門大學學報（自然科學版)，2008, Vol 47，sup 2, 282-285](Ronghao WANG, Ruichuan CHEN, Runzong LIU, 쾌속점 돌연변이의 최적화방법, 하문대학학보 (자연과학판) 2008, Vol 47，sup 2, 282-285]을 참고하였다.
2. ForteBio Qke로 항체 친화력을 측정
바이오틴 키트를 사용하여 EGFR-Fc 융합단백질을 바이오틴화시키고 바이오틴화된 EGFR-Fc를 PBS로 100nM 농도까지 희석하고 스트렙타아비딘 센서표면에 20min 코팅시키고 HEPES EP를 사용하여 센서를 5min 세척하고 측정할 돌연변이체 항체와 모항체 Ame55를 모두 20nM의 농도로 검측웰중에 넣고 이를 씻은 후의 스트렙타아비딘 센서표면의 EGFR-Fc와 결합하게 하며 결합시간은 10min 이고 결합이 평형상태에 달할 때까지 기다리고 복합물을 HEPES EP에서 해리하게 하고 해리시간은 20min이다. ForteBio 소프트웨어 패키지를 사용하여 친화력 분석을 진행하였다.
3. 돌연변이체와 모항체(parent antibody)의 종양 활성 억제 비교
실험방법은 실시예 4의 방법과 같으며 그룹과 투여량은 하기와 같이 정한다: 생리식염수 대조군, Erbitux 대조군, Ame55 모항체 대조군 및 Ame55의 각 돌연변이 항체（Ametumumabs）AmeA1C1, AmeA1C3, AmeA1C3-HI2, AmeA2, AmeA2C1, AmeA2C3, AmeA2C3-HI2, 매개조에 8마리씩 모두 10조, 투여량은 0.2mg/마리이고 3d/번의 량으로 모두 6번 투여하고 약을 끊은 후의 제6일에 마우스를 죽이고 종양의 중량을 측정한다.
ㄴ. 결과
1. 돌연변이체의 친화력 분석
Ame55 아미노산 서열에 기초하여 경, 중쇄 가변 영역 및 프레임 영역 부분의 아미노산 변이를 진행한다. 알라닌 스캔과 위치-지정 돌연변이 방법을 사용하여 돌연변이 설계를 진행하였다. ForteBioQKe 단백질 분자의 상호 작용 시스템을 사용하여 돌연변이체에 대하여 추가적인 선별 및 친화력 평가를 진행하였다. 결과가 나타내는(표 1) 바로는 모항체 Ame55와 비교했을 경우 경쇄 CDR1, CDR3, 중쇄 CDR2, CDR3 구역의 여러개 아미노산 위치는 모두 항체에 대하여 EGFR와의 결합능력을 유지하는데 매우 중요하다. 그 원인은 해당 위치의 아미노산이 상호작용에 직접 참여하였기 때문일수 있고, 해당 위치의 아미노산이 항체의 전반적인 공간 구조를 정확하게 유지하기 위해 극히 중요하기 때문일 수 있다. 이러한 변형된 아미노산 위치 중 가장 중요한 위치는, 경쇄의 26번째 아미노산과 89번째 아미노산, 중쇄의 54번째 아미노산과 107번째 아미노산이다. 우선 한 개의 아미노산의 교체를 진행한 결과, 본 발명은 경쇄의 89번째 아미노산이 Val로부터 Ala또는 Ser로 변형된 후 친화력이 4배이상 강화되었고, 추가적으로 경쇄의 26번째 아미노산의 Gly 또는 Lys를 조합한 후 친화력이 추가로 강화되었으며 이를 모항체 친화력과 비교했을 때 5배이상 강화되었고; 또는 중쇄의 54번째, 107번째 아미노산을 각각 Ser로 교체하여 경쇄의 89A/S와 조합발현한 후 항체의 친화력이 89A/S와 비교하여 유의한 차이를 나타내며 강화되었다는 것을 발견하였다. 친화력의 강화가 항체의 생물학적 활성에 대한 영향을 주는지 추가적으로 증명하기 위하여, 하기 7주의 돌연변이체 항체: AmeA1C1(경쇄의 26번째 아미노산은 Gly로, 89번째 아미노산은 Ser로 변이됨), AmeA1C3(경쇄의 26번째 아미노산은 Lys로, 89번째 아미노산은 Ser로 변이됨), AmeA1C3-HI2(경쇄의 26번째 아미노산은 Lys로, 89번째 아미노산은 Ser로 변이됨과 동시에 중쇄의 107번째 아미노산은 Ser로 변이됨), AmeA2(경쇄의 89번째 아미노산은 Ala로 변위됨), AmeA2Cl(경쇄의 26번째 아미노산은 Gly로, 89번째 아미노산은 Ala로 변이됨), AmeA2C3(경쇄의 26번재 아미노산은 Lys로, 89번째 아미노산은 Ala로 변이됨), AmeA2C3-HI2(경쇄의 26번째 아미노산은 Lys로, 89번째 아미노산은 Ala로 변이됨과 동시에 중쇄의 107번째 아미노산은 Ser로 변이됨)에 대하여 체내 활성평가를 진행하였다.
2. 돌연변이체와 Ame55의 종양 억제 활성 비교
돌연변이체와 모항체의 활성 차이를 추가적으로 평가하기 위하여, 약 투여량을 0.2μg/마리의 비교적 낮은 투여량으로 낮춘 다음, 친화력이 각각 다르게 강화된 여러 주의 돌연변이체와 모항체의 종양 활성 억제 비교를 종양이 이식된 마우스에서 진행하였다. 결과가 나타내는 바로는 대조 항체군의 평균 종양 중량은 1.854g이고, 0.2μg/마리의 약 투여량 조건하에서 모항체 Ame55군(평균 종양 중량이 0.71g)의 종양 활성 억제율이 60%로 낮아졌으나 돌연변이체 종양 활성 억제는 모항체보다 명확하게 좋았으며 그의 종양 억제율은 각각 67% 내지 93%사이였고, 일부 항체들은 상업화한 항체 Erbitux(종양 억제율 91%)의 활성과 동등하였다. 상기 결과는 돌연변이체의 친화력 강화가 체내 생물학적 활성의 개선에 확실히 유익하다는 것을 보여준다. 각 그룹의 종양 생장 상황과 종양의 중량 통계는 도 14에 나타나 있다.
Ame55 돌연변이체의 친화력 변화 상황 통계표
경쇄 중쇄
돌연변이위치 친화력 변화 돌연변이위치 친화력 변화
13A 1 50A 결합하지 않음
26G(C1) 0.5 50R 결합하지 않음
26N(C2) 1 51A >10
26K(C3) 0.3 52A 결합하지 않음
G28P >100 52D >10
29E >100 53A 5
32I 1 54A >10
32V 2 54S 0.5
33Y 2 55A >100
51G 1 56A 1
55P 2 57A 결합하지 않음
88Q 2 57Y 결합하지 않음
88A >10 58A >10
88Y 5 59A >10
88L 5 59N >10
88G 3 60A 5
88N >10 66H 1
89S（A1） 0.5 99A >10
89A(A2) 0.25 99S >10
89L 5 100A 5
90A >10 101A 4
91A >10 102A 결합하지 않음
92A 2 103A 결합하지 않음
92S 4 104A 3
92P 1 105A >10
93A >10 106A >10
94A >10 107G 1.5
95A >10 107S 0.2
95S >10 108A 5
96A >10
97A >10
26G+89S <0.3
26K+89S <0.2
26G +89A <0.2
26K +89A <0.1
주석: 돌연변이체 항체과 모항체의 비교, 모항체 친화력을 1로 하여 친화력 감소 배수를 산정하였다.
[실시예 6] Ame55 경쇄의 EGFR에 대한 특이적 결합 능력에 대한 검출
Ame55 경쇄가 단독으로 EGFR에 대하여 특이적 결합 능력을 가지고 있는지를 검출하기 위하여 본 발명은 Ame55의 단독 경쇄(서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열)와 한 개의 VH3 생식 계통(germline) 유전자 패밀리 유래의 항체 중쇄(서열번호 22로 표시되는 서열)를 조합하였고, HEK293 일과성 발현 시스템에서 일과성 발현을 진행하였으며, ProteinA 크로마토그래피 정제를 통하여 Ame55 경쇄를 포함하는 새로운 항체 Ame-9B를 얻었다. Ame-9B의 EGFR에 대한 결합능력은 Fortebio 단백질 상호 작용 시스템을 통하여 검출되었으며 구체적인 방법은 실시예 5에 나타나 있다. 결과에서 나타난 바로는 비록 친화력이 어느 정도 낮아지긴 했으나(약 6배 낮아짐) Ame-9B는 여전히 EGFR와의 결합 능력을 유지하였다(도 15 참조).
본 발명의 항체의 인간 EGFR에 대한 결합 친화력은 1nM 미만이고, 그의 돌연변이체의 친화력은 10nM 미만이며; 본 발명의 항체가 EGFR를 발현하는 세포 A431 종양 마우스의 종양 성장의 생물학 활성을 억제하는 양호한 효과를 갖고 있다는 것을 증명함으로써 항체 단백질 IgG의 면역활성과 생물학적 활성의 검증을 완료하였다. 본 발명의 항체는 EGFR 표적 종양 및 기타 질병, 예를 들면 염증과 자가 면역성 질병의 예방과 치료를 위한 특이적 항체 약물을 제공하였다.
<110> Shanghai Serum Biotechnology Co.,Ltd. Institute of biotechnology, Academy of military medical sciences, PLA. <120> FULLY HUMAN ANTI-HUMAN EPIDEMIC GROWTH FACTOR RECEPTOR ANTIBODIES AND ENCODING GENES AND APPLICATION OF THE ANTIBODIES <130> YPI201504-0013 <150> CN 201210465918.4 <151> 2012-11-16 <160> 22 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> CDRL1of EGFR <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> Xaa=Ala or Gly or Asn or Lys <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> Xaa=Ala or Val or Ile <220> <221> VARIANT <222> (11) <223> Xaa=Ser or Tyr <400> 1 Ser Gly Asp Xaa Leu Gly Asp Lys Tyr Xaa Xaa 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2 of EGFR <220> <221> VARIANT <222> (3) <223> Xaa=Ser or Thr or Ala or Gly <400> 2 Glu Asp Xaa Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> CDRL3 of EGFR <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa=Ser or Asn or Ala or Gly or Leu or Tyr or Gln <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa=Ser or Val or Ala or Leu <220> <221> VARIANT <222> (5) <223> Xaa=Gly or Ala or Pro <220> <221> VARIANT <222> (8) <223> Xaa=Gly or Ser <400> 3 Xaa Xaa Trp Asp Xaa Asp Trp Xaa Met Pro 1 5 10 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1 of EGFR <400> 4 Ser Tyr Trp Ile Gly 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2 of EGFR <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa=Gly or Ser <220> <221> VARIANT <222> (6) <223> Xaa=Gly or Ser <400> 5 Xaa Ile Ile Tyr Pro Xaa Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 1 5 10 15 Gln <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> CDRH3 of EGFR <220> <221> VARIANT <222> (9) <223> Xaa=Ala or Ser or Gly <400> 6 Gly Ile Ile Tyr Pro Ser Asn Val Xaa Val 1 5 10 <210> 7 <211> 108 <212> PRT <213> light chain variable region amino acid sequence of anti-EGFR antibody <220> <221> VARIANT <222> (26) <223> Xaa= Ala or Gly or Asn or Lys <220> <221> VARIANT <222> (32) <223> Xaa= Ala or Val or Ile <220> <221> VARIANT <222> (33) <223> Xaa=Ser or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (51) <223> Xaa=Ser or Thr or Ala or Gly <220> <221> VARIANT <222> (88) <223> Xaa=Ser or Asn or Ala or Gly or Leu or Tyr or Gln <220> <221> VARIANT <222> (89) <223> Xaa= Ser or Val or Ala or Leu <220> <221> VARIANT <222> (92) <223> Xaa=Gly or Ala or Pro <220> <221> VARIANT <222> (95) <223> Xaa=Gly or Ser <400> 7 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Xaa Leu Gly Asp Lys Tyr Xaa 20 25 30 Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Glu Asp Xaa Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Trp Asp Xaa Asp Trp Xaa Met 85 90 95 Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 8 <211> 119 <212> PRT <213> heavy chain variable region amino acid sequence of anti-EGFR antibody <220> <221> VARIANT <222> (49) <223> Xaa=Gly or Ser <220> <221> VARIANT <222> (54) <223> Xaa=Gly or Ser <220> <221> VARIANT <222> (107) <223> Xaa=Ala or Ser or Gly <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Xaa Ile Ile Tyr Pro Xaa Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ile Ile Tyr Pro Ser Asn Val Xaa Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 327 <212> DNA <213> light chain variable region encoding gene of Ame55 single chain antibody <400> 9 agctacgaac tgacccagcc gccgagcgtg tcggtggcgc cgggtcagac cgcgcgtatc 60 acctgctcgg gcgatgcgct gggcgataaa tacgcgagct ggtatcagca gaaaccgggt 120 caggcaccgg tgctggtgat ttacgaagat tctaaacgcc cgtctggcat cccggaacgc 180 tttagcggct cgaattcggg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac ccaggcggag 240 gatgaggcgg actattactg ctcggtgtgg gatggcgact gggggatgcc tgtgtttggc 300 ggtggcacca aactgaccgt gctgggc 327 <210> 10 <211> 357 <212> DNA <213> heavy chain variable region encoding gene of Ame55 single chain antibody <400> 10 gaagttcaac tggttcaaag tggtgcggaa gtgaagaaac cgggcgaaag tctgaaaatt 60 agttgcaaag gctctggtta ttcttttacg tcttattgga tcggctgggt tcgtcagatg 120 ccgggtaaag gtctggaatg gatgggtatt atttatccgg gtgatagtga tacgcgttat 180 tctccgagtt ttcagggtca ggttactatt agtgcagata aaagcatcag caccgcgtat 240 ctgcagtgga gttctctgaa agcgagtgat accgcgatgt attattgcgc acgtggtatt 300 atttatcctt ctaatgtcgc tgtctggggt cagggcactc tggtgaccgt gtcgagc 357 <210> 11 <211> 49 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 11 gaattagaat tcgccgccac catgcgaccc tccgggacgg ccggggcag 49 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 12 gaatagctag ctccattcgt tggacagcct tcaagacctg 40 <210> 13 <211> 47 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 13 gaaggatcct taatggtgat gatggtgatg gctccattcg ttggaca 47 <210> 14 <211> 45 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 14 gcgcccctta agggcgtgca gtgcgaagtt caactggttc aaagc 45 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 15 cggtgctagc gctcgacacg gtcaccagag t 31 <210> 16 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 16 caagtgtaca ggatcatggg caagctacga actgacccag ccgc 44 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 17 cggtaagctt ggtgccaccg ccaaacac 28 <210> 18 <211> 249 <212> PRT <213> Ame55 single chain antibody amino acid sequence <400> 18 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Gly Asp Lys Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Val Trp Asp Gly Asp Trp Gly Met 85 90 95 Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Ser Thr Ile Thr Ser Tyr Asn Val Tyr Tyr Thr Lys Leu Ser Ser Ser 115 120 125 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro 130 135 140 Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr 145 150 155 160 Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu 165 170 175 Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro 180 185 190 Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr 195 200 205 Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr 210 215 220 Tyr Cys Ala Arg Gly Ile Ile Tyr Pro Ser Asn Val Ala Val Trp Gly 225 230 235 240 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 19 <211> 747 <212> DNA <213> Ame55 single chain antibody nucleotide sequence <400> 19 agctacgaac tgacccagcc gccgagcgtg tcggtggcgc cgggtcagac cgcgcgtatc 60 acctgctcgg gcgatgcgct gggcgataaa tacgcgagct ggtatcagca gaaaccgggt 120 caggcaccgg tgctggtgat ttacgaagat tctaaacgcc cgtctggcat cccggaacgc 180 tttagcggct cgaattcggg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac ccaggcggag 240 gatgaggcgg actattactg ctcggtgtgg gatggcgact gggggatgcc tgtgtttggc 300 ggtggcacca aactgaccgt gctgggcagc ggcggctcga ccataacttc gtataatgta 360 tactatacga agttatcgag ctcgggcagc gaagttcaac tggttcaaag tggtgcggaa 420 gtgaagaaac cgggcgaaag tctgaaaatt agttgcaaag gctctggtta ttcttttacg 480 tcttattgga tcggctgggt tcgtcagatg ccgggtaaag gtctggaatg gatgggtatt 540 atttatccgg gtgatagtga tacgcgttat tctccgagtt ttcagggtca ggttactatt 600 agtgcagata aaagcatcag caccgcgtat ctgcagtgga gttctctgaa agcgagtgat 660 accgcgatgt attattgcgc acgtggtatt atttatcctt ctaatgtcgc tgtctggggt 720 cagggcactc tggtgaccgt gtcgagc 747 <210> 20 <211> 109 <212> PRT <213> light chain variable region amino acid sequence of Ame55 single chain antibody <400> 20 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Gly Asp Lys Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Val Trp Asp Gly Asp Trp Gly Met 85 90 95 Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 21 <211> 119 <212> PRT <213> heavy chain variable region amino acid sequence of Ame55 single chain antibody <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ile Ile Tyr Pro Ser Asn Val Ala Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 118 <212> PRT <213> antibody heavy chain amino acid sequence of VH3 germline gene family <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Gly Thr Gly Gly Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Trp Ser Trp Thr Gly Val Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115

Claims (28)

  1. 경쇄 가변 영역에 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역에 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나;
    서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 상기 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 둘 모두에 하기 아미노산 치환을 가지는 것을 특징으로 하는 인간 유래 항-인간EGFR 항체:
    (1) 서열번호 20의 26번째 위치의 아미노산의 글리신(Gly)으로의 치환 및 서열번호 20의 89번째 위치의 아미노산의 세린(Ser)으로의 치환,
    (2) 서열번호 20의 26번째 위치의 아미노산의 라이신(Lys)으로의 치환 및 서열번호 20의 89번째 위치의 아미노산의 세린(Ser)으로의 치환,
    (3) 서열번호 20의 26번째 위치의 아미노산의 글리신(Gly)으로의 치환 및 서열번호 20의 89번째 위치의 아미노산의 알라닌(Ala)으로의 치환,
    (4) 서열번호 20의 26번째 위치의 아미노산의 라이신(Lys)으로의 치환 및 서열번호 20의 89번째 위치의 아미노산의 알라닌(Ala)으로의 치환,
    (5) 서열번호 20의 26번째 위치의 아미노산의 라이신(Lys)으로의 치환, 서열번호 20의 89번째 위치의 아미노산의 세린(Ser)으로의 치환 및 서열번호 21의 107번째 위치의 아미노산의 세린(Ser)으로의 치환,
    (6) 서열번호 20의 89번째 위치의 아미노산의 알라닌(Ala)으로의 치환, 또는
    (7) 서열번호 20의 26번째 위치의 아미노산의 라이신(Lys)으로의 치환, 서열번호 20의 89번째 위치의 아미노산의 알라닌(Ala)으로의 치환 및 서열번호 21의 107번째 위치의 아미노산의 세린(Ser)으로의 치환.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 단쇄 항체, Fab, 소 항체(mini antibody), 키메라 항체 또는 완전 항체 면역 글로불린 IgG1, IgG2, IgA, IgE, IgM, IgG4, IgD인 것을 특징으로 하는, 인간 유래 항-인간EGFR 항체.
  3. 제1항 또는 제2항의 인간 유래 항-인간EGFR 항체를 코딩하는 유전자.
  4. 제3항에 있어서, 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 하기의 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 유전자:
    1) 서열번호 9로 표시되는 DNA서열.
  5. 제3항에 있어서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 하기의 DNA서열인 것을 특징으로 하는 유전자:
    1) 서열번호 10으로 표시되는 DNA서열.
  6. 제4항의 유전자를 포함하는 발현 벡터.
  7. 제5항의 유전자를 포함하는 발현 벡터.
  8. 제6항의 발현 벡터를 포함하는 숙주균.
  9. 제6항의 발현 벡터를 포함하는 숙주세포.
  10. 제6항의 발현 벡터를 포함하는 발현 카세트.
  11. 제7항의 발현 벡터를 포함하는 숙주균.
  12. 제7항의 발현 벡터를 포함하는 숙주세포.
  13. 제7항의 발현 벡터를 포함하는 발현 카세트.
  14. 제1항에 있어서, 적어도 10-8M의 친화력으로 인간 EGFR에 결합하는 것을 특징으로 하는, 인간 유래 항-인간EGFR 항체.
  15. 제1항에 있어서, EGFR 리간드가 인간 EGFR와 결합하는 것을 억제하는 것을 특징으로 하는, 인간 유래 항-인간EGFR 항체.
  16. 제1항에 있어서, 상기 항체는 세포 막 상에 발현된 EGFR에 결합하고; 상기 세포는 인간 피부암 세포, 인간 간암 세포, 인간 결장암 세포, 인간 자궁 경부암 세포, 난소암 세포, 인간 폐암 세포, 방광암 세포, 유방암 세포, 신장암 세포, 전립선암 세포, 두경부 종양 편평상피세포, 췌장암 세포, 활막 섬유아세포, 또는 각질 형성 세포인 것을 특징으로 하는, 인간 유래 항-인간EGFR 항체.
  17. 제1항 또는 제2항의 항체를 포함하는 종양, 염증 또는 자가면역성 질환 치료용 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 항체와 별도의 한가지 이상의 항체를 혼합하여 혼합제제(mixture preparation)로 제조되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  19. 제1항 또는 제2항의 항체를 포함하는 검측시약.
  20. 제19항에 있어서, 상기 항체와 별도의 한가지 이상의 항체를 혼합하여 혼합제제(mixture preparation)로 제조되는 것을 특징으로 하는, 검측시약.
  21. 다양한 연결 형태로 세포 독성제에 연결된 제1항 또는 제2항의 항체를 포함하는 항체 표적 약물 분자.
  22. 제21항에 있어서, 상기 다양한 연결 형태는 항체를 표지하는 것, 체외가교 또는 분자 커플링인 것을 특징으로 하는, 항체 표적 약물 분자.
  23. 제21항에 있어서, 상기 세포 독성제는 화학분자, 방사성 동위원소, 폴리펩티드, 독소 및 세포를 사멸시키는 특성을 갖거나 세포자살(apoptosis)을 유도하는 특성을 갖는 기타 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 표적 약물 분자.
  24. 기타 단백질, 기타 폴리펩티드, 또는 상기 기타 단백질 및 기타 폴리펩티드 둘 모두와 항체의 융합 단백질로서,
    상기 융합 단백질은 특정 기능을 갖는 기타 단백질 또는 기타 폴리펩티드와 제1항 또는 제2항의 항체의 복합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  25. 제24항에 있어서, 상기 융합 단백질은 항체의 유전자를 면역 독소, 기타 항체 또는 항체 단편, 또는 사이토카인 유전자와 연결하여 재조합 발현 벡터를 작제하고, 포유동물 세포 또는 기타 발현 시스템을 통하여 재조합 융합 단백질 분자를 획득함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
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