EP1641829A1 - Emitter-bindende peptide die eine ver nderung der spektralen emissionseigenschaften des emitters bewirken - Google Patents

Emitter-bindende peptide die eine ver nderung der spektralen emissionseigenschaften des emitters bewirken

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Publication number
EP1641829A1
EP1641829A1 EP04729434A EP04729434A EP1641829A1 EP 1641829 A1 EP1641829 A1 EP 1641829A1 EP 04729434 A EP04729434 A EP 04729434A EP 04729434 A EP04729434 A EP 04729434A EP 1641829 A1 EP1641829 A1 EP 1641829A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
emitter
seq
binding peptide
nos
fluorescence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04729434A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Michael Schirner
Kai Licha
Andreas Menrad
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Morphosys AG
Bayer Pharma AG
Original Assignee
Morphosys AG
Schering AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE2003131054 external-priority patent/DE10331054A1/de
Application filed by Morphosys AG, Schering AG filed Critical Morphosys AG
Publication of EP1641829A1 publication Critical patent/EP1641829A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL

Definitions

  • the present invention relates to emitter-binding peptides which, when their antigen-binding pocket interacts with the emitter, cause a change in the spectral emission properties of the emitter.
  • the emitter-binding peptides of the invention are in particular components of antibodies and antibody fragments.
  • peptides, proteins, antibodies or oligonucleotides are based, which have a high affinity for a substance to be determined. Proteins and peptides are preferably used for this purpose, and antibodies and antibody fragments are particularly preferably used.
  • Certain in-vitro diagnostic methods are based on the combination of different antibodies against the substance to be determined, one antibody being used to separate the substance to be determined from the test sample and the other antibody carrying the diagnostically proven signal molecule.
  • the labeled antibody is optically detected [Grayeski, ML 3 Anal Chem. 1987, 59, 1243].
  • light-induced phosphorescence and fluorescence can also be used as the optical property of molecules for diagnostic measurement methods.
  • fluorescence in particular as the optical property of molecules offers the advantage of high detection sensitivity and high linearity of the measurement signal over a large dynamic range.
  • Other detection methods are based on a change in the polarization level or the detection of phosphorescence.
  • the anti-substance antibodies used serve different purposes. On the one hand they are used for the separation of the substance to be determined from the sample, on the other hand they also perform the task of localizing or positioning different signal transmitters used on the substance to be examined.
  • acoustic see e.g. Cooper MA, et al. Direct and sensitive detection of a human virus by rupture event scanning. Nat Biotechnol. 2001 Sep; 19 (9): 833-7.
  • magnetic measuring methods are known.
  • Optical measurement methods have become most widespread [Nakamura, R.M., Dito, W.R., Tucker, E.S. (Eds.). Immunoassays: Clinical Laboratory Techniques for the 1980s. A. R. Liss, New York. Edwards, R. (ed.). Immunoassays: Essential Data, 1996, Wiley Europe.].
  • the anti-substance antibody is labeled with a fluorophore. This marking takes place through specific and non-specific chemical coupling.
  • the labeled antibody is added in excess to the test sample. This is necessary to bind all substance molecules to be examined.
  • This method is further generally based on the fact that the one anti-substance antibody serves to separate the substance to be examined and the second anti-substance antibody, which recognizes another binding site of the test substance, is labeled with a signaling molecule. In this way, a falsification of the measurement result by the unbound, but signaling antibody can be avoided.
  • this procedure is associated with increased methodological and technical effort and higher costs.
  • the high technical effort which prevents this method from being established for rapid diagnostics, proves to be particularly disadvantageous.
  • Antibodies and peptides directed against molecules of small molecular weight are already known. This also includes antibodies and peptides against dye molecules.
  • Simeonov et al. Give no indication of a red shift while maintaining the fluorescence quantum yield for cyanine dyes in the wavelength range from 600-1200 nm.
  • Rozinov M.N. et al. (Chem. Biol. 1998, 5, 713-728) describe the selection of 12-mer peptides from phage libraries which bind the dyes Texas Red, Rhodamine Red, Oregon Green 514 and fluorescein. A red shift in absorption and fluorescence was observed for Texas Red, but only by 2.8 nm and 1.4 nm, respectively.
  • antibodies against various dyes are already commercially available, e.g. B. against fluorescein, tetramethylrhodamine, Texas Red, Alexa Fluor 488, BODIPY FL, Lucifer yellow and Cascade Blue, Oregon Green (Molecular Probes, Inc., USA).
  • these are polyclonal IgG antibodies for bioanalytical purposes, some of which have uncontrollable cross-reactivities and have not resulted from a strict selection process.
  • Emitter-binding peptides which have a red color Shift while maintaining the fluorescence quantum yield for cyanine dyes in the wavelength range of 600-1200 nm.
  • an emitter-binding peptide which is characterized in that, when its antigen binding pocket interacts with the emitter, this causes a change in the spectral emission properties of the emitter, comprising a method for producing an emitter-binding peptide according to the invention the immunization of a suitable organism with an emitter, comprising a dye which is selected from the group of polymethine dyes, such as dicarbocyanine, tricarbocyanine, indotricarbocyanine, merocyanine, styryl, squarilium and oxonol dyes and rhodamine dyes, phenoxazine or Phenothiazine dyes and corresponding uses of an emitter-binding peptide, a nucleic acid, a host cell or an antibody or conjugate according to the invention as a diagnostic for in vitro diagnostics.
  • Appropriate configurations are listed in the dependent claims.
  • a first aspect of the present invention thus relates to an emitter-binding peptide, characterized in that this causes a change in the spectral emission properties of the emitter when its antigen binding pocket interacts with the emitter.
  • an emitter-binding peptide according to the invention is preferred, the emitter comprising a dye which has at least one absorption maximum and / or fluorescence maximum within the spectral range from 700 to 1000 nm, preferably at least one absorption maximum and fluorescence maximum within the spectral range from 750 to 900 nm.
  • an emitter-binding peptide according to the invention, the change in the emission properties of the part of the emitter being selected from a change in the polarization plane, the fluorescence intensity, the phosphorescence intensity, the fluorescence lifetime and a bathochromic shift in the absorption maximum and / or the fluorescence maximum.
  • the invention is not restricted to these special phenomena; the term “change in emission properties” in the context of the present invention is intended to encompass all physical phenomena or effects in which the energy-rich radiation striking the emitter is changed in its properties and these Change depends on the binding / non-binding of the substance-emitter conjugate or substance-recognizing agent-emitter conjugate with its emitter binding partner and the substance.
  • the substance is, for example, a peptide, protein, oligonucleotide and in particular an antibody or an antibody fragment.
  • the antibody fragments are fragments which comprise at least the antigen-binding regions which contain the so-called "complementarity-determining regions"("CDRs").
  • the antigen-binding regions preferably comprise the complete variable chains VL and VH.
  • the antibody or the antibody fragment is selected from polyclonal or monoclonal antibodies, humanized antibodies, Fab fragments, in particular monomeric Fab fragments, scFV fragments, synthetic and recombinant antibodies, scTCR Chains and mixtures thereof.
  • antibody fragments can be present either as complete immunoglobulins or antibodies in one of the naturally occurring formats (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM) or as antibody fragments, the antibody fragments at least the amino acid positions 4 to 103 for VL and 5 to 109 for VH , preferably comprise the amino acid positions 3 to 107 for VL and 4 to 111 for VH and particularly preferably the complete variable chains VL and VH (amino acid positions 1 to 109 for VL and 1 to 113 for VH) (numbering according to WO 97/08320).
  • the antibody or the antibody fragment comprises at least one of the sequences SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 and 39 contain CDR areas (VL: CDR1 positions 24-34, CDR2 positions 50-56, CDR3 positions 89-96; VH: CDR1 positions 26-35, CDR2 positions 50-65, CDR3 positions 95-102), especially VL CDR3 or VH CDR3.
  • VL CDR1 positions 24-34, CDR2 positions 50-56, CDR3 positions 89-96
  • VH CDR1 positions 26-35, CDR2 positions 50-65, CDR3 positions 95-102
  • An antibody which contains one of the sequences SEQ-ID NOs: 2, 6, 10, 14, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 and 39 is particularly preferred variable chains VL or a variable chains VH contained in the sequences SEQ-ID NOs: 1, 5, 9 and 13 (or a fragment of such an antibody).
  • an antibody comprising one of the VH / NL pairs contained in the following sequence pairs: SEQ ID Os: 1 + 2; SEQ ID ⁇ Os: 5 + 6; SEQ ID ⁇ Os: 9 + 10; SEQ ID ⁇ Os: 13 + 14; SEQ ID ⁇ Os: 5 + 17; SEQ ID ⁇ Os: 5 + 19; SEQ ID ⁇ Os: 5 + 37; SEQ ID ⁇ Os: 9 + 21; SEQ ID ⁇ Os: 9 + 23; SEQ ID ⁇ Os: 9 + 25; SEQ ID ⁇ Os: 9 + 27; SEQ ID ⁇ Os: 9 + 29; SEQ ID ⁇ Os: 9 + 31; SEQ ID ⁇ Os: 9 + 33; SEQ ID ⁇ Os: 9 + 39; SEQ-ID ⁇ Os: 13 + 35 (or a fragment of such an antibody).
  • CDR regions of both the heavy and the light chain are responsible for the affinity, selectivity and specificity.
  • the CDR3 area from NH and the CDR3 area from VL play a role, followed by CDR2 from VH and CDR1 from VL, while CDR1 from VH and CDR2 from VL mostly play a subordinate role.
  • the CDR ranges are therefore particularly suitable for optimizing the affinity and selectivity and specificity of antibodies (see also, for example, Schier et al., J. Mol. Biol. (1996) 263, 551).
  • one or more of the CDR areas could be exchanged, for example specifically for CDR areas of other antibodies already showing the properties according to the invention, or by libraries of corresponding CDR sequences (see the optimization in Example 1), which either produce completely random variations or contain a more or less strong preference (tendency) towards certain amino acids or combinations thereof.
  • the person skilled in the art is also able to exchange entire variable chains in the same way for corresponding chains of other defined antibodies or for various libraries of such chains. Methods are also known to the person skilled in the art to specifically exchange one or more amino acid residues in the CDRs by mutagenesis. The identification of amino acid residues to be changed in this way takes place, for. B.
  • the specialist mom When making changes to the CDRs, the specialist mom also has knowledge of the so-called “canonical structures" (Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. (2000) 295, 979); Knappik et al. J. Mol. Biol. (2000) 296, 57), which have an influence on the three-dimensional arrangement of the CDR areas and which can be taken into account in the design of corresponding optimization strategies.
  • nucleic acid molecules which encode one of the antibodies according to the invention or an antibody fragment.
  • these are nucleic acid molecules which are one of the sequences SEQ-ID NOs: 2, 6, 10, 14, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 and 39 contained variable chains VL or a variable chain VH contained in the sequences SEQ-ID NOs: 1, 5, 9 and 13.
  • the sequences according to SEQ-ID NOs: 3, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 are particularly preferred and 40.
  • the emitter-binding peptide of the present invention optimally has a binding affinity of less than 50 nM and preferably less than 10 nM.
  • an emitter-binding peptide of the present invention comprising a dye which has at least one absorption maximum and / or fluorescence maximum within the spectral range from 700 to 1000 nm, preferably at least one absorption maximum and fluorescence maximum within the spectral range from 750 to 900 nm.
  • the bathochromic shift of the dye is chosen so that the shift of the absorption and / or fluorescence maximum to higher wavelengths after interaction with the means for recognizing the emitter by a value greater than 15 nm, preferably greater than 25 nm, and most preferably about 30 nm.
  • a shift that is a property of the dye need not necessarily be considered as such.
  • the shift would be measured as a change in an emission value adapted to the dye, that is to say at a certain singular wavelength.
  • Suitable optical means for measurement are provided for this purpose, which are known to the person skilled in the art. This also applies to the measurement of the change in the polarization plane, the fluorescence intensity, the phosphorescence intensity, the fluorescence lifetime and a bathochromic shift in the absorption maximum and / or the fluorescence maximum.
  • the emitter used comprises a dye which is selected from the group of polymethine dyes such as dicarbocyanine, tricarbocyanine, indotricarbocyanine, merocyanine, styryl, squarilium and oxonol dyes and rhodamine dyes , Phenoxazine or phenothiazine dyes.
  • the emitter of the substance-emitter conjugate according to the invention contains a cyanine dye of the general formula (I)
  • R 1 and R 2 independently of one another are a C 1 -C sulfoalky! chain 3 a saturated or unsaturated, branched or straight-chain Ci-Cso-alkyl chain, optionally with from 0 to 15 acidic atoms and / or from 0 up to 3 carbonyl groups is interrupted and / or can be substituted with 0 to 5 hydroxyl groups, means R 3 and R 4 independently of one another for the group -COOE 1 , -CONE ⁇ 2 , -NHCOE 1 , -NHCONHE 1 , - N- ⁇ E 2 , -OE 1 , -OSO 3 E 1 , -SOsE 1 , -SO ⁇ HE 1 or -E 1 , where E 1 and E 2 independently of one another are a hydrogen atom, a C 1 -C sulfoalkyl chain, a saturated or represents unsaturated, branched or straight-chain Ci-Cso-alky
  • the emitters can form conjugates with substances.
  • those of the general formula are used as substance-emitter conjugates
  • Suitable structural components of the conjugates according to the invention include Dyes which have at least one absorption maximum and fluorescence maximum within the spectral range from 600 to 1200 nm. Dyes with at least one absorption maximum and fluorescence maximum within the spectral range from 700 to 1000 nm are preferred.
  • Dyes that meet these criteria are, for example, those from the following classes: polymethine dyes, such as dicarbocyanine, tricarbocyanine, merocyanine and oxonol dyes, rhodamine dyes, phenoxazine or phenothiazine dyes, tetrapyrrole dyes, in particular benzopophyrins, chorines, bacteriochlorins, pheophorbhorides Pu ⁇ urine and Phthalocyanine.
  • polymethine dyes such as dicarbocyanine, tricarbocyanine, merocyanine and oxonol dyes, rhodamine dyes, phenoxazine or phenothiazine dyes, tetrapyrrole dyes, in particular benzopophyrins, chorines, bacteriochlorins, pheophorbhorides Pu ⁇ urine and Phthalocyan
  • Preferred dyes are the cyanine dyes with absorption maxima between 750 and 900 nm, with particular advantage indotricarbocyanines.
  • Structural constituents of the conjugates according to the invention are also the substances whose concentration is to be determined using the method according to the invention. These are selected, for example, from antigens such as proteins, peptides, nucleic acids, oligonucleotides, blood components, serum components, lipids, pharmaceuticals and compounds of low molecular weight, in particular sugars, dyes or other compounds with a molecular weight of less than 500 daltons.
  • Preferred dyes are the cyanine dyes with absorption maxima between 750 and 900 nm, with particular advantage indotricarbocyanines.
  • the dyes contain structural elements via which the covalent coupling to the substance structures takes place. These are e.g. B. Linkers with carboxy groups, amino groups, hydroxy groups.
  • an optical measurement this can be done in different ways and depends mainly on the type of characteristic change in the spectral properties of the emitter (e.g. fluorophore). Generally preferred is a detection of the shift in the absorption wavelength and emission wavelength or the measurement of the absorption and / or fluorescence intensity at a wavelength which for the most part detects the portion of the fluorophore bound to the antibody. Depending on the change in the spectral properties of the antibody-bound fluorophore, other properties, such as. B. the photon lifetime, the polarization and the fading behavior can be used for optical measurement.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of an emitter-binding peptide according to the invention for in vitro diagnostics.
  • the emitter-binding peptide according to the invention can also be present in a diagnostic kit, optionally together with other auxiliaries. All kits according to the invention can furthermore contain special instructions and documents (e.g. calibration curves, instructions for quantification, etc.).
  • FIG. 1 the CysDisplay screening vector pMORPH23 (vector map and sequence),
  • Figure 2 The expression vector pMORPHX9 MS (vector map and sequence), and
  • FIG. 3 Abso ⁇ tionspektrum (left) and fluorescence spectrum of the dye from Example 2 in the absence and in the presence of antibody MOR02965 in PBS.
  • Example 1 Selection, production and characterization of emitter-binding antibodies: Selection of HuCAL GOLD Fab antibody fragments against the cyanine dye Fuji 6-4 (ZK203468) [T- ⁇ iatri ⁇ -m-3,3-dimethyl-2 - ⁇ 4- ⁇ - ⁇ ethyl-7- [3 ⁇ - dimethyl-5-sulfonato-l- (2-sulfonatoethyl) -3H-indoliu ⁇ n-2-ylJ- ⁇ epta-2,4,6-lrien-l-ylidenJ- l- (2-sul onatoethyl) -2,3-dihydro-lH-indole-5-sulfonate, inner salt]
  • HuCAL GOLD is a fully synthetic, modular human antibody library in Fab antibody format. HuCAL GOLD is based on the HuCAL consensus antibody genes which have been described for the HuCAL-scFvl library (WO 97/08320; Knappik, (2000), J. Mol. Biol. 296, 57-86; Krebs et al. J Immunol Methods. 2001 Aug 1,254 (1-2): 67-84). In HuCAL GOLD, all six CDR areas are nucleic by using so-called trinucleotide mutagenesis (Virnelas et al. (1994)) Acids Res.
  • HuCAL GOLD also uses a modified screening process, the so-called CysDisplay (WO 01/05950).
  • CysDisplay WO 01/05950.
  • the vector pMORPH23 used for the screening process can be found in Figure 1.
  • the infected cells were pelleted and resuspended in 2xYT / 34 ⁇ g / ml chloramphenicol / 10 ⁇ g / ml tetracycline / 50 ⁇ g / ml kanamycin / 0.25 mM IPTG and cultivated at 22 ° C. overnight.
  • the phages were precipitated twice from the supernatant with PEG and harvested by centrifugation (Ausubel (1998) Current protocols in molecular biology. John Wiley Sons, Inc., New York, USA).
  • the phages were resuspended in PBS / 20% glycerin and stored at -80 ° C.
  • the phagemid amplification between the individual selection rounds took place as follows: log-phase E. coli TG1 cells were infected with the selected phages and plated on LB agar plates with 1% glucose / 34 ⁇ g / ml chloramphenicol. After overnight incubation, the bacterial colonies were scraped off, re-cultured and infected with VCSM13 helper phages.
  • the purified and concentrated phagemids from the HuCAL GOLD Antikö ⁇ er library were used in a standard selection process.
  • ZA203468 or transferrin-coupled ZK203468 were used alternately as antigens.
  • the antigens were taken up in PBS and applied in concentrations of 50 ⁇ g / ml to Maxiso ⁇ TM Mikrotite ⁇ latten F96 (Nunc).
  • the Maxiso ⁇ plates were incubated at 4 ° C. overnight ("coating"). After blocking the Maxiso ⁇ plates with 5% milk powder in PBS, approx. 2E + 13 HuCAL GOLD phages were placed in the antigen-loaded, blocked wells and incubated there overnight or for two hours at room temperature.
  • bound phages were eluted with 20 mM DTT or 100 ⁇ M unconjugated ZK203468. A total of three successive selection rounds were carried out, the phage amplification taking place between the selection rounds, as described above.
  • the Fab-coding inserts of the isolated HuCAL clones were subcloned into the expression vector pMORPHX9_MS (see FIG. 2) in order to facilitate the subsequent expression of the Fab fragments.
  • the purified plasmid DNA of the selected HuCAL Fab clones was digested with the restriction enzymes Xbal and EcoRI.
  • the Fab-coding inserts were purified and ligated into the correspondingly digested vector pMORPHX9 VIS. This cloning step leads to the Fab expressing vector pMORPHX9_Fab_MS.
  • Fab fragments expressed by this vector carry two C-terminal tags (Myc-Tag and Strep-Tag II) for purification and detection. Screening and characterization of ZK203468-binding Fab fragments
  • the plasmid DNA of the four parenteral clones MOR02628, MOR02965, MOR02969 and MOR02977 was digested with the restriction enzymes EcoRI and Xbal and the resulting complete Fab insert from the expression vector pMORPHX9_MS was subcloned into the correspondingly cut display vector pMORPH23. This step is necessary in order to provide the genlll which is used to present the Fab fragment on the phage surface.
  • the four parenteral clones (now in pMORPH23) were digested with Bpil and Sphl. The LCDR3 region and the constant Clambda region were removed from the vector backbone.
  • the corresponding vector DNA fragment was isolated and purified.
  • Several ⁇ g of vector DNA and compatible insert DNA were ligated in a molar ratio of 1: 2 with T4 DNA ligase and, after a purification step, transformed into electrocompetent TOP10F 'cells. Library sizes of 5E + 8 to approximately 1E + 9 clones were achieved per parenteral antibody.
  • the libraries based on the clones MOR02628, MOR02969 and MOR02977 were combined ("Pool”).
  • the MOR02965 library was treated separately ("lead”).
  • the corresponding phagemids were produced by infection with VCSM13 Helfe ⁇ hagen using these TOPIOF 'maturation libraries.
  • the purified and concentrated phagemids from "lead” and “pool” libraries were used in a maturation selection process under stringent conditions (long washing periods, displacement by purified, parental Fab proteins).
  • ZA203468 or transferrin-coupled ZK203468 were used alternately as antigens. These antigens were taken up in PBS and applied in small concentrations of 100-250 ng / ml on Maxi-so ⁇ TM microtitre plates F96 (Nunc). The Maxiso ⁇ plates were incubated at 4 ° C. overnight ("coating"). After blocking the Maxiso ⁇ plates with 5% milk powder in PBS, approx.
  • 2E + 11 phages were added in small concentrations of 60 or 12 ng / ml Antigen-phage solutions were incubated overnight or 2 hours at room temperature In order to increase the stringency, an additional 0.5 ⁇ g / ml of purified Fab fragments of the parent clones or 40 ng / ml of ZK203468 were added during this incubation Solutions containing antigen-bound phages were then applied to blocked neutravidin strips and incubated for 30 min in order to bind to the solid phase via the bio- to allow tinrest of the antigen. After several washing steps, bound phages were eluted with 20 mM DTT. A total of two successive selection rounds were carried out, the phage amplification between the selection rounds taking place as described above.
  • the Fab-coding inserts of the isolated HuCAL clones were sub-cloned into the expression vector pMORPHX9_MS in order to facilitate the subsequent expression.
  • the purified plasmid DNA of the selected HuCAL Fab clones was digested with the restriction enzymes Xbal and EcoRI.
  • the Fab coding insert was purified and ligated into the correspondingly digested vector pMORPHX9_MS. This cloning step fills to the Fab expressing vector pMORPHX9_Fab_MS.
  • Fab fragments expressed by this vector carry two C-terminal tags (Myc-Tag and Strep-Tag II) for purification and detection.
  • the affinity of the parenteral MOR02977 could be improved by a factor of 140 compared to MOR03267. All other clones identified showed improvements of factor 2-70 compared to the respective parenteral Fab.
  • Example 3 Photophysical characterization of the dye-antibody complexes and determination of the spectral shifts / fluorescence quantum yields
  • Example 4 Construction of expression vectors for the expression of HuCAL immunoglobulins cloning of the heavy chain: The "multiple cloning site" of the vector pCDNA3.1 + (Invitrogen) is removed (Nhel / Apal), and a placeholder, which corresponds to the restriction sites from the HuCAL design is used for the ligation of the leader sequence (Nhel / EcoRI), the VH domain from the Fab fragment (Muni /), and the constant immunoglobulin regions (Blpl / Apal) , The leader sequence (EMBL 83133) is equipped with a Kozak sequence (Kozak, 1987).
  • the constant regions of human IgG (PIR J00228), IgG4 (EMBL K01316), and serum IgAl (EMBL J00220) are divided into overlapping oligonucleotides approximately 70 bases in length. "Silent mutations” are introduced to remove restriction sites that are not compatible with the HuCAL design. The oligonucleotides are linked by "overlap extension-PCR".
  • the heavy chain of the Fab fragment is cut out over Mfel / Blpl and ligated into the vector, which is opened with EcoRI / BlpI.
  • EcoRI (g / aattc) and Mfel (c / aattg) both have compatible ones cohesive ends (aatt), and the sequence of the original Mfel cleavage site in the Fab fragments changes from: c / aattg to g / aattg after ligation into the IgG expression vector, thereby on the one hand both the Mfel and the EcoRI - Interface are destroyed, and on the other hand an amino acid exchange from Q (codon: caa) to E (codon: gaa) takes place.
  • the "multiple cloning site" of pCDNA3.1 / Zeo + (Invitrogen) is replaced by two different placeholders.
  • the k placeholder contains restriction interfaces for the incorporation of a k leader sequence (Nhel / EcoRV), the HuCAL Fab Vk domain (EcoRV / BsiWI), and the constant region of the k chain (BsiWI / Apal).
  • the corresponding interfaces in the 1 placeholder are Nhel / EcoRV (1 leader), EcoRV / Hpal (VI domain), and Hpal / Apal (constant region 1 chain).
  • the k-leader (EMBL Z00022) and the 1-leader (EMBL J00241) are both provided with Kozak sequences.
  • the constant regions of human k- (EMBL L00241) and 1-chains (EMBL Ml 8645) are both assembled by "overlap extension-PCR" as described above.
  • IgG-expressing CHO cells CHO-Kl cells are co-transfected with an equimolar mixture of expression vectors for the heavy and light IgG chains. Double-resistant transfectants are selected with 600 mg / ml G418 and 300 mg / ml Zeocin (Invitrogen) followed by limiting dilution. The supernatant from individual clones is checked for IgG expression by "capture ELISA". Positive clones are grown in RPMI-1640 medium, which is provided with 10% "ultra-low IgG-FCS" (Life Technologies). After adjusting the pH of the supernatant to 8.0 and sterile filtration, the solution is subjected to a standard ProteinA column chromatography (Porös 20 A, PE Biosystems).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Emitter-bindende Peptide, die bei einer Wechselwirkung ihrer Antigen­Bindungstasche mit dem Emitter eine Verânderung der spektralen Emissionseigenschaften des Emitters bewirken. Die Emitter-bindende Peptide der Erfindung sind insbesondere Bestandteile von Antikôrper und Antikôrperfragmenten.

Description

Emitter-bindende Peptide die eine Veränderung der spektralen Emissionseigenschaften des Emitters bewirken
Die vorliegende Erfindung betrifft Emitter-bindende Peptide, die bei einer Wechselwirkung ihrer Antigen-Bindungstasche mit dem Emitter eine Veränderung der spektralen Emissionseigenschaften des Emitters bewirken. Die Emitter-bindende Peptide der Erfindung sind insbesondere Bestandteile von Antikörper und Antikörperfragmenten.
Hintergrund der Erfindung
Für den diagnostischen Nachhweis von Substanzen und deren Konzentrationsbestimmung werden heute in vielen Fällen in-vitro diagnostische Meßverfahren angewendet, die auf biologischen Molekülen, wie z. B. Peptiden, Proteinen, Antikörpern oder Oligonukleotiden, beruhen, die eine hohe Affinität für eine zu bestimmende Substanz haben. Bevorzugt werden hierfür Proteine und Peptide und besonders bevorzugt Antikörper und Antikö erfragmente verwendet.
Bestimmte in-vitro diagnostische Verfahren, wie z.B. die Elektrochemiluminienz basieren auf der Kombination verschiedener Antikörper gegen die zu bestimmende Substanz, wobei der eine Antikörper für die Abtrennung der zu bestimmenden Substanz aus der Untersuchungsprobe dient und der andere Antikörper das diagnostisch nachgewiesene Signalmolekül trägt. Im Falle des diagnostischen Verfahrens der Elektrochemolumineszenz wird der markierte Antikörper optisch delektiert [Grayeski, M. L.3 Anal Chem. 1987, 59, 1243].
Neben der Elektrolumineszenz kann auch die lichtinduzierte Phosphoreszenz und die Fluoreszenz als optische Eigenschaft von Molekülen für diagnostische Meßverfahren verwendet werden. Gegenüber der Elektrolumineszenz und Phosphoreszenz bietet insbesondere die Fluoreszenz als optische Eigenschaft von Molekülen den Vorteil der hohen Nachweisempfindlichkeit und eine hohe Linearität des Meßsignals über einen großen dynamischen Bereich hinweg.
Zum Nachweis der Fluoreszenz eines Fluorophors wurden verschiedene Meßverfahren entwickelt, die unterschiedliche Prinzipien innerhalb der Fluoreszenzprozesse ausnutzen. Eta- blierte Meßverfahren nutzen z. B. die Abschwächung polarisierten Lichtes (Fluoreszenzpolarisierung - FP), die Messung der Photonenlebensdauer (Fluoreszenzlebensdauermessung - FLM), die Ausbleicheigenschaften (Fluoreszence-Photobleaching Recovery - FPR) und den Energietransfer zwischen verschiedenen Fluorophoren (Fluoreszenz-Resonanz-Energie- Transfer - FRET) [Williams, A. T., et al, Methods Immunol. Anal. 1993, 1, 466;Youn, H. J. et al., Anal. Biochem. 1995 Oswald, B. et al, Anal. Biochem. 2000, 280, 272; Szollosi, J. et. al., Cytometry 1998, 34, 159].
Andere Nachweisverfahren basieren auf einer Veränderung der Polarisationsebene oder dem Nachweis einer Phosphoreszenz.
Bei den oben genannten Verfahren erfüllen die verwendeten Anti- Substanz- Antikörper unterschiedliche Zwecke. Einerseits werden sie für die Abtrennung der zu bestimmenden Substanz aus der Probe verwendet, andererseits erfüllen sie aber auch die Aufgabe der Lokalisierung bzw. Positionierung unterschiedlicher verwendeter Signalgeber an der zu untersuchenden Substanz. Zum Nachweis z.B. eines Antikörpers in einer Probe haben sich vor allem optische und radioaktive Meßverfahren etabliert, aber auch akustische [siehe z.B. Cooper MA, et al. Direct and sensitive detection of a human virus by rupture event scanning. Nat Biotechnol. 2001 Sep;19(9):833-7.] und magnetische Meßverfahren sind bekannt. Die größte Verbreitung haben die optischen Meßverfahren erlangt [Nakamura, R. M., Dito, W. R., Tucker, E. S. (Eds.). Immunoassays: Clinical Laboratory Techniques for the 1980s. A. R. Liss, New York. Edwards, R. (ed.). Immunoassays: Essential Data, 1996, Wiley Europe.].
Bei der Mehrzahl der bereits verfügbaren Meßverfahren wird der Anti-Substanz-Antikörper mit einem Fluorophor markiert. Diese Markierung erfolgt durch spezifische und unspezifische chemische Kopplung. Der markierte Antikörper wird im Überschuß zu der Untersuchungsprobe zugegeben. Dies ist erforderlich, um alle zu untersuchenden Substanzmoleküle zu binden. Diesen Verfahren liegt weiterhin allgemein zu Grunde, daß der eine Anti-Substanz- Antikörper der Abtrennung der zu untersuchenden Substanz dient und der zweite AntiSubstanz-Antikörper, der an einer anderen Bindungsstelle der Untersuchungssubstanz erkennt, mit einem signalgebenden Molekül markiert ist. Auf diese Weise kann eine Verfälschung des Messergebnisses durch den nicht gebundenen, aber signalgebenden Antikörper vermieden werden. Diese Verfahrensweise ist jedoch, bedingt durch den Abtrennungsschritt, mit einem erhöhten methodischen und technischen Aufwand und höheren Kosten verbunden. Besonders nachteilig erweist sich jedoch der hohe technische Aufwand, der eine Etablierung dieses Verfahrens für die Schnelldiagnostik verhindert.
Antikörper und Peptide, die gegen Moleküle kleinen Molekulargewichts gerichtet sind, sind bereits bekannt. Darunter fallen auch Antikörper und Peptide gegen Farbstoffmoleküle. So beschreiben Simeonov A. et al. in Science 2000, 290, 307-313 Antikörper gegen Stilbene („Brue-fluorescent antibodies"). Diese Antikörper katalysieren spezifisch photochemische Isomerierungsvorgänge und führen zu rotverschobenen Absorptions- und Fluoreszenzmaxima im UV-VIS Spektralbereich (Absorptionsverschiebung maximal 12 nm, Fluoreszenzverschiebung 22 nm). Simeonov et al. geben jedoch keinen Hinweis auf eine Rotverschiebung unter Beibehalt der Fluoreszenzquantenausbeute bei Cyaninfarbstoffen im Wellenlängenbereich von 600-1200 nm.
Watt R. M. et al. (Immunochemistry 1977, 14, 533-541) beschreiben die spektralen Eigenschaften von bereits bekannten anti-Fluorescein-Antikörperkonstrukten. Der Antikörper bewirkt nach Bindung des Fluoresceins eine Verschiebung des Absorptions- und Fluoreszenzmaximums im sichtbaren Spektralbereich, jedoch nur um 12 nm bzw. 5 nm. Zusätzlich erfolgt eine starke Verringerung der Fluoreszenzquantenausbeute um ca. 90%.
Rozinov M. N. et al. (Chem. Biol. 1998, 5, 713-728) beschreiben die Selektion 12-merer Peptide aus Phagenbibliotheken, die die Farbstoffe Texas Red, Rhodamine Red, Oregon Green 514 und Fluorescein binden. Für Texas Red wurde eine Rotverschiebung der Absorption und Fluoreszenz beobachtet, jedoch nur um 2.8 nm bzw. 1.4 nm.
Des weiteren sind Antikörper gegen verschiedene Farbstoffe bereits kommerziell erhältlich, z. B. gegen Fluorescein, Tetramethylrhodamin, Texas Red, Alexa Fluor 488, BODIPY FL, Lucifer yellow and Cascade Blue, Oregon Green (Fa. Molecular Probes, Inc., USA). Hierbei handelt es sich jedoch um polyklonale IgG Antikörper für bioanalytische Zwecke, die zum Teil unkontrollierbare Kreuzreaktivitäten aufweisen und nicht aus einem strikten Selektions- prozess hervorgegangen sind.
Es besteht somit ein weiterer Bedarf an verbesserten Emitter-bindenden Peptiden und insbesondere spezifischen Antikörpern, die besser für die oben genannten Meßverfahren geeignet werden. Vorteilhaft wären dabei insbesondere Emitter-bindende Peptide, die eine Rotver- Schiebung unter Beibehalt der Fluoreszenzquantenausbeute bei Cyaninfarbstoffen im Wellenlängenbereich von 600- 1200 nm bewirken würden.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Emitter-bindendes Peptid gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß dieses bei einer Wechselwirkung seiner Antigenbindungstasche mit dem Emitter eine Veränderung der spektralen Emissionseigenschaften des Emitters bewirkt, einem Verfahren zur Herstellung eines Emitter-bindenden Peptids gemäß der Erfindung, umfassend die Immunisierung eines geeigneten Organismus mit einem Emitter, umfassend einen Farbstoff, der ausgewählt ist aus der Gruppe von Polymethinfarbstoffen, wie Dicarbocyanin-, Tricarbocyanin-, Indotricarbocyanin-, Merocyanin-, Styryl-, Squarilium- und Oxonolfarbstof- fen und Rhodaminfarbstoffen, Phenoxazin- oder Phenothiazinfarbstoffen und entsprechenden Verwendungen eines Emitter-bindenden Peptids, einer Nukleinsäure, einer Wirtszelle oder eines Antikörpers oder Konjugats gemäß der Erfindung als Diagnostikum für die in vitro Diagnostik. Zweckmäßige Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen aufgeführt.
Ein erster Aspekts der vorliegenden Erfindung betrifft somit ein Emitter-bindendes Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß dieses bei einer Wechselwirkung seiner Antigenbindungstasche mit dem Emitter eine Veränderung der spektralen Emissionseigenschaften des Emitters bewirkt.
Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Emitter-bindendes Peptid, wobei der Emitter einen Farbstoff umfaßt, der mindestens ein Absoφtionsmaximum und/oder Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 700 bis 1000 nm, bevorzugt mindestens ein Absorptionsmaximum und Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 750 bis 900 nm aufweist.
Weiter bevorzugt ist ein erfmdungsgemäßes Emitter-bindendes Peptid, wobei die Veränderung der Emissionseigenschaften des Teils des Emitters ausgewählt ist aus einer Veränderung der Polarisationsebene, der Fluoreszenzintensität, der Phosphoreszenzintensität, der Fluoreszenzlebensdauer und einer bathochromen Verschiebung des Absorptionsmaximums und/oder des Fluoreszenzmaximums. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese speziellen Phänomene beschränkt, der Begriff „Veränderung der Emissionseigenschaften" im Rahmen der vorliegenden Erfindung soll alle physikalischen Phänomene oder Effekte umfassen, bei dem die auf den Emitter treffende energiereiche Strahlung in ihrer Eigenschaft verändert wird und diese Veränderung dabei von der Bindung/nicht-Bindung des Substanz-Emitter-Konjugats oder Substanz-erkennendes Mittel-Emitter-Konjugat mit seinem Emitter-Bindungspartner und der Substanz quantitativ abhängig ist. In einer Ausfuhrungsform ist die Substanz zum Beispiel ein Peptid, Protein, Oligonukleotid und insbesondere ein Antikörper oder ein Antikörperfrag- ment. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Antikörperfragmenten um Fragmente, die zumindest die Antigen-bindenden Bereiche umfassen, die die sogenannten "complementarity-determining regions" ("CDRs") enthalten. Bevorzugterweise umfassen die Antigen-bindenden Bereiche dabei die vollständigen variablen Ketten VL und VH.
In einem besonders bevorzugten Aspekt des Emitter-bindenden Peptids gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Antikörper oder das Antikörperfragment ausgewählt aus polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, humanisierten Antikörpern, Fab-Fragmenten, insbesondere monomeren Fab-Fragmenten, scFV-Fragmenten, synthetischen und rekombinanten Antikörpern, scTCR-Ketten und Gemischen davon.
Insbesondere bevorzugt sind dabei im Falle der synthetischen und rekombinanten Antikörper oder Antiköφerfragmente diejenigen aus einer HuCAL-Bibliothek (WO 97/08320; Knap- pik,(2000), J. Mol. Biol. 296, 57-86; Krebs et al. J Immunol Methods. 2001 Aug 1;254(1- 2):67-84). Diese können entweder als vollständige Immuno globuline oder Antiköφer in einem der natürlich vorkommenden Formate (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM) oder als Antiköφer- fragmβnte vorliegen, wobei die Antiköφerfragmente zumindest die Aminosäurepositionen 4 bis 103 für VL und 5 bis 109 für VH, bevorzugt die Aminosäurepositionen 3 bis 107 für VL und 4 bis 111 für VH und besonders bevorzugt die vollständigen variablen Ketten VL und VH (Aminosäurepositionen 1 bis 109 für VL und 1 bis 113 für VH) umfassen (Numerierung nach WO 97/08320).
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Antiköφer oder das Antiköφerfragment dabei zumindest einen der in den Sequenzen SEQ-ID NOs: 1, 2, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 und 39 enthaltenen CDR-Bereiche (VL: CDR1 Positionen 24- 34, CDR2 Positionen 50-56, CDR3 Positionen 89-96; VH: CDR1 Positionen 26-35, CDR2 Positionen 50-65, CDR3 Positionen 95-102), insbesondere VL CDR3 oder VH CDR3. Besonders bevorzugt ist dabei ein Antiköφer, der eine der in den Sequenzen SEQ-ID NOs: 2, 6, 10, 14, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 und 39 enthaltenen variablen Ketten VL oder eine in den Sequenzen SEQ-ID NOs: 1, 5, 9 und 13 enthaltenen variablen Ketten VH umfaßt (oder ein Fragment eines solchen Antiköφers). Am meisten bevorzugt ist ein Antiköφer, der eines VH/NL-Paare umfaßt, die in den folgenden Sequenzpaaren enthalten sind: SEQ-ID Os: 1+2; SEQ-ID ΝOs: 5+6; SEQ-ID ΝOs: 9+10; SEQ-ID ΝOs: 13+14; SEQ-ID ΝOs: 5+17; SEQ-ID ΝOs: 5+19; SEQ-ID ΝOs: 5+37; SEQ-ID ΝOs: 9+21; SEQ-ID ΝOs: 9+23; SEQ-ID ΝOs: 9+25; SEQ-ID ΝOs: 9+27; SEQ-ID ΝOs: 9+29; SEQ-ID ΝOs: 9+31; SEQ-ID ΝOs: 9+33; SEQ-ID ΝOs: 9+39; SEQ-ID ΝOs: 13+35 (oder ein Fragment eines solchen Antiköφers). Insbesondere bevorzugt sind dabei die Fab-Fragmente MOR02628, MOR02965, MOR02977, MOR02969, MOR03263, MOR03325, MOR03285, MOR03201, MOR03267, MOR03268, MOR03292, MOR03294, MOR03295, MOR03309, MOR03293 und MOR03291. Ausgehend von den so beschriebenen erfindungsgemäßen Antiköφern ergeben sich für den Fachmann in naheliegender Weise verschiedene Möglichkeiten, neue modifizierte Antiköφer zu erhalten, die die erfindungsgemäßen Eigenschaften ebenfalls zeigen.
Dem Fachmann ist bekannt, daß für die Affinität sowie Selektivität und Spezifität insbesondere die CDR-Bereiche sowohl der schweren als auch der leichten Kette verantwortlich sind. Dabei spielen insbesondere der CDR3 -Bereich von NH und der CDR3 -Bereich von VL ein Rolle, gefolgt von CDR2 von VH und CDR1 von VL, während CDR1 von VH und CDR2 von VL zumeist eine untergeordnete Rolle spielen. Zur Optimierung von Affinität sowie Selektivität und Spezifität von Antiköφern bieten sich daher insbesondere die CDR-Bereiche an (s. auch z. B. Schier et al., J. Mol. Biol. (1996) 263, 551). Dabei kömien zum Beispiel ein oder mehrere der CDR-Bereiche ausgetauscht werden, zum Beispiel gezielt gegen CDR- Bereiche von anderen, die erfindungsgemäßen Eigenschaften bereits zeigenden Antiköφern, oder aber durch Bibliotheken von entsprechenden CDR-Sequenzen (siehe hierzu die Optimierung in Beispiel 1), die entweder vollständig zufällige Variationen erzeugen oder einen mehr oder weniger starke Bevorzugung (Tendenz) in Richtung von bestimmten Aminosäuren oder Kombinationen davon enthalten. Der Fachmann ist darüber hinaus auch in der Lage, ganze variable Ketten in gleicher Weise gegen entsprechende Ketten anderer definierter Antiköφer oder gegen diverse Bibliotheken solcher Ketten auszutauschen. Des weiteren sind dem Fachmann Verfahren bekannt, gezielt durch Mutagenese eine oder mehrere Aminosäurereste in den CDRs auszutauschen. Die Identifikation derartig zu verändernder Aminosäurereste erfolgt dabei z. B. auf Basis eines Vergleichs der Sequenzen verschiedener Antiköφer und die Identifikation von konservierten oder zumindest hoch homologen Resten an den entsprechenden Positionen. Bei den Veränderungen an den CDRs verfügt der Fachmami dabei auch über Kenntnisse zu den sogenannten "kanonischen Strukturen" (Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. (2000) 295, 979); Knappik et al. J. Mol. Biol. (2000) 296, 57), die einen Einfluß auf die dreidimensionale Anordnung der CDR-Bereiche haben und die beim Design entsprechender Optimierungsstrategien berücksichtigt werden können.
Darüber hinaus sind dem Fachmann Techniken vertraut, auch die Gerüstregionen von Antiköφern oder Antiköφerfragmenten zu verändern, um zu stabileren oder besser exprimierba- ren Molekülen zu gelangen (WO 92/01787; Nieba et al. (1997) Protein Eng. 10, 435; Ewert et al. (2003) Biochemistry 42, 1517).
Über diese bereits beschriebenen Strategien zur Modifikation von Antiköφern oder Antikörperfragmenten hinaus, ist der Fachmann in Kenntnis der erfindungsgemäßen Antiköφer und der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Meßverfahren auch in der Lage, weitere Veränderung an der Aminosäuresequenz oder der Zusammensetzung der beschriebenen Antiköφer vorzunehmen und durch Anwendung der beschriebenen Assays und Meßverfahren zu entscheiden, ob modifizierte Antiköφer entstanden sind, deren Eigenschaften mit denen übereinstimmen, die die erfindungsgemäßen Antiköφer auszeichnen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die einen der erfindungsgemäßen Antiköφer oder ein Antiköφerfragment kodieren. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich dabei um Nukleinsäuremoleküle, die eine der in den Sequenzen SEQ-ID NOs: 2, 6, 10, 14, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 und 39 enthaltenen variablen Ketten VL oder eine in den Sequenzen SEQ-ID NOs: 1, 5, 9 und 13 enthaltenen variablen Ketten VH kodieren. Besonders bevorzugt sind dabei die Sequenzen gemäß der SEQ-ID NOs: 3, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 und 40.
Das Emitter-bindendes Peptid der vorliegenden Erfindung weist optimalerweise eine Bin- dungsaffinität von kleiner als 50 nM und bevorzugt von kleiner als 10 nM auf.
Ein weiterer Aspekt ist ein Emitter-bindendes Peptid der vorliegenden Erfindung, wobei der Emitter einen Farbstoff umfaßt, der mindestens ein Absoφtionsmaximum und/oder Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 700 bis 1000 nm, bevorzugt mindestens ein Absoφtionsmaximum und Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 750 bis 900 nm aufweist. Die bathochrome Verschiebung des Farbstoffs ist so gewählt, daß die Verschiebung des Absoφtions- und/oder Fluoreszenzmaximums zu höheren Wellenlängen nach Wechselwirkung mit dem Mittel zur Erkennung des Emitters um einen Wert von größer 15 nm, bevorzugt größer 25 nm, und am meisten bevorzugt um ungefähr 30 nm erfolgt. Dabei muß nicht unbedingt eine Verschiebung als solche betrachtet werden, die eine Eigenschaft des Farbstoffs ist. Üblicherweise würde die Verschiebung als Veränderung eines an den Farbstoff angepaßten Emissionswertes gemessen werden, also bei einer bestimmten singulären Wellenlänge. Dafür sind geeignete optische Mitteln zur Messung vorgesehen, die dem Fachmann bekannt sind. Dies gilt ebenfalls für die Messung der Veränderung der Polarisationsebene, der Fluoreszenzintensität, der Phosphoreszenzintensität, der Fluoreszenzlebensdauer und einer bathochromen Verschiebung des Absoφtionsmaximums und/oder des Fluoreszenzmaximums.
Für die erfindungsgemäßen Emitter-bindenden Peptide ist es bevorzugt, daß der verwendete Emitter einen Farbstoff umfaßt, der ausgewählt ist aus der Gruppe von Polymethinfarbstoffen, wie Dicarbocyanin-, Tricarbocyanin-, Indotricarbocyanin-, Merocyanin-, Styryl-, Squarilium- und Oxonolfarbstoffen und Rhodaminfarbstoffen, Phenoxazin- oder Phenothiazinfarbstoffen. Allgemein kami der Emitter des erfindungsgemäßen Substanz-Emitter-Konjugats einen Cya- ninfarbstoff der allgemeinen Formel (I)
umfassen, in der D für einen Rest (II) oder (III)
steht, wobei die mit dem Stern markierte Position die Verknüpfungsstelle mit dem Rest B bedeutet und für die Gruppe (IV), (V), (VI), (VII) oder (VIII)
Rö =CH ^C „CH— FT CH CH R (V) =CH ,CH =CH "CH— ^C ^ - T ^ (IV) ( (CCHry,) iü (VI)
R5 I ==CH "*Cr ^C CH- R5 \ (CH2) CH- ---C^- CH. =CH ^CH ^CH ^CH— (VIII) NU)
stehen kann, in denen R1 und R2 unabhängig voneinander eine Cι-C -Sulfoalky!kette3 eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradekettige Ci-Cso-Alkylkette darstellt, die gegebenenfalls mit von 0 bis 15 Sauer Stoffatomen und/oder von 0 bis 3 Carbonylgruppen unterbrochen ist und/oder mit 0 bis 5 Hydroxygruppen substituiert sein kann, bedeutet, R3 und R4 unabhängig voneinander für die Gruppe -COOE1, -CONE^2, -NHCOE1, -NHCONHE1, - N-^E2, -OE1, -OSO3E1, -SOsE1, -SO^HE1 oder -E1 stehen, wobei E1 und E2 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine C1-C -Sulfoalkylkette, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradekettige Ci-Cso-Alkylkette darstellt, die gegebenenfalls von 0 bis 15 Sauerstoffatomen und/oder von 0 bis 3 Carbonylgruppen unterbrochen ist und/oder mit 0 bis 5 Hydroxygruppen substituiert ist, R5 für ein Wasserstoffatom, eine Methyl-, Ethyl- oder Propylgruppe oder ein Fluor- Chlor, Brom- oder Jodatom steht, b die Zahl 2 oder 3 bedeutet, und X für O, S, =C(CH3)2 oder-(CH=CH)- steht, sowie Salze und Solvate dieser Verbindungen.
Überraschenderweise konnte gefunden werden, daß nach hochaffiner Bindung eines Antikörpers an einen Cyaninfarbstoff mit Absoφtion und Fluoreszenz im Nahinfraroten Spektralbereich (> 750 nm) eine Verschiebung des Absoφtionsmaximums und Fluoreszenzmaximums um ca. 30 nm zu höheren Wellenlängen erfolgte (bathochrome Verschiebung). Unter Ausnutzung dieses Prinzips ist es somit zum Beispiel möglich, über einen großen Konzentrationsbereich ein Signal aus einer Vollblutprobe direkt und spektral getrennt zu detektieren, wobei sich das Signal linear zur Konzentration der zu bestimmenden Substanz verhält.
Die Emitter können mit Substanzen Konjugate bilden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden als Substanz-Emitter-Konjugate solche der allg, Formel
S-E
verwendet, worin S für eine zu untersuchende Substanz und E für einen Emitter steht, der einen Teil umfaßt, der auf eine Wechselwirkung mit dem Mittel zur Erkennung des Emitters mit einer Veränderung der Emissionseigenschaften reagiert. Als struktureller Bestandteil der erfindungsgemäßen Konjugate eignen sich u.a. Farbstoffe, die mindestens ein Absoφtionsmaximum und Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 600 bis 1200 nm besitzen. Bevorzugt sind dabei Farbstoffe mit mindestens ein Absoφtionsmaximum und Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 700 bis 1000 nm besitzen. Farbstoffe, die diese Kriterien erfüllen, sind beispielsweise solche aus folgenden Klassen: Poly- methinfarbstoffe, wie Dicarbocyanin-, Tricarbocyanin-, Merocyanin- und Oxonolfarbstoffe, Rhodaminfarbstoffe, Phenoxazin- oder Phenothiazinfarbstoffe, Tetrapyrrolfarbstoffe, insbesondere Benzopoφhyrine, Chorine, Bacteriochlorine, Pheophorbide, Bacteriopheophorbide, Puφurine und Phthalocyanine.
Bevorzugte Farbstoffe sind die Cyaninfarbstoffe mit Absoφtionsmaxima zwischen 750 und 900 nm, mit besonderem Vorteil Indotricarbocyanine. Struktureller Bestandteil der erfindungsgemäßen Konjugate sind auch die Substanzen, deren Konzentrationsbestimmung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgen soll. Diese sind beispielsweise ausgewählt aus Antigenen, wie Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Oligonukleotiden, Blutkomponenten, Serumkomponenten, Lipiden, Pharmaka und Verbindungen niederen Molekulargewichts, insbesondere Zuckern, Farbstoffen oder anderen Verbindungen mit einem Molekulargewicht von unter 500 Dalton.
Bevorzugte Farbstoffe sind die Cyaninfarbstoffe mit Absoφtionsmaxima zwischen 750 und 900 nm, mit besonderem Vorteil Indotricarbocyanine.
Die Farbstoffe enthalten Strukturelemente, über welche die kovalente Kopplung an die Sub- stanzstrukuren erfolgt. Dieses sind z. B. Linker mit Carboxygruppen, Aminogruppen, Hydroxygruppen.
Im Falle einer optischen Messung kann diese in unterschiedlicher Weise erfolgen und richtet sich hauptsächlich nach der Art der charakteristischen Veränderung der spektralen Eigenschaften des Emitters (z.B. Fluorophors). Generell bevorzugt ist eine Erfassung der Verschiebung der Absoφtionswellenlänge und Emissionswellenlänge oder die Messung der Absoφti- on und / oder Fluoreszenzintensität bei einer Wellenlänge, die zum größten Teil den am Antiköφer gebundenen Anteil des Fluorophors erfaßt. Je nach Veränderung der spektralen Eigenschaften des antiköφergebundenen Fluorophors können auch andere Eigenschaften, wie z. B. die Photonenlebensdauer, die Polarisation und das Ausbleichverhalten zur optischen Messung verwendet werden.
Der besondere Vorteil von Fluorophoren im spektralen Bereich des nahinfraroten Lichtes liegt in der geringen Überdeckung durch Bestandteile des Blutes. Hierdurch wird eine Tiefen- eindringung ermöglicht, ohne daß das zu delektierende Signal unverhältnismäßig stark verändert wird.
Dem Fachmann sind darüber hinaus auch bereits Antiköφer gegen Fluorophore bekannt, die in der Lage sind, nach Bindung des Fluorophors dessen spektrale Eigenschaften im UV- Bereich zu verändern. Durch Bindung eines Fluorophors in die Antigenbindungstasche eines Antiköφers können vor allem die Fluoreszenzintensität, das Absoφtionsmaximum, das Emissionsmaximum, und die Photonenlebensdauer verändert werden [Simeonov A., et al., Science (2000) 307-313]. Diese bekannten Antiköφer sind jedoch gegen Emitter (Fluoropho- re) gerichtet, die ihre Absoφtion und Fluoreszenzemission im sichtbaren und UV-Bereich des Lichts haben.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Emitter-bindenden Peptids für die in vitro Diagnostik.
Zu diesem Zweck kann das erfindungsgemäße Emitter-bindende Peptid auch in einem diagnostischen Kit vorliegen, gegebenenfalls zusammen mit anderen Hilfsstoffen. Alle erfindungsgemäßen Kits können weiterhin spezielle Instruktionen und Unterlagen (z.B. Eichkurven, -Anweisung zur Quantifizierung, usw.) enthalten.
Die Erfindung soll nun im folgenden anhand von Beispielen und den beigefügten Figuren und Sequenzen näher beschrieben werden, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Es zeigen:
Figur 1 : Den CysDisplay-Screening Vektor pMORPH23 (Vektorkarte und Sequenz),
Figur 2: Den Expressionsvektor pMORPHX9 MS (Vektorkarte und Sequenz), und
Figur 3 : Absoφtionspektrum (links) und Fluoreszenzspektrum vom Farbstoff aus Beispiel 2 in Abwesenheit und in Gegenwart von Antiköφer MOR02965 in PBS.
Beispiele:
Beispiel 1: Selektionierung, Herstellung und Charakterisierung von Emitter-bindenden Antikörpern: Selektion von HuCAL GOLD Fab Antikörper-Fragmenten gegen den Cy- anin-Farbstoff Fuji 6-4 (ZK203468) [T-Ωiatriιι-m-3,3-dimethyl-2-{4-ι-ιethyl-7-[3^- dimethyl-5-sulfonato-l-(2-sulfonatoethyl)-3H-indoliuιn-2-ylJ-ιepta-2,4,6-lrien-l-ylidenJ- l-(2-sul onatoethyl)-2,3-dihydro-lH-indol-5-sulfonat, inneres Salz]
HuCAL GOLD Antikörperbibliothek:
Antiköφerbibliothek HuCAL GOLD: HuCAL GOLD ist eine vollsynthetische, modulare humane Antiköφerbibliothek im Fab Antiköφerftagmentformat. HuCAL GOLD basiert auf den HuCAL-Konsensus-Antiköφergenen, die für die Bibliothek HuCAL-scFvl beschrieben wurden (WO 97/08320; Knappik,(2000), J. Mol. Biol. 296, 57-86; Krebs et al. J Immunol Methods. 2001 Aug l;254(l-2):67-84). In HuCAL GOLD sind alle sechs CDR-Bereiche durch den Einsatz der sogenannten Trinukleotidmutagenese (Virnekäs et al. (1994) Nucleic Acids Res. 1994 Dec 25;22(25):5600-7) entsprechend der Zusammensetzung dieser Bereiche in menschlichen Antiköφern diversifiziert, während in früheren HuCAL-Bibliotheken (HuCAL-scFvl und HuCAL-Fabl lediglich die CDR3-Bereiche in VH und VL entsprechend der natürlichen Zusammensetzung (s. Knappik et al., 2000) diversifiziert worden waren. Darüber hinaus findet in HuCAL GOLD auch ein abgewandeltes Screening- Verfahren Verwendung, das sogenannte CysDisplay (WO 01/05950). Der für das Screeningverfahren verwendete Vektor pMORPH23 findet sich in Figur 1.
Vλ Positionen 1 and 2. Die ursprünglichen HuCAL Mastergene wurden mit ihren authentischen N-Termini konstruiert: VLλl: QS (CAGAGC), VLλ2: QS (CAGAGC), and VLλ3: SY (AGCTAT). Diese Sequenzen finden sich in WO 97/08320. Bei der Herstellung der HuCAL- scFvl -Bibliothek wurden diese beiden Aminosäurereste in "DI" geändert, um das Klonieren zu erleichtern (EcoRI site). Diese Reste wurden bei der Herstellung von HuCAL-Fabl und HuCAL GOLD beibehalten. Daher enthalten alle HuCAL-Bibliotheken VLλ-Gene mit derE- coR ^-Schnittstelle GATATC (DI) am 5 '-Ende. Alle HuCAL kappa Gene (Mastergene und alle Gene in den Bibliotheken) enthalten ohnehin DI am 5 '-Ende, da dies die authentischen N- Termini darstellen (WO 97/08320).
VH Position 1. Die ursprünglichen HuCAL-Mastergene wurden mit ihren authentischen N- termini hergestellt: VH1A, VH1B, VH2, VH4, und VH6 mit Q (=CAG) als erstem Aminosäurerest und VH3 sowie VH5 mit E (=GAA). Die entsprechenden Sequenzen finden sich in WO 97/08320. Bei der Klonierung der HuCAL-Fabl sowie der HuCAL GOLD Bibliothek wurde an dieser Position 1 die Amiosäure Q (CAG) in allen VH-Genen eingebaut.
Phagemid-Produktion
Durch Infektion von E. coli TOP 10F '-Zellen aus der HuCAL GOLD Antiköφer-Bibliothek bzw. aus den Maturierungsbibliotheken mittels Helfeφhagen wurden große Mengen an Pha- gemiden produziert und angereichert. Dazu wurden die HuCAL GOLD bzw. die Maturierungsbibliotheken (in den TOP 10F '-Zellen) in 2xYT-Medium mit 34 μg/ml Chlorampheni- col/ 10 μg/ml Tetrazyklin/ 1% Glucose bei 37°C bis zu einer OD600 von 0.5 kultiviert. Anschließend erfolgte die Infektion mit VCSM13 Helfeφhagen bei 37°C. Die infizierten Zellen wurden pelletiert und in 2xYT/ 34 μg/ml Chloramphenicol/ 10 μg/ml Tetrazyklin/ 50 μg/ml Kanamycin/ 0.25 mM IPTG resuspendiert und bei 22°C über Nacht kultiviert. Aus dem Überstand wurden die Phagen 2x mit PEG ausgefällt und durch Zentrifugation geerntet (Ausubel (1998) Current protocols in molecular biology. John Wiley Sons, Inc., New York, USA). Die Phagen wurden in PBS/ 20% Glyzerin resuspendiert und bei -80°C gelagert.
Die Phagemid-Amplifikation zwischen den einzelnen Selektionsrunden erfolgte folgendermaßen: log-Phase E. coli TGl -Zellen wurden mit den selektionierten Phagen infiziert und auf LB-Agar-Platten mit 1% Glucose/ 34 μg/ml Chloramphenicol ausplattiert. Nach Inkubation über Nacht wurden die Bakterienkolonien abgekratzt, neu kultiviert und mit VCSM13 Helferphagen infiziert.
Primäre Selektion von Antikörpern gegen den Farbstoff Fuji 6-4 (ZK203468)
Die gereinigten und aufkonzentrierten Phagemide der HuCAL GOLD Antiköφer-Bibliothek wurden in ein Standard-Selektionsverfahren eingesetzt. Als Antigene wurden BSA- bzw. Transferrin-gekoppeltes ZK203468 alternierend verwendet. Die Antigene wurden in PBS aufgenommen und in Konzentrationen von 50 μg/ml auf Maxisoφ™ Mikrotiteφlatten F96 (Nunc) aufgebracht. Die Maxisoφ-Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert ("coating"). Nach Abblocken der Maxisoφ-Platten mit 5% Milchpulver in PBS -wurden ca. 2E+13 HuCAL GOLD-Phagen in die Antigen-beladenen, abgeblockten Wells gegeben und dort über Nacht bzw. zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach mehreren Waschschritten, die mit fortschreitenden Selektionsrunden stringenter wurden, wurden gebundene Phagen mit 20 mM DTT bzw. 100 μM unkonjugiertem ZK203468 eluiert. Insgesamt wurden drei aufeinanderfolgende Selektionsrunden durchgeführt, wobei die Phagenamplifikation zwischen den Selektionsrunden erfolgte, wie oben beschrieben.
Sufo-ϊüonierung selektionierter Fab-Fragmente zur Expression
Nach der drei Runden umfassenden Antikörper- Selektion wurden die Fab-codierenden Inserts der isolierten HuCAL-Klone in den Expressionsvektor pMORPHX9_MS (s. Figur 2) sub- kloniert, um die anschließende Expression der Fab-Fragmente zu erleichtern. Dazu wurde die gereinigte Plasmid-DNA der selektionierten HuCAL Fab-Klone mit den Restriktionsenzymen Xbal und EcoRI verdaut. Die Fab-codierenden Inserts wurde aufgereinigt und in den entsprechend verdauten Vektor pMORPHX9 VIS ligiert. Dieser Klonierungsschritt führt zu dem Fab-exprimierenden Vektor pMORPHX9_Fab_MS. Fab-Fragmente, die von diesem Vektor exprimiert werden, tragen zwei C-terminale Tags (Myc-Tag und Strep-Tag II) zur Aufreinigung und Detektion. Screening und Charakterisierung von ZK203468-bindenden Fab-Fragmenten
Mehrere tausend Klone wurden nach der Selektion und Sub-Klonierung vereinzelt und mittels ELISA im 384-well-Format auf spezifische Erkennung der im Panning verwendeten Antigene ZK203468-BSA und -Transferrin getestet. Hierbei identifizierte Klone wurden in einem In- hibitions-ELIS A auf effiziente Bindung des unkonjugierten Farbstoffs untersucht.
Dies führte zu den parenteralen Fab-Fragmenten MOR02628 (Proteinsequenzen SEQ-ID NO: 1 (VH-CH) und SEQ-ID NO: 2 (VL-CL); DNA-Sequenzen SEQ-ID NO: 3 (VH-CH) und SEQ-ID NO: 4 (VL-CL)), MOR02965 (Proteinsequenzen SEQ-ID NO: 5 (VH-CH) und SEQ- ID NO: 6 (VL-CL); DNA-Sequenzen SEQ-ID NO: 7 (VH-CH) und SEQ-ID NO: 8 (VL-CL)), MOR02977 (Proteinsequenzen SEQ-ID NO: 9 (VH-CH) und SEQ-ID NO: 10 (VL-CL); DNA-Sequenzen SEQ-ID NO: 11 (VH-CH) und SEQ-ID NO: 12 (VL-CL)) und MOR02969 (Proteinsequenzen SEQ-ID NO: 13 (VH-CH) und SEQ-ID NO: 14 (VL-CL); DNA- Sequenzen SEQ-ID NO: 15 (VH-CH) und SEQ-ID NO: 16 (VL-CL)), die den unkonjugierten Farbstoff ZK203468 effizient binden.
Beispiel 2: Optimierung der parentalen Antikörper-Fragmenten durch Austausch der LCDR3-Region
Klonierung der LCDR3-Bibliotheken
Die Plasmid-DNA der vier parenteralen Klone MOR02628, MOR02965, MOR02969 und MOR02977 wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Xbal verdaut und das entstandene, vollständige Fab-Insert vom Expressionsvektor pMORPHX9_MS in den entsprechend geschnittenen Display-Vektor pMORPH23 sub-kloniert. Dieser Schritt ist nötig, um das Ge- nlll bereitzustellen, das der Präsentaion des Fab-Fragments auf der Phagenoberfläche dient. In einem v/eiteren Schritt wurden die vier parenteralen Klone (nun in pMORPH23) mit Bpil und Sphl verdaut. Hierbei wurden die LCDR3 -Region und der konstante Clambda-Bereich aus dem Vektor-Rückgrat entfernt. Das entsprechende Vektor-DNA-Fragment wurde isoliert und aufgereinigt. Parallel dazu wurde aus der HuCAL-Fab 2 Bibliothek das komplementäre Bpil/Sphl-Fragment isoliert, welches eine diversifizierte LCDR3 -Region (mit einer Variabilität von etwa 3E+8) plus konstanten Clambda-Bereich enthält (= Insert-DNA). Mehrere μg Vektor-DNA und kompatible Insert-DNA wurden im molaren Verhältnis von 1:2 mit T4- DNA-Ligase ligiert und nach einem Aufreinigungsschritt in elektrokompetente TOP10F'- Zellen transformiert. Dabei wurden pro parenteralem Antiköφer Bibliotheksgrößen von 5E+8 bis etwa 1E+9 Klonen erzielt. Die Bibliotheken, denen die Klone MOR02628, MOR02969 und MOR02977 zugrunde lagen, wurden vereinigt ("Pool"). Die MOR02965-Bibliothek wurde separat behandelt ("Lead"). Wie bereits beschrieben, wurden mittels dieser TOPIOF'-Maturierungs-Bibliotheken die entsprechenden Phagemide durch Infektion mit VCSM13 Helfeφhagen produziert.
Antikörper-Selektionen auf Maxisorp™ Mikrotiterplatten
Die gereinigten und aufkonzentrierten Phagemide von "lead"- und "pool"-Bibliotheken wurden in ein Maturierungs-Selektionsverfahren unter stringenten Bedingungen eingesetzt (lange Waschperioden, Verdrängung durch gereinigte, parentale Fab-Proteine). Als Antigene wurden BSA- bzw. Transferrin-gekoppeltes ZK203468 alternierend verwendet. Diese Antigene wurden in PBS aufgenommen und in geringen Konzentrationen von 100-250 ng/ml auf Maxi- soφ™ Mikrotiteφlatten F96 (Nunc) aufgebracht. Die Maxisoφ-Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert ("coating"). Nach Abblocken der Maxisoφ-Platten mit 5% Milchpulver in PBS wurden ca. 2E+11 HuCAL Phagen in die Antigen-beladenen, abgeblockten Wells gegeben und dort über Nacht bzw. zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Um die Stringenz zu erhöhen, wurden während dieser Inkubation zusätzlich 100 nM bzw. 500 nM gereinigte Fab-Fragmente der parentalen Klone zugegeben. Nach mehreren ausgedehnten Waschschritten wurden gebundene Phagen mit 20 mM DTT eluiert. Insgesamt wurden zwei aufeinanderfolgende Selektionsrunden durchgeführt, wobei die Phagenamplifikation zwischen den Selektionsrunden erfolgte wie oben beschrieben.
Antikörper-Selektionen auf Neutavidin-Strips
Die gereinigten und aufkonzentrierten Phagemide von "lead"- und "pool"-Bibliotheken wurden weiterhin in ein zweites Maturierungs-Selektionsverfahren unter stringenten Bedingungen (lange Waschperioden, Verdrängung durch aufgereinigte, parentale Fab-Proteine bzw. freien Farbstoff) eingesetzt. Als Antigene wurde Biotin-conjugiertes ZK203468 ("alternierend mit Alkyl- bzw. Ether-Linker) verwendet. Diese Antigene wurden in PBS aufgenommen und in geringen Konzentrationen von 60 bzw. 12 ng/ml mit den ca. 2E+11 Phagen versetzt. Die An- tigen-Phagen-Lösungen wurden über Nacht bzw. 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Um die Stringenz zu erhöhen, wurden während dieser Inkubation zusätzlich 0.5 μg/ml gereinigte Fab-Fragmente der parentalen Klone bzw. 40 ng/ml ZK203468 zugegeben. Die Anti- gen-gebundene Phagen enthaltenden Lösungen wurden anschließend auf geblockte Neutravi- din-Strips aufgebracht und 30 min inkubiert, um die Bindung an die Festphase über den Bio- tinrest des Antigens zu ermöglichen. Nach mehreren Waschschritten wurden gebundene Phagen mit 20 mM DTT eluiert. Insgesamt wurden zwei aufeinanderfolgende Selektionsrunden dmchgeführt, wobei die Phagenamplifikation zwischen den Selektionsrunden erfolgte wie oben beschrieben.
Sub-Klonierung selektionierter Fab-Fragmente zur Expression
Nach der Selektion ("Maturierung") wurden die Fab-codierenden Inserts der isolierten HuCAL-Klone in den Expressionsvektor pMORPHX9_MS sub-kloniert, um die anschließende Expression zu erleichtern. Dazu wurde die gereinigte Plasmid-DNA der selektionierten HuCAL Fab-Klone mit den Restriktionsenzymen Xbal und EcoRI verdaut. Das Fabcodierende Insert wurde aufgereinigt und in den entsprechend verdauten Vektor pMORPHX9_MS ligiert. Dieser Klonierungsschritt fülirt zu dem Fab-exprimierenden Vektor pMORPHX9_Fab_MS. Fab-Fragmente, die von diesem Vektor exprimiert werden, tragen zwei C-terminale Tags (Myc-Tag und Strep-Tag II) zur Aufreinigung und Detektion.
Identifikation optimierter Antikörper-Fragmente
Um Antiköφer mit verbesserten Affinitäten zum Farbstoff Fuji 6-4 zu identifizieren, wurden die Klone aus den Selektionen vereinzelt und in ELISAs im 384-well-Format gescreent. Dazu wurde auf die ELISA-Mikrotiteφlatten ZK203468-BSA aufgebracht. Die zu untersuchenden Fab-Fragmente wurden als nicht-aufgereinigte Bakterienlysate zugegeben. Um zusätzlich zur Bindung an das Antigenkonjugat die Bindung an den freien Farbstoff zu untersuchen, wurden ausserdem identische Screeningplatten mit Bakterienlysat und zusätzlich freiem Farbstoff in zwei unterschiedlichen Konzentrationen versetzt. Die hierbei entstehende Inhibition der Fab- Bindung an die Festphase durch den unkonjugierten Farbstoff zeigte Antiköφer an, die nicht das Farbstoff-Konjugat sondern nur den freien Farbstoff spezifisch erkennen. Hierbei isolierte Klone wurden in Solution-Inhibition-Tests im ELISA-Format und dem Luminex-Gerät genau charakterisiert und deren Affinitäten zu Fuji 6-4 bestimmt.
Die folgenden Klone zeigten verbesserte Affinitäten im Vergleich zu den parenteralen Antiköφern: Name Parenteraler LCDR3-Sequenz Fab MOR02969 - SSYTYRVGGM MOR03291 MOR02969 ASYDYKSKNI MOR02965 - SSWDSSFSW MOR03263 MOR02965 SSWDVSLEW MOR02977 - QSWTTRPLNR MOR03201 MOR02977 SSWTSYFHIR MOR03267 MOR02977 QAWDSNFKNR MOR03292 MOR02977 QSWAPLFKMR MOR03295 MOR02977 QSWDSALSNR
Zusammenfassend konnte die Affinität des parenteralen MOR02977 im Vergleich zu MOR03267 um den Faktor 140 verbessert werden. Alle weiteren identifizierten Klone zeigten Verbesserungen von Faktor 2-70 im Vergleich zum jeweiligen parenteralen Fab.
Beispiel 3: Photophysikalische Charakterisierung der Farbstoff- Antikörper-Komplexe und Bestimmung der spektralen Verschiebungen / Fluoreszenzquantenausbeuten
Es wurden Farbstoff-Antiköφer-Komplexe basierend auf Antiköφern mit Bindung an den Indotricarbocyaninfarbstoff Trinatrium-3 ,3 -dimethyl-2- {4-methyl-7- [3 ,3 -dimethyl-5- sulfonato- 1 -(2-sulfonatoethyl)-3H-indolium-2-yl]hepta-2,4,6-trien- 1 -yliden} - 1 -(2- sulfonatoethyl)-2,3-dihydro-lH-indol-5-sulfonat, imieres Salz untersucht (siehe Beispiele 1 und 2). Es wurden Lösungen der Konzentration von 1 μmol/L des o. g. Farbstoffes und 2,4 μmol/L des jeweiligen Antiköφers in PBS hergestellt und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Absoφtionsmaxima wurden mit einem Spektralphotometer (Perkin-Elmer, Lambda2) bestimmt. Die Fluoreszenzmaxima und Fluoreszenzquantenausbeuten wurden mit einem SPEX Fluorolog (wellenlängenabhängige Empfindlichkeit von Lampe und Detektor kalibriert) relativ zu Indocyaningrün bestimmt (Q = 0,13 in DMSO, J Chem Eng Data 1977, 22, 379, Bioconjugate Chem 2001, 12, 44). Aus den Absoφtions- und Fluoreszenzmaxima wurden die spektralen Verschiebungen relativ zu den Maxima einer Lösung des o. g. Farbstoffes ohne Antiköφer in PBS (1 μmol/L) berechnet (Absoφtionsmax. 754 nm, Fluoreszenzmax. 783 nm, Fluoreszenzquantausbeute 10 %).
Name Parenteraler LCDR3- SEQ-ID SEQ-ID SEQ-ID SEQ-ID Fab Sequenz NO. VH NO. VL NO. VH NO. VL Protein Protein DNA DNA AAWDFRKRL 1 2 3 4 MOR02628 N MOR02965 SSWDSSFSW 5 6 7 8 QSWTTRPLN 9 10 11 12 MOR02977 R SSYTYRVGG 13 14 15 16 MOR02969 M
MOR02965 - SSWDSSFSW 5 6 7 8
MOR03263 MOR02965 SSWDVSLEW 5 17 7 18 ASWDKSLQ 5 19 7 20
MOR03325 MOR02965 W
MOR03285 MOR02965 QAWTGSYAT 5 37 7 38
QSWTTRPLN 9 10 11 12
MOR02977 - R
MOR03201 MOR02977 SSWTSYFHIR 9 21 11 22 QAWDSNFKN 9 23 11 24
MOR03267 MOR02977 R RSWDSNLSY 9 25 11 26
MOR03268 MOR02977 S QSWAPLFKM 9 27 11 28
MOR03292 MOR02977 R
MOR03294 MOR02977 QTWTSSFSSR 9 29 11 30 QSWDSALSN 9 31 11 32
MORQ3295 MOR02977 R QTWBHGFTH 9 33 11 34
MOR03309 MOR02977 R SSWTTIYRN 9 39 11 40
MOR03293 MOR02977 R
SSYTYRVGG 13 14 15 16
MOR02969 - M ASYDYKSKN 13 36 15 36
MOR03291 MOR02969 I Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle zusammengefaßt:
Beispiel 4: Konstruktion von Expressionsvektoren für die Expression von HuCAL Im- munoglobulinen Klonierung der schweren Kette: Die "multiple cloning site" des Vektors pCDNA3.1+ (Invi- trogen) wird entfernt (Nhel/Apal), und ein Platzhalter, der mit den Restriktionsschnittstellen aus dem HuCAL-Design kompatibel ist, wird eingesetzt für die Ligation der Leader-Sequenz (Nhel/EcoRI), der VH-Domäne aus dem Fab-Fragment (Muni/), und die konstanten Immuno- globulinregionen (Blpl/Apal). Die Leadersequenz (EMBL 83133) wird mit einer Kozakse- quenz ausgestattet (Kozak, 1987). Die konstanten Regionen von humanem IgG (PIR J00228), IgG4 (EMBL K01316), und Serum-IgAl (EMBL J00220) werden in überlappende Oligo- nucleotide von einer Länge von etwa 70 Basen aufgeteilt. "Silent Mutations" werden eingeführt, um Restriktionsschnittstellen zu entfernen, die nicht mit dem HuCAL-Design kompatibel sind. Die Oligonukleotide werden durch "overlap extension-PCR" verknüpft.
Während des Subklonierens von den Fab-Fragmenten in ein IgG-Molekül wird die schwere Kette des Fab-Fragments über Mfel/Blpl ausgeschnitten und in den Vektor, der mit Eco- RI/BlpI geöffnet wird, ligiert. EcoRI (g/aattc) und Mfel (c/aattg) besitzten beide kompatible kohäsive Enden (aatt), und die Sequenz der ursprünglichen Mfel- Schnittstelle in den Fab- Fragmenten ändert sich von: c/aattg nach g/aattg nach der Ligation in den IgG- Expressionsvektor, wodurch zum Einen sowohl die Mfel- als auch die EcoRI- Schnittstelle zerstört werden, und zum Anderen eine Aminosäurenaustausch von Q (Kodon: caa) nach E (Kodon: gaa) statt findet.
Klonierung der leichten Kette. Die "multiple cloning site" von pCDNA3.1/Zeo+ (Invitrogen) wird duch zwei unterschiedliche Platzhalter ersetzt. Der k-Platzhalter enthält Restriktionsschnittstellen für den Einbau einer k-Leadersequenz (Nhel/EcoRV), der HuCAL Fab Vk- Domäne (EcoRV/BsiWI), und der konstanten Region der k-Kette (BsiWI/Apal). Die entsprechenden Schnittstellen im 1-Platzhalter sind Nhel/EcoRV (1-Leader), EcoRV/Hpal (VI- Domäne), and Hpal/Apal (konstante Region 1-Kette). Der k-Leader (EMBL Z00022) sowie der 1-Leader (EMBL J00241) sind beide mit Kozak-Sequenzen versehen. Die konstanten Regionen von humanen k- (EMBL L00241) und 1-Ketten (EMBL Ml 8645) werden beide durch "overlap extension-PCR" assembliert, so wie oben beschrieben.
Generation von IgG-exprimierenden CHO-Zellen. CHO-Kl Zellen werden mit einer äqui- molaren Mischung von Expressionsvektoren für die schwere und leichte IgG-Ketten co- transfiziert. Zweifach resistente Transfektantent werden mit 600 mg/ml G418 und 300 mg/ml Zeocin (Invitrogen) gefolgt von limitierender Verdünnung selektioniert. Der Überstand von Einzelklonen wird auf IgG-Expression durch "capture-ELISA" übeφrüft. Positive Klone werden in RPMI-1640 Medium, das mit 10% "ultra-low IgG-FCS" (Life Technologies) versehen ist, angezogen. Nach Einstellung des pH- Werts des Überstands auf 8.0 und Sterilfiltra- tion, wird die Lösung einer Standard-ProteinA-Säulenchromatographie unterzogen (Porös 20 A, PE Biosystems).

Claims

Patentansprüche
1. Emitter-bindendes Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß dieses bei einer Wechselwirkung seiner Antigenbindungstasche mit dem Emitter eine Veränderung der spektralen Emissionseigenschaften des Emitters bewirkt.
2. Emitter-bindendes Peptid nach Anspruch 1, wobei der Emitter einen Farbstoff umfaßt, der mindestens ein Absoφtionsmaximum und/oder Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 700 bis 1000 nm, bevorzugt mindestens ein Absoφtionsmaximum und Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 750 bis 900 nm aufweist.
3. Emitter-bindendes Peptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2, das ausgewählt ist aus Antiköφern oder Antiköφerfragmenten, wie zum Beispiel Fab-Fragmenteri, scFv-Fragmenten, scTCR-Ketten, single-chain- Antiköφern und Gemischen davon.
4. Emitter-bindendes Peptid nach Anspruch 3, umfassend eines der VH/VL-Paare, das in einem der folgenden Sequenzpaare enthalten ist: SEQ-ID NOs: 1+2; SEQ-ID NOs: 5+6; SEQ-ID NOs: 9+10; SEQ-ID NOs: 13+14; SEQ-ID NOs: 5+17; SEQ-ID NOs: 5+19; SEQ-ID NOs: 5+37; SEQ-ID NOs: 9+21; SEQ-ID NOs: 9+23; SEQ-ID NOs: 9+25; SEQ- ID NOs: 9+27; SEQ-ID NOs: 9+29; SEQ-ID NOs: 9+31; SEQ-ID NOs: 9+33; SEQ-ID NOs: 9+39; und SEQ-ID NOs: 13+35.
5. Emitter-bindendes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dessen Bindungsaffinität zu dem Emitter kleiner als 50 nM und bevorzugt kleiner als 10 nM ist,
6. Emitter-bindendes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Veränderung der Emissionseigenschaften des Emitters ausgewählt ist aus einer Veränderung der Polarisationsebene der Fluoreszenzintensität, Phosphoreszenz, insbesondere Phosphoreszenzintensität, Lebensdauer der Fluoreszenz und einer bathochromen Verschiebung des Absoφti- onsmaximums und/oder Fluoreszenzmaximums.
7. Emitter-bindendes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Verschiebung des Absoφtions- und/oder Fluoreszenzmaximums zu höheren Wellenlängen nach Wechsel- Wirkung mit dem Mittel zur Erkennung des Emitters um einen Wert größer 15 nm, bevorzugt größer 25 nm, und am meisten bevorzugt um ungefähr 30 nm erfolgt.
8. Emitter-bindendes Peptid nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei der Farbstoff ausgewählt ist aus der Gruppe von Polymetlnnfarbstoffen, wie Dicarbocyanin-, Tricarbocyanin-, Indotricarbocyanin-, Merocyanin-, Styryl-, Squarilium- und Oxonolfarbstoffen und Rho- daminfarbstoffen, Phenoxazin- oder Phenothiazinfarbstoffen.
9. Emitter-bindendes Peptid nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei der Farbstoff ein Cya- ninfarbstoff der allgemeinen Formel (I)
umfaßt, in dem D für einen Rest (II) oder (III)
steht, wobei die mit dem Stern markierte Position die Verknüpfungsstelle mit dem Rest B bedeutet und für die Gruppe (IV), (V), (VI), (VII) oder (VIII)
(IV) (VII) (VIII) stehen kann, in denen R1 und R2 unabhängig voneinander eine CrC-t-Sulfoalkylkette, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradekettige -Cso-Alkylkette darstellt, die gegebenenfalls mit von 0 bis 15 Sauerstoffatomen und/oder von 0 bis 3 Carbonylgruppen unterbrochen ist und/oder mit 0 bis 5 Hydroxygruppen substituiert sein kann, bedeutet, R3 und R4 unabhängig voneinander für die Gruppe -COOE1, -CONE^2, -NHCOE1, - NHCONHE1, -NE^2, -OE1, -OSOsE1, -SO3E1, -SO^HE1 oder -E1 steht, wobei E1 und E2 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine C1-C -Sulfoalkylkette, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradekettige CrCso-Alkylkette darstellt, die gegebenenfalls von 0 bis 15 Sauerstoffatomen und/oder von 0 bis 3 Carbonylgruppen unterbrochen ist und/oder mit 0 bis 5 Hydroxygruppen substituiert ist, R5 für ein Wasserstoffatom oder ein Fluor- Chlor, Brom- oder Jodatom, Me, Et, Prop steht, b die Zahl 2 oder 3 bedeutet, und X O, S, =C(CH3)2 oder-(CH=CH)- bedeutet, sowie Salz und Solvate dieser Verbindungen.
10. Polynuldeotid, insbesondere DNA, RNA oder PNA, umfassend eine Sequenz, die für ein Emitter-bindendes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder funktionellen Varianten davon kodiert.
11. DNA- oder RNA- Vektormolekül, das mindestens ein oder mehrere Polynukleotid(e) nach Anspruch 10 enthält und das in Zellen exprimierbar ist.
12. Wirtszelle, die ein Polynuldeotid gemäß Anspruch 10 oder ein Vektormolekül gemäß Anspruch 11 enthält.
13. Antiköφer, insbesondere polyklonaler oder monoklonaler Antiköφer, humaner oder humanisierter Antiköφer, synthetischer oder rekombinanter Antiköφer, umfassend mindestens ein Emitter-bindendes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
14. Verfahren zur Herstellung eines Emitter-bindenden Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend die Immunisierung eines geeigneten Organismus mit einem Emitter, umfassend einen Farbstoff, der ausgewählt ist aus der Gruppe von Polymethinfarb- stoffen, wie Dicarbocyanin-, Tricarbocyanin-, Indotricarbocyanin-, Merocyanin-, Sty- ryl-, Squarilium- und Oxonolfarbstoffen und Rhodaminfarbstoffen, Phenoxazin- oder Phenothiazinfarbstoffen.
15. Verfahren zur Herstellung eines Emitter-bindenden Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend die rekombinante und/oder synthetische Herstellung des Peptids.
16. Verwendung eines Emitter-bindenden Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9, einer Nukleinsäure nach Anspruch 10 oder 11, einer Wirtszelle nach Anspruch 12, oder eines Antiköφers nach Anspruch 13 als Diagnostikum für die in vitro Diagnostik.
17. Diagnostischer Kit für die in vitro Diagnose, umfassend mindestens ein Mittel ausgewählt aus einem Emitter-bindenden Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9, einer Nukleinsäure nach Anspruch 10 oder 11, einer Wirtszelle nach Anspruch 12, oder einem Antiköφer nach Anspruch 13, gegebenenfalls zusammen mit anderen Hilfsstoffen und/oder Anweisungen, in gemeinsamen oder in getrennten Behältern.
18. Verfahren zur quantitativen in v tro-Bestimmung einer in einer Probe enthaltenen Substanz, umfassend den Schritt von, a) in Kontakt bringen eines Emitter-bindenden Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9 mit einem Emitter, wobei die Wechselwirkung seiner des Emitters des Konjugats mit dem Emitter-bindenden Peptid eine Veränderung der spektralen Emissionseigenschaften des Emitters bewirkt, und b) Messen der Veränderung der spektralen Emissionseigenschaften des Emitters.
19. Verfahren zur direkten quantitativen in vztro-Bestimmung einer in einer Probe enthaltenen Substanz oder eines in der Probe vorhandenen Antigen-erkennenden Mittels nach Anspruch 18, umfassend weiterhin den Schritt von, d) Quantifizieren der in der Probe enthaltenen Substanz mittels der gemessenen Veränderung der Emissionseigenschaften des Emitters.
20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei die Veränderung der spektralen Emissionseigenschaften des Teils des Emitters ausgewählt ist aus einer Veränderung der Polarisationsebene, Phosphoreszenz, insbesondere Phosphoreszenzintensität, Lebensdauer der Fluoreszenz und einer bathochromen Verschiebung des Absoφtionsmaximums und/oder Fluoreszenzmaximums.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei als das Emitter-bindende Peptid, Antiköφerfragmente, wie zum Beispiel Fab-Fragmente, scFv-Fragmente, scTCR- Ketten, single-chain-Antiköφer und Gemische davon mit der Probe in Kontakt gebracht werden.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei das Emitter-bindende Peptid eine Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 umfaßt.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, wobei das Emitter-bindende Peptid eine Bindungsaffinität zu dem Emitter von weniger als 50 nM und bevorzugt weniger als 10 nM aufweist.
EP04729434A 2003-07-09 2004-04-26 Emitter-bindende peptide die eine ver nderung der spektralen emissionseigenschaften des emitters bewirken Withdrawn EP1641829A1 (de)

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