WO2005005985A1

WO2005005985A1 - Vorrichtung und verfahren zur direkten quantitativen in vitro- bestimmung einer in einer probe enthaltenen substanz

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Publication number: WO2005005985A1
Application number: PCT/EP2004/007595
Authority: WO
Inventors: Michael Schirner; Kai Licha
Original assignee: Schering Ag
Priority date: 2003-07-09
Filing date: 2004-07-09
Publication date: 2005-01-20
Also published as: US20050037402A1; DE10331093A1; JP2009513940A; EP1642130A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur direkten quantitativen in vitro-Bestimmung einer in einer Probe enthaltenen Substanz. Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfaßt auf einer Oberfläche immobilisierte Mittel zur Substanz-Erkennung, freies Substanz-Emitter-Konjugat, und auf einer Oberfläche immobilisierte Mittel zur Erkennung des Emitters. Der verwendete Emitter der Vorrichtung umfaßt einen Teil, der auf eine Wechselwirkung mit dem Mittel zur Erkennung des Emitters mit einer Veränderung der Emissionseigenschaften reagiert. Mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtung können Substanzen, ausgewählt aus Antigenen, wie Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Oligonukleotiden, Blutkomponenten, Serumkomponenten, Lipiden, Pharmaka und Verbindungen niederen Molekulargewichts oder, in,einem anderen Aufbau, Substanzerkennende Mittel, wie etwa Antikörper oder deren Fragmente direkt quantitativ in z.B. Vollblutproben bestimmt werden.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur direkten quantitativen in viϊro-Bestimmung einer in einer Probe enthaltenen Substanz

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur direkten quantitativen in v tro-Bestimmung einer in einer Probe enthaltenen Substanz. Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfaßt auf einer Oberfläche immobilisierte Mittel zur Substanz-Erkennung, frei- es Substanz-Emitter-Konjugat, und auf einer Oberfläche immobilisierte Mittel zur Erkennung des Emitters. Der verwendete Emitter der Vorrichtung umfaßt einen Teil, der auf eine Wechselwirkung mit dem Mittel zur Erkennung des Emitters mit einer Veränderung der Emissionseigenschaften reagiert. Mittels der erfϊndungsgemäßen Vorrichtung können Substanzen, ausgewählt aus Antigenen, wie Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Oligonukleotiden, Blutkom- ponenten, Serumkomponenten, Lipiden, Pharmaka und Verbindungen niederen Molekulargewichts oder Antikörper oder deren Fragmente direkt quantitativ in z.B. Vollblutproben bestimmt werden.

Hintergrund der Erfindung

Für den diagnostischen Nachhweis von Substanzen und deren Konzentrationsbestimmung werden heute in vielen Fällen in-vitro diagnostische Meßverfahren angewendet, die auf biologischen Molekülen, wie z. B. Peptiden, Proteinen, Antikörpern oder Oligonukleotiden, beruhen, die eine hohe Affinität für eine zu bestimmende Substanz haben. Bevorzugt werden hier- für Proteine und Peptide und besonders bevorzugt Antikörper und Antikörperfragmente verwendet.

Dabei erfüllen die verwendeten Anti-Substanz-Antikörper unterschiedliche Zwecke. Einerseits werden sie für die Abtrennung der zu bestimmenden Substanz aus der Probe verwendet, andererseits erfüllen sie aber auch die Aufgabe der Lokalisierung bzw. Positionierung unterschiedlicher verwendeter Signalgeber an der zu untersuchenden Substanz. Zum Nachweis z.B. eines Antikörpers in einer Probe haben sich vor allem optische und radioaktive Meßverfahren etabliert, aber auch akustische [siehe z.B. Cooper MA, et al. Direct and sensitive detec- tion of a human virus by rupture event scanning. Nat Biotechnol. 2001 Sep;l 9(9): 833 -7.] und magnetische Meßverfahren sind bekannt. Die größte Verbreitung haben die optischen Meß- verfahren erlangt [Nakamura, R. M., Dito, W. R., Tucker, E. S. (Eds.). Immunoassays: Clini- cal Laboratory Techniques for the 1980s. A. R. Liss, New York. Edwards, R. (ed.). Immunoassays: Essential Data, 1996, Wiley Europe].

Antikörper und Peptide, die gegen Moleküle kleinen Molekulargewichts gerichtet sind, sind bereits bekannt. Darunter fallen auch Antikörper und Peptide gegen Farbstoffmoleküle [Si- meonov A. et al., Science 2000, 290, 307-313; Watt R. M. et al., Immunochemistry 1977, 14, 533-541; Rozinov M. N. et al., Chem. Biol. 1998, 5, 713-728]. Des weiteren sind Antikörper gegen verschiedene Farbstoffe bereits kommerziell erhältlich, z. B. gegen Fluorescein, Tetra- methylrhodamin, Texas Red, Alexa Fluor 488, BODIPY FL, Lucifer yellow and Cascade Blue, Oregon Green (Fa. Molecular Probes, Inc., USA). Hierbei handelt es sich jedoch um polyklonale IgG Antikörper für bioanalytische Zwecke, die zum Teil unkontrollierbare Kreuzreaktivitäten aufweisen und nicht aus einem strikten Selektionsprozess hervorgegangen sind.

Bestimmte in vitro diagnostische Verfahren, wie z.B. die Elektrochemiluminienz basieren auf der Kombination verschiedener Antikörper gegen die zu bestimmende Substanz, wobei der eine Antikörper für die Abtrennung der zu bestimmenden Substanz aus der Untersuchungsprobe dient und der andere Antikörper das diagnostisch nachgewiesene Signalmolekül trägt. Im Falle des diagnostischen Verfahrens der Elektrochemolummeszenz wird der markierte Antikörper optisch detektiert [Grayeski, M. L., Anal. Chem. 1987, 59, 1243].

Neben der Elektrolumineszenz kann auch die lichtinduzierte Phosphoreszenz und die Fluoreszenz als optische Eigenschaft von Molekülen für diagnostische Meßverfahren verwendet wer- den. Gegenüber der Elektrolumineszenz und Phosphoreszenz bietet insbesondere die Fluoreszenz als optische Eigenschaft von Molekülen den Vorteil der hohen Nachweisempfindlichkeit und eine hohe Linearität des Meßsignals über einen großen dynamischen Bereich hinweg.

Zum Nachweis der Fluoreszenz eines Fluorophors wurden verschiedene Meßverfahren ent- wickelt, die unterschiedliche Prinzipien innerhalb der Fluoreszenzprozesse ausnutzen. Etablierte Meßverfahren nutzen z. B. die Abschwächung polarisierten Lichtes (Fluoreszenzpolarisierung - FP), die Messung der Photonenlebensdauer (Fluoreszenzlebensdauermessung - FLM), die Ausbleicheigenschaften (Fluoreszence-Photobleaching Recovery - FPR) und den Energietransfer zwischen verschiedenen Fluorophoren (Fluoreszenz-Resonanz-Energie- Transfer - FRET) [Williams, A. T., et ab, Methods Immunol. Anal. 1993, 1, 466;Youn, H. J. et al., Anal. Biochem. 1995 Oswald, B. et al., Anal. Biochem. 2000, 280, 272; Szollosi, J. et. al., Cytometry 1998, 34, 159].

Andere Nachweisverfahren basieren auf einer Veränderung der Polarisationsebene oder dem Nachweis einer Phosphoreszenz.

Bei der Mehrzahl der bereits verfügbaren Meßverfahren wird der Anti-Substanz-Antikörper mit einem Fluorophor markiert. Diese Markierung erfolgt durch spezifische und unspezifische chemische Kopplung. Der markierte Antikörper wird im Überschuß zu der Untersuchungsprobe zugegeben. Dies ist erforderlich, um alle zu untersuchenden Substanzmoleküle zu binden. Bei der Messung der Fluoreszenzintensität als sensitivstem Meßparameter von Fluo- rophoren muß jedoch bedacht werden, daß auch der ungebundene, markierte Anti-Substanz- Antikörper ein Fluoreszenzsignal abgibt. Aus diesem Grund ist eine Trennung des an die Sub- stanz spezifisch gebundenen Anti-Substanz-Antikörpers von dem nicht gebundenen Anteil erforderlich.

Diesen Verfahren liegt weiterhin allgemein zu Grunde, daß der eine Anti-Substanz- Antikörper der Abtrennung der zu untersuchenden Substanz dient und der zweite Anti- Substanz-Antikörper, der an einer anderen Bindundungsstelle der Untersuchungssubstanz erkennt, mit einem signalgebenden Molekül markiert ist. Auf diese Weise kann eine Verfälschung des Messergebnisses durch den nicht gebundenen, aber signalgebenden Antikörper vermieden werden. Diese Verfahrensweise ist jedoch, bedingt durch den Abtrennungsschritt, mit einem erhöhten methodischen und technischen Aufwand und höheren Kosten verbunden. Besonders nachteilig erweist sich jedoch der hohe technische Aufwand, der eine Etablierung dieses Verfahrens für die Schnelldiagnostik verhindert.

Neuere fluoreszenzbasierte Meßverfahren, wie z.B. die Fluoreszenzpolarisierung und der Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) sind Methoden, die es ermöglichen, ohne Ab- trennung des Anteils der nicht gebundenen, Fluorophormarkierten Antikörper den Gehalt der spezifisch gebundenen Anti-Substanz- Antikörper zu bestimmen.

Hierdurch wird in einem Schritt die Messung des Gehaltes einer zu bestimmenden Substanz unbekannter Konzentration ermöglicht. Beide hier genannte Methoden weisen jedoch auch entscheidende Nachteile aufweisen, die eine weite Verbreitung in der in- vitro Diagnostik verhindern. So weist die Fluoreszenz-Polarisation eine im Vergleich zur Fluoreszenzintensitätsmessung hohe Nachweisgrenze auf und ist damit nicht in der Lage, sehr geringe Mengen einer unbekannten Substanz zu bestimmen. Ein weiterer Nachteil ist, daß das Meßverfahren nicht störquellenfrei in einer Vollblutprobe oder Serumprobe angewendet werden kann, da das Polarisationslicht durch eine Vielzahl von Proteinen beeinflußt wird und somit die Durch- leutung einer Blutprobe nicht fehlerfrei möglich ist.

FRET ist ebenfalls ein Verfahren, das zum Nachweis der spezifisch gebundenen, Fluorophor- markierten Antikörper ohne Trennschritte angewendet werden kann, obwohl im Unterschied zur Fluoreszenzpolarisation die Fluoreszenzintensität als Meßsignal erfaßt wird, ist die Anwendung an einer Vollblutprobe oder Serumprobe ebenfalls nicht möglich. Die Ursache hierfür liegt in der starken Absorption und Autofluoreszenz der Meßprobe bei den Wellenlängen, die z.Z. für das Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Meßverfahren verwendet werden (sichtbarer Spektralbereich bis ca. 550 nm) [Mathis, G., J. Clin. Ligand Assay, 1997, 20, 141; Mathis, G., Clin. Chem. 1995, 41, 1391; Mathis, G., et. al., Clin. Chem. 1993, 39, 1251 Clarke, E. E.₅ et. al., J. Neuroscience Methods 2000, 102, 61; Leblanc, V., et. al., Anal. Biochem. 2002, 308, 247].

Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung und ein optisches Meßverfahren für die hierfür notwendigen Nachweisreagenzien zur Bestimmung des Gehalts einer unbekannten Substanz ohne Trennschritt bereitzustellen, welches unter anderem auch für die quantitative Bestimmung in einer Vollblutprobe verwendet werden kann.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das erfindungsgemäße Meßverfahren und der Bereitstellung einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Meßverfahrens gemäß der unabhängigen Ansprüche 1, 18 und 19 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen aufgeführt.

Gemäß eines ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung wird somit eine Vorrichtung (1) zur direkten quantitativen in v tro-Bestimmung einer in einer Probe enthaltenen Substanz (3) zur Verfügung gestellt, umfassend, a) auf einer Oberfläche (6) immobilisierte Mittel zur Substanz-Erkennung (5), b) freies Substanz-Emitter-Konjugat (2), und c) auf einer Oberfläche immobilisierte Mittel zur Erkennung des Emitters (4), wobei der verwendete Emitter einen Teil umfaßt, der auf eine Wechselwirkung mit dem Mittel zur Erkennung des Emitters (4) mit einer Veränderung der Emissionseigenschaften reagiert. Bevorzugterweise umfaßt die erfindungsgemäße Vorrichtung zur direkten quantitativen in v/tro-Bestimmung einer in einer Probe enthaltenen Substanz weiterhin d) Mittel zur Messung der Veränderung der Emissionsei- genschaften des Emitters.

Bevorzugt ist eine erfindungsgemäße Vorrichtung, wobei die Substanz ausgewählt ist aus Antigenen, wie Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Oligonukleotiden, Blutkomponenten, Serumkomponenten, Lipiden, Pharmaka und Verbindungen niederen Molekulargewichts, insbesondere Zuckern, Farbstoffen oder anderen Verbindungen mit einem Molekulargewicht von unter 500 Dalton.

Weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemäße Vorrichtung, wobei die Substanz ein Antikörper oder Antikörperfragment ist. Dabei wird eine erfmdungsgemäße Vorrichtung (10) zur direk- ten quantitativen in v/tro-Bestimmung eines in einer Probe enthaltenen Antikörpers oder Antikörperfragments (13) verwendet, umfassend, a) auf einer Oberfläche (16) immobilisiertes Antigen (15), b) freies Antikörper- (oder Antikörperfragment)-Emitter-Konjugat (12), und c) auf einer Oberfläche immobilisierte Mittel zur Erkennung des Emitters (14), wobei der verwendete Emitter einen Teil umfaßt, der auf eine Wechselwirkung mit dem Mittel zur Erken- nung des Emitters mit einer Veränderung der Emissionseigenschaften reagiert. Bevorzugterweise umfaßt auch diese erfindungsgemäße Vorrichtung zur direkten quantitativen in vitro- Bestimmung eines in einer Probe enthaltenen Antikörpers oder Antikörperfragments weiterhin Mittel zur Messung der Veränderung der Emissionseigenschaften des Emitters.

Weiter bevorzugt ist eine erfindungsgemäße Vorrichtung, wobei die Veränderung der Emissionseigenschaften des Teils des Emitters ausgewählt ist aus einer Veränderung der Polarisationsebene, der Fluoreszenzintensität, der Phosphoreszenzintensität, der Fluoreszenzlebensdauer und einer bathochromen Verschiebung des Absorptionsmaximums und/oder des Fluoreszenzmaximums. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese speziellen Phänomene beschränkt, der Begriff „Veränderung der Emissionseigenschaften" im Rahmen der vorliegenden Erfindung soll alle physikalischen Phänomene oder Effekte umfassen, bei dem die auf den Emitter treffende energiereiche Strahlung in ihrer Eigenschaft verändert wird und diese Veränderung dabei von der Bindung/nicht-Bindung des Substanz-Emitter-Konjugats mit seinem Emitter- Bindungspartner und der Substanz quantitativ abhängig ist. In einer Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die Substanz zum Beispiel ein Peptid, Protein, Oligo- nukleotid und insbesondere ein Antikörper oder ein Antikörperfragment. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Antikörperfragmenten um Fragmente, die zumindest die Antigen-bindenden Bereiche umfassen, die die sogenannten "complementarity- determining regions" ("CDRs") enthalten. Bevorzugterweise umfassen die Antigen-bindenden Bereiche dabei die vollständigen variablen Ketten VH und VL.

In einem besonders bevorzugten Aspekt der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Antikörper oder das Antikörperfragment ausgewählt aus polyklonalen oder monoklo- nalen Antikörpern, humanisierten Antikörpern, Fab-Fragmenten, insbesondere monomeren Fab-Fragmenten, scFv-Fragmenten, synthetischen und rekombinanten Antikörpern, scTCR- Ketten und Gemischen davon.

Der anti-Substanz-Antikörper oder das anti-Substanz-Antikörperfragment einer Vorrichtung der vorliegenden Erfindung weist optimalerweise eine höhere Antigenbindungsaffinität auf, als der anti-Emitter-Antikörper oder das anti-Emitter-Antikö erfragment zum Emitter. Diese Affinität ist erfindungsgemäß so gewählt, daß der anti-Substanz-Antikörper oder das antiSubstanz-Antikörperfragment eine mindestens zweifach höhere Antigenbindungsaffinität aufweist, als der anti-Emitter-Antikörper oder das anti-Emitter-Antikörperfragment zum Emitter. Weiter bevorzugt ist, daß der anti-Substanz-Antikörper oder das anti-Substanz- Antikörperfragment eine mindestens zehnfach höhere Antigenbindungsaffinität aufweist, als der anti-Emitter-Antikörper oder das anti-Emitter-Antikörperfragment zum Emitter. So ist eine Bindungsaffinität der Antikörper von kleiner als 50 nM bevorzugt und weiter bevorzugt kleiner als 10 nM. Mittels der Wahl der Affinitäten kann die Empfindlichkeit des Tests opti- mal gewählt werden. Dazu ist es günstig, daß die optimale Einstellung mittels herkömmlicher Testreihen direkt ermittelt werden kann, ohne das Erfordernis von aufwendigen Abtreimschritten. Gleiches gilt für die zweite Ausführungsform des Tests der Erfindung, bei der dann eine Einstellung mittels der Menge der Komponenten vorgenommen wird.

So kann in der erfindungsgemäßen Vorrichtung der auf der Oberfläche immobilisierte antiEmitter-Antikörper im molaren Überschuß gegenüber dem anti-Substanz-Antikörper oder gegenüber dem immobilisierten Antigen vorliegen, wobei das Verhältnis vorzugsweise von 1:2 bis 1:50 beträgt. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine erfindungsgemäße Vorrichtung, wobei der Emitter einen Farbstoff umfaßt, der mindestens ein Absorptionsmaximum und/oder Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 700 bis 1000 um, bevorzugt mindestens ein Absorptionsmaximum und Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 750 bis 900 nm aufweist. Die bathochrome Verschiebung des Farbstoffs ist so gewählt, daß die Verschiebung des Absorptions- und/oder Fluoreszenzmaximums zu höheren Wellenlängen nach Wechselwirkung mit dem Mittel zur Erkennung des Emitters um einen Wert von größer 15 nm, bevorzugt größer 25 nm, und am meisten bevorzugt um ungefähr 30 nm erfolgt. Dabei muß nicht unbedingt eine Verschiebung als solche betrachtet werden, die eine Eigenschaft des Farbstoffs ist. Üblicherweise würde die Verschiebung als Veränderung eines an den Farbstoff angepaßten Emissionswertes gemessen werden, also bei einer bestimmten singulären Wellenlänge. Dafür ist die erfindungsgemäße Vorrichtung bevorzugt z.B. mit geeigneten optischen Mitteln zur Messung versehen, die dem Fachmann bekannt sind. Dies gilt ebenfalls für die Messung der Veränderung der Polarisationsebene, der Fluoreszenzintensität, der Phosphoreszenzintensität, der Fluoreszenzlebensdauer und einer bathochromen Verschiebung des Absorptionsmaximums und/oder des Fluoreszenzmaximums.

Für die erfindungsgemäße Vorrichtung ist es bevorzugt, daß der verwendete Emitter einen Farbstoff umfaßt, der ausgewählt ist aus der Gruppe von Polymethinfarbstoffen, wie Dicarbo- cyanin-, Tricarbocyanin-, Indotricarbocyanin-, Merocyanin-, Styryl-, Squarilium- und Oxo- nolfarbstoffen und Rhodaminfarbstoffen, Phenoxazin- oder Phenothiazinfarbstoffen. Allgemein kann der Emitter des Substanz-Emitter-Konjugats der erfindungsgemäßen Vorrichtung einen Cyaninfarbstoff der allgemeinen Formel (I)

umfassen, in der D für einen Rest (II) oder (III)

steht, wobei die mit dem Stern markierte Position die Verknüpfungsstelle mit dem Rest B bedeutet und für die Gruppe (IV), (V), (VI), (VII) oder (VIII)

(VIII)

stehen kann, in denen R¹ und R² unabhängig voneinander eine Ci-C₄-Sulfoalkylkette, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradekettige d-Cso-Alkylkette darstellt, die gegebenenfalls mit von 0 bis 15 Sauerstoffatomen und/oder von 0 bis 3 Carbonylgruppen unterbrochen ist und/oder mit 0 bis 5 Hydroxygruppen substituiert sein kann, bedeutet, R³ und R⁴ unabhängig voneinander für die Gruppe -COOE¹, -CONE^!E² ₅ -NHCOE¹, -NHCONHE¹, - NE^², -OE¹, -OSOsE¹, -SO₃E¹, -SO₂NHE¹ oder -E¹ stehen, wobei E¹ und E² unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine CrC-i-Sulfoalkylkette, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradekettige Ci-Cso-Alkylkette darstellt, die gegebenenfalls von 0 bis 15 Sauer Stoffatomen und/oder von 0 bis 3 Carbonylgruppen unterbrochen ist und/oder mit 0 bis 5 Hydroxygruppen substituiert ist, R⁵ für ein Wasserstoffatom, eine Methyl-, Ethyl- oder Pro- pylgruppe oder ein Fluor- Chlor, Brom- oder Jodatom steht, b die Zahl 2 oder 3 bedeutet, und X und y unabhängig voneinander für O, S, =C(CH₃)₂ oder-(CH=CH)- stehen, sowie Salze und Solvate dieser Verbindungen. Überraschenderweise konnte gefunden werden, daß nach hochaffiner Bindung eines Antikörpers an einen Cyaninfarbstoff mit Absorption und Fluoreszenz im nahinfraroten Spektralbereich (> 750 nm) eine Verschiebung des Absorptionsmaximums und Fluoreszenzmaximums um ca. 30 nm zu höheren Wellenlängen erfolgte (bathochrome Verschiebung). Unter Ausnutzung dieses Prinzips ist es somit zum Beispiel möglich, über einen großen Konzentrationsbereich ein Signal aus einer Vollblutprobe direkt und spektral getrennt zu detektieren, wobei sich das Signal linear zur Konzentration der zu bestimmenden Substanz verhält.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden als Substanz-Emitter-Konjugate solche der allgemeinen Formel

S-E

verwendet, worin S für eine zu untersuchende Substanz und E für einen Emitter steht, der einen Teil umfaßt, der auf eine Wechselwirkung mit dem Mittel zur Erkennung des Emitters mit einer Veränderung der Emissionseigenschaften reagiert. Als struktureller Bestandteil der erfindungsgemäßen Konjugate eignen sich u.a. Farbstoffe, die mindestens ein Absorptionsmaximum und Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 600 bis 1200 nm besitzen. Bevorzugt sind dabei Farbstoffe mit mindestens ein Absorptionsmaximum und Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 700 bis 1000 nm besitzen. Farbstoffe, die diese Kriterien erfüllen, sind beispielsweise solche aus folgenden Klassen: Poly- methinfarbstoffe, wie Dicarbocyanin-, Tricarbocyanin-, Merocyanin- und Oxonolfarbstoffe, Rhodaminfarbstoffe, Phenoxazin- oder Phenothiazinfarbstoffe, Tetrapyrrolfarbstoffe, insbe- sondere Benzoporphyrine, Chlorine, Bacteriochlorine, Pheophorbide, Bacteriopheophorbide, Purpurine und Phthalocyanine.

Bevorzugte Farbstoffe sind die Cyaninfarbstoffe mit Absorptionsmaxima zwischen 750 und 900 nm, mit besonderem Vorteil Indotricarbocyanine. Struktureller Bestandteil der erfin- dungsgemäßen Konjugate sind auch die Substanzen, deren Konzentrationsbestimmung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgen soll.

Diese sind beispielsweise ausgewählt aus Antigenen, wie Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Oligonukleotiden, Blutkomponenten, Serumkomponenten, Lipiden, Pharmaka und Verbin- düngen niederen Molekulargewichts, insbesondere Zuckern, Farbstoffen oder anderen Verbindungen mit einem Molekulargewicht von unter 500 Dalton.

Analog dazu werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden als Substanz- erkennendes Mittel-Emitter-Konjugate solche der allgemeinen Formel

SEM-E

verwendet, worin SEM für ein zu untersuchendes Substanz-erkennendes Mittel und E für ei- nen Emitter steht, der einen Teil umfaßt, der auf eine Wechselwirkung mit dem Mittel zur Erkennung des Emitters mit einer Veränderung der Emissionseigenschaften reagiert. Als struktureller Bestandteil der erfindungsgemäßen Konjugate eignen sich u.a. Farbstoffe, die mindestens ein Absorptionsmaximum und Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 600 bis 1200 nm besitzen. Bevorzugt sind dabei Farbstoffe mit mindestens ein Ab- sorptionsmaximum und Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 700 bis 1000 nm besitzen. Farbstoffe, die diese Kriterien erfüllen, sind beispielsweise solche aus folgenden Klassen: Polymethinfarbstoffe, wie Dicarbocyanin-, Tricarbocyanin-, Merocyanin- und Oxonolfarbstoffe, Rhodaminfarbstoffe, Phenoxazin- oder Phenothiazinfarbstoffe, Tetra- pyrrolfarbstoffe, insbesondere Benzoporphyrine, Chlorine, Bacteriochlorine, Pheophorbide, Bacteriopheophorbide, Purpurine und Phthalocyanine.

Bevorzugte Farbstoffe sind die Cyaninfarbstoffe mit Absorptionsmaxima zwischen 750 und 900 nm, mit besonderem Vorteil Indotricarbocyanine. Struktureller Bestandteil der erfindungsgemäßen Konjugate sind auch die Substanz-erkennenden Mittel, deren Konzentrations- bestimmung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgen soll.

Diese sind beispielsweise ausgewählt aus Peptiden, Proteinen, Oligonukleotiden und insbesondere Antikörpern oder Antikörperfragmenten.

Die Farbstoffe enthalten Strukturelemente, über welche die kovalente Kopplung an die Sub- stanzstrukuren oder die Substanz-erkennenden Strukturen erfolgt. Dieses sind z. B. Linker mit Carboxygruppen, Aminogruppen, Hydroxygruppen. Im Falle einer Antigen-Antikörper- Bindung weist das Konjugat aus der zu untersuchenden Substanz und dem Emitter eine Bindungsaffinität einerseits zu dem Antikörper gegen die zu untersuchende Substanz und ande- rerseits zu dem Antikörper gegen den Emitter-Teil (z.B. Fluorophor) auf. Nach Bindung des Anti-Fluorophor-Antikörpers an das Fluorophor erfolgt eine Verschiebung des Absorptionsund/oder Fluoreszenzmaximums. Bevorzugt erfolgt in diesem Fall eine Verschiebung des Absorptions- und Fluoreszenzmaximums zu höheren Wellenlängen um einen Wert größer 15 nm. Besonders bevorzugt ist dieser Wert größer 25 nm.

In einem weiteren Aspekt der erfindungsgemäßen Vorrichtung liegen die Mittel und/oder das Antigen (Substanz) direkt oder indirekt auf einer Oberfläche statistisch zufällig oder gerichtet immobilisiert vor. Unter „indirekter" Immobilisierung wird hier die Kopplung der Mittel über einen geeigneten „Linker" verstanden. Solche Linker sind z.B. in der Technik der biologischen „Chips" breit verwendet und sind dem Fachmann gut bekannt. Die generelle Funktion des Linkers ist die Fixierung und optionale genaue Positionierung der Mittel auf der Oberfläche. Die Fixierung kann dabei kovalent oder nicht kovalent erfolgen. Üblicherweise ist der Linker an der Bindung zwischen der nachzuweisenden Substanz und dem immobilisierten Mittel nicht beteiligt. Beispiele für Linker reichen von z.B. PNA-Oligomeren, Silan-haltigen Gruppen und Succinimid-Gruppen bis zu Gruppen, die Peptidbindungen ausbilden. Die „direkte" Immobilisierung auf der Oberfläche erfolgt ohne weitere Zwischengruppen, zum Beispiel durch eine aktivierte endständige Gruppe des Mittels. Solche chemischen aktivierten Gruppen sind dem Fachmann ebenfalls gut bekannt. Mittels der vorstehend genannten immo- bilisierenden Gruppen kann die Verteilung der Mittel auf der Oberfläche statistisch zufällig oder gerichtet erfolgen. Die gerichtete Immobilisierung erlaubt zum Beispiel die Aufbringung von verschiedenen Nachweismitteln auf eine Oberfläche und somit z.B. die Herstellung einer Oberfläche, die für mehrere Tests gleichzeitig geeignet sein kann.

Erfindungsgemäß umfaßt die Vorrichtung eine Membran, Kugel (Perle oder „Bead") oder feste ebene Oberfläche, wobei diese Träger aus Nylon, Cellulose und deren Derivaten, Harzmatrizes, Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold bestehen können. Dies sind herkömmliche Materialien für solche Oberflächen, die leicht herzustellen sind.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Verfahren zur direkten quantitativen in vt^'tro-Bestimmung einer in einer Probe enthaltenen Substanz (3), umfassend die Schritte von, a) zur Verfügung stellen einer Vorrichtung (1), umfassend, i) auf einer Oberfläche (6) immobilisierte Mittel zur Substanz-Erkennung (5), ii) freies Substanz-Emitter- Konjugat (2), und iii) auf einer Oberfläche immobilisierte Mittel zur Erkennung des Emitters (4), wobei der verwendete Emitter einen Teil umfaßt, der auf eine Wechselwirkung mit dem Mittel zur Erkennung des Emitters mit einer Veränderung der Emissionseigenschaften reagiert, b) in Kontakt bringen der Vorrichtung mit einer Probe, die eine zu quantifizierende Substanz enthält, und c) Messen der Veränderung der Emissionseigenschaften des Emitters.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Verfahren zur direkten quantitativen in v trσ-Bestimmung eines in der Probe vorhandenen Substanz-erkennenden Mittels, umfassend die Schritte von, a) zur Verfügung stellen einer Vorrichtung (10), umfas- send, i) auf einer Oberfläche (16) immobilisierte Substanz (15), ii) freies Substanzerkennendes Mittel-Emitter-Konjugat (12), und iii) auf einer Oberfläche immobilisierte Mittel zur Erkennung des Emitters (14), wobei der verwendete Emitter einen Teil umfaßt, der auf eine Wechselwirkung mit dem Mittel zur Erkennung des Emitters mit einer Veränderung der Emissionseigenschaften reagiert, b) in Kontakt bringen der Vorrichtung mit einer Probe, die eine zu quantifizierende Substanz oder ein Substanz-erkennendes Mittel enthält, und c) Messen der Veränderung der Emissionseigenschaften des Emitters. Bevorzugterweise umfaßt auch hier die Vorrichtung weiterhin Mittel zur Messung der Veränderung der Emissionseigenschaften des Emitters.

Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren zur quantitativen in vztro-Bestimmung einer in einer Probe enthaltenen Substanz, das weiterhin ein d) Quantifizieren der in der Probe enthaltenen Substanz oder des Substanz-erkennenden Mittels mittels der gemessenen Veränderung der Emissionseigenschaften des Emitters umfaßt.

Das erfindungsgemäße Meßverfahren beruht in einer bevorzugten Ausführungsform (siehe Figur 1) auf der Verwendung eines Konjugats (2) bestehend aus der zu bestimmenden Substanz und einem Emitter (insbesondere Fluorophor) in Kombination mit zwei Antikörpern (4, 5), wobei der eine Antikörper die zu bestimmende Substanz als Antigen bindet (AntiSubstanz-Antikörper, 5) und der andere Antikörper den Emitter als Antigen bindet (Anti- Emitter-Antikörper, 4). Das erfindungsgemäße Konjugat (2) aus der zu bestimmenden Substanz und dem Emitter konkurriert mit der zu bestimmenden freien Substanz (3) in der Probe um die Bindungsstellen des Substanz-bindenden Antikörpers (5). Je höher der Gehalt der zu bestimmenden Substanz (3) in der Untersuchungsprobe ist, desto stärker wird das Konjugat (2) aus der Antigenbindungsstelle des Anti-Substanz-Antikörpers verdrängt und bindet in steigender Konzentration am Anti-Emitter-Antikörper (4) (siehe Figur 1). Der Anti-Emitter- Antikörper (5) zeichnet sich dadurch aus, daß sich durch die Bindung des Emitters in die An- tigenbindungstasche des Antikörpers die spektralen Eigenschaften des Emitters charakteristisch verändern. Hierdurch wird es möglich, den Anteil des Substanz-Emitter-Konjugates (2), der am Anti-Emitter- Antikörper (4) gebunden ist, unter Ausnutzung der spektralen Differenz vom Anteil, der am Anti-Substanz-Antikörper (5) gebunden ist, getrennt zu bestimmen.

Das Substanz-Emitter-Konjugat (2) kompetitiert mit der zu untersuchenden Substanz (3) um die Bindungsstellen an dem Antikörper, der gegen die zu untersuchende Substanz gerichtet ist (5). Steigende Konzentrationen der zu untersuchenden Substanz (3) in der Untersuchungsprobe verschieben die Bindung des Konjugates in Richtung des Antikörpers (4), der gegen den Emitter gerichtet ist.

Das erfindungsgemäße Meßverfahren beruht in einer anderen bevorzugten Ausführungsform (siehe Figur 2) auf der Verwendung eines Konjugats (12) bestehend aus einem bestimmten Substanz-erkennenden Mittel, z.B. einem Antikörper, und einem Emitter (insbesondere Fluorophor) in Kombination mit einem Antikörper und Antigen (13, 14), wobei das Antigen die bestimmte Substanz, z.B. Antikörper, bindet (Anti-Substanz- Antikörper, 13) und der Antikörper den Emitter als Antigen bindet (Anti-Emitter-Antikörper, 14). Das Konjugat aus dem Substanz-erkennenden Mittel und dem Emitter konkurriert mit dem zu bestimmenden freien Antikörper (13) in der Probe um die immobilisierte Substanz (15). Je höher der Gehalt des zu bestimmenden Substanz-erkennenden Mittels, z.B. Antikörpers (13) in der Untersuchungsprobe ist, desto stärker wird das Konjugat aus der Antigenbindungsstelle des Anti-Substanz- Antikörpers (13) verdrängt und bindet in steigender Konzentration am Anti-Emitters- Antikörper (14) (Figur 2). Der Anti-Emitter- Antikörper (14) zeichnet sich dadurch aus, daß sich durch die Bindung des Emitters in die Antigenbindungstasche des Antikörpers die spektralen Eigenschaften des Emitters charakteristisch verändern. Hierdurch wird es möglich, den Anteil des Substanz-erkennenden Mittel (z.B. Antikörper)-Emitters-Konjugates (12), der am Anti-Emitter- Antikörper (14) gebunden ist, unter Ausnutzung der spektralen Differenz vom Anteil, der an der Substanz (15) gebunden ist, getrennt zu bestimmen.

Das Substanz-erkennende-Mittel-Emitter-Konjugat (12) kompetitiert mit dem zu untersuchenden Substanz-erkennenden-Mittel (13) um die Bindungsstellen an der Substanz (5). Steigende Konzentrationen des zu untersuchenden Substanz-erkennenden-Mittels (13) in der Un- tersuchungsprobe verschieben die Bindung des Konjugates in Richtung des Antikörpers (14), der gegen den Emitter gerichtet ist.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Verfahren, wobei die zu bestimmende Substanz ausge- wählt ist aus Antigenen, wie Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Oligonukleotiden, Blutkomponenten, Serumkomponenten, Lipiden, Pharmaka und Verbindungen niederen Molekulargewichts, insbesondere Zuckern, Farbstoffen oder anderen Verbindungen mit einem Molekulargewicht von unter 500 Dalton. Die Substanz-erkennenden Mittel sind beispielsweise ausgewählt aus Peptiden, Proteinen, Oligonukleotiden und insbesondere Antikörpern oder Anti- körperfragmenten.

Weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die Veränderung der Emissionseigenschaften des Teils des Emitters ausgewählt ist aus einer Veränderung der Polarisationsebene, der Fluoreszenzintensität, der Phosphoreszenzintensität, der Fluoreszenzlebensdau- er und einer bathochromen Verschiebung des Absorptionsmaximums und/oder des Fluoreszenzmaximums. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese speziellen Phänomene beschränkt, der Begriff „Veränderung der Emissionseigenschaften" im Rahmen der vorliegenden Erfindung soll alle physikalischen Phänomene oder Effekte umfassen, bei dem die auf den Emitter treffende energiereiche Strahlung in ihrer Eigenschaft verändert wird und diese Veränderung dabei von der Bindung/nicht-Bindung des Substanz-Emitter-Konjugats oder Substanzerkennendes Mittel-Emitter-Konjugat mit seinem Emitter-Bindungspartner und der Substanz quantitativ abhängig ist. In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die Substanz zum Beispiel ein Peptid, Protein, Oligonukleotid und insbesondere ein Antikörper oder ein Antikörperfragment.

Im Falle einer optischen Messung kann diese in unterschiedlicher Weise erfolgen und richtet sich hauptsächlich nach der Art der charakteristischen Veränderung der spektralen Eigenschaften des Emitters (z.B. Fluorophors). Generell bevorzugt ist eine Erfassung der Verschiebung der Absorptionswellenlänge und Emissionswellenlänge oder die Messung der Absorpti- on und / oder Fluoreszenzintensität bei einer Wellenlänge, die zum größten Teil den am Antikörper gebundenen Anteil des Emitters erfaßt. Je nach Veränderung der spektralen Eigenschaften des antikörpergebundenen Emitters können auch andere Eigenschaften, wie z. B. die Photonenlebensdauer, die Polarisation und das Ausbleichverhalten zur optischen Messung verwendet werden. Der besondere Vorteil von Fluorophoren im spektralen Bereich des nahinfraroten Lichtes liegt in der geringen Überdeckung durch Bestandteile des Blutes. Hierdurch wird eine Tiefen- eindringung ermöglicht, ohne daß das zu detektierende Signal unverhältnismäßig stark verän- dert wird.

Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren wobei als die Substanz-erkennenden Mittel Peptide, Proteine und insbesondere Antikörper oder Antikörperfragmente mit der Probe in Kontakt gebracht werden. In einem besonders bevorzugten Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Antikörper oder das Antikörperfragment ausgewählt aus po- lyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, humanisierten Antikörpern, Fab-Fragmenten, insbesondere monomeren Fab-Fragmenten, scFv-Fragmenten, synthetischen und rekombinan- ten Antikörpern, scTCR-Ketten und Gemischen davon.

Die eingesetzten Antikörper können bivalente Gesamt-lmmunglobuline sein, bevorzugt werden jedoch monomere Fab-Fragmente im Testsystem eingesetzt. Nach Blockierung freier Bindungsstellen an der Festphase wird das System bei konstanter Substanz- Fluorophorkonzentration bei sättigender Konzentration und steigender Substanzkonzentration geeicht. Die zu bestimmende Probe wird entweder verdünnt, vorzugsweise aber unverdünnt zur Messung eingesetzt.

Antikörper, die gegen zu untersuchende Substanzen gerichtet sind (Anti-Substanz- Antikörper), sind bereits bekannt. Erfindungsgemäß bevorzugt sind Anti-Substanzantikörper mit einer hohen Affinität zur Substanz. Simeonov A. et al. beschreiben in Science 2000, 290, 307-313 Antikörper gegen Stilbene („Blue-fluorescent antibodies"). Die Antikörper katalysieren spezifisch photochemische Isomerierungsvorgänge und fuhren zu rotverschobenen Ab- sorptions- und Fluoreszenzmaxima im UV-VIS Spektralbereich (Absorptionsverschiebung maximal 12 nm, Fluoreszenzverschiebung 22 nm). Simeonov A. et al. geben keinerlei Hinweis auf eine Rotverschiebung unter Erhalt der Fluoreszenzquantenausbeute bei Cyaninfarb- Stoffen im Wellenlängenbereich von 600-1200 nm.

Watt R. M. et al. (Immunochemistry 1977, 14, 533-541) beschreiben die spektralen Eigenschaften des bereits bekannten anti-Fluorescein-Antikörperkonstrukts. Der Antikörper bewirkt nach Bindung des Fluoresceins eine Verschiebung des Absorptions- und Fluoreszenzmaxi- murns im sichtbaren Spektralbereich, jedoch nur um 12 nm bzw. 5 nm. Zusätzlich erfolgt eine starke Verringerung der Fluoreszenzquantenausbeute (um ca. 90%). Die Rotverschiebungen der erfindungsgemäß verwendeten Antikörper-Farbstoff-Konstrukte betragen > 15 nm im NIR Spektralbereich unter Erhalt der Fluoreszenzquantenausbeute.

Rozinov M. N. et al. (Chem. Biol 1998, 5, 713-728) beschreiben zuletzt die Selektion 12- merer Peptide aus Phagenbibliotheken, die die Farbstoffe Texas Red, Rhodamine Red, Oregon Green 514 und Fluorescein binden. Für Texas Red wurde eine Rotverschiebung der Absorption und Fluoreszenz beobachtet, jedoch nur um 2.8 nm bzw. 1.4 nm. Rozinov et al. schlagen jedoch nicht vor, daß Antikörper gegen Cyaninfarbstoffe zu größeren Verschiebungen bei Erhalt der Fluoreszenzquantenausbeute führen und daher für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind.

Dem Fachmann sind darüber hinaus auch bereits Antikörper gegen Fluorophore bekannt, die in der Lage sind, nach Bindung des Fluorophors dessen spektrale Eigenschaften im UV- Bereich zu verändern. Durch Bindung eines Fluorophors in die Antigenbindungstasche eines Antikörpers können vor allem die Fluoreszenzintensität, das Absorptionsmaximum, das Emissionsmaximum, und die Photonenlebensdauer verändert werden [Simeonov A., et al., Science (2000) 307-313]. Diese bekannten Antikörper sind jedoch gegen Emitter (Fluoropho- re) gerichtet, die ihre Absorption und Fluoreszenzemission im sichtbaren und UV-Bereich des Lichts haben.

Der anti-Substanz-Antikörper oder das anti-Substanz-Antikörperfragment im Verfahren der vorliegenden Erfindung weist optimalerweise eine höhere Antigenbindungsaffinität auf, als der anti-Emitter-Antikörper oder das anti-Emitter-Antiköφerfragment zum Emitter. Diese Affinität ist erfindungsgemäß so gewählt, daß der anti-Substanz-Antikörper oder das anti- Substanz-Antikörperfragment eine mindestens zweifach höhere Antigenbindungsaffinität aufweist, als der anti-Emitter-Antikörper oder das anti-Emitter-Antikörperfragment zum Emitter. Weiter bevorzugt ist, daß der anti-Substanz-Antikörper oder das anti-Substanz- Antikörperfragment eine mindestens zehnfach höhere Antigenbindungsaffinität aufweist, als der anti-Emitter-Antikörper oder das anti-Emitter-Antiköφerfragment zum Emitter. So ist eine Bindungsaffinität der Antiköφer von kleiner als 50 nM bevorzugt und weiter bevorzugt kleiner als 10 nM. Mittels der Wahl der Affinitäten kann die Empfindlichkeit des Tests optimal gewählt werden. Dazu ist es günstig, daß die optimale Einstellung mittels herkömmlicher Testreihen direkt ermittelt werden kann, ohne das Erfordernis von aufwendigen Abtrenn- schritten. Gleiches gilt für die zweite Ausführungsform des Tests der Erfindung, bei der dann eine Einstellung mittels der Menge der Komponenten vorgenommen wird.

Das erfindungsgemäße Meßverfahren verwendet somit bevorzugt Anti-Substanz-Antiköφer, die eine höhere Antigenbindungsaffinität haben, als der Anti-Fluorophor-Antiköφer. Bevorzugt sind Anti-Substanz-Antiköφer mit einer mindestens zweifach höheren Bindungsaffinität gegenüber dem Anti-Fluorophor-Antiköφer. Besonders bevorzugt sind Anti-Substanz- Antiköφer mit einer mehr als zehnfach höheren Bindungsaffinität. Die Anti-Fluorophor- Antiköφer richten sich bevorzugt gegen Fluorophore, die im spektralen Bereich des nahinfra- roten Lichtes absorbieren und emittieren und deren spektralen Eigenschaften durch die Bindung an den Antiköφer in der Weise verändert wird, das sich das Emissionssignal des Anti- köφer-gebundenen Anteils des Fluorophors von dem freien Anteil des Fluorophors spektral getrennt erfassen läßt.

So kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren der auf der Oberfläche immobilisierte anti- Emitter-Antiköφer im molaren Überschuß gegenüber dem anti-Substanz-Antiköφer oder gegenüber dem immobilisierten Antigen vorliegt, wobei das Verhältnis vorzugsweise von 1 :2 bis 1:50 beträgt.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung für die in vitro Diagnostik. Ein noch weiterer Aspekt betrifft die Verwendung eines Substanz-Emitter-Konjugats oder Emitter-erkennenden Mittels, insbesondere eines Substanz-Fluorophor-Konjugats oder Anti-Fluorophor-Antiköφers für die in vitro Diagnostik.

Zu diesem Zweck kann die erfindungsgemäße Vorrichtung auch in einem diagnostischen Kit vorliegen, in dem die Komponenten der Vorrichtung, gegebenenfalls zusammen mit anderen Hilfsstoffen, gemeinsam oder in getrennten Behältern zur Verfügung gestellt werden. Eine weitere Möglichkeit besteht in einem ersten Kit, daß die Grundelemente der Vorrichtung der Erfindung zur Verfugung stellt (z.B. geeignete Oberfläche und daran gekoppelte Antiköφer und/oder Substanz), was dann zusammen mit den Inhaltsstoffen eines zweiten Kits (enthaltend Substanz zur Eichung und/oder weitere Antiköφer) für die jeweilige Anwendung „spezialisiert" wird. Ein solcher zweiter Kit könnte zum Beispiel ein bestimmtes Substanz- Emitter-Konjugat enthalten. Alle diese Kits können weiterhin spezielle Instruktionen und Unterlagen (z.B. Eichkurven, Anweisung zur Quantifizierung, usw) enthalten.

Die Erfindung soll nun im folgenden anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die beige- fugten Figuren näher beschrieben werden, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Es zeigt:

Figur 1 eine erste Ausführungsform der Vorrichtung der Erfindung, Figur 2 eine zweite Ausführungsform der Vorrichtung der Erfindung, und Figur 3 das Absoφtionspektrum (links) und Fluoreszenzspektrum vom Farbstoff ohne und in Gegenwart von Antiköφer MOR02965 in PBS aus Beispiel 2.

Beispiele:

Beispiel 1: Selektionierung, Herstellung und Charakterisierung von Emitter-bindenden Antikörpern: Selektion von HuCAL GOLD Antikörper-Fragmenten gegen den Cyanin- Farbstoff Fuji 6-4 (ZK203468) [Trinatrium-3,3-dimethyl-2-{4-methyl-7-[3,3-dimethyl-5- sulfonato-l-(2-sulfonatoethyl)-3H-indohum-2-yl]hepta-2,4,6-trien-l-yliden}-l-(2- sulfonatoethyl)-2,3-dihydro-lH-indol-5-sulfonat, inneres Sak]

HuCAL GOLD Antikβrperbibliothek:

Antiköφerbibliothek HuCAL GOLD. HuCAL GOLD ist eine vollsynthetische, modulare humane Antiköφerbibliothek im Fab Antiköφerfragmentformat. HuCAL GOLD basiert auf den HuCAL-Konsensus-Antiköφergenen, die für die Bibliothek HuCAL-scFvl beschrieben wurden (WO 97/08320; Knappik,(2000), J. Mol. Biol 296, 57-86; Krebs et al. J Immunol Me- thods. 2001 Aug l;254(l-2):67-84). In HuCAL GOLD sind alle sechs CDR-Bereiche durch den Einsatz der sogenannten Trinukleotidmutagenese (Virnekäs et al. (1994) Nucleic Acids Res. 1994 Dec 25;22(25):5600-7) entsprechend der Zusammensetzung dieser Bereiche in menschlichen Antiköφern diversifiziert, während in früheren HuCAL-Bibliotheken (HuCAL- scFvl und HuCAL-Fabl lediglich die CDR3-Bereiche in VH und VL entsprechend der natür- liehen Zusammensetzung (s. Knappik et al., 2000) diversifiziert worden waren. Darüber hinaus findet in HuCAL GOLD auch ein abgewandeltes Screening- Verfahren Verwendung, das sogenannte CysDisplay (WO 01/05950). Vλ Positionen 1 and 2. Die ursprünglichen HuCAL Mastergene wurden mit ihren authentischen N-Termini konstruiert: VLλl: QS (CAGAGC), VLλ2: QS (CAGAGC), und VLλ3: SY (AGCTAT). Diese Sequenzen finden sich in WO 97/08320. Bei der Herstellung der HuCAL- scFvl -Bibliothek wurden diese beiden Aminosäurereste in "DI" geändert, um das Klonieren zu erleichtern (EcoRI site). Diese Reste wurden bei der Herstellung von HuCAL-Fabl und HuCAL GOLD beibehalten. Daher enthalten alle HuCAL-Bibliotheken VLλ-Gene mit derE- coR -Schnittstelle GATATC (DI) am 5 '-Ende. Alle HuCAL kappa Gene (Mastergene und alle Gene in den Bibliotheken) enthalten ohnehin DI am 5 '-Ende, da dies die authentischen N- Termini darstellen (WO 97/08320).

VH Position 1. Die ursprünglichen HuCAL-Mastergene wurden mit ihren authentischen N- termini hergestellt: VH1A, VH1B, VH2, VH4, und VH6 mit Q (=CAG) als erstem Aminosäurerest und VH3 sowie VH5 mit E (=GAA). Die entsprechenden Sequenzen finden sich in WO 97/08320. Bei der Klonierung der HuCAL-Fabl sowie der HuCAL GOLD Bibliothek wurde an dieser Position 1 die Aminosäure Q (CAG) in allen VH-Genen eingebaut.

Phagemid-Produktion

Durch Infektion von E. coli TOP 10F '-Zellen aus der HuCAL GOLD Antiköφer-Bibliothek bzw. aus den Maturierungsbibliotheken mittels Helfeφhagen wurden große Mengen an Pha- gemiden produziert und angereichert. Dazu wurden die HuCAL GOLD bzw. die Maturierungsbibliotheken (in den TOP 10F '-Zellen) in 2xYT-Medium mit 34 μg/ml Chlorampheni- col/ 10 μg/ml Tetrazyklin/ 1% Glucose bei 37°C bis zu einer OD₆oo von 0.5 kultiviert. Anschließend erfolgte die Infektion mit VCSM13 Helfeφhagen bei 37°C. Die infizierten Zellen wurden pelletiert und in 2xYT/ 34 μg/ml Chloramphenicol/ 10 μg/ml Tetrazyklin/ 50 μg/ml Kanamycin/ 0.25 mM IPTG resuspendiert und bei 22°C über Nacht kultiviert. Aus dem Überstand wurden die Phagen 2x mit PEG ausgefällt und durch Zentrifugation geerntet (Ausubel (1998) Current protocols in molecular biology. John Wiley Sons, Inc., New York, USA). Die Phagen wurden in PBS/ 20% Glyzerin resuspendiert und bei -80°C gelagert.

Die Phagemid-Amplifikation zwischen den einzelnen Selektionsrunden erfolgte folgendermaßen: log-Phase E. coli TG 1 -Zellen wurden mit den selektionierten Phagen infiziert und auf LB-Agar-Platten mit 1% Glucose/ 34 μg/ml Chloramphenicol ausplattiert. Nach Inkubation über Nacht wurden die Bakterienkolonien abgekratzt, neu kultiviert und mit VCSM13 Helfeφhagen infiziert. Primäre Selektion von Antikörpern gegen den Farbstoff Fuji 6-4 (ZK203468)

Die gereinigten und aufkonzentrierten Phagemide der HuCAL GOLD Antiköφer-Bibliothek wurden in ein Standard-Selektionsverfahren eingesetzt. Als Antigene wurden BSA- bzw. Transferrin-gekoppeltes ZK203468 alternierend verwendet. Die Antigene wurden in PBS aufgenommen und in Konzentrationen von 50 μg/ml auf Maxisoφ™ Mikrotiteφlatten F96 (Nunc) aufgebracht. Die Maxisoφ-Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert ("coating"). Nach Abblocken der Maxisoφ-Platten mit 5% Milchpulver in PBS wurden ca. 2E+13 HuCAL GOLD-Phagen in die Antigen-beladenen, abgeblockten Tüpfeln gegeben und dort über Nacht bzw. zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach mehreren Waschschritten, die mit fortschreitenden Selektionsrunden stringenter wurden, wurden gebundene Phagen mit 20 mM DTT bzw. 100 μM unkonjugiertem ZK203468 eluiert. Insgesamt wurden drei aufeinanderfolgende Selektionsrunden durchgeführt, wobei die Phagenamplifikation zwischen den Selektionsrunden erfolgte, wie oben beschrieben.

Sub-Klonierung selektionierter Fab-Fragmente zur Expression

Nach der drei Runden umfassenden Antiköφer-Selektion wurden die Fab-codierenden Inserts der isolierten HuCAL-Klone in den Expressionsvektor pMORPHX9_MS sub-kloniert, um die anschließende Expression der Fab-Fragmente zu erleichtern. Dazu wurde die gereinigte Plas- mid-DNA der selektionierten HuCAL Fab-Klone mit den Restriktionsenzymen Xbal und EcoRI verdaut. Die Fab-codierenden Inserts wurde aufgereinigt und in den entsprechend verdauten Vektor pMORPHX9_MS ligiert. Dieser Klonierungsschritt führt zu dem Fab- exprimierenden Vektor pMORPHX9_Fab_MS. Fab-Fragmente, die von diesem Vektor ex- primiert werden, tragen zwei C-terminale Tags (Myc-Tag und Strep-Tag II) zur Aufreinigung und Detektion.

Sereening mmά Charakterisierung von E-20346δ-bindenden Fab-Fragmenten Mehrere tausend Klone wurden nach der Selektion und Sub-Klonierung vereinzelt und mittels ELISA im 384-well-Format auf spezifische Erkennung der im Panning verwendeten Antigene ZK203468-BSA und -Transferrin getestet. Hierbei identifizierte Klone wurden in einem In- hibitions-ELISA auf effiziente Bindung des unkonjugierten Farbstoffs untersucht. Dies führte zu den parenteralen Fab-Fragmenten MOR02628 (Proteinsequenzen SEQ-ID NO: 1 (VH-CH) und SEQ-ID NO: 2 (VL-CL); DNA-Sequenzen SEQ-ID NO: 3 (VH-CH) und SEQ-ID NO: 4 (VL-CL)), MOR02965 (Proteinsequenzen SEQ-ID NO: 5 (VH-CH) und SEQ-ID NO: 6 (VL- CL); DNA-Sequenzen SEQ-ID NO: 7 (VH-CH) und SEQ-ID NO: 8 (VL-CL)) und MOR02977 (Proteinsequenzen SEQ-ID NO: 9 (VH-CH) und SEQ-ID NO: 10 (VL-CL); DNA-Sequenzen SEQ-ID NO: 11 (VH-CH) und SEQ-ID NO: 12 (VL-CL)), die den nicht- konjugierten Farbstoff ZK203468 effizient binden.

Beispiel 2: Photophysikalische Charakterisierung der Farbstoff- Antikörper-Komplexe und Bestimmung der spektralen Verschiebungen / Fluoreszenzquantenausbeuten Es wurden Farbstoff-Antiköφer-Komplexe basierend auf Antiköφern mit Bindung an den Indotricarbocyaninfarbstoff Trinatrium-3,3-dimethyl-2-{4-methyl-7-[3,3-dimethyl-5- sulfonato- 1 -(2-sulfonatoethyl)-3H-indolium-2-yl]hepta-2,4,6-trien- 1 -yliden} - 1 -(2- sulfonatoethyl)-2,3-dihydro-lH-indol-5-sulfonat, inneres Salz untersucht (siehe Beispiel 1). Es wurden Lösungen der Konzentration von 1 μmol/1 des o. g. Farbstoffes und 2,4 μmol/1 des jeweiligen Antiköφers in PBS hergestellt und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Absoφ- tionsmaxima wurden mit einem Spektralphotometer (Perkin-Elmer, Lambda2) bestimmt. Die Fluoreszenzmaxima und Fluoreszenzquantenausbeuten wurden mit einem SPEX Fluorolog (wellenlängenabhängige Empfindlichkeit von Lampe und Detektor kalibriert) relativ zu Indo- cyaningrün bestimmt (Q = 0,13 in DMSO, J Chem Eng Data 1977, 22, 379, Bioconjugate Chem 2001, 12, 44). Aus den Absoφtions- und Fluoreszenzmaxima wurden die spektralen Verschiebungen relativ zu den Maxima einer Lösung des o. g. Farbstoffes ohne Antiköφer in PBS (1 μmol/1) berechnet (Absoφtionsmax. 754 nm, Fluoreszenzmax. 783 nm, Fluoreszenzquantausbeute 10 %).

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt: Tabelle 1

Beispiel 3: Synthese des Konjugats aus Substanz-erkennendem Mittel und Emitter: anti- ED-B-Fibronektin-Antikörper / Indotricarbocyaninkonjugat

Antiköφer gegen die hochreine rekombinante ED-B -Domäne des fötalen Fibronektin werden vorzugsweise als scFv, Fab, (Fab)₂ oder als Gesamt-IgG verwendet. Im vorliegenden Beispiel wird ein Fab mit C-terminalen Cystein-tag verwendet und mit einem Linker-modifierten Derivat des Indotricarbocyaninfarbstoffs Trinatrium-3,3-dimethyl-2-{4-methyl-7-[3,3-dimethyl- 5-sulfonato- 1 -(2-sulfonatoethyl)-3H-indolium-2-yl]hepta-2,4,6-trien- 1 -yliden}- 1 -(2- sulfonatoethyl)-2,3-dihydro-lH-indol-5-sulfonat, inneres Salz kovalent konjugiert. Folgende Arbeitsschritte werden durchgeführt:

Synthese von Trinatrium 3,3-dimethyl-2-{7-[3,3-dimethyl-5-sulfonato-l-(2- sulfonatoethyl)-3H-indolium-2-yl]-4-(5-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)ethyl]carbamoyl}-3-oxa-pentyl)hepta-2,4,6-trien-l-yliden}-l-(2-sulfonatoethyl)-2,3- dihydro-lH-indoI-5-suIfonat, inneres Salz zur Konjugation an Fab

a) 3-Oxa-6-(4-Pyridinyl)hexansäure-tert-butylester Eine Lösung von 75 g (0,4 Mol) 3-(4-Pyridnyl)-l-propanol in 400 ml Toluol / 50 ml THF wird mit 10 g Tetrabutylammoniumsulfat und 350 ml 32-proz. Natronlauge versetzt. Anschließend wird 123 g (0,68 Mol) Bromessigsäure-ter/-butylester zugetropft und 18 h bei Raumtemp. gerührt. Die organische Phase wird abgetrennt, die wäßrige Phase dreimal mit Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit NaCl-Lösung gewa- sehen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Nach chromatographischer Reinigung (Kieselgel; Laufmittel Hexan:Ethylacetat) erhält man 56 g Produkt (41 % d. Th.) als bräunliches Öl. b) 3 - [4-Oxa-5-(tert-Butyloxycarbonyl)pentyl] glutaconaldehyd-dianilid-hydrobromid

Eine Lösung von 5,0 g (20 mMol) 3-Oxa-6-(4-Pyridinyl)hexansäure-tert-butylester in 60 ml Diethylether wird mit 3,7 g (40 mMol) Amiin und anschließend bei 0 °C mit einer Lösung von 2,2 g (20 mMol) Bromcyan in 8 ml Diethylether versetzt. Nach 1 h Rühren bei 0 °C wird mit 50 ml Diethylether versetzt und der entstandene rote Feststoff abfiltriert, mit Ether gewaschen und vakuumgetrocknet. Ausbeute: 8,5 g (85 % d. Th.) eines violetten Feststoffes.

c) Trinattiιm 3,3-dimethyl-2-{7-[3,3-dimethyl-5-sulfonato-l-(2-sulfonatoethyl)-3H- indolium-2-yl]-4-(6-carboxy-4-oxahexyl)hepta-2,4,6-trien- 1 -yliden} - 1 -(2- sulfonatoethyl)-2,3-dihydro-lH-indol-5-sulfonat, inneres Salz Eine Suspension von 3,0 g (6 mMol) 3-[2-(tert-Butyloxycarbonyl)ethyl]glutaconaldehyd- dianilid-hydrobromid (Beispiel 10b) und 4,2 g (12 mMol) l-(2-Sulfonatoethyl)-2,3,3- trimethyl-3H-indolenin-5-sulfonsäure (Beispiel la) in 50 ml Essigsäureanhydrid und 10 ml Essigsäure wird mit 2,5 g (30 mMol) Natriumacetat versetzt und 50 min bei 120 °C gerührt. Nach Abkühlen wird mit Diethylether versetzt, der ausgefallene Feststoff abfiltriert, in Ace- ton ausgerührt und im getrocknet. Nach chromatographischer Reinigung (RP-C18-Kieselgel, Laufmittel Wasser/Methanol), Entfernung des Methanols im Vakuum und Gefriertrocknung erhält man direkt die Titelverbindung. Ausbeute: 2,3 g (41 % d. Th.) eines blauen Lyophili- sats.

d) Trinatrium 3,3-dimethyl-2-{7-[3,3-dimethyl-5-sulfonato-l -(2-sulfonatoethyl)-3H- indolium-2-yl]-4-(5- { [2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)ethyl]carbamoyl} -3-oxa- pentyl)hepta-2,4,6-trien- 1 -yliden} - 1 -(2-sulfonatoethyl)-2,3-dihydro-l H-indol-5-sulfonat, inneres Salz

1,0 g (1,1 mMol) der Titelverbindung aus Beispiel Xe und 0,1 g (1,1 mMol) Triethylamin werden in 15 ml Dimethylformamid gelöst, bei 0°C mit 0,37 g (1,1 mMol) TBTU versetzt und 15 min gerührt. Anschließend wird eine Lösung von 0,42 g (1,7 mMol) N-(2- Aminoethyl)maleimid-trifluoracetat (Int J Pept Protein Res 1992, 40, 445) und 0,17 mg (1,7 mmol) Triethylamin in 1,0 ml Dimethylformamid zugegeben und 1 h bei Raumtemp. gerührt. Nach Zugabe von 30 ml Diethylether wird der Feststoff abzentrifugiert, getrocknet und mittels Chromatographie gereinigt (RP C-18 Kieselgel, Gradient Methanol/Wasser). Ausbeute: 0,85 g eines blauen Lyophilisats (73 % d. Th.). Synthese eines Indotricarbocyanin-Fab-Konjugats

0,3 ml einer Lösung von Fab Antiköφer in PBS (Konz. 0,8 mg / ml) wird mit 60 μL einer Lösung von Tris(Carboxyethyl)phosphin (TCEP) in PBS (2,8 mg/ml) versetzt und unter Stickstoff 1 h bei 25°C inkubiert. Überschüssiges TCEP wird mittels Gelfitration über eine- NAP-5-Säule (Eluens: PBS) abgetrennt. Die mittels Photometrie bestimmte Menge an erhaltenem Fab (OD_280nm ⁼ 1,4) beträgt 230 - 250 μg (Volumen 0,5 - 0,6 ml). Die Lösung wird mit 0,03 μMol Trinatrium 3,3-dimethyl-2-{7-[3,3-dimethyl-5-sulfonato-l-(2-sulfonatoethyl)- 3H-indolium-2-yl] -4-(5 - { [2-(2,5 -dioxo-2, 5 -dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)ethyl] carbamoyl} -3 -oxa- pentyl)hepta-2,4,6-trien- 1 -yliden} - 1 -(2-sulfonatoethyl)-2,3-dihydro- 1 H-indol-5-sulfonat, in- neres Salz versetzt (Stammlösungen von 0,5 mg/ml in PBS) und 30 min bei 25°C inkubiert. Das Konjugat wird durch Gelchromatographie über eine NAP-5-Säule (Eluens: PBS/10% Glycerin) gereinigt. Die Immunreaktivität der Konjugatlösung wird mittels Affmitätschroma- tographie (ED-B-Fibronektin-Resin) bestimmt (JImmunol Meth 1999, 231, 239) und beträgt ~ 75%.

Beispiel 4: In-vitro-Assay zur Quantifizierung von embryonalen Fibronektin (ED-B- Fibronektin) in humanem Serum

Die Quantifizierung von zirkulierendem fötalen Fibronektin (ED-B - Fibronektin) (Curr Opin Drug Discov Devel. 2002, 5, 204) basiert auf ELISA-Techniken. Dazu werden transparente 96-well Immunosorb-ELISA-Platten, vorzugsweise aber weiße Immunosorb-ELISA-Platten (Nunk, Dänemark) zur Chemolumineszenz-Detektion verwendet. Folgende Arbeitsschritte werden durchgeführt:

Beschichtung der ELΪSA-Platten Die hochreine rekombinante ED-B-Domäne des fötalen Fibronektin (ED-B-FN) wird als Antigen zusammen mit dem hochreinen anti-Emitter- Antiköφer (siehe Beispiel 1), der vorzugsweise als scFv, Fab, (Fab) oder als Gesamt-IgG vorliegen kann, an der Oberfläche der ELISA-Platten immobilisiert. Als Kopplungspuffer wird PBS, vorzugsweise aber alkalischer Kopplungspuffer verwendet. Dieser setzt sich zusammen aus einer Mischung von 17 ml einer 0.2 M Na₂CO₃ Lösung und 8 ml einer NaHCO₃-Lösung, die auf 100 ml aufgefüllt mit bidest. Wasser den gebrauchsfertigen Kopplungspuffer ergeben. Die Konzentrationen von rekombi- nantem Antigen und anti-Emitter-Antiköφer liegt im Bereich von l-10μg/ml wobei das optimale molare Verhältnis von rekombinantem Antigen und anti-Emitter-Antiköφer empirisch ermittelt werden muß. Vorzugsweise werden aber Verhältnisse im Bereich von 1:5 - 1:100 gewählt. Die Kopplung erfolgt entweder für 2 Stunden bei 37 °C oder aber bei 4 °C über Nacht in einem Volumen von lOOμl pro Tüpfel.

Blockierung freier Bindungsstellen

Nach erfolgter Kopplung werden freie Bindungsstellen auf den ELISA-Platten mit PBS, das 2% (w/v) Rinder Serum Albumin oder Gelatine enthält, vorzugsweise aber mit Blockierungspuffer mit 2% (w/v) Rinder-Albumin oder Gelatine blockiert. Dazu wird die Platte nach der Koppelung ausgeschlagen und mit 200μl/Loch Blockierungspuffer für 2 Stunden bei 37 °C inkubiert.

Kalibrierung

Zur Kalibrierung des Systems wird eine Eichreihe der hochreinen ED-B-FN in humanem Serum pipettiert. Dazu wird eine ED-B-FN-Probe mit einer Konzentration von lOμg/ml seriell in 1 :2-Schritten verdünnt, wobei jede Probe eine konstante Konzentration von anti-Substanz- Antiköφer, markiert mit Emitter, (anti-ED-B-FN Fab-Indotricarbocyaninkonjugat aus Beispiel 3) enthält. Diese kann entsprechend dem Testsystem im Bereich von 0.1 μg/ml bis 10 μg/ml liegen.

Pipettieren des quantitativen ELISA Die geblockte ELISA-Platte wird ausgeschlagen und jeweils lOOμl der Eichproteinreihe werden in Triplikaten in die jeweiligen Löcher der ELISA-Platte pipettiert. Ebenso werden die zu bestimmenden Serum- oder Vollblutproben in Triplikaten auf die Platte aufgebracht und für 30 Minuten bei 37 °C inkubiert.

Messnng der Proben

Die Mesung der Proben erfolgt in einem Spektralfluorometer mit zwei Monochromatoren (SPEX-Fluorog, Jobin Yvon). Die Wellenlänge des Anregungslichts und die Detektionswel- lenlänge für die emittierte Fluoreszenz kann frei gewählt werden. Die Proben werden in einem ELISA-Plattenmodul untersucht. Das vorliegenden Beispiel wird als Anregungswellen- länge 790 nm gewählt. Die Detektion der Fluoreszenz erfolgt in einem Bandpass von 805 - 860 nm. Dadurch wird der Anstieg des Fluoreszenzsignals bei rotverschobener Wellenlänge (vgl. Abbildung) durch Zunahme des Anteils an anti-Substanz-Emitter-Konjugat, welcher über den Farbstoff an immobilisiertes anti-Emitter-Antiköφer bindet, erfaßt. Typischerweise findet man einen sigmoiden Kurvenverlauf, wobei der lineare Meßbereich der Eichreihe zur quantitativen Bestimmung der Meßproben verwendet wird.

Beispiel 5: Antikörper gegen ED-B-Fibronektin Antiköφer gegen ED-B-Fibronektin wurden analog zu der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise aus der HuCAL GOLD-Antiköφerbibliothek gegen ED-B-Fibronektin als Antigen generiert.

Bezugszeichenliste

(1) Vorrichtung zur Messung einer Substanz in einer Probe

(2) Substanz-Emitter-Konjugat

(3) Substanz

(4) Emitter-erkennendes Mittel

(5) Substanz-erkennendes Mittel

(6) Oberfläche

(10) Vorrichtung zur Messung eines Antiköφer-erkennenden Mittel in einer Probe

(12) Antiköφer-Emitter-Konjugat

(13) Antiköφer

(14) Emitter-erkennendes Mittel

(15) immobilisiertes Antigen

(16) Oberfläche

Claims

Patentansprüche

1. Vorrichtung zur direkten quantitativen in v/tro-Bestimmung einer in einer Probe enthaltenen Substanz, umfassend, a) auf einer Oberfläche immobilisierte Mittel zur Substanz-Erkennung, b) freies Substanz-Emitter-Konjugat, und c) auf einer Oberfläche immobilisierte Mittel zur Erkennung des Emitters, wobei der verwendete Emitter einen Teil umfaßt, der auf eine Wechselwirkung mit dem Mittel zur Erkennung des Emitters mit einer Veränderung der Emissionseigenschaften reagiert.

2. Vorrichtung zur direkten quantitativen in vztro-Bestimmung einer in einer Probe enthal- tenen Substanz nach Anspruch 1 , weiter umfassend, d) Mittel zur Messung der Veränderung der Emissionseigenschafiten des Emitters.

3. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Substanz ausgewählt ist aus Antigenen, wie Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Oligonukleotiden, Blutkomponen- ten, Serumkomponenten, Lipiden, Pharmaka und Verbindungen niederen Molekulargewichts, oder Antiköφern und Antiköφerfragmenten.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Veränderung der Emissionseigenschaften des Teils des Emitters ausgewählt ist aus einer Veränderung der Polarisa- tionsebene, der Fluoreszenzintensität, der Phosphoreszenzintensität, der Fluoreszenzlebensdauer und einer bathochromen Verschiebung des Absoφtionsmaximums und/oder des Fluoreszenzmaximums.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Substanz-erkennenden Mittel Peptide, Proteine, Oligonukleotide und insbesondere Antiköφer oder Antiköφerfrag- mente sind.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die Antiköφer oder Antiköφer- fragmente ausgewählt sind aus polyklonalen oder monoklonalen Antiköφern, humani- sierten Antiköφern, Fab-Fragmenten, insbesondere monomeren Fab-Fragmenten, scFv- Fragmenten, synthetischen und rekombinanten Antiköφern, scTCR-Ketten und Gemischen davon.

7. Vorrichtung nach Anspruch 5 oder 6, wobei der anti-Substanz-Antiköφer oder das anti- Substanz-Antiköφerfragment eine höhere Antigenbindungsaffinität aufweist, als der anti-Emitter-Antiköφer oder das anti-Emitter-Antiköφerfragment zum Emitter.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei der anti-Substanz-Antiköφer oder das anti- Substanz-Antiköφerfragment eine mindestens zweifach höhere Antigenbindungsaffini- tat aufweist, als der anti-Emitter-Antiköφer oder das anti-Emitter-Antiköφerfragment zum Emitter.

9. Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, wobei der anti-Substanz-Antiköφer oder das anti- Substanz-Antiköφerfragment eine mindestens zehnfach höhere Antigenbindungsaffini- tat aufweist, als der anti-Emitter-Antiköφer oder das anti-Emitter-Antiköφerfragment zum Emitter.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei die Bindungsaffinität des anti- Substanz-Antiköφer oder das anti-Substanz-Antiköφerfragments kleiner als 50 nM und bevorzugt kleiner als 10 nM ist.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der auf einer Oberfläche immobilisierte anti-Emitter-Antiköφer im molaren Überschuß gegenüber dem anti-Substanz- Antiköφer oder gegenüber dem Antigen vorliegt, wobei das Verhältnis vorzugsweise von 1 :2 bis 1 :50 beträgt.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der Emitter einen Farbstoff umfaßt, der mindestens ein Absoφtionsmaximum und/oder Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 700 bis 1000 nm, bevorzugt mindestens ein Absoφti- onsmaximum und Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 750 bis 900 nm aufweist.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Verschiebung des Absoφti- ons- und/oder Fluoreszenzmaximums zu höheren Wellenlängen nach Wechselwirkung mit dem Mittel zur Erkennung des Emitters um einen Wert größer 15 nm, bevorzugt größer 25 nm, und am meisten bevorzugt um ungefähr 30 nm erfolgt.

14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der verwendete Emitter einen Farbstoff umfaßt, der ausgewählt ist aus der Gruppe von Polymethinfarbstoffen, wie Dicarbocyanin-, Tricarbocyanin-, Indotricarbocyanin-, Merocyanin-, Styryl-, Squarilium- und Oxonolfarbstoffen und Rhodaminfarbstoffen, Phenoxazin- oder Phenothiazin- farbstoffen.

15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der Emitter des Substanz- Emitter-Konjugat einen Cyaninfarbstoff der allgemeinen Formel (I)

umfaßt, in der D für einen Rest (II) oder (III)

(VIII) stehen kann, in denen R¹ und R² unabhängig voneinander eine C₁-C₄-Sulfoalkylkette, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradekettige Ci-Cso-Alkylkette darstellt, die gegebenenfalls mit von 0 bis 15 Sauerstoffatomen und/oder von 0 bis 3 Carbonylgruppen unterbrochen ist und/oder mit 0 bis 5 Hydroxygruppen substituiert sein kann, bedeutet, R³ und R⁴ unabhängig voneinander für die Gruppe -COOE¹, -CONE^², -NHCOE¹, - NHCONHE¹, -NE'E², -OE¹, -OSO₃.E¹, -SOsE¹, -SOzNHE¹ oder -E¹ stehen, wobei E¹ und E² unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine C₁-C₄-Sulfoalkylkette, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradekettige Ci-Cso-Alkylkette darstellt, die gegebenenfalls von 0 bis 15 Sauerstoffatomen und/oder von 0 bis 3 Carbonylgruppen unterbrochen ist und/oder mit 0 bis 5 Hydroxygruppen substituiert ist, R⁵ für ein Wasserstoffatom, einen Methyl-, Ethyl- oder Propylrest oder ein Fluor- Chlor, Brom- oder Jodatom steht, b die Zahl 2 oder 3 bedeutet, und X und Y unabhängig voneinander O, S, =C(CH₃)₂ oder-(CH=CH)- bedeuten, und Salze und Solvate dieser Verbindungen.

16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Substanz-erkennden Mittel und/oder die Substanz direkt oder indirekt auf einer Oberfläche statistisch zufällig oder gerichtet immobilisiert vorliegen.

17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Oberfläche eine Membran, Kugel (Bead) oder feste ebene Oberfläche umfaßt, die aus Harzmatrizes, Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht.

18. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17 für die in vitro Dia- gnostik.

19. Verfahren zur direkten quantitativen in v/tro-Bestimmung einer in einer Probe enthaltenen Substanz, umfassend die Schritte von, a) zur Verfügung stellen einer Vorrichtung, umfassend, i) auf einer Oberfläche immobilisierte Mittel zur Substanz-Erkennung, ii) freies Substanz-Emitter-Konjugat, und iii) auf einer Oberfläche immobilisierte Mittel zur Erkennung des Emitters, wobei der verwendete Emitter einen Teil umfaßt, der auf eine Wechselwirkung mit dem Mittel zur Erkennung des Emitters mit einer Veränderung der Emissionseigenschaften reagiert, b) in Kontakt bringen der Vorrichtung mit einer Probe, die eine zu quantifizierende Substanz enthält, und c) Messen der Veränderung der Emissionseigenschaften des Emitters.

20. Verfahren zur direkten quantitativen in vt^'tro-Bestimmung einer in einer Probe enthaltenen Substanz , umfassend die Schritte von, a) zur Verfügung stellen einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, b) in Kontakt bringen der Vorrichtung mit einer Probe, die eine zu quantifizierende Substanz enthält, und c) Messen der Veränderung der Emissionseigenschaften des Emitters.

21. Verfahren zur quantitativen in v/tro-Bestimmung einer in einer Probe enthaltenen Substanz nach Anspruch 19 oder 20, weiter umfassend d) Quantifizieren der in der Probe enthaltenen Substanz mittels der gemessenen Veränderung der Emissionseigenschaften des Emitters.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei die Substanz ausgewählt ist aus Antigenen, wie Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Oligonukleotiden, Blutkomponen- ten, Serumko ponenten, Lipiden, Pharmaka und Verbindungen niederen Molekulargewichts, oder Antiköφern und Antiköφerfragmenten.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, wobei die Veränderung der Emissionseigenschaften des Teils des Emitters ausgewählt ist aus einer Veränderung der Polarisa- tionsebene, der Fluoreszenzintensität, der Phosphoreszenzintensität, der Fluoreszenzlebensdauer und einer bathochromen Verschiebung des Absoφtionsmaximums und/oder des Fluoreszenzmaximums.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, wobei als die Substanz-erkennenden Mittel Peptide, Proteine und insbesondere Antiköφer oder Antiköφerfragmente mit der Probe in Kontakt gebracht werden.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 24, wobei die Antiköφer oder Antiköφerfragmente ausgewählt sind aus polyklonalen oder monoklonalen Antiköφern, humanisierten Antiköφern, Fab-Fragmenten, insbesondere monomeren Fab-Fragmenten, scFv- Fragmenten, synthetischen und rekombinanten Antiköφern, scTCR-Ketten und Gemischen davon.

26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, wobei der anti-Substanz-Antiköφer oder das an- ti-Substanz-Antiköφerfragment eine höhere Antigenbindungsaffinität aufweist, als der anti-Emitter-Antiköφer oder das anti-Emitter-Antiköφerfragment zum Emitter.

27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei der anti-Substanz-Antiköφer oder das antiSubstanz- Antiköφerfragment eine mindestens zweifach höhere und insbesondere zehnfach höhere Antigenbindungsaffinität aufweist, als der anti-Emitter-Antiköφer oder das anti-Emitter-Antiköφerfragment zum Emitter.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 27, wobei der auf einer Oberfläche immobilisierte anti-Emitter-Antiköφer im molaren Überschuß gegenüber dem anti-Substanz- Antiköφer oder gegenüber dem Antigen mit der Probe in Kontakt gebracht wird, wobei das Verhältnis vorzugsweise 1:2-1:50 beträgt.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 28, wobei der Emitter einen Farbstoff umfaßt, der mindestens ein Absoφtionsmaximum und/oder Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 700 bis 1000 nm, bevorzugt mindestens ein Absoφtionsmaximum und Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 750 bis 900 nm aufweist.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 29, wobei die Verschiebung des Absoφti- ons- und/oder Fluoreszenzmaximums zu höheren Wellenlängen nach Wechselwirkung mit dem Mittel zur Erkennung des Emitters um einen Wert größer 15 nm, bevorzugt größer 25 nm, und am meisten bevorzugt um ungefähr 30 nm erfolgt.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 30, wobei der verwendete Emitter einen Farbstoff umfaßt, der ausgewählt ist aus der Gruppe von Polymethinfarbstoffen, wie Dicarbocyanin-, Tricarbocyanin-, Indotricarbocyanin-, Merocyanin-, Styryl-, Squarilium- und Oxonolfarbstoffen und Rhodaminfarbstoffen, Phenoxazin- oder Phenothiazin- farbstoffen.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 30, wobei der Emitter des Substanz- Emitter-Konjugat einen Cyaninfarbstoff der allgemeinen Formel (I)

umfaßt, in der D für einen Rest (II) oder (III)

(VIII) stehen kann, in denen R¹ und R² unabhängig voneinander eine C₁-C -Sulfoalkylkette, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradekettige CrCso-Alkylkette darstellt, die gegebenenfalls mit von 0 bis 15 Sauerstoffatomen und/oder von 0 bis 3 Carbonylgruppen unterbrochen ist und/oder mit 0 bis 5 Hydroxygruppen substituiert sein kann, bedeutet, R³ und R⁴ unabhängig voneinander für die Gruppe -COOE¹, -CONE'E², -NHCOE¹, - NHCONHE¹, -NE^², -OE¹, -OSO₃E¹, -SO₃E\ -SO₂NHE¹ oder -E¹ stehen, wobei E und E unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Ci-C -Sulfoalkylkette, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradekettige CrCso-Alkylkette dar- stellt, die gegebenenfalls von 0 bis 15 Sauerstoffatomen und/oder von 0 bis 3 Carbonylgruppen unterbrochen ist und/oder mit 0 bis 5 Hydroxygruppen substituiert ist, R⁵ für ein Wasserstoffatom, einen Methyl-, Ethyl- oder Propylrest oder ein Fluor- Chlor, Brom- oder Jodatom steht, b die Zahl 2 oder 3 bedeutet, und X und Y unabhängig voneinander O, S, =C(CH₃)₂ oder-(CH=CH)- bedeuten, und Salze und Solvate dieser Verbindungen.

33. Verwendung von Substanz-Emitter-Konjugaten in einem Verfahren zur direkten quantitativen in v/tro-Bestimmung nach einem der Ansprüche 19 bis 32.

34. Diagnostischer Kit, umfassend Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 19 bis 32, gegebenenfalls zusammen mit anderen Hilfsstoffen und/oder Anweisungen, gemeinsam oder in getrennten Behältern.