DE10331054A1

DE10331054A1 - Emitter-bindende Peptide die eine Veränderung der spektralen Emissionseigenschaften des Emitters bewirken

Info

Publication number: DE10331054A1
Application number: DE2003131054
Authority: DE
Inventors: Michael Schirner; Kai Licha; Andreas Menrad
Original assignee: Morphosys AG; Schering AG
Current assignee: Morphosys AG; Bayer Pharma AG
Priority date: 2003-07-09
Filing date: 2003-07-09
Publication date: 2005-02-03
Also published as: CN1820027A; CN100422214C

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Emitter-bindende Peptide, die bei einer Wechselwirkung ihrer Antigen-Bindungstasche mit dem Emitter eine Veränderung der spektralen Emissionseigenschaften des Emitters bewirken. Die Emitter-bindenden Peptide der Erfindung sind insbesondere Bestandteile von Antikörpern und Antikörperfragmenten.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Emitter-bindende Peptide, die bei einer Wechselwirkung ihrer Antigen-Bindungstasche mit dem Emitter eine Veränderung der spektralen Emissionseigenschaften des Emitters bewirken. Die Emitter-bindende Peptide der Erfindung sind insbesondere Bestandteile von Antikörper und Antikörperfragmenten.
Hintergrund der Erfindung
Für den diagnostischen Nachhweis von Substanzen und deren Konzentrationsbestimmung werden heute in vielen Fällen in-vitro diagnostische Meßverfahren angewendet, die auf biologischen Molekülen, wie z. B. Peptiden, Proteinen, Antikörpern oder Oligonukleotiden, beruhen, die eine hohe Affinität für eine zu bestimmende Substanz haben. Bevorzugt werden hierfür Proteine und Peptide und besonders bevorzugt Antikörper und Antikörperfragmente verwendet.

Bestimmte in-vitro diagnostische Verfahren, wie z.B. die Elektrochemiluminienz basieren auf der Kombination verschiedener Antikörper gegen die zu bestimmende Substanz, wobei der eine Antikörper für die Abtrennung der zu bestimmenden Substanz aus der Untersuchungsprobe dient und der andere Antikörper das diagnostisch nachgewiesene Signalmolekül trägt. Im Falle des diagnostischen Verfahrens der Elektrochemolumineszenz wird der markierte Antikörper optisch detektiert [Grayeski, M. L., Anal. Chem. 1987, 59, 1243].

Neben der Elektrolumineszenz kann auch die lichtinduzierte Phosphoreszenz und die Fluoreszenz als optische Eigenschaft von Molekülen für diagnostische Meßverfahren verwendet werden. Gegenüber der Elektrolumineszenz und Phosphoreszenz bietet insbesondere die Fluoreszenz als optische Eigenschaft von Molekülen den Vorteil der hohen Nachweisempfindlichkeit und eine hohe Linearität des Meßsignals über einen großen dynamischen Bereich hinweg.

Zum Nachweis der Fluoreszenz eines Fluorophors wurden verschiedene Meßverfahren entwickelt, die unterschiedliche Prinzipien innerhalb der Fluoreszenzprozesse ausnutzen. Eta blierte Meßverfahren nutzen z. B. die Abschwächung polarisierten Lichtes (Fluoreszenzpolarisierung – FP), die Messung der Photonenlebensdauer (Fluoreszenzlebensdauermessung – FLM), die Ausbleicheigenschaften (Fluoreszence-Photobleaching Recovery – FPR) und den Energietransfer zwischen verschiedenen Fluorophoren (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer – FRET) [Williams, A. T., et al., Methods Immunol. Anal. 1993, 1, 466;Youn, H. J. et al., Anal. Biochem. 1995 Oswald, B. et al., Anal. Biochem. 2000, 280, 272; Szollosi, J. et. al., Cytometry 1998, 34, 159].

Andere Nachweisverfahren basieren auf einer Veränderung der Polarisationsebene oder dem Nachweis einer Phosphoreszenz.

Bei den oben genannten Verfahren erfüllen die verwendeten Anti-Substanz-Antikörper unterschiedliche Zwecke. Einerseits werden sie für die Abtrennung der zu bestimmenden Substanz aus der Probe verwendet, andererseits erfüllen sie aber auch die Aufgabe der Lokalisierung bzw. Positionierung unterschiedlicher verwendeter Signalgeber an der zu untersuchenden Substanz. Zum Nachweis z.B. eines Antikörpers in einer Probe haben sich vor allem optische und radioaktive Meßverfahren etabliert, aber auch akustische [siehe z.B. Cooper MA, et al. Direct and sensitive detection of a human virus by rupture event scanning. Nat Biotechnol. 2001 Sep;19(9):833-7.] und magnetische Meßverfahren sind bekannt. Die größte Verbreitung haben die optischen Meßverfahren erlangt [Nakamura, R. M., Dito, W. R., Tucker, E. S. (Eds.). Immunoassays: Clinical Laboratory Techniques for the 1980s. A. R. Liss, New York. Edwards, R. (ed.). Immunoassays: Essential Data, 1996, Wiley Europe.].

Bei der Mehrzahl der bereits verfügbaren Meßverfahren wird der Anti-Substanz-Antikörper mit einem Fluorophor markiert. Diese Markierung erfolgt durch spezifische und unspezifische chemische Kopplung. Der markierte Antikörper wird im Überschuß zu der Untersuchungsprobe zugegeben. Dies ist erforderlich, um alle zu untersuchenden Substanzmoleküle zu binden. Diesen Verfahren liegt weiterhin allgemein zu Grunde, daß der eine Anti-Substanz-Antikörper der Abtrennung der zu untersuchenden Substanz dient und der zweite Anti-Substanz-Antikörper, der an einer anderen Bindungsstelle der Untersuchungssubstanz erkennt, mit einem signalgebenden Molekül markiert ist. Auf diese Weise kann eine Verfälschung des Messergebnisses durch den nicht gebundenen, aber signalgebenden Antikörper vermieden werden. Diese Verfahrensweise ist jedoch, bedingt durch den Abtrennungsschritt, mit einem erhöhten methodischen und technischen Aufwand und höheren Kosten verbunden.

Besonders nachteilig erweist sich jedoch der hohe technische Aufwand, der eine Etablierung dieses Verfahrens für die Schnelldiagnostik verhindert.

Antikörper und Peptide, die gegen Moleküle kleinen Molekulargewichts gerichtet sind, sind bereits bekannt. Darunter fallen auch Antikörper und Peptide gegen Farbstoffmoleküle. So beschreiben Simeonov A. et al. in Science 2000, 290, 307-313 Antikörper gegen Stilbene („Blue-fluorescent antibodies"). Diese Antikörper katalysieren spezifisch photochemische Isomerierungsvorgänge und führen zu rotverschobenen Absorptions- und Fluoreszenzmaxima im UV-VIS Spektralbereich (Absorptionsverschiebung maximal 12 nm, Fluoreszenzverschiebung 22 nm). Simeonov et al. geben jedoch keinen Hinweis auf eine Rotverschiebung unter Beibehalt der Fluoreszenzquantenausbeute bei Cyaninfarbstoffen im Wellenlängenbereich von 600-1200 nm.

Watt R. M. et al. (Immunochemistry 1977, 14, 533-541) beschreiben die spektralen Eigenschaften von bereits bekannten anti-Fluorescein-Antikörperkonstrukten. Der Antikörper bewirkt nach Bindung des Fluoresceins eine Verschiebung des Absorptions- und Fluoreszenzmaximums im sichtbaren Spektralbereich, jedoch nur um 12 nm bzw. 5 nm. Zusätzlich erfolgt eine starke Verringerung der Fluoreszenzquantenausbeute um ca. 90%.

Rozinov M. N. et al. (Chem. Biol. 1998, 5, 713-728) beschreiben die Selektion 12-merer Peptide aus Phagenbibliotheken, die die Farbstoffe Texas Red, Rhodamine Red, Oregon Green 514 und Fluorescein binden. Für Texas Red wurde eine Rotverschiebung der Absorption und Fluoreszenz beobachtet, jedoch nur um 2.8 nm bzw. 1.4 nm.

Des weiteren sind Antikörper gegen verschiedene Farbstoffe bereits kommerziell erhältlich, z. B. gegen Fluorescein, Tetramethylrhodamin, Texas Red, Alexa Fluor 488, BODIPY FL, Lucifer yellow and Cascade Blue, Oregon Green (Fa. Molecular Probes, Inc., USA). Hierbei handelt es sich jedoch um polyklonale IgG Antikörper für bioanalytische Zwecke, die zum Teil unkontrollierbare Kreuzreaktivitäten aufweisen und nicht aus einem strikten Selektionsprozess hervorgegangen sind.

Es besteht somit ein weiterer Bedarf an verbesserten Emitter-bindenden Peptiden und insbesondere spezifischen Antikörpern, die besser für die oben genannten Meßverfahren geeignet werden. Vorteilhaft wären dabei insbesondere Emitter-bindende Peptide, die eine Rotver schiebung unter Beibehalt der Fluoreszenzquantenausbeute bei Cyaninfarbstoffen im Wellenlängenbereich von 600-1200 nm bewirken würden.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Emitter-bindendes Peptid gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß dieses bei einer Wechselwirkung seiner Antigenbindungstasche mit dem Emitter eine Veränderung der spektralen Emissionseigenschaften des Emitters bewirkt, einem Verfahren zur Herstellung eines Emitter-bindenden Peptids gemäß der Erfindung, umfassend die Immunisierung eines geeigneten Organismus mit einem Emitter, umfassend einen Farbstoff, der ausgewählt ist aus der Gruppe von Polymethinfarbstoffen, wie Dicarbocyanin-, Tricarbocyanin-, Indotricarbocyanin-, Merocyanin-, Styryl-, Squarilium- und Oxonolfarbstoffen und Rhodaminfarbstoffen, Phenoxazin- oder Phenothiazinfarbstoffen und entsprechenden Verwendungen eines Emitter-bindenden Peptids, einer Nukleinsäure, einer Wirtszelle oder eines Antikörpers oder Konjugats gemäß der Erfindung als Diagnostikum für die in vitro Diagnostik. Zweckmäßige Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen aufgeführt.

Ein erster Aspekts der vorliegenden Erfindung betrifft somit ein Emitter-bindendes Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß dieses bei einer Wechselwirkung seiner Antigenbindungstasche mit dem Emitter eine Veränderung der spektralen Emissionseigenschaften des Emitters bewirkt.

Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Emitter-bindendes Peptid, wobei der Emitter einen Farbstoff umfaßt, der mindestens ein Absorptionsmaximum und/oder Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 700 bis 1000 nm, bevorzugt mindestens ein Absorptionsmaximum und Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 750 bis 900 nm aufweist.

Weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Emitter-bindendes Peptid, wobei die Veränderung der Emissionseigenschaften des Teils des Emitters ausgewählt ist aus einer Veränderung der Polarisationsebene, der Fluoreszenzintensität, der Phosphoreszenzintensität, der Fluoreszenzlebensdauer und einer bathochromen Verschiebung des Absorptionsmaximums und/oder des Fluoreszenzmaximums. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese speziellen Phänomene beschränkt, der Begriff „Veränderung der Emissionseigenschaften" im Rahmen der vorliegenden Erfindung soll alle physikalischen Phänomene oder Effekte umfassen, bei dem die auf den Emitter treffende energiereiche Strahlung in ihrer Eigenschaft verändert wird und diese Veränderung dabei von der Bindung/nicht-Bindung des Substanz-Emitter-Konjugats oder Substanz-erkennendes Mittel-Emitter-Konjugat mit seinem Emitter-Bindungspartner und der Substanz quantitativ abhängig ist. In einer Ausführungsform ist die Substanz zum Beispiel ein Peptid, Protein, Oligonukleotid und insbesondere ein Antikörper oder ein Antikörperfragment. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Antikörperfragmenten um Fragmente, die zumindest die Antigen-bindenden Bereiche umfassen, die die sogenannten "complementarity-determining regions" ("CDRs") enthalten. Bevorzugterweise umfassen die Antigen-bindenden Bereiche dabei die vollständigen variablen Ketten VL und VH.

In einem besonders bevorzugten Aspekt des Emitter-bindenden Peptids gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Antikörper oder das Antikörperfragment ausgewählt aus polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, humanisierten Antikörpern, Fab-Fragmenten, insbesondere monomeren Fab-Fragmenten, scFV-Fragmenten, synthetischen und rekombinanten Antikörpern, scTCR-Ketten und Gemischen davon.

Insbesondere bevorzugt sind dabei im Falle der synthetischen und rekombinanten Antikörper oder Antikörperfragmente diejenigen aus einer HuCAL-Bibliothek (WO 97/08320; Knappik,(2000), J. Mol. Biol. 296, 57-86; Krebs et al. J Immunol Methods. 2001 Aug 1;254(1-2):67-84). Diese können entweder als vollständige Immunoglobuline oder Antikörper in einem der natürlich vorkommenden Formate (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM) oder als Antikörperfragmente vorliegen, wobei die Antikörperfragmente zumindest die Aminosäurepositionen 4 bis 103 für VL und 5 bis 109 für VH, bevorzugt die Aminosäurepositionen 3 bis 107 für VL und 4 bis 111 für VH und besonders bevorzugt die vollständigen variablen Ketten VL und VH (Aminosäurepositionen 1 bis 109 für VL und 1 bis 113 für VH) umfassen (Numerierung nach WO 97/08320).

In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Antikörper oder das Antikörperfragment dabei zumindest einen der in den Sequenzen SEQ-ID NOs: 1, 2, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 und 39 enthaltenen CDR-Bereiche (VL: CDR1 Positionen 24-34, CDR2 Positionen 50-56, CDR3 Positionen 89-96; VH: CDR1 Positionen 26-35, CDR2 Positionen 50-65, CDR3 Positionen 95-102), insbesondere VL CDR3 oder VH CDR3. Besonders bevorzugt ist dabei ein Antikörper, der eine der in den Sequenzen SEQ-ID NOs: 2, 6, 10, 14, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 und 39 enthaltenen variablen Ketten VL oder eine in den Sequenzen SEQ-ID NOs: 1, 5, 9 und 13 enthaltenen variablen Ketten VH umfaßt (oder ein Fragment eines solchen Antikörpers). Am meisten bevorzugt ist ein Antikörper, der eines VH/VL-Paare umfaßt, die in den folgenden Sequenzpaaren enthalten sind: SEQ-ID NOs: 1+2; SEQ-ID NOs: 5+6; SEQ-ID NOs: 9+10; SEQ-ID NOs: 13+14; SEQ-ID NOs: 5+17; SEQ-ID NOs: 5+19; SEQ-ID NOs: 5+37; SEQ-ID NOs: 9+21; SEQ-ID NOs: 9+23; SEQ-ID NOs: 9+25; SEQ-ID NOs: 9+27; SEQ-ID NOs: 9+29; SEQ-ID NOs: 9+31; SEQ-ID NOs: 9+33; SEQ-ID NOs: 9+39; SEQ-ID NOs: 13+35 (oder ein Fragment eines solchen Antikörpers). Insbesondere bevorzugt sind dabei die Fab-Fragmente MOR02628, MOR02965, MOR02977, MOR02969, MOR03263, MOR03325, MOR03285, MOR03201, MOR03267, MOR03268, MOR03292, MOR03294, MOR03295, MOR03309, MOR03293 und MOR03291. Ausgehend von den so beschriebenen erfindungsgemäßen Antikörpern ergeben sich für den Fachmann in naheliegender Weise verschiedene Möglichkeiten, neue modifizierte Antikörper zu erhalten, die die erfindungsgemäßen Eigenschaften ebenfalls zeigen.

Dem Fachmann ist bekannt, daß für die Affinität sowie Selektivität und Spezifität insbesondere die CDR-Bereiche sowohl der schweren als auch der leichten Kette verantwortlich sind. Dabei spielen insbesondere der CDR3-Bereich von VH und der CDR3-Bereich von VL ein Rolle, gefolgt von CDR2 von VH und CDR1 von VL, während CDR1 von VH und CDR2 von VL zumeist eine untergeordnete Rolle spielen. Zur Optimierung von Affinität sowie Selektivität und Spezifität von Antikörpern bieten sich daher insbesondere die CDR-Bereiche an (s. auch z. B. Schier et al., J. Mol. Biol. (1996) 263, 551). Dabei können zum Beispiel ein oder mehrere der CDR-Bereiche ausgetauscht werden, zum Beispiel gezielt gegen CDR-Bereiche von anderen, die erfindungsgemäßen Eigenschaften bereits zeigenden Antikörpern, oder aber durch Bibliotheken von entsprechenden CDR-Sequenzen (siehe hierzu die Optimierung in Beispiel 1), die entweder vollständig zufällige Variationen erzeugen oder einen mehr oder weniger starke Bevorzugung (Tendenz) in Richtung von bestimmten Aminosäuren oder Kombinationen davon enthalten. Der Fachmann ist darüber hinaus auch in der Lage, ganze variable Ketten in gleicher Weise gegen entsprechende Ketten anderer definierter Antikörper oder gegen diverse Bibliotheken solcher Ketten auszutauschen. Des weiteren sind dem Fachmann Verfahren bekannt, gezielt durch Mutagenese eine oder mehrere Aminosäurereste in den CDRs auszutauschen. Die Identifikation derartig zu verändernder Aminosäurereste erfolgt dabei z. B. auf Basis eines Vergleichs der Sequenzen verschiedener Antikörper und die Identifikation von konservierten oder zumindest hoch homologen Resten an den entsprechenden Positionen. Bei den Veränderungen an den CDRs verfügt der Fachmann dabei auch über Kenntnisse zu den sogenannten "kanonischen Strukturen" (Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. (2000) 295, 979); Knappik et al. J. Mol. Biol. (2000) 296, 57), die einen Einfluß auf die dreidimensionale Anordnung der CDR-Bereiche haben und die beim Design entsprechender Optimierungsstrategien berücksichtigt werden können.

Darüber hinaus sind dem Fachmann Techniken vertraut, auch die Gerüstregionen von Antikörpern oder Antikörperfragmenten zu verändern, um zu stabileren oder besser exprimierbaren Molekülen zu gelangen (WO 92/01787; Nieba et al. (1997) Protein Eng. 10, 435; Ewert et al. (2003) Biochemistry 42, 1517).

Über diese bereits beschriebenen Strategien zur Modifikation von Antikörpern oder Antikörperfragmenten hinaus, ist der Fachmann in Kenntnis der erfindungsgemäßen Antikörper und der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Meßverfahren auch in der Lage, weitere Veränderung an der Aminosäuresequenz oder der Zusammensetzung der beschriebenen Antikörper vorzunehmen und durch Anwendung der beschriebenen Assays und Meßverfahren zu entscheiden, ob modifizierte Antikörper entstanden sind, deren Eigenschaften mit denen übereinstimmen, die die erfindungsgemäßen Antikörper auszeichnen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die einen der erfindungsgemäßen Antikörper oder ein Antikörperfragment kodieren. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich dabei um Nukleinsäuremoleküle, die eine der in den Sequenzen SEQ-ID NOs: 2, 6, 10, 14, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 und 39 enthaltenen variablen Ketten VL oder eine in den Sequenzen SEQ-ID NOs: 1, 5, 9 und 13 enthaltenen variablen Ketten VH kodieren. Besonders bevorzugt sind dabei die Sequenzen gemäß der SEQ-ID NOs: 3, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 und 40.

Das Emitter-bindendes Peptid der vorliegenden Erfindung weist optimalerweise eine Bindungsaffinität von kleiner als 50 nM und bevorzugt von kleiner als 10 nM auf.

Ein weiterer Aspekt ist ein Emitter-bindendes Peptid der vorliegenden Erfindung, wobei der Emitter einen Farbstoff umfaßt, der mindestens ein Absorptionsmaximum und/oder Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 700 bis 1000 nm, bevorzugt mindestens ein Absorptionsmaximum und Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 750 bis 900 nm aufweist. Die bathochrome Verschiebung des Farbstoffs ist so gewählt, daß die Verschiebung des Absorptions- und/oder Fluoreszenzmaximums zu höheren Wellenlängen nach Wechselwirkung mit dem Mittel zur Erkennung des Emitters um einen Wert von größer 15 nm, bevorzugt größer 25 nm, und am meisten bevorzugt um ungefähr 30 nm erfolgt. Dabei muß nicht unbedingt eine Verschiebung als solche betrachtet werden, die eine Eigenschaft des Farbstoffs ist. Üblicherweise würde die Verschiebung als Veränderung eines an den Farbstoff angepaßten Emissionswertes gemessen werden, also bei einer bestimmten singulären Wellenlänge. Dafür sind geeignete optische Mitteln zur Messung vorgesehen, die dem Fachmann bekannt sind. Dies gilt ebenfalls für die Messung der Veränderung der Polarisationsebene, der Fluoreszenzintensität, der Phosphoreszenzintensität, der Fluoreszenzlebensdauer und einer bathochromen Verschiebung des Absorptionsmaximums und/oder des Fluoreszenzmaximums.

Für die erfindungsgemäßen Emitter-bindenden Peptide ist es bevorzugt, daß der verwendete Emitter einen Farbstoff umfaßt, der ausgewählt ist aus der Gruppe von Polymethinfarbstoffen, wie Dicarbocyanin-, Tricarbocyanin-, Indotricarbocyanin-, Merocyanin-, Styryl-, Squarilium- und Oxonolfarbstoffen und Rhodaminfarbstoffen, Phenoxazin- oder Phenothiazinfarbstoffen. Allgemein kann der Emitter des erfindungsgemäßen Substanz-Emitter-Konjugats einen Cyaninfarbstoff der allgemeinen Formel (I)

umfassen, in der D für einen Rest (II) oder (III)

steht, wobei die mit dem Stern markierte Position die Verknüpfungsstelle mit dem Rest B bedeutet und für die Gruppe (IV), (V), (VI), (VII) oder (VIII)

stehen kann, in denen R¹ und R² unabhängig voneinander eine C₁-C₄-Sulfoalkylkette, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradekettige C₁-C₅₀-Alkylkette darstellt, die gegebenenfalls mit von 0 bis 15 Sauerstoffatomen und/oder von 0 bis 3 Carbonylgruppen unterbrochen ist und/oder mit 0 bis 5 Hydroxygruppen substituiert sein kann, bedeutet, R³ und R⁴ unabhängig voneinander für die Gruppe -COOE¹, -CONE¹E², -NHCOE¹, -NHCONHE¹, -NE¹E², -OE¹, -OSO₃E¹, -SO₃E¹, -SO₂NHE¹ oder -E¹ stehen, wobei E¹ und E² unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine C₁-C₄-Sulfoalkylkette, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradekettige C₁-C₅₀-Alkylkette darstellt, die gegebenenfalls von 0 bis 15 Sauerstoffatomen und/oder von 0 bis 3 Carbonylgruppen unterbrochen ist und/oder mit 0 bis 5 Hydroxygruppen substituiert ist, R⁵ für ein Wasserstoffatom, eine Methyl-, Ethyl- oder Propylgruppe oder ein Fluor- Chlor, Brom- oder Jodatom steht, b die Zahl 2 oder 3 bedeutet, und X für O, S, =C(CH₃)₂ oder -(CH=CH)- steht, sowie Salze und Solvate dieser Verbindungen.

Überraschenderweise konnte gefunden werden, daß nach hochaffiner Bindung eines Antikörpers an einen Cyaninfarbstoff mit Absorption und Fluoreszenz im Nahinfraroten Spektralbereich (> 750 nm) eine Verschiebung des Absorptionsmaximums und Fluoreszenzmaximums um ca. 30 nm zu höheren Wellenlängen erfolgte (bathochrome Verschiebung). Unter Ausnutzung dieses Prinzips ist es somit zum Beispiel möglich, über einen großen Konzentrationsbereich ein Signal aus einer Vollblutprobe direkt und spektral getrennt zu detektieren, wobei sich das Signal linear zur Konzentration der zu bestimmenden Substanz verhält.

Die Emitter können mit Substanzen Konjugate bilden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden als Substanz-Emitter-Konjugate solche der allg, Formel S-E verwendet, worin S für eine zu untersuchende Substanz und E für einen Emitter steht, der einen Teil umfaßt, der auf eine Wechselwirkung mit dem Mittel zur Erkennung des Emitters mit einer Veränderung der Emissionseigenschaften reagiert. Als struktureller Bestandteil der erfindungsgemäßen Konjugate eignen sich u.a. Farbstoffe, die mindestens ein Absorptionsmaximum und Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 600 bis 1200 nm besitzen. Bevorzugt sind dabei Farbstoffe mit mindestens ein Absorptionsmaximum und Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 700 bis 1000 nm besitzen. Farbstoffe, die diese Kriterien erfüllen, sind beispielsweise solche aus folgenden Klassen: Polymethinfarbstoffe, wie Dicarbocyanin-, Tricarbocyanin-, Merocyanin- und Oxonolfarbstoffe, Rhodaminfarbstoffe, Phenoxazin- oder Phenothiazinfarbstoffe, Tetrapyrrolfarbstoffe, insbesondere Benzoporphyrine, Chorine, Bacteriochlorine, Pheophorbide, Bacteriopheophorbide, Purpurine und Phthalocyanine.

Bevorzugte Farbstoffe sind die Cyaninfarbstoffe mit Absorptionsmaxima zwischen 750 und 900 nm, mit besonderem Vorteil Indotricarbocyanine. Struktureller Bestandteil der erfindungsgemäßen Konjugate sind auch die Substanzen, deren Konzentrationsbestimmung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgen soll.

Diese sind beispielsweise ausgewählt aus Antigenen, wie Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Oligonukleotiden, Blutkomponenten, Serumkomponenten, Lipiden, Pharmaka und Verbindungen niederen Molekulargewichts, insbesondere Zuckern, Farbstoffen oder anderen Verbindungen mit einem Molekulargewicht von unter 500 Dalton.

Bevorzugte Farbstoffe sind die Cyaninfarbstoffe mit Absorptionsmaxima zwischen 750 und 900 nm, mit besonderem Vorteil Indotricarbocyanine.

Die Farbstoffe enthalten Strukturelemente, über welche die kovalente Kopplung an die Substanzstrukuren erfolgt. Dieses sind z. B. Linker mit Carboxygruppen, Aminogruppen, Hydroxygruppen.

Im Falle einer optischen Messung kann diese in unterschiedlicher Weise erfolgen und richtet sich hauptsächlich nach der Art der charakteristischen Veränderung der spektralen Eigenschaften des Emitters (z.B. Fluorophors). Generell bevorzugt ist eine Erfassung der Verschiebung der Absorptionswellenlänge und Emissionswellenlänge oder die Messung der Absorption und/oder Fluoreszenzintensität bei einer Wellenlänge, die zum größten Teil den am Antikörper gebundenen Anteil des Fluorophors erfaßt. Je nach Veränderung der spektralen Eigenschaften des antikörpergebundenen Fluorophors können auch andere Eigenschaften, wie z. B. die Photonenlebensdauer, die Polarisation und das Ausbleichverhalten zur optischen Messung verwendet werden.

Der besondere Vorteil von Fluorophoren im spektralen Bereich des nahinfraroten Lichtes liegt in der geringen Überdeckung durch Bestandteile des Blutes. Hierdurch wird eine Tiefeneindringung ermöglicht, ohne daß das zu detektierende Signal unverhältnismäßig stark verändert wird.

Dem Fachmann sind darüber hinaus auch bereits Antikörper gegen Fluorophore bekannt, die in der Lage sind, nach Bindung des Fluorophors dessen spektrale Eigenschaften im UV-Bereich zu verändern. Durch Bindung eines Fluorophors in die Antigenbindungstasche eines Antikörpers können vor allem die Fluoreszenzintensität, das Absorptionsmaximum, das Emissionsmaximum, und die Photonenlebensdauer verändert werden [Simeonov A., et al., Science (2000) 307-313]. Diese bekannten Antikörper sind jedoch gegen Emitter (Fluoropho re) gerichtet, die ihre Absorption und Fluoreszenzemission im sichtbaren und UV-Bereich des Lichts haben.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Emitter-bindenden Peptids für die in vitro Diagnostik.

Zu diesem Zweck kann das erfindungsgemäße Emitter-bindende Peptid auch in einem diagnostischen Kit vorliegen, gegebenenfalls zusammen mit anderen Hilfsstoffen. Alle erfindungsgemäßen Kits können weiterhin spezielle Instruktionen und Unterlagen (z.B. Eichkurven, Anweisung zur Quantifizierung, usw.) enthalten.

Die Erfindung soll nun im folgenden anhand von Beispielen und den beigefügten Figuren und Sequenzen näher beschrieben werden, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Es zeigen:

1: Den CysDisplay-Screening Vektor pMORPH23 (Vektorkarte und Sequenz),

2: Den Expressionsvektor pMORPHX9 MS (Vektorkarte und Sequenz), und

3: Absorptionspektrum (links) und Fluoreszenzspektrum vom Farbstoff aus Beispiel 2 in Abwesenheit und in Gegenwart von Antikörper MOR02965 in PBS.

Beispiel 1: Selektionierung, Herstellung und Charakterisierung von Emitter-bindenden Antikörpern: Selektion von HuCAL GOLD Fab Antikörper-Fragmenten gegen den Cyanin-Farbstoff Fuji 6-4 (ZK203468) (Trinatrium-3,3-dimethyl-2-{4-methyl-7-[3,3-dimethyl-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoethyl)-3H-indolium-2-yl]hepta-2,4,6-trien-1-yliden}-1-(2-sulfonatoethyl)-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonat, inneres Salz]
HuCAL GOLD Antikörperbibliothek:
Antikörperbibliothek HuCAL GOLD: HuCAL GOLD ist eine vollsynthetische, modulare humane Antikörperbibliothek im Fab Antikörperfragmentformat. HuCAL GOLD basiert auf den HuCAL-Konsensus-Antikörpergenen, die für die Bibliothek HuCAL-scFv1 beschrieben wurden (WO 97/08320; Knappik,(2000), J. Mol. Biol. 296, 57-86; Krebs et al. J Immunol Methods. 2001 Aug 1;254(1-2):67-84). In HuCAL GOLD sind alle sechs CDR-Bereiche durch den Einsatz der sogenannten Trinukleotidmutagenese (Virnekäs et al. (1994) Nucleic Acids Res. 1994 Dec 25;22(25):5600-7) entsprechend der Zusammensetzung dieser Bereiche in menschlichen Antikörpern diversifiziert, während in früheren HuCAL-Bibliotheken (HuCAL-scFv1 und HuCAL-Fab1 lediglich die CDR3-Bereiche in VH und VL entsprechend der natürlichen Zusammensetzung (s. Knappik et al., 2000) diversifiziert worden waren. Darüber hinaus findet in HuCAL GOLD auch ein abgewandeltes Screening-Verfahren Verwendung, das sogenannte CysDisplay (WO 01/05950). Der für das Screeningverfahren verwendete Vektor pMORPH23 findet sich in 1.
Vλ Positionen 1 and 2. Die ursprünglichen HuCAL Mastergene wurden mit ihren authentischen N-Termini konstruiert: VLλ1: QS (CAGAGC), VLλ2: QS (CAGAGC), and VLλ3: SY (AGCTAT). Diese Sequenzen finden sich in WO 97/08320. Bei der Herstellung der HuCAL-scFv1-Bibliothek wurden diese beiden Aminosäurereste in "DI" geändert, um das Klonieren zu erleichtern (EcoRI site). Diese Reste wurden bei der Herstellung von HuCAL-Fab1 und HuCAL GOLD beibehalten. Daher enthalten alle HuCAL-Bibliotheken VLλ-Gene mit derEcoRV-Schnittstelle GATATC (DI) am 5'-Ende. Alle HuCAL kappa Gene (Mastergene und alle Gene in den Bibliotheken) enthalten ohnehin DI am 5'-Ende, da dies die authentischen N-Termini darstellen (WO 97/08320).
VH Position 1. Die ursprünglichen HuCAL-Mastergene wurden mit ihren authentischen N-termini hergestellt: VH1A, VH1B, VH2, VH4, und VH6 mit Q (=CAG) als erstem Aminosäurerest und VH3 sowie VHS mit E (=GAA). Die entsprechenden Sequenzen finden sich in WO 97/08320. Bei der Klonierung der HuCAL-Fab1 sowie der HuCAL GOLD Bibliothek wurde an dieser Position 1 die Amiosäure Q (CAG) in allen VH-Genen eingebaut.
Phagemid-Produktion
Durch Infektion von E. coli TOP10F'-Zellen aus der HuCAL GOLD Antikörper-Bibliothek bzw. aus den Maturierungsbibliotheken mittels Helferphagen wurden große Mengen an Phagemiden produziert und angereichert. Dazu wurden die HuCAL GOLD bzw. die Maturierungsbibliotheken (in den TOP10F'-Zellen) in 2xYT-Medium mit 34 μg/ml Chloramphenicol/ 10 μg/ml Tetrazyklin/ 1 % Glucose bei 37°C bis zu einer OD₆₀₀ von 0.5 kultiviert. Anschließend erfolgte die Infektion mit VCSM13 Helferphagen bei 37°C. Die infizierten Zellen wurden pelletiert und in 2xYT/ 34 μg/ml Chloramphenicol/ 10 μg/ml Tetrazyklin/ 50 μg/ml Kanamycin/ 0.25 mM IPTG resuspendiert und bei 22°C über Nacht kultiviert. Aus dem Überstand wurden die Phagen 2x mit PEG ausgefällt und durch Zentrifugation geerntet (Ausubel (1998) Current protocols in molecular biology. John Wiley Sons, Inc., New York, USA). Die Phagen wurden in PBS/ 20% Glyzerin resuspendiert und bei –80°C gelagert.
Die Phagemid-Amplifikation zwischen den einzelnen Selektionsrunden erfolgte folgendermaßen: log-Phase E. coli TG1-Zellen wurden mit den selektionierten Phagen infiziert und auf LB-Agar-Platten mit 1% Glucose/ 34 μg/ml Chloramphenicol ausplattiert. Nach Inkubation über Nacht wurden die Bakterienkolonien abgekratzt, neu kultiviert und mit VCSM13 Helferphagen infiziert.
Primäre Selektion von Antikörpern gegen den Farbstoff Fuji 6-4 (ZK203468)
Die gereinigten und aufkonzentrierten Phagemide der HuCAL GOLD Antikörper-Bibliothek wurden in ein Standard-Selektionsverfahren eingesetzt. Als Antigene wurden BSA- bzw. Transferrin-gekoppeltes ZK203468 alternierend verwendet. Die Antigene wurden in PBS aufgenommen und in Konzentrationen von 50 μg/ml auf Maxisorp^TM Mikrotiterplatten F96 (Nunc) aufgebracht. Die Maxisorp-Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert ("coating"). Nach Abblocken der Maxisorp-Platten mit 5% Milchpulver in PBS wurden ca. 2E+13 HuCAL GOLD-Phagen in die Antigen-beladenen, abgeblockten Wells gegeben und dort über Nacht bzw. zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach mehreren Waschschritten, die mit fortschreitenden Selektionsrunden stringenter wurden, wurden gebundene Phagen mit 20 mM DTT bzw. 100 μM unkonjugiertem ZK203468 eluiert. Insgesamt wurden drei aufeinanderfolgende Selektionsrunden durchgeführt, wobei die Phagenamplifikation zwischen den Selektionsrunden erfolgte, wie oben beschrieben.
Sub-Klonierung selektionierter Fab-Fragmente zur Expression
Nach der drei Runden umfassenden Antikörper-Selektion wurden die Fab-codierenden Inserts der isolierten HuCAL-Klone in den Expressionsvektor pMORPHX9_MS (s. 2) subkloniert, um die anschließende Expression der Fab-Fragmente zu erleichtern. Dazu wurde die gereinigte Plasmid-DNA der selektionierten HuCAL Fab-Klone mit den Restriktionsenzymen XbaI und EcoRI verdaut. Die Fab-codierenden Inserts wurde aufgereinigt und in den entsprechend verdauten Vektor pMORPHX9_MS ligiert. Dieser Klonierungsschritt führt zu dem Fab-exprimierenden Vektor pMORPHX9_Fab_MS. Fab-Fragmente, die von diesem Vektor exprimiert werden, tragen zwei C-terminale Tags (Myc-Tag und Strep-Tag II) zur Aufreinigung und Detektion.
Screening und Charakterisierung von ZK203468-bindenden Fab-Fragmenten Mehrere tausend Klone wurden nach der Selektion und Sub-Klonierung vereinzelt und mittels ELISA im 384-well-Format auf spezifische Erkennung der im Panning verwendeten Antigene ZK203468-BSA und -Transferrin getestet. Hierbei identifizierte Klone wurden in einem Inhibitions-ELISA auf effiziente Bindung des unkonjugierten Farbstoffs untersucht.
Dies führte zu den parenteralen Fab-Fragmenten MOR02628 (Proteinsequenzen SEQ-ID NO: 1 (VH-CH) und SEQ-ID NO: 2 (VL-CL); DNA-Sequenzen SEQ-ID NO: 3 (VH-CH) und SEQ-ID NO: 4 (VL-CL)), MOR02965 (Proteinsequenzen SEQ-ID NO: 5 (VH-CH) und SEQ-ID NO: 6 (VL-CL); DNA-Sequenzen SEQ-ID NO: 7 (VH-CH) und SEQ-ID NO: 8 (VL-CL)), MOR02977 (Proteinsequenzen SEQ-ID NO: 9 (VH-CH) und SEQ-ID NO: 10 (VL-CL); DNA-Sequenzen SEQ-ID NO: 11 (VH-CH) und SEQ-ID NO: 12 (VL-CL)) und MOR02969 (Proteinsequenzen SEQ-ID NO: 13 (VH-CH) und SEQ-ID NO: 14 (VL-CL); DNA-Sequenzen SEQ-ID NO: 15 (VH-CH) und SEQ-ID NO: 16 (VL-CL)), die den unkonjugierten Farbstoff ZK203468 effizient binden.
Beispiel 2: Optimierung der parentalen Antikörper-Fragmenten durch Austausch der LCDR3-Region
Klonierung der LCDR3-Bibliotheken
Die Plasmid-DNA der vier parenteralen Klone MOR02628, MOR02965, MOR02969 und MOR02977 wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XbaI verdaut und das entstandene, vollständige Fab-Insert vom Expressionsvektor pMORPHX9_MS in den entsprechend geschnittenen Display-Vektor pMORPH23 sub-kloniert. Dieser Schritt ist nötig, um das GenIII bereitzustellen, das der Präsentaion des Fab-Fragments auf der Phagenoberfläche dient. In einem weiteren Schritt wurden die vier parenteralen Klone (nun in pMORPH23) mit BpiI und SphI verdaut. Hierbei wurden die LCDR3-Region und der konstante Clambda-Bereich aus dem Vektor-Rückgrat entfernt. Das entsprechende Vektor-DNA-Fragment wurde isoliert und aufgereinigt. Parallel dazu wurde aus der HuCAL-Fab 2 Bibliothek das komplementäre BpiI/SphI-Fragment isoliert, welches eine diversifizierte LCDR3-Region (mit einer Variabilität von etwa 3E+8) plus konstanten Clambda-Bereich enthält (= Insert-DNA). Mehrere μg Vektor-DNA und kompatible Insert-DNA wurden im molaren Verhältnis von 1:2 mit T4-DNA-Ligase ligiert und nach einem Aufreinigungsschritt in elektrokompetente TOP10F'-Zellen transformiert. Dabei wurden pro parenteralem Antikörper Bibliotheksgrößen von 5E+8 bis etwa 1E+9 Klonen erzielt.
Die Bibliotheken, denen die Klone MOR02628, MOR02969 und MOR02977 zugrunde lagen, wurden vereinigt ("Pool"). Die MOR02965-Bibliothek wurde separat behandelt ("Lead"). Wie bereits beschrieben, wurden mittels dieser TOP10F'-Maturierungs-Bibliotheken die entsprechenden Phagemide durch Infektion mit VCSM13 Helferphagen produziert.
Antikörper-Selektionen auf Maxisorp^TM Mikrotiterplatten
Die gereinigten und aufkonzentrierten Phagemide von "lead"- und "pool"-Bibliotheken wurden in ein Maturierungs-Selektionsverfahren unter stringenten Bedingungen eingesetzt (lange Waschperioden, Verdrängung durch gereinigte, parentale Fab-Proteine). Als Antigene wurden BSA- bzw. Transferrin-gekoppeltes ZK203468 alternierend verwendet. Diese Antigene wurden in PBS aufgenommen und in geringen Konzentrationen von 100-250 ng/ml auf Maxisorp^TM Mikrotiterplatten F96 (Nunc) aufgebracht. Die Maxisorp-Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert ("coating"). Nach Abblocken der Maxisorp-Platten mit 5% Milchpulver in PBS wurden ca. 2E+11 HuCAL Phagen in die Antigen-beladenen, abgeblockten Wells gegeben und dort über Nacht bzw. zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Um die Stringenz zu erhöhen, wurden während dieser Inkubation zusätzlich 100 nM bzw. 500 nM gereinigte Fab-Fragmente der parentalen Klone zugegeben. Nach mehreren ausgedehnten Waschschritten wurden gebundene Phagen mit 20 mM DTT eluiert. Insgesamt wurden zwei aufeinanderfolgende Selektionsrunden durchgeführt, wobei die Phagenamplifikation zwischen den Selektionsrunden erfolgte wie oben beschrieben.
Antikörper-Selektionen auf Neutavidin-Strips
Die gereinigten und aufkonzentrierten Phagemide von "lead"- und "pool"-Bibliotheken wurden weiterhin in ein zweites Maturierungs-Selektionsverfahren unter stringenten Bedingungen (lange Waschperioden, Verdrängung durch aufgereinigte, parentale Fab-Proteine bzw. freien Farbstoff) eingesetzt. Als Antigene wurde Biotin-conjugiertes ZK203468 (alternierend mit Alkyl- bzw. Ether-Linker) verwendet. Diese Antigene wurden in PBS aufgenommen und in geringen Konzentrationen von 60 bzw. 12 ng/ml mit den ca. 2E+11 Phagen versetzt. Die Antigen-Phagen-Lösungen wurden über Nacht bzw. 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Um die Stringenz zu erhöhen, wurden während dieser Inkubation zusätzlich 0.5 μg/ml gereinigte Fab-Fragmente der parentalen Klone bzw. 40 ng/ml ZKZ03468 zugegeben. Die Antigen-gebundene Phagen enthaltenden Lösungen wurden anschließend auf geblockte Neutravidin-Strips aufgebracht und 30 min inkubiert, um die Bindung an die Festphase über den Bio tinrest des Antigens zu ermöglichen. Nach mehreren Waschschritten wurden gebundene Phagen mit 20 mM DTT eluiert. Insgesamt wurden zwei aufeinanderfolgende Selektionsrunden durchgeführt, wobei die Phagenamplifikation zwischen den Selektionsrunden erfolgte wie oben beschrieben.
Sub-Klonierung selektionierter Fab-Fragmente zur Expression
Nach der Selektion ("Maturierung") wurden die Fab-codierenden Inserts der isolierten HuCAL-Klone in den Expressionsvektor pM0RPHX9_MS sub-kloniert, um die anschließende Expression zu erleichtern. Dazu wurde die gereinigte Plasmid-DNA der selektionierten HuCAL Fab-Klone mit den Restriktionsenzymen XbaI und EcoRI verdaut. Das Fab-codierende Insert wurde aufgereinigt und in den entsprechend verdauten Vektor pMORPHX9_MS ligiert. Dieser Klonierungsschritt führt zu dem Fab-exprimierenden Vektor pMORPHX9_Fab_MS. Fab-Fragmente, die von diesem Vektor exprimiert werden, tragen zwei C-terminale Tags (Myc-Tag und Strep-Tag II) zur Aufreinigung und Detektion.
Identifikation optimierter Antikörper-Fragmente
Um Antikörper mit verbesserten Affinitäten zum Farbstoff Fuji 6-4 zu identifizieren, wurden die Klone aus den Selektionen vereinzelt und in ELISAs im 384-well-Format gescreent. Dazu wurde auf die ELISA-Mikrotiterplatten ZK203468-BSA aufgebracht. Die zu untersuchenden Fab-Fragmente wurden als nicht-aufgereinigte Bakterienlysate zugegeben. Um zusätzlich zur Bindung an das Antigenkonjugat die Bindung an den freien Farbstoff zu untersuchen, wurden ausserdem identische Screeningplatten mit Bakterienlysat und zusätzlich freiem Farbstoff in zwei unterschiedlichen Konzentrationen versetzt. Die hierbei entstehende Inhibition der Fab-Bindung an die Festphase durch den unkonjugierten Farbstoff zeigte Antikörper an, die nicht das Farbstoff-Konjugat sondern nur den freien Farbstoff spezifisch erkennen. Hierbei isolierte Klone wurden in Solution-Inhibition-Tests im ELISA-Format und dem Luminex-Gerät genau charakterisiert und deren Affinitäten zu Fuji 6-4 bestimmt.
Die folgenden Klone zeigten verbesserte Affinitäten im Vergleich zu den parenteralen Antikörpern:
Zusammenfassend konnte die Affinität des parenteralen MOR02977 im Vergleich zu MOR03267 um den Faktor 140 verbessert werden. Alle weiteren identifizierten Klone zeigten Verbesserungen von Faktor 2-70 im Vergleich zum jeweiligen parenteralen Fab.
Beispiel 3: Photophysikalische Charakterisierung der Farbstoff-Antikörper-Komplexe und Bestimmung der spektralen Verschiebungen/Fluoreszenzquantenausbeuten
Es wurden Farbstoff-Antikörper-Komplexe basierend auf Antikörpern mit Bindung an den Indotricarbocyaninfarbstoff Trinatrium-3,3-dimethyl-2-{4-methyl-7-[3,3-dimethyl-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoethyl)-3H-indolium-2-yl]hepta-2,4,6-trien-1-yliden}-1-(2-sulfonatoethyl)-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonat, inneres Salz untersucht (siehe Beispiele 1 und 2). Es wurden Lösungen der Konzentration von 1 μmol/L des o. g. Farbstoffes und 2,4 μmol/L des jeweiligen Antikörpers in PBS hergestellt und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Absorptionsmaxima wurden mit einem Spektralphotometer (Perkin-Elmer, Lambda2) bestimmt. Die Fluoreszenzmaxima und Fluoreszenzquantenausbeuten wurden mit einem SPEX Fluorolog (wellenlängenabhängige Empfindlichkeit von Lampe und Detektor kalibriert) relativ zu Indocyaningrün bestimmt (Q = 0,13 in DMSO, J Chem Eng Data 1977, 22, 379, Bioconjugate Chem 2001, 12, 44). Aus den Absorptions- und Fluoreszenzmaxima wurden die spektralen Verschiebungen relativ zu den Maxima einer Lösung des o. g. Farbstoffes ohne Antikörper in PBS (1 μmol/L) berechnet (Absorptionsmax. 754 nm, Fluoreszenzmax. 783 nm, Fluoreszenzquantausbeute 10 %).
Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle zusammengefaßt:
Beispiel 4: Konstruktion von Expressionsvektoren für die Expression von HuCAL Immunoglobulinen
Klonierung der schweren Kette: Die "multiple cloning site" des Vektors pCDNA3.1+ (Invitrogen) wird entfernt (NheI/ApaI), und ein Platzhalter, der mit den Restriktionsschnittstellen aus dem HuCAL-Design kompatibel ist, wird eingesetzt für die Ligation der Leader-Sequenz (NheI/EcoRI), der VH-Domäne aus dem Fab-Fragment (MunI/), und die konstanten Immunoglobulinregionen (BlpI/ApaI). Die Leadersequenz (EMBL 83133) wird mit einer Kozaksequenz ausgestattet (Kozak, 1987). Die konstanten Regionen von humanem IgG (PIR J00228), IgG4 (EMBL K01316), und Serum-IgAI (EMBL J00220) werden in überlappende Oligonucleotide von einer Länge von etwa 70 Basen aufgeteilt. "Silent Mutations" werden eingeführt, um Restriktionsschnittstellen zu entfernen, die nicht mit dem HuCAL-Design kompatibel sind. Die Oligonukleotide werden durch "overlap extension-PCR" verknüpft.
Während des Subklonierens von den Fab-Fragmenten in ein IgG-Molekül wird die schwere Kette des Fab-Fragments über MfeI/BlpI ausgeschnitten und in den Vektor, der mit Eco-RI/BlpI geöffnet wird, ligiert. EcoRI (g/aattc) und MfeI (c/aattg) besitzten beide kompatible kohäsive Enden (aatt), und die Sequenz der ursprünglichen MfeI-Schnittstelle in den Fab-Fragmenten ändert sich von: c/aattg nach g/aattg nach der Ligation in den IgG-Expressionsvektor, wodurch zum Einen sowohl die MfeI- als auch die EcoRI-Schnittstelle zerstört werden, und zum Anderen eine Aminosäurenaustausch von Q (Kodon: caa) nach E (Kodon: gaa) statt findet.
Klonierung der leichten Kette. Die "multiple cloning site" von pCDNA3.1/Zeo+ (Invitrogen) wird duch zwei unterschiedliche Platzhalter ersetzt. Der k-Platzhalter enthält Restriktionsschnittstellen für den Einbau einer k-Leadersequenz (NheI/EcoRV), der HuCAL Fab Vk-Domäne (EcoRV/BsiWI), und der konstanten Region der k-Kette (BsiWI/ApaI). Die entsprechenden Schnittstellen im l-Platzhalter sind NheI/EcoRV (l-Leader), EcoRV/HpaI (VI-Domäne), and HpaI/ApaI (konstante Region l-Kette). Der k-Leader (EMBL Z00022) sowie der l-Leader (EMBL J00241) sind beide mit Kozak-Sequenzen versehen. Die konstanten Regionen von humanen k- (EMBL L00241) und l-Ketten (EMBL M18645) werden beide durch "overlap extension-PCR" assembliert, so wie oben beschrieben.
Generation von IgG-exprimierenden CHO-Zellen. CHO-K1 Zellen werden mit einer äquimolaren Mischung von Expressionsvektoren für die schwere und leichte IgG-Ketten co-transfiziert. Zweifach resistente Transfektantent werden mit 600 mg/ml G418 und 300 mg/ml Zeocin (Invitrogen) gefolgt von limitierender Verdünnung selektioniert. Der Überstand von Einzelklonen wird auf IgG-Expression durch "capture-ELISA" überprüft. Positive Klone werden in RPMI-1640 Medium, das mit 10% "ultra-low IgG-FCS" (Life Technologies) versehen ist, angezogen. Nach Einstellung des pH-Werts des Überstands auf 8.0 und Sterilfiltration, wird die Lösung einer Standard-ProteinA-Säulenchromatographie unterzogen (Poros 20 A, PE Biosystems).
Sequenzprotokoll

Claims

Emitter-bindendes Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß dieses bei einer Wechselwirkung seiner Antigenbindungstasche mit dem Emitter eine Veränderung der spektralen Emissionseigenschaften des Emitters bewirkt.
Emitter-bindendes Peptid nach Anspruch 1, wobei der Emitter einen Farbstoff umfaßt, der mindestens ein Absorptionsmaximum und/oder Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 700 bis 1000 nm, bevorzugt mindestens ein Absorptionsmaximum und Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 750 bis 900 nm aufweist.
Emitter-bindendes Peptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2, das ausgewählt ist aus Antikörpern oder Antikörperfragmenten, wie zum Beispiel Fab-Fragmenten, scFv-Fragmenten, scTCR-Ketten, single-chain-Antikörpern und Gemischen davon.
Emitter-bindendes Peptid nach Anspruch 3, umfassend eines der VH/VL-Paare, das in einem der folgenden Sequenzpaare enthalten ist: SEQ-ID NOs: 1+2; SEQ-ID NOs: 5+6; SEQ-ID NOs: 9+10; SEQ-ID NOs: 13+14; SEQ-ID NOs: 5+17; SEQ-ID NOs: 5+19; SEQ-ID NOs: 5+37; SEQ-ID NOs: 9+21; SEQ-ID NOs: 9+23; SEQ-ID NOs: 9+25; SEQ-ID NOs: 9+27; SEQ-ID NOs: 9+29; SEQ-ID NOs: 9+31; SEQ-ID NOs: 9+33; SEQ-ID NOs: 9+39; und SEQ-ID NOs: 13+35.
Emitter-bindendes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dessen Bindungsaffinität zu dem Emitter kleiner als 50 nM und bevorzugt kleiner als 10 nM ist.
Emitter-bindendes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Veränderung der Emissionseigenschaften des Emitters ausgewählt ist aus einer Veränderung der Polarisationsebene der Fluoreszenzintensität, Phosphoreszenz, insbesondere Phosphoreszenzintensität, Lebensdauer der Fluoreszenz und einer bathochromen Verschiebung des Absorptionsmaximums und/oder Fluoreszenzmaximums.
Emitter-bindendes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Verschiebung des Absorptions- und/oder Fluoreszenzmaximums zu höheren Wellenlängen nach Wechsel wirkung mit dem Mittel zur Erkennung des Emitters um einen Wert größer 15 nm, bevorzugt größer 25 nm, und am meisten bevorzugt um ungefähr 30 nm erfolgt.
Emitter-bindendes Peptid nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei der Farbstoff ausgewählt ist aus der Gruppe von Polymethinfarbstoffen, wie Dicarbocyanin-, Tricarbocyanin-, Indotricarbocyanin-, Merocyanin-, Styryl-, Squarilium- und Oxonolfarbstoffen und Rhodaminfarbstoffen, Phenoxazin- oder Phenothiazinfarbstoffen.
Emitter-bindendes Peptid nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei der Farbstoff ein Cyaninfarbstoff der allgemeinen Formel (I)
umfaßt, in dem D für einen Rest (II) oder (III)
steht, wobei die mit dem Stern markierte Position die Verknüpfungsstelle mit dem Rest B bedeutet und für die Gruppe (IV), (V), (VI), (VII) oder (VIII)

stehen kann, in denen R¹ und R² unabhängig voneinander eine C₁-C₄-Sulfoalkylkette, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradekettige C₁-C₅₀-Alkylkette darstellt, die gegebenenfalls mit von 0 bis 15 Sauerstoffatomen und/oder von 0 bis 3 Carbonylgruppen unterbrochen ist und/oder mit 0 bis 5 Hydroxygruppen substituiert sein kann, bedeutet, R³ und R⁴ unabhängig voneinander für die Gruppe -COOE¹, -CONE¹E², -NHCOE¹, -NHCONHE¹, -NE¹E², -OE¹, -OSO₃E¹, -SO₃E¹, -SO₂NHE¹ oder -E¹ steht, wobei E¹ und E² unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine C₁-C₄-Sulfoalkylkette, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradekettige C₁-C₅₀-Alkylkette darstellt, die gegebenenfalls von 0 bis 15 Sauerstoffatomen und/oder von 0 bis 3 Carbonylgruppen unterbrochen ist und/oder mit 0 bis 5 Hydroxygruppen substituiert ist, R⁵ für ein Wasserstoffatom oder ein Fluor- Chlor, Brom- oder Jodatom, Me, Et, Prop steht, b die Zahl 2 oder 3 bedeutet, und X O, S, =C(CH₃)₂ oder -(CH=CH)- bedeutet, sowie Salz und Solvate dieser Verbindungen.
Polynukleotid, insbesondere DNA, RNA oder PNA, umfassend eine Sequenz, die für ein Emitter-bindendes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder funktionellen Varianten davon kodiert.
DNA- oder RNA-Vektormolekül, das mindestens ein oder mehrere Polynukleotid(e) nach Anspruch 10 enthält und das in Zellen exprimierbar ist.
Wirtszelle, die ein Polynukleotid gemäß Anspruch 10 oder ein Vektormolekül gemäß Anspruch 11 enthält.
Antikörper, insbesondere polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, humaner oder humanisierter Antikörper, synthetischer oder rekombinanter Antikörper, umfassend mindestens ein Emitter-bindendes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
Verfahren zur Herstellung eines Emitter-bindenden Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend die Immunisierung eines geeigneten Organismus mit einem Emitter, umfassend einen Farbstoff, der ausgewählt ist aus der Gruppe von Polymethinfarbstoffen, wie Dicarbocyanin-, Tricarbocyanin-, Indotricarbocyanin-, Merocyanin-, Styryl-, Squarilium- und Oxonolfarbstoffen und Rhodaminfarbstoffen, Phenoxazin- oder Phenothiazinfarbstoffen.
Verfahren zur Herstellung eines Emitter-bindenden Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend die rekombinante und/oder synthetische Herstellung des Peptids.
Verwendung eines Emitter-bindenden Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9, einer Nukleinsäure nach Anspruch 10 oder 11, einer Wirtszelle nach Anspruch 12, oder eines Antikörpers nach Anspruch 13 als Diagnostikum für die in vitro Diagnostik.
Diagnostischer Kit für die in vitro Diagnose, umfassend mindestens ein Mittel ausgewählt aus einem Emitter-bindenden Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9, einer Nukleinsäure nach Anspruch 10 oder 11, einer Wirtszelle nach Anspruch 12, oder einem Antikörper nach Anspruch 13, gegebenenfalls zusammen mit anderen Hilfsstoffen und/oder Anweisungen, in gemeinsamen oder in getrennten Behältern.
Verfahren zur quantitativen in vitro-Bestimmung einer in einer Probe enthaltenen Substanz umfassend den Schritt von, a) in Kontakt bringen eines Emitter-bindenden Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9 mit einem Emitter, wobei die Wechselwirkung seiner des Emitters des Konjugats mit dem Emitter-bindenden Peptid eine Veränderung der spektralen Emissionseigenschaften des Emitters bewirkt. und b) Messen der Veränderung der spektralen Emissionseigenschaften des Emitters.
Verfahren zur direkten quantitativen in vitro-Bestimmung einer in einer Probe enthaltenen Substanz oder eines in der Probe vorhandenen Antigen-erkennenden Mittels nach Anspruch 18, umfassend weiterhin den Schritt von, d) Quantifizieren der in der Probe enthaltenen Substanz mittels der gemessenen Veränderung der Emissionseigenschaften des Emitters.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei die Veränderung der spektralen Emissionseigenschaften des Teils des Emitters ausgewählt ist aus einer Veränderung der Polarisationsebene, Phosphoreszenz, insbesondere Phosphoreszenzintensität, Lebensdauer der Fluoreszenz und einer bathochromen Verschiebung des Absorptionsmaximums und/oder Fluoreszenzmaximums.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei als das Emitter-bindende Peptid, Antikörperfragmente, wie zum Beispiel Fab-Fragmente, scFv-Fragmente, scTCR-Ketten, single-chain-Antikörper und Gemische davon mit der Probe in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei das Emitter-bindende Peptid eine Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, wobei das Emitter-bindende Peptid eine Bindungsaffinität zu dem Emitter von weniger als 50 nM und bevorzugt weniger als 10 nM aufweist.