DE69612509T2

DE69612509T2 - Spezifische bindungspartner fuer menschliches karzinoembryonisches antigen, substanzen und methoden

Info

Publication number: DE69612509T2
Application number: DE69612509T
Authority: DE
Inventors: Julie Allen; Gerald Mccafferty; Katharine Osbourn
Original assignee: Cambridge Antibody Technology Ltd
Current assignee: MedImmune Ltd
Priority date: 1995-12-07
Filing date: 1996-12-09
Publication date: 2001-10-18
Anticipated expiration: 2016-12-10
Also published as: GB9621295D0; EP0865492A1; CA2239519A1; DK0865492T3; ATE200516T1; JP2009148299A; AU1103697A; WO1997020932A1; CA2239519C; DE69612509D1; AU703319B2; JP4773540B2; ES2157473T3; JP2000504204A; EP0865492B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft spezifische Bindungselemente für carcinoembryonales Human-Antigen (CEA) sowie zugehörige Materialien und Verfahren.
CEA ist ein Tumorassoziiertes Glykoprotein, dessen Expression bei einer Anzahl von Human-Karzinomen erhöht ist. CEA ist ein Tumor-Marker mit weitverbreiteter klinischer Verwendung, und dagegen gebildete Antikörper sind zur Abbildung (D. M. Goldenberg, Int. J. of. Biol. Markers 7, 183-188 (1992)) und Therapie (z. B. Ledermann et al., Int. J. Cancer 47, 659-664 (1991)) verwendet worden. CEA ist ein Mitglied der Immunglobulin-Überfamilie und weist Homologie mit einer Anzahl anderer Antigene auf, wie z. B. normalem kreuzreagierendem Antigen (NCA), das auf normalem Gewebe zu finden ist (F. Buchegger et al., Int. J. Cancer 33, 643-649 (1984)).
Es gibt eine Anzahl von Mäuse-Anti-CEA-Antikörper, die sich an eine Bandbreite von Epitopen auf CEA binden (Hammarstrom et al., Cancer Res. 49, 4852-4858 (1989)), und Human-Anti-CEA-Antikörper sind aus Human-Phagen-Display-Bibliotheken isoliert worden (A. D. Griffiths et al., EMBO J. 12, 725-734 (1993); A. D. Griffiths et al., EMBO J. 13, 3245-3260 (1994); WO 93/11236). Die vorliegende Erfindung resultiert daraus, dass die Erfinder das erste Beispiel von Human-Anti-CEA-Antikörpern mit einer Dissoziationskonstante von weniger als 10 nM für CEA (1 · 10&supmin;&sup8; M), und die ersten derartigen Human- Anti-CEA-Antikörper erhalten haben, die nicht mit Zelltypen, die NCA exprimieren, oder mit einer normalen Human-Leber-Zelllinie kreuz reagieren.
Hierin wird gezeigt, dass große universelle Phagen-Display-Bibliotheken als Quelle von für Human-CEA spezifischen Human-Antikörpern dienen können. Dann können Human-Antikörper gegen Human-CEA mit verbesserten Eigenschaften maßgeschneidert werden. In Beispiel 1 wird gezeigt, wie die Affinität des Human-Anti-CEA-Antikörpers durch Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese der Komplementarität bestimmenden Regionen (CDRs) der VH- und VL-Domänen der Antikörper verbessert werden kann. Die Anwendung von Antikörper-Kettenshuffling wird ebenfalls demonstriert, wobei beispielsweise die VH-Domänen von aus einer Bibliothek herrührenden Antikörpern mit den VL-Domänen aus einer anderen Bibliothek kombiniert werden, wodurch der Pool an auf jede VH-Dömäne getesteten VL-Partnern erweitert wird. Beispiel 1 demonstriert auch die A wendung dieses Verfahren, d. h. einer Kombination aus Oligonukleotid-Mutagenese und VL-Kettenshuffling, zur Erzeugung neuer Antikörper, die im Vergleich zum Stamm-Antikörper eine geänderte Spezifität für einen Bereich von normalen Geweben aufweisen. Die Antikörper weisen im Vergleich zum Stamm-Antikörper auch verbesserte Affinität für Human-CEA auf. Es wird gezeigt, dass dieses Verfahren in der Lage ist, die Spezifität des ursprünglichen Antikörpers so zu verändern, dass seine potenzielle Leistungsfähigkeit als spezifisches auf Tumoren abzielendes Mittel verbessert wird. Die Kreuzreaktivität gegenüber einer menschlichen Zell linie normaler Leberzellen wird mit bestimmten Kombinationen von VH und VL stark verringert.
Die Verwendung von Anti-CEA-Antikörpern zur Behandlung und Diagnose von Krebs ist Gegenstand einer Reihe von Patenten (z. B. Matsuoka und Kuroki, Patent Nr. 4.871.834 (1989), Buchegger und Mach, JP-Patent Nr. 5.047.507 (1991); Chester et al., WO 95/ 15341 (1995)). Die hierin geoffenbarten Human-Antikörper sollten für ähnliche Anwendungen wertvoll sein, wobei sie den Vorteil haben, dass sie aufgrund des Fehlens der Human-Anti-Mäuse-Antikörper- (HAMA-) Reaktion den Einsatz von wiederholten Behandlungen ermöglichen (Schroff et al., Cancer Res. 45, 879-885 (1985); DeJager et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 29, 377 (1988)). HAMA-Reaktionen haben eine Reihe von Auswirkungen, von der Neutralisation des verabreichten Antikörpers, was zu einer reduzierten therapeutischen Dosis führt, bis hin zu allergischen Reaktionen, Serumkrankheit und Nierenschädigungen.
In der vorliegenden Anmeldung wird gezeigt, dass die Human-Antikörper gegen Human-CEA bei der Tumor-Lokalisierung in einem Mäuse-Xenotransplantat-Modell von Human-Adenokarzinom wirksam sein können.
Die WO 95/15341 offenbart Anti-CEA-Antikörper, die aus einer Phagen-Display-Bibliothek erhalten werden, die aus mit Human-CEA immunisierten Mäusen gebildet wurde.
Nap et al., Cancer Research 55, 2329-2339, beschreiben die Analyse einer Reihe von monoklonalen Mäuse-Anti-CEA-Antikörpern.
Die WO 91/01990 offenbart heterozygote Antikörper gegen CEA, die eine variable Mäuse-Region und eine konstante Human-Region umfassen.
Epstein et al., Developments in Biological Standardisation 66, 429-437 (1987), beschreiben die Isolierung von monoklonalen Mäuse-Antikörpern gegen CEA aus Human-Metastasen zur Leber von primärem Kolon-Adenokarzinom.

TERMINOLOGIE

Spezifisches Bindungselement

Dieser Ausdruck beschreibt ein Element eines Paares von Molekülen, die Bindungsspezifität füreinander aufweisen. Die Elemente eines spezifischen Bindungspaares können natürlich erhalten oder ganz oder teilweise synthetisch hergestellt sein. Ein Element des Paares von Molekülen weist einen Bereich an seiner Oberfläche oder einen Hohlraum auf, der sich spezifisch an eine bestimmte räumliche und polare Organisation des anderes Elements des Paares von Molekülen bindet und daher komplementär dazu ist. So weisen die Elemente des Paares die Eigenschaft auf, sich spezifisch aneinander zu binden. Beispiele für Typen spezifischer Bindungspaare sind Antigen-Antikörper, Biotin- Avidin, Hormon-Hormonrezeptor, Rezeptor-Ligand, Enzym-Substrat. Die vorliegende Anmeldung betrifft Reaktionen vom Antigen-Antikörper-Typ.

Antikörper

Dieser Ausdruck beschreibt ein Immunglobulin, das natürlich vorkommen oder gänzlich oder teilweise synthetisch hergestellt sein kann. Der Begriff umfasst auch jedes Polypeptid oder Protein mit einer Bindungsdomäne, die eine Antikörper-Bindungsdomäne oder dazu homolog ist. Diese können aus natürlichen Quellen stammen oder teilweise oder gänzlich synthetisch hergestellt sein. Beispiele für die Antikörper sind die Immunglobulin-Isotypen und ihre Isotyp-Unterklassen; Fragmente, die eine Antigen-Bindungsdomäne umfassen, wie z. B. Fab, scFv, Fv, dAb und Fd; sowie Diakörper.
Es ist möglich, unter Verwendung monoklonaler und anderer Antikörper Techniken der DNA-Rekombinationstechnologie anzuwenden, um andere Antikörper oder heterozygote Moleküle zu erzeugen, welche die Spezifität des ursprünglichen Antikörpers beibehalten. Derartige Techniken können das Einführen von DNA eines anderen Immunglobulins umfassen, die für die variable Immunglobulin-Region oder die Komplementarität bestimmenden Regionen (CDRs) eines Antikörpers gegen die konstanten Regionen oder konstanten Regionen plus Rahmenregionen kodiert. Siehe beispielsweise EP-A-184.186, GB-A-2.188.648 oder EP-A-239.400. Eine Hybridom- oder andere Zelle, die einen Antikörper produziert, kann genetischer Mutation oder anderen Veränderungen unterzogen werden, welche die Bindungspezifität der produzierten Antikörper ändern oder auch nicht.
Da Antikörper auf vielerlei Arten modifiziert werden können, sollte der Begriff "Antikörper" so verstanden werden, dass er jedes spezifische Bindungselement oder jede Substanz mit einer Bindungsdomäne mit der erforderlichen Spezifität umfasst. Daher umfasst dieser Begriff auch Antikörperfragmente, Derivate, funktionelle Äquivalente und Homologe von Antikörpern, einschließliches jedes Polypeptids, das eine Immunglobulin-Bindungdomäne umfasst, ob es natürlich vorkommend oder gänzlich oder teilweise synthetisch ist. Heterozygote Moleküle, die eine Immunglobulin-Bindungsdomäne oder ein Äquivalent dazu fusioniert an ein anderes Polypeptid umfassen, zählen daher auch dazu. Klonierung und Expression von heterozygoten Antikörpern werden in der EP-A- 0.120.694 und der EP-A-0.125.023 beschrieben.
Es ist gezeigt worden, dass Fragmente eines ganzen Antikörpers die Funktion der Bindung von Antigenen erfüllen können. Beispiele für Bindungsfragmente sind (i) das Fab- Fragment, das aus VL-, VH-, CL- und CH1-Domänen besteht; (ii) das Fd-Fragment, das aus den VH- und CH1-Domänen besteht; (iii) das Fv-Fragment, das aus den VL- und VH- Domänen eines einzigen Antikörpers besteht; (iv) das dAb-Fragment (E. S. Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), das aus einer VH-Domäne besteht; (v) isolierte CDR-Regionen; (vi) F(ab')2-Fragmente, zweiwertige Fragmente, die zwei verbundene Fab-Fragmente umfassen, (vii) Einzelketten-Fv-Moleküle (scFv), worin eine VH-Domäne und eine VL-Domäne über einen Peptidlinker verbunden sind, der das Assoziieren der beiden Domänen ermöglicht, um eine Antigen-Bindungsstelle zu bilden (Bird et al., Science 242, 423-426 (1988); Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)); (viii) bispezifische Einzelketten-Fv-Dimere (PCT/US92/09965), sowie (ix) "Diakörper", mehrwertige oder mehrfach spezifische Fragmente, die durch Genfusion konstruiert werden (WO 94/13804; P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Si. USA 90, 6444-6448 (1993)).
Diakörper sind Multimere aus Polypeptiden, wobei jedes Polypeptid eine erste Domäne, die eine Bindungsregion einer Immunglobulin-Leichtkette umfasst, sowie eine zweite Domäne umfasst, die eine Bindungsregion einer Immunglobulin-Schwerkette umfasst, und die beiden Domänen (z. B. über einen Peptid-Linker) verbunden, aber nicht in der Lage sind, miteinander zu assoziieren, um eine Antigen-Bindungsstelle zu bilden: Antigen-Bindungsstellen werden durch Assoziation der ersten Domäne eines Polypeptids innerhalb des Multimers mit der zweiten Domäne eines anderen Polypeptids innerhalb des Multimers gebildet (WO 94/13804).
Wenn bispezifische Antikörper zu verwenden sind, kann es sich dabei um herkömmliche bispezifische Antikörper handeln, die auf eine Vielzahl von Arten hergestellt werden können (P. Holliger und G. Winter, Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)), z. B. chemisch oder aus Hybrid-Hybridomen hergestellt sind, oder es können beliebige der obengenannten bispezifischen Antikörperfragmente sein. Es kann vorzuziehen sein, anstelle von ganzen Antikörpern scFv-Dimere oder Diakörper zu verwenden. Diakörper und scFv können ohne Fc-Region konstruiert werden, indem nur variable Domänen verwendet werden, wodurch die Auswirkungen anti-idotypischer Reaktion potenziell verringert werden Andere Formen bispezifischer Antikörper sind die Einzelketten-"Janusins", wie von Traunecker et al., Embo Journal 10, 3655-3659 (1991), beschrieben.
Bispezifische Diakörper, im Gegensatz zu bispezifischen Gesamt-Antikörpern, können auch besonders nützlich sein, weil sie leicht konstruiert und in E. coli exprimiert werden können. Diakörper (und viele andere Polypeptide, wie z. B. Antikörperfragmente) mit entsprechenden Bindungsspezifitäten können leicht unter Einsatz von Phagen-Display (WO 94/13804) aus Bibliotheken selektiert werden. Nenn ein Arm des Diakörpers konstant gehalten werden soll, beispielsweise mit einer gegen Antigen X gerichteten Spezifität, kann eine Bibliothek, in der der andere Arm variiert wird, erstellt und ein Antikörper mit geeigneter Spezifität selektiert werden.

Antigen-Bindungsdomäne

Dieser Begriff beschreibt jenen Teil eines Antikörpers, der den Bereich umfasst, der sich spezifisch an einen Teil oder ein gesamtes Antigen bindet und komplementär dazu ist. Bei großen Antigenen kann sich ein Antikörper nur ein einen bestimmten Teil des Antigens binden, und dieser Teil wird als Epitop bezeichnet. Eine Antikörper-Bindungsdomäne kann von einer oder mehreren variablen Antikörperdomänen bereitgestellt werden. Vorzugsweise umfasst eine Antigen-Bindungsdomäne eine variable Antikörper- Leichtketten-Region (VL) und eine variable Antikörper-Schwerketten-Region (VH).

Spezifisch

Dieser Begriff wird verwendet, um die Situation zu beschreiben, in der ein Element eines spezifischen Bindungspaares keine signifikante Bindung an andere Moleküle als seine(n) spezifischen Bindungspartner zeigt. Der Begriff ist auch anzuwenden, wenn z. B. eine Antigen-Bindungsdomäne für ein bestimmtes Epitop spezifisch ist, das von einer Anzahl von Antigenen getragen wird, in welchem Fall das spezifische Bindungselement, das die Antigen-Bindungsdomäne bildet, in der Lage ist, sich an die verschiedenen Antigene zu binden, die das Epitop tragen.

Fernktionell äquivalente Variantenform

Dieser Ausdruck bezeichnet ein Molekül (die Variante), die, obwohl sie strukturelle Unterschiede zu einem anderen Molekül (dem Ursprung) aufweist, gewisse signifikante Homologie und auch zumindest einen Teil der biologischen Funktion des Stamm-Moleküls beibehält, z. B. die Fähigkeit zur Bindung eines bestimmten Antigens oder Epitops. Varianten können in Form von Fragmenten, Derivaten oder Mutanten vorliegen. Eine Variante, ein Derivat oder eine Mutante kann durch Modifikation des Stamm-Moleküls durch Addition, Deletion, Substitution oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren oder durch Bindung eines anderen Moleküls erhalten werden. Diese Änderungen können auf Nukleotid- oder auf Protein-Ebene erfolgen. Beispielsweise kann das kodierte Polypeptid ein Fab-Fragment sein, das dann an einen Fc-Schwanz aus anderer Quelle gebunden wird. Alternativ dazu kann eine Markierung, wie z. B. ein Enzym, Fluorescein usw., angebunden werden.
Die vorliegende Erfindung stellt allgemein ein spezifisches Bindungselement (das ein Polypeptid umfasst) bereit, welches eine Human-Antikörper-Antigen-Bindungsdomäne umfasst, die für Human-CEA spezifisch ist.
Gemäß einem Aspekt weist die Bindungsdomäne eine Dissoziationskonstante für Human-CEA auf, die unter 1,0 · 10&supmin;&sup8; M, vorzugsweise unter 5,0 · 10&supmin;&sup9; M, liegt.
Ein spezifisches Bindungselement, das eine Human-Antikörper-Antigen-Bindungsdomäne umfasst, die für carcinoembryonales Human-Antigen spezifisch ist, worin die Bindungsdomäne eine Dissoziationskonstante für carcinoembryonales Human-Antigen aufweist, die unter 1,0 · 10&supmin;&sup8; M liegt, kann eine Bindungsdomäne umfassen, die eine Paarung aus VH- und VL-Domänen umfasst, die aus folgenden ausgewählt ist:
i) der VH-Domäne von CEA6, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(a) gezeigt wird, und der VL-Domäne von CEA6, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(b) gezeigt wird;
11) der VH-Domäne von CEA6, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(a) gezeigt wird, und einer VL-Domäne, die aus TO6D4, TOGD8 und TOGD12 ausgewählt ist, deren Aminosäuresequenzen in Fig. 4 gezeigt werden;
iii) der VL-Domäne von CEA6, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(b) gezeigt wird, und einer VH-Domäne, die aus TO6D10, HBA11, HBB11 und HBB6 ausgewählt ist, deren Aminosäuresequenzen in Fig. 2 gezeigt werden;
iv) jener von TO6D11, d. h. der VH-Domäne von TOGD10, deren Aminosäuresequenz in Fig. 2 gezeigt wird, und der VL-Domäne von TOGD12, deren Aminosäuresequenz in Fig. 4 gezeigt wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt bindet sich oder kreuzreagiert das spezifische Bindungselement nicht oder nicht signifikant an bzw. mit Human-Leberzellen, beispielsweise eine(r) Human-Leber-Zelllinie. Es kann schwache kreuzreaktive Bindung mit Human-Leberzellen vorliegen, mit der Maßgabe, dass sie im Vergleich zur Bindung an Human- CEA nicht signifikant ist. Daher kann das spezifische Bindungselement im Wesentlichen nicht-kreuzreaktiv mit Human-Leberzellen sein. Ebenso kann es sich nicht oder nicht signifikant an andere normale Gewebe oder Zellen, wie z. B. Gefäßendothel, Muskeln, Neutrophile, Erythrozyten oder Lymphozyten, binden. Das Fehlen von Reaktivität mit normalen Lymphozyten und Neutrophilen ist ein Indikator dafür, dass kein hohes Ausmaß an Kreuzreaktivität mit NCA vorliegt.
Ein spezifisches Bindungselement, das eine Human-Antikörper-Antigen-Bindungsdomäne umfasst, die für carcinoembryonales Human-Antigen spezifisch ist, worin die Bindungsdomäne im Wesentlichen nicht-kreuzreaktiv mit Human-Leberzellen ist, kann eine Paarung von VH- und VL-Domänen umfassen, die aus folgenden ausgewählt ist:
i) der VH-Domäne von CEA6, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(a) gezeigt wird, und einer VL-Domäne, die aus TOGD4 und TOGD12 ausgewählt ist, deren Aminosäuresequenzen in Fig. 4 gezeigt werden;
ii) der VL-Domäne von CEA6, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(b) gezeigt wird, und der VH-Domäne von TOGD10, deren Aminosäuresequenz in Fig. 2 gezeigt wird;
iii) jener von TOGD11, d. h. der VH-Domäne von TOGD10, deren Aminosäuresequenz in Fig. 2 gezeigt wird, und der VL-Domäne von TOGD12, deren Aminosäuresequenz in Fig. 4 gezeigt wird.
Das spezifische Bindungselement kann zellassoziiertes CEA oder lösliches CEA binden. Es kann sich bevorzugt an zellassoziiertes CEA binden.
Spezifische Bindungselemente, die eine Human-Antikörper-Antigen-Bindungsdomäne umfassen, die für carcinoembryonales Human-Antigen spezifisch ist, worin sich die Bindungsdomäne gegenüber löslichem carcinoembryonalem Human-Antigen bevorzugt an zellassoziiertes carcinoembryonales Human-Antigen bindet, können eine Paarung von VH- und VL-Domänen umfassen, die aus folgenden ausgewählt ist:
i) der VH-Domäne von CEA6, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(a) gezeigt wird, und der VL-Domäne von CEA6, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(b) gezeigt wird;
ii) der VH-Domäne von CEA6, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(a) gezeigt wird, und einer VL-Domäne, die aus TOGD4 und TOGD12 ausgewählt ist, deren Aminosäuresequenzen in Fig. 4 gezeigt werden;
iii) der VL-Domäne von CEA6, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(b) gezeigt wird, und einer VH-Domäne, die aus TO6D10 und HBB11 ausgewählt ist, deren Aminosäuresequenzen in Fig. 2 gezeigt werden;
iv) jener von TO6D11, d. h. der VH-Domäne von TO6D10, deren Aminosäuresequenz in Fig. 2 gezeigt wird, und der VL-Domäne von TO6D12, deren Aminosäuresequenz in Fig. 4 gezeigt wird.
Ein spezifisches Bindungselement gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist für ein Kohlenhydrat-Epitop von Human-CEA spezifisch. Beispiele sind spezifische Bindungselemente, welche die VH- und VL-Paarung von beliebigen Vertretern von CEA1, CEA2, CEA3, CEA4 und CEA5 umfassen, wobei die Aminosäuresequenzen ihrer VH-Domänen in Fig. 1(a) gezeigt werden und die Aminosäuresequenzen ihrer VL-Domänen in Fig. 1(b) gezeigt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein spezifisches Bindungselement bereit, das eine Human-Antikörper-Antigen-Bindungsdomäne umfasst, die sich vorzugsweise spezifisch an die extrazelluläre A3-B3-Domäne von Human-CEA bindet. Ein solches spezifisches Bindungselement kann eine Paarung von VH- und VL-Domänen umfassen, die aus folgenden ausgewählt ist:
i) der VH-Domäne von CEA6, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(a) gezeigt wird, und der VL-Domäne von CEA6, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(b) gezeigt wird;
ii) der VH-Domäne von CEA6, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(a) gezeigt wird, und einer VL-Domäne, die aus TO6D4, 106D8 und 106D12 ausgewählt ist, deren Aminosäuresequenzen in Fig. 4 gezeigt werden;
iii) der VL-Domäne von CEA6, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(b) gezeigt wird, und einer VH-Domäne, die aus HBA11, HBB11 und HBB6 ausgewählt ist, deren Aminosäuresequenzen in Fig. 2 gezeigt werden;
iv) jener von TO6D11, d. h. der VH-Domäne von TOGD10, deren Aminosäuresequenz in Fig. 2 gezeigt wird, und der VL-Domäne von TO6D12, deren Aminosäuresequenz in Fig. 4 gezeigt wird; und
v) der VH-Domäne von CEA6, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(a) gezeigt wird, und einer VL-Domäne, die aus LOB1C, LOE17 und LOSC2 ausgewählt ist, deren Aminosäuresequenzen in Fig. 3 gezeigt werden.
Das spezifische Bindungselement kann in Form eines Antikörperfragments, wie z. B. Einzelketten-Fv (scFv), vorliegen. Es können auch andere Typen von Antikörperfragmenten eingesetzt werden, wie z. B. Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Facb oder ein Diakörper (G. Winter und C. Milstein, Nature 349, 293-299 (1991); WO 94/13804). Das spezifische Bindungselement kann Form eines Gesamt-Antikörpers vorliegen. Der Gesamt-Antikörper kann in jeder beliebigen der Formen der Antikörper-Isotyp en, z. B. IgG, IgA, IgD, IgE und IgM, und jeder beliebigen der Formen der lsotyp-Unterklassen, z. B. IgG1 oder IgG4, vorliegen.
Das spezifische Bindungselement kann auch in Form eines durch Engineering erzeugten Antikörpers vorliegen, z. B. eines bispezifischen Antikörpermoleküls (oder eines Fragments, wie z. B. F(ab')2), das einen Antigen-Bindungsarm (d. h. eine spezifische Domäne) gegen CEA und einen anderen Arm gegen eine andere Spezifität aufweist, oder eines zweiwertigen oder mehrwertigen Moleküls.
Zusätzlich zu Antikörper-Sequenzen kann das spezifische Bindungselement andere Aminosäuren umfassen, z. B. solche, die ein Peptid oder Polypeptid bilden, oder solche, die dem Molekül zusätzlich zur Fähigkeit der Antigen-Bindung eine andere funktionelle Eigenschaft verleihen. Beispielsweise kann das spezifische Bindungselement einen Marker, ein Enzym oder ein Fragment davon usw. umfassen.
Die Bindungsdomäne kann einen Teil einer oder eine gesamte VH-Domäne umfassen, für die ein Keimlinien-Segment oder ein umgeordnetes Gensegment kodiert. Die Bindungsdomäne kann einen Teil einer oder eine gesamte VL-K-Domäne oder VL-X-Domäne umfassen.
Die Bindungsdomäne kann eine VH1-, VH3- oder VH4-Gensequenz einer der folgenden Keimlinien umfassen: der DP71-Keimlinie; der DP47-Keimlinie; der DP67-Keimlinie; der DP32 (evmlinie; der DP10-Keimlinie oder der DP14-Keimlinie; oder eine umgeordnete Form davon. Die "DP"-Nomenklatur wird von I. M. Tomlinson et al., J. Mol. Biol. 227, 77b-798 (1992), beschrieben.
Die Bindungsdomäne kann eine VI1-, VI3- oder Vk1-Gensequenz einer der folgenden Keimlinien umfassen: der Keimlinie DPLS; der DPL2-Keimlinie; der Keimlinie DPL16; der Keimlinie L12a; oder eine umgeordnete Form davon.
Für die Bindungsdomäne kann eine geänderte oder eine Variantenform eines Keimlinien-Gens mit einer oder mehreren Nukleotidänderungen (Addition, Deletion, Substitution und/oder Insertion) kodieren, z. B. etwa oder weniger als etwa 25, 20, 15, 10 oder 5 Änderungen, 4, 3, 2 oder 1, die in einem oder mehreren Rahmen und/oder CDRs vorliegen können.
Die Bindungsdomäne kann einen Teil einer oder eine gesamte VH-Domäne mit jeder in Fig. 1(a) gezeigten Aminosäuresequenz oder eine funktionell äquivalente Variantenform dieser Aminosäuresequenz umfassen.
Insbesondere kann die Bindungsdomäne eine oder mehrere CDRs (Komplementarität bestimmende Regionen) mit einer Aminosäuresequenz umfassen, die in Fig. 1(a) als CDR1, CDR2 oder CDR3 identifziert ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Bindungsdomäne eine in Fig. 1(a) gezeigte CDR3-Sequenz. Funktionell äquivalente Variantenformen der CDRs fallen in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, insbesondere Varianten, die sich von den dargestellten CDR-Sequenzen durch Addition, Deletion, Substitution oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren unterscheiden und die die Fähigkeit, CEA zu binden, und gegebenenfalls eine oder mehrere der bevorzugten Eigenschaften für spezifische Bindungselemente der vorliegenden Erfindung, wie in vorliegender Anmeldung geoffenbart, beibehalten. Besonders bevorzugte Variantensequenzen von CEA6 VH werden in Fig. 2 gezeigt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein spezifisches Bindungselement ene in Fig. 2 gezeigte CDR3-Sequenz (oder eine funktionell äquivalente Variantenform davon). Das spezifische Bindungselement kann die gesamten oder einen Teil der Rahmenregionen umfassen, die in Fig. 2 flankierend und zwischen den CDRs gezeigt werden, oder andere Rahmenregionen, einschließlich modifizierter Versionen der dargestellten. Wenn (zum Beispiel) eine der CDR3-Sequenzen von "HBA11" und "HBB11" (Fig. 2) eingesetzt wird, kann das spezifische Bindungselement einen Arginin- (R-) Rest in der angegebenen Position (Fig. 2) umfassen, gleichgültig, welche Rahmenregion eingesetzt wird.
Die Bindungsdomäne kann einen Teil einer oder eine gesamte VL-Domäne mit jeder in Fig. 1(b) gezeigten Aminosäuresequenz oder eine funktionell äquivalente Variantenform dieser Aminosäuresequenz umfassen.
Insbesondere kann die Bindungsdomäne eine oder mehrere CDRs (Komplementarität bestimmende Regionen) mit einer in Fig. 1(b) als CDR1, CDR2 oder CDR3 identifizierten Aminosäuresequenz umfassen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Bindungsdomäne eine in Fig. 1(b) gezeigte CDR3-Sequenz. Funktionell äquivalente Variantenformen der CDRs fallen auch in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, insbesondere Varianten, die sich von den dargestellten CDR-Sequenzen durch Addition, Deletion, Substitution oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren unterscheiden und die die Fähigkeit, CEA zu binden, und gegebenenfalls eine oder mehrere der bevorzugten Eigenschaften für spezifische Bindungselemente der vorliegenden Erfindung, wie hierin geoffenbart, beibehalten. Besonders bevorzugte Variantensequenzen von CEA6 VL werden in Fig. 3 und Fig. 4 gezeigt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein spezifisches Bindungselement eine in Fig. 3 oder Fig. 4 gezeigte CDR3-Sequenz (oder eine funktionell äquivalente Variantenform davon). Das spezifische Bindungselement kann die gesamten oder einen Teil der Rahmenregionen umfassen, die in Fig. 3 und Fig. 4 als flankierend und zwischen den CDRs gezeigt werden, oder andere Rahmenregionen, einschließlich modifizierter Versionen der dargestellten. Bevorzugte Rahmenmodifikationen werden in Fig. 4 gezeigt, und diese modifizierten Rahmenregionen können mit einer oder m ireren der in Fig. 4 gezeigten CDR-Sequenzen von "TO6D4", "TO6D8" oder "TÖGD12" verwendet werden oder nicht (ihre Verwendung ist aber bevorzugt).
Sogenannte "CDR-Transplantation" ("CDR-grafting"), bei der eine oder mehrere CDR-Sequenzen eines ersten Antikörpers in einem Rahmen von Sequenzen angeordnet wird bzw. werden, der nicht von diesem Antikörper stammt, z. B. von einem anderen Antikörper, wird in der EP-B-0.239.400 geoffenbart, zu der ein äquivalentes US-Patent existiert.
Bestimmte Varianten-VL- oder -VH-Domänen können eine oder mehrere Aminosäureänderungen (Addition, Deletion, Substitution und/oder Insertion) umfassen, möglicherweise weniger als etwa 20 Änderungen, weniger als etwa 15 Änderungen, weniger als etwa 10 Änderungen oder weniger als etwa 5 Änderungen, 4, 3, 2 oder 1, in jeder spezifischen hierin dargelegten Sequenz. Änderungen können in einer oder mehreren Rahmenregionen und/oder einer oder mehreren CDRs vorgenommen werden.
Spezielle VH- und VL-Varianten gemäß vorliegender Erfindung sind folgende: eine VH- Domäne, welche die in Fig. 1(a) für CEA2 VH gezeigte Sequenz umfasst, mit Ausnahme der Deletion von Ser53 in der dargestellten Sequenz; eine VH-Domäne, welche die in Fig. 1(a) für CEA3 VH gezeigte Sequenz umfasst, mit Ausnahme der Deletion von Gly53 in der dargestellten Sequenz; eine VL-Domäne, welche die in Fig. 1(b) für CEA6 gezeigte Sequenz umfasst, mit Ausnahme der Substitution von ThrlO durch Serin (für die ACC an Codon 10 in der zugrundeliegenden Kodiersequenz kodieren kann) in der dargestellten Sequenz; eine VL-Domäne, welche die in Fig. 2 jeweils für CEA6, TO6D10, HBA11, HBB11 und HBB6 gezeigte VL-Sequenz umfasst, mit Ausnahme der Substitution von GInS durch Val und AlaGIuVal an den Resten 9 bis 11 durch GluAlaLeu in der dargestellten Sequenz; eine VL-Domäne, welche die in Fig. 3 oder Fig. 4 jeweils für CEA6, LOB1C, LOE17, LOSC2 TO6D4, TO6D8 und TO6D12 gezeigte Sequenz umfasst, mit Ausnahme der Substitution von Leu33 durch Met in der dargestellten Sequenz; sowie Aminosäuresequenzvarianten der obigen Variaten mit den angegebenen Änderungen gegenüber den dargestellten Sequenzen.
Ein spezifisches Bindungselement gemäß vorliegender Erfindung kann eines sein, das mit einem beliebigen spezifischen Bindungselement, das sich an CEA bindet und einen Teil einer oder eine gesamte der in Fig. 1(a), Fig. 1(b), Fig. 2, Fig. 3 und Fig. 4 gezeigten Sequenzen umfasst, um die Bindung an CEA konkurriert, insbesondere ein beliebiges spezifisches Bindungselement, dessen Sequenz spezifisch hierill geoffenbart ist, einschließlich Varianten davon. Beispielsweise kann ein solches spezifisches Bindungselement mit TO6D11 oder CEA6 um bevorzugte Bindung an die A3-B3-Domäne von CEA konkurrieren oder mit CEA1 um die Bindung an ein Kohlenhydrat-Epitop von CEA konkurrieren. Konkurrenz zwischen Bindungselementen kann in vitro leicht getestet werden, beispielsweise durch Markieren eines Bindungselements mit einem spezifischen Reportermolekül, das in Gegenwart eines oder mehrerer anderer Bindungselemente ohne Markierung detektiert werden kann, um die Identifizierung spezifischer Bindungselemente zu ermöglichen, die sich an das gleiche Epitop oder ein überlappendes Epitop binden.
Gemäß einem Aspekt bindet ein spezifisches Bindungselement gemäß vorliegender Erfindung ein Peptid, das die Aminosäuresequenz
(i) Pro Ala Ala Tyr Leu Trp Trp Val Asp Ser oder
(ii) Pro Pro Ala Tyr Leu Tyr Trp Arg Ser Ser
umfasst. (CEA6 ist eine Ausführungsform eines solchen spezifischen Bindungselements.) Beim diesbezüglichen Testen kann ein Peptid mit dieser Sequenz plus einer oder mehreren Aminosäuren am Ende, beispielsweise CGG am N-Terminus, verwendet werden.
Spezifische Bindungselemente gemäß vorliegender Erfindung können so beschaffen sein, dass ihre Bindung an CEA durch ein Peptid mit oder einschließlich einer der Sequenzen (1) oder (11) gehemmt wird. Beim diesbezüglichen Testen kann ein Peptid mit einer Sequenz plus einer oder mehreren Aminosäuren, wie z. B. CGG am N-Terminus, verwendet werden.
Spezifische Bindungselemente, die eines der Peptide (i) und (ii) binden, können beispielsweise durch Panning mit dem/den Peptid(en) aus einer Phagen-Display-Bibliothek isoliert werden.
Spezifische Bindungselemente gemäß vorliegender Erfindung können in isolierter und/ oder gereinigter Form bereitgestellt werden.
Die vorliegende Erfindung sieht die Verwendung eines spezifischen Bindungselements, wie oben beschrieben, zum Einsatz als Diagnosereagens für Krebsformen beim Menschen, z. B. Kolon-, Lungen-, oder Brust-Adenokarzinom, vor.
Das spezifsiche Bindungselement für CEA kann als Abbildungsmittel eingesetzt werden, das dazu dienen kann, die Gegenwart und die Position von CEA exprimierenden Tumoren spezifisch anzuzeigen. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart einer/eines CEA exprimierenden Zelle oder Tumors bereit, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen von Zellen mit einem bereitgestellten spezifischen Bindungselement und das Bestimmen der Bindung des spezifischen Bindungselements an die Zellen umfasst. Das Verfahren kann in vivo oder in vitro an einer Testprobe von aus dem Körper entnommenen Zellen durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, welches das Herbeiführen oder Ermöglichen von Bindung eines gemäß vorliegender Erfindung erzeugten spezifischen Bindungselements an Human-CEA umfasst. Derartige Bindung kann in vitro oder in vivo stattfinden. Wenn die Bindung in vivo erfolgt, kann das Verfahren die Verabreichung des spezifischen Bindungselements an ein Säugetier, ein oder mehrere Individuen, umfassen. Wie anhand von Versuchen gemäß vorliegender Erfindung gezeigt binden spezifische Bindungselemente gemäß vorliegender Erfindung Human-CEA auf xenotransplantierten Tumoren in Mäusen, was ein nützliches Versuchsmodell für die Untersuchung zu Forschungs- und Entwicklungszwecken der spezifischen Bindungselemente und ihrer Eigenschaften darstellt.
Die Reaktivität von Antikörpern auf eine Zellprobe kann auf beliebige geeignete Weise ermittelt werden. Markieren mit einzelnen Reportermolekülen ist eine Möglichkeit. Die Reportermoleküle können direkt oder indirekt nachweisbare und vorzugsweise messbare Signale erzeugen. Die Bindung von Reportermolekülen kann direkt oder indirekt, kovalent, z. B. über eine Peptidbindung, oder nicht-kovalent erfolgen. Bindung über eine Peptidbindung kann als Ergebnis rekombinanter Expression einer Genfusion erfolgen, die für Antikörper und Reportermolekül kodiert.
Eine bevorzugte Art ist die durch kovalente Bindung jedes Antikörpers mit einem einzelnen Fluorochrom, Phosphor- oder Laserfarbstoff mit spektral isolierter Absorptions- oder Emissionscharakteristik. Geeignete Fluorochrome sind Fluorescein, Rhodamin, Phycoerythrin und Texasrot. Zu den geeigneten chromogenen Farbstoffen zählt Diaminobenzidin.
Andere Reporter umfassen makromolekulare kolloidale Teilchen oder Teilchenmaterial, wie z. B. Latexperlen, die gefärbt, magnetisch oder paramagnetisch sind, und biologisch oder chemisch aktive Mittel, die direkt oder indirekt detektierbare Signale erzeugen können, die visuell zu beobachten, elektronisch zu detektieren oder auf andere Weise aufzuzeichnen sind. Diese Moleküle können beispielsweise Enzyme sein, die Reaktionen katalysieren, die Farben entwickeln oder verändern, oder Veränderungen in den elektrischen Eigenschaften hervorrufen. Sie können molekular anregbar sein, so dass Elektronenübergänge zwischen Energiezuständen zu charakteristischen Spektralabsorptionen oder -emissionen führen. Sie können chemische Einheiten umfassen, die in Verbindung mit Biosensoren verwendet werden. Es können Biotin/Avidin- oder Biotin/Streptavidin- und Alkalische Phosphatase-Detektionssysteme eingesetzt werden.
Die Art des Bestimmens von Bindung ist kein Merkmal der vorliegenden Erfindung, und Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung sind in der Lage, nach eigener Präferenz und gemeinem Wissen eine geeignete Art zu wählen.
Die durch einzelne Antikörper-Reporter-Konjugate erzeugten Signale können dazu dienen, quantifizierbare absolute oder relative Daten der relevanten Antikörper-Bindung in (normalen und Test-) Zellproben zu erhalten. Außerdem kann ein allgemeine Kernfärbung, wie z. B. Propidiumiodid, verwendet werden, um die Gesamt-Zellpopulation in einer Probe zu zählen, was den Erhalt von Mengenverhältnissen einzelner Zellpopulationen in Bezug auf die Gesamtheit der Zellen ermöglicht. Wenn ein Radionukleotid wie z. B. ¹²&sup5;I, ¹¹¹In oder 99mTc an einen Antikörper gebunden ist, kann, wenn dieser Antikörper gegenüber normalem Gewebe bevorzugt in Tumorgewebe lokalisiert wird, die Gegenwart der Radiomarkierung in Tumorgewebe unter Einsatz einer Gamma-Kamera detektiert und quantifiziert werden. Die Qualität des erhaltenen Tumorabbilds steht in direkter Korrelation zum Signal : Rauschen-Verhältnis. Ein Überblick über Krebs-Abbildung mit CEA-Antikörpern ist D. M. Goldenberg, s. o., zu entnehmen.
Die experimentelle Verwendung von ¹²&sup5;I und 99mTc ist hierin als Beispiel angeführt.
Die vorliegende Erfindung sieht auch die Verwendung eines spezifischen Bindungselements, wie oben beschrieben, zum Einsatz als therapeutisches Reagens vor, beispielsweise wenn es gekoppelt, gebunden oder durch Engineering als Fusionsprotein hergestellt ist, um Effektorfunktion aufzuweisen. Ein spezifisches Bindungselement gemäß vorliegender Erfindung kann verwendet werden, um ein Toxin, Radioaktivität, T-Zellen, Killerzellen oder andere Moleküle auf einen CEA exprimierenden Tumor abzuzielen.
Demgemäß sehen weitere Aspekte der Erfindung Behandlungsverfahren, welche die Verabreichung eines bereitgestellten spezifischen Bindungselements, pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein solches spezifisches Bindungselement umfassen, sowie die Verwendung eines solchen spezifischen Bindungselements zur Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung vor, beispielsweise in einem Verfahren zur Herstellung eines Medikaments oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung welches das Formulieren des spezifischen Bindungselements mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten umfasst.
Gemäß vorliegender Erfindung können die bereitgestellten Zusammensetzungen an Individuen verabreicht werden. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise in einer "therapeutisch wirksamen Menge", wobei es sich um eine solche handelt, die ausreicht, um für einen Patienten von Vorteil zu sein. Ein derartiger Vorteil kann zumindest eine Erleichterung zumindest eines Symptoms sein. Die tatsächliche Verabreichungsmenge sowie die Rate und der Zeitverlauf der Verabreichung hängen von der Art und Schwere der behandelten Affektion ab. Die Behandlungsverschreibung, z. B. Entscheidungen bezüglich Dosierung usw., liegt in der Verantwortung des praktischen Arztes und anderer Ärzte. Geeignete Antikörperdosen sind nach dem Stand der Technik bekannt; siehe J. A. Ledermann et al., Int. J. Cancer 47, 659-664 (1991); K. D. Bagshawe et al., Antibody, immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4, 915-922 (1991).
Eine Zusammensetzung kann allein oder in Kombination mit anderen Behandlungen verabreicht werden, entweder gleichzeitig oder nacheinander, je nach der zu behandelnden Affektion.
Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung und zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung können zusätzlich zum Wirkbestandteil einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, Träger, Puffer, Stabilisator oder andere Materialien umfassen, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind. Derartige Materialien sollten nicht-toxisch sein und sollten die Wirksamkeit des Wirkbestandteils nicht beeinträchtigen. Die genaue Beschaffenheit des Trägers oder anderen Materials hängt vom Weg der Verabreichung ab, die oral oder durch Injektion, z. B. intravenös, erfolgen kann.
Pharmazeutische Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung können in Tabletten-, Kapsel-, Pulver- oder flüssiger Form vorliegen. Eine Tablette kann einen festen Träger, wie z. B. Gelatine, oder ein Adjuvans umfassen. Flüssige pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen allgemein einen flüssigen Träger, wie z. B. Wasser, Petroleum, Tier- oder Pflanzenöle, Mineralöl oder Syntheseöl. Physiologische Salzlösung, Dextrose oder eine andere Zuckerlösung oder Glykole, wie z. B. Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol, können auch enthalten sein.
Zur intravenösen Injektion oder Injektion am Erkrankungsort liegt der Wirkbestandteil in Form einer parenteral annehmbaren wässrigen Lösung vor, die Pyrogen-frei ist und geeignete(n) pH, Isotonie und Stabilität aufweist. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung sind in der Lage, geeignete Lösungen herzustellen, wobei beispielsweise isotonische Vehikel, wie z. B. Natriumchlorid-Injektionslösung, "Ringers"-Injektionslösung oder "Lactated Ringers"-Injektionslösung, verwendet werden. Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Puffer, Oxidationshemmer und/oder andere Additive können gegebenenfalls auch enthalten sein.
Ein spezifisches Bindungselement gemäß vorliegender Erfindung kann durch Expression aus dafür kodierender Nukleinsäure hergestellt werden. Nukleinsäure, die für ein beliebiges bereitgestelltes spezifisches Bindungselement kodiert, bildet selbst einen Aspekt der vorliegenden Erfindung, ebenso wie ein Verfahren zur Herstellung des spezifischen Bindungselements, wobei das Verfahren die Expression aus dafür kodierender Nukleinsäure umfasst. Die Expression kann geeigneterweise erzielt werden, indem unter geeigneten Bedingungen rekombinante Wirtszellen kultiviert werden, welche die Nukleinsäure enthalten. Nach der Produktion durch Expression kann ein spezifisches Bindungselement unter Einsatz geeigneter Techniken isoliert und/oder gereinigt werden, und dann entprechend verwendet werden, z. B. zur Formulierung einer Zusammensetzung, die zumindest eine andere Komponente umfassen kann.
Die Nukleinsäure kann für jede der in Fig. 1(a) und Fig. 1(b) gezeigten Aminosäuresequenzen oder jede funktionell äquivalente Form kodieren. Die verwendeten Nukleotidsequenzen können beliebige der in Fig. 1(a) oder Fig. 1(b) gezeigten sein, oder können eine Variante, ein Allel oder ein Derivat davon sein. Änderungen können auf Nukleotid- Ebene durch Addition, Substitution, Deletion oder Insertion eines oder mehrerer Nukleotide vorgenommen werden, wobei sich die Änderungen je nach Degeneration des genetischen Codes auf Aminosäure-Ebene widerspiegeln können oder nicht.
Systeme zum Klonieren und Exprimieren eines Polypeptids in einer Vielzahl unterschiedlicher Wirtszellen sind allgemein bekannt. Geeignete Wirtszellen sind Bakterien, Säugetierzelien, Hefe- und Baculovirus-Systeme. Säugetier-Zelllinien, die gemäß dem Stand der Technik zur Expression eines heterologen Polypeptids verfügbar sind, umfassen China-Hamster-Eierstockzellen, HeLa-Zellen, Babyhamster-Nierenzellen und viele andere. Ein üblicher bevorzugter bakterieller Wirt ist E. coli.
Die Expression von Antikörpern und Antikörper-Fragmenten in prokaryotischen Zellen, wie z. B. E. coli, ist nach dem Stand der Technik allgemein bekannt. Ein Überblick ist beispielsweise A. Plückthun, Bio/Technology 9, 545-551(1991), zu entnehmen. Die Expression in eukaryotischen Zellen in Kultur steht Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ebenfalls als Option zur Produktion eines spezifischen Bindungselements zur Verfügung, bezüglich neuerer Überblicke siehe beispielsweise M. E. Reff, Curr. Opinion Biotech. 4, 573-576 (1993); J. J. Trill et al., Curr. Opinion Biotech. 6, 553-560 (1995).
Es können geeignete Vektoren gewählt oder konstruiert werden, die entsprechende Regulierungssequenzen enthalten, einschließlich Promotorsequenzen, Terminatorsequenzen, Polyadenylierungssequenzen, Enhancersequenzen, Markergenen und andere Sequenzen nach Maßgabe. Vektoren können nach Maßgabe Plasmide, viral, z. B. Phagen, oder Phagemide sein. Weitere Details siehe beispielsweise "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Aufl., Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Viele bekannte Techniken und Vorschriften für die Manipulation von Nukleinsäure, beispielsweise bei der Herstellung von Nukleinsäurekonstrukten, Mutagenese, Sequenzierung, Einbringung von DNA in Zellen und Genexpression sowie Analyse von Proteinen werden im Detail b "Short Protocols in Molecular Biology", 2. Aufl., Ausubel et al. (Hrsg.), John Wiley & Sons, 1992, beschrieben. Die Offenbarungen von Sambrook et al. und Ausubel et al. sind durch Verweis hierin aufgenommen.
Somit stellt ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Wirtszelle bereit, die Nukleinsäure wie hierin geoffenbart enthält. Wieder ein anderer Aspekt stellt ein Verfahren bereit, welches das Einführen einer solchen Nukleinsaure in eine Wirtszelle umfasst. Zur Einführung kann jede beliebige verfügbare Technik eingesetzt werden. Für eukaryotische Zellen geeignete Techniken sind Kalziumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran, Elektroporation, Liposom-vermittelte Transfektion und Transduktion unter Verwendung von Retrovirus oder eines anderen Virus, z. B. Vaccinia oder - bei Insektenzellen - Baculovirus. Bei bakteriellen Zellen können geeignete Techniken Kalziumchlorid-Transformation, Elektroporation und Transfektion unter Einsatz von Bakteriophagen sein.
Dem Einführen kann das Herbeiführen oder Ermöglichen von Expression aus der Nukleinsäure, z. B. durch Kultivierung von Wirtszellen unter Bedingungen zur Expression des Gens, folgen.
Gemäß einer Ausführungsform wird die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung in das Genom (z. B. Chromosom) der Wirtszelle integriert. Die Integration kann nach Standardtechniken durch Einschluss von Sequenzen erfolgen, welche die Rekombination mit dem Genom fördern.
Nach der Produktion eines spezifischen Bindungselements kann selbiges beispielsweise auf jede der hierin geoffenbarten Arten verwendet werden, etwa zur Formulierung einer Zusammensetzung, wie z. B. eines Pharmazeutikums, oder eines Diagnoseprodukts, wie z. B. eines Sets, das zusätzlich zum spezifischen Bindungselement ein oder mehrere Reagenzien umfasst, um die Bindung des Elements an Zellen zu bestimmen, wie bereits erörtert.
Weitere Aspekte der Erfindung und Ausführungsformen sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung klar. Zum vollständigen Verständnis der vorliegenden Erfindung werden zur Veranschaulichung, nicht jedoch als Einschränkung, die folgenden Beispiele angeführt. Es wird auf die folgenden Figuren Bezug genommen:
Fig. 1 zeigt Nukleotid- und Aminosäuresequenzen der VH-Gene (Fig. 1a) und der VL- Gene (Fig. 1b) von Antikörpern, die für CEA spezifisch sind.
Fig. 1(a): Sequenz-Ausrichtung von CEA spezifischen scFvs, die von einer nichtimmunisierten Human-Bibliothek stammen. Der obere Teil der Figur zeigt die Aminosäuresequenzen der VH-Gene der Klone CEA1 → 7 inklusive; der untere Teil zeigt die Nukleotidsequenz derselben Klone. CDR = Komplementarität bestimmende Region.
Fig. 1(b). Sequenz-Ausrichtung von CEA spezifischen scFvs, die von einer nichtimmunisierten Human-Bibliothek stammen. Der obere Teil der Figur zeigt die Aminosäuresequenzen der VL-Gene der Klone CEA1 → 7 inklusive; der untere Teil zeigt die Nukleotidsequenzen derselben Klone. Identische Sequenzen unterschiedlicher Klone sind durch Punkte angegeben.
Fig. 2 zeigt die Sequenzen von Klonen, die durch Mutagenese von VH CDR3 von CEA6 abgeleitet wurden. Ausgerichtete Aminosäuresequenzen der VH-Gene von CEA6 und vier Klonen, die durch Mutagenese der Schwerketten-CDR3 abgeleitet wurden. Identische Sequenzen unterschiedlicher Klone sind durch Punkte angegeben.
Fig. 3 zeigt die Sequenzen von Klonen, die durch Mutagenese von VL CDR3 von CEA6 abgeleitet wurden. Ausgerichtete Aminosäuresequenzen der VL-Gene von CEA6 und drei Klonen, die durch Mutagenese der Schwerketten-CDR3 abgeleitet wurden. Identische Sequenzen unterschiedlicher Klone sind durch Punkte angegeben.
Fig. 4 zeigt ausgerichte Aminosäuresequenzen des VL-Gens von CEA6 und jene von drei Klonen, die durch Leichtketten-Shuffling abgeleitet wurden. Identische Sequenzen unterschiedlicher Klone sind durch Punkte angegeben.
Das am stärksten homologe Keimlinien-Gen jedes Klons ist:
CEA6 L12a
TOGD4 DPK9
TO6D8 DPK9
TOGD12 Hu102
Fig. 5 zeigt die Durchflusszytometrie-Analyse von CEA6 und einer Auswahl an von CEA6 abgeleiteten Klonen auf CEA exprimierenden HeLa-Zellen. Der obere Teil (Fig. 5a) zeigt die Hintergrund-Bindung des detektierenden Antikörpers 9E10 (ohne zugesetztes scFv) an die CEA exprimierenden Zellen. Alle CEA spezifischen Klone zeigen eine etwa 10fache Verschiebung der Anzahl an fluoreszierenden Zellen (x-Achse), so dass sie Anti-CEA-scFv-Bindung an diese Zellen zeigen. (Fig. 5a - negativer Vergleich; Fig. 5b - TO6D4; Fig. 5c - TO6D12; Fig. 5d - HBB11; Fig. 5e - TO6D11; Fig. 5f - TO6D10; Fig. 5g - CEA6)
Fig. 6 zeigt die Durchflusszytometrie-Analyse von cEA6 und einer Auswahl an von CEA6 abgeleiteten Klonen auf CEA exprimierenden HeLa-Zellen, gemessen in Gegenwart von freiem CEA in Konzentrationen von 0,01 bis 1 ug/ml. Die Figur zeigt, dass freies CEA nicht in der Lage ist, Anti-CEA-scFvs von den CEA exprimierenden HeLa-Zellen zu verdrängen. Im Gegensatz dazu wird ein Vergleichs-Antikörper (MFE) von den Zellen bei einer Konzentration von 1 ug/ml freier CEA verdrängt. FSG1 = negativer Vergleich. MFI = mittlere Fluoreszenzintensität.
Fig. 7 zeigt die Durchflusszytometrie-Analyse von CEAG und einer Auswahl an von CEA6 abgeleiteten Klonen auf CEA-negativen Chang-Menschenleber-Zellen. Das obere Diagramm (Fig. 7a) zeigt, dass sich eine Komponente von CEAG an die Leberzellen bindet, während sich TOGD4 (Fig. 7b), TO6D12 (Fig. 7c), TOGD11 (Fig. 7e), TO6D10 (Fig. 7f) und FSG1 (Fig. 7g; eine nicht verwandter, nicht-CEA-spezifischer, scFv-negativer Vergleich) nicht auf die gleiche Weise binden. HBB11 (Fig. 7d) zeigt eine gewisse Kreuzreaktivität mit den Leberzellen, wie durch den breiteren Peak fluoreszierender Zellen gezeigt.
Fig. 8 zeigt Klonierungsstellen im Vektor pUC1 19MCH. Der Vektor basiert auf pUC119 und weist die folgenden Merkmaleauf: CAT-Leadersequenz (Hybrid-GenIII-pelB-Leader); einzigartige Ncol- und Sfil-5'-Klonierungsstellen; einzigartige Notl-3'-Klonierungsstelle; myc-Markierung (zur Detektion mit 9E10); einzelner Cysteinrest für stellenspezifische Markierung; Hexahistidin-Markierung für IMAC-Reinigung.
Fig. 9 zeigt Verhältnisse zwischen Gewebe und Blut (für verschiedene Gewebe) an 99mTechnetium-markiertem CEA6 scFv in einem Mäuse-Xenotransplantat-Modell von Human-Kolon-Adenokarzinom. Volle Balken sind Werte 3 h nach der Injektion, und schraffierte Balken sind Werte 24 h nach der Injektion. Nach 24 h beträgt das Verhältnis der aufgenommenen Radioaktivität im Tumor in Bezug auf jene im Blut etwa 3,0.
Fig. 10 zeigt die Bioverteilung (für verschiedene Gewebe) von 99mTechnetium-markiertem CEA6 3 und 24 h nach der Injektion im Mäuse-Xenotransplantat-Modell von Human-Kolon-Adenocarzinom. Volle Balken sind Werte 4 h nach der Injektion, und schraffierte Balken sind Werte 24 h nach der Injektion. Nach 24 h ist festzustellen, dass zwischen 2 und 3% der injizierten Dosis spezifisch im Tumor lokalisiert werden können.
Fig. 11 zeigt die Klonierungsstellen im Vektor uUC119EHIS. Der Vektor basiert auf uUC119 und weist die Folgenden Merkmale auf: einzigartige Klonierungsstellen (Sfil, Pstl, Xhol, Notl); E-Markierung zur Detektion mit Anti-E-Markierungsantikörpern (Pharmacia); Hexahistidin-Markierung zur IMAC-Reinigung.
Fig. 12: Fig. 12(a) zeigt die Nukleotidsequenzen einer Anzahl von VH-Gensegmenten;
Fig. 12(b) zeigt die Nukleotidsequenzen einer Anzahl von VL-Gensegmenten.
Fig. 13 zeigt die Ergebnisse von ELISA zur Bestimmung, ob CEA1, CEA2, CEA3, CEA4, CEA5 und CEA6 K1 PSA erkennen (O. D. bei 450 nm über CEA-Klon-Nr.).
Fig. 14 zeigt die Wirkung der Vorinkubation mit K1 oder CA-Polysialsäure (PSA) auf die Fähigkeit der Klone CEA1, CEA2, CEA3, CEA4, CEA5 und CCA6 sich an immobilisertes CEA zu binden, durch ELISA. 1 = Signal auf nativem CEA; 2 = Signal, wenn ScFv mit K1 vorinkubiert wird; 3 = Signal, wenn scFv mit CA vorinkubiert wird. (Fig. 14a - CEA1; Fig. 14b - CEA2; Fig. 14c - CEA3; Fig. 14d - CEA4, Fig. 14e - CEA5; Fig. 14f - CEA6.)
Fig. 15 zeigt die Bindungspezifität von ausgewählten Peptidphagen für verschiedene gereinigte scFv, aufgetragen als Absorptionsvermögen bei 490 nm und gemessen mittels ELISA.
Fig. 16 zeigt die Hemmung der Bindung von scFv CEA6 an CEA unter Einsatz von ausgewählten Peptidphagen. Die Ergebnisse sind als bei 405 nm gemessenes Absorptionsvermögen aufgetragen.
Fig. 17 zeigt den mittleren Prozentsatz der injizierten Dosis verschiedener ¹²&sup5;I-markierter scFv, lokalisiert in verschienenen Geweben 3 h, 6 h, 18 h und 24 h nach der Injektion.
Alle hierin genannten Dokumente sind durch Verweis hierin aufgenommen.

Liste der Beispiele

Beispiel 1 - Isolierung von für CEA spezifischen Antikörpern.
Beispiel 2 - Affinitätsbestimmung von scEv-Fragmenten, die sich an CEA binden.
Beispiel 3 - Demonstration der Bindung von Für CEA spezifischen Antikörpern an Zellassoziiertes CEA.
Beispiel 4 - Demonstration der Änderung der Spezifität von Anti-CEA-Antikörpern für eine Human-Leberzelllinie.
Beispiel 5 - Epitop-Kartierung von für CEA spezifischen Antikörpern.
Beispiel 6 - In vivo-Lokalisierung von für CEA spezifischen Antikörpern gegen Human- Kolon-Adenokarzinom-Xenotransplantate.
Beispiel 7 - Weitere Untersuchung der Domänenerkennung von CEA6 und TO6D11.
Beispiel 8 - Analyse der Bindungsspezifitäten von CEA1, CEA2, CEA3, CEA4 und CEA5.
Beispiel 9 - Immunozytochemie von CEA1, CEA2, CEA3, CEA4, CEA5, CEA6 und affinitätsgereifte Versionen von CEA6.
Beispiel 10 - Lokalisation von I¹²&sup5;-markierten Anti-CEA-Antikörpern gegen Human-Kolon-Adenokarzinom.
Beispiel 11 - Verfeinerung der Epitop-Kartierung von für CEA spezifischen Antikörpern.
Beispiel 12 - Analyse der Tumor-Aufnahme von für CEA spezifischem ¹²&sup5;I-markiertem scFv und dessen Verteilung in normalem Gewebe.

BEISPIEL 1 - ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON ANTIKÖRPERN GEGEN HUMAN-CEA DURCH SELEKTION EINES NICHT-IMMUNISIERTEN PHAGEN-ANTIKÖRPER-REPERTOIRES.

1. Identifikation und Charakterisierung von Antikörpern gegen Humar-CEA durch Selektion eines nicht-immunisierten Phagen-Antikörper-Repertoires

Antikörper-Repertoire

Es wurde das folgende Antikörper-Repertoire verwendet:
Große Einzelketten-Fv-Bibliothek, die von Lymphoidgeweben, einschließlich Mandeln, Knochenmark und Peripherblutlymphozyten, stammt.
Polyadenylierte RNA wurde aus den B-Zellen verschiedener Lymphoidgewebe von 43 nicht-immunisierten Spendern unter Einsatz des "Quickprep-mRNA"-Sets (Pharmacia) hergestellt. Erststrang-cDNA wurde aus mRNA unter Einsatz eines "Erststrang-cDNA- Synthese"-Sets (Pharmacia) unter Verwendung von statistischen Hexameren zum Primen der Snythese synthetisiert. V-Gene wurden unter Verwendung familienspezifischer Primer für VH-, Vk- und VI-Gene amplifiziert wie bereits beschrieben (Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991)) und daraufhin zusammen mit dem (Gly4, Ser)3-scFv-Linker durch PCR-Assemblierung rekombiniert. Die VH-Linker-VL-Antikörper-Konstrukte wurden in die Sfi I- und Not I-Stellen des Phagemidvektors pCANTAB 6 kloniert. Ligation, Elektroporation und Ausplattieren der Zellen erfolgten wie bereits beschrieben (Marks et al., s. o.). Die Bibliothek wurde etwa 1000 Mal so groß angelegt als damals beschrieben, indem die eingesetzten Mengen an Vektor und Insert vergrößert wurden und Mehrfach- Elektroporationen durchgeführt wurden. Dies erzeugte ein scFv-Repertoire, das Berechnungen zufolge etwa 6,0 · 10&sup9; einzelne Rekombinanten aufwies, von denen durch Bst NI-Fingerprinting gezeigt wurde, dass sie extrem vielfältig (divers) waren.

a. Induktion einer Phagen-Antikörper-Bibliothek

Das obige Phagen-Antikörper-Repertoire wurde aus Antikörpern gegen CEA selektiert. Das Repertoire wurde wie folgt behandelt, um Phagemidteilchen zu gewinnen 500 ml vorgewärmtes (37ºC) 2YTAG (2YT-Medium, ergänzt mit 10() ug/ml Ampicillin und 2% Glucose) in einem 21-Spitzkolben wurde mit etwa 3 · 10 Zellen aus einer Glycerin- Stamm-Kultur (-70ºC) der Bibliothek beimpft. Die Kultur wurde bei 37ºC unter guter Belüftung gezüchtet, bis die O. D. bei 600 nm 0,7 erreichte (etwa 2 h). M13K07-Helferphagen (Stratagene) wurden der Kultur bis zu einer Multiplizität der Infektion (MOI) von etwa 10 zugegeben (wobei angenommen wird, dass eine O. D. von 1 bei 600 nm 5 · 10&sup8; Zellen pro ml Kultur entspricht). Die Kultur wurde stationär bei 37ºC 15 min lang inkubiert, gefolgt von 45 min unter leichter Belüftung (200 U/min) bei derselben Temperatur. Die Kultur wurde zentrifugiert und der Übestand vom Zellpellet abgegossen. Die Zellen wurden in 500 ml 2YTAK (2YT-Medium, ergänzt mit 100 ug/ml Ampicillin und 50 ug/ml Kanamycin) resuspendiert und die Kultur über Nacht bei 30ºC unter guter Belüftung (300 U/min) inkubiert. Phagenteilchen wurden durch drei Polyethylenglykol- (PEG-) Fällungen gereinigt und konzentriert (J. Sanibrook, E. F. Fritsch, & T. Maniatis, "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour, New York (1990)) und in PBS mit 10¹² transduzierenden Einheiten (tE)/nil resuspendiert (Ampicillin-resistente Klone).

b. Panning der Phagen-Antikörper-Bibliothek auf CEA

Induzierte Phagen aus dem Repertoire wurden auf CEA gepannt. Ein Immunröhrchen mit 75 mm · 12 mm (Nung; Maxisorp) wurde mit 1 ml rekonibinantem Human-CEA (20 ug/ml; Genzyme) in PBS über Nacht bei 37ºC beschichtet. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurde das Röhrchen mit 3% MPBS (3% "Marvel"-Magermilchpulver, 1 · PBS) befüllt und 2 h lang bei 37ºC zum Blockieren inkubiert. Die Waschung wurde wiederholt, Phagemid-Teilchen (10¹³ tE) in 1 ml 3% MPBS wurden zugegeben und das Röhrchen stationär bei 37ºC 1 h lang inkubiert. Das Röhrchen wurde 20 Mal mit PBST (0,1 2¹/&sub4;), dann 20 Mal mit PBS gewaschen. Gebundene Phagenteilchen wurden aus dem Röhrchen eluiert, indem 1 ml 100 mM-Triethylamin zugegeben wurde, und das Röhrchen wurde stationär bei Raumtemperatur 10 min lang inkubiert. Das eluierte Material wurde sofort durch Pipettieren in ein Röhrchen neutralisiert, das 0,5 ml 1M-Tris.HCl (pH 7,4) enthielt. Die Phagen wurden bei 4ºC gelagert. 0, 77 ml der eluierten Phagen wurden eingesetzt, um 10 ml sich logarithmisch vermehrende E. coli TG1 (T.). Gibson, PhD-Dissertation, University of Cambridge, UK (1984)) zu infizieren. Infizierte Zellen wurden 1 h lang bei 37ºC unter leichter Belüftung in 2YT-Brühe gezüchtet und dann auf 2YTAG-Medium in 243 mm · 243 mm-Platten (Nung) ausplattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 30ºC inkubiert. Kolonien wurden von den Platten in 10 ml 2YT- Brühe abgeschabt und 15 Vol.-% Glycerin zugegeben, um sie bei - 70ºC zu lagern.
Glycerin-Stammkulturen aus der ersten Panning-Runde des Repertoires auf CEA wurden unter Einsatz von Helfer-Phagen gewonnen, um Phageniid-Teilchen für die zweite Panning-Runde zu erhalten. 250 ul Glycerin-Stammlösung wurde verwendet, um 50 ml 2YTAG-Brühe zu impfen, und in einem 250 ml-Spitzkolben bei 37ºC unter guter Belüftung beimpft, bis die O. D. bei 600 nm 0,7 erreichte (etwa 2 h). M13K07 Helfer-Phagen (MOI = 10) wurden der Kultur zugegeben, die dann stationär bei 37ºC 15 min lang inkubiert wurde, gefolgt von 45 min unter leichter Belüftung (200 U/min) bei derselben Temperatur. Die Kultur wurde zentrifugiert und der Überstand vom Zellpellet abgegossen. Die Zellen wurden in 50 ml vorgewärmten 2YTAK resuspendiert und die Kultur über Nacht bei 30ºC unter guter Belüftung inkubiert. Phagenteilchen wurden durch PEG-Fällung gereinigt und konzentriert (Sambrook et al., 1990) und in PBS mit 10¹³ tE/ml resuspendiert.
Induzierte Phagen aus der ersten Panning-Runde des Repertoires wurden ein zweites Mal selektiert wie oben beschrieben. Der Vorgang des Plagen-Züchtens und -Pannings wurde in einer dritten und vierten Selektionsrunde wiederholt.

c. Vermehrung einzelner selektierter Klone iür Immuntests

Einzelne Kolonien aus der dritten und vierten Selektionsrunde wurden eingesetzt, um 100 ul 2YTAG in einzelne Näpfe von 96 Napf-Gewehekullurllatten (Corning) zu impren. Die Platten wurden bei 30ºC über Nacht unter mäßigem Rütteln (200 U/min) inkubiert. Givcerin wurde jedem Napf bis 15% zugegeben und diese Master-Platten bei -70 C gelagert, bis sie zur Analyse bereit waren.

d. ELISA zum /cientüzieren von von -Nnti-CEA scFv

Für CEA spezifische Klone wurden den durch ELISA identifiziert, wobei auf Phagen freigelegtes scFv oder lösliches scFv eingesetzt wurde.

i. Phagen-ELISA

Zellen von den Master-Platten wurden eingesetzt, um Frische 96-Napf-Gewebekulturplatten zu beimpfen, die 100 ul 2YTAG pro Napfenthielten. Diese Platten wurden 6 bis 8 h lang bei 37ºC inkubiert, bis sich die Zellen in den Näpfen logarithmisch vermehrten (O. D.600 0,2-1,0). M13K07 wurde jedem Napf bis zu einer MOI von 10 zugegeben und stationär 15 min lang und dann 45 min lang unter leichtem Rütteln (100 U/min), jeweils bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden bei 2.000 U/min 10 min lang zentrifugiert und der Überstand entfernt. Jedes Zellpellet wurde in 100 ul 2YTAK resuspendiert und bei 30ºC über Nacht inkubiert.
Jede Platte wurde mit 2.000 U/min zentrifugiert und die 100 ul Überstand aus jedem Napfentnommen und in 20 ul 18%M6PBS (18% Magermilchpulver, 6 · PBS) stationär bei Raumtemperatur für 1 h blockiert. Unterdessen wurden flexible Mikrotiterplatten, die über Nacht stationär bei 37ºC entweder mit 100 ul 0,3 mg/ml CEA in PBS oder 100 ul PBS allein (was eine unbeschichtete Vergleichsplatte ergab) beschichtet worden waren, wurden dreimal in PBS gewaschen und für 2 h stationär bei Raumtemperatur in 3MPBS blockiert. Diese Platten wurden dann dreimal mit PBS gewaschen und 50 ul vorblockierte Phagen jedem Napf sowohl der CEA-beschichteten als auch der unbeschichteten Platte zugegeben. Die Platten wurden stationär bei 37ºC 1 h lang inkubiert, woraufhin die Phagen abgegossen wurden. Die Platten wurden durch dreimaliges Inkubieren für 2 min in PBST, gefolgt von dreimaligem Inkubieren für 2 min in PBS, jeweils bei Raumtemperatur, gewaschen.
Jedem Napf sowohl der CEA-beschichteten als auch der unbeschichteten Platte wurden 30 ul einer 1 : 10.000-Verdünnung Schafs-Anti-fd-Antikörper Pharmaciat in 3MPBS zugegebero die Platten bei 37 ~C stationär für 1 h inkubiert. vde Platte wurde wie oben beschrieben gewaschen und 30 ul einer 1 : 3.000-Verdünnung Esels-Anti-Schafs-Alkalische Phosphatase-Konjugat (Sigma) in 3MPBS zugegebell und stationär bei 37ºC 1 h lang inkubiert. Die Platten wurden wie oben beschrieben gevaschen, gefolgt von zwei Spülungen in 0,9% NaCl. Die Alkalische Phosphatase-Aktivität wurde entweder unter Einsatz des chromagenen Substrats pNPP (Sigma) oder des Ampak-Svtems (Dako) sichtbar gemacht. Das von jedem Klon erzeugte Absorptions-Signal wurde durch Messen der optischen Dichte lei entweder 403 nm (pNPP) oder 492 nm (Ampak) unter Einsatz eines Mikrotiterplatten-Lesegeräts bewertet. Klone wurden für die weitere Analyse ausgewählt, wenn das auf der CEA-beschichteten Platte erzeugte ELISA-Signal zumindest das Doppelte desjenigen auf der unbeschichteten Platte betrug.

ii. Lösungs-ELISA

Zellen von den Masterplatten wurden eingesetzt, u in frische 96 Napi-Gewebekulturplatten zu beimpfen, die 100 ul 2YTAG pro Napfenthielten. Diese Platten wurden für 8 h bei 30ºC inkubiert, dann bei 2.000 U/min 10 min lang zentrifugiert und der Überstand entfernt. Jedes Zellpellet wurde in 100 ul 2YTA resuspendiert, das 1 mM IPTG enthielt, und bei 30ºC über Nacht inkubiert.
Jede Platte wurde bei 2.000 U/min zentrifugiert, die 100 ul Überstand aus jedem Napf gewonnen und in 20 ul 18%MGPBS stationär bei Raumtemperatur 1 h lang blockiert. Unterdessen wurden flexible Mikrotiterplatten, die über Nacht stationär bei 37ºC entweder mit 100 ul 0,5 ug/ml CEA in PBS oder 100 ul PBS alleine blockiert worden waren, dreimal in PBS gewaschen und für 2 h stationär bei 37ºC in 3MPBS blockiert. Diese Platten wurden dann dreimal mit PBS gewaschen und 50 pl vorblockiertes lösliches scFv jedem Napfsovohl der CEA-beschichteten als auch der unbeschichteten Platte zugegeben. Die Platten wurden stationär bei 37ºC 1 h lang inkubiert, woraufhin die scFv- Lösungen abgegossen wurden. Die Platten wurden gewaschen, indem dreimal für 2 min in PBST inkubiert wurde, gefolgt von dreimaligem Inkubieren für 2 min in PBS, alles bei Raumtemperatur.
Jedem Napfsowohl der CEA-beschichteten als auch der unheschichteten Platte wurden 100 ul einer 1 : 200-Verdünnung des Anti-mvc-Markierung-Mäuse-Antikörpers 9E10 (S. Munro & H. R. B. Pelham, Cell 46, 291-300 (198 G)) in 3 MPBS zugegelen und die Platten bei 37 tC stationär für 1 h inkubiert. Jede Platte wurde wie oben beschrieben gewaschen und 100 ml einer 1 : 5000-Verdünnung Ziegen-Anti-Mäuse-Alkalische Phosphatase-Konjugat (Pierce) in 3MPBS zugegeben und stationär bei 37ºC 1 h lang inkubiert. Die Platten wurden wie oben beschrieben gewaschen, gefolgt von zwei Spülungen in 09 t NaCl. Die Alkalische Phosphatase-Aktivität wurde unter Einsatz des chromogenen Substrats pNPP (Sigma) sichtbar gemacht. Das von jedem Klon erzeugte Absorptions- Signal wurde durch Ntessen der optischen Dichte bei 405 nm (pNPP) unter Einsatz eines Mikrotiterplatten-Lesegeräts bewertet. Klone wurden für efie weitere Analyse ausgewählt, wenn das auf der CEA-beschichteten Platte erzeugte ELISA-Signal zumindest das Doppelte desjenigen auf der unbeschichteten Platte betrug.

iii. Spezifitäts-ELISA

Klone, die wie oben beschrieben als CEA besser als ein unbeschichteter Napf bindend identifiziert worden waren, wurden näher auf Spezifität untersucht. Es wurden Spezifitäts-ELISAs durchgeführt, bei denen entweder auf Phagen freigelegtes oder wie oben beschrieben in Lösung vorliegendes scFv eingesetzt wurde, mit der Ausnahme, dass 5 ml Medium in 50 ml Falcon-Röhrchen mit jedem Klon beimpft und gezüchtet wurden, um das Phagen- und lösliche scFv zu erzeugen, dass im ELISA eingesetzt wird. Mikrotiterplatten-Näpfe wurden mit 100 ul 0,5 ug/ml CEA, 10 ug/ml Rinderserumalbumin (BSA), 10 ug/ml Ovalbumin, 10 ug/ml Lysozym, 10 ug/ml Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) oder PBS (der unbeschichtete Napf) beschichtet. Nach dem Vorblockieren sowohl der Phagen (oder löslichen scFv) als auch der Mikrotiterplatten wurden 50 ul blockierte Phagen (oder lösliches scFv) von jedem Klon einem Napf, cler mit CEA, BSA, Ovalburnin, Lysozvm, KLH beschichtet war, oder einem unl> eschichteten Napfzugegebeui. Die oben wurde die Alkalische Phosphatase-Aktivirät unter Einsatz des chromogenen Substrats pNPP (Sigma) sichtbar gemacht. Klone wurden als für CEA spezifisch angesehen, wenn das im CEA-beschichteten Napferzeugte ELISA-Signal zumindest um das Fünffache stärker als das Signal eines der Testantigene oder eines unbeschichteten Napfs war.

e. Sequenzierung voll CEA-speziuischen ScFv-Anrikörpern

Die Nukleotidsequenzen der CEA spezifischen Antikörper wurden ermittelt, indem zunächst vektorspezifische Primer eingesetzt wurden, um die insertierte DNA von jedem Klon zu amplifizieren. Zellen von einer individuellen Kolonie auf einer 2YTAG-Agarplatte wurden als Templat für eine Polymerase-Kettenreaktions- (PCR-) Amplifikation der insertierten DNA unter Einsatz der Primer pUC19reverse und fdtetseq eingesetzt (Tabelle 1). Die Amplifikationsbedingungen bestanden in 30 Zyklen bei 94ºC für 1 min. 55 ºC für 1 min und 72ºC für 2 min. gefolgt von 10 min bei 72ºC. Die PCR-Produkte wurden unter Einsatz eines PCR-Cleanup-Sets (Promega) in ein Endvolumen von 50 ul H&sub2;O gereinigt. Zwischen 2 und 5 ul jedes Insertpräparats wurden als Templat zum Sequenzieren unter Einsatz des Taq-Dye-Terminatorzyklus-Sequenziersystems (Applied Biosystems) eingesetzt. Die Primer mycseq10 und PCR-L-Link wurden eingesetzt, um die Leichtkette jedes Klons zu sequenzieren, und PCR-H-Link und pUC19reverse, um die Schwerkette zu sequenzieren (Tabelle 1).

f. Sequerenz der anfänglichen CEA spezifischen ScFv-Antikörper

Sieben verschiedene CEA spezifische Antikörper wurden aus den Selektionen isoliert. Die Klonnamen und zugehörigen Schwer- und Leichtketten-Keimlinien sind jeweils nachstehend angeführt. Die vollständige Sequenz jedes VH- und VL-Domänen-Gens ist in Fig. 1(a) und (b) angeführt.

2. Äffinitätsreinifung der anfänglichen CEA spezifischen ScFv-Antikörper

a. CDR3-"Spickung" des CEA spezifischen ScFv-Antikörpers CEA6

i. Konstruktion eines VH CDR3-"gespickten" Repertoires

Zunächst wurde der mutagene 63-mer-Oligonukleotidprimer CEA6HCDOP synthetisiert (Tabelle 1). Dieser Primer ermöglichte das Spicken von 7 Resten der CEA6 VH CDR3 unter Einsatz einer nicht aufwendigen Mutagenesestrategie (Ballint und Larrick, Gene 137, 109-118 (1993)). Die CEA6-Schwerkette wurde durch PCR unter Einsatz der Primer LM83 und CEA6HCDOP amplifiziert. Die Amplifikationsbedingungen bestanden in 25 Zyklen bei 94ºC für 1 min. 55ºC für 1 min und 72ºC für 1 min. gefolgt von 10 min bei 72ºC. Das PCR-Produkt wurde auf einem 1%-Agarose-TAE-Gel aufgetrennt, die die amplifizierte VH darstellende Bande ausgeschnitten und unter Einsatz des Geneclean- Sets (Bio 101) aus dem Agarosegel eluiert.
Die Ausgangs-CEA6-Leichtkette wurde durch PCR unter Einsatz der Primer fdtetseq und CEA6JH (Tabelle 1) amplifiziert. Die Amplifikationsbedingungen bestanden in 25 Zyklen bei 94ºC für 1 min. 55ºC für 1 min und 72ºC für 1 min. gefolgt von 10 min bei 72ºC. Das PCR-Produkt wurde auf einem 1%-Agarose-TAE aufgetrennt, die die amplifizierte VL darstellende Bande ausgeschnitten und unter Einsatz des Geneclean-Sets (Bio 101) aus dem Agarosegel eluiert.
Etwa 50 ng amplifizierte "gespickte" CEA6-Schwerkette und 50 ng amplifizierte Ausgangs-CE,A6-Leichtkette wurden kombiniert. Dies wurde in einer Assemllierungsamplifikation nach Zugabe von Reaktionspuffer bis 1X, UNi Ps mit 200 nM und 5 Einheiten Taq-Polymerase eingesetzt. Die Amplifikationsbedingungen bestanden in 7 Zyklen bei 94 C für 1 min. 65 C für 4 min. 5 ul jeder Assemblterung wurden als Templat in einer "Durchzugs"-Amplifikation mit den Primern fdtetseg und LMB3 eingesetzt. Die Amplifikationsbedingungen bestanden in 25 Zyklen bei 94 C für I min. 35ºC für 2 min und 72ºC für 1 min. gefolgt von 10 min bei 72ºC.
Das Durchzugsamplifikations-Produkt wurde auf 1 %-Agarose-TAE aufgetrennt und die Bande, die die "gespickten" Durchzugs-VH -VL darstellte, ausgeschnitten und unter Einsatz des Geneclean-Sets eluiert. Dies wurde mit den Restriktionsendonukleasen Sfi I und Not I (NEB) gespalten und in den Phagemidvektor pCantab 6 Iigiert (Amersham-Ligationssystem), der zuvor mit Sfi I und Not I gespalten worden war. Das Ligationsprodukt wurde eingesetzt, um elektrokompetente TG1-Zellen zu transformieren, auf 2YTAG- Platten ausplattiert und über Nacht bei 30ºC inkubiert. Etwa 1,1 · 10&sup7; einzelne Klone wurden aus dieser "Spickung" der CEA6 VH CDR3 erzeugt.

ii. Selektion des CEAG VH CDR3-gespickten Repertoires

Das CEA6 VH CDR3-gespickte Repertoire wurde auf CEA-spezifischer Antikörper selektiert. Phagemidteilchen wurden aus dem Repertoire gewonnen wie zuvor für die anfängliche Bibliothek beschrieben. Gewonnene Phagen wurden für 1 h in einem Endvolumen von 100 ul 3MPBS vorblockiert. Etwa 10¹¹ tE Phagen wurden in der ersten Selektionsrunde eingesetzt, und zwischen 10&sup9; und 10¹&sup0; für nachfolgende Selektionen. Für die ersten Selektionsrunden wurde biotinyliertes CEA in einer Enndkonzentration von 10 nm den vorblockierten Phagen zugegeben und stationär bei 37ºC 1 h lang inkubiert. CEA wurde unter Einsatz von NHS-SS-Biotin (Pearce) gemäß den Angaben des Herstellers in einem Molverhältnis Biotin : CEA von 10 : 1 biotinvliert.
Für jede Selektion wurden 100 ul Dynabeads-Suspension (Dynal) aur einem Magneten getrennt, cfie Perlen gewonnen und für 2 h in 1 ml 3MPBS vorblockiert. Die Perlen wurden auf einem Magneten gewonnen, im Gemisch aus Phagemid und biotinyliertem CEA resuspendiert und bei Raumtemperatur für 15 min inkubiert, wobei sie kopfüber gedreht wurden. Die Perlen wurden auf einem Magneten festgehalten und dreimal mit PBST gewaschen, gefolgt von drei Waschungen in PBS. Nach jeder Waschung wurden die Perlen auf einem Magneten festgehalten und in der nächsten Waschlösung resuspendiert. Schließlich wurde die Hälfte der Perlen in 10 ul Dithiothreitol 50 mM DTT resuspendiert (die andere Hälfte der Perlen bei 4ºC als Reserve gelagert) und bei Raumtemperatur für 5 min inkubiert. Die gesamte Perlensuspension wurde dann verwendet, um 5 ml sich logarithmisch vermehrende TG1-Zellen zu infizieren. Dies wurde bei 37ºC stationär für 13 min und dann unter mäßigem Rütteln für 45 min inkubiert, auf 2YTAG-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30ºC inkubiert.
Kolonien wurden von den Platten in 10 ml 2YT-Brühe abgeschabt und 15 Vol.-% Glycerin zugegeben, um sie bei -70ºC zu lagern.

iii. Identifizierung von CEA-speziitschen ScFv-Antikörpern aus dem CEA6 VH-gespickten Repertoire

Für CEA spezifische ScFv-Antikörper wurden sowohl durch Phagen als auch durch Lösungs-ELISA identifiziert und sequenziert wie zuvor beschrieben. Es wurden vier neue CEA spezifische scFv-Antikörper identifiziert. Alle wiesen die bereits früher beschriebene CEA6-Leichtketten-Sequenz (L12a) und Veränderungen in einem oder mehreren der 7 angestrebten gespickten Reste der VH auf. Die Sequenzen sind in Fig. 2 angegeben.

iv. Konstruktion eines CEA6 VL/VH CDR3-"gespickten" Repertoires

Zunächst wurde der mutagene 65-mer-Oligonukleotidprimer CEAGLCDOP synthetisiert (Tabelle 1). Dieser Primer ermöglichte das Spicken von 4 Resten der CEAG VL CDR3 unter Einsatz einer nicht aufwendigen Mutagenesestrategie (Ballint und Larrick, s. o.). Die CEAG-Leichtkette wurde durch PCR unter Einsatz der Primer (ZEAG)H und CEA6LCDOP ampliriziert. Die Amplrfikationsbedingungen bestanden in 25 Zyklen bei 94ºC für 1 min. 55ºC für 1 min und 72ºC für 1 min. gefolgt von 10 min bei 72ºC. Das PCR-Produkt wurde auf einem 1%-Agarose-TAE-Gel aufgetrennt, die die amplifizierte VH darstellende Bande ausgeschnitten und unter Einsatz des Geneclean-Sets (Bio 101) aus dem Agarosegel eluiert.
Eine Population von von CEA6 abgeleiteten Schwerketten aus der oben beschriebenen 10 nM Biotin-CEA-Selektion wurde durch PCR unter Einsatz der Primer PCRHLINK und LMB3 amplifiziert (Tabelle 1). Die Amplifikationsbedingungen bestanden in 25 Zyklen bei 94ºC für 1 min. 55ºC für 1 min und 72ºC für 1 min. gefolgt von 10 min bei 72 ºC. Das PCR-Produkt wurde auf einem 1%-Agarose-TAE-Gel aufgetrennt, die die amplifizierte VH-Population darstellende Bande ausgeschnitten und unter Einsatz des Geneclean-Sets (Bio 101) aus dem Agarosegel eluiert.
Etwa 50 ng ampflizierte "gespickte" CEA6-Leichtkette und 30 ng der amplifizierten Ausgangs-CEA6-Schwerketten-Population wurden kombiniert. Dies wurde in einer Assemblierungsamplifikation nach Zugabe von Reaktionspuffer bis 1X, dNTPs in 200 nM und 5 Einheiten Taq-Polymerase eingesetzt. Die Amplifikationsbedingungen bestanden in 7 Zyklen bei 94ºC für 1 min. 65ºC für 4 min. 5 ul jeder Assemblierung wurden als Templat in einer "Durchzugs"-Amplifikation mit den Primern fdtetseq und LMB3 eingesetzt. Die Amplifikationsbedingungen bestanden in in 25 Zyklen bei 94ºC für 1 min. 55ºC für 2 min und 72ºC für 1 min. gefolgt von 10 min bei 72ºC.
Da Durchzugsamplifikations-Produkt wurde auf 1 % Agarose-TAE aufgetrennt, die die durchzugsgespickte VH-VL darstellende Bande ausgeschnitten und unter Einsatz des Genecelan Sets eluiert. Dies wurde mit den Restriktionsendonukleasen Sfi I und Not I (NEB) gespalten und in den Phagemidvektor pCantab 6 liiert (Arnersham-Ligationssystem), der zuvor mit Sfi I und Not I gespalten worden war. Das Ligationsprodukt wurde eingesetzt, um elektrokompetende TG1-Zellen zu transformieren, auf 2YTAG-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30ºC inkubiert. Etva 6 · 10º einzelne Klone wurden aus dieser VL CDR3-"Spickung" der CEA6 VL CDR3 erhalten.

v. Selekcion des cm 6 VL/VH CDR 3-gespicktem Repertoires

Das CEA6 VL/VH-CDR3-gespickte Repertoire wurde auf GES-spezifische Antikörper selektiert. Phagemid-Teilchen wurden aus dem Repertoire gewonnen wie zuvor für die anfängliche Bibliothek beschrieben. Die gewonnenen Phagen wurden 1 h lang in einem Endvolumen von 100 ul 3MPBS vorblockiert. Etwa 10¹¹ tE Phagen wurden in der ersten Selektionsrunde und zwischen 10&sup9; und 10¹&sup0; für nachfolgende Selektionen eingesetzt. Für die Selektionen der ersten Runde wurde biotinvliertes CES in einer Endkonzentration von 10 nM den vorblockierten Phagen zugegeben und stationär bei 37ºC für 1 h inkubiert.
Für jede Selektion wurden 100 ul Dynabeads-Suspension (Dynal) auf einem Magneten abgetrennt, die Perlen gewonnen und für 2 h in 1 ml 3MPBS vorblockiert. Die Perlen wurden auf einem Magneten gewonnen, im Gemisch aus Phagemid und biotinyliertem CEA resuspendiert und bei Raumtemperatur für 15 min inkubiert, während es kopfüber gedreht wurde. Die Perlen wurden auf einem Magneten festgehalten und dreimal mit PBST gewaschen, gefolgt von zwei Waschungen in PBS. Dann wurde die Selektion auf Klone mit einer längeren Off-Rate als jene von CEA6 durchgeführt. Die Perlen wurden in PBS gewaschen, das CEA in einer Konzentration von 50 nM enthielt. Zu verschiedenen Zeitpunkten (15', 30', 1 h, 3 h und 18 h) wurden die auf den Magnetperlen festgehaltenen Phagen auf einem Magneten abgetrennt und die Waschlösung ausgetauscht. Schließlich wurde die Hälfte der Perlen in 10 ul 50 mM DTT resuspendiert (die andere Hälfte der Perlen als Reserve bei 4ºC gelagert) und bei Raumtemperatur 5 min lang inkubiert. Die gesamte Perlensuspension wurde dann eingesetzt, um 5 ml sich logarithmisch vermehrende TG1-Zellen zu infizieren. Dies wurde bei 37ºC inkubiert, 15 min lang stationär und dann unter mäßigem Rütteln für 45 min. auf 2YTAG-Platten ausplattiert und üler Nacht bei 30ºC inkubiert.

vi. Identinzierung von CEA-spezifischen ScFv-Antikörpern aus dem CEA6 VH/VL-gespickten Repertoire

Für CEA spezifische ScFv-Antikörper wurden sowohl durcü Phagen als auch durch Lösungs-ELISA identifiziert und sequenziert wie zuvor beschrieben. Es wurden drei neue cm-spezifische scFv-Antikörper identifiziert. Alle drei viesen die zuvor beschriebene CEA6-Schwerkettensequenz (DP10) und Veränderungen in den 4 angestrebten gespickten Resten der VL auf. Die Sequenzen sind in Fig. 3 angeführt.

b. Leichtketten-Shuffling des CEA-spezifischen ScFv-Antikörpers CEA6

i. Repertoire-Konstruktion

Die oben beschriebene Population von CEA6 VH-CDR3-gespickten Klonen wurde mit dem vollständigen Repertoire von Leichtketten rekombiniert, die von den PBL und von Mandeln stammenden scFv-Repertoires abgeleitet worden varen. Die CEA6 VH CDR3- gespickten Schwerketten wurden durch PCR unter Einsatz der Primer PCRHLINK (Tabelle 1) und LMB3 ampfliziert. Die Amplifikationsbedingungen bestanden in 25 Zyklen von 94ºC für 1 min. 55ºC für 1 min und 72ºC für 1 min. gefolgt von 10 min bei 72 ºC. Das PCR-Produkt wurde auf einem 1%-Agarose-TAE-Gel aufgetrennt, die die amplifizierte VH darstellende Bande ausgeschnitten und unter Einsatz des Geneclean-Sets (Bio 101) aus dem Agarosegel eluiert.
Die Mandel-Leichtketten wurden durch PCR unter Einsatz der Primer fdtetseq und PCR- LLINK (Tabelle 1) amplifiziert. Die Amplifikationsbedingungen bestanden in 25 Zyklen bei 94ºC für 1 min, 55ºC für 1 min und 72ºC für 1 mm, gefolgt von 10 min bei 72 ºC. Das PCR-Produkt wurde auf einem 1% Agarose-TAE-Gel aufgetrennt, die die amplifizierte VL darstellende Bande ausgeschnitten und unter Einsatz des Geneclean-Sets (Bio 101) aus dem Agarosegel eluiert.
Etwa 50 ng amplifizierte CEA6 VH CDR3-gespickte Scüwerketten und 30 ng amplifizierte von Mandeln stammende Leichtketten wurden kombiniert. Dies wurde in einer Assemblierungsamplifikation nach Zugabe von Reaktionxpuffer bis 1X, dNTPs in 200 nM und S Einheiten Tad-Polymerase eingesetzt. Die Amplifikationsbedingungen bestanden in 7 Zyklen bei 94ºC für 1 min. 60ºC für 1 min und 72 C für 1 min 30 s, gefolgt von 10 min bei 72ºC. 10 ul jeder Assemblierung wurden als Templat in einer "Durchzugs"- Amplifikation mit den Primern fdtetseq und LMB3 eingesetzt. Die Amplifikationsbedingungen bestanden in 25 Zyklen bei 94ºC für 1 min. 60ºC für 1 min und 72ºC für 1 min 30 s, gefolgt von 10 min bei 72ºC.
Das Durchzugsamplifikations-Produkt wurde auf 1% Agarose-TAE aufgetrennt und die die Durchzugs-VH-VL darstellende Bande ausgeschnitten und unter Einsatz des Geneclean-Sets eluiert. Dies wurde mit den Restriktionsendonukleasen Sfi I und Not I (NEB) gespalten und in den Phagemidvektor pCantab 6 (Amersham-Ligationssystem) ligiert, der zuvor mit Sfi 1 und Not I gespalten worden war. Das Ligationsprodukt wurde eingesetzt, um elektrokompetente TG1-ZeIlen zu transformieren, auf 2YTG-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30ºC inkubiert. Etwa 3 · 10&sup7; einzelne Klone wurden aus dem Leichtketten-Shuffling der CEA6 VH CDR3-gespickten Schwerketten mit den von Mandeln stammenden Leichtketten erzeugt.

ii. Selektion des Leichtketten-Shuffling-Repertoires

Das Leichtketten-Shuffling-Repertoire wurde bezüglich CEA-spezifischer Antikörper mit längeren Off-Rates als CEA6 genau wie oben für das CEAG VH/VL CDR3-gespickte Repertoire beschrieben selektiert.

iii. Identifizierung von CEA spezifischen ScFv-Antikörpern aus dem Leichtketten-Shuffling-Repertoire

Für CEA spezifische ScFv-Antikörper wurden sowohl durch Phagen als auch durch Lösungs-ELISA identifiziert und sequenziert wie zuvor beschrieben. Es wurden drei neue CEA spezifische scFv-Antikörper identifiziert. Alle drei besaßen de zuvor beschriebene CEAG-Schwerkettensequenz (DP10). Die Sequenzen sind nachstehond zusammengefasst, und die vollständige Sequenz jeder VL-Domäne ist in Fig. 4 angegeben.

3. Bildung von Anti-CEA-Antikörpern mit höherer Affinität

Das Rekombinieren von Schwerketten, die von Hochaffinitäts-Anti-CEA-scFv abgeleitet waren, mit Leichtketten, die von Anti-CEA-scFv abgeleitet waren, die verbessere Off- Raten undverringerte Human-Leber-Kreuzreaktivität aufwiesen.
Antikörper, die durch Spicken von CDR3 des scFv-Antikörpers CEA6 abgeleitet sind, binden CEA mit hoher Affinität (Abschnitt 2b). Um die Chance zu verbessern, Antikörper mit höherer Affinität zu erhalten, wurde beschlossen, von Hochaffinitäts-Anti-CEA scFvs abgeleitete VH5 mit VLs zu kombinieren, die von SeFv-Klonen mit längeren Off- Raten abgeleitet wurden und verringerte Human-Leber-Kreuzreaktivität aufweisen (Beispiel 4).
Die Schwerkette von Klon TO6D10 wurde durch PCR unter Einsatz der Primer LMB3 und PCR-H-Link amplifiziert (Tabelle 1). Die Amplifikationsbedingungen bestanden in 25 Zyklen bei 94ºC für 1 min. 55ºC für 1 min und 72ºC für 1 min. gefolgt von 10 min bei 72ºC. Das PCR-Produkt wurde auf einem 1%-Agarose-TAE-Gel aufgetrennt, die die amplifizierte VH darstellende Bande ausgeschnitten und unter Einsatz des Geneclean-Sets (Bio 101) aus dem Agarosegel eluiert.
Leichtketten wurden getrennt durch PCR aus den Anti-CEA spezifischen Klonen TO6D8 und TO6D12 amplifiziert, wobei die Primer fdtetseq und PCRLLink (Tabelle 1) eingesetzt wurden. Es wurden die gleichen PCR-Bedingungen eingesetzt wie für die VH- Amplifikation beschrieben. Jedes VL-PCR-Produkt wurden dann getrennt auf einem 1%- Agarose-TAE-Gel gereinigt wie oben beschrieben.
Etwa 50 ng ampflizierte Schwerkette und 50 ng einer der amplifizierten Leichtketten wurden kombiniert. Diese wurden in Assemblierungsamplifikationen nach Zugabe von Reaktionspuffer, dNTPs in 200 nM und S Einheiten Taq-Polymerase eingesetzt. Die Amplifikationsbedingungen bestanden in 7 Zyklen bei 94ºC für 1 min, 55ºC für 1 min und 72ºC für 2 min. gefolgt von 10 min bei 72ºC, 5 ul jeder Assemblierung wurden als Templat in einer "Durchzugs"-Amplifikation mit den Primern fdtetseq und LMB3 eingesetzt. Die Amplifikationsbedingungen bestanden in 25 Zyklen bei 94ºC für 1 min, 55 ºC für 1 min und 72ºC für 2 min, gefolgt von 10 min bei 72ºC.
Die Durchzugs-Amplifikationsprodukte wurden auf 1%-Agarose-TAE aufgetrennt und die die Durchzugs-VH-VLs darstellenden Banden ausgeschnitten und unter Einsatz des Geneclean-Sets eluiert. Diese wurden mit den Restriktionsendonukleasen Sfi I und Not I (NEB) gespalten und unter Einsatz des Amersham-Ligationssvstems in den Phagemidvektor pCantab 6 ligiert, der zuvor mit Sfi 1 und Not I gespalten worden war. Die Ligationsprodukte wurden eingesetzt, um elektrokompetente TG1-Zellen zu transformieren, auf 2YTAG-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30ºC inkubiert.

c. Identifikation der rekombinierten Klone TOGD9 und TOGD11

Klone, welche die TO6D10-Schwerkette in Kombination entweder mit der TO6D8- Leichtkette (was Klon TO6D9 ergibt) oder der TO6D12-Leichtkette (was Klon TO6D11 ergibt) aufwiesen, wurden durch Sequenzierung identifiziert.

BEISPIEL 2 - AFFINITÄTSBESTIMMUNG FÜR SCFV-FRAGMENTE, DIE SICH AN CEA BINDEN

Die Affinitäten aller Anti-CEA-scFvs, die vom Ausgangs-CEA6-Klon abgeleitet wurden, wurden durch Oberflächenplasmonresonanz ermittelt, wahrend die Affinitäten von CEA1-5 durch Bindungshemmungs-ELISA gemessen wurden.

3. Affinitätsbestimmung durch Oberflächen-Plasmonresonanz

Die Uff-Raten für Bindung an CEA der in Beispiel 1 beschriebenen scFv-Fragmente wurden unter Einsatz von desialyliertem, an den Sensorchip gebundenem CEA ermittelt. 100 ug CES wurde in 0,1 M Natriumacetat-Puffer, pH 4,0, resuspendiert und unter Einsatz von 1,375 mE Sialidase (Sigma) desialyliert. Dies wurde für 4 h bei 37ºC unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Das desialylierte CEA wurde dann unter Einsatz von 1 Einheit Galactose-Oxidase pro 500 ug CEA in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, oxidiert. Dies wurde 2 h lang bei 36ºC inkubiert und unter Einsatz einer Centricon-Säule in 10 mM Natriumacetat-Puffer, pH 4,0, entsalzt. Das CEA wurde dann über Aldehyd-Kopplung auf dem Sensorchip immobilisiert. 15 ul EDC/NHS-Kopplungsmittel (Pierce) wurden mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ul/min über den Chip geleitet. 35 ul 5 mM Hydrazin in Wasser wurde dann über den Chip geleitet, gefolgt von 35 ul Ethanolamin. 4 ul behandeltes CEA mit 60 ug/ml wurden mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ul/min über den Chip geführt, gefolgt von 40 ul 0,1 M Natriumcyanoborhydrid in 0,1 M Acetatputfer, pH 4,0, mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ul/min. Unter Einsatz dieses Verfahrens wurden etwa 1.500 RE (Resonanzeinheiten) CEA gebunden. CEA-Chips mit 5.000 RE und 900 RE wurden unter Einsatz dieses Verfahrens hergestellt. Die Sättigung des Chips mit gereinigtem scFv (siehe Beispiel 3) wurde für jede Probe bestätigt, bevor Oft-Raten-Kalkulationen durchgeführt wurden. Die On- und Off-Raten wurden auch unter Einsatz der Bia-Evaluation-Software und der Annahme berechnet, dass die scFv-Präparate zu 100% aktiv waren. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.

6. Affinitätsmessung durch Inhibicions-ELISA

Die Affinitäten von CEA1 → 5 inklusive konnten durch Oberflächenplasmonresonanz nicht bewertet werden, weil diese scFvs Kohlenhydratstrukturen erkennen, die durch die Desialvlierung von CEA leseitigt wurden. Daher wurden ihre Affinitäten durch Bindungshemmungs-ELISA gemessen.
scFv-Lösungs-ELISAs wurden durchgeführt wie in Beispiel 1 beschriehen. Eine Verdünnungsreihe der scFv-Präparate in PBS wurde durchgeführt, um den Punkt zu ermittelt, an dem ein Signal mit ewa 0,2 O. D.-Einheiten bei ELISA über Nacht erschien. Diese scFv-Konzentration wurde dann über Nacht bei 4 0C mit nativen CEA in Konzentrationen im Bereich von 20 nM bis 0,1 nM vorinkubiert. Die resultierenden Daten wurden als Klotz-Plot (y-Achse = Maximale Absorption / (maximale Absorption - Absorption bei CEA-Konzentration n); x-Achse = 1/CE,A Konzentration n) aufgetragen. Der Steigung des Plots wurde als Dissoziationskonstante angenommen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt.

BEISPIEL 3 - DEMONSTRATION DER BINDUNG VON ANTI-CEA-ANTIKÖRPERN AN ZELLASSOZIIERTES CEA

a. An der Oberfläche von HeLa-Zellen exprimiertes CEA

Für diese Versuche wurde durchwegs Metallaffinitätschromatographie- (IMAC-) gereinigtes scFv eingesetzt; selbiges wurde wie folgt hergestellt. Kolonien wurden in 50 ml 2TY eingeimpft, das 2% Glucose und 100 ug/ml Ampicillin (2TY/G/A) enthielt und über Nacht bei 30ºC inkubiert. Die über Nacht entstandene Kultur wurde dann zu 500 ml 2TY/G/A zugegeben und bei 30ºC in einem Rüttelinkubator für 1 h gezüchtet. Zellen wurden bei 8K für 10 min pelletiert, in 500 ml 2 TY resuspendiert, das 1 mM IPTG und 100 ug/ml Ampicillin enthielt, und bei 22ºC über Nacht gezüchtet. Periplasma-Präprate wurden durch Pelletieren der Zellen bei 8K für 10 min in einem vorgekühlten Rotor (4 ºC) hergestellt. Die Pellets wurde in 25 ml eiskaltem 50 mM Tris-HCl. pH 8, 20% (w/v) Saccharose, 1 mM EDTA resuspendiert und auf Eis 15 min lang inkubiert. ScFv wurde dann aus dem Peripiasma-Präparat durch IMAC gereinigt, wobei NTA-Agarose (Qiagen) gemäß den Angaben des Herstellers eingesetzt wurde.
1 · 10³ CEA exprimierende HeLa-Zellen wurden für 1 h bei Raumtemperatur mit 5 ug lMAC-ereinigtem Anti-CEA-scFv oder 5 ug von für Hunian-Föten-Hämoglobin (FSG-1) spezifischem Vergleichs-scFv inkubiert, aufgefüllt auf 100 jit in PBS/0,5% (w/v) BSA (PBS/BSA). Die Zellen wurden einmal in 10 ml PBS/BSA gewaschen und mit einem Mäuse-Anti-myc-Antikörper (9E10) mit 25 ug/ml in 100 ml PBS/BSA für 1 h inkubiert. Die Zellen wurden in 10 ml PBS/BSA gewaschen und mit 100 ui einer 1 : 200-Verdünnung von FITC-konjugiertem Anti-Mäuse-Antikörper (Sigma) in PBS/BSA inkubiert. Nach einer abschließenden Waschung in 10 ml PBS/BSA wurde die Zellfluoreszenz mittels Durchflusszytometrie unter Einsatz eines Coulter-EPISXL-MCL-Durchflusszytometers gemessen. 1 · 10³ Fluorezenzereignisse wurden unter Einsatz des FL1-Kanals (Emission unter 550 nM) gemessen und wurden auf einer Log-Skala über der Zellenanzahl aufgetragen.
Die Ergebnisse für ein Selektion der Off-Rate-gereiften Anti-CEA-scFvs werden in Fig. 5 gezeigt.

b. Anti-CEA-scFvs binden sich gegenüber löslichem CEA bevorzugt an zellassoziiertes CEA

Durchflusszytometrie-Analyse wurden wie oben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass lösliches CEA den CEA exprimierenden HeLa-Zellen vor der Zugabe des scFv zugesetzt wurde. Den Zellen wurde eine Bandbreite von Konzentrationen von 10 ng/ml bis 1 ug/ml zugegeben (Fig. 6). Bei keiner der getesteten Konzentrationen hemmte lösliches CEA die Bindung von monoklonalem Antikörper an die Zellen. Die Zugabe von löslichem CEA konnte die Bindung eines nicht verwandten monoklonalen Antikörpers mit ähnlicher Affinität für die Zellen hemmen. Dies weist darauf hin, dass CEA6 und affinitätsgereiftes scFv daher gegenüber löslichem CEA bevorzugt zellassoziiertes CEA binden.

BEISPIEL 4 - DEMONSTRATION DER ÄNDERUNG DER SPEZIFITÄT VON AFFNITÄTS- GEREIFTEN ANTI-CEA-ANTIKÖRPERN FÜR EINE HUMAN-LEBERZELLLINIE

Durchflusszytometrie wurde genau wie in Beispiel 3, Abschnitt a, beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 1 · 10³ Chang-Human-Leberzellen mit den IMAC-gereinigten Anti-CEA-scFvs oder Vergleichs-scFv inkubiert wurden. 1 · 10³-Fluoreszenzereignisse wurden unter Einsatz des FL1-Kanals gemessen (Emission unter 530 nm) und auf einer Log-Skala über der Zellenanzahl aufgetragen. Die Ergebnisse werden in Fig. 7 gezeigt.
Aus Fig. 7 ist zu entnehmen, dass CEA6 teilweise mit den Human-Leberzelllinie kreuzreaktiv ist. HBA11 und HBB11 ergeben ebenfalls eine gevisse Kreuzreaktivität, während Klone, die durch Selektionen aus dem Leichtketten-Shuffling-Repertoire isoliert worden waren, in diesem Test keine beobachtbare Kreuzreaktivität mit der Leber-Zelllinie aufwiesen. Somit ist gezeigt worden, dass durch die eingesetzte Selektionsvorschrift eine Anreicherung an Anti-CEA-Antikörpern, die verringerte Kreuzreaktivität für Human-Leber aufweisen, erfolgt ist.

BEISPIEL 5 - EPITOP-KARTIERUNG VON FÜR CEA SPEZIFISCHEN ANTIKÖRPERN

a. Expression von CEA voller Länge oder der CEA-Epitope N, A1-B1, A2-B2, A3-B3.

CEA besteht aus einer NH&sub2;-terminalen Domäne (Domäne N) aus 108 Aminosäureresten, gefolgt von drei in hohem Maße homologen internen Domänen (A1-B1, A2-B2, A3-B3) mit jeweils 178 Resten. Es ist gezeigt worden, dass die C-terminale Domäne mit 23 Resten (Domäne M) post-translational entfernt und durch eine Glykophospholipid-Gruppe ersetzt worden ist, die CEA in der Zellmembran verankert. cDNA von CEA voller Länge oder den Epitopen N, A1-B1, A2-B2 oder A3-B3 als Fusionsproteine mit bakterieller CMP-KDO-Svnthetase (CKS) wurden von Dr. J. Shively bereitgestellt IHass et al., Cancer Res. 31, 1876-1882 (1991)).
XL1-Blue-Zellen, welche die CKS-CEA-Gene enthielten, wurden wie folgt kultiviert. Kulturen aus 2 ml 2TY, das 50 ug/ml Ampicillin enthielt, wurden mit einer einzelnen Kolonie beimpft. Die Kulturen wurden etwa 3 bis 4 h lang bei 37ºC inkubiert, und IPTG wurde in einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben. Das Wachstum wurde für weitere 5 h fortgesetzt, dann wurden die Zellen pelletiert und bei -70ºC eingefroren. Zellpellets wurden in 3 nil 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 10,0, resuspendiert. Lysozym (6 mg) wurde zugegeben, und die Proben wurden für 15 min auf Eis gelegt. 0,3 ml 20 Triton X-100 wurden zugegeben und die Suspension vermischt. Zusätzliche 3 ml 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 10,0, wurden zugegeben. Die Triton-unlösliche Fraktion wurde durch Zentrifugation pelletiert und in 6 ml 8 M Harnstoff resuspendiert. Das Harnstoff-lösliche Material wurde gegen PBS (0,13 NaCl, 0,02 M Natriumphosphat, pH 7,2) dialysiert, was lösliches Protein ergab.

b. Epitop-Kartierung der von cEA6 abgeleiteten Anti-CEA scFv's

Mit den löslichen Domänen wurden in einer Konzentration von 1 ug/ml bei 37ºC über Nacht ELISA-Platten beschichtet. Lösliches Anti-CEA-scFv wurde unter Einsatz von Metallaffinitätschromatographie (IMAC) gereinigt wie in Beispiel 3, Abschnitt a, beschrieben. ELISAs wurden durchgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass gereinigtes scFv in einer Konzentration von etwa 1 ug/ml eingesetzt wurde. Alle von CEA6 abgeleiteten Klone banden sich bevorzugt an die A3-B3-Domäne.
Somit wurde gezeigt, dass, obwohl die Spezifität für Human-Leberzellen durch das Affinitätsreifungsverfahren verändert worden ist, sich dies in der CEA-Domänen-Spezifität der affinitätsgereiften Zellen nicht widerspiegelt.

e. Epitop-Kartierung von CEA1, CEA2, CEA3, CEA4 und CEA5

Diese Klone wurden durch Lösungs-ELISA auf Bindung an desialvliertes CEA getestet (hergestellt wie in Beispiel 2). Behandeltes oder unbehandeltes CEA wurde auf eine ELI- 55-Platte in 0,5 ug/ml aufgetragen und der ELISA dann durchgerührt wie in Beispiel 1 beschrieben. Bei desialvliertem CEA lieferten CESt CEA2, CEA3, CEA4 und CEA5 allesamt kein nachweisbares Signal über dem Hintergrund (0,1 O. D.-Einheiten nach 2 h Entwicklung), während die Signale bei nativem CEA nach 2 h alle über 0,4 O. D.-Einheiten lagen. Dies zeigt, dass dieser Satz von Klonen Kohlenhvdratepitope auf nativem CES erkennt, die durch Sialidase-Behandlung entfernt werden können. Keiner der Klon- Sätze band sich in ELISAs an die epxrimierten CEA-Epitope N, A1-B1, A2-B2 oder A3- B3. Da in E. coli exprimierte Proteine nicht glykosyliert werden, bestätigt dieses Ergebnis die Beobachtungen mit desialyliertem CEA.

BEISPIEL 6 - LOKALISIERUNG VON CEA-SPEZIFISCHEN ANTIKÖRPERN IN HUMANKOLON-ADENOKARZINOM-XENOTRANSPLANTATEN

In eine Mäuse-Xenotransplantat-Modell von Human-Kolon-Adenokarzinom ist gezeigt worden, dass radiomarkierte Mäuse-Anti-CEA-mSbs in einem solchen Modell im Tumor lokalisiert werden können.

a. Subklonieren von scFv in einen Cystein-markierten Vektor zur Radiomarkierung

ScFv-Inserts aller Anti-CEA-Antikörper wurden durch PCR unter Einsatz der Primer LMB3 und ftdseq erzeugt. Die Amplifikationsbedingungen bestanden in 25 Zyklen bei 94ºC für 1 min. 55ºC für 1 min und 72ºC für 1 min. gefolgt von 10 min bei 72ºC. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1%-Agarose-TAE-Gel aufgetrennt, die das amplifizierte scFv darstellende Bande ausgeschnitten und unter Einsatz des Geneclean-Sets (Bio 101) aus dem Agarosegel eluiert. Das Produkt wurde mit den Restriktionsendonukleasen Sfi I und Not I (NEB) gespalten und in den mit Sfi I und Not I gespaltenen Cystein-markierten Vektor pUC119MCH ligiert (Fig. 8). Das Ligationsprodukt wurde eingesetzt, um elektrokompetete TG1-Zellen zu transformieren, auf 2TYAG-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30ºC inkubiert. Kolonien wurden entnommen und das scFV sequenziert, um zu überprüfen, dass das Insert korrekt in den pUC119MCH-Vektor eingebaut worden war.

h. Technetium-99m-Markierung von IMAC-gereinigrern scFv

Anti-CEA-scFvs wurnen durch IMAC gereinigt wie in Beispiel 3 beschrieben. Diese wurden dann mit Technetium-99 m radiomarkiert, wie von Pak et al., ucl. Med. Biol. 19, 699-677 (1992), beschrieben.

c. Tiermodell

Human-LS174T-Xenotransplantate wurden in nackten Mäusen durch subkutanes Passaging aus der Human-Kolon-Adenokarzinorn-Zelllinie LS1 TAT gebildet. Zu jedem Zeitpunkt wurden Gruppen von 4 Mäusen herangezogen. Den Mausen wurden über die Schwanzvene 20 ug Technetium-99rn-markiertes CEAG scFv mit einer spezifischen Aktivität von 3 mCi/mg injiziert. Die Mäuse wurden entweder 3 oder 24 h nach der Injektion getötet, und die Verteilung des Antikörpers im Körper sowie die Gewebe : Blut-Verhältnisse wurden gemessen.
Die für CEA6 scFv erhaltenen Ergebnisse werden in Fig. 9 und Fig. 10 gezeigt. 24 h nach der Injektion wurde das Verhältnis Tumor: Blut mit 3 berechnet, betrug das Verhältnis Tumor: Leber 1, 2 und das Verhältnis Tumor: normaler Kolon 3,6. Somit wurde gezeigt, dass der Anti-CEA-scFv CEA6 in einem Human-Xenotransplantat-Adenokarzinom im nackten Mäusemodell der Krankheit lokalisiert ist.

BEISPIEL 7 - NÄHERE UNTERSUCHUNG DER DOMÄNEN-ERKENNUNG VON CEA6 und TOGD11

a. Bindung von scFv's über die terminalen Cystein-Reste an einem Sensorchip

Monomer-Präparate von CEA6 oder TO6D11, ciie im pUC119MCH-Vektor hergestellt wurden und somit einen terminalen Cysteinrest aurvviesen, wurden an einen CM5-Chip (Pharmacia) gebunden, indem ein Liganden-Thiol-Immobilisierungsverfahren wie folgt eingesetzt wurde. 50 ul 50 mM 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropvl)cardodiimid-HCl- (EDC-) Reagens (Pharmacia) und 50 ul 200 mM N-Hvdroxvsuccinimid- (NHS-) Reagens (Pharmacia) wurden vermischt und mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 pl/min über den Chip geleitet. 20 pl 80 mM 2-(2-Pyridinyldithio)ethanamin-hvdrochlorid- (PDEA-) Aktivierungslösung wurden dann mit der gleichen Fließgeschwindigkeit über den Chip geleitet. Die PDEA-Lösung wurde frisch hergestellt, indem 4,5 mg PDEA (Sigma) in 250 ul 0,1 M Boratpuffer, pH 8,5, gelöst wurden. 20 ul einer Lösung von gereinigtem monomerem scFv mit etwa 100 ug/ml wurde mit PBS auf 50 ul aufgefüllt und 50 pl 50 mM- Natriumformiat, pH 4, wurde dem scFv zugegeben und 50 ul davon über den Chip geleitet, erneut mit 5 ul/min. 50 mM L-Cystein-1 M NaCl-Deaktivierungslösung wurde hergestellt, indem 1,5 mg L-Cystein und 15 mg NaCl in 250 ml 0,1 M Natriumformiat-Puffer, pH 4,3, gelöst wurden, und 20 pl davon wurden mit 5 ul/min über den Chip injiziert. Dieses Verfahren führte zur Immobilisierung von 375 Resonanzeinheiten (REs) an TO6D11, wobei 354 REs an monomerem CEA6 scFv an den Chip gebunden wurden. Ein Vergleichs-Chip, der aus einem bekannten N-Domänen-reaktiven scFv bestand, wurde ebenfalls nach dem gleichen Verfahren hergestellt.

b. Herstellung von gereinigten CEA-Domänen

50 ml-Kulturen der in Beispiel 5a beschriebenen CEA-Domänen, die in den Vektor pUC119EHIS (Fig. 11) ohne das bakterielle CKS-Gen kloniert worden waren, wurden über Nacht bei 30ºC in 2TY gezüchtet, das 2% Glucose und 100 ug/ml Ampicillin (2TYGA) enthielt. Diese Kulturen wurden eingesetzt, um 500 ml 2TYGA zu beimpfen, und wurden bei 30ºC eine weitere Stunde lang gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 5K für 10 min pelletiert und mit 1 mM IPTG und 100 mg/ml Ampicillin, das auf 30ºC vorgewärmt worden war, in 2TY resuspendiert. Induktion erfolgte unter Schütteln für 3 h bei 40ºC, und die Zellen wuren dann wie zuvor pelletiert. Die Pellets wurden in 10 ml 1 · TES (0,2 M Tris-HCl, 0,5 mM EDLX, 0,5 M Sacchrose) resuspendiert und dann 15 ml 0,2 · TES zugegeben. Die Zellen wurden für 30 min auf Eis belassen und Zelibruchstücke dann bei 10K 30 min lang bei 4ºC in einem Sorvall- SS34-Rotor pelletiert. Der Uberstand wurde in ein 50 ml-Falcon-Röhrchen übertragen und 25 ul 1 M MgCl, (Quiagen) zugegeben. 2 ml Ni-NTA-Agarose (Quiagen), die in Phosphatpuffer (300 mM NaCl, 50 mM Natriumphosphat, pH 8) gewaschen worden war, wurde dem Überstand zugegeben und bei 4ºC 1 h lang rotiert. Die Ni-NTA-Agarose wurde dann durch Zentrifugieren in einer Labor-Zentrifuge bei 1.000 U/min für 2 min pelletiert und das Agarose-Pellet zweimal in 20 ml Phosphatpuffer (300 mM NaCl, 50 mM Natriuniphosphat, pH 8) gewaschen, gefolgt von einer Waschung in Phosphatpuffer, der 10 mM Imidazol enthielt. Die Agarose-Aufschlämmung wurde dann auf eine Biorad-Polyprep-Säule übertragen und die CEA-Domänen durch Zugabe von zwei Aliduoten von 1 ml 300 mM-Imidazol in Phosphatpuffer aus der Säule eluiert.

c. Bindung von CEA-Domänen-Präparaten an auf dem Sensorchip inmobilisiertes scFv

70 ul jedes der vier CEA-Domänen-Präparate (A1-B1, A2-B2, A3-B3 und N) wurden mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ul/min über die Chips mit gebundenem scFv geleitet. Nach Injektion jeder Domäne wurde der Chip durch eine Injektion von 10 ul 10 mM HCl regeneriert. Bei den Chips mit gebundenem CE,A6- und TOGD11-scFv führten die Domänen A1-B1, A2-B2 und,A-3B3 alle zur Bindung von etwa 100 RE an die Oberfläche. Für die N-Domäne wurde bei mit CEA6- oder TO6D11-scFv beschichteten Chips keine Bindung beobachtet. Koff für die Domänen wurde sowohl für mit CEA6- als auch TO6D11-scFv beschichtete Chips (Tabelle 4) berechnet, und es wurde festgestellt, dass A3-B3 die längste Off-Rate aufweist, was darauf hindeutet, dass diese Domäne diejenige ist, die von CEA6 und TO6D11 bevorzugt erkannt wird. Die Domänen A1-B1, A2-B2 und A3-B3 enthalten allen drei Domänen gemeinsame Elemente, was für gewisse Kreuzreaktivität der CEA6- und TO6D11-scFvs mit all diesen Domänen verantwortlich sein kann. Dies zeigt, dass die Gesamt-Domänen-Erkennungscharakteristika von CEA6 bei der Affinitätsreifung dieses Antikörpers gegen TO6D11 nicht verändert worden sind.
Zum Vergleich wurde ein Chip mit einem gebundenen scFv, von dem gezeigt worden war, dass er die N-Domäne von CEA erkennt, ebenfalls getestet, indem die verschiedenen Domänen über den Chip geführt wurden. Dieses scFv ergab 54 RE Bindung des N- Domänen-Prä parats und keine nachweisbare Bindung der anderen Domänen an das scFv, was die Aktivität des N-Domänen-Präparats zeigt und erneut die Spezifität dieses scFv bestätigt.

BEISPIEL 8 - ANALYSE DER BINDUNGSSPEZIFITÄTEN VON CEA1, CEA2, CEA3, CEA4 und CEA5.

Wie in Beispiel 5c beschrieben, lieferten CEA1, CEA2, CEA3, CEA4 und CEA5 kein nachweisbares ELISA-Signal, als sie auf Bindung an desialyliertes CEA getestet wurden, was darauf hinweist, das die Klone eine Sialsäure-hältige Kohlenhydrat-Komponente von CEA erkennen. Die Spezifitäten dieser Klone wurden dann wie folgt näher untersucht.

a. Testen von CEA1, CEA2, CEA3, CEA4 und CEA5 auf Bindung an Polysialsäure (PSA) mittels ELISA

Biotinylierte K1-Polysialsäure, eine Version von PSA, die ein Polymer mit durchschnittlich etwa 200 Monomeren Sialsäure ist, wurde von Dr. R. Waibel bereitgestellt. Die K1- Version von BSA wurde aus dem K1-Stamm von E. coli gereinigt. K1 weist ein membranartiges CMP-NeuAc auf; Poly-α-2-8-sialosyl-Sialyltransterase-Komplex katalysiert die Synthese langer linearer PSA- (K1-) Ketten.
Die PSA wurde mit 10 ug/ml bei Raumtemperatur 1 h lang auf eine Streptavidin-beschichtete Platte (Pierce, Reacti-Bind) aufgetragen. Die Platte wurde in 3%MPBS 1 h lang bei Raumtemperatur blockiert und 100 pl Monomer-Präparate von CEA1, CEA2, CEA3, CEA4, CEA5 und CEAG als Vergleiche in 3%MPBS dann jedem Napfmit etwa 100 ug/ml zugegeben. Die Platte wurde für 1.h bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann dreimal in PBST, gefolgt von dreimal in PBS gewaschen. Die Detektion von gebundenem scFv erfolgte mit 1 : 200 verdünntem Anti-myc-Markierung-Antikörper (9E10) (Munro und Pelham, 1986) für 1 h bei 37ºC. Die Platte wurde wie zuvor gewaschen und der Test bei 37ºC für 1 h mit 1 : 5000 verdünntem an alkalische Phosphatase konjugiertem Ziegen-Anti-Mäuse-IgG (Pierce) entwickelt. Die Platten wurden vie zuvor gewaschen, in 0,9% NaCl gespült, und das chromogene Substrat pNPP (Sigma) wurde zugegeben. Das Absorptionsvermögen wurde bei 405 nm gemessen.
Die Klone CEA1, CEA2, CEA3, CEA4 und CEA5 lieferten allesamt ein Signal auf das PSA K1-Polymer, während CEA6 kein nachweisbares Signal ergab (Fig. 13). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass CEA1, CEA2, CEA3, CEA4 und CEA5 allesamt freies K1-PSA erkennen, und somit, dass Sialsäure eine Rolle bei ihrer CEA-Erkennung spielt.

b. Hemmung der Bindung von CEA 1, CEA2, CEA3, CEA4 und CEA5 an CEA durch freies K1 oder freie Kolonsäure (CA)

Ein Überschuss an freiem PSA K1 und freier PSA CA (mit etwa 1 uM) wurde mit 100 ml der scFv-Monomer-Präparate (mit etwa 100 ug/ml) vorinkubiert und die scFvs dann eingesetzt, um natives CEA mittels ELISA zu detektieren wie in Beispiel 1d(ii) beschrieben. CA ist ein Sialsäure-Polymer mit durchschnittlich etwa 16 Sialsäureresten pro Kette. Das Signal auf natives CEA wurde in den Fällen von CEA1, CEA2, CEA3, CEA4 und CEA5 sowohl bei K1 als auch bei CA in unterschiedlichem Ausmaß gehemmt. Bindung von CEA6 an natives CEA wurde durch die Gegenwart von K1- oder CA-PSA nicht gehemmt (Fig. 14). Eine Zusammenfassung des Grads der Hemmung der scFv-Bindung an CEA durch K1 und CA wird in Tabelle 5 gezeigt. Dass die Bindung von CEA1, CEA2, CEA3, CEA4 und in einem geringeren Ausmaß CEA5 an CEA durch die freien PSA-Moleküle gehemmt wird, liefert weitere Hinweise auf die Erkennung von CEA durch dieses seFv, ein Element der Sialsäure-Bindungsspezifität in ihrer Erkennung von CEA.

BEISPIEL 9 - IMMUNCYTOCHEMIE VON CEA1, CEA2, CEA3, CEA4, CEA5 UND CEA6 AUF NORMALER KOLON-SCHLEIMHAUT UND KOLOREKTAL-TUMOREN

Gereinigte Monomer-Präparate der Klone CEA1 → 6 inklusive wurden eingesetzt, um in Paraffineingebetteten, mit Formalin fixierten Schnitten exprimiertes CEA aus verschiedenen Gewebequellen zu detektieren (BioMedix). Die Schnitte wurde in Histoclear entwachst, dann zweimal mit 100% Ethanol, einmal mit 70% Ethanol gewaschen, in destilliertem Wasser rehydriert (jeweils alle 5 nun) und in PBST gespült. Endogene Alkalische Phosphatase-Aktivität wurde dann durch Inkubation mit 20% Essigsäure für 15 min blockiert, mit PBST gespült, dann für 1 h in 1% BSA in PBS (PBSB) blockiert. Nach dem Spülen wurden monomere scFv-Fraktionen, die in PBSB verdünnt waren, aufgetragen und in einer feucht gehaltenen Atmosphäre über Nacht bei 4ºC inkubiert. Objektträger wurden dreimal mit PBST (jeweils 2 min) gespült und dann für 1 h bei Raumtemperatur mit 1 : 100 verdünntem 9E10 in PBSB inkubiert. Nach dem Spülen wie zuvor wurde an alkalische Phosphatase konjugierter Ziegen-Anti-Mäuse-IgG (1 : 100 verdünnt in PBS/10% Kalbfötenserum) zugegeben und die Inkubation für 1 h fortgesetzt. Gebundener Antikörper wurde mit Fast Red-Substrat (Sigma) detektiert, und der Schnitt wurde mit Hämatoxylin kontrastgefärbt und fixiert.
CEA1, CEA2, CEA3, CEA4 und CEA5 ergaben eine schwache Färbung von normalem Kolonkrypta-Epithel und eine heterogene Färbung des normalen Oberflächen-Epithels. Diese fünf Klone zeigten variable, positive Färbung von mäßig bis gut differenzierten Adenokarzinomen. In den mäßig differenzierten Tumoren wurde Färbung an den basalen Oberflächen von Drüsen und am lumenalen Aspekt lokalisiert, während in den besser differenzierten Tumoren die Färbung auf die Mucin-erzeugenden Becherzellen beschränkt war. Diese Klone ergaben kein "klassisches" Anti-CEA-Färbungsmuster, was durch ihre Reaktivität mit Kohlenhydrat-Elementen auf CEA erklärt werden kann, die nicht in allen Expressionsstadien vorhanden sein können.
CEA6 ergab eine intensive Färbung des normalen Oberflächen-Epithels, und Becherzellen und Krypta-Epithel waren ebenfalls reaktiv. Färbung von Adenokarzinom mit CEA6 ergab gleichmäßige intensive Positivität bei mäßig bis gut differenzierten Tumoren, aber stärker heterogene Färbung bei schlecht differenzierten Kazinomen.

BEiSPIEL 10 - LOKALISIERUNG VON I¹²&sup5;-MARKIERTEN ANTI-CEA-ANTIKÖRPERN GEGEN HUMAN-KOLON-ADENOKARZINOM-XENOTRANSPLANTATE

Beispiel 6 beschreibt Daten für die Lokalisierung von Techentium-99 m-markiertem CEA6-scFv in Tumoren in einer nackten Maus, die mit CEA-exprimiertem Human-Kolon- Adenokarzinom xenotransplantiert wurde. Diese Versuche wurden in demselben Tiermodell unter Einsatz von I¹²&sup5;-markiertem CEA6-scFv zusammen mit TO6D11-scFv wiederholt.

a. Markieren von monorneren scFv-Präparaten mit I¹²&sup5;

Markierung von gereinigtem scFv mit I¹²&sup5; wurde unter Einsatz des "Iodogen-Verfahrens" erzielt, das erstmals von Fraker und Speck, Biochem. Biophvs. Res. Commun. 80, 849- 857 (1978), beschrieben wurde. Bei diesem Verfahren wird 10d vorzugsweise an Tyrosin-Reste im Protein gebunden, von denen vier in der VH CDR3 sowohl von CEA6 als auch von TO6D11 vorhanden sind. Obwohl die Iodierung mit CDRs theoretisch die Antigen-Bindungsspezifität beeinträchtigen könnte, wurden sowohl CEA6 als auch TO6- D11 bezüglich Immunreaktivität überprüft, indem sie nach der Radiomarkierung über eine CEA-Affinitätssäule (Säule geliehen von Dr. David Read, Department of Clinical Oncology, Royal Free Hospital, London, GB) geschickt wurden. Dies bestätigte, dass zwischen 7 und 90% des markierten Proteins in der Lage waren, sich an die Säule zu binden, was zeigt, dass ¹²&sup5;I-Markierung ein machbarer Markierungsansatz für die Anwendung des scFv in vivo ist.

b. Tiermodell

Human-LS174T-Xenotransplantate wurden in nackten Mäusen durch subkutane Injektion aus der Human-Kolon-Adenokarzinom-Zelllinie LS17AT gebildet. Für jeden Zeitpunkt wurden Gruppen von 4 Mäusen herangezogen. Den Mäusen wurden durch die Schwanzvene 100 ul mit etwa 10 ug I¹²&sup5;-markierten ScFvs mit einer spezifischen Aktivität von 1 mCi/mg injiziert. Die Mäuse wurden 3, 24 oder 48 h nach der Injektion getötet und die Gewebe : Blut-Verhältnisse der Antikörper durch Gammazählung gemessen.
Die für CEA6 und TOGD11 erhaltenen Ergebnisse werden in Tabelle 6 gezeigt. Sowohl CEA6 als auch TO6D11 waren zu allen Zeitpunkten im Tumor lokalisiert, was wieder bestätigte, dass die Immunreaktivität nicht beeinträchtigt worden war. CEA6 ergab 24 h nach der Injektion ein Verhältnis Tumor Blut von 22,5 : 1 und 48 h nach der Injektion ein Verhältnis von 3,1 : 1. TO6D11 war nicht so effizient im Tumor lokalisiert wie CEA6, was 24 h nach cler Injektion ein Verhältnis Tumor : Blut von 3,8 : 1 ergab, aber das TO6D11, das auf den Tumor abgezielt war, wurde dort länger zurückgehalten als das darauf abgezielte CEA6; 48 h nach der Injektion betrug das Verhältnis Tumor : Blut für TO6D11 6,6 : 1.

BEISPIEL 11 - VERFEINERUNG DER EPTIOP-KARTIERUNG VON FÜR CEA SPEZIFISCHEN ANTIKÖRPERN

(a) Selektion von spezifischen Peptiden aus einer großen Phagen-Freilegungs-Bibliothek

Um die Sequenz(en) auf dem CEA-Molekül, die spezifisch von CEA6 erkannt wird/werden, im Detail zu analysieren, wurde gereinigtes monomeres CEA6 scFv als Antigen zur Selektion eines sehr großen (> 10¹¹ Klone), auf Phagen freigelegten, kombinatorischen Repertoires von Peptiden eingesetzt. Die eingesetzte Peptid-Bibliothek wurde konstruiert wie von Fisch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7761-7766 (1996), beschrieben. Kurz zusammengefasst wurden 10 Aminosäuren, für die auf einem Plasmid auf pUC- Basis kodiert wird, in vivo mit 10 Aminosäuren statistisch rekombinieren gelassen, für die der Akzeptor-Phage kodiert, und durch einen Spacer mit 5 Aminosäuren getrennt.
Das Repertoire rekombinierter Sequenzen (die für 25 Aminosäuren kodieren) wurde an das gIII-Protein von filamentösen Phagen fusioniert und war für die Freilegung verfügbar. Phagen wurden aus Kulturen gereinigt, die über Nacht bei 30 C in 2YT-Medium gezüchtet wurden, das 12,5 ug/ml Tetracyclin enthielt. Typische Phagen-Ausbeuten lagen in der Größenordnung von 1-5 · 10¹¹ tE/ml.
CEAG scFv, das gereinigt worden war, und FPLC, clas wie in Beispiel 3 beschrieben fraktioniert vorden war, wurden eingesetzt, um ein Immunrölirchen (Nung, Maxisorp) mit 10 ug/ml in PBS über Nacht bei 4ºC zu beschichten. Das Röhrchen wurde 1 h lang bei Raumtemperatur mit PBS blockiert, das 3% (w/v) Marvel PBSM> enthielt, woraufhin Phagen enthaltende Überstände (5 · 10¹¹ tE), vorblockiert in PBSM, für weitere 90 min bei Raumtemperatur binden gelassen wurden. Nicht-spezifische Phagen wurden weggewaschen wie in Beispiel 1 beschrieben, und spezifische Phagen wurden mit 3 ml 100 mM Triethylamin eluiert, mit 1,6 ml 1M Tris Cl, pH 8,0, neutralisiert und erneut in E. coli TG1 infiziert. Bis zu 4 Selektionsrunden wurden durchgeführt, und die Ausbeute an CEA6-spezifischen Phagen in der polyklonalen Population wurde durch ELISA bewertet wie unten besprochen. Einzelne Phagenklone aus den Panningrunden 3 und 4 wurden dann weiter mittels ELISA auf Spezfifität gescreent.
96-Napf-Platten wurden entweder mit CEA6-scFv oder mit einem anderen scFv anderer Spezifität als Vergleich mit 10 ug/ml in PBS über Nacht bei 4ºC beschichtet. Die Platten wurden für 1 h bei Raumtemperatur mit PBSM blockiert, dann wurde Überstand von einzelnen Klonen, die in Mikrotiter-Platten in 2YT-tet gezüchtet worden waren, vor der Zugabe zur CEA6-scFv-beschichteten Platte in PBSM vorblockiert. Phagen-Bindung wurde unter Verwendung von Anti-M13-HRP-Konjugat, 1 : 5000 verdünnt, detektiert. Die Detektion erfolgte mit OPD-Substrat (Sigma); die Platten wurden bei 490 nm in einem Mikrotiterplatten-Lesegerät abgelesen.

(b) Sequenzieren von aus der Peptid-Bibliothek selektierten Klonen

Das Sequenzieren von CEA6-positiven Phagen erfolgte mittels PCR cler beiden Exons getrennt mit den folgenden Oligonukleotidprimern:
Exon.1 Oligo 4445 5' -ACTTGGTTAGGTCCATGTCCGTCAGC-3'
fdPCRBACK 5'-GCGATGGTTGTTGTCATTGTCGGC-3'
Exon 2 Oligo 3358 5'-GAAGTGATGCAACACTGGAGC-3'
fd.PCRFOR 5'-TAGCCCCCTTATTAGCGTTTGCCA-3'
Tabelle 7 zeigt eine Aufstellung von Sequenzen von Peptid-Phagen, die nach 3 und 4 Panningrunden auf CEAG scFv selektiert wurden und von denen durch ELISA gezeigt wurde, dass sie sich spezifisch an scFv binden. Von den selektierten Klonen hatte nur 1/11 als 25-Aminosäuren-Peptid rekombiniert; die übrigen Klone umfassten 10 Aminosäuren, für die der Akzeptor-Phage (Exon 2 von Fisch et al., s. o.) kodiert.
Die selektierten Sequenzen werden mit der Human-CEA-Sequenz ausgerichtet gezeigt, die alle drei 178-Aminosäure-Domänen-Wiederholungen (A1 B1, A2B2, A3B3) gemeinsam haben. Die in Tabelle 7 unterstrichenen Reste liegen an den Positionen 139-148 inklusive, innerhalb der "A"-Unterdomäne, wo die stärkste Homologie zu selektierten Peptid-Phagen beobachtet wurde. Die Peptide P3 G 12 und P3C8, die in Pan 3 selektiert wurden, zeigten die auffälligste Homologie; außerdem wurden Klone mit den gleichen Sequenzen wie P3G12 (P4C5) und P3C8 (P4A3) auch in Pan 4 isoliert, was auf die positive Antigen-Selektion von Phagen mit diesen Sequenzen hinweist. Die Phagen P3G12 und P3C8 wurden daher zur Reinigung durch Fällung mit PEG (wie in Beispiel 1(a) beschrieben) und sowohl weitere Spezifitätsanalyse (c) als auch Hemmung der CEA6-Bindung an CEA (d) durch ELISA herangezogen

(c) Spezifitätsanalyse unter Einsatz von scFv mit gemeinsamen Rahmen

Um die Spezifität der Phagen P3G12 und P3C8 für CEA6 nä her zu untersuchen, wurden die folgenden gereinigten scFv's zur Beschichtung aut 96-Napf-Platten herangezogen, wie oben unter (a) beschrieben:
(i) scFv P2-2E10, das für Rinder-Histon H1 spezifisch ist, das ciie gleiche Keimlinien-VH (DP10) und -VL (L12a) wie CEA6 aufweist, sich aber in cler Sequenz der CDRs beider Ketten unterscheidet;
(ii) scFv P2-1D2, das für das gesamte Rinder-Histon spezifisch ist, mit einer anderen VH (DP75, von VH 1) aber derselben VL;
(iii) scFvI VoDox-1, das für die Verbindung Doxorubicin spezifisch ist, mit einer anderen VH (DP47, von VH3), aber der gleichen VL.
Alle scFv's wurden wie in Beispiel 3 gereinigt, und ELISAs wurden durchgeführt wie unter (a) beschrieben. Fig. 15 zeigt das für jedes getestete Peptid aufgetragene Absorptionsvermögen; keines der getesteten scFv kann spezifisch Peptide linden, die auf CEA6 scFv selektiert wurden. Dies bestätigt nicht nur die Spezifität beider Peptide für CEA6, sondern auch, dass kein Peptid die myc-Markierung oder die his-Markierung erkennt, die auf allen scFv vorhanden sind. In unabhängigen Versuchen wurde von allen selektierten Peptiden gezeigt, dass sie CEA6 binden, das als Human-IgG 1, k, reformatiert wurde, sie zeigten aber keine Bindung an einen nicht verwandten Human-Antikörper des gleichen lsotyps.

(d) Bindungshemmungs-ELISA unter Einsatz der Peptid-Phagen

Die Hemmung der Bindung von cEA6 scFv an CEA wurde durch ELISA gemessen, indem entweder selektierte Peptid-Phagen, natives CEA (positive Vergleiche) oder irrelevante Peptid-Phagen (negative Vergleiche) eingesetzt wurden. CEA wurde auf 96 Napf- Platten in 0,5 ug/ml, 50 ul pro Napf über Nacht bei 37ºC aufgetragen. Die Platte wurde mit 3% MPBS blockiert; unterdessen wurden CEAG scFv in I ug/ml mit einer zehnfachen Verdünnungsreihe (in 3% MPBS) von Phagen aus den Klonen P3G12, P3C8 oder P4A2 oder mit CEA iheginnend bei 55 nM) für 90 min bei Raumtemperatur vorinkubiert. Die vorinkubierten Proben wurden dann für 1 h bei Raumtemperatur auf die blockierten Platten übertragen. Gebundenes CEAG wurde durch Standard-Detektion mit 9E10 (1 ug/ml), gefolgt von Anti-Mäuse-Ig-Alkalische Phosphatase-Konjugat (1 : 2500) und PNPP-Substrat (Signa) detektiert.
Fig. 16 zeigt die Abschwächung des ELISA-Signals durch verschiedene Konzentrationen sowohl spezifischer als auch nicht-spezifischer Phagen im Vergleich zur Hemmung unter Einsatz von nativem CEA. Sowohl die P3G12- als auch die P3C8-Phagen in Konzentrationen von über 1,0 · 10¹&sup0; tE/ml hemmen die CEA-Bindung spezifisch, während irrelevante Phagen (P4A2) das nicht tun.

BEISPIEL 12 - ANALYSE DER TUMOR-AUFNAHME UND DER NORMALEN BIOVER- TEILUNG IM GEWEBE VON ¹²&sup5;I-MARKIERTEM CEA-SPEZIFISCHEM scFv

Beispiel 10 beschreibt die effiziente Lokalisierung von ¹²&sup5;I-markiertem, für CEA spezifischem scFv-CEA6 und TO6D11 in xenotransplantierten Human-Kolon-Tumoren. In einem getrennten Versuch war gezeigt worden, dass alle von der Affinitätsreifung von cEA6 (HBB11, TO6D10, TO6D4, TO6D12 sowie TO6D11 und CEA6) herrührenden seFv's 24 h nach der Injektion im Tumorgewebe vorlagen. Bei diesem Versuch zeigten CEA6 und TO6D12 nach 24 h gemessen die höchsten Tumor : Blut-Verhältnisse (11 : 1). Bei TO6D4 war es geringer (4 : 1), aber der Prozentsatz der injizierten Dosis im Tumor war nach 24 h der höchste (2%). TO6D4 ergab auch günstigere Tumor : Nieren-Verhältnisse, was auf langsamere Clearance hinweist. Weitere beschriebene Versuche wurden durchgeführt, um diese Beobachtungen zu bestätigen, und ergaben einen direkten Vergleich von CEA6, TO6D12 und TO6D4, unter Berücksichtigung einer größeren Anzahl an Zeitpunkten, an denen die aufgenommene Radioaktivität gemessen werden konnte.

a. Markierung von monomerem scFv mit ¹²&sup5;I-Iod

Einzelketten-Fv wurden nach dem Iodverfahren wie in Beispiel 10 angeführt markiert. Nach dem Markieren waren 90%, 85% und 62%, ¹²&sup5;I-CEA6, ¹²&sup5;I-TOGD12 bzw. ¹²&sup5;I- TO6D4 an die CEA-Sepharose-Säule gebunden.

b. Tumor-Xenotransplantat-Modell

Gruppen von 16 Mäusen, die LS174T-Xenotransplantate aLliwiesen, wurde eine einzelne intravenöse Dosis jedes iodierten scFv (1 uCl/50 ug) verabreicht. Gruppen von 4 Mäusen wurden 3, 6, 18 und 24 h nach der Injektion getötet und Tumor- sowie andere Gewebe zur Gammazählung entnommen.
Alle drei scFv's waren bevorzugt im Tumor lokalisiert. Die Spitzenverhältnisse Tumor Blut lagen bei 14,6 : 1 (¹²&sup5;I-CEAG nach 24 h), 6,6 : 1 (¹²&sup5;I-TO6D12 nach 24 h) und 7,4 : 1 (¹²&sup5;I-TO6D4 nach 18 h). Fig. 17 zeigt den mittleren Prozentsatz der ujizierten Dosis pro g (%ID/g) Tumor, aufgetragen für die verschiedenen Zeitpunkte. Zum 24 h-Zeitpunkt betrug der mittlere %ID/g 0,5% (1231-CEAG), 0,4% (¹²&sup5;I-TO6D1 2) und und 1,5% (¹²&sup5;I-TO6- D4). TO6D4 zeigte das günstigste Tumor : Nieren-Verhältnis, was darauf hinweist, dass dieses scFv langsamer ausgeschieden wurde. Allerdings zeigte die Messung der Clearanceraten aus dem gesamten Körper, dass sie nicht unterscheidbar waren, mit einer geschätzten t1/2(α) von etwa 2 h. Die Untersuchung zeigt daher, dass, obwohl Klon TO6- D4 relativ zu jener von CEA6 nicht die langsamste Off-Rate aufweist, er jedoch Eigenschaften erworben hat, die zu einer langsameren Clearancerate nach der Verabreichung in vivo führen. Tabelle 1: Oligonukleotid-Primer, die zur Identifizierung und Charakterisierung von CEA-Antikörpern eingesetzt wurden
B = T, G oder C; H = T,C oder A; M = C oder A; Y = T oder C. Tabelle 2: koff und kOn-Bestimmung von Anti-CEA-scFvs clurch Oberflächen-Plasmon-Resonanz

Tabelle 3: Affinitäten von Anti-CEA scFv's, gemessen durch Bindungshemmungs-ELISA

Klon Dissoziationskonstante (M)
CEA1 1.0 · 10&supmin;&sup6;
CEA2 5.0 · 10&supmin;&sup7;
CEA3 5.0 · 10&supmin;&sup7;
CEA4 1.0 · 10&supmin;&sup7;
CEA4 1.0 · 10&supmin;&sup8;
CEA6 7.0 · 10&supmin;&sup9; Tabelle 4: Relatives Ausmaß an Bindung und Off-Raten von gereinigten CEA-Domänen, die über die an Sensorchips gebundenen scFv's TO6D11 bzv. CEAG geführt wurden
Auf den TO6D11- und CEA6-Chips blieben zu wenige REs der N-Domäne zurück, um die koff zu berechnen.
Tabelle 5: Prozentuelle Hemmung der Bindung von CEA1, CEA2, CEA3, CEA4, CEA5 und CEA6 an CEA durch freie K1- und CA-PSA. Tabelle 6: Durchschnittliche Verhältnisse Gewebe: Blut von CEA6, TO6D11 und KolonscFvs im Mäuse-Modell von Human-Kolon-Adenokarzinom Tabelle 7: Sequenzen der auf CEA6 scFv selektierten Peptid-Phagen
* unterstrichene Sequenzen gehen den Bereich der stärksten Homologie an
§ keine Übereinstimmung in der Primärsequenz festgestellt

Claims

1. Isoliertes spezifisches Bindungselement, umfassend eine Human-Antikörper-Antigen-Bindungsdomäne, die für carcinoembryonales Human-Antigen spezifisch ist, worin die Bindungsdomäne eine Dissoziationskonstante für carcinoembryonales Human-Antigen von unter 1,0 · 10&supmin;&sup8; M aufweist, mit Human-Leberzellen im Wesentlichen nicht kreuzreagiert, sich an die extrazelluläre A3-B3-Domäne von carcinoembryonalem Human-Antigen bindet und/oder sich gegenüber löslichem carcinoembrvonalem Human- Antigen bevorzugt an Zellassoziiertes carcinoembryonales Human-Antigen bindet.

2. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 1, worin die Bindungsdomäne eine Dissoziationskonstante für carcinoembryonales Human-Antigen von unter 5,0 · 10&supmin;&sup9; M aufweist.

3. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 1 oder 2, das sich nicht signifikant an eines oder mehrere von Gefäßendothel, Muskeln, Neutrophile, Erythrozyten und Lymphozyten bindet.

4. Spezifisches Bindungselement nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Human-Antikörper-Antigen-Bindungsdomäne eine VH-Domäne und eine VL-Domäne umfasst, wobei die VH- und die VL-Domäne aus den folgenden Paarungen ausgewählt sind:

(i) der VH-Domäne von CEA6, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(a) gezeigt wird, und der VL-Domäne von CEA6, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(b) gezeigt wird;

(ii) der VH-Domäne von CEA6, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(a) gezeigt wird, und einer VL-Domäne, die aus TO6D4 und TO6D12 ausgewählt ist, deren Aminosäuresequenzen in Fig. 4 gezeigt werden;

(iii) jener von TO6D11, d. h. die VH-Domäne von TO6D10, deren Aminosäuresequenz in Fig. 2 gezeigt wird, und der VL-Domäne von TOGD12, deren Aminosäuresequenz in Fig. 4 gezeigt wird;

(iv) der VH-Domäne von CEAG, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(a) gezeigt wird, der VL-Domäne von TO6D8, deren Aminosä uresequenz in Fig. 4 gezeigt wird;

(v) der VL-Domäne von CEA6, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(b) gezeigt wird, der VH-Domäne von HBB11, deren Aminosäuresequenz in Fig. 2 gezeigt wird;

(vi) der VL-Domäne von CEA6, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(b) gezeigt wird, und der VH-Domäne TO6D10, deren Aminosäuresequenz in Fig. 2 gezeigt wird;

(vii) der VL-Domäne von CEA6, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(b) gezeigt wird, und einer VH-Dornäne, die aus HBA11 und HBB6 ausgewählt ist, deren Aminosäuresequenzen in Fig. 2 gezeigt werden;

(viii) der VH-Domäne von CEA6, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(a) gezeigt wird, und einer VL-Domäne, die aus LOB1C, LOE17 und LOSC2 ausgewählt ist, deren Aminosäuresequenzen in Fig. 3 gezeigt werden;

(ix) einer VH-Domäne, die eine Aminosäuresequenzvariante einer VH-Aminosäuresequenz ist, die in Fig. 1(a) oder Fig. 2 gezeigt wird, und einer VL-Domäne, die eine VL-Aminosäuresequenz aufweist, die in Fig. 1(b), Fig. 3 oder Fig. 4 gezeigt wird;

(x) einer VL-Domäne, die eine VL-Aminosäuresequenzvariante einer Aminosäuresequenz ist, die in Fig. 1(b), Fig. 3 oder Fig. 4 gezeigt wird, und einer VH-Domäne, die eine VH-Aminosäuresequenz aufweist, die in Fig. 1(a) oder Fig. 2 gezeigt wird; sowie

(xi) einer VH-Domäne, die eine Aminosäuresequenzvariante einer VH-Aminosäuresequenz ist, die Fig. 1(a) oder Fig. 2 gezeigt wird, und einer VL-Domäne, die eine Aminosäuresequenzvariante einer VL-Aminosäuresequenz ist, die in Fig. 1(b), Fig. 3 oder Fig. 4 gezeigt wird.

Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 1, worin die Human-Antikörper- Antigen-Bindungsdomäne eine VH1-, VH3- oder VH4-Gensequenz einer der folgenden Keimlinien umfasst: der DP71-Keimlinie, der DP47-Keimlinie; cler DP67-Keimlinie; der DP32-Keimlinie; und der DP10-Keimlinie; oder einer neugeordneten Form davon.

6. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 1, worin die Human-Antikörper- Antigen-Bindungsdomäne eine VI1-, VI3- oder Vk1-Gensequenz einer der folgenden Keimlinien umfasst: der Keimlinie DPLS; der DPL2-Keimlinie, der Keimlinie DPL16; der Keimlinie L12a; oder einer neugeordneten Form davon.

7. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 1, worin die Human-Antikörper- Antigen-Bindungsdomäne eine VH-Domäne umfasst, die eine der in Fig. 1(a) gezeigten Aminosäuresequenzen aufweist, oder eine Aminosäuresequenzvariante einer der in Fig. 1(a) gezeigten VH-Aminosäuresequenzen ist.

8. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 1, worin die Human-Antikörper- Antigen-Bindungsdomäne eine oder mehrere Komplementarität bestimmende Regionen (CDR) mit einer in Fig. 1(a) als CDR1-, CDR-2 oder CDR3-Sequenz identifizierten Aminosäuresequenz umfasst.

9. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 8, worin die Human-Antikörper- Antigen-Bindungsdomäne eine in Fig. 1(a) gezeigte CDR3-Sequenz umfasst.

10. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 1, vvorin die Human-Antikörper- Antigen-Bindungsdomäne eine CDR-Sequenz umfasst, die eine durch Addition, Deletion, Substitution oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren erhaltene Variante einer in Fig. 1(a) als CDR1-, CDR2- oder CDR3-Sequenz identifizierten CDR-Sequenz ist.

11. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 1, worin die Human-Antikörper- Antigen-Bindungsdomäne eine VH-Domäne umfasst, die eine Aminosäuresequenzvariante der CEAG VH ist.

12. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 1, worin die Human-Antikörper- Antigen-bincl ungsdomäne eine VH-Domäne umfasst, die eine der in Fig. 2 gezeigten Aminosäuresequenzen als Variante von CEA6 aufweist oder eine Aminosäuresequenzvariante einer der in Fig. 2 gezeigten CEA6 VH-Varianten-Avninosäuresequenzen ist.

13. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 1, worin die Human-Antikörper- Antigen-Bindungsdomäne eine in Fig. 2 als Variante von CDR3 von CEA6 gezeigte CDR3-Sequenz umfasst.

14. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 1, worin die Human-Antikörper- Antigen-Bindungsdomäne eine VL-Domäne umfasst, die eine der in Fig. 1(b) gezeigten Aminosäuresequenzen aufweist oder eine Aminosäuresequenzvariante einer der in Fig. 1(b) gezeigten VL-Aminosäuresequenzen ist.

15. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 1, worin die Human-Antikörper- Antigen-Bindungsdomäne eine oder mehrere Komplementarität bestimmende Regionen (CDR) mit einer in Fig. 1(b) als CDR1-, CDR2- oder CDR3-Sequenz identifizierten Aminosäuresequenz umfasst.

16. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 1, worin die Human-Antikörper- Antigen-Bindungsdomäne eine CDR-Sequenz umfasst, die eine durch Addition, Deletion, Substitution oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren erhaltene Variante einer in Fig. 1(b) als CDR1-, CDR2- oder CDR3-Sequenz identifizierten CDR-Sequenz ist.

17. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 1, worin die Human-Antikörper- Antigen-Bindungsdomäne eine VL-Domäne umfasst, die eine der in Fig. 3 als Variante von CEAG gezeigten Aminosäuresequenzen aufweist, oder eine Aminosäuresequenzvariante einer der in Fig. 3 gezeigten CEA6 VL-Varianten-Aminosäuresequenzen ist.

18. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 1, worin die Human-Antikörper- Antigen-Bindungsdomäne eine in Fig. 3 als Variante von CDR2 von CEA6 gezeigte CDR3-Sequenz umfasst.

19. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 1, worin die Human-Antikörper- Antigen-Bindungsdomäne eine VL-Domäne umfasst, die eine der in Fig. 4 als Variante von CEAG gezeigten Aminosäuresequenzen aufweist, oder eine Aminosäuresequenzvariante einer in Fig. 4 gezeigten CEA6 VL-Varianten-Aminosiuresequenz ist.

20. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 1, worin die Human-Antikörper- Antigen-Bindungsdomäne eine oder mehrere Komplementarität bestimmende Regionen (CDR) mit einer in Fig. 4 als CDR1, CDR2- oder CDR3-Sequenzvariante einer CEA6 CDR identifizierten Aminosäuresequenz umfasst.

21. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 4, worin die Human-Antikörper- Antigen-Bindungsdomäne die VH-Domäne von CEAG, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(a) gezeigt wird, sowie die VL-Domäne von CEA6 umfasst, deren Aminosäuresequenz in Fig. 1(b) gezeigt wird.

22. Spezifisches Bindungselement nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das ein Einzelketten-Fv-(scFv-) Molekül ist.

23. Spezifisches Bindungselement nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das eine oder mehrere Aminosäuren zusätzlich zu jenen, welche die Human-Antikörper- Antigen-Bindungsdomäne bilden, umfasst.

24. Spezifisches Bindungselement nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das ein Marker- oder Reportermolekül umfasst.

25. Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 23, worin der Marker radioaktives Iod ist.

26. In vitro-Verfahren zum Nachweis der Gegenwart einer Zelle, die carcinoembryonales Human-Antigen exprimiert, wobei das Verfahren das Kontaktieren von Zellen mit einem spezifischen Bindungselement nach Anspruch 1 und das Bestimmen der Bindung des spezifischen Bindungselements an die Zellen umfasst.

21. Verfahren, welches das Veranlassen oder Ermöglichen der Bindung eines spezifischen Bindungselements nach einem der Ansprüche 1 bis 24 an carcinoembryonales Human-Antigen in vitro umfasst.

28. Spezifisches Bindungselement nach einem der Ansprüche 1 bis 24 zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung, welches die Verabreichung des spezifischen Bindungselements an ein Säugetier umfasst.

29. Nukleinsäure, die für eine spezifisches Bindungselement nach einem der Ansprüche 1 bis 23 kodiert.

30. Nukleinsäure nach Anspruch 29, die Teil eines Vektors ist.

31. Zelle, die Nukleinsäure nach Anspruch 29 oder Anspruch 30 umfasst.

32. Verfahren zur Produktion eines spezifischen Bindungselements, welches die Expression aus Nukleinsäure nach Anspruch 29 oder Anspruch 30 umfasst.

33. Verfahren nach Anspruch 32, welches das Kultivieren einer Zelle nach Anspruch 31 umfasst.

34. Verfahren nach Anspruch 32 oder Anspruch 33, worin das spezifische Bindungselement nach der Expression isoliert und/oder gereinigt wird.

35. Verfahren nach Anspruch 32, worin das spezifische Bindungselement zum Formulieren einer Zusammensetzung verwendet wird.