JP5618453B2

JP5618453B2 - 抗癌抗体およびその使用

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Publication number: JP5618453B2
Application number: JP2006540111A
Authority: JP
Inventors: ロジャーマッケンジーコリン; コリンロジャーマッケンジー; ジャンビンチャン; タン−ダングエン; キンガンリー; キーエントランマイ
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 2003-11-28
Filing date: 2004-08-17
Publication date: 2014-11-05
Anticipated expiration: 2024-08-17
Also published as: WO2005052158A1; US7872105B2; PL1694845T3; AU2004293502A1; ES2642565T3; JP2008501304A; EP1694845A1; EP1694845B8; CA2547034C; EP1694845B1; EP1694845A4; CA2547034A1; US20060286113A1; AU2004293502B2

Description

背景
プロテオミックリサーチは、新規の腫瘍標的の発見を大いに促進することが、広く期待されている。主な進歩は、診断目的についての標的の同定においてなされた。しかし、現在の技術の限界が、新規の治療標的の同定を妨害している。プロテオミクスにおいて一般的に使用される技術、例えば、二次元ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）、マトリクス支援レーザー脱離イオン化／質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、および酵母２−ハイブリッド系は、細胞表面マーカーのような“薬物化可能な（drugable）”標的についての要求を満たしていない。

腫瘍を標的にする抗体およびペプチドは、ライブラリディスプレイアプローチ（library display approaches）（例えば、Aina, 2002; Hoogenboom, 1998）によって単離され得る。これは、通常、精製された腫瘍特異的または腫瘍関連抗原に対して、ファージディスプレイライブラリ、または他のディスプレイフォーマットを有するライブラリをスクリーニングすることによって達成される。しかし、腫瘍を標的にする抗体およびペプチドはまた、分子標的についての事前の情報無しに、腫瘍細胞または腫瘍組織に対してライブラリをパンニングする（panning）ことによっても単離された。後者のアプローチの注目に値する利点は、以下である：（ｉ）該単離された抗体／ペプチドは、細胞表面上のそれらの抗原／リガンドの天然形態へ結合し、一方、精製された腫瘍抗原は、しばしば現実には組換え体であり、そして翻訳後の修飾を欠いている、（ｉｉ）該抗原は、該単離された抗体／ペプチドへアクセス可能であり（accessible）、一方、純粋な抗原に対するパンニングにより単離されたものは、膜に天然には埋め込まれているかまたは炭水化物修飾によってブロックされるエピトープを認識し得る。しかし、この方法で単離された抗体／ペプチドは、通常、それらの抗原／リガンドに対して低〜中程度の親和性を有する。

各Ｍ１３ファージ粒子は、マイナーコート蛋白質ｐＩＩＩ（minor coat protein pIII）の５つのコピーを提示するので、ｐＩＩＩの全てのコピーにおいて抗体フラグメントを提示するファージ粒子は、五価の抗体（pentavalent antibody）と考えられ得る。ファージ上における抗体フラグメントのこの多価の提示（multivalent display）は、該抗体のアビディティを大いに増加させ、そしてファージ抗体のスクリーニングおよび評価の両方を促進する。単離された抗体フラグメント（ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）あるいはペプチドは、それらはそもそも一価形態で存在しそしてアビディティを欠いているので、遥かに効率低く抗原に結合する。

pIIIファージディスプレイにおけるような五価を可能にする抗体フラグメントオリゴマー化ストラテジー（antibody fragment oligomerization strategy）は、ＰＣＴ／ＣＡ０２／０１８２９（MacKenzieおよびZhang）の主題である。ベロ毒素のＢサブユニット（ＶＴ１Ｂ）のホモ−五量体化ドメイン（homo-pentamerization domain）へのシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）の融合は、該ｓｄＡｂの同時五量体化を生じさせた。ペンタボディー（pentabodies）と呼ばれる、五価のｓｄＡｂは、それらの単量体対応物よりも遥かにより強力に固定化抗原へ結合する。ペプチドホルモン−結合ｓｄＡｂの場合、五量体化は、固定化抗原への結合において１０^３〜１０^４倍の改善を生じさせた。

本発明の目的は、肺癌について親和性を有するシングル−ドメイン抗体（single-domain antibody）を提供することである。

発明の要旨
本明細書において、癌（そして特に、肺癌）への結合について特異的親和性を有する、新規のシングルドメイン抗体ＡＦＡＩおよびそのフラグメントが提供される。この抗体、およびその部分は、特に、癌の診断および治療において使用され得る。

好ましい実施形態の詳細な説明
プロテオミクスリサーチは、多くの新規の腫瘍標的を提供した。しかし、いくつかの制限に起因して、薬物適用に最もアクセス可能である標的を同定することは困難であった。腫瘍細胞に対してシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）ライブラリをスクリーニングし、そして引き続いて単離された抗体の対応の抗原を同定することに基づく、新規の腫瘍抗原ディスカバリープラットフォーム（discovery platform）が、本明細書に記載される。非小細胞肺癌（non-small cell lung carcinoma）（Ａ５４９細胞系）について特異的な、特異的ｓｄＡｂ、ＡＦＡＩを、実施例１に記載のように、ラマの重鎖抗体レパートリーから誘導されたファージライブラリから単離した。非毒性ベロ毒素Ｂサブユニットのホモ五量体化特性（homopentamerization property）を、ＥＳ１ペンタボディー、ＡＦＡＩの五量体形態を作製するために使用した。五量体化は、Ａ５４９細胞へのＡＦＡＩの結合を劇的に向上した。免疫組織染色は、ＥＳ１が肺癌について非常に特異的であることを示した。

本明細書中の開示を考慮して、標準技術に従って、ＥＳ１についての全遺伝子を化学合成しそして大腸菌または別の好適な生物においてそれを発現させることが、可能である。ＡＦＡＩの遺伝子は、その抗原に対して結合エンティティー（binding entity）である、ＥＳ１から合成され得る。本明細書中の開示を考慮して、ＡＦＡＩの二量体、三量体、四量体、他の五量体および他の多価形態を作製することが可能である。このようなプロダクトは、本発明に関連する方法および組成物において有用であり得、本明細書中で記載されるように、問題の悪性組織または細胞への特異的結合を提供するこのようなプロダクトの変異体を提供するＤＮＡおよびクローン材料も有用であり得る。

ＥＳ１、ＡＦＡＩおよび／または類似の結合特異性を示すその変異体（“好適な変異体”）は、肺癌の診断および治療に有用である。従って、ＥＳ１、ＡＦＡＩおよび／またはその好適な変異体が使用され得る診断方法としては、以下が挙げられる：免疫組織化学法；分子（ＥＳ１、ＡＦＡＩ、変異体）をラジオアイソトープで標識し、そして陽電子断層撮影法およびＭＲＩのような腫瘍画像化ツールで検出すること；血液サンプルの分析（および標準技術を使用して結合を検出すること）。

ＥＳ１、ＡＦＡＩおよび／またはその好適な変異体ならびにそれらの使用についての使用説明書を含む診断キットが、具体的には考えられる。

ＥＳ１およびＡＦＡＩに関連する治療方法および組成物は、ＡＦＡＩ、ＥＳ１、またはその好適な変異体を使用すること、そして、例えば、それらをラジオアイソトープで標識し、そして該分子を患者へ適用すること；それらを１以上の従来の治療剤（therapeutics）へ複合体化し、そして該複合体を患者へ適用すること；それらを１以上の毒素へ複合体化し、そして該複合体を患者へ適用すること；ＥＳ１、ＡＦＡＩおよび／またはその好適な変異体をコードする核酸分子を遺伝子治療ベクターにおいて発現させ、そして該ベクターを患者へ適用することを包含する。

結果
実施例１：
細胞培養物
非小細胞肺癌細胞系Ａ５４９を、ＡＴＣＣ（Manassas, VA）から購入し、そして５％ＦＢＳ（Gibco）および１％Antibiotic-Antimycotic（Gibco）が補充されたＤＭＥＭ（Gibco, Rockville, MA）中において維持した。一次ヒト皮膚線維芽細胞は、親切なことに、Dr. J. Xu（Apotex Research Inc. Ottawa, ON）によって提供された。ポリクローナルウサギ抗−ベロ毒素抗血清は、親切なことに、Dr. Clifford Lingwood（Univ. of Toronto）によって提供された。

非小細胞肺癌細胞系Ａ５４９へ結合するｓｄＡｂＡＦＡＩの単離
ナイーブラマシングルドメイン抗体ライブラリ（naive llama single domain antibody library）（Tanhaら、2002）は、腫瘍細胞（今回の場合、非小細胞肺癌細胞系Ａ５４９）に特異的な抗体フラグメントの供給源として役立った。セルパンニング（cell panning）と呼ばれる、Ａ５４９細胞へ結合するファージ抗体の単離を、パンニングの各ラウンドで、ヒト線維芽細胞における該ライブラリのプレ吸着を伴って、Ａ５４９細胞を用いて行った。

ｓｄＡｂファージディスプレイライブラリ（Tanhaら、2002）を、標的細胞としてのＡ５４９およびサブトラクティング細胞（subtracting cells）としてのヒト皮膚線維芽細胞を用いて、パンニングした。パンニングを、若干の改変を伴って、Becerrilら（1999）に記載されるように行った。パンニングの第一ラウンドのために、１０^１３ｐｆｕを、サブトラクティング線維芽細胞と共にインキュベートして、線維芽細胞結合ファージを除去した。上澄み中に残存するファージ粒子を、室温で１時間、５ｃｍペトリ皿中で培養したＡ５４９細胞と共にインキュベートした。該Ａ５４９細胞を、ＰＢＳで５回、各１分、そしてストリッピング緩衝液（stripping buffer）（５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．８、０．５ＭＮａＣｌ、２Ｍ尿素、２％ポリビニルピロリドン）で５回、各１０分、洗浄し、次いで１００ｍＭトリエチルアミンで溶解させた。細胞溶解物を、１００μｌの１Ｍトリス（ｐＨ７．０）の添加によって中和した。該中和された細胞溶解物中のファージを、大腸菌ＴＧ１細胞中で増幅させた。該増幅されたサブ−ライブラリ（sub-library）を、同一の方法を使用して、パンニングの次のラウンドへ供した。個々のファージクローンを、パンニングの４ランド後に選択し、そしてディスプレイされた抗体をコードするＤＮＡ配列を測定した。

個々のファージクローンを、パンニングの４ラウンド後に単離し、そして該ファージクローンの細胞結合活性を、ＥＬＩＳＡによって検査した。９４クローンのうち、２５クローンが陽性の検査結果であった。ＥＬＩＳＡ陽性ファージクローンの配列分析は、全ての２５陽性ファージクローンが同一のｓｄＡｂをディスプレイすることを示した。この抗体は、該抗体のＣＤＲ３領域がテトラペプチドＡｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅであるので（図１）、ＡＦＡＩと名付けられた。

実施例２
細胞染色パートＡ：ファージ提示されたＡＦＡＩでの細胞染色
Ａ５４９細胞を、第１抗体としてのＡＦＡＩファージで、続いて抗−Ｍ１３モノクローナル抗体そしてＦｌｕｏｒ５４６標識化ヤギ抗−マウスＩｇＧで免疫染色した場合、非常に強い蛍光シグナルが、細胞サブポピュレーション（cell sub-population）と関連することが観察された（図２）。陽性Ａ５４９細胞の染色パターンは、ＡＦＡＩが十分な膜抗原（abundant membrane antigen）へ結合することを示唆した。

Ａ５４９細胞へのＡＦＡＩファージの結合が細胞型特異的であるかどうかを調べるために、ヒト気管支上皮細胞細胞系（human bronchial epithelial cell line）、ＨＢＥ４、ヒト前立腺細胞系、ＰＲＥＰ、および一次ヒト線維芽細胞系を、免疫細胞化学染色についてのコントロールとして選択した。Ａ５４９免疫細胞化学について使用した同一条件下で、ヒト線維芽細胞で染色は観察されず、そしてほんの非常に弱い染色が、ＨＢＥ４およびＰＲＥＰで観察された。

実施例３
細胞染色パートＢ：単量体および五量体ＡＦＡＩｓｄＡｂの調製ならびに該ｓｄＡｂでの細胞染色
ＡＦＡＩの更なる評価およびキャラクタライゼーションのために、単量体および五量体ＡＦＡＩを発現させそして精製した。ＡＦＡＩをコードする遺伝子を、ＰＣＲによって増幅し、そして大腸菌発現ベクターへ挿入し、クローンｐＡＦＡＩを作製した（図１Ｂ）。ペンタボディーの高アビディティ効果を活用するために、ＥＳ１と呼ばれる、ＡＦＡＩの五量体形態を構築した（図１Ｂおよび図１Ｃを参照のこと）。発酵最適化無しでの、大腸菌ＴＧ１の１リットルフラスコ培養物からの精製されたＡＦＡＩおよびＥＳ１の収量（図１Ｄ）は、それぞれ、６ｍｇおよび２０ｍｇであった。

簡潔には、ｓｄＡｂＡＦＡＩをコードするＤＮＡを、プラスミドｐＳＪＦ２（Tanha, 2003）のＢｂｓＩ／ＢａｍＨＩ部位およびプラスミドｐＶＴ２のＢｂｓＩ／ＡｐａＩ部位へクローン化し、単量体および五価ＡＦＡＩについての発現ベクターをそれぞれ作製した。得られた大腸菌クローンを、ｐＡＦＡＩ（モノマー）およびｐＥＳ１（ペンタマー）と名付けた。蛋白質ＡＦＡＩおよびＥＳ１を、浸透圧ショックの代わりに細胞溶解による大腸菌細胞からの蛋白質抽出という改変を伴って、Tanhaら（2003）に記載されるように作製した。簡潔には、ｐＡＦＡＩおよびｐＥＳ１クローンを、０．４％カザミノ酸、５ｍｇ／ｌビタミンＢ１および２００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充した、１００ｍｌＭ９培地（０．２％グルコース、０．６％Ｎａ_２ＨＰＯ_４、０．３％ＫＨ_２ＰＯ_４、０．１％ＮＨ_４Ｃｌ、０．０５％ＮａＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭＣａＣｌ_２）へ接種し、そして３７℃で一晩振盪した。３０ｍｌの一晩Ｍ９培養物を、同一の補充物を含む１リットルのＭ９倍地へ移し、そして２４時間３７℃で振盪した。遺伝子発現の誘発を、１００ｍｌ１０×ＴＢ栄養剤（１２％トリプトン、２４％酵母抽出物、４％グリセロール）、２ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンおよび１ｍｌの１ＭＩＰＴＧの添加によって開始し、そして培養物を室温で４８〜７２時間振盪した。大腸菌細胞を遠心分離によって収穫し、そしてEmulsiflex^TM Cell Disruptor (Avestin Inc. Ottawa, ON)で溶解させた。細胞溶解物を遠心分離し、得られたクリアな上澄みを、Hi-Trap^TM Chelating Affinity Column (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)へロードし、そしてＨｉｓ_５タグを含有する蛋白質を、製造業者の使用説明書に従って精製した。

Ａ５４９細胞の免疫化学染色を、単量体（ＡＦＡＩ）および五量体（ＥＳ１）抗体の両方を用いて行った。

標準免疫化学方法を、若干の改変を伴って、ＡＦＡＩファージならびに単量体および五量体ＡＦＡＩを用いての細胞染色において使用した。細胞を、スライドカバースリップ（slide cover slips）において、約７０％コンフルエンスまで増殖させ、そしてＰＢＳ中４％ホルムアルデヒドで１０分間固定した。浸透化（permeabilization）を、０．０５％ＮＰ−４０（Bio-Rad, Hercules, CA）中室温において３０分間行い、続いて０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。ＡＦＡＩファージでの細胞染色のために、２×１０^１１ｐｆｕのＡＦＡＩファージ（Ａ５４９培地中）を、４℃で１８時間固定化細胞と共にインキュベートし、そしてＰＢＳＴで３回、各５分、洗浄した。単量体または五量体ＡＦＡＩでの細胞染色のために、１００μｇ／ｍｌのＡＦＡＩおよびＥＳ１（Ａ５４９培地中）を、室温で２時間、該細胞と共にインキュベートし、そしてＰＢＳＴで３回洗浄した。二次抗体、Ｍ１３ファージについてはモノクローナル抗−Ｍ１３ＩｇＧ（Amersham Biosciences）またはＥＳ１ペンタボディーについては９Ｅ１０抗ｃ−ｍｙｃＩｇＧ（ATCC）を室温で３０分間、１：１００希釈で適用し、続いてＰＢＳＴで３回洗浄した。三次抗体、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６−標識化ヤギ抗−マウスＩｇＧ^ＴＭ（Molecular Probes, Inc, Eugene, OR）を、１：１００で希釈し、そして二次抗体と同一の様式で適用した。対比染色を、ＤＡＰＩおよび（ＤｉＯＣ_５）_３（Molecular Probes）で行った。免疫化学染色に続いて、カバースリップを、Prolong Antifade Kit（Molecular Probes）を使用して載せ、そしてOlympus BX51^TM蛍光顕微鏡下で観察し、画像を記録した。

ＡＦＡＩを使用した場合、恐らく単量体ＡＦＡＩの低結合親和性のために、明確な染色は観察されなかった（図３）。しかし、Ａ５４９細胞を染色するＡＦＡＩ抗体の能力が、五量体形態、ＥＳ１を使用した場合に観察された（図３）。ＡＦＡＩファージで観察されるように、ＥＳ１は、Ａ５４９細胞のサブポピュレーションのみを染色する。

実施例４
腫瘍組織に対するＥＳ１の特異性の測定
ＥＳ１の組織特異性を測定するために、一次抗体としてＥＳ１を使用して、組織マイクロアレイ上において、広範囲の組織の免疫組織化学染色を行った。結果は、ＥＳ１は、中程度から強い免疫反応性を示すことによって、大抵の肺腺癌を認識することを示した。いずれの結腸腺癌もＥＳ１について強い免疫反応性を示さず、しかし、限局性の弱い（focal weak）〜中程度の免疫反応性が、数個のケースにおいて観察された。非癌性肺および結腸組織は、免疫反応性ではなかった（図４、表１）。

免疫組織化学染色
ＥＳ１の組織特異性を測定するために、広範囲の組織の免疫組織化学染色を、一次抗体としてＥＳ１を使用して行った。

一次抗体としてＥＳ１を使用するヒト組織の免疫染色を、パラフィンブロックから切断した４ミクロン厚切片上において、ＡＢＣキット（Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA）を用いて、アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ）方法を使用して行った。

ＭＩＢ１（Dako, 希釈１：１００）およびＴＴＦ１（Dako, 希釈１：５０）、肺腺癌検出において広く使用される２つの抗体、を使用してのヒト組織の免疫染色を、ペルオキシダーゼ−アンチペルオキシダーゼ技術を使用して行った。

形態学評価
ＥＳ１についての免疫反応性を、２人の病理学者によって評価し、そして、連続的な膜および／または細胞質染色パターンが存在した場合、中程度にまたは強く陽性の染色と、そして不連続な膜または弱い細胞質染色が存在した場合、弱く陽性と採点した。中程度または強い染色パターンを、更に、細胞の１０％までを１、そして１０％超を２、５０％超の染色を示す場合において３と採点した。矛盾したスコアを含む場合をレビューした。

肺、結腸、胸胃、膵臓、前立腺、子宮内膜、卵巣、甲状腺および中皮の腫瘍を含む１４３切除またはバイオプシー検体を得た（表１）。各ケースについて、代表的な腫瘍組織の１つのサンプル（直径２ｍｍ）を、パラフィンブロックから取り出し、そして他の腫瘍サンプルで再度埋め込み、少なくとも１５の異なる組織を含有する組織マイクロアレイパラフィンブロック（tissue microarray paraffin block）を作製した。正常な組織もまた、腫瘍組織から遠い非腫瘍組織からおよび正常な剖検肺組織からサンプル化した。マイクロアレイ組織が陰性、弱いまたは限局性免疫反応性を示す、肺、結腸、胸胃膵臓膀胱、胆嚢、食道および卵巣のケースを、大きな組織片を使用して、ＥＳ１についての免疫染色のために再提出した。

表２は、結腸、乳房、尿路上皮癌および他の粘液分泌腺癌（mucus-secreting adenocarcinomas）の組み合わされたグループと、非扁平上皮大細胞肺腺癌（non- squamous large cell lung carcinomas）のグループの免疫染色を比較する。弱いかまたは陰性のＥＳ１免疫反応性を示す他のタイプの癌を除いて、肺非扁平上皮大細胞癌についてのＥＳ１免疫反応性の感受性および特異性は、それぞれ、９７および４５％であった。陽性予想値は５４％であった。

結果は、ＥＳ１は大抵の肺腺癌について中程度から強い免疫反応性を示すことを示した。いずれの結腸腺癌も、ＥＳ１との強い免疫反応性を示さなかった；しかし、弱から中程度の限局性免疫反応性が、数個のケースで観察された。非癌性肺および結腸組織は、免疫反応性ではなかった。

反応性は、しばしば、細胞質中（図８）よりも膜上（図５、６、７）においてより強かった。陽性免疫染色のパターンは、散在性から（図５、６）腫瘍部分または個々の細胞における限局性染色（図７、８）へ変化した。マイクロアレイ切片において陰性、弱いまたは限局性免疫反応性の９３ケースのうち、１または２の免疫反応性のスコアを示した１１個の大きな切片が存在した。表１は、全ての検体の免疫染色についての最終的な知見を要約している。

７個の気管支肺胞癌および２２個の十分に分化している〜ほとんど分化していない（well to poorly-differentiated）腺癌、６個の大細胞未分化癌を含む肺の３５の非扁平上皮大細胞癌は、それぞれ、７、１７および１０の腫瘍において、１，２および３の免疫反応性のスコアを示した（図５〜８）。残りの癌は、陰性免疫反応性を示す扁平上皮分化（squamous differentiation）のいくつかの特徴を有する未分化大細胞癌であった。限局性の中程度から強い免疫反応性を有する腫瘍（１０％未満免疫反応性細胞）は、十分に分化した非粘液性腫瘍であった。２つの腺扁平上皮癌もまた、腺癌部分において１および２の免疫反応性のスコアを示した（図９）。肺の５つの異型腺腫様過形成（atypical adenomatous hyperplasias）のうち４つが、限局性または弱い免疫反応性を示した（図１０）。癌を伴うかまたは伴わない、全ての純粋な扁平上皮癌、カルチノイド腫瘍（carcinoid tumors）、正常および反応性肺実質が、該抗体について反応性でなかった。

１５個の腺癌結腸腺癌（adenocarcinoma colonic adenocarcinomas）、８個の乳癌、４個の尿路上皮癌ならびに膵臓（６）、胃（６）および胆嚢（１）、食道（３）、膀胱（２）、卵巣（３）および気管（１）の腺癌を含む５３個の非肺かつ粘液分泌性腫瘍（non-lung and mucus-secreting tumor）について、免疫反応性は、１５、１１、３、１２および１２個において、それぞれ、１、２、３、弱および陰性と採点された（図１１、１２）。結腸腺癌は、より散在性かつ強い免疫反応性を有する腫瘍のサブグループを形成した。結腸腺腫は、限局性または弱い免疫反応性を示しただけであった。

３２の非肺かつ非粘液性腫瘍について、免疫反応性は、陰性または弱であった。癌の周囲の領域からまたは癌を有していない器官からの、肺、肝臓、膵臓、腎臓、膀胱、子宮内膜、甲状腺、食道および卵巣からの正常組織は、癌について反応性ではなく、時折の腺房（occasional acini）において中程度の陽性を示す乳組織（乳管癌を囲む）の１ケースの例外があった。

スコア１または２の免疫反応性を有する２４の非扁平上皮大細胞肺癌の２４の大きな切片において行ったＭＩＢ１についての免疫染色は、陰性、弱いまたは限局性のＥＳ１−免疫反応性細胞を有する領域と比較して、多数のＥＳ１−免疫反応性細胞の領域において、腫瘍細胞の増殖性の顕著な増加を示した。ＴＴＦ１についての免疫染色を、マクロアレイ組織において行った。全ての非肺かつ非甲状腺組織は、陰性の核免疫反応性（negative nuclear immunoreactivity）を示した。３５の肺非扁平上皮大細胞癌について、ＴＴＦ１免疫反応性は、５個の未分化大細胞癌、２つの乏しく分化した腺癌および１つの粘液性気管支肺胞癌（mucinous bronchiolo-alveolar carcinoma）を含む８つのケースにおいて、陰性であった。他のタイプのマイクロアレイ組織は、免疫反応性ではなかった。

この研究において、ＥＳ１免疫反応性は、ほぼ完全に悪性腫瘍、特に肺腺癌に限定されていた。非粘液性気管支肺胞癌（non-mucinous bronchiolo-alveolar carcinomas）が限局性免疫反応性のみを示したので、粘液成分を有する肺腫瘍において免疫反応性がより強い傾向が存在した。ＥＳ１免疫反応性は、肺腺癌においてよりも弱くそして限局性の染色を有する多数の結腸腺癌において陽性であった。興味深いことに、ＥＳ１免疫染色は、未分化大細胞肺癌の免疫染色におけるＴＴＦ１の低感度と比較して、原発性ならびに転移性部位における未分化大細胞肺癌について２または３をスコアリングのままであった（^＊）。更に、結腸腺腫は、限局性の弱いかまたは陰性の免疫反応性のみを示した。他の器官からの粘液性腺癌は、少数のケースにおいて、スコア２、限局性または弱い免疫反応性を示した。この研究において、肺腺癌において同定された免疫反応性変化は、ＡＦＡＩ抗原のアップレギュレーションに対応する傾向があった。この印象は、ＭＩＢ１についての免疫反応性によって実証されたように、増加された増殖性（proliferativity）を有する肺の癌の領域における陽性ＥＳ１免疫反応性の発見によって支持される。

ＡＦＡＩの使用およびバリエーションの非限定的考察
ＡＦＡＩ抗原は、肺腺癌において、分化の程度がより低い（less differentiated）腫瘍においてさえ、アップレギュレーションされるようである。ＥＳ１は、肺の乏しく分化した肺腺癌について、ＴＴＦ１よりも感度の高いマーカーでありそうである。試験された大抵の正常な組織はＥＳ１−免疫反応性ではなかったので、ＥＳ１は、肺腺癌および多数の結腸癌および乳癌についてのスクリーニングテストの開発における使用に好適である。

本発明の実施形態において、図１に示されるようなＡＦＡＩのアミノ酸配列、あるいはそれに少なくとも９０％、９５％または９８％同一であるアミノ酸配列が提供される。関心のある変異アミノ酸配列の例が、表ＩＩＩに示され、ここで、変化していない残基はハイフンによって示されている。ＡＦＡＩが、抗原結合または特異性に干渉しない位置で変異され得ることが、理解される。特に興味のある部位としては、いくつかの可能な変異が表ＩＩＩに示されるものが挙げられる。いくつかの可能な変異体しか示されていないが、表ＩＩＩに記載されるアミノ酸変化の１またはそれ以上によって配列番号１とは異なるＡＦＡＩの全ての変異体を包含する、全ての機能的な変異体が、明確に意図されておりかつ本発明の範囲内であることが理解されるであろう。

本発明の実施形態において、図１に示されるようなＡＦＡＩの下線が引かれた（ＣＤＲ）領域に対して完全な配列同一性を有しそしてその配列の残りの部分に対して少なくとも４０％、６０％、８０％、または９０％配列同一性を有するアミノ酸配列が提供される。また、このようなアミノ酸配列をコードする核酸配列も提供される。

本発明の実施形態において、図１に開示されるようなＡＦＡＩをコードする核酸配列、あるいはそれに対して少なくとも９０％または９５％同一なアミノ酸配列が提供される。本発明の実施形態において、表２に示される、あるいはその連続する２５０核酸領域に対して、あるいはこのような核酸配列に対して相補的なＡＦＡＩまたはＥＳ１の配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％の配列同一性を有する蛋白質をコードする核酸配列が提供される。本発明の実施形態において、ＡＦＡＩをコードする核酸またはその部分の増幅に好適なＰＣＲプライマーが提供される。場合によっては、該部分は、少なくとも１つのＣＤＲ領域を含む。

本発明の実施形態において、以下の３つの連続アミノ酸配列：ＫＮＬＭＧ、ＴＩＳＧＳＧＧＴＮＹＡＳＳＶＥＧおよびＡＦＡＩの少なくとも１つを含む少なくとも９０アミノ酸を含むポリペプチド配列が提供される。

本発明の実施形態において、ポリペプチドを抗原結合フラグメントへグラフトすることによって複合体を形成することにおける、ＡＦＡＩ誘導ポリペプチドおよび／または配列番号１に対して少なくとも９０％同一性を有するポリペプチドおよび／またはその一部の使用が提供される。場合によっては、１以上のＡＦＡＩＣＤＲが、例えば、ＶＨＨ、ＶＨまたはＶＬフレームワーク（足場（scaffold））または免疫グロブリンおよび／またはそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ）を含む、抗原結合フラグメントへグラフトされる。１またはそれ以上のＡＦＡＩＣＤＲはまた、融合蛋白質を作製するために使用され得、ここで、第２ポリペプチド配列が、有用な官能性または特性を提供する。場合によっては、当該分野において公知の技術を使用してＡＦＡＩ抗体のヒト化変異体を作製することが望ましいかもしれない。このようなヒト化抗体は、本明細書中で明確に意図される。場合によっては、ＡＦＡＩまたはその一部を自己集合分子（self assembly molecules）へ複合体化して、増強された抗原結合特性を有する多量体複合体（multi meric complexes）を形成させることが望ましい。

本発明の実施形態において、該３つの連続アミノ酸配列の少なくとも１つを含むポリペプチドとカーゴ分子（単数又は複数）との複合体が提供される。カーゴ分子は、癌の診断または処置に有用であり得る。例えば、それは、組織中の問題の細胞の同定および位置決定（localization）において有用な酵素または放射性同位体であり得、あるいはそれは、癌細胞の増殖する生存能または能力を減少させることにおいて有用な、薬物、更に強い抗原、アポトーシス誘導剤（apoptosis inducer）または放射性同位体のような細胞傷害剤（cytotoxic agent）であり得る。

参考文献の組み込みは、それが本明細書中に開示されるものの特許性に関連しているという承認または示唆ではない。

図１は、単量体および五量体ＡＦＡＩの図である。（ａ）下線が引かれているＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するＡＦＡＩの配列（配列番号１）；（ｂ）単量体（ＡＦＡＩ）および五量体（ＥＳ１）蛋白質の一次構造の略図；（ｃ）下線が引かれているＡＦＡＩを有するＥＳ１の配列（配列番号２）；（ｄ）精製されたＥＳ１（レーン１）およびＡＦＡＩ（レーン２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。図２は、ＡＦＡＩファージ抗体でのＡ５４９細胞の免疫組織化学染色の画像図である。細胞を、第１抗体としての該ＡＦＡＩファージ、第２抗体としてのマウス抗−Ｍ１３ＩｇＧ、および第３抗体としてのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６標識化ヤギ抗−マウスＩｇＧへ暴露した。ＤＡＰＩおよびＤｉＯＣ_５（３）を使用して、細胞核および細胞内小胞体をそれぞれ染色した。図３は、ＡＦＡＩおよびＥＳ１でのＡ５４９の免疫組織化学染色の画像図である。Ａ５４９細胞を、第１抗体としてのＥＳ１（Ａ）またはＡＦＡＩ（Ｄ）のいずれか、第２抗体としてのモノクローナル抗−ｃ−ｍｙｃＩｇＧ、第３抗体としてのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６（レッド）標識化抗−マウスＩｇＧへ暴露した。（Ａ）および（Ｄ）のＤＡＰＩ染色を、それぞれ、（Ｂ）および（Ｅ）に示す。Ａ，ＢおよびＤ，Ｅの重ね合わせを、それぞれ、ＣおよびＦに示す。図４は、ＥＳ１が、分化した肺腺癌へ強力に結合し、そして大抵の結腸腺癌または正常な肺組織へは結合しないことを示す、免疫組織化学染色の画像図である：（Ａ）肺腺癌の強い陽性染色、（Ｂ）（Ａ）において囲まれた領域の拡大図、（Ｃ）結腸腺癌の陰性染色、および（Ｄ）正常な肺組織の陰性染色。図５は、粘液性タイプの気管支肺胞癌の図である：（Ａ）主として管腔縁（luminal borders）に沿う、散在性の中程度の免疫反応性を示すＥＳ１についての免疫染色；（Ｂ）Ａにおける領域の高倍率；（Ｃ）陰性免疫反応性を示すＴＴＦ１（ＤＡＫＯ）についての免疫染色。図６は、転移性の分化に乏しい肺腺癌の図である：（Ａ）散在性の強い免疫反応性を示すＥＳ１についての免疫染色；（Ｂ）Ａにおける領域の高倍率；（Ｃ）陰性免疫反応性を示すＴＴＦ１についての免疫染色。図７は、肺の中程度に分化した腺癌の図である：（Ａ）限局性の弱い染色を示す領域に隣接する限局性領域（focal area）における強い免疫反応性を示すＥＳ１についての免疫反応性；（Ｂ）Ａにおける領域の高倍率；（Ｃ）強いＥＳ１免疫反応性を有する領域における免疫反応性の顕著な増加を示すＭＩＢ１（ＤＡＫＯ）についての免疫染色。図８は、肺の分化の乏しい腺癌の図である：（Ａ）中程度かつ広範囲の免疫反応性を示すＥＳ１についての免疫染色；（Ｂ、Ｃ）Ａにおける領域の高倍率。正常な気管支上皮における陰性免疫染色に注意のこと。図９は、肺腺扁平上皮癌の図である：（Ａ）限局性免疫反応性を示すＥＳ１についての免疫染色；（Ｂ、Ｃ）限局性免疫反応性を示すＡにおける領域の高倍率。図１０は、肺の典型的な腺腫様過形成の図である：（Ａ）限局性の弱い免疫反応性を示すＥＳ１についての免疫染色；（Ｂ、Ｃ）弱い免疫反応性を示すＡにおける領域の高倍率。図１１は、脳における転移性の中程度に分化した結腸腺癌の図である：（Ａ）数個の単一細胞における限局性免疫反応性を示すＥＳ１についての免疫染色；（Ｂ）Ａにおける領域の高倍率。図１２は、胸の浸潤している乳管癌(duct cartinoma)の図である：（Ａ）限局性の中程度の免疫反応性を示すＥＳ１についての免疫染色；（Ｂ）Ａにおける領域の高倍率；（Ｃ）正常な胸組織における数個の腺房における限局性の強い免疫反応性。

Claims

配列番号４のアミノ酸配列（ＣＤＲ１）、配列番号６のアミノ酸配列（ＣＤＲ２）、配列番号３のアミノ酸配列（ＣＤＲ３）、及び非毒性ベロ毒素Ｂサブユニットを含む単離されたポリペプチドであって、非小細胞肺癌に結合するポリペプチド。
ＣＤＲ１とＣＤＲ２との間に１２〜１６アミノ酸、ＣＤＲ２とＣＤＲ３との間に３０〜３４アミノ酸そしてＣＤＲ１とＣＤＲ３との間に４６〜６６アミノ酸のギャップが存在する、請求項１に記載のポリペプチド。
配列番号５のアミノ酸配列及び非毒性ベロ毒素Ｂサブユニットを含む、単離されたポリペプチドであって、非小細胞肺癌に結合するポリペプチド。
配列番号１のアミノ酸配列及び非毒性ベロ毒素Ｂサブユニットを含む、単離されたポリペプチドであって、非小細胞肺癌に結合するポリペプチド。
肺癌細胞へ放射性同位体、薬物、毒素、酵素、細胞傷害剤、又はアポトーシス誘導剤を標的化することにおける、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
放射性同位体、薬物、毒素、酵素、細胞傷害剤、及びアポトーシス誘導剤からなる群より選択される少なくとも一種の分子と、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドとを含む、複合体。
哺乳類組織における肺癌細胞を検出することにおける、請求項６に記載の複合体のインビトロでの使用。
（ａ）請求項６に記載の複合体；および
（ｂ）請求項７の使用を行うための使用説明書
を含む、キット。
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むオリゴマー。
配列番号２のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドのオリゴマー。
少なくとも１つのサブユニットが放射性同位体、薬物、毒素、酵素、細胞傷害剤、又はアポトーシス誘導剤を含む、請求項９又は１０に記載のオリゴマー。
（ａ）請求項９又は１０に記載のオリゴマー；および
（ｂ）オリゴマーの使用を行うための使用説明書
を含む、キット。
配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。