CN117242093A - 免疫组织化学方法和kir3dl2特异性试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测石蜡包埋组织样本中的KIR3DL2表达的抗体和方法。还提供了制备抗体、抗体片段及其衍生物的方法，该抗体、抗体片段及其衍生物在石蜡包埋组织样本中与其靶抗原特异性结合。

Description

免疫组织化学方法和KIR3DL2特异性试剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年4月5日提交的美国临时申请号63/170,603的权益；该美国临时申请全文以引用方式并入本文；包括任何附图。
对序列表的引用
本申请连同电子格式的序列表一起提交。序列表以2022年3月30日创建的名为“KIR-12PCT Sequences_ST25”的文件提供，其大小为25.7KB。该序列表的电子格式中的信息全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及用于检测生物样本(例如石蜡包埋组织样本)中的KIR3DL2的研究和诊断工具。本发明还涉及使用所述工具以检测表达KIR3DL2的细胞的方法。
背景技术
杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)为受体家族，其与C型凝集素受体(CD94-NKG2)一起被人NK细胞和T淋巴细胞子集用于特异性识别MHC I类分子。
在杀伤细胞免疫球蛋白(Ig)样受体(KIR)家族的成员中，已经研究了杀伤细胞免疫球蛋白样受体、3Ig结构域和长胞质尾区2(KIR3DL2)作为用于治疗恶性肿瘤的靶标，该恶性肿瘤涉及表达KIR3DL2受体的CD4+T细胞，特别是CD4+T细胞，包括皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)，诸如蕈样真菌病和塞扎里氏综合征(参见例如WO2010/081890和WO02/50122)。KIR3DL2受体还经常由其他外周T细胞淋巴瘤(PTCL)中的肿瘤细胞来表达，并且在正常淋巴细胞上以低频率表达。
已经开发出靶向KIR3DL2受体并且在表达KIR3DL2的细胞恶性肿瘤、特别是CD4+T细胞恶性肿瘤的治疗中呈现增加的活性的单克隆抗体(参见例如WO2014/044686)。
为了更好地理解肿瘤环境，通常希望检测存在于肿瘤组织中的KIR3DL2受体。这可例如使用冷冻组织样本进行。这不仅在研究中有用，而且还可帮助决定要使用什么类型的治疗，例如通过检测组织(例如，肿瘤环境)是否以存在作为治疗(例如，免疫疗法)的靶标的蛋白质为特征。为了选择能够调节该蛋白质和/或表达该蛋白质的细胞的活性的治疗，该信息可能有价值。
适用于检测细胞培养物中或冷冻组织样本中的KIR3DL2多肽的一些抗体是已知的。抗体12B11和19H12实际上适用于肿瘤细胞的表面上的KIR3DL2表达的检测(例如，体外测定)，因为12B11和19H12均能够在检测测定中检测KIR3DL2阳性细胞。12B11对于使用冷冻组织切片的免疫组织化学测定是有利的，而19H12对于流式细胞术检测是有利的。
触及冷冻组织样本为限制因素，需要开发用于检测其他样本(诸如已经保存为福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本的组织样本)中的KIR3DL2的新测试。遗憾的是，通常不可能找到有效起作用并在FFPE切片中具有特异性的KIR3DL2特异性单克隆抗体。据信这是由于福尔马林固定对蛋白质结构的影响。重组蛋白或细胞上由被描述为具有特异性的抗体结合的表位在用于FFPE中时通常存在于其他蛋白质上，从而使这些抗体是非特异性的。在其他情况下，天然细胞蛋白上的许多表位因甲醛(例如福尔马林)固定而被破坏，从而使得使用重组蛋白或细胞鉴别的抗体对于染色FFPE切片无效。
因此，需要特异性靶向KIR3DL2的经改善的抗体用于染色生物样本(例如石蜡包埋组织切片)。
发明内容
本发明尤其涉及生物样本、优选地福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样本中的KIR3DL2多肽的研究、检测和/或监测。本公开起因于适用于检测生物样本中KIR3DL2的抗体的表征。这些抗体在FFPE方案中保持对此类预定靶抗原的特异性，尤其是它们结合KIR3DL2多肽上的表位，该表位在福尔马林固定后仍然存在并具有特异性。这些抗体允许在IHC方案中的KIR3DL2的检测的高特异性，而无需检测KIR3DL1和/或其他KIR多肽(例如，KIR3DS1)。所得诊断抗体可以用作用于一致检测来自个体的FFPE样本的试剂。
本文所述的KIR3DL2特异性抗体是通过设计和测试合成肽而发现的，该合成肽被设计成模拟可能出现在KIR3DL2蛋白质中的潜在的经福尔马林修饰的表位。进而发现与某些合成肽结合的抗体在FFPE样本中对KIR3DL2的选择性超过KIR3DL1。该研究由此鉴别了在经福尔马林处理的KIR3DL2中存在或出现的新表位或结合位点，以及它们在野生型KIR3DL2氨基酸序列中的对应位点或序列。
福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织提供优于其他免疫学方法的两个主要优点：(1)该组织不需要特殊处理；以及(2)充分认知到细胞学和构造特征，从而允许改进组织病理学解释。然而，通常不可能找到有效起作用并在FFPE切片中具有特异性的KIR3DL2特异性单克隆抗体。先前开发的抗体确实不是KIR3DL2特异性的，因为当在FFPE样本中测试时，它们也与KIR3DL1多肽结合。本发明人已经开发了适用于特异性检测KIR3DL2多肽并且用于FFPE生物样本的染色的抗体。在多种表达KIR3DL2的细胞(例如转染细胞、来自人体供体的人体组织或来自患者的肿瘤组织)中测试了所得抗体，并且发现这些抗体在检测FFPE组织切片中的靶抗原方面保持极佳的性能。
因此，本公开提供了能够与生物样本中的KIR3DL2多肽结合的抗体或其抗体片段，其中抗体或抗体片段包含重链和轻链，该重链包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，该轻链包含与SEQ IDNO:22的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。
本公开的另一个目的为能够与KIR3DL2多肽结合的抗体或其抗体片段，其中抗体或抗体片段包含SEQ ID NO:21中示出的重链可变区的重链CDR1、2和3以及SEQ ID NO:22中示出的轻链可变区的轻链CDR1、2和3。
在一个实施方案中，提供了抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含：(i)重链，该重链包含CDR1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，其具有：SEQ ID NO:3(HCDR1)、SEQ ID NO:6(HCDR2)和SEQ ID NO:9(HCDR3)的序列；以及(ii)轻链，该轻链包含CDR1、2和3(LCDR1、LDR2、LCDR3)，其具有SEQ ID NO:12(LCDR1)、SEQ ID NO:15(LCDR2)和SEQ ID NO:18(LCDR3)的序列，其中每个CDR均可以任选地包含1个、2个或3个氨基酸取代、缺失或插入。
在一个实施方案中，提供了作为抗体P3-R4D-H5的功能保守变体的单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方案中，提供了抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段作为具有SEQ IDNO:21的重链可变区以及SEQ ID NO:22的轻链可变区的轻链CDR1、2和3的抗体的功能保守变体。
在一个实施方案中，提供了分离的多肽(例如，分离的多肽包含或对应于在表达KIR3DL2的细胞的福尔马林处理之后存在的KIR3DL2上的表位)，其中分离的多肽由SEQ IDNO:24的氨基酸序列组成。在另一个实施方案中，根据本公开的分离的多肽可以被修饰或与一种或多种异源多肽稠合或包含在另一种多肽(例如包含一个或多个非KIR3DL2氨基酸序列的多肽)中。
在一个实施方案中，提供了结合此类分离的多肽的抗体或其抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体或其抗体片段与所述分离的多肽的结合通过ELISA测试来进行确定，其中所述抗体或其抗体片段与包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的多肽接触。在具体实施方案中，SEQ ID NO:24的氨基酸序列的所述多肽结合在固体支持体上，例如此类多肽因此可以稠合至与固体支持体结合的接头肽。
在一个实施方案中，提供了与多肽结合的单克隆抗体或抗体片段，该多肽包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由其组成：CEHFFLHREGISEDPSRLVG(SEQ ID NO:23)、CTPLTDTSVYTELPNAEPRS(SEQ ID NO:24)和CPRAPQSGLEGVF(SEQ ID NO:25)。在一个实施方案中，所述抗体或其抗体片段与所述多肽的结合通过ELISA测试来进行确定，其中所述抗体或其抗体片段与包含SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸序列的所述多肽接触。在具体实施方案中，SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸序列的所述多肽结合在固体支持体上。
在一个实施方案中，提供了结合KIR3DL2多肽的单克隆抗体或抗体片段，其中抗体或抗体片段与多肽结合，该多肽包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由其组成：CEHFFLHREGISEDPSRLVG(SEQ IDNO:23)、CTPLTDTSVYTELPNAEPRS(SEQ ID NO:24)和CPRAPQSGLEGVF(SEQ ID NO:25)。
在一个实施方案中，提供了单克隆抗体或抗体片段，该单克隆抗体或抗体片段结合KIR3DL2上与具有SEQ ID NO:21的重链可变区以及SEQ ID NO:22的轻链可变区的轻链CDR1、2和3的抗体相同的表位。任选地，抗体或抗体片段结合多肽，该多肽包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由其组成：CEHFFLHREGISEDPSRLVG(SEQ ID NO:23)、CTPLTDTSVYTELPNAEPRS(SEQ ID NO:24)和CPRAPQSGLEGVF(SEQ ID NO:25)。在本文的任何实施方案中，根据本公开的抗体或其抗体片段能够与福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样本中的KIR3DL2多肽特异性结合。
在另一个实施方案中，提供了与生物样本中的KIR3DL2多肽的细胞内部分或表位结合的抗体或抗体片段。例如，抗体或抗体片段可以被指定为与KIR3DL2多肽的细胞质结构域结合(或与此类结构域中的表位结合)，任选地其中细胞质结构域对应于SEQ ID NO:1的残基340-434。在一个实施方案中，抗体或抗体片段与KIR3DL2多肽的对应于SEQ ID NO:1的残基399-417的部分或表位结合。在一个实施方案中，抗体或抗体片段与生物样品中的KIR3DL2多肽的细胞内部分或表位结合，该生物样本已经被固定在福尔马林中，然后在与所述抗体或抗体片段接触之前被切成切片。在一个实施方案中，KIR3DL2多肽的所述细胞内部分或表位具有氨基酸序列TPLTDTSVYTELPNAEPRS(SEQ ID NO:31)。在一个实施方案中，抗体或抗体片段结合多肽，该多肽包含氨基酸序列CTPLTDTSVYTELPNAEPRS(SEQ ID NO:24)或由其组成。
在另一个实施方案中，提供了与生物样本中的KIR3DL2多肽结合的抗体或抗体片段，并且所述抗体或其抗体片段基本上不与KIR3DL1(例如，包含SEQ ID NO:30中示出的氨基酸序列的KIR3DL1等位基因*00101)多肽结合。优选地，所述生物样本为福尔马林固定石蜡包埋组织样本。
在本文的任何实施方案中，抗体或抗体片段可以被指定为能够与已经被制备为石蜡包埋细胞团块的细胞的生物样本中的KIR3DL2多肽特异性结合。
在一个实施方案中，抗体或抗体片段能够结合(或者，例如染色)已经被制备为石蜡包埋细胞团块的表达KIR3DL2的细胞，其中所述抗体或其抗体片段不结合(或者，例如染色)不表达KIR3DL2并且已经被制备为石蜡包埋细胞团块的表达KIR3DL1的细胞，任选进一步地，其中细胞被固定在福尔马林中，然后在与所述抗体或其抗体片段接触之前被切成切片。
本公开还提供了用于检测生物样本中的表达KIR3DL2的细胞的存在的抗体或其抗体片段。在一个实施方案中，生物样本为组织样本。在一个实施方案中，生物样本为固定组织样本。在另一个实施方案中，生物样本为福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样本。在一个实施方案中，借助于免疫组织化学(IHC)来完成通过根据本公开的抗体或其抗体片段对表达KIR3DL2的细胞的存在的检测。有利地，抗体或其抗体片段用于通过石蜡包埋组织切片的免疫染色来检测表达KIR3DL2的细胞，所述抗体或其抗体片段在FFPE中保持特异性并且具有有利的亲和力，从而允许KIR3DL2的准确检测。
在另一个方面，提供了一种检测样本中的表达KIR3DL2的细胞的体外方法，所述方法包括：(i)提供来自包含细胞的个体的生物样本，以及(ii)用根据本公开的抗体或其抗体片段检测表达KIR3DL2的细胞。在一个实施方案中，生物样本为组织样本。在一个实施方案中，生物样本为固定组织样本。在另一个实施方案中，生物样本为福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样本。在一个实施方案中，用根据本公开的抗体或其抗体片段检测表达KIR3DL2的细胞的步骤(ii)包括：使样本与如所公开的抗体或抗体片段接触，以及检测由所述抗体或其抗体片段与样本之间的免疫反应引起的免疫复合物的形成。在一个实施方案中，借助于免疫组织化学(IHC)来完成根据本公开的抗体或其抗体片段与样本之间的此类免疫复合物的形成的检测。在一个实施方案中，通过使用与本公开的抗体或抗体片段特异性结合的二抗来完成根据本公开的抗体或其抗体片段与样本之间的此类免疫复合物的形成的检测。在一个实施方案中，石蜡包埋组织样本已被固定、包埋于石蜡中、切片、脱蜡并转移至玻片。
本公开的另一个方面为评估患有癌症的个体对于用免疫治疗剂进行治疗的适合性的体外方法，所述方法包括：(i)提供来自患者的生物样本，以及(ii)使用根据本公开的抗体或抗体片段来检测所述样本中的表达KIR3DL2的细胞，其中检测到表达KIR3DL2的细胞指示个体适合用免疫治疗剂进行治疗。在一个实施方案中，生物样本为组织样本。在一个实施方案中，生物样本为固定组织样本。在另一个实施方案中，生物样本为福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样本。在一个实施方案中，用于治疗患有癌症的个体的免疫治疗剂为结合KIR3DL2多肽的药剂。在一个实施方案中，结合KIR3DL2多肽的免疫治疗剂为结合KIR3DL2多肽并且针对表达KIR3DL2的细胞通过ADCC来增强细胞毒性的抗体。在一个优选的实施方案中，抗体为LACUTAMAB。在另一个实施方案中，石蜡包埋组织样本已被固定、包埋于石蜡中、切片、脱蜡并转移至玻片。
本公开还提供了治疗个体的疾病的方法，所述方法包括：(i)提供来自个体的生物样本，(ii)使用根据本公开的抗体或其抗体片段来检测所述样本中的表达KIR3DL2的细胞，以及(iii)如果检测到表达KIR3DL2的细胞，则将免疫治疗剂施用于个体。在一个实施方案中，生物样本为组织样本。在一个实施方案中，生物样本为固定组织样本。在另一个实施方案中，生物样本为福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样本。在一个实施方案中，待治疗的疾病为癌症。在一个实施方案中，癌症为淋巴瘤，例如CD4+T细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，CD4+淋巴瘤为皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)。在一个实施方案中，CTCL为蕈样真菌病或塞扎里氏综合征。在另外的实施方案中，CTCL为转化型T淋巴瘤。在另一个实施方案中，CD4+淋巴瘤为外周T细胞淋巴瘤(PTCL)。在一个实施方案中，石蜡包埋生物样本已被固定、包埋于石蜡中、切片、脱蜡并转移至玻片。
本公开的另一个方面涉及试剂盒，该试剂盒包含：根据本公开的抗体或抗体片段；以及特异性识别根据本公开的所述抗体或其抗体片段的经标记的二抗。
本公开还提供了编码根据本公开的抗体或抗体片段的分离的核酸。
还提供了产生根据本公开的抗体或抗体片段的杂交瘤或重组宿主细胞。
本发明的这些和另外的有利方面和特征可以在本文其他地方进一步描述。
附图说明
图1表示在Elisa测定中对选自scFv文库的克隆P3-R4D-H5可溶性scFv的若干稀释液并且针对与BSA偶联或游离的肽3或针对BSA测量的光密度(450nm)。
图2表示用抗KIR3DL2可溶性scFv克隆P3-R4D-H5、P3-R4D-F4、P3-R4D-C10、P3-R4D-C1、P3-R4D-B9、P3-R4D-B5在表达KIR3DL2和表达KIR3DL1的细胞团块上获得的IHC染色的图片。在Leica Bond RX上以5μg/mL执行染色。
图3表示用抗KIR3DL2克隆P3-R4D-H5或同种型对照抗体在不同CHO/CHO-mb-HuKIR3DL2混合FFPE细胞团块上获得的IHC染色的图片。在Leica Bond RX上以5μg/mL执行染色。比例尺表示25μm。CHO不表达KIR3DL2，而CHO-mb-HuKIR3DL2为表达KIR3DL2的细胞。如图所说明的，Ab意指抗体；FFPE意指福尔马林固定石蜡包埋的；IC意指同种型对照，并且IHC意指免疫组织化学。
图4表示用抗KIR3DL2克隆P3-R4D-H5或同种型对照抗体在不同Raji/HuT混合FFPE细胞团块上获得的IHC染色的图片。在Leica Bond RX上以5μg/mL执行染色。比例尺表示25μm。箭头表示KIR3DL2+细胞。如图所说明的，Ab意指抗体；FFPE意指福尔马林固定石蜡包埋的；IC意指同种型对照，并且IHC意指免疫组织化学。
图5A、图5B和图5C表示用抗KIR3DL2克隆12B11在表达KIR3DL2的RAJI细胞(和作为阴性对照的非表达KIR3DL2的RAJI细胞)上获得的IHC染色的图片。测试了若干染色条件：柠檬酸盐缓冲液pH7，试剂盒envision+DAB；柠檬酸盐缓冲液pH7，试剂盒envision+酪酰胺-生物素+链霉亲和素-HRP+DAB；柠檬酸盐缓冲液pH6，试剂盒envision+DAB；EDTA pH7试剂盒envision+DAB；Tris-EDTA pH9试剂盒envision+DAB。
图6为表示在IHC中通过若干浓度的抗KIR3DL2克隆P3-R4D-H5染色的FFPE样本上测量的光密度的图。对若干FFPE样本执行染色：CHO-K1SV细胞(CHO)、CHO-K1SV-mb-HuKIR3DL1细胞(CHO-KIR3DL1)和CHO-K1SV-mb-HuKIR3DL2细胞(CHO-KIR3DL2)。
图7表示在来自罹患CTCL(例如蕈样真菌病或塞扎里氏综合征)的个体的不同CTCL活组织检查上的KIR3DL2显色IHC染色的图像。FFPE切片用克隆P3-R4D-H5 Ab以5μg/mL在Leica Bond RX上染色(左图)，并且冷冻切片使用抗KIR3DL2克隆12B11以10μg/mL在Ventana Benchmark XT上染色(右图)。对于每种情况，示出了低放大倍数和高放大倍数，并且指示了单核细胞中KIR3DL2+细胞的百分比。比例尺对应于低放大倍数图像上的1mm或2.5mm(分别对于左中图、左下图和右下图或右中图、左上图和右上图)并且对应于高放大倍数图像上的50μm。如图所说明的，B意指活组织检查；CTCL意指皮肤T细胞淋巴瘤；FFPE意指福尔马林固定石蜡包埋的；并且IHC意指免疫组织化学。
图8表示在来自罹患PTCL的个体的PTCL活组织检查上的KIR3DL2显色IHC染色的图像。FFPE切片用克隆P3-R4D-H5 Ab以5μg/mL在Leica Bond RX上染色(左图)，并且冷冻切片使用抗KIR3DL2克隆12B11以10μg/mL在Ventana Benchmark XT上染色(右图)。对于这2种情况，示出了低放大倍数和高放大倍数，并且指示了由病理学家确定的单核细胞中KIR3DL2+细胞的百分比。比例尺对应于低放大倍数图像上的2.5mm和高放大倍数图像上的50μm。如图所说明的，PTCL意指外周T细胞淋巴瘤；FFPE意指福尔马林固定石蜡包埋的；IHC意指免疫组织化学；并且LN意指淋巴结。
图9表示在来自罹患CTCL(蕈样真菌病)的个体的FFPE样本上的KIR3DL2显色IHC染色的图像。FFPE切片用克隆P3-R4D-H5 Ab以5μg/mL在Leica Bond RX上染色。图9A和图9C为具有强KIR3DL2信号的高度阳性CTCL的IHC图像。图9B为弱阳性CTCL的IHC图像。图9D为复发的CTCL(蕈样真菌病)样本的IHC图像，该样品具有强KIR3DL2阳性的区域和几乎阴性的区。
图10表示在来自罹患PTCL的个体的FFPE样本上的KIR3DL2显色IHC染色的图像。FFPE切片用克隆P3-R4D-H5 Ab以5μg/mL在Leica Bond RX上染色。图10A为高度阳性PTCL(未另外指定)的IHC图像。图10B为具有分散的阳性肿瘤细胞的PTCL(未另外指定)的IHC图像，该阳性肿瘤细胞针对微弱的基质细胞阳性的背景。图10C和图10D为中等KIR3DL2阳性PTCL(未另外指定)的IHC图像，其在图10D中的样本内具有区域可变性。
具体实施方式
定义
如本说明书中所用，“一个”或“一种”可意指一个(种)或多个(种)。如权利要求中所用，当与词语“包含”结合使用时，词语“一个”或“一种”可意指一个(种)或超过一个(种)。
在使用“包含”的情况下，这可任选地被替代为“基本上由...组成”，更任选地被替代为“由...组成”。
本文的术语“抗体”以最广泛的意义使用并且具体地包括全长单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及抗体片段和衍生物，只要它们表现出期望的生物活性即可。例如Harlow等人，《抗体：实验室手册》(ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约(N.Y.)，(1988)中提供了与抗体产生相关的各种技术。
“抗体片段”包括全长抗体的一部分，例如其抗原结合区或可变区。抗体片段的示例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、F(ab)3、Fv(通常为抗体的单臂的VL和VH结构域)、单链Fv(scFv)、dsFv、Fd片段(通常为VH和CH1结构域)和dAb(通常为VH结构域)片段；VH、VL、VhH和V-NAR结构域；微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体和κ抗体(参见例如Ill等人，《蛋白质工程》(Protein Eng)，1997；10:949-57)；骆驼IgG；IgNAR；以及由抗体片段和一个或多个分离的CDR或功能互补位形成的多特异性抗体片段，其中分离的CDR或抗原结合残基或多肽可缔合或连接在一起而形成功能抗体片段。各种类型的抗体片段已在例如Holliger和Hudson，《自然-生物技术》(Nat Biotechnol)，2005；23，1126-1136；WO2005040219以及公布的美国专利申请20050238646和20020161201中描述或综述。
如本文所用，术语“抗原结合结构域”是指包括能够免疫特异性结合于表位的三维结构的结构域。因此，在一个实施方案中，所述结构域可以包括高变区，任选地抗体链的VH和/或VL结构域，任选地至少VH结构域。在另一个实施方案中，结合结构域可以包括抗体链的一个、两个或全部三个互补决定区(CDR)。在另一个实施方案中，结合结构域可以包括来自非免疫球蛋白支架的多肽结构域。
如本文所用，术语“抗体衍生物”包括全长抗体或者抗体的片段，例如至少包括其抗原结合区或可变区，其中氨基酸中的一个或多个氨基酸被化学修饰，例如通过烷化反应、聚乙二醇化、酰化、酯形成或酰胺形成等来进行化学修饰。这包括但不限于聚乙二醇化抗体、半胱氨酸-聚乙二醇化抗体及其变体。
当在本文中使用时，术语“高变区”是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，1991)和/或来自“高变环”的那些残基(例如，轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol)，1987；196:901-917)。通常，该区域中的氨基酸残基的编号通过Kabat等人，出处同上中所述的方法执行。诸如“Kabat位置”、“如Kabat中的可变结构域残基编号”和“根据Kabat”之类的短语在本文中是指用于重链可变结构域或轻链可变结构域的该编号系统。使用Kabat编号系统，肽的实际线性氨基酸序列可包含与可变结构域的FR或CDR的缩短或向其中的插入相对应的更少或附加氨基酸。例如，重链可变结构域可包含在CDR H2的残基52之后的单氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后插入的残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可通过在同源性区域处对给定抗体的序列与“标准”Kabat编号序列进行比对来确定该抗体的残基的Kabat编号。任一定义应用于指抗体的CDR或其变体均旨在位于如本文所定义和使用的术语的范围内。下表1中列出了涵盖如常用编号方案所定义的CDR的适当氨基酸残基作为比较。涵盖特定CDR的确切残基号将根据CDR的序列和大小而变化。在考虑到该抗体的可变区氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可常规地确定哪些残基构成特定CDR。
表1
CDR Kabat Chotia AbM
HCDR1 31-35 26-32 26-35
HCDR2 50-65 52-58 50-58
HCDR3 95-102 95-102 95-102
VCDR1 24-34 26-32 24-34
VCDR2 60-56 50-52 50-56
VCDR3 89-97 91-96 89-97
如本文所用，所谓“框架”或“FR”残基意指除被定义为CDR的那些区域之外的抗体可变结构域的区域。每个抗体可变结构域框架可被进一步细分为由这些CDR分开的连续区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。
如本文所定义，所谓“恒定区”意指由轻链或重链免疫球蛋白恒定区基因编码的抗体衍生恒定区。如本文所用，所谓“恒定轻链”或“轻链恒定区”意指由κ(Cκ)或λ(Cλ)轻链编码的抗体的区域。恒定轻链通常包含单个结构域，并且如本文所定义，是指Cκ的位置108-214或Cλ，其中编号根据EU索引(Kabat等人，1991，《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，美国公共卫生署(UnitedStates Public Health Service)，国立卫生研究院(National Institutes of Health)，贝塞斯达(Bethesda))。如本文所用，所谓“恒定重链”或“重链恒定区”意指由μ、δ、γ、α或ε基因编码的抗体的区域以将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA或IgE。对于全长IgG抗体而言，如本文所定义的恒定重链是指CH1结构域的N端到CH3结构域的C端，因此包含位置118-447，其中编号根据EU索引。
如本文所用，所谓“Fab”或“Fab区域”意指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可孤立地指该区域，或指在多肽、多特异性多肽或抗体的背景下的该区域，或如本文所概述的任何其他实施方案。
如本文所用，所谓“单链Fv”或“scFv”意指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。一般来讲，Fv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，该多肽接头使scFv能够形成用于抗原结合的期望结构。用于产生scFv的方法在本领域中是熟知的。有关用于产生scFv的方法的综述，参见Pluckthun，《单克隆抗体的药理学》(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，施普林格出版社(Springer-Verlag)，纽约(New York)，第269-315页(1994)。
如本文所用，所谓“Fv”或“Fv片段”或“Fv区域”意指包含单一抗体的VL和VH结构域的多肽。
如本文所用，所谓“Fc”或“Fc区域”意指包含将第一恒定区免疫球蛋白结构域排除在外的抗体的恒定区的多肽。因此Fc是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，及这些结构域N端的柔性铰链。对于IgA和IgM而言，Fc可包含J链。对于IgG而言，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2(CH2)和Cγ3(CH3)及Cγ1与Cγ2之间的铰链。尽管Fc区的边界可改变，但是人类IgG重链Fc区通常被定义为包含残基C226、P230或A231到其羧基端，其中该编号根据EU索引。Fc可孤立地指该区域，或指Fc多肽的背景下的该区域，如下所述。如本文所用，所谓“Fc多肽”或“Fc衍生多肽”意指包含全部或部分Fc区的多肽。Fc多肽包括但不限于抗体、Fc融合体和Fc片段。
如本文所用，所谓“可变区”意指包含基本上由分别构成轻链(包括κ和λ)和重链免疫球蛋白基因座的VL(包括Vκ(VK)和Vλ)和/或VH基因中的任一者编码的一个或多个Ig结构域的抗体的区域。轻链或重链可变区(VL或VH)由被称为“互补决定区”或“CDR”的三个高变区中断的“框架”或“FR”区组成。框架区和CDR的范围已如Kabat(参见“免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)”，E.Kabat等人，美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，(1983))中及如Chothia中精确定义。抗体的框架区(即，成分轻链和重链的组合框架区)用于定位并对齐主要负责结合抗原的CDR。
术语“特异性结合”意指抗体或多肽可在竞争性结合测定中优选地结合结合配偶体，例如KIR3DL2，如使用重组形式的蛋白质、其中的表位或存在于分离的靶细胞表面上的天然蛋白质评估的。竞争性结合测定和其他用于确定特异性结合的方法在下文进一步描述并且是本领域中熟知的。
如本文所用，术语“亲和力”意指抗体或多肽与表位的结合强度。抗体的亲和力由被定义为[Ab]×[Ag]/[Ab-Ag]的解离常数KD给定，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物的摩尔浓度，[Ab]是未结合抗体的摩尔浓度，并且[Ag]是未结合抗原的摩尔浓度。亲和常数KA由1/KD定义。用于确定mAb亲和力的优选方法可见于Harlow等人，《抗体：实验室手册》(Antibodies:ALaboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约(N.Y.)，1988)，Coligan等人编辑，《当代免疫学方案》(Current Protocols in Immunology)，格林出版联合公司(GreenePublishing Assoc.)和威利跨学科出版社(Wiley Interscience)，纽约(N.Y.)，(1992、1993)，以及Muller，《酶学方法》(Meth.Enzymol.)，92:589-601(1983)，这些参考文献全文以引用方式并入本文。本领域中熟知的用于确定mAb亲和力的一种优选的标准方法是使用表面等离子共振(SPR)筛选(诸如通过用BIAcoreTMSPR分析设备分析)。
在本方面的上下文中，“决定簇”是指多肽上相互作用或结合的位点。
术语“表位”是指抗原决定簇，并且是抗体或多肽结合的抗原上的区域或区。蛋白质表位可包含直接参与结合的氨基酸残基以及被特异性抗原结合抗体或肽有效封闭的氨基酸残基，即，抗体的“足迹”内的氨基酸残基。其是可与例如抗体或受体组合的复合抗原分子上的最简单形式或最小结构区域。表位可为线性的或构象/结构的。术语“线性表位”被定义为由线性氨基酸序列上连续的氨基酸残基构成的表位(一级结构)。术语“构象或结构表位”被定义为由并不都连续并因此代表通过分子折叠而彼此接近的线性氨基酸序列的分开部分的氨基酸残基构成的表位(二级、三级和/或四级结构)。构象表位取决于3维结构。因此术语“构象”通常可与“结构”互换使用。
所谓“氨基酸修饰”在本文中意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。氨基酸修饰在本文中的一个示例是取代。所谓“氨基酸修饰”在本文中意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。所谓“氨基酸取代”或“取代”在本文中意指蛋白质序列中的给定位置处的氨基酸替换为另一氨基酸。例如，取代Y50W是指亲本多肽的变体，其中位置50处的酪氨酸被替换为色氨酸。多肽的“变体”是指具有与参考多肽(通常为天然或“亲本”多肽)基本上相同的氨基酸序列的多肽。多肽变体在天然氨基酸序列内的某些位置处可具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。
“保守”氨基酸取代是氨基酸残基被替换为具有类似物理化学特性的侧链的氨基酸残基的那些取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中是已知的，并且包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。
术语“同一性”或“相同”在两个或更多个多肽的序列之间的关系中使用时是指多肽之间的序列相关性的程度，如通过两个或更多个氨基酸残基的链之间的匹配数所确定。“同一性”度量通过特定数学模型或计算机程序(即，“算法”)解决的具有空位对齐(如果有的话)的两个或更多个序列中的更小序列之间的相同匹配的百分比。可易于通过已知方法计算相关多肽的同一性。此类方法包括但不限于以下文献中描述的那些：《计算分子生物学》(Computational Molecular Biology)，Lesk,A.M.编辑，牛津大学出版社(OxfordUniversity Press)，纽约(New York)，1988；《生物计算：信息学和基因组计划》(Biocomputing:Informatics and Genome Projects)，Smith,D.W.编辑，学术出版社(Academic Press)，纽约(New York)，1993；《序列数据的计算机分析第1部分》(ComputerAnalysis of Sequence Data,Part 1)，Griffin,A.M.和Griffin，H.G.编辑，胡马纳出版社(Humana Press)，新泽西州(New Jersey)，1994；《分子生物学中的序列分析》(SequenceAnalysis in Molecular Biology)，von Heinje,G.，学术出版社(Academic Press)，1987；《序列分析引物》(Sequence Analysis Primer)，Gribskov,M.和Devereux，J.编辑，M.斯托克顿出版社(M.Stockton Press)，纽约(New York)，1991；以及Carillo等人，《工业和应用数学会应用数学杂志》(SIAM J.Applied Math.)，48,1073(1988)。
用于确定同一性的优选方法被设计为给出所测试的序列之间的最大匹配。确定同一性的方法在公开可用的计算机程序中有所描述。用于确定两个序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux等人，《核酸研究》(Nucl.Acid.Res.)，12，387(1984)；威斯康星大学遗传学计算机小组(Genetics Computer Group,Universityof Wisconsin)，威斯康星州麦迪逊(Madison,Wis.)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，215，403-410(1990))。BLASTX程序可从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)和其他来源(《BLAST手册》(BLAST Manual)，Altschul等人，NCB/NLM/NIH贝塞斯达(Bethesda)，马里兰州(Md.)20894；Altschul等人，出处同上)公开获得。熟知的Smith Waterman算法也可用于确定同一性。
“分离的”分子是这样的分子，其是发现该分子的组合物中相对于该分子所属于的分子类别而言主要的物质(即，其构成该组合物中的该分子类型的至少约50％并且通常将构成该组合物中的该分子物质(例如肽)的至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更多)。通常，多肽的组合物对于该组合物中的所有存在的肽物质的背景下的多肽或至少相对于所提议用途的背景下的基本上活性的肽物质将表现出98％、98％或99％同源性。
术语“重组”在参考例如细胞或核酸、蛋白质或载体使用时，指示该细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或变更天然核酸或蛋白质来修饰，或该细胞衍生于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式中未发现的基因，或表达在其他情况下异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。
如本文所用，“石蜡包埋样本”(或石蜡包埋“细胞”、“细胞团块”、“玻片”或“组织”)是指取自生物体或体外细胞培养物的已被固定、包埋于石蜡中、切片、脱蜡并转移到玻片的细胞或组织。应当理解，固定和石蜡包埋是习惯作法，其在许多方面(例如关于所使用的固定和包埋方法、关于遵循的方案等)可变化，并且出于本发明的目的，涵盖任何此类变型方法，只要其涉及组织的固定(诸如通过福尔马林处理)、包埋于石蜡或等同材料中、切片并转移到玻片即可。
如本文所用，术语“生物样本”或“样本”包括但不限于生物流体(例如血清、淋巴、血液)、细胞样本或组织样本(例如骨髓或组织活组织检查，包括粘膜组织诸如来自肠道、肠道固有层或肺)。
在本文的上下文中，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指预防、缓解、管理、治愈或减轻疾病或障碍的一种或多种症状或临床相关表现，除非与上下文相矛盾。例如，尚未鉴别出疾病或障碍的症状或临床相关表现的个体的“治疗”是预防或预防性疗法，而已鉴别出疾病或障碍的症状或临床相关表现的个体的“治疗”通常不构成预防或预防性疗法。
术语“KIR3DL2”(CD158k)是指约140kD的三-Ig结构域分子的二硫键连接的同源二聚体，其描述于以下文献中：Pende等人，(1996)J.Exp.Med.184:505-518，该文献的公开内容以引用方式并入本文。已经报道了针对KIR3DL2多肽的若干等位基因变体，这些中的每一个被术语KIR3DL2涵盖。成熟的人KIR3DL2(等位基因*002)的氨基酸序列如以下SEQ ID NO:1所示，与Genbank登录号AAB52520相对应，其中省略了21个氨基酸残基前导序列。
表2
KIR3DL2(等位基因*002)的cDNA如Genbank登录号U30272所示。人KIR3DL2等位基因*003的氨基酸序列如以下所示，与Gen-bank登录号AAB36593相对应：
表3
还涵盖了分别与野生型、全长KIR3DL2共享一个或多个生物特性或功能并且共享至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的核苷酸或氨基酸同一性的任何核酸或蛋白质序列。
如本文所用，术语KIR3DL1是指另一种KIR3D受体，其与KIR3DL2共享相对较高的氨基酸同一性，并且结合KIR3DL2的各种HLA配体也由KIR3DL1识别。此类KIR3DL1多肽可以为KIR3DL1等位基因*00101，其包含SEQ ID NO:30中示出的氨基酸序列。
每当在该整篇说明书内参考抗KIR3DL2结合剂(例如，抗体)提及“治疗”或“癌的治疗”等时，都意指：(a)癌治疗方法，所述方法包括以下步骤：将抗KIR3DL2结合剂(优选地在药学上可接受的载体材料中)以允许癌治疗的剂量(治疗有效量)、优选地以如本文所指定的剂量(量)施用(以进行至少一次治疗)给需要此类治疗的个体、哺乳动物，尤其是人类；(b)抗KIR3DL2结合剂用于癌治疗的用途，或用于所述治疗(尤其是在人类中)的抗KIR3DL2结合剂；(c)抗KIR3DL2结合剂用于制造癌治疗用药物制剂的用途、使用抗KIR3DL2结合剂制造癌治疗用药物制剂的方法(包括将抗KIR3DL2结合剂与药学上可接受的载体混合)或包含适于癌治疗的有效剂量的抗KIR3DL2结合剂的药物制剂；或(d)根据容许在提交本申请的国家取得专利授权的主题的a)、b)和c)的任何组合。
结合人KIR3DL2的抗体的示例包括但不限于抗体AZ158、抗体19H12、抗体2B12和抗体12B11。另外的此类抗体提供于均于2013年9月17日提交的PCT/EP2013/069302和PCT/EP2013/069293中，其公开内容以引用方式并入本文。AZ158结合人KIR3DL2以及人KIR3DL1和KIR3DS1多肽，2B12和与KIR3DL2选择性地结合并且不结合KIR3DL1(或KIR3DS1)。抗体AZ158可以用作例如向个体施用的治疗剂，以用于消除表达KIR3DL2的靶标，例如通过诱导ADCC和/或CDC。抗体2B12、19H12和12B11也适合用作向个体施用的用于消除表达KIR3DL2的靶细胞的治疗剂。19H12和12B11以及PCT/EP2013/069293中公开的其他抗体能够经由KIR3DL2内化到细胞中，并且可以有利地用作抗体-药物缀合物。2B12和PCT/EP2013/069302中公开的其他抗体不诱导任何KIR3DL2内化到肿瘤细胞中，从而在寻求效应细胞介导的活性时提供有利的用途，例如用于耗竭诱导ADCC的抗体。PCT/EP2015/055224公开了人源化抗体。一种结合人KIR3DL2并且适合用作向个体施用的用于消除表达KIR3DL2的靶细胞的治疗剂的此类抗体在商业名称LACUTAMAB下为已知的(参见WHO药物信息，第32卷，第4期，2018)。
术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是本领域熟知的术语，并且是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后引起靶细胞的裂解。介导ADCC的非特异性细胞毒性细胞包含自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
如本文所用，“T细胞”是指在胸腺中成熟的淋巴细胞的亚群体，并且这些T细胞以及其他分子在其表面上显示T细胞受体。T细胞可以凭借某些特征和生物特性来鉴别，该某些特征和生物特性为诸如特异性表面抗原(包括TCR、CD4或CD8，任选地CD4和IL-23R)的表达、某些T细胞杀伤肿瘤或经感染的细胞的能力、某些T细胞激活免疫系统的其他细胞的能力以及释放被称为细胞因子(该细胞因子刺激或抑制免疫应答)的蛋白质分子的能力。
产生诊断抗体
抗体或其抗体片段与KIR3DL2特异性结合，特别是在固定样本(诸如福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织切片)中。这些抗体可以在已被制备为石蜡包埋细胞团块的包含表达KIR3DL2的细胞的生物样本(例如，FFPE切片)中与其靶抗原特异性结合。这些抗体特异性结合石蜡包埋组织切片中的KIR3DL2的能力使得它们可用于多种应用，特别是用于检测KIR3DL2或表达KIR3DL2的细胞(例如癌细胞)以及KIR3DL2或表达KIR3DL2的细胞的水平或分布，以用于诊断或治疗目的，如本文所述。在某些实施方案中，抗体或其抗体片段用于在取自个体(例如患有癌症的个体)的样本(例如活组织检查)中确定癌性组织中或附近的表达KIR3DL2的细胞的存在或水平。任选进一步地，在一个实施方案中，如果在组织样本中检测到KIR3DL2，则确定存在表达KIR3DL2的细胞。任选地，在另一个实施方案中，如果在组织样本中检测到KIR3DL2(任选地如果检测到预定水平的KIR3DL2)，则确定该个体适合用结合KIR3DL2的治疗性抗体治疗。
该抗体与靶抗原的结合的检测可以以多种方式中的任何方式执行。例如，该抗体可以直接用可检测部分(例如发光化合物，诸如荧光部分)或用放射性化合物、用金、用生物素(这允许后续与亲和素例如亲和素-AP的扩增结合)或用酶(诸如碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP))标记。在另选的和优选的实施方案中，间接地评估该抗体与样本中的靶抗原的结合，例如通过使用二抗，该二抗与抗靶抗原的一抗结合且自身被标记，优选地被诸如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)之类的酶标记；然而，应当理解，可使用任何合适的方法标记或检测二抗。在一个优选的实施方案中，扩增系统用于增强该二抗所提供的信号，例如EnVision系统，其中二抗结合聚合物(例如，葡聚糖)，而该聚合物结合可检测化合物或酶诸如HRP或AP的许多拷贝(参见例如Wiedorn等人，(2001)，《组织化学与细胞化学杂志》(The Journal of Histochemistry&Cytochemistry)，第49卷(9):1067-1071；等人，(2001)，《组织化学与细胞化学杂志》(Journal of Histochemistry andCytochemistry)，第49卷，623-630；这些文献的全部公开内容以引用方式并入本文)。
KIR3DL2多肽或其一个或多个免疫原性片段可用作引发抗体的免疫原，并且抗体可识别如本文所述石蜡包埋样本上的KIR3DL2多肽内的表位。根据本公开的抗体可以识别存在于KIR3DL2多肽的细胞外(即，它们可接近存在于细胞之外的抗体)或细胞内结构域上的表位。优选地，所识别的表位存在于KIR3DL2多肽的细胞内结构域上。当在与抗体接触之前将组织切成切片时，在FFPE样本中存在于KIR3DL2多肽的细胞内结构域上的此类表位可接近所述抗体。在一个方面，该表位为由抗体在石蜡包埋细胞团块样本中特异性地识别的表位。
可以通过本领域已知的多种技术产生本发明的抗体。通常，这些抗体是通过用包括KIR3DL2多肽，优选地人KIR3DL2多肽的免疫原对非人动物，优选地兔进行免疫而产生的。多肽可以包括人多肽或其片段或衍生物(通常是免疫原性片段，即，包括暴露于表达KIR3DL2多肽的细胞的表面上的表位的多肽的一部分)的全长序列。此类片段通常含有成熟多肽序列的至少约7个连续氨基酸，甚至更优选地其至少约10个连续氨基酸。片段通常基本上衍生于KIR3DL2受体的细胞外结构域。此类片段通常可以通过使用工具(诸如IHCPeptide ProfilerTM技术(BIOTEM公司(BIOTEM Corp.)))来设计。在一个优选的实施方案中，免疫通过注射衍生于KIR3DL2多肽并且由此类前述工具获得的至少两种免疫原性片段的库、优选地至少三种免疫原性片段的库来实现。在一个实施方案中，衍生于KIR3DL2多肽的免疫原性片段由下表中公开的序列来定义。
表4
肽4484_1 SEQ ID NO:23 CEHFFLHREGISEDPSRLVG
肽4484_3 SEQ ID NO:24 CTPLTDTSVYTELPNAEPRS
肽4484_4 SEQ ID NO:25 CPRAPQSGLEGVF
用KIR3DL2多肽或其免疫原性片段免疫非人哺乳动物的步骤可以以本领域众所周知的任何方式进行，用于刺激小鼠中抗体的产生(参见例如，E.Harlow和D.Lane，《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual.)》，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1988)，该文献的全部公开内容以引用方式并入本文)。将免疫原混悬或溶解于缓冲液中，任选地与佐剂诸如完全或不完全弗氏佐剂一起混悬或溶解。用于确定免疫原的量、缓冲液的类型和佐剂的量的方法为本领域技术人员所熟知并且不以任何方式对本发明构成限制。这些参数对于不同免疫原可能不同，但容易阐明。
类似地，足以刺激产生抗体的免疫接种的位置和频率也是本领域中熟知的。在典型免疫接种方案中，在第1天向非人动物的腹膜内注射抗原并且约一周后再注射一次。之后在第21天左右进行抗原的回忆注射(recall injection)，任选地与佐剂诸如不完全弗氏佐剂一起注射。这些回忆注射在静脉内执行，并且可在连续几天内重复。随后在第35天进行静脉内或腹膜内加强注射，通常不用佐剂。该方案在约45天后引起产生抗原特异性抗体的B细胞的生成。也可使用其他方案，只要它们引起表达针对免疫接种中所用抗原的抗体的B细胞的生成即可。
在一个另选实施方案中，将未免疫接种的非人哺乳动物的淋巴细胞分离，使之体外生长，然后在细胞培养中暴露于免疫原。随后收获淋巴细胞，并进行下文所述的融合步骤。
来自脾细胞的B细胞可以与免疫化非人哺乳动物分离，总RNA可以被提取并且定量以便建立scFv文库。此类文库的构造对于本领域技术人员是常见的(例如Lennard S等人，(2002)《用于构造scFv文库的标准方案》(Standard Protocols for the Construction ofscFv Libraries)。在抗体噬菌体展示中。《分子生物学方法》(Methods in MolecularBiologyTM)，第178卷)。详细地说，编码γ链和κ/λ轻链的可变结构域的RNA可以分别用特异性引物组进行回复扩增(retro-amplified)。扩增的VH和VL PCR产物可以分别汇集并且克隆在备份载体中，以便生成两个不同的子文库(一个用于重链并且一个用于轻链)。将VL片段克隆在噬菌粒载体中，然后将VH片段插入含有VL库的载体中。通常，载体格式VH/VL-6His(HHHHHH)TMFLAG(DYKDDDDK)适用于此类构造。通常，适用于建立此类公开中的scFv文库的载体为M13K07噬菌体。一旦构造后，scFv文库就可以通过常用方法(诸如噬菌体展示)来进行筛选。为此目的，经噬菌体展示的scFvs文库可以使用针对KIR3DL2多肽或其片段的不同策略来经受若干淘选。抗KIR3DL2肽分离的克隆DNA可以进行提取，然后测序。可以将此类序列插入合适的载体中以产生对应的scFv。合适的表达载体或表达系统为常识的一部分。例如，大肠杆菌(E.coli)菌株可以被转化并且用于生产此类scFv。可以评估此类scFv针对KIR3DL2多肽的反应性以选择最好的克隆。
根据任选的实施方案，将对结合KIR3DL2多肽上存在的表位的抗体进行编码的DNA(与scFv文库分离)放置于适当的表达载体中，以用于转染到适当的宿主细胞中。然后，将宿主细胞用于重组产生抗体或其变体，诸如该单克隆抗体的人源化形式、抗体的活性片段、包括抗体的抗原识别部分的嵌合抗体或包括可检测部分的形式。
对本发明的KIR3DL2特异性抗体进行编码的DNA可以容易地分离，并且使用常规程序测序(例如，通过使用能够与对抗体的重链和轻链进行编码的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。一旦分离，就可将DNA置于表达载体中，然后将表达载体转染进宿主细胞诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中(这些细胞原本不产生免疫球蛋白)，以实现单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。如在本说明书的其他地方所述，可修饰此类DNA序列以用于大量目的中的任一个目的，例如用于人源化抗体，产生片段或衍生物，或用于修饰抗体的序列(例如，在抗原结合位点中)，以优化抗体的结合特异性。
根据一个实施方案，提供了分离的多肽，该分离的多肽包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或由其组成。另选地，根据本公开的分离的多肽可以被修饰或与一种或多种异源多肽稠合或包含在另一种多肽(例如包含一个或多个非KIR3DL2氨基酸序列的多肽)中。还提供了与所述多肽结合的抗体或其抗体片段，所述多肽包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或由其组成。根据本公开的抗体或其抗体片段与所述多肽(所述多肽包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或由其组成)的结合可以通过本领域技术人员已知的任何方法(例如ELISA、BIACORE)来评估。在一个优选的实施方案中，此类结合通过ELISA测试来进行评估。ELISA(酶联免疫吸附测定)测试为允许检测抗体与另一种抗原(例如肽)之间的结合的简单方法。例如，通过ELISA测试检测根据本公开的抗体或其抗体片段与包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或由其组成的所述多肽的结合可以包括以下步骤：(i)用包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或由其组成的所述多肽包被微量滴定板孔；(ii)封闭板的所有未结合位点(例如通过使用BSA)以避免假阳性结果；(iii)向孔提供抗体或其抗体片段(例如，可溶性scFv)；(iv)提供对一抗或其抗体片段具有特异性的二抗，所述抗体与酶缀合；(v)提供适于与酶反应以产生有色产物的底物，其指示抗体或其抗体片段与多肽的结合。任选地，包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的多肽可以结合在固体支持体上，以继续进行ELISA测试。此类多肽可以例如稠合至与固体支持体结合的接头多肽。
本公开提供了基于福尔马林固定石蜡包埋样本(FFPE细胞团块)的检测或筛选的方法，其揭示了在甲醛或福尔马林处理后存在的KIR3DL2表位。因此，在一个方面，本公开提供了特异性地结合被保存为石蜡包埋细胞团块并在分析之前脱蜡的样本中的表达KIR3DL2多肽的细胞(例如，使之表达KIR3DL2的细胞)的单克隆抗体。任选地，该抗体进一步以不与石蜡包埋细胞团块中的KIR3DL2阴性细胞(不表达KIR3DL2的细胞)结合或与其结合不明显为特征。任选地，该抗体进一步以与石蜡包埋组织切片中的表达KIR3DL2多肽的细胞结合为特征。
在一个方面，本公开提供了特异性结合人KIR3DL2多肽的单克隆抗体或其抗体片段，其中所述抗体与已经使用甲醛(例如福尔马林、多聚甲醛)固定的生物样本中的所述KIR3DL2多肽特异性结合。福尔马林固定可特别用于制备石蜡包埋组织切片，然后可对石蜡包埋组织切片进行脱蜡并且分析感兴趣的标记物(例如，KIR3DL2多肽)的存在。
在一个方面，提供了特异性地结合由已被保存在石蜡中的细胞(例如，已被保存为石蜡包埋细胞团块的细胞)表达的人KIR3DL2多肽的单克隆抗体。任选地，将这些细胞团块化、甲醛处理(例如，甲醛、福尔马林、多聚甲醛)，然后石蜡包埋。任选地，表达人KIR3DL2多肽的细胞位于在分析之前已经脱蜡的生物样本中。
在一个方面，抗体结合存在于FFPE细胞团块样本中的KIR3DL2上的抗原决定簇。由抗体结合的残基可以被指定为存在于KIR3DL2多肽的表面上，任选进一步地在由细胞表达的KIR3DL2多肽中。
在一个实施方案中，提供了一种制备或测试能够与生物样本中的KIR3DL2多肽结合的抗体或其抗体片段的方法，该方法包括确定抗体或抗体片段是否结合选自由以下项组成的组的氨基酸序列：CEHFFLHREGISEDPSRLVG(SEQ ID NO:23)、CTPLTDTSVYTELPNAEPRS(SEQ ID NO:24)和CPRAPQSGLEGVF(SEQ ID NO:25)。
在一个实施方案中，提供了一种制备或测试能够与生物样本中的KIR3DL2多肽结合的抗体或其抗体片段的方法，该方法包括确定抗体或抗体片段是否结合KIR3DL2上与具有SEQ ID NO:21的VH和SEQ ID NO:22的VL的抗体相同的表位。
在一个实施方案中，提供了一种制备能够与生物样本中的KIR3DL2多肽结合的抗体或其抗体片段的方法，该方法包括：用选自由以下项组成的组的氨基酸序列免疫非人哺乳动物：CEHFFLHREGISEDPSRLVG(SEQ ID NO:23)、CTPLTDTSVYTELPNAEPRS(SEQ ID NO:24)和CPRAPQSGLEGVF(SEQ ID NO:25)；从哺乳动物分离与KIR3DL2结合的抗体；以及任选进一步地针对其与生物样本(例如FFPE样本)中的KIR3DL2多肽结合的能力而从中评估和/或选择抗体。在一个实施方案中，提供了一种制备能够与生物样本中的KIR3DL2多肽结合的抗体或其抗体片段的方法，该方法包括：提供多种抗体并且针对其结合选自由以下项组成的组的氨基酸序列的能力而评估和/或选择抗体：CEHFFLHREGISEDPSRLVG(SEQ ID NO:23)、CTPLTDTSVYTELPNAEPRS(SEQ ID NO:24)和CPRAPQSGLEGVF(SEQ ID NO:25)；以及任选进一步地评估抗体或其抗体片段是否能够与生物样本(例如FFPE样本)中的KIR3DL2多肽结合。在一个实施方案中，提供了通过制备本公开的抗体或抗体片段的方法来获得的抗体或抗体片段。
在一个方面，提供了一种能够与KIR3DL2多肽特异性结合的抗体或其抗体片段，该抗体或其抗体片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该重链可变区包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。(参见下表5)。
表5
在一个方面，能够与KIR3DL2多肽特异性结合的抗体包含与具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链具有至少约80％序列同一性(例如，至少约85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高同一性)的重链。
在一个方面，能够与KIR3DL2多肽特异性结合的抗体包含与具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链具有至少约80％序列同一性(例如，至少约85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高同一性)的轻链。
在任何方面，能够与KIR3DL2多肽特异性结合的抗体可以被指定为包含人来源的VH和VL框架(例如，FR1、FR2、FR3和FR4)。
根据本发明的抗体可以包含如本文所定义的抗原结合区(例如轻链VH/VL)，该抗原结合区与IgG型的免疫球蛋白恒定区、任选地恒定区、任选地IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型稠合，任选进一步地包含氨基酸取代以降低效应子功能(与Fcγ受体结合)。在一个实施方案中，如上文所定义的抗原结合区可以与igG型的兔免疫球蛋白恒定区稠合。
在一些实施方案中，提供了包含以下的抗体：SEQ ID NO:21的VH氨基酸序列的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)以及SEQ ID NO:22的VL氨基酸序列的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LDR2、LCDR3)。任选地，CDR是根据Kabat、Chothia、Abm或IMGT编号方案确定的。
在一个方面提供了抗体，该抗体包含：(i)重链，该重链包含CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，其具有：SEQ ID NO:03(HCDR1)、SEQ ID NO:06(HCDR2)和SEQ ID NO:09(HCDR3)的序列；以及(ii)轻链，该轻链包含CDR 1、2和3(LCDR1、LDR2、LCDR3)，其具有SEQID NO:12(LCDR1)、SEQ ID NO:15(LCDR2)和SEQ ID NO:18(LCDR3)的序列。(参见下表6和表7)。
表6
表7
任选地，所述轻链或重链CDR中的任何一者或多者可以含有一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如，取代、插入或缺失)。
在一个方面，能够与KIR3DL2多肽特异性结合的抗体包含：含有氨基酸序列：TYAMS(SEQ ID NO:3)的HCDR1或其至少4个邻接氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同氨基酸取代；含有氨基酸序列：IIGASGNTWYASWAKG(SEQ ID NO:6)的HCDR2或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个邻接氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同氨基酸取代；含有氨基酸序列：FWAGYPSNAAATVSGMDP(SEQ ID NO:9)的HCDR3或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个邻接氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同氨基酸取代；含有氨基酸序列：TLSTGYSVGSYGIG(SEQ ID NO:12)的LCDR1或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个邻接氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同氨基酸取代；含有氨基酸序列：YHTEEIKHQGS(SEQ ID NO:15)的LCDR2区或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个邻接氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同氨基酸取代；和/或含有氨基酸序列：ATAHGSGSSFHVV(SEQ ID NO:18)的LCDR3区或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个邻接氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同氨基酸取代。
本发明的又一个目的还涵盖能够与本公开的KIR3DL2多肽特异性结合的抗体的功能保守变体。“功能保守变体”是指蛋白质(例如抗体或抗体片段)中的给定氨基酸残基已经改变而不更改蛋白质的整体构象和功能的变体，包含但不限于用具有类似特性(诸如例如，极性、氢键合潜力、酸性、碱性、疏水性、芳香族等)的氨基酸替换氨基酸。除被指示为保守的那些氨基酸之外的氨基酸在蛋白质中可不同，使得类似功能的任何两种蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列相似度百分比可变化并且可为例如70％至99％，如根据比对方案(诸如通过聚类方法(Cluster Method))确定，其中相似度基于MEGALIGN算法。“功能保守变体”还包含与能够与如上文所定义的KIR3DL2多肽特异性结合的抗体具有至少60％、优选地至少75％、更优选地至少85％、仍优选地至少90％并且甚至更优选地至少95％的氨基酸同一性(如通过BLAST或FASTA算法确定的)，并且具有与能够与如上文所定义的KIR3DL2多肽特异性结合的抗体相同或基本上类似的特性或功能的多肽。
指定的重链、轻链、可变区和CDR序列可以包含序列修饰，例如取代(1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个序列修饰)。在一个实施方案中，氨基酸序列包含一个、两个、三个或更多个氨基酸取代，其中被取代的残基是存在于人源序列中的残基。在一个实施方案中，该取代是保守修饰。保守序列修饰是指不显著影响或改变包含该氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可通过本领域中已知的标准技术(诸如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入到本发明的抗体中。保守氨基酸取代通常是氨基酸残基被替换为具有类似物理化学特性的侧链的氨基酸残基的那些取代。指定的氨基酸序列可包含一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸插入、缺失或取代。在进行取代的情况下，优选的取代将为保守修饰。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明的抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可被替换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基并且可使用本文所述的测定法测试改变的抗体的保留功能(即，本文所阐述的特性)。
在一个实施方案中，本发明的抗体是保留其结合和/或功能特性的抗体片段。本发明的抗体的片段和衍生物(除非另外指明或明确与上下文矛盾，否则它们被如本申请中所用的术语“抗体(antibody)”或“抗体(antibodies)”涵盖)，优选地抗KIR3DL2抗体，可以通过本领域中已知的技术来产生。“片段”包含完整抗体的一部分，通常为抗原结合位点或可变区。抗体片段的示例包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2和Fv片段；双抗体；作为具有由邻接氨基酸残基的一个不间断序列组成的一级结构的多肽的任何抗体片段(在本文中称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包括但不限于(1)单链Fv分子，(2)仅包含一个轻链可变结构域的单链多肽或包含轻链可变结构域的三个CDR而没有相关联的重链部分的其片段，以及(3)仅包含一个重链可变区的单链多肽或包含重链可变区的三个CDR而没有相关联的轻链部分的其片段；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
FFPE样本的制备和染色
本发明抗体具有能够与存在于固定组织或细胞样本中的多肽(例如，KIR3DL2多肽)有效且特异性结合的特定特性。制备和使用此类组织制备物的各种方法在本领域中是熟知的，并且可使用任何合适的制备方法或类型。这些抗体还能够结合样本中的其靶抗原，其中在固定时或之前存在治疗性(例如，功能中和)抗体。
取自个体的生物样本中的FFPE材料通常是组织。FFPE组织是首先通过解剖或活组织检查而从标本动物(例如，人类个体)分离的一块组织。然后，固定该组织以防止其腐烂或腐化并且允许在显微镜下清楚地检查该组织，从而进行组织学、病理学或细胞学研究。固定是将组织固定化、杀死并保存以用于染色和在显微镜下观察该组织的目的的过程。固定后处理使组织可透过染色试剂并且使其大分子交联，使得它们被固定化并锁定在适当位置。然后将该固定组织包埋于蜡中以允许其被切成薄切片并用苏木精和伊红染液染色。之后，通过切出细切片来进行显微切片以在显微镜下研究用抗体进行的染色。
例如，应当理解，本发明抗体可与不同合适的固定细胞或组织制备物和所使用的不同特定固定或包埋方法一起使用。例如，虽然最常用的甲醛基固定规程涉及福尔马林(例如，10％)，但可使用另选方法，诸如多聚甲醛(PFA)、布安溶液(福尔马林/苦味酸)、醇、锌基溶液(举个例子来说，参见例如Lykidis等人，(2007)，《核酸研究》(Nucleic AcidsResearch)，2007，1-10，该文献的全部公开内容全部并入本文)和其他(参见例如HOPE方法，《病理学研究与实践》(Pathology Research and Practice)，第197卷，第12期，2001年12月，第823-826页(4)，该文献的全部公开内容以引用方式并入本文)。类似地，虽然石蜡是优选的，但其他材料也可用于包埋，例如聚酯蜡、聚乙二醇基配方、乙二醇甲基丙烯酸酯、JB-4塑料和其他材料。有关用于制备和使用组织制备物的方法的综述，参见例如Gillespie等人，(2002)，《美国病理学杂志》(Am JPathol.)，2002年2月；160(2):449-457；Fischer等人，《CSH方案》(CSH Protocols)；2008；Renshaw(2007)，《免疫组织化学：方法快报系列》(Immunohistochemistry:Methods Express Series)；Bancroft(2007)，《组织学技术的理论与实践》(Theory and Practice of Histological Techniques)；以及PCT专利公布号WO06074392；这些文献的全部公开内容以引用方式并入本文)。
在本发明的一个实施方案中，FFPE组织为其中寻求研究KIR3DL2的表达的人体组织(例如肿瘤组织、肿瘤旁组织、正常组织)。例如，FFPE组织可以为其中寻求研究KIR3DL2的表达的任何人肿瘤组织。肿瘤可以为例如鳞状上皮、膀胱、胃、肾、头和颈、皮肤、乳房、胃肠道、结肠、食道、卵巢、子宫颈、甲状腺、肠、肝脏、脑、胰腺、前列腺、泌尿生殖道、淋巴系统、胃、喉和/或肺的肿瘤。FFPE组织可以例如衍生于血液样本。在一个实施方案中，当检测到KIR3DL2时，FFPE组织可以为从已经接受用抗KIR3DL2抗体治疗(例如，已经历或正经历采用此类抗体的疗程)的个体获得的肿瘤或肿瘤旁组织。
将抗体(例如，抗KIR3DL2抗体)与FFPE材料一起温育，以用于KIR3DL2多肽的检测。术语温育步骤涉及使FFPE材料与本发明的抗体接触不同时间段，这取决于材料、抗体和/或抗原的种类。温育过程还取决于各种其他参数，例如检测灵敏度、哪种优化遵循本领域技术人员已知的常规规程。添加化学溶液和/或应用物理规程(例如热影响)可改善样本中的靶结构的可及性。因该温育而形成具体的温育产物。
用于检测所形成的抗体/抗原复合物的合适测试是本领域技术人员已知的或可容易被设计为例行事项。许多不同类型的测定法是已知的，下文阐述了这些测定法的示例。尽管该测定可以为适于使用抗KIR3DL2 mAb结合以检测和/或定量KIR3DL2表达的任何测定，但后者优选地借助于与初级抗KIR3DL2抗体特异性相互作用的物质来进行确定。
因此，例如，待检查的样本(组织或细胞)通过来自生物流体、肿瘤组织或健康组织的活组织检查以及切片(例如，3mm厚或更小)来获得并且使用福尔马林或等效固定方法(参见上文)来固定。固定的时间取决于应用，但可在几小时到24小时或更多小时的范围内。固定后，将组织包埋于石蜡(或等效材料)中，并且在显微切片机中切出极薄切片(例如，5微米)，然后将这些切片封固到(优选地涂布于)玻片上。之后将玻片干燥，例如风干。
可将玻片上的固定和包埋组织切片干燥并且无限期地储存。对于免疫组织化学而言，将玻片脱蜡，然后再水化。例如，对这些玻片进行一系列洗涤，首先用二甲苯洗涤，随后用含乙醇的二甲苯洗涤，然后用水中百分比减少的乙醇洗涤。
在抗体染色之前，可对组织进行抗原修复步骤(例如，酶促的或基于热的)以使固定期间形成并可掩盖表位的甲烷桥断裂。在一个优选的实施方案中，使用沸腾10mM柠檬酸盐缓冲液pH 6中的处理。
一旦已使玻片再水化并且已理想地执行抗原修复，就可将这些玻片与一抗一起温育。首先，用例如TBS洗涤玻片，然后在采用例如血清/BSA的封闭步骤之后，可施加该抗体。该抗体的浓度将取决于其形式(例如，纯化)、其亲和力、所使用的组织样本，但合适的浓度为例如1g/ml至10μg/ml。在一个实施方案中，所使用的浓度为10μg/ml。温育的时间也可变化，但过夜温育通常是合适的。在例如TBS中的后抗体洗涤步骤后，随后处理这些玻片以检测抗体结合。
所使用的检测方法将取决于所使用的抗体、组织等，并且可例如涉及与一抗缀合的发光或另外可见或可检测的部分的检测，或通过使用可检测的二抗。抗体检测的方法在本领域中是熟知的并且例如在以下文献中教导：Harlow等人，《抗体：实验室手册》(Antibodies:A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)，第1版(1988年12月1日)；Fischer等人，《CSH方案》(CSH Protocols)；2008；Renshaw(2007)，《免疫组织化学：方法快报系列》(Immunohistochemistry:MethodsExpress Series)；Bancroft(2007)，《组织学技术的理论与实践》(Theory and Practiceof Histological Techniques)；PCT专利公布号WO06074392；这些文献中的每篇文献的全部公开内容全部并入本文。
许多直接或间接检测方法是已知的并且可适于使用。直接标记包括附接到抗体的荧光或发光标签、金属、染料、放射性核素等。可使用用碘-125(125I)标记的抗体。使用对蛋白质具有特异性的化学发光抗体的化学发光测定法适用于蛋白质水平的灵敏、非放射性检测。用荧光染料标记的抗体也是合适的。荧光染料的示例包括但不限于DAPI、荧光素、Hoechst 33258、R-藻蓝蛋白、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、罗丹明、德克萨斯红和丽丝胺。
间接标记包括本领域中熟知的各种酶，诸如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、脲酶等。抗3DL2抗体与酶的共价键合可以通过不同方法(诸如与戊二醛偶联)来执行。该酶和该抗体均经由游离氨基与戊二醛互连，并且去除网络化的酶和抗体的副产物。在另一种方法中，如果该酶为糖蛋白(诸如过氧物酶)，则该酶经由糖残基偶联到该抗体。该酶由高碘酸钠氧化并且与该抗体的氨基直接互连。其他含碳水化合物的酶也可以以这种方式偶联到该抗体。酶偶联也可通过使用异双功能接头(诸如琥珀酰亚胺基6-(N-马来酰亚胺基)己酸酯)将该抗体的氨基与酶(诸如β-半乳糖苷酶)的游离硫醇基互连来执行。辣根过氧化物酶检测系统可例如与显色底物四甲基联苯胺(TMB)一起使用，该TMB在存在过氧化氢的情况下产生在450nm处可检测的可溶性产物。碱性磷酸酶检测系统可与例如显色底物磷酸对硝基苯酯一起使用，该磷酸对硝基苯酯产生可易于在405nm处检测的可溶性产物。类似地，β-半乳糖苷酶检测系统可与显色底物邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)一起使用，该ONPG产生在410nm处可检测的可溶性产物。脲酶检测系统可与诸如脲-溴甲酚紫之类的底物一起使用。
在一个实施方案中，一抗的结合通过结合标记的二抗、优选地与诸如HRP或AP之类的酶共价连接的二抗来检测。在一个特别优选的实施方案中，使用用于抗体检测的放大的多种方法中的任何方法来放大该二抗的结合所生成的信号。例如，可使用EnVision方法(参见例如美国专利号5,543,332和欧洲专利号594,772；等人，(2001)，《组织化学与细胞化学杂志》(Journal of Histochemistry and Cytochemistry)，第49卷，623-630；Wiedorn等人，(2001)，《组织化学与细胞化学杂志》(The Journal of Histochemistry&Cytochemistry)，第49卷(9):1067-1071；这些文献的全部公开内容以引用方式并入本文)，其中二抗连接到聚合物(例如，葡聚糖)，而该聚合物自身连接到AP或HRP的许多拷贝。
抗体在诊断、预后和治疗中的用途及其方法
本发明的抗体在检测生物样本内的KIR3DL2多肽方面为特别有效的。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体在检测组织样本内的KIR3DL2多肽方面为特别有效的。在另一个实施方案中，本发明的抗体在检测固定组织样本内的KIR3DL2多肽方面为特别有效的。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体在检测福尔马林固定石蜡包埋组织样本(FFPE)内的KIR3DL2多肽方面为特别有效的，而对不表达靶抗原多肽的组织或细胞不进行非特异性染色。因此这些抗体将具有用于在KIR3DL2多肽和/或表达KIR3DL2的细胞的检测和/或定位令人感兴趣的疾病中研究、评估、诊断、预后和/或监测的优点。
因此，提供了检测、诊断或监测个体中的癌症的方法，该方法包括以下步骤：(例如，在体外)使癌性细胞与本公开的抗KIR3DL2抗体或其抗体片段接触，以及检测癌性细胞相关KIR3DL2多肽。在相关实施方案中，该诊断方法将包括免疫组织化学(IHC)。在某些实施方案中，生物样本为组织样本。在另一个实施方案中，生物样本为固定组织样本。在一个优选的实施方案中，生物样本为福尔马林固定和/或石蜡包埋组织样本。本领域技术人员将进一步理解，此类KIR3DL2检测剂可用效应子、标记物或报告子来标记或与之缔合，并且使用多种标准成像技术中的任何一种技术来检测。在其他实施方案中，抗KIR3DL2抗体将未被直接标记并且将使用可检测的次级剂(例如，经标记的抗兔抗体)来进行检测。在某些实施方案中，本公开提供了用于鉴别或选择要施用疗法(例如，化学疗法、免疫疗法)的个体的方法，该方法包括使用本方面的抗KIR3DL2组合物和检测方法中的任一者来诊断个体，以及基于该结果来定制疗程。本公开进一步提供了用于选择患有表达KIR3DL2的癌症的个体以用于施用增强抗肿瘤应答方案的药剂(例如，化学治疗剂、免疫治疗剂，诸如抗KIR3DL2单克隆抗体)的方法，该药剂用于预防或治疗癌症。在某些实施方案中，本公开提供了一种用于监测用于预防或治疗癌症的疗法(例如治疗性抗KIR3DL2抗体)(例如，的功效)的方法。
本文所述的抗体可以用于检测，优选地体外检测，表达KIR3DL2的细胞的存在，例如癌性细胞(例如癌性CD4 T细胞、癌性CD8 T细胞)。此类方法通常将涉及使来自个体的生物样本与根据本公开的抗体接触以及检测由该抗体与生物样本之间的免疫反应引起的免疫复合物的形成。在某些实施方案中，生物样本为组织样本。在另一个实施方案中，生物样本为固定组织样本。在一个优选的实施方案中，生物样本为福尔马林固定和/或石蜡包埋组织样本。该复合物可直接地通过标记根据本公开的抗体来检测，或间接地通过添加揭示根据本公开的抗体的存在的分子(二抗等)来检测。例如，标记可通过使该抗体与放射性或荧光标签偶联来实现。这些方法是本领域技术人员熟知的。因此，本公开还涉及根据本公开的抗体用于制备诊断组合物的用途，该诊断组合物可以用于检测表达KIR3DL2的细胞(例如癌性细胞、癌性CD4T细胞、癌性CD8 T细胞)的存在，任选地用于检测病变(其中存在表达KIR3DL2的细胞)的存在，任选地用于在体内或体外表征癌症或其他病变。
在一些实施方案中，本公开的抗体将可用于预测癌进展。癌预后、癌或癌进展的预后包括提供以下任一者或多者的预报或预测(预后)：易患癌或被诊断为患有癌的受试者的生存持续时间、易患癌或被诊断为患有癌的受试者的无复发生存持续时间、无进展生存持续时间、易患癌或被诊断为患有癌的受试者或受试者组中的治疗应答率、和/或受试者中治疗后的应答持续时间、应答程度或生存期。示例性生存期终点包括例如TTP(进展时间)、PFS(无进展生存)、DOR(应答持续时间)和OS(总生存期)。一般来讲，疾病进展和应答可根据标准的肿瘤应答标准约定，例如根据“实体瘤应答评估标准(Response Evaluation Criteriain Solid Tumors)”(RECIST)v1.1(如Eisenhauer,EA等人，实体瘤的新应答评估标准：修订的RECIST指南(New response evaluation criteria in solid tumours:Revised RECISTguideline)(版本1.1)，《欧洲癌症杂志》(Eur J Cancer)，2009:45:228-247所详述；该文献的公开内容以引用方式并入本文)来确定。
在一些方面，来自患有癌症的个体的生物样本可以使用本文公开的抗体来表征或评估，以评估生物样本中的KIR3DL2多肽和/或表达KIR3DL2的细胞。在某些实施方案中，生物样本为组织样本。在另一个实施方案中，生物样本为固定组织样本。在一个优选的实施方案中，生物样本为福尔马林固定和/或石蜡包埋组织样本。在一个实施方案中，个体未用结合KIR3DL2多肽并且对表达KIR3DL2的细胞增强细胞毒性(例如通过ADCC)的药剂(例如治疗性抗体)进行治疗。另选地，个体已经经历或正在经历使用结合KIR3DL2多肽的治疗性抗体(例如抗KIR3DL2单克隆抗体，诸如lacutamab)的疗程。
本公开的方法可用于确定个体是否患有以表达KIR3DL2的细胞为特征的癌症。此类方法可用于确定和/或提供个体的最佳疗程，以及监测个体的疾病。
在一个实施方案中，本公开提供了一种用于检测在患有癌症的个体中的表达KIR3DL2的细胞的方法，该方法包括：提供来自个体的生物样本，任选地其中该样本包含肿瘤组织或癌性细胞；以及使用本公开的单克隆抗体来检测所述样本中的KIR3DL2多肽。在某些实施方案中，生物样本为组织样本。在另一个实施方案中，生物样本为固定组织样本。在一个优选的实施方案中，生物样本为福尔马林固定和/或石蜡包埋组织样本。在一个实施方案中，检测到KIR3DL2多肽指示组织中的表达KIR3DL2的细胞的存在，任选地其中表达KIR3DL2的细胞为癌性细胞。
在一个实施方案中，个体已经经历或正在经历使用化学治疗剂的疗程。
在一个实施方案中，个体对于使用结合KIR3DL2多肽的药剂(例如，治疗性抗体)的疗程是符合条件的(例如，个体为候选者或潜在候选者)。
在一个实施方案中，个体已经经历或正在经历使用治疗性抗体的疗程，该治疗性抗体特异性结合KIR3DL2多肽和/或表达KIR3DL2的细胞。
在一个实施方案中，以KIR3DL2和/或表达KIR3DL2的细胞为特征的癌症或肿瘤(或患有此类癌症或肿瘤的个体)可以被鉴别为适合(例如，受益于)用化学治疗剂或免疫治疗剂治疗。例如，免疫治疗剂可以为通过诱导细胞毒性(例如通过ADCC)来直接或间接作用于表达KIR3DL2的细胞的药剂。此类药剂可用于治疗具有以可检测和/或升高水平的KIR3DL2表达为特征的癌症或肿瘤组织的个体。
在一个实施方案中，本公开提供了用于对其有需要的个体中的癌症的诊断、预后、监测和/或表征的体外方法，该方法包括：提供来自个体的生物样本；以及使用与优选地固定组织样本(任选地石蜡包埋组织样本)中的人KIR3DL2多肽特异性结合的单克隆抗体来检测样本中的KIR3DL2多肽(例如，表达KIR3DL2的细胞)，其中检测到KIR3DL2多肽指示个体适于(例如，受益于)用化学治疗剂或免疫治疗剂进行治疗。免疫治疗剂可以为通过诱导细胞毒性(例如通过ADCC)来直接或间接作用于表达KIR3DL2的细胞的药剂。此类药剂可用于治疗具有以可检测和/或升高水平的KIR3DL2表达为特征的癌症或肿瘤组织的个体。在一个实施方案中，生物样本为组织样本。在一个实施方案中，生物样本为固定组织样本，优选地化学固定组织样本。在一个实施方案中，生物样本为福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织。
在一个实施方案中，个体已经经历或正在经历使用治疗性抗体(诸如Lacutamab)的疗程，该治疗性抗体结合KIR3DL2多肽(例如表达KIR3DL2的细胞)并且诱导细胞毒性(例如通过ADCC)。可以评估来自个体的生物样本的KIR3DL2的表达和/或水平。如果KIR3DL2为可检测的，则个体可以被认为适合用结合KIR3DL2多肽(例如表达KIR3DL2的细胞)并且诱导细胞毒性(例如通过ADCC)的治疗性抗体持续治疗或进一步治疗，和/或适合用另外的或不同的治疗剂治疗。因此，在一个实施方案中，本公开提供了用于对其有需要的个体中的癌症的诊断、预后、监测和/或表征的体外方法，该方法包括：提供来自已经用治疗性抗体(诸如Lacutamab)进行治疗的个体的石蜡包埋生物样本，该治疗性抗体结合KIR3DL2多肽(例如表达KIR3DL2的细胞)并且诱导细胞毒性(例如通过ADCC)；以及使用与固定组织样本(任选地石蜡包埋组织样本)中的人KIR3DL2多肽特异性结合的单克隆抗体来检测样本中的KIR3DL2多肽(例如，表达KIR3DL2的细胞)，其中检测到KIR3DL2多肽指示个体适合(例如，受益于)用化学治疗剂或免疫治疗剂进行治疗。
在一个实施方案中，其癌性细胞或肿瘤组织的特征在于表达KIR3DL2多肽的个体可以用抗癌剂进行治疗，该抗癌剂为例如化学治疗剂、免疫治疗剂、结合KIR3DL2多肽(例如表达KIR3DL2的细胞)并且针对表达KIR3DL2的细胞增强细胞毒性(例如通过ADCC)的药剂(诸如Lacutamab)。此类药剂可用于治疗具有以可检测和/或升高水平的KIR3DL2表达为特征的肿瘤或肿瘤组织的个体。
在一个实施方案中，本公开提供了一种用于治疗或预防对其有需要的个体的癌症的方法，该方法包括：
(i)提供来自个体的生物样本，检测所述样本中的表达KIR3DL2的细胞，
(ii)在确定生物样本表达KIR3DL2的细胞(任选地处于与参考水平相比增加的水平)时，将免疫治疗剂施用于个体。
在某些实施方案中，生物样本为组织样本。在另一个实施方案中，生物样本为固定组织样本。在一个优选的实施方案中，生物样本为福尔马林固定和/或石蜡包埋组织样本。
在一个实施方案中，本公开提供了一种用于治疗或预防对其有需要的个体的癌症的方法，该方法包括：
(i)提供来自个体的生物样本，使用本公开的抗体来检测所述样本中的表达KIR3DL2的细胞，以及
(ii)在确定生物样本表达KIR3DL2的细胞(任选地处于与参考水平相比增加的水平)时，将免疫治疗剂施用于个体。
在某些实施方案中，生物样本为组织样本。在另一个实施方案中，生物样本为固定组织样本。在一个优选的实施方案中，生物样本为福尔马林固定和/或石蜡包埋组织样本。
在一个实施方案中，本公开提供了一种用于治疗或预防对其有需要的个体的癌症的方法，该方法包括：
(i)提供来自个体的生物样本，使用本公开的抗体来检测所述样本中的表达KIR3DL2的细胞，以及
(ii)在确定生物样本表达KIR3DL2的细胞(任选地处于与参考水平相比增加的水平)时，将免疫治疗剂施用于个体，该免疫治疗剂(诸如Lacutamab)结合KIR3DL2多肽(例如表达KIR3DL2的细胞)并且针对表达KIR3DL2的细胞增强细胞毒性(例如通过ADCC)。
在某些实施方案中，生物样本为组织样本。在另一个实施方案中，生物样本为固定组织样本。在一个优选的实施方案中，生物样本为福尔马林固定和/或石蜡包埋组织样本。
在任何方面，使用抗体来检测样本中的KIR3DL2多肽可以包括以下步骤：使来自个体的生物样本与抗体接触，以及检测由抗体与生物样本之间的免疫反应引起的免疫复合物的形成。在某些实施方案中，生物样本为组织样本。在另一个实施方案中，生物样本为固定组织样本。在一个优选的实施方案中，生物样本为福尔马林固定和/或石蜡包埋组织样本。
结合KIR3DL2(例如，在肿瘤细胞的表面处的KIR3DL2)的药剂可以为耗竭性抗KIR3DL2抗体(例如，结合KIR3DL2的抗体或抗体片段，任选地与细胞毒性药剂(诸如毒素)稠合)、包含结合KIR3DL2的抗体片段的嵌合抗原受体(例如，CAR-T细胞受体)、在其表面处表达嵌合抗原受体的效应细胞(例如，NK或T细胞)、与Fc结构域稠合的多肽、免疫粘附素等，其结合KIR3DL2。抗体药剂(治疗性抗体)的示例在PCT公开WO2014/044686中公开。
抗体的特征任选地在于，通过来自健康志愿者的PBMC对于HuT78肿瘤裂解的51Cr-释放测定中的EC50小于100ng/ml，任选地在1ng/ml与100ng/ml之间，任选地在1ng/ml与50ng/ml之间，任选地在25ng/ml与75ng/ml之间，任选地约50ng/ml。抗体的特征任选地在于：通过来自健康志愿者的PBMC对于HuT78肿瘤裂解的51Cr-释放测定中的EC50与本文公开的抗KIR3DL2抗体的EC50相当(例如，其EC50低于抗体的EC50的1-log或0.5-log或处于其内，该抗体具有SEQ ID NO:3的VH和SEQ ID NO:4的VL，包括野生型或经修饰的人IgG1同种型的Fc结构域，并且介导ADCC。
在一个实施方案中，根据本公开使用的治疗性抗KIR3DL2抗体为或包含lacutamab的重链和轻链氨基酸序列(参见WHO药物信息，第32卷，第4期，2018)。Lacutamab为具有以下项的人源化抗体：SEQ ID NO:26的重链可变区的Kabat重链CDR1、2和3，以及SEQ ID NO:27的轻链可变区的Kabat轻链CDR1、2和3(参见下表8)。CDR可以由合适的编号方案(例如Kabat编号)来确定。在一个实施方案中，lacutamab可以被表征为包含含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的轻链可变区。
表8
在一个实施方案中，lacutamab可以被表征为包含含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的轻链(参见下表9)。
表9
在一个实施方案中，抗KIR3DL2治疗性抗体包含在PCT公开WO2014/044681或WO2014/044686中公开的抗体11E1、8C7、3C12和/或6E1的重链和轻链CDR。
还提供了例如用于癌症的诊断试剂盒或预后试剂盒，该诊断试剂盒或预后试剂盒包含根据本公开的抗体或其抗体片段。任选地，试剂盒包含本发明的抗体或其抗体片段以及特异性识别本公开的所述抗体或其抗体片段的经标记的二抗。任选地，试剂盒包含用作诊断或预后的本发明的抗体，以及免疫治疗剂。在一个实施方案中，免疫治疗剂为结合KIR3DL2多肽(例如表达KIR3DL2的细胞)并且针对表达KIR3DL2的细胞增强细胞毒性(例如通过ADCC)的药剂(诸如Lacutamab)。所述试剂盒另外可以包括用来检测由生物样本与抗体之间的免疫反应产生的免疫复合物的装置，特别是实现所述经标记的抗体的检测的试剂。
本方法可用于一系列癌症的研究、评估、诊断、预后和/或监测。
此类方法适用于检测、评估对治疗的适合性和/或治疗患有TCL、易患TCL或已经经历TCL的个体。在一个实施方案中，TCL是侵袭性或晚期TCL(例如，IV期，或更一般地超过II期)。在一个实施方案中，个体患有复发性或难治性疾病。在一个实施方案中，个体具有疾病进展的不良预后(例如，存活的不良预后)，对疗法的应答具有不良预后，或者在用先前疗法进行先前治疗后具有进展性或复发性疾病。
在一个实施方案中，TCL是侵袭性T细胞肿瘤。在一个实施方案中，TCL是侵袭性非皮肤TCL。在另一个实施方案中，TCL是侵袭性皮肤TCL，任选地原发性皮肤CD4+小/中等T细胞淋巴瘤或原发性CD8+小/中等T细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，TCL是皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)。在一个实施方案中，TCL是外周T细胞淋巴瘤(PTCL)，任选地非皮肤PTCL。PTCL和PTCL-NOS可以任选地被指定为除皮肤T细胞淋巴瘤以外的疾病。
皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)(参见以下图像)是一组淋巴组织增生性病症，其特征在于肿瘤性T淋巴细胞定位于皮肤。总体来说，CTCL被分类为非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的类型。在以下文献中报告了世界卫生组织-欧洲癌症研究和治疗组织(WHO-EORTC)CTCL分类：Willemze等人，(2005)《血液(Blood)》105:3768-3785。WHO-EORTC将CTCL分成具有无痛临床行为的那些和具有侵袭性亚型的那些。第三类是非T细胞淋巴瘤的前体血液肿瘤(CD4+/CD56+血液皮肤肿瘤、母细胞自然杀伤(NK)细胞淋巴瘤或B细胞源性原发性皮肤肿瘤)。可以具有无痛临床行为的CTCL包含蕈样真菌病(MF)及其变体、原发性皮肤CD30+淋巴组织增生性病症(例如，原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病)、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤(临时性)和原发性皮肤CD4+小/中等大小的多形性T细胞淋巴瘤(临时性)。具有侵袭性临床行为的CTCL包含塞扎里氏综合征(SS)、成人T细胞白血病/淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤、鼻型、原发性皮肤外周T细胞淋巴瘤、未指定的原发性皮肤侵袭性嗜表皮性CD8+T细胞淋巴瘤(临时性)和皮肤γ/δ阳性T细胞淋巴瘤(临时性)。本文公开的方法可以用于治疗这些病状中的每种病状。
最常见的CTLC是MF和SS。它们的特征综述于例如Willemze等人，(2005)《血液》105:3768-3785，该文献的公开内容以引用方式并入本文。在大多数MF病例中，由于其临床特征、疾病史以及组织形态学和细胞形态学发现而得到诊断。将CTCL与炎性皮肤病区分开的另外的诊断标准是通过分子测定(例如，Southern印迹、聚合酶链反应(PCR))证明皮肤活组织检查标本中的显性T细胞克隆。也可以考虑基因检测。典型的蕈样真菌病分为三个阶段:(1)斑贴(萎缩或非萎缩)：非特异性皮炎、下干和臀部上的斑贴；瘙痒症，其最少/不存在；(2)斑：强瘙痒斑、淋巴结病以及(3)肿瘤：易于溃疡。塞扎里氏综合征由红皮病和白血病定义。体征和症状包含水肿性皮肤、淋巴结病、手掌和/或足底角化过度、脱发、指甲营养不良、外翻和肝脾肿大。对于塞扎里氏综合征的诊断，标准通常包含通过分子或细胞遗传学方法显示的外周血中的绝对塞扎里氏细胞计数、免疫表型异常、T细胞抗原的损失和/或T细胞克隆。
根据TNM分类，CTCL阶段包含I、II、III和IV，并且适当时，外周血受累。具有蕈样真菌病或塞扎里氏综合征(MF/SS)细胞的外周血受累与更晚期皮肤分期、淋巴结和内脏受累以及存活期缩短相关。MF和SS具有由国际皮肤淋巴瘤学会(ISCL)和欧洲癌症研究和治疗组织(EORTC)提出的正式分期系统。参见，Olsen等人，(2007)《血液》110(6):1713-1722；以及Agar等人，(2010)《临床肿瘤学杂志(J.Clin.Oncol.)》28(31):4730-4739，所述文献的公开内容通过引用并入本文。
在一个实施方案中，TCL是外周T细胞淋巴瘤(PTCL)，任选地非皮肤PTCL。PTCL和PTCL-NOS可以任选地被指定为除被认为是不同病理学的皮肤T细胞淋巴瘤塞扎里氏综合征和蕈样真菌病以外的疾病。在一个实施方案中，PTCL是结节(例如，主要或显著结节)PTCL。显著结节PTCL尤其包含PTCL-NOS(外周T细胞淋巴瘤，未另外指定)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)。例如，PTCL可以是侵袭性、非皮肤、显著结节PCTL(疾病可以另外具有结外呈递)。
在一个实施方案中，PTCL是结外(例如，主要结外)PTCL。例如，PTCL可以是侵袭性、非皮肤、结外PCTL。
在一个实施方案中，PTCL是成人T细胞白血病或淋巴瘤(ATL)，例如HTLV+ATL。
在一个实施方案中，PTCL是结外NK/T细胞淋巴瘤、鼻型。在一个实施方案中，PTCL是肠病相关T细胞淋巴瘤。
在一个实施方案中，PTCL是肝脾T细胞淋巴瘤，任选地肝脾αβT细胞淋巴瘤，任选地肝脾γδT细胞淋巴瘤。
在一个实施方案中，PTCL是间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)，任选地ALK+ALCL，任选地ALK-ALCL。ALK+ALCL通常享有使用常规疗法的有利预后(93％的5年存活期)，但ALK-ALCL具有不良预后(37％)。在一个实施方案中，PTCL是血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)，任选地皮肤AITL，任选地原发性皮肤CD4+小/中等T细胞淋巴瘤或原发性CD8+小/中等T细胞淋巴瘤，任选地非皮肤AITL。
在一个实施方案中，PTCL是肠淋巴瘤，例如肠ALCL。
在一个实施方案中，PTCL为T细胞前淋巴细胞性白血病。
在一个实施方案中，PTCL是PTCL-NOS(外周T细胞淋巴瘤，未另外指定)。PTCL-NOS，也称为PCTL-U或未指定的PTCL，是侵袭性淋巴瘤，主要是结节型，但结外受累是常见的。大多数结节病例为CD4+和CD8-。大多数患有PTCL-NOS的个体存在结节受累；然而，也可以涉及多个结外部位(例如肝脏、骨髓、胃肠、皮肤)。研究通常报告使用标准化学疗法的大约30％-35％的5年总存活期。在过去，已经描述了与可识别的T细胞肿瘤亚型相对应的多个明确实体，诸如伦纳特淋巴瘤(Lennert lymphoma)、T区淋巴瘤、多形性T细胞淋巴瘤和T免疫母细胞性淋巴瘤，但是仍然缺乏这些与独特的临床病理学实体相对应的证据。为此，世界卫生组织(WHO)最近对造血和淋巴肿瘤的分类已经将这些归入PTCL-NOS/U的单一广泛类别下。因此，可以指定PTCL-NOS排除某些独特的临床病理学实体，如T细胞前淋巴细胞性白血病、ATL/成人T细胞白血病、结外NK/T细胞白血病鼻型、EATL/肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、ALCL/间变性大细胞淋巴瘤和/或AITL/血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤。
PTCL诊断标准可以是标准医学指南的那些诊断标准，例如，根据世界卫生组织(WHO)分类系统(参见例如，世界卫生组织WHO造血和淋巴组织肿瘤分类，第4版，里昂，法国：IARC出版社(IARC Press),2008)。还参见例如，Foss等人，(2011)《血液》117:6756-6767，该文献的公开内容以引用方式并入本文。
在一个实施方案中，TCL的特征在于在其表面处表达显著和/或可检测的KIR3DL2多肽的肿瘤或肿瘤细胞。有利地，通过根据本公开的方法来确定KIR3DL2表达。
还提供了编码本公开的抗体或抗体片段的核酸。在一个实施方案中，核酸为分离的和/或重组的(包括例如基本上纯的)核酸，该核酸包含编码本公开的抗体或抗体片段的序列。
提供了产生本公开的抗体片段的杂交瘤或重组宿主细胞。因此，本公开的杂交瘤或重组宿主细胞可以包含编码本公开的抗体或抗体片段的核酸。
实施例
实施例1：生成用于在福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本中进行KIR3DL2免疫组织 化学(IHC)染色的单克隆抗体
兔免疫
用于生成抗KIR3DL2抗体的兔免疫使用4种不同策略来执行：
(1)用天然重组KIR3DL2蛋白免疫2只兔(兔#121和122)
(2)用根据第一IHC样方案(IHC-A)处理的KIR3DL2蛋白的重组细胞外结构域免疫2只兔(兔#278和372)
(3)用根据第二IHC样方案(IHC-B)处理的KIR3DL2蛋白的重组细胞外结构域免疫2只兔(兔#373和374)
(4)用使用IHC Peptide ProfilerTM技术(BIOTEM公司，法国)设计的3种肽(肽1：CEHFFLHREGISEDPSRLVG(SEQ ID NO:23)、肽3：CTPLTDTSVYTELPNAEPRS(SEQ ID NO:24)和肽4：CPRAPQSGLEGVF(SEQ ID NO:25))的库免疫2只兔(兔#375和376)。肽1为来自KIR3DL2受体的细胞外结构域的表位，而肽3和肽4为来自KIR3DL2受体的细胞内结构域的表位。
此类肽被生产并且与载体蛋白缀合(免疫原肽与KLH缀合，并且筛选肽与BSA缀合和/或游离)。
在第1天、第21天、第35天向兔子注射(皮下途径)抗原。在第45天执行放血。血清通过在蛋白质和肽上进行ELISA并且在FFPE组织微阵列上进行IHC来进行筛选。
兔121和122呈现类似的谱，但根据所达到的滴度，兔121似乎为文库构造的更好的候选者。在IHC中，可以观察到对KIR3DL2没有明显特异性的良好反应性。兔278和372呈现类似的谱，但根据所达到的滴度，兔278似乎为文库构造的更好的候选者。在IHC中，可以观察到对KIR3DL2没有明显特异性的良好反应性。兔373和374呈现类似的谱，但根据所达到的滴度，兔374似乎为文库构造的更好的候选者。在IHC中，可以观察到对KIR3DL2没有明显特异性的良好反应性。兔375和376呈现类似的谱，但根据所达到的滴度，兔376似乎为文库构造的更好的候选者。在IHC中，可以观察到对KIR3DL2良好的反应性/特异性。
总之，这些数据导致选择了用肽库免疫的1只动物(兔#376)和用使用IHC样程序B处理的KIR3DL2蛋白的重组细胞外结构域免疫的1只动物(兔#374)，其通过ELISA示出了强Ab滴度和更强的IHC染色。如果用肽库免疫后获得的血清在经KIR3DL2转染的CHO细胞上给出染色并且在未经转染的CHO细胞上未给出染色，则用使用IHC样程序B处理的KIR3DL2蛋白的重组细胞外结构域免疫后获得的血清对经KIR3DL2转染和经KIR3DL1转染的细胞两者染色。由于针对KIR3DL1的潜在交叉反应性，因此选择后者作为第二选择。
scFv文库的构造
对所选择的兔子执行脾切除术。脾在分子生物学实验室中进行处理，以用于RNA提取。然后将总RNA定量。编码γ链和κ/λ轻链的可变结构域的RNA分别用特异性引物组进行回复扩增。扩增的质量通过用1％ TBE/0.8％琼脂糖凝胶的电泳来进行控制。SmartLadder SFMW-1800-04(Eurogentec)用作电泳期间的参考。扩增的VH和VL PCR产物分别汇集并且克隆在备份载体中，以便生成两个不同的子文库(一个用于重链并且一个用于轻链)。文库构造的第一步骤由将VL片段克隆在我们的噬菌粒载体中组成，并且然后将VH片段插入到含有VL库的载体中。已经选择载体格式VH/VL-6His(HHHHHH)-FLAG(DYKDDDDK)以用于构造。
由兔(该兔用使用IHC样程序B处理的KIR3DL2蛋白免疫)构造的最终scFv文库由2.4×108个独立克隆组成，其具有87％的实际尺寸插入率(通过菌落-PCR)；并且最终封装在M13K07噬菌体中。由兔(该兔用3种肽的库免疫)构造的最终scFv文库由1.7×108个独立克隆组成，其具有94％的实际尺寸插入率(通过菌落-PCR)；并且最终封装在M13K07噬菌体中。在选择反应性克隆并且对候选者进行序列分析后，在大肠杆菌中产生24个克隆作为可溶性scFv并且纯化。在这些候选者中，16个来自用使用IHC样程序B处理的KIR3DL2蛋白的重组细胞外结构域进行的兔免疫(兔#374)，并且8个来自用肽库进行的兔免疫(兔#376)。
对于这些候选者，scFv的反应性通过ELISA来进行评估。对于从兔免疫(该兔免疫用使用IHC样程序B处理的KIR3DL2蛋白的重组细胞外结构域进行)中检索的16scFv，观察到针对KIR3DL2蛋白的强反应性，但未观察到针对三种肽1、3和4的强反应性。在从兔免疫(该兔免疫用肽库进行)中检索的8个scFv中，两种抗肽1scFv(P1-R7A-C11和P1-R7A-G1)呈现了针对与BSA缀合或游离的靶向肽1的高反应性。还观察到针对KIR3DL2的细胞外结构域的反应性。六种抗肽3scFv示出了针对肽3的反应性(与游离肽相比，与BSA缀合的肽更强)，并且未观察到针对BSA的反应性。通过ELISA评估的克隆P3-R4D-H5针对游离的或与BSA缀合的肽3的反应性呈现在图1上。似乎克隆P3-R4D-H5针对与BSA偶联的肽3比游离的肽3具有更强的反应性。
然后，这24个候选者的反应性使用经KIR3DL2转染和经KIR3DL1转染的CHO细胞通过IHC来进行评估。从用使用IHC样程序B处理的KIR3DL2蛋白进行的免疫中鉴别的16个克隆(兔#374)在经KIR3DL2转染和经KIR3DL1转染的CHO细胞两者上给出了强信号。
在选自用肽库进行的兔免疫的8个候选者(兔#376)中，两个候选者对肽1具有特异性(P1-R7A-G1和P1-R7A-C11)，并且6个候选者对肽3具有特异性(P3-R4D-F4、P3-R4D-C1、P3-R4D-H5、P3-R4D-C10、P3-R4D-B5和P3-R4D-B9)。两个抗肽1克隆均在经KIR3DL2转染的细胞上给出了强染色，并且在经KIR3DL1转染的细胞上给出了较低信号。根据ELISA数据，克隆P1-R7A-C11似乎为比克隆P1-R7A-G1更好的候选者，并且选择了前一个候选者。如图2所示，所有的抗肽3候选者均对经KIR3DL2转染的细胞呈现了强反应性，并且对经KIR3DL1转染的细胞呈现了较低反应性。相对于经KIR3DL1转染的细胞，用克隆P3-R4D-H5获得了在经KIR3DL2转染的细胞上的最强鉴别染色，这证明了其对KIR3DL2多肽的特异性。用克隆P3-R4D-C10、P3-R4D-B5和P3-R4D-B9也获得了鉴别染色。因为相对于经KIR3DL1转染的细胞，它们给出了在经KIR3DL2转染的细胞上的最强鉴别染色，所以选择了以下克隆：P3-R4D-H5、P3-R4D-C10、P3-R4D-B5和P3-R4D-B9。
总之，基于ELISA和IHC数据，选择并且生产呈兔IgG格式的P1-R7A-C11、P3-R4D-H5、P3-R4D-C10、P3-R4D-B5和P3-R4D-B9。
重新格式化和IgG生产
将所选择的scFv在全兔IgG抗体中重新格式化：P1-R7A-C11(兔IgG/K)、P3-R4D-H5(兔IgG/λ)、P3-R4D-C10(兔IgG/λ)、P3-R4D-B5(兔IgG/λ)和P3-R4D-B9(兔IgG/λ)。针对在哺乳动物细胞中进行表达，将编码重链的可变结构域(VH)和轻链的可变结构域(VL)的序列(呈现在下表中)优化并且合成。将对应的合成基因克隆在含有IgG重链和λ或κ轻链的兔恒定区的载体系统中。一旦通过定序来进行验证，就扩增载体以用于低内毒素质粒DNA的制备。
表10
瞬态转染使用中国仓鼠卵巢细胞在Biotem下进行。在最后培养日(纯化前)收获上清液，并且抗体滴度使用ForteBio Protein A生物传感器来进行测量。最后，上清液通过蛋白A亲和色谱法来进行纯化。
用于FFPE样本上的IHC的抗KIR3DL2抗体候选者选择
IHC测试在Ventana Benchmark Ultra自动玻片染色机上执行。该染色机由病理学家广泛使用，并且与伴随诊断的发展相容。
首先，测试呈兔IgG格式的所选择的克隆P1-R7A-C11、P3-R4D-H5、P3-R4D-C10、P3-R4D-B5和P3-R4D-B9，以评估它们在呈组织微阵列格式的FFPE细胞团块和正常皮肤上的特异性。在IHC评估后，两个克隆(P3-R4D-H5和P1-R7A-C11)被选择为对KIR3DL2更具有特异性的Ab，并且保存以用于另外的测试。在若干浓度(10μg/mL、7.5μg/mL、5μg/mL和2.5μg/mL)下，这2个克隆在也包括正常皮肤和FFPE人体组织(2个淋巴结、结肠、肝脏和CTCL)的呈组织微阵列格式的FFPE细胞团块上测试。与克隆P1-R7A-C11相比，克隆P3-R4D-H5在KIR3DL2阴性细胞上和FFPE组织上给出了较低的非特异性染色。与在CHO-mb-HuKIR3DL1或CHO细胞上获得的结果相比，它还在具有内源性KIR3DL2表达的HuT 78细胞上给出了更强的膜染色强度。克隆P3-R4D-H5在FFPE样本上给出了最好的结果。
实施例2：KIR3DL2特异性抗体在细胞团块的IHC染色中的用途。
用克隆P3-R4D-H5在FFPE细胞团块上进行KIR3DL2染色
在CHO-mb-HuKIR3DL2和HuT 78ATCC TIB-161细胞上执行了测试，因为它们过表达KIR3DL2。培养7天后(3代)，将CHO(KIR3DL2阴性细胞)与CHO-mb-HuKIR3DL2细胞混合以生成8种不同比例的KIR3DL2阴性和阳性细胞的混合物。培养17天后(7代)，将Raji和HuT细胞通过系列稀释法混合以生成8种不同比例的KIR3DL2阴性和阳性细胞的混合物。FFPE细胞团块用2千万个细胞/团块进行制备。将细胞系在福尔马林中固定1小时。然后，将细胞在PBS1X中洗涤并且重混悬于溶化的histogel中。在+5±3℃下histogel凝固后，将细胞团块放置于标准盒中并且用组织处理器脱水。接下来，将细胞团块包埋在石蜡中。石蜡凝固后，将FFPE细胞团块储存在室温(RT)下。切片在72℃下脱蜡30分钟，并且用表位修复缓冲液在+100℃下执行表位修复步骤20分钟。将切片与一抗(克隆P3-R4D-H5或同种型对照)一起温育20分钟。然后，冲洗切片，用后初级Ab(兔抗小鼠)温育8分钟，并且然后用辣根过氧化物酶(HRP)聚合物(抗兔-HRP)温育8分钟。染色的显示用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)执行10分钟。
用LEICA BOND RX，使用5μg/mL下的抗KIR3DL2克隆P3-R4D-H5在8个CHO/CHO-mb-HuKIR3DL2混合FFPE细胞团块的5个切片/块上执行IHC染色，并且使用相同浓度下的IC(同种型对照)在相同FFPE细胞团块的1个切片/块上执行IHC染色。如图3所示，可检测到超低数目的KIR3DL2+细胞的存在(直至通过流式细胞术确定的2.75％)。可以预知，用抗KIR3DL2抗体克隆P3-R4D-H5染色的细胞的数目连同在团块中的经KIR3DL2转染的细胞的百分比一起增加。同种型对照没有观察到染色。
此外，用LEICA BOND RX，使用5μg/mL下的抗KIR3DL2克隆P3-R4D-H5在8个Raji(人KIR3DL2阴性细胞)/HuT(HuT 78，ATCC参考TIB-161，人KIR3DL2阳性细胞)混合FFPE细胞团块的5个切片/块上执行IHC染色，并且使用相同浓度下的同种型对照在相同团块的1个切片/块上执行IHC染色。如图4所示，在此再次表明，可检测到超低数目(通过流式细胞术确定为2.42％)的KIR3DL2+细胞的存在。可以预知，用抗KIR3DL2抗体克隆P3-R4D-H5染色的细胞的数目连同团块中的HuT细胞的百分比一起增加。用同种型对照时，没有看到染色。总之，关于转染细胞(CHO-mb-HuKIR3DL2)和具有内源性表达的细胞(HuT)的混合团块的这些数据表明，克隆P3-R4D-H5为用于FFPE样本上的IHC的特异性抗KIR3DL2抗体。该抗体允许区分具有内源性KIR3DL2表达的细胞和没有KIR3DL2表达的细胞，其具有预期的百分比值并且甚至当阳性细胞以超低频率存在时。
克隆P3-R4D-H5和12B11 KIR3DL2染色的比较
用最著名的组织染色抗KIR3DL2抗体，克隆12B11，在混合冷冻团块上和FFPE细胞团块上执行相同类型的上述实验。FFPE细胞团块的制备与上述相同。执行不同的去掩蔽和扩增条件(例如缓冲液、缓冲液pH、添加酪酰胺-生物素)。对于冷冻样本，将切片再水化，用0.3％的H2O2温育10分钟，用PBS1X挤压瓶冲洗三次并且与蛋白质块温育30分钟。然后，去除蛋白质块，并且将切片与一抗(抗KIR3DL2 12B11抗体或小鼠IgG1同种型对照)在室温下温育1小时。将切片在PBS1X中冲洗三次，每次5分钟，并且然后在室温下与HRP偶联的二级Ab(来自Dako的EnVision试剂盒)温育30分钟。然后，将切片在PBS1X中冲洗三次，每次5分钟。最后，染色的显示用DAB执行5分钟。对于在冷冻样本上用LEICA BOND RX进行的IHC染色，该方案与用于FFPE样本的没有脱蜡和表位修复步骤的方案相同。
克隆P3-R4D-H5允许对在FFPE团块切片上的具有内源性KIR3DL2表达的细胞系(HuT细胞)进行染色。在方案优化后，克隆12B11(用于KIR3DL2组织染色的参考抗体)能够对冷冻样本中的HuT细胞系进行染色。然而，通过数字病理学进行的进一步分析示出，用克隆12B11染色的冷冻样本的染色准确度较低，其具有的染色质量与FFPE细胞团块样本观察到的染色相比较差。总之，用于在FFPE和冷冻样本上的IHC的抗KIR3DL2克隆P3-R4D-H5和12B11分别为KIR3DL2特异性抗体并且允许检测低数目的KIR3DL2表达细胞。然而，在FFPE样本上的染色质量比用冷冻样本染色的质量更好。
如图5A、5B和5C所示，在若干条件下使用克隆12B11 Ab(用于冷冻样本上的KIR3DL2组织染色的参考抗体)的IHC不允许显示含有KIR3DL2阳性细胞的FFPE细胞团块上的KIR3DL2。克隆12B11因此不能用于FFPE样本上的KIR3DL2 IHC染色。
相对于KIR3DL1，克隆P3-R4D-H5在IHC中针对KIR3DL2的特异性
在由以下项组成的FFPE细胞团块上执行相同类型的上述实验(参见在FFPE细胞团块上用克隆P3-R4D-H5进行的R3DL2染色)：作为人KIR3DL2和KIR3DL1阴性细胞的CHO细胞(CHO)；作为人KIR3DL1阳性细胞和KIR3DL2阴性细胞的CHO-mb-HuKIR3DL1细胞(CHO-KIR3DL1)；以及作为人KIR3DL2阳性细胞和KIR3DL1阴性细胞的CHO-mb-HuKIR3DL2细胞(CHO-KIR3DL2)。使用若干浓度下的抗KIR3DL2抗体克隆P3-R4D-H5来执行IHC染色后，通过HistoQuantif来确定FFPE切片的光密度。如图6所示，抗KIR3DL2克隆P3-R4D-H5与表达KIR3DL2的细胞结合，而没有观察到在表达KIR3DL1的细胞上的实质性结合。因此，克隆P3-R4D-H5对FFPE样本中的KIR3DL2多肽为特异性的。
实施例3：KIR3DL2特异性抗体在由活组织检查制备的细胞团块的IHC染色中的用 途
CTCL个体活组织检查的染色
克隆P3-R4D-H5和12B11分别用于染色FFPE和匹配的冷冻CTCL活组织检查。对来自罹患蕈样真菌病或塞扎里氏综合征的个体的活组织检查的FFPE和冷冻切片的染色评估由病理学家在扫描玻片上执行。对于每个FFPE块，制备3μm厚的切片，其沉积在superfrost玻片上并且在通风烘箱中在+45+/-3℃下干燥至少一小时。FFPE和冷冻切片上的KIR3DL2染色的代表性图像在图7中示出。由病理学家以半定量方式来估计单核细胞中KIR3DL2+细胞的百分比。在用抗KIR3DL2克隆P3-R4D-H5染色的FFPE CTCL样本上和在用抗KIR3DL2克隆12B11染色的匹配的冷冻样本上，由病理学家估计单核细胞中KIR3DL2+细胞的百分比。
通过比较在匹配的CTCL活组织检查上的用克隆12B11和克隆P3-R4D-H5估计的KIR3DL2+细胞的百分比，观察到克隆P3-R4D-H5通常给出了更高百分比的染色细胞。这反映了以下事实：对冷冻样本的染色评估更困难并且给出了较差的准确性，即冷冻样本的质量对于那些活组织检查是差的(与FFPE样本相比，冷冻样本对温度变化更敏感)。
另外，根据上文所呈现的方法将蕈样真菌病肿瘤样本(CTCL)用抗KIR3DL2克隆P3-R4D-H5进行的进一步IHC染色在图9A、图9B、图9C和图9D中示出。图9A和图9C表现出具有KIR3DL2的高表达(强信号)的肿瘤样本，而图9B表现出弱阳性肿瘤样本。图9D示出了复发的蕈样真菌病肿瘤样本，该样品涵盖具有强KIR3DL2阳性的区域和几乎KIR3DL2阴性的区域。
PTCL个体活组织检查的染色
克隆P3-R4D-H5和12B11分别用于FFPE染色并且匹配冷冻PTCL活组织检查。对来自罹患PTCL的个体的活组织检查的FFPE和冷冻切片的染色评估由病理学家在扫描玻片上执行。FFPE和冷冻切片上的KIR3DL2染色的代表性图像在图8中示出。在用抗KIR3DL2克隆12B11染色的冷冻PTCL样本上和在用抗KIR3DL2克隆P3-R4D-H5或同种型对照染色的匹配的FFPE样本上，由病理学家估计单核细胞中KIR3DL2+细胞的百分比。
结果示出，克隆12B11和克隆P3-R4D-H5允许分别对冷冻和FFPE PTCL样本上的KIR3DL2+细胞进行染色。
另外，根据上文所呈现的方法将PTCL肿瘤样本用抗KIR3DL2克隆P3-R4D-H5进行的进一步IHC染色在图10A、图10B、图10C和图10D中示出。图10A表现出高度KIR3DL2阳性的PTCL-NOS肿瘤样本，而图10C和图10D表现出具有中度KIR3DL2阳性的PTCL-NOS肿瘤样品(在图10D中的样本内具有区域性可变性。图10B示出了具有分散的KIR3DL2阳性肿瘤细胞的PTCL-NOS肿瘤样本，该阳性肿瘤细胞针对微弱的基质细胞KIR3DL2阳性的背景。
本文引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请和专利)据此全文以引用方式并入本文，就好像每篇参考文献单独且具体地指示为以引用方式并入并在本文中完全阐述一样(达到法律所允许的最大程度)，而不管在本文其他地方对特定文档进行的任何单独提供的并入。
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序列表
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<151> 2021-04-05
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<170> PatentIn 3.5版本
<210> 1
<211> 434
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
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Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Gly Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Phe Trp
85 90 95
Ala Gly Tyr Pro Ser Asn Ala Ala Ala Thr Val Ser Gly Met Asp Pro
100 105 110
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 119
<212> PRT
<213> 欧洲野兔
<400> 22
Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Ser Ala Ser Leu Asp Thr
1 5 10 15
Thr Ala Arg Leu Ala Cys Thr Leu Ser Thr Gly Tyr Ser Val Gly Ser
20 25 30
Tyr Gly Ile Gly Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Arg Pro Pro Arg Tyr
35 40 45
Leu Leu Thr Tyr His Thr Glu Glu Ile Lys His Gln Gly Ser Gly Val
50 55 60
Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Thr Ser Glu Asn Thr Ala Val
65 70 75 80
Leu Ser Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Ala His Gly Ser Gly Ser Ser Phe His Val Val Phe Gly Gly
100 105 110
Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr
115
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 计算机设计的肽
<400> 23
Cys Glu His Phe Phe Leu His Arg Glu Gly Ile Ser Glu Asp Pro Ser
1 5 10 15
Arg Leu Val Gly
20
<210> 24
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 计算机设计的肽
<400> 24
Cys Thr Pro Leu Thr Asp Thr Ser Val Tyr Thr Glu Leu Pro Asn Ala
1 5 10 15
Glu Pro Arg Ser
20
<210> 25
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 计算机设计的肽
<400> 25
Cys Pro Arg Ala Pro Gln Ser Gly Leu Glu Gly Val Phe
1 5 10
<210> 26
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合
<400> 26
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala
20 25 30
Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Ser His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Glu Gly Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合
<400> 27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合
<400> 28
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala
20 25 30
Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Ser His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Glu Gly Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 29
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 30
<211> 444
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 30
Met Ser Leu Met Val Val Ser Met Ala Cys Val Gly Leu Phe Leu Val
1 5 10 15
Gln Arg Ala Gly Pro His Met Gly Gly Gln Asp Lys Pro Phe Leu Ser
20 25 30
Ala Trp Pro Ser Ala Val Val Pro Arg Gly Gly His Val Thr Leu Arg
35 40 45
Cys His Tyr Arg His Arg Phe Asn Asn Phe Met Leu Tyr Lys Glu Asp
50 55 60
Arg Ile His Ile Pro Ile Phe His Gly Arg Ile Phe Gln Glu Ser Phe
65 70 75 80
Asn Met Ser Pro Val Thr Thr Ala His Ala Gly Asn Tyr Thr Cys Arg
85 90 95
Gly Ser His Pro His Ser Pro Thr Gly Trp Ser Ala Pro Ser Asn Pro
100 105 110
Val Val Ile Met Val Thr Gly Asn His Arg Lys Pro Ser Leu Leu Ala
115 120 125
His Pro Gly Pro Leu Val Lys Ser Gly Glu Arg Val Ile Leu Gln Cys
130 135 140
Trp Ser Asp Ile Met Phe Glu His Phe Phe Leu His Lys Glu Gly Ile
145 150 155 160
Ser Lys Asp Pro Ser Arg Leu Val Gly Gln Ile His Asp Gly Val Ser
165 170 175
Lys Ala Asn Phe Ser Ile Gly Pro Met Met Leu Ala Leu Ala Gly Thr
180 185 190
Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Val Thr His Thr Pro Tyr Gln Leu Ser Ala
195 200 205
Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Val Val Thr Gly Pro Tyr Glu Lys Pro
210 215 220
Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Lys Val Gln Ala Gly Glu Ser Val
225 230 235 240
Thr Leu Ser Cys Ser Ser Arg Ser Ser Tyr Asp Met Tyr His Leu Ser
245 250 255
Arg Glu Gly Gly Ala His Glu Arg Arg Leu Pro Ala Val Arg Lys Val
260 265 270
Asn Arg Thr Phe Gln Ala Asp Phe Pro Leu Gly Pro Ala Thr His Gly
275 280 285
Gly Thr Tyr Arg Cys Phe Gly Ser Phe Arg His Ser Pro Tyr Glu Trp
290 295 300
Ser Asp Pro Ser Asp Pro Leu Leu Val Ser Val Thr Gly Asn Pro Ser
305 310 315 320
Ser Ser Trp Pro Ser Pro Thr Glu Pro Ser Ser Lys Ser Gly Asn Pro
325 330 335
Arg His Leu His Ile Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Ile Ile Leu Phe
340 345 350
Ile Leu Leu Leu Phe Phe Leu Leu His Leu Trp Cys Ser Asn Lys Lys
355 360 365
Asn Ala Ala Val Met Asp Gln Glu Pro Ala Gly Asn Arg Thr Ala Asn
370 375 380
Ser Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp Pro Glu Glu Val Thr Tyr Ala Gln
385 390 395 400
Leu Asp His Cys Val Phe Thr Gln Arg Lys Ile Thr Arg Pro Ser Gln
405 410 415
Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr Asp Thr Ile Leu Tyr Thr Glu Leu Pro
420 425 430
Asn Ala Lys Pro Arg Ser Lys Val Val Ser Cys Pro
435 440
<210> 31
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 31
Thr Pro Leu Thr Asp Thr Ser Val Tyr Thr Glu Leu Pro Asn Ala Glu
1 5 10 15
Pro Arg Ser

Claims (44)

1.一种抗体或其抗体片段，所述抗体或其抗体片段能够与生物样本中的KIR3DL2多肽特异性结合，其中所述抗体或抗体片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQID NO:22的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。
2.一种抗体或其抗体片段，所述抗体或其抗体片段能够与已经被制备为石蜡包埋细胞团块的细胞的生物样本中的KIR3DL2多肽结合，其中所述抗体或抗体片段具有：(i)重链，所述重链包含CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，其具有SEQ ID NO:03(HCDR1)、SEQ ID NO:06(HCDR2)和SEQ ID NO:09(HCDR3)的序列；以及(ii)轻链，所述轻链包含CDR 1、2和3(LCDR1、LDR2、LCDR3)，其具有SEQ ID NO:12(LCDR1)、SEQ ID NO:15(LCDR2)和SEQ ID NO:18(LCDR3)的序列，其中每个CDR均能够任选地包含1个、2个或3个氨基酸取代、缺失或插入。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗体片段，其中所述抗体或其抗体片段能够与福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样本中的KIR3DL2多肽特异性结合。
4.一种分离的多肽，所述分离的多肽由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成。
5.一种抗体或其抗体片段，所述抗体或其抗体片段结合根据权利要求4所述的分离的多肽。
6.根据权利要求5所述的抗体或其抗体片段，其中与根据权利要求4所述的分离的多核苷酸的结合通过ELISA测试来进行确定，其中所述抗体或其抗体片段与包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的肽接触，所述肽优选地结合在固相支持体上。
7.一种抗体或其抗体片段，所述抗体或其抗体片段能够与生物样本中的KIR3DL2多肽特异性结合，其中所述抗体或其抗体片段能够与KIR3DL2多肽的细胞内表位结合，所述生物样本已经被固定在福尔马林中，然后在与所述抗体或其抗体片段接触之前被切成切片。
8.根据权利要求7所述的抗体或其抗体片段，其中所述抗体或其抗体片段结合KIR3DL2多肽的对应于TPLTDTSVYTELPNAEPRS(SEQID NO:31)的氨基酸序列的部分。
9.一种抗体或其抗体片段，所述抗体或其抗体片段能够与已经被制备为石蜡包埋细胞团块的表达KIR3DL2的细胞的生物样本中的KIR3DL2多肽结合，其中所述抗体或其抗体片段不与已经被制备为石蜡包埋细胞团块的不表达KIR3DL2的表达KIR3DL1的细胞的生物样本中的KIR3DL1结合。
10.根据权利要求1至3、5至9所述的抗体或其抗体片段，其用于检测生物样本中的表达KIR3DL2的细胞的存在。
11.根据权利要求10所述的用于所述用途的抗体或抗体片段，其中所述生物样本为组织样本。
12.根据权利要求11所述的用于所述用途的抗体或抗体片段，其中所述生物样本为固定组织样本。
13.根据权利要求12所述的用于所述用途的抗体或抗体片段，其中所述样本为福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的用于所述用途的抗体或抗体片段，其中借助于免疫组织化学(IHC)来完成检测。
15.一种检测样本中的表达KIR3DL2的细胞的体外方法，所述方法包括：(i)提供来自包含细胞的个体的生物样本，以及(ii)用根据权利要求1至3、5至9所述的抗体或其抗体片段检测表达KIR3DL2的细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物样本为组织样本。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述生物样本为固定组织样本。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述样本为福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织。
19.根据权利要求15至18所述的方法，其中检测表达KIR3DL2的细胞的步骤包括：使所述样本与根据权利要求1至3、5至9所述的抗体或抗体片段接触，以及检测由所述抗体或其抗体片段与所述样本之间的免疫反应引起的免疫复合物的形成。
20.根据权利要求19所述的方法，其中借助于免疫化学(IHC)来完成检测免疫复合物的形成。
21.根据权利要求20所述的方法，其中通过使用与根据权利要求1至3、5至8所述的抗体或抗体片段结合的二抗来完成检测免疫复合物的形成。
22.根据权利要求18至21所述的方法，其中石蜡包埋组织样本已被固定、包埋于石蜡中、切片、脱蜡并转移至玻片。
23.一种评估患有癌症的个体对于用免疫治疗剂进行治疗的适合性的体外方法，所述方法包括：(i)提供来自个体的生物样本，以及(ii)使用根据权利要求1至6所述的抗体或其抗体片段来检测所述样本中的表达KIR3DL2的细胞，其中检测到表达KIR3DL2的细胞指示所述个体适合用免疫治疗剂进行治疗。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述生物样本为组织样本。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述生物样本为固定组织样本。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述生物样本为福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述免疫治疗剂为结合KIR3DL2多肽的药剂。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述免疫治疗剂为结合KIR3DL2多肽并且针对表达KIR3DL2的细胞通过ADCC来增强细胞毒性的抗体。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述抗体为LACUTAMAB。
30.根据权利要求23至29所述的方法，其中所述石蜡包埋组织样本已被固定、包埋于石蜡中、切片、脱蜡并转移至玻片。
31.一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括：(i)提供来自个体的生物样本，根据权利要求15至22中任一项所述的方法使用根据权利要求1至3、5至9所述的抗体或其抗体片段来检测所述样本中的表达KIR3DL2的细胞，以及(ii)如果检测到表达KIR3DL2的细胞，则将免疫治疗剂施用于所述个体。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述生物样本为组织样本。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述生物样本为固定组织样本。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述生物样本为福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织。
35.根据权利要求31所述的方法，其中所述疾病为癌症。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述癌症为淋巴瘤。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述淋巴瘤为皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述CTCL为蕈样真菌病或塞扎里氏综合征。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述CTCL为转化型T淋巴瘤。
40.根据权利要求36所述的方法，其中所述淋巴瘤为外周T细胞淋巴瘤(PTCL)。
41.根据权利要求34至40中任一项所述的方法，其中所述石蜡包埋生物样本已被固定、包埋于石蜡中、切片、脱蜡并转移至玻片。
42.一种试剂盒，所述试剂盒包含：根据权利要求1至3、5至9中任一项所述的抗体或抗体片段；以及特异性识别根据权利要求1至3、5至9中任一项所述的所述抗体或其抗体片段的经标记的二抗。
43.一种分离的核酸或核酸组，所述分离的核酸或核酸组编码根据权利要求1至3、5至9所述的抗体或抗体片段。
44.一种杂交瘤或重组宿主细胞，所述杂交瘤或重组宿主细胞产生根据权利要求1至3、5至9所述的抗体或抗体片段，或者包含根据权利要求43所述的核酸。
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