ES2642565T3

ES2642565T3 - Anticuerpos anticarcinoma y sus usos

Info

Publication number: ES2642565T3
Application number: ES04761652.9T
Authority: ES
Inventors: Colin Roger Mackenzie; Jianbing Zhang; Thanh-Dung Nguyen; Qinggang Li; Kien Trung Mai
Original assignee: National Research Council of Canada; Ottawa Health Research Institute
Current assignee: National Research Council of Canada; Ottawa Health Research Institute
Priority date: 2003-11-28
Filing date: 2004-08-17
Publication date: 2017-11-16
Anticipated expiration: 2024-08-17
Also published as: US20060286113A1; AU2004293502A1; CA2547034A1; JP5618453B2; US7872105B2; EP1694845A1; EP1694845B8; WO2005052158A1; CA2547034C; EP1694845A4; PL1694845T3; EP1694845B1; AU2004293502B2; JP2008501304A

Description

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DESCRIPCION

Anticuerpos anticarcinoma y sus usos

En general se espera que la investigacion proteomica facilite en gran medida el descubrimiento de nuevas dianas tumorales. Los principales avances se han realizado en la identificacion de dianas para fines de diagnostico. Sin embargo, las limitaciones de las tecnologfas actuales han dificultado la identificacion de nuevas dianas terapeuticas. Las tecnicas comunmente empleadas en la proteomica, tales como electroforesis en gel bidimensional, cromatogra- ffa Kquida y espectrometna de masas en tandem (LC/MS/MS), ionizacion por desorcion laser asistida por una ma- triz/espectrometna de masas (MALDI-MS), y el sistema de dos Idbridos de levadura no han satisfecho la demanda de dianas "utilizables como farmacos", tales como marcadores de la superficie celular.

Los anticuerpos y peptidos que se dirigen a tumores se pueden aislar por medio de enfoques de presentacion en genotecas (por ejemplo, Aina, 2002; Hoogenboom, 1998). Esto se logra generalmente mediante el escrutinio de una genoteca de presentacion en fagos, o genotecas con otros formatos de presentacion, contra antfgenos purificados espedficos de tumores o asociados a tumores. Sin embargo, los anticuerpos y los peptidos que se dirigen a tumores tambien se han aislado mediante la seleccion por afinidad en genotecas frente a celulas tumorales o tejidos tumorales sin una informacion previa de las dianas moleculares. Las ventajas notables de este ultimo enfoque son:

(i) los anticuerpos/peptidos aislados se unen a formas naturales de sus antfgenos/ligandos en la superficie celular, mientras que los antfgenos tumorales purificados son frecuentemente de naturaleza recombinante y care- cen de una modificacion postraduccional, (ii) los antfgenos son accesibles para los anticuerpos/peptidos aislados aunque los aislados mediante una seleccion por afinidad frente a antfgenos puros, pueden reconocer epf- topos que estan hundidos de forma natural en la membrana o bloqueados por una modificacion de los hidratos de carbono. Sin embargo, los anticuerpos/peptidos aislados con este metodo, por lo general tienen una afinidad de baja a moderada hacia sus antfgenos/ligandos.

Puesto que cada partmula del fago M13 presenta cinco copias de la protema pIII de recubrimiento menor, una partf- cula de fago que presenta un fragmento de anticuerpo en todas las copias de pIII, se puede considerar un anticuerpo pentavalente. Esta presentacion multivalente de fragmentos de anticuerpo en los fagos aumenta en gran medida la avidez del anticuerpo y facilita tanto el escrutinio como la evaluacion de los anticuerpos en fagos. Los fragmentos de anticuerpo aislados (scFv o sdAbs) o los peptidos se unen a antfgeno con mucha menos eficacia ya que estan pre- sentes principalmente en una forma monovalente y carecen de avidez.

Una estrategia de oligomerizacion de fragmentos de anticuerpo que permite una pentavalencia como en la presentacion en fagos con pIII, es el objeto del documento PCT/CA02/01829 (MacKenzie y Zhang). La fusion de un anticuerpo de dominio unico (sdAb) con el dominio de homopentamerizacion de la subunidad B de verotoxina (VT1 B) da como resultado la pentamerizacion simultanea del sdAb. Los sdAbs pentavalentes, denominados pentacuerpos, se unen con mucha mas fuerza al antfgeno inmovilizado que sus homologos monomericos. En el caso de un sdAb que se urna a una hormona peptfdica, la pentamerizacion daba como resultado una mejora de 103 a 104 veces en la union al antfgeno inmovilizado. El documento WO0052054 da a conocer un scFv contra las celulas A459. Un objeto de la invencion es proporcionar un anticuerpo de dominio unico con afinidad hacia el carcinoma de pulmon.

COMPENDIO DE LA INVENClON

Se proporciona en el presente documento un nuevo anticuerpo de dominio unico AFAI y fragmentos del mismo que tiene afinidad espedfica por la union a un carcinoma, y especialmente al carcinoma de pulmon. Este anticuerpo, y porciones del mismo, se pueden utilizar, entre otras cosas en el diagnostico y el tratamiento de un carcinoma. La invencion se define por las reivindicaciones adjuntas.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

La FIGURA 1 es una representacion de AFAI monomerico y pentamerico. (a) Secuencia de AFAI (SEQ ID NO. 1) con CDR1, CDR2 y CDR3 subrayadas; (b) representacion esquematica de las estructuras primarias de la protema monomerica (AFAI) y pentamerica (ES1); (c) secuencia de ES1 (SEQ ID NO. 2) con AFAI subrayado; (d) SDS-PAGE de ES1 purificado (carril 1) y AFAI (carril 2).

La FIGURA 2 es una representacion ilustrada de una tincion inmunocitoqmmica de las celulas A549 con el anticuerpo AFAI en fagos. Las celulas se expusieron al fago con AFAI como primer anticuerpo, a IgG de raton an- ti-Ml3 como segundo anticuerpo y a IgG de cabra anti-raton marcada con Alexa Fluor 546 como tercer anticuerpo. DAPI y DIOC5(3) se utilizaron para tenir los nucleos celulares y el retmulo endoplasmatico, respectiva- mente.

La FIGURA 3 es una representacion ilustrada de una tincion inmunocitoqmmica de A549 con AFAI y ES1. Las celulas A549 se expusieron a ES1 (A) o AFAI (D) como primer anticuerpo, a IgG monoclonal anti-c-myc como segundo anticuerpo y a IgG anti-raton marcada con Alexa Fluor 546 (rojo) como tercer anticuerpo. La tincion con DAPI de (A) y (D) se muestra en (B) y (E), respectivamente. Superposiciones de A, B y D, E se muestran en C y F, respectivamente.

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La FIGURA 4 es una representacion ilustrada de una tincion inmunohistoqmmica que muestra que ES1 se une fuertemente a un adenocarcinoma de pulmon diferenciado y no se une a la mayona de los adenocarcinomas de colon o al tejido pulmonar normal. (A) Tincion fuerte positiva de un adenocarcinoma de pulmon, (B) vista ampliada del area en el recuadro en (A), (C) tincion negativa de un adenocarcinoma de colon y (D) tincion ne- gativa de tejido pulmonar normal.

La FIGURA 5 es una representacion de un carcinoma bronquioloalveolar de tipo mucinoso: (A) inmunotincion con ES1 que muestra una inmunorreactividad moderada difusa, principalmente a lo largo de los lfmites lumina- les; (B) gran aumento de un area en A; (C) inmunotincion con TTF1 (DaKO) que muestra una inmunorreactividad negativa.

La FIGURA 6 es una representacion de un adenocarcinoma de pulmon metastasico poco diferenciado: (A) inmunotincion con ES1 que muestra una inmunorreactividad fuerte difusa; (B) gran aumento de un area en A; (C) inmunotincion con TTF1 que muestra una inmunorreactividad negativa.

La FIGURA 7 es una representacion de un adenocarcinoma de pulmon moderadamente diferenciado: (A) inmunotincion con ES1 que muestra una fuerte inmunorreactividad en una zona focal adyacente a un area que muestra una tincion focal debil; (B) gran aumento de un area en A. (C) Inmunotincion con MIB1 (DAKO) que muestra un aumento notable de la inmunorreactividad en una zona con fuerte inmunorreactividad con ES1.

La FIGURA 8 es una representacion de un adenocarcinoma de pulmon poco diferenciado: (A) inmunotincion con ES1 que muestra una inmunorreactividad moderada y extensa; (B, C) gran aumento de un area en A. Ob- servese la inmunotincion negativa en el epitelio bronquial normal.

La FIGURA 9 es una representacion de un carcinoma de pulmon adenoescamoso: (A) inmunotincion con ES1 que muestra una inmunorreactividad focal; (B, C) gran aumento de un area en A que muestra una inmunorreactividad focal.

La FIGURA 10 es una representacion de una hiperplasia adenomatosa tfpica del pulmon: (A) inmunotincion con ES1 que muestra una inmunorreactividad focal debil, (B, C) gran aumento de un area en A que muestra una inmunorreactividad debil.

La FIGURA 11 es una representacion de un adenocarcinoma colonico metastasico moderadamente diferenciado en el cerebro: (A) inmunotincion con ES1 que muestra una inmunorreactividad focal en unas pocas celulas aisladas; (B) gran aumento de un area en A.

La FIGURA 12 es una representacion de carcinoma ductal infiltrante de la mama: (A) inmunotincion con ES1 que muestra una inmunorreactividad moderada focal; (B) gran aumento de un area en A; (C) inmunorreactividad focal fuerte en algunos acinos en el tejido mamario normal.

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

La investigacion proteomica ha proporcionado muchas dianas tumorales novedosas. Sin embargo, debido a algunas limitaciones, ha sido diffcil identificar dianas que sean mas accesibles para la aplicacion de farmacos. Una nueva plataforma de descubrimiento de antfgenos tumorales basada en el escrutinio de una genoteca de anticuerpos de dominio unico (sdAb) frente a celulas tumorales y, posteriormente, la identificacion de los antfgenos correspondien- tes de los anticuerpos aislados, se describe en el presente documento. Un sdAb espedfico, AFAI, espedfico de carcinoma de pulmon de celulas no pequenas (lmea celular A549) se aislo a partir de una genoteca de fagos obteni- da a partir del repertorio de anticuerpos de cadena pesada de una llama, tal y como se describe en el Ejemplo 1. La propiedad de homopentamerizacion de una subunidad B de verotoxina no toxica fue explotada para preparar el pentacuerpo ES1, las formas pentamericas de AFAI. La pentamerizacion mejoro enormemente la union del AFAI a las celulas A549. Una tincion inmunohistoqmmica mostro que ES1 es altamente espedfico para el carcinoma de pulmon.

De cara a la descripcion en el presente documento, es posible sintetizar qmmicamente el gen completo de ES1 y expresarlo en E. coli o en otro organismo apropiado de acuerdo con tecnicas convencionales. El gen de AFAI se puede sintetizar a partir de ES1, que es la entidad que se une a su antfgeno. De cara a la descripcion en el presente documento, es posible preparar formas dimericas, trimericas, tetramericas, pentamericas y otras formas multivalen- tes de AFAI. Tales productos pueden ser utiles en metodos y composiciones que se relacionan con la presente in- vencion, al igual que el ADN y el material clonado pueden proporcionar variantes de tales productos que proporcio- nan una union espedfica a un tejido maligno o a celulas de interes, como se describe en el presente documento.

ES1, AFAI y/o variantes de los mismos que muestran una especificidad de union similar ("variantes adecuadas") son utiles en el diagnostico y el tratamiento del carcinoma de pulmon. Los metodos de diagnostico con los que se pueden emplear ES1, AFAI y/o variantes adecuadas de los mismos incluyen: metodos de inmunohistoqmmica; marcado de la(s) molecula(s) (ES1, AFAI, variantes) con radioisotopos y deteccion con herramientas de formacion de image- nes de tumores, tales como la tomograffa por emision de positrones e IRM; analisis de muestras de sangre (y detec- tar la union usando tecnicas convencionales).

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Se contemplan espedficamente kits de diagnostico que comprenden ES1, AFAI y/o una variante adecuada de los mismos y las instrucciones para su uso.

Los metodos terapeuticos y las composiciones relacionadas con ES1 y AFAI incluyen emplear AFAI, ES1 o una variante adecuada de los mismos y, por ejemplo: marcarlos con radioisotopos y aplicar las moleculas a un paciente; conjugarlos con uno o varios agentes terapeuticos convencionales y aplicar el conjugado a un paciente; conjugarlos con una o varias toxinas y aplicar los conjugados a pacientes; expresar moleculas de acido nucleico que codifican ES1, AFAI y/o una variante adecuada de los mismos en un vector de terapia genica y aplicar los vectores a pacien- tes.

Resultados Ejemplo 1:

Cultivo celular

La lmea celular de carcinoma de pulmon de celulas no pequenas, A549, se adquirio en la ATCC (Manassas, VA) y se conservo en DMEM (Gibco, Rockville, MA) complementado con 5% de FBS (Gibco) y 1% de antibiotico antimico- tico (Gibco). Las celulas de fibroblastos dermicos humanos primarios fueron amablemente proporcionadas por el Dr. J. Xu (Apotex Research Inc. Ottawa, ON). El antisuero policlonal de conejo anti-verotoxina fue proporcionado amablemente por el Dr. Clifford Lingwood (Univ. de Toronto).

Aislamiento del sdAb AFAI que se une a la lmea celular de carcinoma de pulmon de celulas no pequenas A549

Una genoteca de anticuerpos de dominio unico de llama sin tratamiento previo (Tanha et al., 2002) sirvio como fuen- te de un fragmento de anticuerpo espedfico de las celulas tumorales, en este caso la lmea celular de carcinoma de pulmon de celulas no pequenas A549. El aislamiento de los anticuerpos en fagos que se uman a las celulas A549, denominado seleccion celular por afinidad, se llevo a cabo con celulas A549 con una adsorcion previa de la genoteca sobre fibroblastos humanos en cada ronda de seleccion por afinidad.

Una genoteca de presentacion en fagos de sdAb (Tanha et al., 2002) se selecciono por afinidad con A549 como celulas diana y fibroblastos dermicos humanos como celulas de sustraccion. La seleccion por afinidad se realizo como se describe en Becerril et al. (1999) con ligeras modificaciones. Para la primera ronda de seleccion por afinidad, se incubaron 1013 pfu con las celulas de sustraccion de fibroblastos para eliminar fagos que se uman a fibroblastos. Las partmulas de fagos restantes en el material sobrenadante se incubaron con celulas A549 cultivadas en una placa de Petri de 5 cm a temperatura ambiente durante 1 h. Las celulas A549 se lavaron 5 veces, 1 minuto cada vez, con PBS y 5 veces, 10 minutos cada vez, con tampon de extraccion (glicina 50 mM, pH 2,8, NaCl 0,5 M, urea 2 M, 2% de polivinilpirrolidona) y despues se lisaron con trietilamina 100 mM. El lisado celular se neutralizo mediante la adicion de 100 pl de Tris 1 M (pH 7,0). Los fagos en el lisado celular neutralizado se amplificaron en celulas TG1 de E. coli. La subgenoteca amplificada se sometio a la siguiente ronda de seleccion por afinidad empleando el mis- mo metodo. Los clones de fagos individuales se seleccionaron despues de cuatro rondas de seleccion por afinidad y se determinaron las secuencias de ADN que codificaban los anticuerpos presentados.

Los clones de fagos individuales se aislaron despues de cuatro rondas de seleccion por afinidad y las actividades de union a las celulas de los clones de fagos se examinaron mediante ELISA. De 94 clones, 25 clones dieron positivo. El analisis de la secuencia de los clones de fagos positivos con ELISA, mostraba que los 25 clones de fagos positi- vos mostraban el mismo sdAb. Este anticuerpo se designo AFAI porque la region CDR3 del anticuerpo es el tetra- peptido Ala-Phe-Ala-Ile (Figura 1).

Ejemplo 2

Tincion celular Parte A: Tincion de las celulas con AFAI presentado en fagos

Cuando las celulas A549 se inmunotineron con el fago con AFAI como primer anticuerpo, seguido por un anticuerpo monoclonal anti-M13 e IgG de cabra anti-raton marcada con Fluor 546, se observo que unas senales fluorescentes muy intensas estaban asociadas con una subpoblacion celular (Fig. 2). El patron de la tincion de las celulas A549 positivas sugena que AFAI se une a un antfgeno de membrana abundante.

Para investigar si la union del fago con AFAI a las celulas A549 es espedfica del tipo celular, una lmea celular humana de epitelio bronquial, HBE4, una lmea celular humana de prostata, PREP y una lmea celular humana de fibroblastos primarios se eligieron como controles para la tincion inmunocitoqmmica. Con las mismas condiciones em- pleadas para la inmunocitoqmmica de A549, no se observo ninguna tincion con fibroblastos humanos y solo se ob- servo una tincion muy debil con HBE4 y PREP.

Ejemplo 3

Tincion celular Parte B: Produccion de sdAbs de AFAI monomeros y pentameros y tincion celular con los sdAbs

Para una evaluacion adicional y una caracterizacion de AFAI, AFAI monomeros y pentameros se expresaron y se purificaron. El gen que codificaba AFAI se amplifico mediante PCR y se inserto en un vector de expresion de E. coli, generando el clon pAFAl (Fig. 1B). Para aprovechar el efecto de avidez elevada de los pentacuerpos, se construyo una forma pentamerica de AFAI, denominada ES1 (Fig. 1B y Fig. 1C). Los rendimientos de AFAI y ES1 purificados 5 (Fig. 1D) a partir de cultivos en matraces de 1 litro de E. coli TG1, sin optimizacion de la fermentacion, eran 6 mg y 20 mg, respectivamente.

Brevemente, el ADN que codificaba el sdAb AFAI se clono en los sitios Bbsl/BamHI del plasmido pSJF2 (Tanha, 2003) y los sitios Bbsl/ApaI del plasmido pVT2 para generar vectores de expresion para AFAi monomero y pentame- ro, respectivamente. Los clones de E. coli obtenidos se designaron pAFAI (monomero) y pES1 (pentamero). Las 10 protemas AFAI y ES1 se produjeron como se describe en Tanha et al. (2003), con la modificacion de una extraccion de las protemas a partir de celulas de E. coli mediante lisis de las celulas en lugar de choque osmotico. Brevemente, los clones de pAFAI y pES1 se inocularon en 100 ml de medio M9 (0,2% de glucosa, 0,6% de Na2HPO4, 0,3% de KH2PO4, 0,1% de NH4Cl, 0,05% de NaCl, MgCh 1 mM, CaC^0,1 mM) complementado con 0,4% de casaminoaci- dos, 5 mg/l de vitamina B1 y 200 pg/ml de ampicilina y se agitaron durante una noche a 37°C. Treinta ml del cultivo 15 de M9 durante una noche se transfirieron a 1 litro de medio M9 con los mismos complementos y se agitaron a 37°C durante 24 horas. La induccion de la expresion genica se inicio mediante la adicion de 100 ml de 10 x nutrientes TB (12% de triptona, 24% de extracto de levadura, 4% de glicerol), 2 ml de 100 mg/ml de ampicilina y 1 ml de IPTG 1 M y los cultivos se agitaron a temperatura ambiente durante 48 a 72 horas. Las celulas de E. coli se recogieron mediante centrifugacion y se lisaron con un homogeneizador celular Emulsiflex® (Avestin Inc. Ottawa, ON). El lisado 20 celular se centrifugo, el material sobrenadante claro obtenido se cargo en una columna de afinidad quelante Hi- Trap® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) y las protemas que conteman marcador Hiss se purificaron siguien- do las instrucciones del fabricante.

La tincion inmunoqmmica de las celulas A549 se realizo con ambos anticuerpos monomericos (AFAI) y pentameri- cos (ES1).

25 Se emplearon metodos inmunoqmmicos convencionales, con ligeras modificaciones, en la tincion de las celulas con fago con AFAI y con AFAI monomerico y pentamerico. Las celulas se cultivaron en cubreobjetos de portaobjetos hasta aproximadamente 70% de confluencia y se fijaron durante 10 minutos con formaldetndo al 4% en PBS. La permeabilizacion se llevo a cabo durante 30 minutos a temperatura ambiente en 0,05% de NP-40 (Bio-Rad, Hercules, CA) seguida de tres lavados con PBS que contema 0,05% de Tween-20 (PBST). Para la tincion de las celulas 30 con fago con AFAI, se incubaron 2 x 1011 pfu de fago con AFAI (en medio A549) con celulas fijadas durante 18 horas a 4°C y se lavaron tres veces, 5 minutos cada vez, con PBST. Para la tincion de las celulas con AFAI monomerico o pentamerico, se incubaron 100 pg/ml de AFAI y ES1 (en medio A549) con las celulas durante 2 horas a temperatura ambiente y se lavaron tres veces con PBST. Los anticuerpos secundarios, IgG monoclonal anti-M13 (Amersham Biosciences) para el fago M13 o la IgG 9E10 anti c-myc (ATCC) para el pentacuerpo ES1, se aplicaron con una 35 dilucion 1:100 durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguida de tres lavados con PBST. El tercer anticuerpo IgG de cabra anti-raton marcada con Alexa Fluor 546® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR), se diluyo 1:100 y se aplico de la misma manera que los anticuerpos secundarios. La tincion de contraste se realizo con DAPI y (DIOC5)3 (Molecular Probes). Despues de la tincion inmunoqmmica, los cubreobjetos se montaron usando un kit Prolong Antifade (Molecular Probes) y se observaron con un microscopio de fluorescencia Olympus BX51® y las imagenes se 40 registraron.

No se observo ninguna tincion obvia cuando se empleo AFAI (Fig. 3), debido probablemente a la baja afinidad de union de AFAI monomerico. La capacidad del anticuerpo AFAI para tenir las celulas A549, sin embargo, se observo cuando se empleaba la forma pentamerica, ES1, (Fig. 3). Tal y como se observo con el fago con AFAI, ES1 sola- mente tenia una subpoblacion de las celulas A549.

45 Ejemplo 4

Determinacion de la especificidad de ES1 para tejidos tumorales

Para determinar la especificidad de tejido de ES1, se realizo una tincion inmunohistoqmmica de una amplia gama de tejidos sobre una micromatriz de tejido utilizando ES1 como anticuerpo primario. Los resultados mostraban que ES1 reconoda la mayona de los adenocarcinomas de pulmon, mostrando una inmunorreactividad de moderada a fuerte. 50 Ningun adenocarcinoma de colon mostraba una inmunorreactividad fuerte hacia ES1, sin embargo, se observo una inmunorreactividad focal de debil a moderada en unos pocos casos. Los tejidos de pulmon y de colon no cancerosos no eran inmunorreactivos (Fig. 4, Tabla 1).

Tinciones inmunohistoquimicas

Para determinar la especificidad de tejido de ES1, se realizo una tincion inmunohistoqmmica de una amplia gama de 55 tejidos usando ES1 como anticuerpo primario.

La inmunotincion de tejidos humanos utilizando ES1 como anticuerpo primario se realizo utilizando el metodo del complejo avidina-biotina peroxidasa (ABC) con un kit ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.) en sec- ciones de cuatro micras de espesor cortadas de los bloques de parafina.

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La inmunotincion de tejidos humanos utilizando MIB1 (Dako, dilucion 1:100) y TTF1 (Dako, dilucion 1:50), dos anti- cuerpos utilizados ampliamente en la deteccion de carcinoma de pulmon, se llevo a cabo utilizando la tecnica de peroxidasa-antiperoxidasa.

Evaluacion morfologica

La inmunorreactividad de ES1 fue evaluada por dos patologos y se puntuo como una tincion moderada o fuertemen- te positiva cuando habfa un patron de tincion continua de la membrana y/o citoplasmatica, y como debilmente positi- va cuando habfa una tincion discontinua membranosa o citoplasmatica debil. El patron de tincion moderada o fuerte se puntuo adicionalmente como 3 en los casos que mostraban una tincion en mas del 50% de las celulas, como 2 en mas del 10% y como 1 en hasta el 10%. Se revisaron los casos con una puntuacion discrepante.

Se obtuvieron ciento cuarenta y tres espedmenes de resecciones o de biopsias que conteman tumores de pulmon, colon, mama, estomago, pancreas, prostata, endometrio, ovario, tiroides y mesotelio (Tabla 1). Para cada caso, una muestra de tejido tumoral representativo, de 2 mm de diametro, se retiro del bloque de parafina y se volvio a incluir con otras muestras tumorales para producir un bloque de parafina con una micromatriz de tejidos que contema al menos 15 tejidos diferentes. Del tejido normal tambien se tomaron muestras a partir de tejido no tumoral distante del tumor y de tejido pulmonar normal de una autopsia. Los casos de pulmon, colon, mama, estomago, pancreas, vejiga urinaria, vesfcula biliar, esofago y ovario con tejido de la micromatriz que mostraba una inmunorreactividad negativa, debil o focal, se volvieron a presentar para someter a una inmunotincion con ES1, utilizando secciones de tejido de gran tamano.

La Tabla 2 compara los resultados de la inmunotincion del grupo de carcinomas de pulmon de celulas grandes no escamosas con el grupo combinado de carcinomas de colon, mama, urotelial y otros adenocarcinomas secretores de moco. Excluyendo otros tipos de carcinomas que mostraban una inmunorreactividad debil o negativa con ES1, la sensibilidad y la especificidad de la inmunorreactividad con ES1 en los carcinomas pulmonares de celulas grandes no escamosas eran del 97 y 45%, respectivamente. El valor predictivo positivo era del 54%.

Los resultados mostraban que ES1 presentaba una inmunorreactividad de moderada a fuerte con la mayona de los adenocarcinomas de pulmon. Ninguno de los adenocarcinomas de colon mostraba una inmunorreactividad fuerte con ES1; sin embargo, se observo una inmunorreactividad focal de debil a moderada en algunos casos. Los tejidos de pulmon y colon no cancerosos no eran inmunorreactivos.

La reactividad era frecuentemente mas fuerte en la membrana (Figuras 5, 6, 7) que en el citoplasma (Figuras 8). El patron de inmunotincion positiva variaba desde una tincion difusa (Figuras 5, 6) a una tincion focal en porciones de tumor o en celulas individuales (Figuras 7, 8). De 93 casos con inmunorreactividad negativa, debil o focal en las secciones de la micromatriz, habfa once secciones grandes que mostraban una puntuacion de la inmunorreactividad de 1 o 2. La Tabla 1 resume los resultados finales de la inmunotincion de todos los espedmenes.

Treinta y cinco carcinomas de pulmon de celulas grandes no escamosas que inclrnan siete carcinomas bronquioloal- veolares y 22 adenocarcinomas desde bien diferenciados a poco diferenciados, seis carcinomas de celulas grandes indiferenciados mostraron puntuaciones de la inmunorreactividad de 1, 2 y 3 en 7, 17 y 10 tumores respectivamente (Figuras 5 a 8). El carcinoma restante era un carcinoma de celulas grandes no diferenciado con algunas caractensti- cas de diferenciacion escamosa que mostraba una inmunorreactividad negativa. Los tumores con inmunorreactividad focal de moderada a fuerte (menos del 10% de celulas inmunorreactivas), eran tumores no mucinosos bien diferenciados. Dos carcinomas adenoescamosos tambien mostraban puntuaciones de la inmunorreactividad de 1 y 2 en el componente de adenocarcinoma (Figura 9). Cuatro de las cinco hiperplasias atfpicas adenomatosas del pulmon mostraban una inmunorreactividad focal o debil (Figura 10). Todos los carcinomas escamosos puros, tumores carcinoides, parenquima pulmonar normal y reactivo con o sin carcinomas acompanantes, no reaccionaron con el anticuerpo.

En 53 tumores no de pulmon y secretores de moco que inclrnan 15 adenocarcinomas de colon, 8 carcinomas de mama, 4 carcinomas uroteliales y adenocarcinomas de pancreas (seis), estomago (seis) y vesfcula biliar (uno), eso- fago (tres), vejiga urinaria (dos), ovario (tres) y traquea (uno), la inmunorreactividad se puntuo como 1, 2, 3, debil y negativa en 15, 11, 3, 12 y 12, respectivamente (Figuras 11, 12). Los adenocarcinomas del colon formaban el sub- grupo de tumores con mas inmunorreactividad difusa y fuerte. Los adenomas de colon solo mostraban una inmunorreactividad focal o debil.

En 32 tumores no de pulmon y no mucinosos, la inmunorreactividad era negativa o debil. Los tejidos normales pro- cedentes de pulmon, hngado, pancreas, rinon, vejiga urinaria, endometrio, tiroides, esofago y ovario de las zonas circundantes al cancer o de organos que no teman cancer, no eran reactivos para el cancer con excepcion de un caso de tejido de mama (que rodeaba un carcinoma ductal) que mostraba positividad moderada en acinos ocasiona- les.

La inmunotincion con MIB1 realizada en 24 secciones grandes de 24 carcinomas de pulmon de celulas grandes no escamosas con una puntuacion de la inmunorreactividad de 1 o 2, mostraba un aumento notable de la proliferacion de las celulas tumorales en areas con gran cantidad de celulas inmunorreactivas con ES1, en comparacion con las zonas con celulas inmunorreactivas con ES1 negativas, debiles o focales. La inmunotincion con TTF1 se realizo en

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tejido de micromatrices. Todos los tejidos no de pulmon y no de tiroides mostraban una inmunorreactividad nuclear negativa. En 35 carcinomas de pulmon de celulas grandes no escamosas, la inmunorreactividad con TTF1 era nega- tiva en 8 casos, incluyendo 5 carcinomas de celulas grandes no diferenciados, dos adenocarcinomas poco diferen- ciados y un carcinoma bronquioloalveolar mucinoso. Los otros tipos de tejido de la micromatriz no eran inmunorreac- tivos.

En este estudio, la inmunorreactividad con ES1 estaba casi completamente limitada a tumores malignos, en particular adenocarcinomas de pulmon. Habfa una tendencia a que la inmunorreactividad fuera mas fuerte en los tumores de pulmon con un componente mucinoso, ya que los carcinomas no mucinosos bronquioloalveolares mostraban solo una inmunorreactividad focal. La inmunorreactividad con ES1 era positiva en una serie de adenocarcinomas de colon con tincion mas debil y focal que en los adenocarcinomas de pulmon. De interes, la inmunotincion con ES1 siguio teniendo una puntuacion de 2 o 3 en un carcinoma de pulmon de celulas grandes no diferenciado en el sitio primario, asf como en los sitios de metastasis en comparacion con la baja sensibilidad de TTF1 en la inmunotincion del carcinoma de pulmon de celulas grandes no diferenciado (*). Ademas los adenomas de colon solo mostraban una inmunorreactividad focal debil o negativa. El adenocarcinoma mucinoso procedente de otros organos presenta- ba una puntuacion de 2, una inmunorreactividad focal o debil en un numero escaso de casos. Los cambios inmuno- rreactivos identificados en los adenocarcinomas de pulmon en este estudio probablemente se corresponden con una regulacion al alza del antfgeno AFAI. Esta impresion se ve apoyada por el hallazgo de una inmunorreactividad con ES1 positiva en areas de carcinoma de pulmon con una mayor capacidad de proliferacion como se demuestra con la inmunorreactividad con MIB1.

Exposicion no limitante de variaciones y usos de AFAI

El antfgeno AFAI, parece estar regulado al alza en el adenocarcinoma de pulmon, incluso en tumores menos diferenciados. ES1 es probablemente un marcador mas sensible que TTF1 para un adenocarcinoma de pulmon poco diferenciado. Dado que la mayona del tejido normal sometido a ensayo no era inmunorreactivo con ES1, ES1 es adecuado para uso en el desarrollo de una prueba de deteccion para adenocarcinomas de pulmon y una serie de carcinomas de colon y de mama.

En una realizacion de la invencion, se proporciona una secuencia de aminoacidos de AFAI como se muestra en la Figura 1 o una secuencia de aminoacidos que es al menos 90%, 95% o 98% identica a la misma. Los ejemplos de secuencias de aminoacidos variantes de interes se muestran en la Tabla III, en la que los residuos sin cambios se indican mediante un guion. Se apreciara que AFAI se puede mutar en cualquier posicion que no interfiera con la union al antfgeno o la especificidad. Los sitios de interes particular incluyen aquellos para los que se muestran algu- nas mutaciones posibles en la Tabla III. Aunque solo se muestran algunas variantes posibles, se apreciara que to- das las variantes funcionales, incluyendo todas las variantes de AFAI que difieren de SEQ. ID. No. 1 en uno o varios de los cambios de aminoacidos descritos en la Tabla III, estan contempladas espedficamente y estan dentro del alcance de la invencion.

En una realizacion de la invencion, se proporciona una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de secuencia completa con las regiones subrayadas (CDR) de AFAI, tal y como se muestra en la Figura 1 y que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con las porciones restantes de esa secuencia. Tambien se proporcionan secuencias de acidos nucleicos que codifican tales secuencias de aminoacidos.

En una realizacion de la invencion, se proporcionan secuencias de acidos nucleicos que codifican AFAI tal y como se describe en la Figura 1, o una secuencia de aminoacidos que es al menos 90% o 95% identica a las mismas.

En una realizacion de la invencion, se proporciona una secuencia de polipeptido que comprende al menos 90 ami- noacidos que incluyen las tres secuencias siguientes de aminoacidos contiguos: KNLMG, TISGSGGTNYASSVEG y AFAI.

En una realizacion de la invencion, se proporciona el uso de un polipeptido obtenido a partir de AFAI y/o un polipep- tido que tiene al menos un 90% de identidad con SEQ ID NO. 1 como se muestra en la Figura 1A y/o una porcion de la misma, en la formacion de un conjugado mediante el injerto en el polipeptido de un fragmento que se une a antf- geno. En algunos casos, una o varias de las CDRs de AFAI se injertan en un fragmento que se une a antfgeno, incluyendo, por ejemplo, una estructura VHH, VH o VL (armazon) o una inmunoglobulina y/o un fragmento de la misma (por ejemplo, Fab, scFv). Una o varias de las CDRs de AFAI tambien se pueden emplear para producir una protema de fusion en la que la segunda secuencia polipeptfdica proporciona una funcionalidad o propiedad util. En algunos casos puede ser deseable producir variantes humanizadas del anticuerpo AFAI usando metodos conocidos en la tecnica. Tales anticuerpos humanizados se contemplan espedficamente en el presente documento. En algunos casos sera deseable conjugar AFAI o una porcion del mismo con moleculas de autoensamblaje para permitir la formacion de complejos multimericos que tienen propiedades de union a antfgeno mejoradas.

En una realizacion de la invencion, se proporciona un conjugado de un polipeptido que contiene al menos una de las tres secuencias de aminoacidos contiguos y una molecula o moleculas que se van a transportar. La molecula que se va a transportar puede ser util para el diagnostico o el tratamiento de un carcinoma. Por ejemplo, puede ser una enzima o un radioisotopo util en la identificacion y la localizacion de celulas de interes en un tejido o puede ser un

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agente citotoxico tal como un farmaco, un antigeno adicional fuerte, un inductor de la apoptosis o un radioisotopo util en la reduccion de la viabilidad o la capacidad de proliferacion de una celula de carcinoma.

Referencias

1. Aina, O. H., Sroka, T. C., Chen, M. L. & Lam, K. S. (2002). Therapeutic cancer targeting peptides. Biopolymers 66, 184-199.

2. Hoogenboom, H. R., Henderikx, P. & de Haard, H. (1998). Creating and engineering human antibodies for immunotherapy. Adv. Drug Deliv. Rev. 31, 5-31.

3. Zhang, J., Spring, H. & Schwab, M. (2001). Neuroblastoma tumor cell-binding peptides identified through random peptide phage display. Cancer Left. 171, 153-164.

4. Tanha, J., Dubuc, G., Hirama, T., Narang, S. A. & MacKenzie, C. R. (2002). Selection by phage display of llama conventional V(H) fragments with heavy chain antibody V(H)H properties. J. Immunol. Methods 263, 97109.

5. Williams, L. E., Wu, A. M., Yazaki, P. J., Liu, A., Raubitschek, A. A., Shively, J. E. & Wong, J. Y. (2001). Numerical selection of optimal tumor imaging agents with application to engineered antibodies. Cancer Biother. Radiopharm. 16, 25-35.

6. Rader, C., Cheresh, D. A. & Barbas, C. F., Ill (1998). A phage display approach for rapid antibody humanization: designed combinatorial V gene libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 95, 8910-8915.

7. Becerril, B., Poul, M. A. & Marks, J. D. (1999). Toward selection of internalizing antibodies from phage libraries. Biochem. Biophys. Res. Commun. 255, 386-393.

8. Tanha, J., Muruganandam, A. & Stanimirovic, D. (2003). Phage display technology for identifying specific antigens on brain endothelial cells. Methods Mol. Med. 89, 436-449.

9. Gharahdaghi, F., Weinberg, C. R., Meagher, D. A., Imai, B. S. & Mische, S. M. (1999). Mass spectrometric identification of proteins from silver-stained polyacrylamide gel: a method for the removal of silver ions to enhance sensitivity. Electrophoresis 20, 601-605.

10. MacKenzie R y Zhang J (2002), documento PCT/CA02/01829.

11. Conrath KE, Wernery U, Muyldermans S, Nguyen VK. (2003) Emergence and evolution of functional heavy- chain antibodies in Camelidae. Dev Comp Immunol. 27(2):87-103.

12. Riechmann L, Muyldermans S. (1999) Single domain antibodies: comparison of camel VH and camelised human VH domains. J Immunol Methods. 231:25-38.

13. Tanha J, Dubuc G, Hirama T, Narang SA, MacKenzie CR. (2002) Selection by phage display of llama conventional V(H) fragments with heavy chain antibody V(H)H properties. J Immunol Methods. 263:97-109.

14. Conrath K, Lauwereys M, Wyns L, Muyldermans S. (2001) Camel single-domain antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs. J Biol Chem. 276(10):7346-50.

15. Muyldermans S. (2001) Single domain camel antibodies: current status. J Biotechnol. 74(4):277-302.

Tabla 1: 143 lesiones neoplasicas y 103 muestras de tejido no neoplasico diferente

Categonas: n° Inmunorreactividad

+ + +: + + + debil -

A) LESIONES NEOPLASICAS PULMONARES (54 lesiones)

Adenocarcinoma, n°: 22 8 11 3

Carcinoma de celulas no pequenas indiferenciado: 6 2 3 1

Carcinoma bronquioloalveolar: 7 3 4

Carcinoma adenoescamoso: 2 1 1

Carcinoma de celulas escamosas: 5 2 3

Carcinoma de celulas pequenas indiferenciado: 3 3

Hiperplasia adenomatosa atfpica: 6 1 3 2

Tumor carcinoide: 3 3

B) TUMORES SECRETORES DE MOCO NO PULMONARES (53 tumores)

Adenocarcinoma de colon: 15 3 5 3 3 1

Carcinoma ductal de mama: 8 2 3 1 2

Adenocarcinoma pancreatico: 6 2 1 2 1

Adenocarcinoma gastrico: 6 1 2 1 2

Adenocarcinoma de vesfcula biliar: 1 1

Adenocarcinoma esofagico: 3 2 1

Adenocarcinoma de vejiga urinaria: 2 1 1

Adenocarcinoma mucinoso de ovario: 3 1 2

Carcinoma de traquea/adenoide qrnstico: 1 1

Carcinoma urotelial: 4 1 1 2

Adenoma de colon: 4 1 2 1

C) TUMORES NO PULMONARES Y NO MUCINOSOS (32 tumores)

Carcinoma de celulas renales: 4 1 3

Carcinoma hepatocelular: 5 3 2

Carcinoma papilar seroso de ovario: 4 4

Carcinoma papilar de tiroides: 5 1 4

Adenoma pleomorfico salivar: 3 3

Mesotelioma: 5 5

Adenocarcinoma de prostata: 3 3

Carcinoma endometrioide: 2 2

Carcinoma escamoso esofagico: 1 1

D) TEJIDO PULMONAR NORMAL

Tejido circundante a un carcinoma de pulmon: 52 52

Pulmon que no tiene cancer: 4 4

E) OTROS TEJIDOS NORMALES

prostata (3), rinon (4), endometrio (2), ovario (3), tiroides (5) vejiga urinaria (6), esofago (2), mesotelio (5), mucosa del colon (8), pancreas (4) mucosa gastrica (5): 47 1a 46

Clasificacion de la inmunorreactividad: +++: inmunorreactividad de moderada a fuerte en mas del 50% de las celulas tumorales

++: inmunorreactividad de moderada a fuerte en mas del 10% de las celulas tumorales +: inmunorreactividad de moderada a fuerte en hasta un 10% de las celulas tumorales a: positividad focal en algunos acinos normales de mama

Tabla 2: Comparacion entre carcinomas de pulmon no escamosos de celulas grandes y carcinomas no de pulmon

Grupos: Total Inmunorreactividad

Positiva: Debil o negati- va

Carcinomas de pulmon no escamosos de celulas grandes: 35 34 1

Adenocarcioma de otros sitios: 53 29 24

(Adenocarcinoma de colon): (15) (11) (4)

Grupos: Total Inmunorreactividad

Positiva: Debil o negati- va

(Carcinoma de mama, carcinomas uroteliales y adenocarcinomas no coloni- cos secretores de mucosa)*: (38) (18) (20)

*pancreas, estomago, vesfcula biliar, ovario (no seroso), vejiga urinaria y esofago

La sensibilidad de la inmunorreactividad con ES1 en los carcinomas de pulmon no escamosos y no de celulas pequenas era del 97% (34/35)

La especificidad era del 45% (24/53)

Valor predictivo positivo: 54% (34/63)

Tabla III

Parte A SEQ ID 5

DVQLQASGGG XiVQPGGSLRL SCAAHDPIFD KNLMGWX2RQA PGKX3XEX5VAT ISGSGGTNYA SSVEGRFTIS RDNAKKTVYL QMNDLKPEDT AVYYCNSAFA IX6GQGTQVTV SS

en donde Xi es: V, S, D, L, F, W o T; X2 es: G, F, Y, V, I, H o L; X3 es: Q, G, E, D, L, R o K; X4 es: R, C, Q, L, I, P o K; X5 es: Y, T, A, W, F, S o L; X6 es: W, R, E, A, G, V o K.

Parte B

imagen1

Parte C

imagen2

Parte D

EVQUSASGGG WQPGGSliKb SCfUV&DPIFD

imagen3

Parte E

DVQLQASGGG WQPGGSLRI. SCAAHDi’IF’D KNLMGWGRQA EGHQREYVAT ISGSGGTNYA SSVEGKFTIS RDNAKKTVYL QMIJDLKPEDT AVYYCNSAFA IWGQGTQVTV SS SSQ.ID.I ..............................................................................................— ..................-BQ-A--------------------------—--------------------------------------------------------------------------------------E—— -..................

imagen4

Parte F

DVQLQA5GGG WQPQGSIRL SCAAHDPIPD KNLMGWGRQA PGKQREYVAT ISGSCGTOVA SSVEGEFTIS RDNAKKTVYL QMHDLKPBOT AVYYCNSAFA IW0CGTQVTV SS SBQ-ID.l

L-

•V---------------L-Vf-

............................L-W-

-V—- ------W;

-v—------L—•

-V-----------------L-W-

-A-

■A-

Parte G

DVQLQ&SGGG WQPGGSLRL SC&AHDPIFD KNLMGWGRQA PGKQREYVAT ISGS3GTKYA SSVEGEFTIS EEHMOCIVYL QMHDLKPEDT AVYYCNSAFA INGQGTQVTV SS SEQ.ID.l

F-

F

•I----------LX-F-

--------- --'LI-F-

•I-.................-I-F-

-I---------------LI---

-I---------LI-F-

•G-

G-

•G-

Parte H

DVQLQAEGGG WQPGGGLRL SCAAHDPIFD KNLMGWGRQA PGKQREYVAT ISGSGGTNYA SSVEGRETIS RDNAKKTVYL QMNDLKCEElT AVYYCNSAFA XWGQGTQVTV SS SEQ.ID.l

W

w

w-

•H— ---RP-S-

------------------RP-S-

------p-s

-h—- ---r--s

-H----------RP—-

-V-

,v-

-V'

Parte I

DVQLQASCGG WQPGGSLRL SCAAHDPIFD KNLMGWGRQA PGKQREYVAT ISGSGGTNYA SSVEGRFTI5 RDUAKKT7YL QMKDLK7EJJT AVYYCNSAFA 1WGQGTQVTV S3 SEQ.ID.l

T-

•L-’-----KK-L-

-------_-------XK-L-

■L................--K-L-

-L--- ---X--L- -L------ ---XK—

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo de dominio unico aislado (sdAb) caracterizado por una secuencia de una region determinante de la complementariedad (CDR1) KNLMG, una secuencia de CDR2 TiSGSGGTNYASSVEG y una secuencia de CDR3 AFAI y que tiene una secuencia de aminoacidos con al menos 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO. 1

5 como se muestra en la Figura 1A, y al menos 90% de identidad de secuencia de las porciones restantes de SEQ ID

NO. 1 como se muestra en la Figura 1A y en donde el sdAb aislado se une a una lmea celular A549 de carcinoma de pulmon de celulas no pequenas.
2. La secuencia de sdAb segun la reivindicacion 1, que consiste en SEQ ID NO. 1 como se muestra en la Figura 1A.
3. El sdAb segun la reivindicacion 1, en donde la secuencia es SEQ ID NO. 5 como se muestra en la Tabla III.

10 4. Un conjugado que comprende el anticuerpo segun la reivindicacion 1 a 3 y una molecula seleccionada a partir del

grupo que consiste en un radioisotopo, un agente terapeutico o una toxina.
5. Un conjugado que comprende el anticuerpo segun la reivindicacion 1 a 3 y un radioisotopo para uso en el diag- nostico de carcinoma de pulmon en tejido de mairnfero.
6. El anticuerpo segun las reivindicaciones 1 o 2 o el conjugado segun la reivindicacion 4 que comprende el anti-

15 cuerpo segun la reivindicacion 1 o 2 y una molecula seleccionada a partir del grupo que consiste en un radioisotopo,

un agente terapeutico y una toxina para uso en el tratamiento de carcinoma de pulmon.
7. Un kit que comprende:

(a) el conjugado segun la reivindicacion 4; e

(b) instrucciones para llevar a cabo el uso segun la reivindicacion 6.

20 8. Un oligomero que comprende el sdAb segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.
9. El oligomero segun la reivindicacion 8, que es un homopentamero y que comprende SEQ ID NO. 2 como se muestra en la Figura 1C.
10. Un vector de terapia genica que expresa una secuencia de nucleotidos, que codifica el sdAb segun las reivindi- caciones 1 a 3.