CN102292098A - 基于志贺毒素2型蛋白的方法和组合物 - Google Patents

基于志贺毒素2型蛋白的方法和组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN102292098A
CN102292098A CN2010800052595A CN201080005259A CN102292098A CN 102292098 A CN102292098 A CN 102292098A CN 2010800052595 A CN2010800052595 A CN 2010800052595A CN 201080005259 A CN201080005259 A CN 201080005259A CN 102292098 A CN102292098 A CN 102292098A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
stx2
polypeptide
seq
fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2010800052595A
Other languages
English (en)
Inventor
艾利森·奥博莱
安杰拉·迈尔顿-塞尔桑
迈克尔·史密斯
詹姆斯·辛克莱尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henry M Jackson Foundation for Advancedment of Military Medicine Inc
Original Assignee
Henry M Jackson Foundation for Advancedment of Military Medicine Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henry M Jackson Foundation for Advancedment of Military Medicine Inc filed Critical Henry M Jackson Foundation for Advancedment of Military Medicine Inc
Publication of CN102292098A publication Critical patent/CN102292098A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0283—Shigella
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/25—Shigella (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1228—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K16/1232—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia from Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56916—Enterobacteria, e.g. shigella, salmonella, klebsiella, serratia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

本发明是基于11E10抗体在Stx2蛋白中的表位的发现。本发明的特征在于组合物，其含有包含11E10单克隆抗体表位的非全长Stx2多肽。本发明的特征还在于生产抗-Stx2抗体的方法，所述抗-Stx2抗体对Stx2蛋白的11E10表位是特异性的。另外，本发明的特征在于使用包含11E10表位的多肽或使用通过本发明的方法开发出的抗-Stx2抗体治疗具有志贺毒素相关疾病(例如，溶血性尿毒症综合征和与大肠杆菌和痢疾志贺氏菌感染有关的疾病)或处于发展所述疾病风险中的受试者的方法。此外，本发明的特征在于使用通过本发明的方法开发出的抗体对样品中Stx2的检测。

Description

基于志贺毒素2型蛋白的方法和组合物
技术领域
一般而言，本发明涉及治疗和预防志贺毒素(Shiga toxin)相关疾病的领域。
背景技术
在美国，生成志贺毒素(Stx)的大肠杆菌(STEC)每年造成约110,000例感染。肠出血性大肠杆菌(EHEC)(最显著地是血清型O157:H7)是被发现产生Stx介导的疾病的STEC的子集(subset)。生成Stx的生物体的感染的一种可能并发症是溶血性尿毒症综合征(HUS)，其特征在于溶血性贫血、栓塞性血小板减少症和肾衰竭。对于具有HUS的那些人而言，存在大约5-10％病死率，且幸存者可能具有持续的肾损伤。目前，没有FDA批准的用于减轻或预防由Stx-介导的疾病引起的疾病的疗法或疫苗，但是几个在将来有前途的选择包括：结合和中和Stx2的人源化的单克隆抗体，和嵌合的StxA2/StxB1类毒素，其引起中和应答并提供对Stx1或Stx2或Stx1和Stx2的致死攻击(challenge)的保护。
基本上存在Stx的2个主要类型：Stx/Stx1和Stx2。Stx由痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)1型生成，而Stx1和Stx2由大肠杆菌生成。Stx和Stx1基本上相同，仅在A亚基中存在1个氨基酸差异。Stx1和Stx2的成熟的A和B亚基分别具有68％和73％相似性。尽管存在氨基酸序列差异，Stx和Stx2的晶体结构非常类似(图1)。通过多克隆抗血清可以辨别这些毒素：针对Stx1产生的多克隆抗血清不会中和Stx2，反之亦然。存在Stx1和Stx2的变体，包括Stx1c、Stx1d、Stx2c、Stx2d、Stx2d-可活化的(Stx2-act.)、Stx2e和Stx2f。
志贺毒素是具有AB5结构的复杂的全毒素。活性结构域(A)含有将60S核糖体亚基的28S rRNA脱嘌呤化的N-糖苷酶，其终止蛋白合成，并最终导致细胞死亡。A亚基是～32kDa，且被胰蛋白酶(trypsin)或弗林蛋白酶(furin)蛋白水解性地切割成～28kDa A1亚基和～5kDa A2肽，它们通过单个二硫键相连。A1亚基含有活性结构域，且A2肽将该活性结构域非共价地连接到结合(B)结构域上。(B)结构域由5个相同的～7.7kDa单体组成，所述单体形成五聚体，A2肽的C-端贯穿该五聚体。B亚基单体中的每一个具有2个半胱氨酸残基，它们在每个单体内形成二硫键。B五聚体结合真核受体三聚己糖神经酰胺(三己糖基神经酰胺，globotriaosylceramide)(Gb3)(或Gb4，如对于Stx2e的情况)。
尽管已知暴露于这些毒素的结果，目前尚不存在对Stx-介导的疾病的已知治疗或疫苗。抗生素的使用可能通过增加细菌的毒素释放而加重该情况。因而，需要预防或治疗由志贺毒素造成的EHEC感染的并发症的化合物。这样的化合物可以用于治疗受感染的受试者，并减少毒素对中枢神经系统(CNS)、血液和肾的系统性作用。另外，如果可以中和毒素，可以安全地给予抗生素，以杀死胃肠(GI)道中的细菌。由于抗生素通过诱导携带毒素基因的噬菌体而增加毒素生成的可能性，STEC感染的抗生素治疗被禁忌。这样的化合物也可以用于预防感染的并发症，其通过在个体获得EHEC感染之前治疗暴露的或高危的个体而进行。这样的个体将包括日间住院医疗的儿童或在医护疗养所中的老年人，该处已经鉴别出EHEC腹泻的病例。这些个体处于发展EHEC感染的高危中，经常具有严重的并发症，且EHEC在这些环境中的传播并不罕见。
发明内容
单克隆抗体11E10会识别Stx2的A亚基，并中和它的细胞毒性。尽管StxA1和StxA2之间存在68％氨基酸(aa)序列相似性，11E10单克隆抗体不会结合StxA1。我们已经发现，11E10表位包括跨StxA2单体上的3个区域的不连续的或构象的表位。发现3个不同性区域在Stx2A亚基的晶体结构上的位置彼此邻近，所述3个不同性区域包括氨基酸42-49(SEQ IDNO：1)、96-100(SEQ ID NO：2)和244-259(SEQ ID NO：3)。因此，我们已经发现，11E10表位包括以SEQ ID NO：1、2和3示出的序列中的至少1个、2个或所有3个。
因此，本发明的特征在于一种多肽，其包括在SEQ ID NO：1、2和3中所述的氨基酸序列的至少1个、2个或3个，其中所述多肽不是全长Stx2。所述多肽至少包括在SEQ ID NO：1中所述的氨基酸序列。理想地，所述多肽包括在SEQ ID NO：1和2中所述的氨基酸序列，或更理想地，所述多肽包括在SEQ ID NO：1、2和3中所述的氨基酸序列。在一个实施方式中，在SEQ ID NO：1、2和3中所述的序列的一个或多个被插入非-Stx2蛋白支架(protein scaffold)中。在某些实施方式中，所述蛋白支架是与Stx1或其片段基本上相同的蛋白，例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一个实施方式中，所述蛋白支架是Stx1、Stx或携带一个或多个保守点(位点，point)突变的Stx1。在另一个实施方式中，本发明的多肽包括与在SEQ ID NO：8中所述的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述多肽可以包括Stx2的片段，其包括SEQ ID NO：1、2或3；SEQ ID NO：1和2；或SEQ ID NO：1、2和3，例如，Stx2多肽序列的氨基酸29-297、氨基酸1-158或氨基酸29-128，其中所述片段不是全长Stx2。在有些实施方式中，所述片段被插入蛋白支架(例如，Stx或Stx1)中。
本发明的特征还在于一种多肽，其包括与在SEQ ID NO：8中所述的氨基酸序列的片段基本上相同的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述片段包括与SEQ ID NO：8的氨基酸64-122至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，且另外至少包括在SEQ ID NO：1中所述的氨基酸序列。优选地，所述片段另外包含在SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：2和3中所述的(一个或多个)氨基酸序列。所述片段的长度可以是，例如，20、40、59、60、150、200、219、236、250、300或314个氨基酸。在某些实施方式中，所述多肽被类毒素化。所有上述多肽都被包括在术语“本发明的多肽”内。
本发明也包括编码任一种本发明的多肽的核酸分子，包括其中所述核酸被连接到载体中的表达构建体上，且其中该载体被插入宿主细胞中。
在一个有关的方面，本发明的特征在于一种用于使用任一种本发明的多肽刺激针对Stx2的免疫应答的组合物。理想地，所述多肽包括在SEQ IDNO：1和2中所述的序列，或更理想地，所述多肽包括在SEQ ID NO：1、2和3中所述的序列。在这些实施方式的任一个中，所述组合物可以另外包括佐剂(adjuvant)。在某些实施方式中，所述组合物不会刺激针对Stx1的免疫应答。
本发明的特征还在于任一种本发明的多肽(例如，蛋白支架如Stx1，其插入了在SEQ ID NO：1、2或3中的至少1个、2个或所有3个中所述的氨基酸序列)的应用。这样的肽可以用于针对任意志贺毒素有关的疾病进行免疫或治疗，所述疾病包括溶血性尿毒症综合征和与大肠杆菌和痢疾志贺氏菌感染有关的疾病。在一个实施方式中，所述肽与在SEQ ID NO：8中所述的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在另一个方面，本发明的特征在于生产特异性地结合Stx2的11E10表位的抗-Stx2抗体(例如，单克隆和多克隆抗体)或其片段的方法。这样的抗体或片段特异性地结合Stx2，而不结合Stx1。该方法包括，用多肽免疫哺乳动物，所述多肽包括Stx2的片段(即，非全长Stx2)，所述Stx2的片段包括在SEQ IDNO：1、2和3中所述的序列的至少1个、2个或3个，其中该多肽不包括全长Stx2。优选地，所述方法包括，使用这样的多肽，所述多肽至少含有在SEQ ID NO：1中所述的序列，更优选在SEQ ID NO：1和2中所述的序列，甚至更优选在SEQ ID NO：1、2和3中所述的序列。在一个实施方式中，所述肽包括蛋白支架，例如与Stx1基本上相同的蛋白，其插入了在SEQ ID NO：1、2和3中所述的一个或多个氨基酸序列。所述方法可以包括，用含有11E10表位的多肽(例如，如本文所述的)免疫哺乳动物，其中所述多肽不包括全长Stx2。在一个实施方式中，用含有与在SEQ ID NO：8中所述的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽免疫哺乳动物。使用本领域已知的或本文所述的标准方法，可以筛选通过上述方法生产的抗-Stx2抗体，所述方法包括，例如，体外中和试验，以鉴别特异性地结合Stx2且不结合Stx1的抗体。还包括免疫原性多肽和制备该多肽的方法、以及编码该多肽的核酸分子(包括其中该核酸被连接到载体中的表达构建体上，且其中该载体被插入宿主细胞中)，作为本发明的有关方面。
本发明的特征还在于特异性地结合Stx2的11E10表位的抗-Stx2抗体或其片段，其中所述抗体或其片段特异性地结合Stx2且不结合Stx1。优选的本发明的抗体结合这样的表位，其包括在SEQ ID NO：1、2和3中所述的序列的至少1个、2个或所有3个，理想地至少包括SEQ ID NO：1，更理想地至少包括SEQ ID NO：1和2，最理想地含有SEQ ID NO：1、2和3。所述抗体表位可以是构象表位，其中基于蛋白支架的构象，所述氨基酸序列是邻近的，例如，如在本文所述的嵌合蛋白中，其中在SEQ ID NO：1、2和3中所述的Stx2序列的一个或多个被插入与Stx1基本上相同的蛋白支架中。所述抗体可以是IgG、IgM、IgE、IgD、IgA、Fab、Fv、单克隆和多克隆抗体或抗体片段，且可以通过本文所述的方法开发。所述抗体优选地以小于100nM、50nM、10nM、1nM、100pM、10pM或1pM或更小的Kd结合Stx2。在一个实施例中，本发明的抗体抑制11E10抗体与Stx2的结合或与含有11E10表位的嵌合蛋白的结合，包括以100nM至1pM的Kd值进行抑制。本发明的抗体可以抑制Stx2结合真核受体三聚己糖神经酰胺(Gb3)。本发明的抗-Stx2抗体特别地排除下述抗体的任何小鼠、人源化或嵌合形式：11E10、TMA-15、VTM1.1、5C12(包括5C12人单克隆抗体和r5C12)、6G3、5H8、11F11、11G10、2E1、10E10、IG3、2F10、3E9、4H9、5A4、5F3、5C11、1A4、1A5、BC5BB12、DC1、EH5、EA5BA3、ED5DF3、GB6、BA4和cαStx2抗体。本发明另外包括生产任一种本发明的抗体的杂交瘤细胞系。
本发明的另一个方面的特征在于使用任一种本发明的抗-Stx2抗体检测生物样品(例如，组织、细胞、细胞提取物、体液和活组织检查样品)中的Stx2的方法。本发明的检测方法包括、但不限于，ELISA、RIA、蛋白印迹法、免疫沉淀和流式细胞术。本发明包括，基于样品中Stx2的鉴别诊断志贺毒素相关疾病。本发明的特征还在于用于检测志贺毒素相关疾病的免疫检验试剂盒，所述试剂盒包括本发明的抗体，和用于检测所述抗体和样品中存在的Stx2之间的相互作用的装置(means)。
本发明的另一个方面的特征在于使用本文提供的或通过任一种前述方法生产的抗体治疗志贺毒素相关疾病的方法。志贺毒素相关疾病的实例包括溶血性尿毒症综合征(HUS)和与大肠杆菌和痢疾志贺氏菌感染有关的疾病。这些抗体可以与其它治疗联合给予，所述其它治疗包括但不限于特异性地结合其它志贺毒素相关蛋白(例如，Stx1)的抗体。
“11E10表位”是指这样的氨基酸序列，其作为线性结构或三维构象的结果，形成11E10抗体的结合位点。该术语可以包括任意的非全长Stx2蛋白，所述非全长Stx2蛋白包括与在SEQ ID NO：1、2和3中所述的序列的1个、2个或3个(例如，SEQ ID NO：1和2，或SEQ ID NO：1、2和3)相同或基本上相同的序列。在希望的实施方式中，11E10表位包括SEQ IDNO：1和2、或1、2和3。包括11E10表位的蛋白的一个实例是包括与在SEQ ID NO：8中所述的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的蛋白。
术语“特异性地结合Stx2的11E10表位的抗体”或“11E10表位特异性的抗体”是指这样的抗体，其以100nM-1pM的Kd值结合包含11E10表位的蛋白。这样的抗体还被表征为，微弱的或没有可检测的与Stx1蛋白的结合(例如，对于Stx1具有大于100nM、200nM、500nM、1μM、10μM、100μM、1mM或更大的Kd值)。使用本领域已知的任意测定法，包括、但不限于基于表面等离子体共振的测定法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)和竞争测定法(例如RIA’s)，可以测定抗体亲和力。另外，可以对抗体进行本文所述的体外中和测定。使用本文所述的或本领域已知的测定法，特异性地结合11E10表位的抗体可以中和Stx2的细胞毒性效应至少10％、20％、30％、40％、50％、75％或更大。该术语特别地排除了下述抗-Stx2抗体的小鼠、嵌合、人源化或人形式：11E10、TMA-15、VTM1.1、5C12(包括5C12人单克隆抗体和r5C12(Akiyoshi和Tzipori(2005)Infect.Immun.73：4054-4061)、6G3、5H8、11F11、11G10、2E1、10E10(Perera等人(1988)J.Clin.Microbiol.26：2127-2131)、IG3、2F10、3E9、4H9、5A4、5F3、5C11、1A4、1A5(Ma等人(2008)Immunol.Lett.121：110-115(2008))、BC5BB12、DC1EH5、EA5BA3、ED5DF3、GB6、BA4(Downes等人(1988)Infect.Immun.56：1926-1933)、cαStx2抗体、在Smith等人((2006)Vaccine24：4122-4129)中所述的抗体、在Donohue-Rolfe等人((1999)Infect Immun.67：3645-364)中所述的抗体和在Sheoran等人((2003)Infect Immun.71：3125-3130)中所述的抗体。
“抑制结合”是指，使一种蛋白与另一种蛋白的结合减少了至少50％，优选60％、70％、80％、90％或更多，这通过例如本文所述的蛋白印迹法或通过ELISA或本领域已知的Gb3受体结合测定法来测得。
术语“抗体”以最广泛的含义使用，包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或抗体片段，只要这样的分子具有所需的生物活性(例如，中和本文所述的Stx2毒素)。
本文使用的“纯化的”或“分离的”表示已经从它的天然环境的组分中鉴别出来和分离和/或回收的蛋白。它的天然环境的污染物组分是通常干扰所述蛋白的诊断或治疗用途的物质，且可以包括酶、激素和其它蛋白性的(proteinaceous)或非蛋白性的(non-proteinaceous)溶质。
“类毒素化”是指，例如通过突变、结合(缀合，conjugation)或交联，以减少细胞毒性且维持抗原性的方式改变。Stx2的类毒素化形式包括甲醛-和戊二醛-处理过的Stx2和具有Y77S突变的Stx2。类毒素化的Stx蛋白的其它非限制性实例是携带Y77S和E167Q突变的Stx2(Wen等人(2006)Vaccine 24：1142-1148)、携带E167D和6组氨酸标签的Stx2(Robinson等人(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 103：9667-9672)、携带Y77S、E167Q和R170L突变的StxA2/StxB1类毒素(Smith等人，Vaccine 24：4122-4129(2006))。其它实例描述在Gordon等人((1992)Infect.Immunol.60(2)：485-490)中。
“非全长Stx2”是指这样的蛋白，其含有全长Stx2多肽的小于90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％或更少的氨基酸。非全长Stx2的实例包括、但不限于，在SEQ ID NO：4-8中所述的氨基酸序列。其它实例包括这样的多肽，其包含Stx2的氨基酸29-297、1-158或29-128或由它们组成，包括，例如在图1A中提供的嵌合多肽。野生型Stx1、Stx2或在本申请内描述的嵌合毒素的A亚基都具有22个氨基酸的前导序列，其被去除，从而产生成熟A亚基蛋白。
为了本说明书的目的，术语“全长Stx2”和Stx2片段的氨基酸编号表示全长成熟的StxA2亚基。该成熟A亚基以后被胰蛋白酶或弗林蛋白酶不对称地切割成A1片段(N-端～248个氨基酸)和A2肽(C-端～50个氨基酸)。A亚基(天然的或嵌合的形式)通常存在于全毒素的背景下；但是，在单独表达时(例如，没有B亚基)，A亚基或其片段可以引起针对11E10表位的免疫应答。
本文使用的术语“蛋白支架”或“支架”表示这样的蛋白结构，其已经插入了异源蛋白的一个或多个氨基酸序列，例如，在SEQ ID NO：1、2或3中所述的Stx2氨基酸序列。优选地，蛋白支架的三维结构是已知的，且异源蛋白的片段被插入在关键位置，例如，在表面暴露的环处，或在蛋白支架和异源蛋白之间的结构同源性区域。Stx2的片段的插入，可以伴随着选择性地删除蛋白支架的某些序列，例如，与要被插入的序列具有结构同源性的序列。在该实例中，蛋白支架的未删除的序列可以用于确定与另一种蛋白(例如，Stx1)的序列同一性百分比。已经用作蛋白支架的示例性的蛋白是Stx或Stx1(本文所述)、绿色荧光蛋白(Abedi等人(1998)Nucleic Acids Res.26：623-630)、和细胞毒性T淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA-4)(Hufton等人(2000)FEBS lett.475：225-231)。蛋白支架特别地排除异源蛋白序列与其末端融合的蛋白标签，例如，FLAG表位或谷胱甘肽-S-转移酶。
“基本上相同的”是指，当最佳地比对(例如使用下述的方法)时，与第二核酸或氨基酸序列(例如，Stx2、Stx1或嵌合蛋白，诸如在SEQ ID NO：8中所述的序列)具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸或氨基酸序列。“基本同一性”可以用于表示不同类型和长度的序列，诸如全长序列、表位或免疫原性肽、功能结构域、编码和/或调节序列、外显子、内含子、启动子和基因组序列。以不同的方式测定2个多肽或核酸序列之间的同一性百分比，所述方式属于本领域的常识，例如，使用可公开得到的计算机软件，诸如Smith Waterman比对(Smith，T.F.和M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147：195-7)；“最佳拟合”(Smith和Waterman(1981)Advances inApplied Mathematics，482-489)，其整合进GeneMatcher PlusTM中(Schwarz和Dayhof(1979)Atlas of Protein Sequence and Structure，Dayhoff，M.O.编，第353-358页)；BLAST程序(基础的局部比对搜索工具(Altschul，S.F.，W.Gish，等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10)、BLAST-2、BLAST-P、BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、CLUSTAL或Megalign(DNASTAR)软件。另外，本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在要对比的序列长度上实现最大比对所需的任意算法。一般而言，对于蛋白，对比序列的长度可以是至少5个氨基酸，优选10、25、50、100、150、200、300或315个氨基酸或更多达到蛋白的整个长度。对于核酸，对比序列的长度通常可以是至少15、75、150、300、450、600、900或945个核苷酸或更多达到核酸分子的整个长度。应当理解，对于测定序列同一性的目的，当对比DNA序列和RNA序列时，胸腺嘧啶核苷酸等同于尿嘧啶核苷酸。在一个实施方式中，可以在SEQ ID NO：8的片段(例如，SEQ ID NO：8的氨基酸64-122或64-282)长度上，测量蛋白(例如，志贺毒素蛋白的成熟A亚基)的序列同一性。对于氨基酸序列，保守替换(替代、置换，substitutions)通常包括在下述组内的替换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。
“片段”是指多肽或核酸分子的一部分，其含有参照核酸分子或多肽的整个长度的小于100％，优选至少2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％。片段可以含有，例如，10、15、75、150、300、450、600、900或945或更多个核苷酸，或4、5、10、25、50、100、150、200、300、315个氨基酸或更多。志贺毒素1型或志贺毒素2型蛋白的片段可以包括小于全长蛋白的任意部分，例如，长度为4、5、8、10、25、50、100、150、200、300、315、或更多个氨基酸的片段。在一个实施例中，片段包括SEQ ID NO：8的氨基酸64-122或64-282。
“志贺毒素相关疾病”是指由表达志贺毒素的病原体导致的任意疾病。术语“志贺毒素相关疾病”意在包括溶血性尿毒症综合征、志贺细菌性痢疾(shigellosis)、和由生成志贺毒素的大肠杆菌和痢疾志贺氏菌感染导致的疾病。
附图说明
图1A示出了最初的杂种(杂交，hybrid)Stx1/Stx2A亚基。Stx1以黑色显示，Stx2以白色描绘。在各个嵌合蛋白的左侧显示了嵌合毒素的名称，在嵌合的A亚基的下面列出了Stx2的区域。
图1B显示了用兔抗-Stx1和抗-Stx2多克隆(上图)或单克隆11E10(下图)探测(作为探针检测，probe)的Stx1、Stx2和最初的嵌合毒素的蛋白印迹分析。泳道1和2分别含有25ng纯化的Stx1或Stx2。泳道3-8含有下述嵌合毒素：泳道3，Stx1(2A29-297)；泳道4，Stx1(2A1-158)；泳道5，Stx1(2A29-128)；泳道6，Stx1(2A29-76)；泳道7，Stx1(2A42-76)；泳道8，Stx 1(2A42-49)。
图1C显示了11E10单克隆抗体对最初的嵌合毒素的中和百分比。将中和数据标准化，使得全长Stx2的％中和设定为100％(实际的％中和＝65％)，并以标准化的全长Stx2中和的百分比，给出其它毒素的中和水平。误差棒代表标准化的值的标准误差。
图2A显示了StxA1和StxA2在包含11E10单克隆抗体表位的3个区域中的氨基酸比对。黑色和灰色氨基酸分别描绘了保守的和非保守的氨基酸；点代表相同的残基。11E10单克隆抗体表位的3个区域如下：区域A(StxA2残基42-49)、区域B(StxA2残基96-100)、区域C(StxA2残基244-259)。在比对中显示的氨基酸的编号是相对于StxA1成熟蛋白。StxA1具有在位置185处的额外氨基酸；该添加造成区域C(在StxA2中的表位)成为与Stx1的对应区域不同的一个编号。
图2B显示了Stx2晶体结构的条带图，它用浅灰色显示了Stx2A1和B亚基，11E10单克隆抗体表位的3个区域除外。区域A(绿色)、B(蓝色)和C(青色)分别用黑色、灰色和白色的箭头标记。用黑色描绘A2肽，且用星号标记活性部位(红色)。
图2C显示了Stx2晶体结构的填空表示(spacefill representation)。用箭头指示区域A、B和C。
图3A示出了含有嵌合的A亚基的第二代嵌合毒素。Stx1以黑色显示，而Stx2以白色描绘。在各个嵌合蛋白的左侧显示了嵌合毒素的名称，在嵌合的A亚基的下面列出了Stx2的区域。区域A、B和C分别表示StxA2的氨基酸42-49(SEQ ID NO：1)、96-100(SEQ ID NO：2)、244-259(SEQ IDNO：3)。
图3B描述了用兔抗-Stx1(上图)或11E10单克隆抗体(下图)探测的Stx1、Stx2和5个第二代嵌合毒素的蛋白印迹分析。泳道1含有25ng纯化的Stx2。泳道2-6含有下述嵌合毒素：泳道2，Stx1+A；泳道3，Stx1+AB；泳道4，Stx1+AC；泳道5，Stx1+BC；泳道6，Stx1+ABC。
图3C显示了11E10单克隆抗体对第二代杂种毒素的中和。将Stx2中和的水平标准化为100％，如在图1C中所示。误差棒代表标准化的值的标准误差。
图4A显示了使用11E10单克隆抗体对Stx2和Stx2变体的蛋白印迹分析。泳道1含有25ng纯化的Stx2。泳道2-5含有下述毒素：泳道2，Stx2c；泳道3，Stx2d；泳道4，Stx2dact；泳道5，Stx2e。用兔抗-Stx2多克隆抗体(上图)或单克隆抗体11E10(下图)探测蛋白印迹。
图4B描述了11E10对Stx2变体的中和百分比。将Stx2中和的水平标准化为100％，如在图1C中所示。误差棒代表标准化的值的标准误差。
图5描述了通过兔网织红细胞裂解物中萤光素酶mRNA的翻译测得的蛋白合成抑制。将纯化的Stx2的0.2ng等分试样与0、0.2或2ng 11E10相混合，并加入网织红细胞裂解物中。通过萤光素酶mRNA的翻译的减少，指示蛋白合成抑制，并在向萤光素底物加入毒素-处理过的裂解物以后，通过生物发光测量。将2ng同种型-匹配的(isotype-matched)无关的抗体13C4样品与2ng Stx2相混合，作为阴性对照。误差棒代表从平均比标准误差计算出的95％置信区间。从双尾Student氏t-检验衍生出的概率值指示含有和没有抗体的样品之间的生物发光信号的显著差异(p＜0.005)。
图6A-6J证实，单克隆抗体11E10会改变Vero细胞中的Stx2的总细胞分布。将Stx2与PBS(A、H-J)或11E10(B、C和E-G)相混合，然后加给Vero细胞6h。作为对照，在没有Stx2存在下，将11E10加给Vero细胞(D)。用针对Stx2的多克隆抗体、然后用AlexaFluor 488结合的第二抗体检测毒素(A和B)，而用AlexaFluor 488结合的抗-小鼠IgG检测11E10(C和D)。通过中毒的细胞的双重标记，评估Stx2与初级内体(内涵体，endosome)标志物EEA1的共区域化。用抗-Stx2单克隆11F11和绿色荧光第二抗体，使在有(图E)和没有(图H)抗体11E10存在下的Stx2分布显现出来(可视化，visualize)。用山羊抗-EEA1和红色荧光第二抗体，使内体标志物EEA1的分布显现出来(图F和I)。使这些染色图案重叠(图G和J)，并用黄-橙染色(用箭头指示)，指示毒素与内体的共区域化。
图7A-7D显示了Stx2区域A(SEQ ID NO：1)(图7A)、Stx2区域B(SEQ ID NO：2)(图7B)、Stx2区域C(SEQ ID NO：3)(图7C)和Stx2e区域B(SEQ ID NO：19)(图7D)的氨基酸序列。
图8A显示了Stx1+A嵌合体的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。加工过的前导序列标有下划线，Stx2A区域是粗体且标有下划线。未加工的蛋白的长度是315个氨基酸；成熟蛋白的长度是293个氨基酸。
图8B显示了Stx1+AB嵌合体的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。加工过的前导序列标有下划线，Stx2A和B区域是粗体且标有下划线。未加工的蛋白的长度是315个氨基酸；成熟蛋白的长度是293个氨基酸。
图8C显示了Stx1+AC嵌合体的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。加工过的前导序列标有下划线，Stx2A和C区域是粗体且标有下划线。未加工的蛋白的长度是315个氨基酸；成熟蛋白的长度是293个氨基酸。
图8D显示了Stx1+BC嵌合体的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。加工过的前导序列标有下划线，Stx2B和C区域是粗体且标有下划线。未加工的蛋白的长度是315个氨基酸；成熟蛋白的长度是293个氨基酸。
图8E显示了Stx1+ABC嵌合体的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。加工过的前导序列标有下划线，Stx2A、B和C区域是粗体且标有下划线。未加工的蛋白的长度是315个氨基酸；成熟蛋白的长度是293个氨基酸。
图9A显示了Stx1操纵子的DNA序列(SEQ ID NO：9)，其从StxA1起始密码子处开始，并在StxB1终止密码子处结束。
图9B显示了StxA1的DNA序列(SEQ ID NO：10)，其从StxA1起始密码子处开始，并在StxA1终止密码子处结束。
图9C显示了StxB1的DNA序列(SEQ ID NO：11)，其从StxB1起始密码子处开始，并在StxB1终止密码子处结束。
图10A显示了StxA1的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。加工过的前导序列标有下划线。未加工的蛋白的长度是315个氨基酸；成熟蛋白的长度是293个氨基酸。
图10B显示了StxB1的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)。加工过的前导序列标有下划线。未加工的蛋白的长度是89个氨基酸；成熟蛋白的长度是69个氨基酸。
图11A显示了Stx2操纵子的DNA序列(SEQ ID NO：14)，其从StxA2起始密码子处开始，并在StxB2终止密码子处结束。
图11B显示了StxA2的DNA序列(SEQ ID NO：15)，其从StxA2起始密码子处开始，并在StxA2终止密码子处结束。
图11C显示了StxB2的DNA序列(SEQ ID NO：16)，其从StxB2起始密码子处开始，并在StxB2终止密码子处结束。
图12A显示了StxA2的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)。加工过的前导序列标有下划线。未加工的蛋白的长度是319个氨基酸；成熟蛋白的长度是297个氨基酸。
图12B显示了StxB2的氨基酸序列(SEQ ID NO：18)。加工过的前导序列标有下划线。未加工的蛋白的长度是89个氨基酸；成熟蛋白的长度是70个氨基酸。
具体实施方式
一般而言，本发明的特征在于与Stx2蛋白的11E10表位的发现有关的组合物和方法。我们已经发现，11E10表位包括在SEQ ID NO：1、2和3中所述的序列的至少1个、2个或3个。本发明的组合物和方法可以用于检测、治疗或预防志贺毒素相关疾病。例如，用含有11E10表位的肽或用特异性地结合Stx2蛋白的11E10表位的抗体，可以治疗具有志贺毒素相关疾病(例如，溶血性尿毒症综合征和与大肠杆菌和痢疾志贺氏菌感染有关的疾病)或处于发展所述疾病的风险中的受试者(主体、对象，subject)。
I.适应症
志贺毒素相关疾病包括由生成志贺毒素的痢疾志贺氏菌或肠出血性(enterohemorrhagic)大肠杆菌(EHEC)(最特别地，血清型O157:H7)的感染导致的那些疾病。这些感染经常导致溶血性尿毒症综合征(HUS)，其特征在于溶血性贫血、栓塞性血小板减少症和肾衰竭。
本发明的化合物和方法可以用于治疗具有志贺毒素相关疾病或处于发展所述疾病的风险中的受试者。这样的受试者包括日间住院医疗的(inday care)儿童或在医护疗养所中的老年人。在一个实施例中，所述受试者是在日间住院医疗中或在医护疗养所中，该处已经检测出EHEC腹泻的病例。在该实施例中，所述受试者可能已经或没有发展所述疾病。本发明的方法和组合物可以用于治疗受EHEC感染的个体中的感染、检测其它受感染的个体、和预防EHEC在日间住院医疗或医护疗养所中的传播。
II.抗体
本发明包括特异性地结合志贺毒素2型(Stx2)蛋白的11E10表位的抗体的生产和抗体本身。理想地，这样的抗体不会可检测地结合Stx1。抗体的识别和特异性地结合靶蛋白的独特能力，提供了用于诊断和治疗与生成志贺毒素的大肠杆菌(STEC)有关的疾病的方案。本发明提供了抗体的生产，所述抗体包括、但不限于，多克隆和单克隆抗体、抗-独特型(anti-idiotypic)抗体、鼠和其它哺乳动物抗体、抗体片段、双特异性抗体、抗体二聚体或四聚体、单链抗体(例如，scFv′s和结合抗原的抗体片段诸如Fab、双抗体和Fab′片段)、基于抗体结合区的重组结合区、嵌合抗体、灵长类动物化的抗体、人源化抗体和全人抗体、结构域删除(缺失，deleted)的抗体、和用可检测的标志物标记或用毒素或放射性核素偶联的抗体。这样的抗体通过本领域已知的常规方法生产。在一个方面，本发明包括特异性地结合Stx2的11E10表位的单克隆抗体或抗体片段的制备，其中所述制备包括，使用多肽，所述多肽含有选自在SEQ ID NO：1、2或3中所述的序列的至少1个、2个或3个序列。一个实例是在SEQ ID NO：8中所述的蛋白。
多克隆抗体
通过如下免疫兔或其它动物，可以制备多克隆抗体：注射抗原，随后以适当的间隔进行强化。给动物抽血，并通常通过ELISA，针对纯化的蛋白测定血清。
通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射抗原和佐剂，可以在动物体内产生特异性地结合11E10表位的多克隆抗体。使用双功能试剂或衍生剂(例如，马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基结合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基结合)、戊二醛或琥珀酸酐)，将含有11E10表位的肽结合到在被免疫的物种中呈免疫原性的蛋白上(例如，钥孔嘁血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制剂)，这是有用的。
例如，可以针对11E10表位，用免疫原性结合物或衍生物免疫动物，其通过下述进行：将1μg至1mg所述肽或结合物(分别对于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant)混合，并将此溶液在多个位点皮内注射。一个月后，通过在多个位点皮下注射，用占原始量1/5至1/10的在弗氏完全佐剂中的肽或结合物强化(boost)动物。7-14天后，抽取动物血样，并测定血清的针对抗原或其片段的抗体效价。强化动物，直至效价平稳。优选地，用相同多肽的结合物强化动物，但是所述结合物结合不同的蛋白和/或通过不同交联剂结合。还可在重组细胞培养物中制备结合物，作为蛋白融合物。还适当地使用明矾等凝聚剂来增强免疫应答。
可以在人免疫球蛋白基因的转基因动物中，或通过从原料(起始材料，starting material)受试者分离2种或更多种Stx2反应性的B-淋巴细胞，生产嵌合的、人源化的或全人多克隆抗体。
也可以纯化和选择多克隆抗体(例如，对于构象限制的抗原肽，通过亲和力)，在必要时重复，以提供单克隆抗体。可替换地或附加地，可以采用从淋巴细胞克隆出编码单个抗体的核酸。
单克隆抗体
在本发明的另一个实施方式中，从基本上同源的抗体的群体(即除了可能存在少量天然产生的突变以外，构成(including)群体的单独抗体是相同的)，得到单克隆抗体。因此，术语“单克隆”指示抗体的特征不是离散抗体(discrete antibodies)的混合物。
通过本领域已知的方法可以制备单克隆抗体，所述方法例如Kohler和Milstein的杂交瘤方法，其通过使来自免疫的小鼠的脾细胞与连续复制的肿瘤细胞(诸如骨髓瘤或淋巴瘤细胞)融合而进行(Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495-497；Gulfre和Milstein(1981)Methods inEnzymology：Immunochemical Techniques 73：1-46，Langone和Banatis编，Academic Press)。然后通过有限稀释方法，克隆杂交瘤细胞，并通过ELISA、RIA或生物测定，测定上清液的抗体生产。在另一个实施方式中，可以通过重组DNA方法制备单克隆抗体。
为了制备特异性地结合11E10表位的单克隆抗体(Mab)，可以使用由培养的连续细胞系生产抗体分子的任意技术。例如，由上面的Kohler和Milstein((1975)最初开发的、以及在Kohler和Milstein(1976)Eur J Immunol.6：511-519；Kohler等人(1976)Eur J Immunol.6：292-295；Hammerling等人(1981)见：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，第563-681页)中的杂交瘤技术，和三源杂交瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等人(1983)Immunol Today 4：72-79)，和用于生产人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等人(1985)见：Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页)。这样的抗体可以属于任意的免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和它们的任意子类。可以在体外或在体内培养在本发明中生产Mab的杂交瘤。在本发明的另一个实施方式中，使用本领域已知的技术，可以在无菌动物中生产单克隆抗体。
一般而言，用包括11E10表位的多肽免疫小鼠或其它合适的宿主动物(如仓鼠)，以诱导淋巴细胞，该淋巴细胞生产或能生产可特异性地结合用于免疫的抗原或其片段的抗体。可替换地，在体外免疫淋巴细胞。
取出免疫的宿主动物(例如，小鼠)的脾细胞，并使用合适的融合剂(如聚乙二醇)，使所述脾细胞与合适的细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)融合，以形成杂交瘤细胞(Goding(1986)Monoclonal Antibodies：Principles andPractice，第59-103页，Academic Press)。根据本发明，可以使用任意合适的骨髓瘤细胞系；但是，优选的骨髓瘤细胞是有效地融合、支持选择的抗体生产细胞的稳定的高水平抗体生产、且对培养基(诸如HAT培养基)敏感的那些。在它们中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如来源于可从Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.USA得到的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，和可从美国典型培养物保藏中心，Rockville，Md.USA得到的SP-2细胞。
可以在合适的培养基中，接种和培养如此制备的杂交瘤细胞，所述培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。然后可以测定通过这样的选择和/或培养基(在其中维持杂交瘤细胞)得到的杂交瘤细胞，以鉴别特异性地结合11E10表位的单克隆抗体的生产。优选地，通过免疫沉淀或通过体外结合试验诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)或使用Biacore仪器，测定由杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性。通过例如Munson和Rodbard((1980)AnalBiochem.107：220-239)的Scatchard分析，可以测定单克隆抗体的结合亲和力。
鉴别出生产具有所需的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，通过有限稀释过程，可以亚克隆所述克隆，并通过标准方法培养(Goding，同上)。此外，所述杂交瘤细胞可作为动物的腹水瘤(ascitestumors)在体内生长。通过常规的免疫球蛋白纯化方法，例如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法，可以使由亚克隆分泌的单克隆抗体适当地从培养基、腹水液或血清中分离出来。
使用常规方法(例如，使用能够特异性地结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，可以容易地分离并测序编码本发明的单克隆抗体的DNA。本发明的杂交瘤细胞用作这类DNA的优选来源。分离后，可以将所述DNA置于表达载体中，然后转染进宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞、COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中合成单克隆抗体(参见例如，Skerra等人(1993)Curr Opin Immunol.5：256-262和Pluckthun(1992)Immunol Rev.130：151-188)。
还可以修饰DNA，例如通过使人重链和轻链恒定结构域的编码序列的全部或一部分代替同源的鼠序列(Morrison等人(1984)Proc Natl AcadSci.U.S.A.81：6851-6855)，或通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或一部分共价地连接到免疫球蛋白编码序列上。以此方式，制备嵌合或杂种抗体，它们具有抗-11E10表位单克隆抗体的结合特异性。通常，这种非免疫球蛋白多肽代替本发明抗体的恒定结构域，或者它们代替本发明抗体的抗原结合位点的可变结构域，以产生嵌合的二价抗体，所述嵌合的二价抗体包括一个具有对根据本发明的11E10表位的特异性的抗原结合位点和另一个具有对不同抗原的特异性的抗原结合位点。
修饰的抗体
本发明的修饰的抗体包括、但不限于：嵌合的单克隆抗体(例如，人-小鼠嵌合体)、人单克隆抗体和人源化的单克隆抗体。嵌合抗体是这样的分子，其中不同的部分源自不同的动物物种，诸如具有人免疫球蛋白恒定区和源自鼠mAb的可变区的那些(参见，例如，美国专利号4,816,567和4,816,397)。非人(例如，鼠)抗体的人源化形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合子序列)，所述免疫球蛋白链或其片段含有源自非人免疫球蛋白的最小序列，诸如一个或多个来自非人物种的互补性决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区(参见，例如，美国专利号5,585,089)。
人源化的抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体(recipient)的互补性决定区(CDR)的残基被具有所需的特异性、亲和力和能力的来自非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基替代。在有些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被对应的非人残基替代。人源化的抗体还可以包括在受体抗体中和在输入的CDR或框架序列中都不存在的残基。一般而言，人源化的抗体包括基本上所有的至少一个、通常2个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区域与非人免疫球蛋白的CDR区域相对应，且所有或基本上所有的FR区域是人免疫球蛋白共有序列的FR区域。人源化的抗体还最适宜地至少包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分，通常是人免疫球蛋白的一部分。
通过本领域已知的重组DNA技术，例如使用在下述文献中所述的方法，可以生产嵌合的和人源化的单克隆抗体：WO 87/02671；EP 184，187；EP171，496；EP 173，494；WO 86/01533；US 4,816,567；EP 125，023；Better等人(1988)Science 240：1041-1043；Liu等人((1987)Proc Natl Acad Sci.U.S.A.84：3439-3443)；Liu等人((1987)J Immunol.139：3521-3526)；Sun等人((1987)Proc Natl Acad Sci.U.S.A.84：214-218)；Nishimura等人((1987)Cancer Res.47：999-1005)；Wood等人((1985)Nature 314：446-449)；Shaw等人((1988)J Natl Cancer Inst.80：1553-1559)；Morrison((1985)Science 229：1202-1207)；Oi等人((1986)Biotechniques.4：214)；US5,225,539；Jones等人((1986)Nature 321：552-525)；Verhoeyan等人((1988)Science 239：1534)；和Beidler等人((1988)J Immunol.141：4053-4060)。关于人源化的抗体和与其有关的方法的进一步讨论，参见下面。
Newman((1992)Biotechnology.10：1455-1460)公开了另一种生产重组抗体的非常有效的方法。也参见美国专利号5,756,096；5,750,105；5,693,780；5,681,722；和5,658,570。
将非人抗体人源化的方法是本领域众所周知的。人源化可以基本上按照如上所述的Winter和同事的方法(包括Jones等人0((1986)Nature 321：522-525)；Riechmann等人((1988)Nature 332：323-327)；Verhoeyen等人((1988)Science 239：1534-1536)来完成，其通过用啮齿动物CDR或CDR序列代替人抗体的相应序列进行。因此，这种人源化的抗体是嵌合抗体(参见美国专利号4,816,567和6,331,415)。在实践中，人源化的抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和一些可能的FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基替代。
要用于制备人源化的抗体的人可变结构域(轻链和重链)的选择，对于减少抗原性而言是非常重要的。根据所谓的最佳拟合方法，针对已知人可变结构域序列的整个文库，筛选啮齿动物抗体的可变结构域序列。然后接受与啮齿动物的序列最接近的人序列，作为人源化的抗体的人框架(FR)(Sims等人(1993)J Immunol.151：2296-2308；Chothia和Lesk(1987)JMolBiol.196：901-917)。另一种方法使用源自轻链或重链的特定子集(subgroup)的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可以用于几种不同的人源化的抗体(Carter等人(1992)Proc Natl Acad Sci.U.S.A.89：4285-4289；Presta等人(1993)J Immunol.151：2623-2632)。
还希望，被人源化的抗体保留对抗原(即，Stx2的11E10表位)的高亲和力和其它有利的生物特性。为实现这一目的，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型，分析亲本序列和不同概念的人源化产物，来制备人源化的抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且是本领域技术人员熟知的。可获得例证并展示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些展示(显示，displays)，可以分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析这些残基影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力。以此方式，可以选择FR残基，并与共有和输入(import)序列结合，从而得到所需的抗体特征，诸如增加的对(一种或多种)靶抗原的亲和力。一般而言，CDR残基直接地并最显著地参与影响抗原的结合。
全人抗体可用于人受试者的治疗性处理。例如，使用不能表达内源免疫球蛋白重链和轻链基因、但是可以表达人重链和轻链基因的转基因小鼠，可以生产这样的抗体。可以以常见方式，用选择的抗原(例如，包括11E10表位的多肽)免疫转基因小鼠。例如，参见PCT公开号WO 94/02602，WO 00/76310；美国专利号5,545,806；5,545,807；5,569,825；6,150,584；6,512,097；和6,657,103；Jakobovits等人((1993)Proc Natl Acad Sci.U.S.A.90：2551)；Jakobovits等人((1993)Nature 362：255-258)；Bruggemann等人((1993)Year in Immunol.7：33-40)；Mendez等人((1997)Nat Gene.15：146-156)和Green和Jakobovits((1998)J Exp Med.188：483-495)。
通过杂交瘤方法，也可以制备人单克隆抗体。用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系已经描述在：例如，Kozbor((1984)J Immunol.133：3001-3005)；Brodeur等人((1987)Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，第51-63页，Marcel Dekker，Inc.，New York)；和Boerner等人((1991)J Immunol.147：86-95)。
使用称作导向选择(定向选择，guided selection)的技术，也可以产生识别选择的表位的全人抗体。在该方案中，使用选择的非人单克隆抗体(例如小鼠抗体)来引导识别相同表位的全人抗体的选择(Jespers等人(1994)Biotechnology.12：899-903)。
可以用于生产单链Fv和抗体的技术的实例包括在下述文献中描述的那些：美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等人((1991)MethEnzymol.203：46-88)；Shu等人((1993)Proc Natl Acad Sci.U.S.A.90：7995-7999)；和Skerra等人((1988)Science 240：1038-1040)。
可替换地，采用噬菌体展示技术(McCafferty等人(1990)Nature 348：552-553)，可以在体外从未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因所有组分(repertoires)生产人抗体和抗体片段。噬菌体展示可用多种形式进行。参见，例如，Johnson和Chiswell((1993)Curr Opin Struct Biol.3：564-571)。V-基因片段的几种来源可用于噬菌体展示。Clackson等人((1991)Nature 352：624-628)从源自免疫小鼠脾脏的小的V基因随机组合文库分离了多种抗噁唑酮抗体阵列(array)。基本上按照Marks等人((1991)JMol Biol.222：581-597)或Griffith等人((1993)EMBO J.12：725-734)所述的技术，可以构建未免疫人供体的V基因的所有组分，并分离抗各种抗原阵列(包括自身抗原)的抗体。
本发明提供了免疫球蛋白分子的功能活性片段、衍生物或类似物，所述免疫球蛋白分子特异性地结合包含11E10表位的蛋白。在该背景下，功能活性是指，所述片段、衍生物或类似物能诱导抗-抗-独特型抗体(即第三抗体)，其识别被所述片段、衍生物或类似物的来源抗体所识别的相同抗原。具体地，在一个优选的实施方式中，通过删除框架和CDR序列(它们是在特异性地识别抗原的CDR序列的C-端)，可以增强免疫球蛋白分子的独特型的抗原性。为了确定哪个CDR序列结合抗原，通过本领域已知的任意结合试验方法，可以在结合试验中与抗原一起使用含有CDR序列的合成肽。
本发明提供了抗体片段，例如，但不限于、F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab和scFv。通过已知的技术，例如通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶-介导的切割，可以产生识别特定表位的抗体片段。
本发明也提供了本发明的抗体的重链和轻链二聚体或其任意最小片段，诸如Fvs或单链抗体(SCA)(例如，描述在美国专利号4,946,778；Bird((1988)Science 242：423-42)；Huston等人((1988)Proc Natl Acad Sci.U.S.A.85：5879-5883)；和Ward等人((1989)Nature 334：544-54)或具有与本发明抗体相同特异性的任意其它分子。通过经氨基酸桥连接Fv区域的重链和轻链片段，形成单链抗体，产生单链多肽。可以使用在大肠杆菌中装配功能性Fv片段的技术(Skerra等人(1988)Science 242：1038-1041)。
可替换地，通过筛选Fab表达文库(例如，描述在Huse等人((1989)Science 246：1275-1281))中结合特异性抗原的Fab片段的克隆，或通过筛选抗体文库(参见，例如，Clackson等人((1991)Nature 352：624-628)和Hanes和Pluckthun((1997)Proc Natl Acad Sci.U.S.A.94：4937-4942))，可以得到至少编码所述抗体的Fab部分的克隆。
在其它实施方式中，本发明提供了本发明免疫球蛋白的融合蛋白或其功能活性片段。在一个实施例中，所述免疫球蛋白在N-端或C-端通过共价键(例如，肽键)与不是免疫球蛋白的另一种蛋白(或其一部分，优选蛋白的至少10、20或50个氨基酸部分)的氨基酸序列融合。优选地，所述免疫球蛋白或其片段在恒定结构域的N-端处共价地连接到其它蛋白上。如上所述，这样的融合蛋白可以方便纯化、延长体内半衰期和增强抗原跨上皮屏障向免疫系统的递送。
在另一个实施方式中，本发明提供了组合物和合并的抗体(pooledantibodies)、抗体片段和本文所述的其它抗体变体的应用。例如，可以合并2种或更多种单克隆抗体进行使用。在一个具体的实施方式中，将本发明的抗体与特异性地结合Stx或Stx1的抗体合并。
治疗给予(administration)
本发明的特征还在于将使用上述方法开发的抗体(例如，特异性地结合Stx2的11E10表位的抗体)给予具有志贺毒素相关疾病或处于发展所述疾病的风险中的受试者。
以与良好医疗实践相一致的方式，配制、定量和给予本发明的抗体。在该背景下考虑的因素包括待治疗的具体障碍、待治疗的具体受试者、单个受试者的临床状况、障碍的成因、药剂的递送部位、给予方法、给予计划和医疗从业人员已知的其它因素。要给予的特异性地结合Stx2的11E10表位的抗体的治疗有效量由这样的考虑因素控制，且是预防、改善、治疗或稳定化志贺毒素相关疾病或与其有关的症状必需的最小量。对11E10表位特异性的抗体并非必须、但是可选地与当前用于预防或治疗志贺毒素相关疾病的一种或多种药剂(例如，对Stx1特异性的抗体，包括13C4或其人源化的或嵌合的衍生物)一起配制。这样的其它药剂的有效量取决于在制剂中存在的对Stx2的11E10表位特异性的抗体的量、障碍或治疗的类型、和上面讨论的其它因素。
通过任意合适的方式，给予抗体，所述方式包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内。肠胃外输注包括肌肉内的、静脉内的、动脉内的、腹膜内的或皮下的给予。另外，适当地通过脉冲输注(具体地，抗体的剂量递减)来给予抗体。优选地，通过注射来给药，最优选静脉内或皮下注射，这部分地取决于所述给予是短暂的还是长期的。
III.疫苗
本发明的特征在于用于刺激针对Stx2蛋白的免疫应答的组合物。
通过给予含有本发明的11E10表位的组合物(例如，疫苗)，可以治疗具有志贺毒素相关疾病或处于发展所述疾病的风险中的个体，其中所述多肽不包括全长Stx2多肽或加工过的StxA2亚基，优选地以免疫原性有效量。所述组合物可以预防性地和/或治疗性地给予。
根据本领域已知的标准程序，可以开发不同类型的疫苗。例如，疫苗可以是基于肽的(参见，例如，Smith等人((2006)Vaccine 24：4122-4129))、基于核酸的(例如，参见Bentacor等人，“DNA vaccine encoding theenterohemorragic Escherichia coli 1(EHEC)Shiga-like toxin 2(Stx2)A2 andB subunits confers protective immunity to Stx challenge in the murine model”Clin.Vaccine Immunol.(印刷之前的电子出版物，PMID 19176691))、基于细菌或病毒的疫苗。含有多肽或核酸(所述核酸编码包含11E10表位的多肽)的疫苗制剂可以含有多种其它组分，包括稳定剂。所述疫苗也可以包含一种或多种合适的佐剂或与其共同给予。本领域技术人员通过标准方法，可以确定疫苗中佐剂与包含11E10表位的多肽的比例。
在另一个实施方式中，肽疫苗可以以多种方式使用包含11E10表位的肽或其功能衍生物作为预防性或治疗性疫苗，包括：1)作为相同序列的单体或多聚体，2)与可以促进聚集、促进表位的呈递或加工(例如，I/II类靶向序列)的额外序列和/或其它抗体、T辅助细胞(T helper)或CTL表位连续地或非连续地结合，以增加11E10表位的免疫原性，3)化学修饰或结合到可增加疫苗的免疫原性或递送的药剂上(例如，脂肪酸或酰基链、KLH、破伤风类毒素或霍乱毒素)，4)上述的任意组合，5)上述任一种与佐剂的组合，所述佐剂包括但不限于无机凝胶诸如氢氧化铝和油包水乳剂诸如不完全弗氏佐剂、铝盐、皂甙(皂角苷)或三萜类、MPL、霍乱毒素、
Figure BDA0000077912310000221
SAF、弗氏佐剂、
Figure BDA0000077912310000222
Figure BDA0000077912310000223
以及其它，尤其是在美国专利号5,709,860、5,695,770和5,585,103中所述的那些；和/或与递送载体的组合，递送载体包括但不限于脂质体、VPL或病毒-样颗粒、微乳剂、减毒的或杀死的细菌和病毒载体和可降解的微球(参见例如，Kersten和Hirschberg((2004)Expert Rev ofVaccines.3：453-462)；Sheikh等人((2000)Curr Opin Mol Ther.2：37-54))，和6)通过任意途径给予，或作为离体给细胞加载抗原的方式。
本领域技术人员可以确定作为针对志贺毒素相关疾病的预防性治疗或治疗而给予个体的、包含11E10表位的多肽(其中所述多肽不是全长Stx2)的剂量。通常，剂量含有约10μg至1,000mg、优选约10mg至500mg、更优选约30mg至120mg、更优选约40mg至70mg、最优选约60mg包含11E10表位的多肽。
将至少1剂量的包含11E10表位的多肽给予受试者，优选至少2剂量，更优选4剂量，给予多达6剂量或更多总剂量。在最后一次免疫后以1周或2周间隔给予加强剂量(booster dose)的包含11E10表位的多肽可能是合乎需要的，通常1个加强剂量含有与最初给予的剂量相同或更少的量的11E10表位。在一个实施例中，以1周间隔，分4个剂量给予免疫方案。由于多肽或核酸可能在胃中分解，所述免疫优选地肠胃外给予(例如，皮下、肌肉内、静脉内或皮内注射)。通过一般的医学评价，可以追踪免疫的受试者的进展，通过血清学和/或胃镜检查来筛选感染。
IV.实施例
实施例1
单克隆抗体11E10识别Stx2的A1亚基。11E10与Stx2的结合会中和Stx2的细胞毒性和致死活性，但是所述单克隆抗体不会结合或中和Stx1，尽管成熟A亚基的氨基酸存在55％同一性和68％相似性。在本研究中，我们试图鉴别Stx2上的构成11E10表位的(一个或多个)区段，并确定11E10对该区域的识别如何导致毒素的灭活。为了这些目的，我们制备了一组嵌合的Stx1/Stx2分子，然后通过蛋白印迹分析评价了11E10识别那些杂种毒素的能力，和在Vero细胞的细胞毒性试验中中和它们的能力。我们还对比了Stx1和Stx2的氨基酸序列和晶体结构中的不同性区段(stretches of dissimilarity)，它们可能预测11E10在Stx2上的结合表位。通过这些评估，我们得出结论，即11E10表位由在Stx2活性位点周围的3个不连续区域组成。为了研究11E10如何中和Stx2，我们考察了11E10/Stx2与靶核糖体复合(complex)的能力。我们发现，11E10与Stx2的结合在体外试验中阻止毒素抑制蛋白合成，并且改变Stx2在Vero细胞中的总细胞分布。我们提出，11E10单克隆抗体与Stx2的结合中和至少一些(如果不是全部的话)毒素作用，且可能通过阻止毒素到达核糖体或灭活核糖体来实现。
我们已经研究了被动免疫策略来中和与STEC感染有关的Stx(Dowling等人(2005)Antimicrob.AgentsChemother.49：1808-1812，Edwards等人(1998)见：J.B.Kaper和A.D.O′Brien(ed.)，Escherichia coliO157：H7 and other Shiga toxin-producing E.coli strains.ASM Press，Washington，DC.，Kimura等人(2002)Hybrid.Hybridomics.21：161-168，Ma等人(2008)Immunol.Lett.121：110-115，Mukherjee等人(2002)Infect.Immun.70：612-619，Mukherjee等人(2002)Infect.Immun.70：5896-5899.)。我们的被动免疫策略基于在该实验室中开发的鼠单克隆抗体，其特异性地结合和中和Stx/Stx1或Stx2(Strockbine等人(1985)Infect.Immun.50：695-700，Perera等人(1988)J Clin.Microbiol.26：2127-2131)。通过用甲醛处理类毒素化的Stx2免疫BALB/c小鼠，产生单克隆抗体11E10(Perera等人，同上)。通过蛋白印迹分析，11E10单克隆抗体特异性地识别Stx2的A1片段，并中和Stx2(对于Vero细胞和小鼠而言)，但是不结合或中和Stx/Stx1(Edwards等人，同上；Perera等人同上)。将鼠11E10单克隆抗体修饰成含有人恒定区，以减少抗体受体产生抗-小鼠抗体应答的潜力。该人/小鼠嵌合抗体(称作cαStx2)成功地经过了I期临床试验(Dowling等人，同上)。在该报告中，我们定义了由鼠11E10单克隆抗体识别(和因此，也被cαStx2识别)的Stx2的A亚基上的表位在Stx2的A亚基上，且有证据表明，单克隆抗体会在体外阻断毒素的酶促作用，并也改变Vero细胞中的毒素运输。
材料和方法
菌株、质粒、纯化的Stx1和Stx2、和单克隆抗体11E10和13C4。
根据需要，在添加了100μg/ml氨苄西林的Luria-Bertani(LB)肉汤中或在LB琼脂(Becton Dickinson和Company，Sparks，MD)上培养细菌，用于选择重组质粒。在表1中列出了在本研究中使用的菌株和质粒。如以前所述(Melton-Celsa和O′Brien(2000)第385-406页，见：Handbook ofExperimental Pharmacology，vol.145.Springer-Verlag，Berlin)，通过亲和色谱法纯化Stx1和Stx2，并在该实验室中生产单克隆抗体11E10、11F11(对Stx2特异性的(Perera等人，同上)和13C4(对Stx1特异性的(Strockbine等人(1985)Infect.Immun.50：695-700)]，并保藏在BEI Resources(马纳萨斯(Manassas)，VA)。
表1.在本研究中使用的菌株和质粒。
Figure BDA0000077912310000251
Figure BDA0000077912310000261
嵌合毒素质粒的构建。
使用重叠延伸拼接(SOE)方法(Higuchi(1989)第61-70页。见：H.A.Erlich(编)，PCR technology.Stockton Press，New York)，通过PCR，产生6个含有stxA1和stxA2二者的部分的嵌合毒素基因，并将PCR产物连接进pBluescript II KS(-)(Stratagene，La Jolla，CA)中。嵌合毒素基因含有天然启动子和Shine-Dalgarno序列，在那些条件下，来自5个克隆的毒素表达水平是足够的。为了提高来自1个克隆(pMJS11)的A亚基的表达水平，通过PCR扩增毒素操纵子第二次，并将优化的Shine-Dalgarno序列[TAAGGAGGACAGCTATG(优化的Shine-Dalgarno序列标有下划线，且StxA2的翻译起始位点被加粗)SEQ ID NO：20]添加在stxA2的上游。将后一次PCR产物连接进pTrcHis2C表达载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，所述表达载体具有异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)-诱导型启动子。在表2中列出了在本研究中使用的所有引物。在使用之前，证实了为本研究建立的每个构建体的DNA序列。
表2.在本研究中使用的合成的寡核苷酸引物
Figure BDA0000077912310000262
Figure BDA0000077912310000271
Figure BDA0000077912310000281
Figure BDA0000077912310000291
a限制酶位点标有下划线；b诱变密码子位点是粗体。
从含有紧邻B基因下游的6个组氨酸密码子的stx1克隆，产生了5个额外His-标记的嵌合毒素(图2A)。由这些嵌合体生成的毒素含有来自Stx2A亚基的1个、2个或3个区域(下文称作区域A、B和C)，所述区域包含推定的11E10单克隆抗体表位来代替Stx1中的相当序列。区域A、B和C分别表示Stx2A亚基的氨基酸42-49(SEQ ID NO：1)、96-100(SEQID NO：2)和244-259(SEQ ID NO：3)。将制备的5个嵌合毒素命名为：Stx1+A(含有在SEQ ID NO：4中所述的嵌合的Stx2A序列)、Stx1+AB(含有在SEQ ID NO：5中所述的嵌合的Stx2A序列)、Stx1+AC(含有在SEQ IDNO：6中所述的嵌合的Stx2A序列)、Stx1+BC(含有在SEQ ID NO：7中所述的嵌合的Stx2A序列)、或Stx1+ABC(含有在SEQ ID NO：8中所述的嵌合的Stx2A序列)。
部分地类毒素化的Stx1+ABC的产生和纯化。
通过SOE方法，通过将在A亚基的位置77处的酪氨酸残基改变为丝氨酸残基，部分地类毒素化Stx1+ABC毒素。Y77S突变使对Vero细胞的50％细胞毒性剂量(CD50)从106降低至102CD50/ml诱导的培养物。导入Y77S突变后的细胞毒性的该4-log减少与以前关于Stx1中的Y77S突变的报道(Deresiewicz等人(1992)Biochemistry 31：3272-3280)类似。
如以前所述(Smith等人(2006)Infect.Immun.74：6992-6998)，用镍亲和柱纯化Stx1+ABC类毒素。通过双金鸡纳酸(二辛可宁酸，bicinchoninicacid)试验(Pierce，Rockford，IL)，测定类毒素的浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶的银-染色揭示，嵌合类毒素的A和B亚基是存在的2个主要条带，尽管观察到其它微小条带(数据未显示)。
Stx2c和Stx2d变体克隆(variant clone)的构建。
如以前关于Stx2所述(Robinson等人(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 103：9667-9672)，通过PCR，建立了表达His-标记的Stx2c的克隆。使用引物2DF和2DR，通过PCR，从大肠杆菌EH250建立stx2d克隆(Pierard等人(1998)J.Clin.Microbiol.36：3317-3322)。将PCR产物连接进表达载体pTrcHis2C中。通过序列分析，证实stx2c和stx2d被正确地扩增。
蛋白印迹分析
对纯化的Stx1、Stx2或表达嵌合Stx1/Stx2毒素的细菌的声波裂解物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后如以前所述(Smith等人，同上)，通过蛋白印迹法进行考察。如下估测含有Stx1、Stx2或嵌合毒素的声波裂解物中的A亚基的浓度。首先，通过使用NIH ImageJ软件，http://rsb.info.nih.gov/nih-image，测定兔抗-Stx1和抗-Stx2兔多克隆抗体的特定稀释液(dilutions)，所述抗体分别检测来自Stx1或Stx2的纯化的A亚基至相对等价水平。其次，通过SDS-PAGE，分离含有嵌合体的声波裂解物，然后将得到的凝胶转移至硝酸纤维素，然后用如上测定的稀释的兔抗-Stx1和抗-Stx2兔多克隆抗体的混合物探测这些印迹。第三，用NIH Image J程序定量与每个泳道中的嵌合的A亚基相对应的条带，以测定每个裂解物样品中的毒素浓度。第四，向2个额外的聚丙烯酰胺凝胶加载纯化的Stx1、Stx2或含有嵌合体的裂解物样品，它们被标准化成含有等效浓度(从步骤3测定)。然后对毒素制品进行SDS-PAGE，随后使用兔抗-Stx1和兔抗-Stx2多克隆抗体的混合物(图1B上图)(印迹1)或11E10单克隆抗体(图1B下图)(印迹2)，进行蛋白印迹分析。在这些蛋白印迹中使用的第二抗体是结合到辣根过氧化物酶[(HRP)Bio-Rad，Hercules，CA]上的山羊抗-兔免疫球蛋白G(IgG)(对于印迹1，稀释度为1∶15,000)(图1B上图)和结合到HRP(Bio-RAD，Hercules，CA)上的山羊抗-小鼠IgG(对于印迹2，稀释度为1∶3,000)(图1B下图)。使用ECL-Plus蛋白印迹检测试剂盒(Amersham Bioscience，Little Chalfont，白金汉郡(Buckinghamshire)，英国(England))，通过化学发光，检测结合的第二抗体。
还在表达Stx2、Stx2c、Stx2d、Stx2dact或Stx2e的克隆的声波裂解物上，进行了蛋白印迹。首先，如上所述，测定来自这些毒素样品的A亚基的浓度，例外是，仅兔抗-Stx2多克隆抗体用作探针。然后，向2个额外的聚丙烯酰胺凝胶加载等量的标准化的样品，并使用兔抗-Stx2多克隆抗体或11E10单克隆抗体作为第一抗体，进行蛋白印迹。第二抗体和检测方法与上述相同。
在Vero细胞上的体外中和试验。
如以前所述(Marques等人(1986)J Infect.Dis.154：338-341；Smith等人，同上)，使用11E10，在Vero细胞(ATCC，马纳萨斯(Manassas)，VA)上，进行来自含有Stx1、Stx2、嵌合的Stx1/Stx2毒素、Stx2c、Stx2d、Stx2dact或Stx2e的细菌的声波裂解物的体外中和试验。简而言之，将等体积的含有在Eagle氏最低必需培养基(EMEM)中的毒素(1-3CD50)和在EMEM中的纯化的11E10单克隆抗体(0.5mg/ml)的样品混合到一起，并在37℃和5％CO2温育2h。然后将毒素-抗体混合物覆盖到96-孔平板内的亚汇合(subconfluent)的Vero细胞上，并温育48h。然后将Vero细胞固定、染色，并测定在600nm的光密度(OD600)。这些中和实验一式两份地进行至少2次。通过对比其中加入了单独的毒素或毒素加抗体的孔中的细胞存活性，测定11E10单克隆抗体中和声波裂解物中的毒素的细胞毒性效应的能力。通过下式计算抗体的毒素中和百分比。中和百分比：[(毒素+抗体孔的平均OD600-仅毒素孔的平均OD600)/(仅细胞孔的平均OD600-仅毒素孔的平均OD600)]x 100。11E10单克隆抗体将Stx2中和至约65％的野生型活性。为了更容易地对比11E10单克隆抗体对毒素衍生物的中和百分比水平，将数据标准化，使得11E10对Stx2的中和量设定为100％，并相对于Stx2的水平，计算其它毒素的中和水平。
小鼠的免疫和攻击
从体重为14-16g的CD-1雄性小鼠(Charles River Laboratories，波士顿(Boston)，MA)，收集免疫前血清(preimmune sera)。将这些血清样品用于酶联免疫吸附测定(ELISA)，以确定小鼠是否具有针对Stx1或Stx2的预存效价(pre-existing titers)。在研究起点，小鼠都没有表现出对任一种毒素的免疫应答。然后将小鼠分成2组：假接种(sham-inoculated)组(下文称作阴性对照组)和用嵌合类毒素免疫的组。用PBS和TiterMax(一种油包水-佐剂)(TiterMax，USA Inc.，Norcross，GA)的混合物，腹膜内免疫阴性对照组中的小鼠。用与TiterMax混合的1ug类毒素，腹膜内免疫第二组小鼠。以3周的间隔，强化小鼠，共强化4次。最后一次强化后2周，用10倍50％致死量(LD50)的Stx1(1,250ng)腹膜内攻击5只阴性对照小鼠和5只类毒素-免疫的小鼠，并用5倍LD50的Stx2(5ng)攻击29只阴性对照小鼠和34只类毒素-免疫的小鼠。
体外蛋白合成抑制试验。
兔网织红细胞裂解物、荧火虫萤光素酶mRNA和萤光素底物购自Promega Corporation(Madison，WI)。将Stx2(4ng/μl)与等体积的抗体(4或40ng/μl)混合，并将1μl毒素/抗体混合物与9μl网织红细胞裂解物混合。在30℃温育混合物，以允许毒素灭活裂解物中的核糖体。1小时后，加入已经加热至70℃2min的萤光素酶mRNA和氨基酸的等分试样，并温育该溶液另外90min，以允许体外蛋白合成继续进行。所有试验一式三份地进行。通过将1μl裂解物混合物加入到在透明(clear)的96孔平板(FisherScientific，匹兹堡(Pittsburgh)，PA)中的20μl萤光素底物中，测量萤光素酶活性。以10min曝光量，用Kodak Image Station 440CF检测生物发光的光发射。通过在与单个孔对应的圆形区域内的总信号强度的总和，分析发光信号。
11E10在中毒的细胞中的定位
以1X 105个细胞/ml的浓度，将Vero细胞接种进8孔组织培养载玻片(Thermo Fisher Scientific，Rochester，NY)中，并在37℃在5％CO2气氛下，附着24小时。将Stx2(0.2ml，10ng/ml)与10ng纯化的11E10单克隆抗体或与作为阴性对照的PBS相混合。与Vero细胞一起温育抗体/毒素或PBS/毒素溶液6h，然后用缓冲的福尔马林(Formalde-Fresh，FisherScientific，匹兹堡(Pittsburgh)，PA)固定细胞，并用在PBS中的0.001％Triton-X100(Pierce，Rockford，IL)渗透化。所有免疫染色操作是在含有3％牛血清白蛋白(BSA，Sigma，St.Louis MO)的PBS中进行。使用Alexa-Fluor 488标记的驴抗-小鼠IgG(Invitrogen，Carlsbad，CA)，检测单克隆抗体11E10在细胞内的存在。用兔抗-Stx2多克隆抗体标记在中毒的细胞内的总Stx2，并使用Alexa-Fluor 488-结合的驴抗-兔IgG作为第二抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。分别使用抗-Stx2单克隆抗体11F11(Perera等人，同上)(BEI Resources，Manassas，VA)和抗-EEA1(C-15)山羊多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)和Alexa-Fluor标记的第二抗体，实现Stx2和内体双重标记。与适当的第一和第二抗体一起温育后，用福尔马林在37℃固定细胞20min，并用SlowFade培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)封固载玻片。通过具有反射光荧光附加器(reflected lightfluorescence attachment)和Spot CCD数字照相机(Diagnostic InstrumentProducts，Sterling Heights，MI)的Olympus显微镜，得到结合的荧光团-标记的第二抗体的40x放大率图像。处理荧光图像，并用Adobe Photoshop(Adobe Systems，San Jose，CA)叠加。
结果
最初的嵌合毒素与单克隆抗体11E10的相互作用。
为了确定Stx2中与11E10单克隆抗体相互作用的部分，我们构建了6种嵌合毒素操纵子的最初集合，所述操纵子含有stxA2基因的不同区域，插入它们来替代stxA1的对应区域(图1A)。使用11E10单克隆抗体，探测下述的蛋白印记：纯化的Stx1、Stx2或表达6种不同的嵌合的Stx1/Stx2毒素之一的大肠杆菌DH5α的裂解物。所述抗体与Stx2强烈反应，且所述嵌合毒素含有来自Stx2A亚基的下述区域的氨基酸：29-297、1-158和29-128(图1B)。仍然被11E10识别(尽管较弱)的含有Stx2的最小部分的嵌合毒素含有仅8个来自StxA2的氨基酸，即区域42-49。
接着，考察了11E10单克隆抗体中和细菌裂解物的毒性的能力，所述细菌裂解物含有Stx1、Stx2或Vero细胞的6种最初的嵌合毒素之一。如预期的，11E10单克隆抗体中和Stx2，但是不中和Stx1(图1C)。但是，与Stx2相比，11E10中和了约85％的含有来自StxA2的区域1-158或29-297的杂种毒素，该结果提示，11E10表位的重要组分位于Stx2的残基29-158之间。相反，含有来自Stx2的氨基酸29-128的嵌合毒素在免疫印迹中被强烈识别，但是仅被中和至Stx2的水平的约32％。这些发现一起提示，11E10中和表位包括比11E10与Stx1在蛋白印迹中结合所需(2A29-128)更大数目的氨基酸，因此，中和表位的一部分从该杂合体中缺失。与标准化的Stx2中和水平相比，在蛋白印迹分析中被11E10单克隆抗体弱检出的另外3种嵌合毒素没有明显地被11E10中和(小于15％)。总之，这些结果表明，在Stx2上的11E10中和表位的一个或多个关键组分存在于氨基酸29-76的外面。
Stx1和Stx2A亚基氨基酸序列和晶体结构之间的差异分析。
第一组嵌合毒素的蛋白印迹和中和分析表明，11E10表位至少需要Stx2A亚基的氨基酸42-49(SEQ ID NO：1)来进行毒素检测，而且揭示，完全识别和毒素中和需要其它氨基酸。因此，比对了来自Stx1和Stx2的成熟A亚基的氨基酸序列，以鉴别可能参与11E10对Stx2的识别和中和的氨基酸的其它独特区段。接着，使用Deep View/Swiss-PDB观察器(viewer)，对比了Stx(Fraser等人(1994)，同上)和Stx2(Fraser等人(2004)，同上)的晶体结构(蛋白数据库登录号分别是1RQ4和1R4P)，以评估毒素之间的序列差异区域在三维结构中的定位和这些区域彼此的接近。如以前确立的，跨Stx2A亚基中的残基42-49的8个氨基酸形成11E10结合位点的一部分，且在下文称作区域A或SEQ ID NO：1(图2A；区域A具有下划线的氨基酸)。当在Stx2晶体结构的背景下观察来自区域A的8个氨基酸时，它们似乎形成毒素结构中的主要弯曲(用绿色指示，并在图2B中用黑色箭头指示，且也在图2C中指示)，另外，在Stx2的外侧面上发现，邻近在氨基酸167附近的活性位点裂口(cleft)。
当对比Stx1和Stx2的氨基酸序列和晶体结构时，鉴别出这两个毒素的A亚基之间的第二个不同区域，我们将该区段称作区域B或SEQ ID NO：2(参见图2A；区域B具有下划线的氨基酸)。区域B跨Stx2的A亚基中的5个残基(96THISV100)(SEQ ID NO：2)，且在该区域中的5个氨基酸中的4个在Stx1和Stx2之间存在差异(图2A)。尽管区域B距离区域A大约50个氨基酸，该部分氨基酸在Stx2晶体结构中向区域A延伸(区域B用蓝色指示，并在图2B中用灰色箭头指示)。在三维结构中区域A与区域B的紧密接近，在填空模型(空间填充模型，space-filling model)中甚至更清楚(图2C)。
Stx1和Stx2的A亚基之间的第三个不同区域(我们命名为区域C或SEQ ID NO：3)与在Stx2的残基246附近的弗林蛋白酶切割位点重叠(参见图2A；区域C具有下划线的氨基酸)。鉴别出了区域C，不仅因为Stx1和Stx2之间在该位置的氨基酸序列差异，而且因为Stx和Stx2的晶体结构的对比指示，区域C(用青色指示，且在图2C中用白色箭头指示)在空间上邻近区域A和B。从我们对Stx和Stx2晶体结构的分析，我们得出结论，即区域A、B和C聚簇在Stx2的同一面上，相对邻近催化活性位点(在图2C中可以最好地看出)。
第二代嵌合毒素与单克隆抗体11E10的相互作用。
为了确定区域B和C是否是11E10表位的一部分，我们生产了第二组嵌合毒素，它们含有来自Stx2的区域A、B或C的不同组合，以替代Stx1上的对应区域(图3A)。接着，用11E10探测了Stx1、Stx2或嵌合毒素的蛋白印迹(图3B，下图)。11E10单克隆抗体检测到含有区域A的所有毒素(Stx2、Stx1+A、Stx1+AB、Stx1+AC、和Stx1+ABC)(图3B，下图)。缺少区域A的毒素未被11E10单克隆抗体检出(Stx1和Stx1+BC)，该发现证实，区域A是11E10表位的必要组分。但是，与包含单独的区域A或A加区域C的嵌合毒素相比，2个掺入了区域A和B的嵌合毒素(Stx1+AB或Stx1+ABC)表现为更强烈地被11E10单克隆抗体检出(图3B，下图)。这些结果共同地指示，区域A和B对于毒素的全11E10识别而言都是重要的。
我们接着测定了5种第二代嵌合毒素各自的声波裂解物(图3A)，用于11E10单克隆抗体的体外中和。抗体中和含有区域A、B和C(Stx1+ABC)的嵌合毒素至Stx2中和水平的大约65％。相反，仅含有区域A和B(Stx1+AB)或A和C(Stx1+AC)的嵌合毒素被中和至Stx1+ABC嵌合体的中和水平的约一半(图3C)。针对Stx1+A或Stx1+BC嵌合毒素，没有观察到明显的11E10中和(分别是大约6.9和4.3％)。由于嵌合毒素的更强烈的(＞50％)中和需要来自Stx2的区域A、B和C，我们得出结论，即所有3个区域(A、B和C)都是11E10的＞50％中和所必需的。
使用Stx2和Stx2变体和11E10单克隆抗体的蛋白印迹和体外中和试验结果。
为了确定哪些Stx2变体可以被11E10、Stx1、Stx2或Stx2变体(Stx2c、Stx2d、Stx2dact和Stx2e)识别和/或中和，通过蛋白印迹进行了分析。Stx2和所有Stx2变体都被11E10识别，尽管Stx2e以低许多的程度被检出(图4A，下图)。在蛋白印迹形式中11E10对Stx2e的这种弱检测与我们以前的报道相一致，即通过菌落印迹，11E10不能检测生成Stx2e的菌株(Perera等人，同上)。与Stx2相比，Stx2e在区域B中具有2个保守氨基酸差异(AHISL(SEQ ID NO：19)，而不是THISV(SEQ ID NO：2))。在紧邻区域A处，也存在几个氨基酸序列差异(未显示)。我们推测，这些差异可能导致在蛋白印迹上11E10对Stx2e的识别减少。
当评价单克隆抗体11E10对Stx2变体毒素的中和能力时，我们发现，11E10中和所有的Stx2变体毒素至Stx2的中和水平的大于或等于60％(图4B)。我们对观察到的11E10对Stx2e的中和水平感到惊奇，因为在蛋白印迹形式中，11E10对Stx2e的识别有限(图4A，下图)。但是，在本研究中11E10对Stx2e的中和与我们以前的结果相一致，所述结果证实，11E10部分地中和Stx2e(Perera等人，同上)。
Stx1+ABC类毒素在小鼠中的免疫和保护应答。
我们接着试图查明Stx1+ABC杂种分子的类毒素化的衍生物是否会在小鼠中引起针对Stx2的血清中和应答或保护应答。用嵌合类毒素或作为对照的PBS，免疫小鼠组。然后评价来自5只类毒素-免疫的小鼠和5只PBS-免疫的小鼠的血清的抗-Stx1中和应答。来自PBS-免疫的小鼠的血清都不含有Stx1-中和活性。如从以前的研究所预见到的，所有5只类毒素-免疫的小鼠具有针对Stx1的中和抗体(Smith等人(2006)Vaccine24：4122-4129，Wen等人，同上)。来自这5只小鼠的血清的平均抗-Stx1中和效价超过背景4.0±0.9log。11份来自其它34只类毒素-免疫的小鼠的血清具有一些针对Stx2的中和应答，尽管来自29只PBS-免疫的小鼠的血清都没有表现出任何抗-Stx2应答(数据未显示)。
在最后一次强化后2周，用10LD50的Stx1腹膜内攻击5只阴性对照小鼠和5只类毒素-免疫的小鼠。如从以前的研究结果所预见到的(Smith等人，同上，Wen等人，同上)，所有阴性对照小鼠死亡，而所有类毒素-免疫的小鼠度过致死攻击而存活下来(表3)。另外，用Stx1攻击的类毒素-免疫的小鼠的存活与来自这些小鼠的体外中和效价直接相关。
表3.针对Stx1或Stx2的致死攻击保护免疫的小鼠。
Figure BDA0000077912310000361
a以前测得Stx1和Stx2的LD50分别是125和1ng/小鼠。
b当小鼠受到攻击时，它们的平均体重是47.1g。
c使用Fisher氏精确检验来对比在C和D组中的存活比例，p值是0.2667。
因为在类毒素-免疫的组中观察到低Stx2中和抗体效价，我们选择使用仅5LD50的Stx2来攻击其它小鼠。29只阴性对照小鼠中有6只(20.7％)度过了Stx2攻击存活下来，而34只类毒素-免疫的小鼠中有12只(35.3％)存活(表3)，尽管不是统计上显著的，该发现表明，嵌合类毒素可能已经提供了一些针对Stx2的保护。
体外蛋白合成抑制试验。
我们发现，11E10表位似乎由在Stx2活性位点裂口附近的表面环组成，这引导我们提出假说，即11E10可能通过阻断Stx2抑制蛋白合成的能力来中和该毒素。因此，我们在加入了萤光素酶mRNA的兔网织红细胞蛋白合成试验中评估了11E10单克隆抗体是否能中和Stx2的核糖体-灭活效应。选择毒素的浓度，其使来自萤光素酶报告蛋白的信号比不加入毒素时测得的信号降低大约60％(图5)。向试验中加入11E10，允许在兔网织红细胞裂解物中发生蛋白合成(甚至当存在Stx2时)，而同种型-匹配的无关的抗体则不会(图5)。
单克隆抗体11E10改变Stx2在Vero细胞中的总分布
尽管我们发现，单克隆抗体11E10会在体外蛋白合成试验中阻止Stx2对蛋白合成的抑制，我们进一步假设，11E10可以阻止Stx2到达中毒的Vero细胞的细胞质中的核糖体。因此，我们试图确定单克隆抗体11E10是否改变靶细胞中的Stx2定位。(我们以前发现，11E10-结合的Stx2可以结合Vero细胞，且11E10可以连接到结合在Vero细胞上的Stx2上(数据未显示))。将Stx2与11E10或PBS混合，并与Vero细胞一起温育抗体/毒素或PBS/毒素混合物。然后使用兔多克隆抗体抗-Stx2和荧光团-标记的抗-兔IgG第二抗体，使靶细胞中的Stx2分布可视化(图6)。在没有11E10存在下，Stx2表现为遍布于细胞质中(图6A)，但是在有11E10存在下，似乎保持浓缩在大核周体(largely perinuclear bodies)中(图6B)。当用抗-小鼠IgG染色与毒素/11E10混合物一起温育的细胞时，在与Stx2相同的核周斑点结构中观察到11E10(图6C)。在没有毒素存在下，11E10单克隆抗体不能进入细胞(图6D)。11E10-结合的Stx2在核周围的斑点体内的定位，提示抗体-毒素复合物进入细胞，但是不进入细胞质。因此，我们通过用初级内体标志物单克隆抗体EEA-1免疫染色中毒的细胞，研究了Stx2或11E10-结合的Stx2是否位于初级内体中。我们发现，在11E10-结合的Stx2中毒的细胞中的多数Stx2与初级内体标志物(early endosome marker)一起共定位(图6E-G)，正如当重叠染色图案时由黄色-橙色所指示的。相反，当仅与Stx2一起温育Vero细胞时，发现毒素遍布于细胞质中，且仅小量与初级内体标志物一起共定位(图6H-J)。
讨论
我们的结果证实，11E10单克隆抗体表位是构象的，且包括在Stx2A亚基中的3个非线性区域，所述区域在晶体结构中似乎邻近毒素的活性位点(参见图2C)。我们鉴别11E10表位的策略涉及嵌合的Stx1/Stx2毒素的产生，且基于下述假设，即将Stx2序列置于Stx1主链(backbone)上会维持抗体表位的3-维三级结构，并允许11E10单克隆抗体的识别。我们发现，在蛋白印迹分析中允许11E10识别的最小StxA2区域仅由8个Stx2氨基酸(42NHTPPGSY49)(SEQ ID NO：1)组成。但是，仅含有来自Stx2的那8个氨基酸(区域A)的嵌合的Stx1/Stx2没有被11E10单克隆抗体中和。因为11E10中和Stx2，我们认为，我们已经鉴别出的8个氨基酸组成11E10表位的关键区域，但是没有构成完整的中和表位。我们进一步分析了Stx1和Stx2的氨基酸序列和晶体结构中的差异，以尝试鉴别出可能参与11E10识别和中和的Stx2上的其它区域。通过这些对比，我们鉴别出了Stx2的另外2个区段，它们可能构成11E10表位。实际上，我们发现，所有3个区域都是11E10的最完整识别和中和所必需的(当那些区域被用于替代Stx1上的对应区段时)。
我们得出的结论是，完整的11E10中和表位包含Stx2上的3个不连续区域，这可能是令人惊奇的，因为在蛋白印迹的推定变性条件下，单克隆抗体会识别Stx2。对于后一发现的几种解释是可能的。这些可能性包括，蛋白印迹反应性主要是由于11E10与区域A(42NHTPPGSY49)的相互作用，或在蛋白印迹过程中，发生A亚基的部分重新折叠(再折叠，refolding)，正如我们在另一研究中对于单克隆抗体13C4所观察到的(Smith等人(2006)Infect.Immun.74：6992-6998)。
在Stx2上的形成11E10单克隆抗体中和表位的3个表面环的序列在Stx2变体中是保守的。在Stx2d和Stx2e(在人分离物中罕见的2种毒素)中，在那些区域中存在几个氨基酸差异(Melton-Celsa等人(2005)，同上)。但是，11E10单克隆抗体确实检测并部分地中和Stx2和在该报告中分析的所有Stx2变体(Stx2c、Stx2d、Stx2dact和Stx2e)的细胞毒性活性。Stx2e会被Vero细胞上的11E10中和，但是在蛋白印迹形式中与Stx2相比较差地被识别，这一发现可能指示，与中和相比，在Stx2和Stx2e之间不同的区域B中的序列对于蛋白印迹上的识别而言是更重要的。但是，11E10具有中和所有这些变体毒素的能力的事实提示，它可能是治疗人的由Stx2和Stx2-有关毒素介导的疾病的良好候选物。实际上，我们已经发现，11E10在毒血症(Stx2)疾病模型(Sauter等人(2008)Infect.Immun.76：4469-4478)和口服饲喂产生Stx2dact的菌株的小鼠疾病模型(Edwards等人，同上)中是保护性的。我们目前涉及正在进行的人源化形式的11E10即cαStx2的实验室评价，对它们的I期安全性试验已经完成(Dowling等人，同上)。
我们尝试通过用类毒素化的嵌合的Stx1分子(其含有仅29个来自Stx2的氨基酸，它们构成11E10表位)进行免疫，来保护小鼠度过Stx2攻击。我们发现，尽管免疫的小鼠产生了针对Stx1的保护应答，仅少数小鼠产生了Stx2-中和抗体，且它们具有低效价。使用嵌合类毒素的额外强化，可能已经提高对Stx2的应答。
我们发现，11E10会在体外阻断Stx2的酶活性，我们预测该事实是基于11E10表位与毒素活性位点的紧密邻近。我们进一步观察到，11E10会改变毒素在细胞内的总分布，该发现类似于如Krautz-Peterson等人((2008)Infect.Immun.76：1931-1939)所报道的不同的StxA2单克隆抗体5C12中和Stx2的数据。这些研究人员得出结论，当单克隆抗体5C12结合StxA2时，它会改变该毒素的细胞内运输模式(Krautz-Peterson等人，同上)。我们的数据指示，11E10/Stx2复合物结合并进入宿主细胞后，抗体可以阻止毒素运输到细胞溶质(cytosol)中的靶核糖体。但是，由于我们证实，11E10会在体外阻止毒素的酶促功能，我们预测，如果与11E10络合的Stx2的A亚基到达它在细胞溶质中的酶促靶标，该毒素不能杀死细胞。
其它实施方式
本领域技术人员会明了所描述的本发明的方法和组合物的不同修饰和变动，而不脱离本发明的范围和精神。尽管已经结合具体的希望的实施方式描述了本发明，应当理解，要求保护的本发明不应当不适当地局限于这些具体的实施方式。
在本说明书中提及的所有专利、专利申请和出版物，都通过引用并入本文中，其程度如同具体地且单个地将每篇独立的公开物通过引用并入本文。
Figure IDA0000077912360000011
Figure IDA0000077912360000031
Figure IDA0000077912360000041
Figure IDA0000077912360000051
Figure IDA0000077912360000061
Figure IDA0000077912360000081
Figure IDA0000077912360000091
Figure IDA0000077912360000101
Figure IDA0000077912360000111
Figure IDA0000077912360000121
Figure IDA0000077912360000131
Figure IDA0000077912360000141
Figure IDA0000077912360000151
Figure IDA0000077912360000161
Figure IDA0000077912360000171
Figure IDA0000077912360000181
Figure IDA0000077912360000191

Claims (62)

1.一种用于刺激针对Stx2的免疫应答的组合物，所述组合物包含药学上可接受的载体和至少一种纯化的多肽，所述多肽包含：
(i)SEQ ID NO：1；
(ii)SEQ ID NO：1和2；或
(iii)SEQ ID NO：1、2和3；
以及非-Stx2蛋白支架，其中，所述SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1和2、或SEQ ID NO：1、2和3插入到所述非-Stx2蛋白支架中，其中，所述多肽具有Stx2的抗原性。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述支架包含与Stx1基本上相同的蛋白或其片段。
3.如权利要求1所述的组合物，其中，所述多肽包含SEQ ID NO：1、2和3和非-Stx2蛋白支架。
4.如权利要求1所述的组合物，其中，所述多肽包含SEQ ID NO：1和2和非-Stx2蛋白支架。
5.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物不刺激针对Stx1的免疫应答。
6.如权利要求1所述的组合物，其中，所述多肽包含与在SEQ ID NO：8中所述的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。
7.如权利要求1所述的组合物，其中，所述多肽包含在SEQ ID NO：8中所述的氨基酸序列。
8.一种用于刺激针对Stx2的免疫应答的组合物，所述组合物包含药学上可接受的载体和至少一种纯化的多肽，所述至少一种纯化的多肽包含与在SEQ ID NO：8中所述的氨基酸序列具有至少92％同一性的氨基酸序列，其中，所述多肽具有Stx2的抗原性。
9.如权利要求1或8所述的组合物，其中，所述组合物还包含佐剂。
10.一种纯化的多肽，其包含：
(i)SEQ ID NO：1；
(ii)SEQ ID NO：1和2；或
(iii)SEQ ID NO：1、2和3；
以及非-Stx2蛋白支架，其中，所述SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1和2、或SEQ ID NO：1、2和3插入到所述非-Stx2蛋白支架中，且其中，所述多肽具有Stx2的抗原性。
11.如权利要求10所述的纯化的多肽，其中，所述支架包含与Stx1基本上相同的蛋白或其片段。
12.如权利要求10所述的纯化的多肽，其中，所述多肽包含SEQ ID NO：1、2和3和非-Stx2蛋白支架。
13.如权利要求10所述的纯化的多肽，其中，所述多肽包含SEQ ID NO：1和2和非-Stx2蛋白支架。
14.一种纯化的多肽，其包含与在SEQ ID NO：8中所述的氨基酸序列具有至少92％序列同一性的氨基酸序列，其中，所述多肽包含在SEQID NO：1、2和3中所述的氨基酸序列中的至少一个，且其中，所述多肽具有Stx2的抗原性。
15.如权利要求14所述的纯化的多肽，所述多肽包含与在SEQ ID NO：8中所述的氨基酸序列具有93％序列同一性的氨基酸序列。
16.如权利要求15所述的纯化的多肽，所述多肽包含与在SEQ ID NO：8中所述的氨基酸序列具有95％序列同一性的氨基酸序列。
17.如权利要求16所述的纯化的多肽，所述多肽包含在SEQ ID NO：8中所述的氨基酸序列。
18.如权利要求17所述的纯化的多肽，所述多肽由在SEQ ID NO：8中所述的氨基酸序列组成。
19.一种纯化的多肽，其中，所述多肽是SEQ ID NO：8的氨基酸序列的片段，所述多肽包含与SEQ ID NO：8的氨基酸64-122具有至少80％序列同一性的片段，其中，所述片段包含SEQ ID NO：1。
20.如权利要求19所述的纯化的多肽，其中，所述片段包含SEQ ID NO：1和2。
21.如权利要求20所述的纯化的多肽，其中，所述片段包含SEQ ID NO：1、2和3。
22.如权利要求10-21中任一项所述的纯化的多肽，其中，所述多肽被类毒素化。
23.一种分离的核酸分子，其编码如权利要求10-22所述的多肽中的任一种。
24.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述核酸分子可操作地连接到表达控制序列上。
25.一种能够表达多肽的载体，所述载体包含如权利要求23所述的核酸分子。
26.一种宿主细胞，其含有如权利要求25所述的载体。
27.一种制备多肽的方法，所述多肽包含如权利要求10-22所述的多肽中的任一种，所述方法包括下述步骤：
(a)将如权利要求23所述的核酸导入宿主细胞中，和
(b)从所述宿主细胞纯化所述多肽。
28.一种用于生产抗-Stx2抗体的方法，所述抗-Stx2抗体特异性地结合志贺毒素2型(Stx2)蛋白的11E10表位，所述方法包括下述步骤：
a)用如权利要求10-22所述的多肽中的任一种免疫哺乳动物；
和
b)从所述哺乳动物的组织或从使用所述组织制备的杂交瘤，纯化特异性地结合Stx2蛋白的11E10表位的所述抗-Stx2抗体。
29.如权利要求28所述的方法，其中，特异性地结合Stx2蛋白的11E10表位的所述抗-Stx2抗体不结合Stx1。
30.如权利要求28所述的方法，还包括下述步骤：
c)在体外中和试验中，筛选针对Stx2和Stx1的所述抗体，其中，中和至少50％的Stx2细胞毒性效应的抗体是特异性地结合Stx2蛋白的11E10表位的抗-Stx2抗体。
31.如权利要求28所述的方法，其中，步骤(a)还包括使用佐剂。
32.如权利要求28所述的方法，其中，所述抗体是多克隆抗体或其片段。
33.如权利要求28所述的方法，其中，所述抗体是单克隆抗体或其片段。
34.如权利要求28所述的方法，其中，所述抗体是修饰的抗体。
35.如权利要求28所述的方法，其中，所述抗体是嵌合的或人源化的抗体。
36.一种在受试者中诱导针对Stx2的免疫应答的方法，所述方法包括，给予如权利要求1-9所述的组合物中的任一种。
37.一种治疗或预防受试者的志贺毒素相关疾病的方法，所述方法包括，给予如权利要求1-9所述的组合物中的任一种。
38.如权利要求37所述的方法，其中，所述志贺毒素相关疾病是溶血性尿毒症综合征。
39.如权利要求37所述的方法，其中，所述志贺毒素相关疾病与大肠杆菌(E.coli)或痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)感染有关。
40.一种特异性地结合志贺毒素2型(Stx2)蛋白的11E10表位的抗-Stx2抗体或其片段，所述志贺毒素2型(Stx2)蛋白的11E10表位包含如权利要求10-22所述的多肽中的任一种，其中，所述抗体抑制11E10抗体(ATCC 1907)、嵌合的11E10抗体、或人源化的11E10抗体与所述Stx2蛋白的结合。
41.一种特异性地结合志贺毒素2型(Stx2)蛋白的11E10表位的抗-Stx2抗体或其片段，其中，所述表位包含如权利要求10-22所述的多肽中的任一种，其中，所述抗体抑制5C12抗体、嵌合的5C12抗体、或人源化的5C12抗体与所述Stx2蛋白的结合。
42.如权利要求40或41所述的抗体或其片段，其中，所述抗体特异性地结合包含SEQ ID NO：1、2和3中所述的序列的所述多肽中的表位。
43.如权利要求40或41所述的抗体或其片段，其中，所述11E10表位是构象表位。
44.如权利要求40或41所述的抗体或其片段，其中，所述抗体是单克隆抗体。
45.如权利要求40或41所述的抗体或其片段，其中，所述抗体是嵌合的、人源化的、或全人的抗体。
46.如权利要求40或41所述的抗体或其片段，其中，所述抗体是多克隆抗体。
47.如权利要求40所述的抗体或其片段，其中，所述抗体抑制Stx2和11E10抗体之间的结合，其中，所述11E10抗体具有0.50nM或更低的Kd。
48.如权利要求40所述的抗体，其中，所述抗体阻断Stx2的酶促活性，或改变Stx2的细胞内分布。
49.如权利要求40或41所述的抗体或其片段，其中，所述抗体是IgG、IgM、IgE、IgD或IgA。
50.如权利要求40或41所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段是Fab或Fv片段。
51.一种药物组合物，其包含如权利要求40-50所述的抗体中的任一种和药学上可接受的载体。
52.一种杂交瘤细胞系，其生产如权利要求40-50所述的抗体中的任一种。
53.一种检测生物样品中的Stx2的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)在允许抗体和Stx2之间形成复合物的条件下，使所述生物样品接触如权利要求40-50所述的抗体或其片段；和
(b)检测所述复合物。
54.如权利要求53所述的方法，其中，所述生物样品来自组织、细胞、细胞提取物、体液、或活组织检查。
55.如权利要求53所述的方法，其中，使用ELISA、RIA、蛋白印迹法、免疫沉淀、或流式细胞术，检测所述复合物。
56.一种诊断受试者的志贺毒素相关疾病的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)从所述受试者得到生物样品；
(b)在允许抗体和Stx2之间形成复合物的条件下，使所述生物样品接触如权利要求40-50所述的抗体中的任一种；和
(c)检测步骤(b)中的所述复合物；
其中，Stx2在所述样品中的存在诊断出具有志贺毒素相关疾病的受试者。
57.如权利要求56所述的方法，其中，所述志贺毒素相关疾病是溶血性尿毒症综合征。
58.如权利要求56所述的方法，其中，所述志贺毒素相关疾病是大肠杆菌或痢疾志贺氏菌感染。
59.一种用于检测志贺毒素相关疾病的免疫检验试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求40-50所述的抗体中的任一种和用于检测所述抗体的装置。
60.一种治疗或预防受试者的志贺毒素相关疾病的方法，所述方法包括，向所述受试者给予药学有效剂量的如权利要求40-50所述的抗体中的任一种。
61.如权利要求60所述的方法，其中，所述志贺毒素相关疾病是溶血性尿毒症综合征。
62.如权利要求60所述的方法，其中，所述志贺毒素相关疾病与大肠杆菌或痢疾志贺氏菌感染有关。
CN2010800052595A 2009-01-23 2010-01-21 基于志贺毒素2型蛋白的方法和组合物 Pending CN102292098A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14689209P 2009-01-23 2009-01-23
US61/146,892 2009-01-23
US21008209P 2009-03-13 2009-03-13
US61/210,082 2009-03-13
PCT/US2010/021610 WO2010085539A1 (en) 2009-01-23 2010-01-21 Methods and compositions based on shiga toxin type 2 protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102292098A true CN102292098A (zh) 2011-12-21

Family

ID=42356196

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800052595A Pending CN102292098A (zh) 2009-01-23 2010-01-21 基于志贺毒素2型蛋白的方法和组合物

Country Status (16)

Country Link
US (2) US8969529B2 (zh)
EP (1) EP2381954B8 (zh)
JP (1) JP5773886B2 (zh)
KR (1) KR101832499B1 (zh)
CN (1) CN102292098A (zh)
AR (1) AR075047A1 (zh)
AU (1) AU2010206800B2 (zh)
BR (1) BRPI1007230B1 (zh)
CA (1) CA2748873C (zh)
CL (1) CL2011001769A1 (zh)
ES (1) ES2614803T3 (zh)
MX (1) MX2011007866A (zh)
NZ (1) NZ593926A (zh)
PE (1) PE20120425A1 (zh)
RU (1) RU2011126896A (zh)
WO (1) WO2010085539A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103343164A (zh) * 2013-06-17 2013-10-09 武汉轻工大学 产志贺毒素大肠杆菌多重pcr检测方法、试剂盒及应用
CN104558167A (zh) * 2014-12-26 2015-04-29 江苏省疾病预防控制中心 检测i型志贺毒素双抗夹心法酶联免疫试剂盒及其应用
CN106604934A (zh) * 2014-06-11 2017-04-26 分子模板公司 耐受蛋白酶切割的志贺毒素a亚基效应子多肽和包含其的细胞靶向分子
CN115856296A (zh) * 2022-12-16 2023-03-28 华北理工大学 抗志贺氏菌的单克隆抗体及其检测中的应用

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1229045A1 (en) * 2001-02-01 2002-08-07 Institut Curie Universal carrier for targeting molecules to Gb3 receptor expressing cells
WO2007124133A2 (en) 2006-04-20 2007-11-01 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Incorporated Methods and compositions based on shiga toxin type 1 protein
ES2614803T3 (es) 2009-01-23 2017-06-02 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Métodos y composiciones basadas en proteína tipo 2 de la toxina Shiga
US9513287B1 (en) * 2012-09-28 2016-12-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture High affinity monoclonal antibodies for detection of shiga toxin 2
US9310368B1 (en) * 2012-09-28 2016-04-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture High affinity monoclonal antibodies for detection of Shiga toxin 2 (STX2)
ES2808726T3 (es) * 2013-03-12 2021-03-01 Molecular Templates Inc Inmunotoxinas de unión a CD20 para inducir la internalización celular y procedimientos que usan las mismas
RU2573924C2 (ru) * 2013-07-11 2016-01-27 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) НЕТОКСИЧНЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШИГА ТОКСИН 2-ГО ТИПА (Stx2)
IL285403B2 (en) 2014-01-27 2023-10-01 Molecular Templates Inc Polypeptides that remove an epitope for MHC group I
US11142584B2 (en) 2014-03-11 2021-10-12 Molecular Templates, Inc. CD20-binding proteins comprising Shiga toxin A subunit effector regions for inducing cellular internalization and methods using same
JP6444486B2 (ja) 2015-02-05 2018-12-26 モレキュラー テンプレーツ, インク.Molecular Templates, Inc. 志賀毒素ａサブユニットエフェクター領域を含む多価ｃｄ２０結合分子及びそれらの強化組成物
MX2017015493A (es) 2015-05-30 2018-02-09 Molecular Templates Inc Andamiajes de la subunidad a de la toxina shiga desinmunizados y moleculas con direccion a las celulas que los comprenden.
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
IL293710B1 (en) 2016-12-07 2024-06-01 Molecular Templates Inc Shiga toxin A subunit activator polypeptides, Shiga toxin activator scaffolds and cell-targeting molecules for site-specific conjugation
US20200024312A1 (en) 2017-01-25 2020-01-23 Molecular Templates, Inc. Cell-targeting molecules comprising de-immunized, shiga toxin a subunit effectors and cd8+ t-cell epitopes
IL268443B2 (en) 2018-04-17 2024-07-01 Molecular Templates Inc HER2-targeted molecules containing Shiga toxin subunit A scaffolds, without vaccination

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999032645A1 (en) * 1997-12-23 1999-07-01 Stinson Jeffrey L Humanized monoclonal antibodies that protect against shiga toxin induced disease
US20020160005A1 (en) * 1996-11-15 2002-10-31 Trustees Of Tufts College Human neutralizing antibodies against hemolytic urmec syndrome
WO2006091677A1 (en) * 2005-02-22 2006-08-31 Jean Gariepy Yeast strains expressing ribosome-inactivating protein domain and method of using same
WO2007098201A2 (en) * 2006-02-16 2007-08-30 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Shiga toxoid chimeric proteins
US20070292426A1 (en) * 2006-04-20 2007-12-20 Michael Smith Methods and compositions based on Shiga toxin type 1 protein
US20080107653A1 (en) * 2003-07-21 2008-05-08 Akzo Nobel N.V. Hybrid Toxins Comprising Shiga-Like Toxin Subunits Fused to Eschericihia Coli Heat Labile Enterotoxin Subunits and Vaccines Thereof
CN101314616A (zh) * 2008-05-30 2008-12-03 中国人民解放军第三军医大学 肠出血性大肠杆菌o157：h7志贺毒素ⅱb表位肽及其应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5164298A (en) 1988-06-24 1992-11-17 Hsc Research Development Corporation Verocytotoxin receptor assay
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
AU669124B2 (en) 1991-09-18 1996-05-30 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing humanized chimera antibody
US5552144A (en) * 1992-01-22 1996-09-03 Microcarb, Inc. Immunogenic shiga-like toxin II variant mutants
US5747272A (en) 1994-02-14 1998-05-05 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Detection of shiga-like toxins of enterohemoragic Escherichia coli
US5968894A (en) 1994-02-22 1999-10-19 Lingwood; Clifford A. Verotoxin pharmaceutical compositions and medical treatments therewith
AU4184597A (en) 1996-09-10 1998-04-02 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Histidine-tagged shiga toxins, toxoids, and protein fusions with such toxins and toxoids, methods for the purification and preparation thereof
US7910096B2 (en) 1996-11-15 2011-03-22 Trustees Of Tufts College Human neutralizing antibodies against hemolytic uremic syndrome
WO1998020903A1 (en) 1996-11-15 1998-05-22 Trustees Of Tufts College Humanized neutralizing antibodies against hemolytic uremic syndrome
US7846435B1 (en) 1998-05-20 2010-12-07 Teijin Limited Humanized antibodies that recognize Verotoxin II and cell line producing same
ES2642565T3 (es) 2003-11-28 2017-11-16 National Research Council Of Canada Anticuerpos anticarcinoma y sus usos
WO2005075647A1 (en) 2004-02-06 2005-08-18 Nymox Corporation Humanized antibody
CA2458084A1 (en) 2004-03-12 2005-09-12 Dalton Chemical Laboratories Inc. Novel process for octreotide synthesis
CA2652999A1 (en) 2006-05-31 2007-12-13 Thallion Pharmaceuticals Incorporated Methods, compositions, and kits for treating shiga toxin associated conditions
US20090258010A1 (en) 2006-05-31 2009-10-15 Thallion Pharmaceuticals, Inc. Methods, compositions, and kits for treating shiga toxin associated conditions
WO2008080218A1 (en) * 2006-12-29 2008-07-10 Osprey Pharmaceuticals Usa, Inc. Methods of selecting and producing modified toxins, conjugates containing modified toxins and uses thereof
US20100298238A1 (en) * 2007-10-08 2010-11-25 Rutgers, The State University Nontoxic shiga-like toxin mutant compositions and methods
EP2344646A2 (en) * 2008-09-12 2011-07-20 Scarab Genomics, LLC Clean genome bactofection
ES2614803T3 (es) 2009-01-23 2017-06-02 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Métodos y composiciones basadas en proteína tipo 2 de la toxina Shiga

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020160005A1 (en) * 1996-11-15 2002-10-31 Trustees Of Tufts College Human neutralizing antibodies against hemolytic urmec syndrome
WO1999032645A1 (en) * 1997-12-23 1999-07-01 Stinson Jeffrey L Humanized monoclonal antibodies that protect against shiga toxin induced disease
US20080107653A1 (en) * 2003-07-21 2008-05-08 Akzo Nobel N.V. Hybrid Toxins Comprising Shiga-Like Toxin Subunits Fused to Eschericihia Coli Heat Labile Enterotoxin Subunits and Vaccines Thereof
WO2006091677A1 (en) * 2005-02-22 2006-08-31 Jean Gariepy Yeast strains expressing ribosome-inactivating protein domain and method of using same
WO2007098201A2 (en) * 2006-02-16 2007-08-30 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Shiga toxoid chimeric proteins
US20070292426A1 (en) * 2006-04-20 2007-12-20 Michael Smith Methods and compositions based on Shiga toxin type 1 protein
CN101314616A (zh) * 2008-05-30 2008-12-03 中国人民解放军第三军医大学 肠出血性大肠杆菌o157：h7志贺毒素ⅱb表位肽及其应用

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103343164A (zh) * 2013-06-17 2013-10-09 武汉轻工大学 产志贺毒素大肠杆菌多重pcr检测方法、试剂盒及应用
CN103343164B (zh) * 2013-06-17 2016-05-18 武汉轻工大学 产志贺毒素大肠杆菌多重pcr检测方法、试剂盒及应用
CN106604934A (zh) * 2014-06-11 2017-04-26 分子模板公司 耐受蛋白酶切割的志贺毒素a亚基效应子多肽和包含其的细胞靶向分子
CN104558167A (zh) * 2014-12-26 2015-04-29 江苏省疾病预防控制中心 检测i型志贺毒素双抗夹心法酶联免疫试剂盒及其应用
CN104558167B (zh) * 2014-12-26 2017-12-26 江苏省疾病预防控制中心 检测i型志贺毒素双抗夹心法酶联免疫试剂盒及其应用
CN115856296A (zh) * 2022-12-16 2023-03-28 华北理工大学 抗志贺氏菌的单克隆抗体及其检测中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2381954B8 (en) 2017-01-25
CA2748873C (en) 2017-09-12
AR075047A1 (es) 2011-03-02
CA2748873A1 (en) 2010-07-29
US8969529B2 (en) 2015-03-03
US9801931B2 (en) 2017-10-31
NZ593926A (en) 2013-03-28
ES2614803T3 (es) 2017-06-02
BRPI1007230B1 (pt) 2019-11-12
EP2381954B1 (en) 2016-11-02
CL2011001769A1 (es) 2012-08-31
JP2012515551A (ja) 2012-07-12
BRPI1007230A2 (pt) 2016-02-16
WO2010085539A1 (en) 2010-07-29
PE20120425A1 (es) 2012-05-03
JP5773886B2 (ja) 2015-09-02
KR20110119725A (ko) 2011-11-02
AU2010206800A1 (en) 2011-07-28
EP2381954A1 (en) 2011-11-02
US20160243210A1 (en) 2016-08-25
EP2381954A4 (en) 2012-08-01
RU2011126896A (ru) 2013-02-27
KR101832499B1 (ko) 2018-02-26
US20110318357A1 (en) 2011-12-29
MX2011007866A (es) 2011-10-06
AU2010206800B2 (en) 2016-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102292098A (zh) 基于志贺毒素2型蛋白的方法和组合物
Garcia et al. Iron and contact with host cells induce expression of adhesins on surface of Trichomonas vaginalis
Hirota et al. Identification of an antigenic epitope in Helicobacter pylori urease that induces neutralizing antibody production
Darrieux et al. Fusion proteins containing family 1 and family 2 PspA fragments elicit protection against Streptococcus pneumoniae that correlates with antibody-mediated enhancement of complement deposition
US20140023652A1 (en) Methods and compositions based on shiga toxin type 1 protein
Rosenqvist et al. Functional activities and epitope specificity of human and murine antibodies against the class 4 outer membrane protein (Rmp) of Neisseria meningitidis
US20100297664A1 (en) Paratope and epitope of anti-mortalin antibody
Tavano et al. Mapping of the Neisseria meningitidis NadA cell-binding site: relevance of predicted α-helices in the NH2-terminal and dimeric coiled-coil regions
CN116693681B (zh) 抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白a的单克隆抗体及其应用
Fahimi et al. Pleiotropic cytotoxicity of VacA toxin in host cells and its impact on immunotherapy
Kumar et al. Outer membrane protein assembly factor YaeT (omp85) and GroEL proteins of Edwardsiella tarda are immunogenic antigens for Labeo rohita (Hamilton)
US20150293118A1 (en) Cross-reactive determinants and methods for their identification
McNeilly et al. Predicted coverage and immuno-safety of a recombinant C-repeat region based Streptococcus pyogenes vaccine candidate
ES2358804T3 (es) Polipéptidos de campylobacter jejuni ubicados en superficie.
Ramalingam et al. Cloning, expression, and purification of the 27 kDa (MPT51, Rv3803c) protein of Mycobacterium tuberculosis
Sears Characterization of autotransporters of the Surface cell antigen (Sca) family in Rickettsia typhi

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20111221