JP5773886B2 - 志賀毒素タイプ2タンパク質に基づいた方法と組成物 - Google Patents
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Description
一般的に、本発明は志賀毒素関連疾患の治療および予防の分野に関する。
[本発明1001]
薬剤的に許容可能な担体と、少なくとも1つの精製ポリペプチドとを含む、Stx2に対する免疫反応を刺激するための組成物であって、該ポリペプチドが:
(i) 配列番号:1;
(ii) 配列番号:1 および 2; または
(iii) 配列番号:1, 2, および3;
並びに非Stx2タンパク質骨格を含み、該配列番号:1、配列番号:1 および 2、または配列番号:1, 2, および3が該非Stx2タンパク質骨格に挿入されており、該ポリペプチドがStx2の抗原性を持つ、前記組成物。
[本発明1002]
前記骨格がStx1と実質的に同一のタンパク質、またはその断片を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
前記ポリペプチドが配列番号:1, 2, および3 並びに非Stx2タンパク質骨格を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1004]
前記ポリペプチドが配列番号:1および2 並びに非Stx2タンパク質骨格を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1005]
前記組成物がStx1に対する免疫反応を刺激しない、本発明1001の組成物。
[本発明1006]
前記ポリペプチドが配列番号:8で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1007]前記ポリペプチドが配列番号:8で示されるアミノ酸配列を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1008]
薬剤的に許容可能な担体と、配列番号:8に示されるアミノ酸配列と少なくとも92%の同一性を持つアミノ酸配列を含む少なくとも1つの精製ポリペプチドとを含む、Stx2に対する免疫反応を刺激するための組成物であって、該ポリペプチドがStx2の抗原性を持つ、前記組成物。
[本発明1009]
前記組成物がさらにアジュバントを含む、本発明1001または1008の組成物。
[本発明1010]
(i) 配列番号:1;
(ii) 配列番号:1 および 2; または
(iii) 配列番号:1, 2, および3;
並びに非Stx2タンパク質骨格を含む、精製ポリペプチドであって、該配列番号:1、配列番号:1 および 2、または配列番号:1, 2, および3が該非Stx2タンパク質骨格に挿入されており、該ポリペプチドがStx2の抗原性を持つ、前記精製ポリペプチド。
[本発明1011]
前記骨格が、Stx1と実質的に同一のタンパク質、またはその断片を含む、本発明1010の精製ポリペプチド。
[本発明1012]
前記ポリペプチドが配列番号:1, 2, および3 並びに非Stx2タンパク質骨格を含む、本発明1010の精製ポリペプチド。
[本発明1013]
前記ポリペプチドが配列番号:1 および2 並びに非Stx2タンパク質骨格を含む、本発明1010の精製ポリペプチド。
[本発明1014]
配列番号:8に示されるアミノ酸配列と少なくとも92%の配列同一性を持つアミノ酸配列を含む精製ポリペプチドであって、該ポリペプチドが配列番号:1, 2, および3に示されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含み、該ポリペプチドがStx2の抗原性を持つ、前記精製ポリペプチド。
[本発明1015]
前記ポリペプチドが配列番号:8に示されるアミノ酸配列と93%の配列同一性を持つアミノ酸配列を含む、本発明1014の精製ポリペプチド。
[本発明1016]
前記ポリペプチドが配列番号:8に示されるアミノ酸配列と95%の配列同一性を持つアミノ酸配列を含む、本発明1015の精製ポリペプチド。
[本発明1017]
前記ポリペプチドが配列番号:8に示されるアミノ酸配列を含む、本発明1016の精製ポリペプチド。
[本発明1018]
前記ポリペプチドが配列番号:8に示されるアミノ酸配列から成る、本発明1017の精製ポリペプチド。
[本発明1019]
前記ポリペプチドが、配列番号:8に示されるアミノ酸配列の断片であり、前記ポリペプチドが配列番号:8のアミノ酸64〜122と少なくとも80%の配列同一性を持つ断片を含み、該断片が配列番号:1を含む、精製ポリペプチド。
[本発明1020]
前記断片が配列番号:1 および2 を含む、本発明1019の精製ポリペプチド。
[本発明1021]
前記断片が配列番号:1、2 および3 を含む、本発明1020の精製ポリペプチド。
[本発明1022]
前記ポリペプチドがトキソイド化されている、本発明1010〜1021のいずれか1つの精製ポリペプチド。
[本発明1023]
本発明1010〜1022のポリペプチドのいずれか1つをコードしている、単離された核酸分子。
[本発明1024]
前記核酸分子が発現制御配列に動作可能なように結合されている、本発明1023の単離された核酸分子。
[本発明1025]
本発明1023の核酸分子を含む、ポリペプチドを発現することができるベクター。
[本発明1026]
本発明1025のベクターを含む宿主細胞。
[本発明1027]
本発明1010〜1022のポリペプチドのいずれか1つを含むポリペプチドの製造方法であって:
(a) 本発明1023の核酸を宿主細胞に導入する工程、および
(b) 宿主細胞からの該ポリペプチドを精製する工程、
を含む、前記方法。
[本発明1028]
志賀毒素タイプ2(Stx2)タンパク質の11E10 エピトープに特異的に結合する抗Stx2抗体の産生方法であって、
a) 本発明1010〜1022のポリペプチドのいずれか1つで哺乳動物を免疫する工程、および
b) 該哺乳動物の組織から、または該組織を使用して作られたハイブリドーマから、Stx2タンパク質の11E10エピトープに特異的に結合する前記抗Stx2抗体を精製する工程、
を含む、前記方法。
[本発明1029]
Stx2タンパク質の11E10エピトープに特異的に結合する前記抗Stx2抗体がStx1に結合しない、本発明1028の方法。
[本発明1030]
c) インビトロ中和分析でStx2およびStx1に対する前記抗体をスクリーニングする工程であって、Stx2の細胞毒性作用の少なくとも50%を中和する抗体が、Stx2タンパク質の11E10エピトープに特異的に結合する抗Stx2抗体である、前記工程
をさらに含む、本発明1028の方法。
[本発明1031]
工程(a)がアジュバントを使用することをさらに含む、本発明1028の方法。
[本発明1032]
前記抗体がポリクローナル抗体またはその断片である、本発明1028の方法。
[本発明1033]
前記抗体がモノクローナル抗体またはその断片である、本発明1028の方法。
[本発明1034]
前記抗体が修飾抗体である、本発明1028の方法。
[本発明1035]
前記抗体がキメラまたはヒト化抗体である、本発明1028の方法。
[本発明1036]
本発明1001〜1009の組成物のいずれか1つを投与することを含む、被験者にStx2への免疫反応を誘導する方法。
[本発明1037]
本発明1001〜1009の組成物のいずれか1つを投与することを含む、被験者の志賀毒素関連疾患を治療または予防する方法。
[本発明1038]
前記志賀毒素関連疾患が溶血性尿毒症症候群である、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記志賀毒素関連疾患が大腸菌またはシゲラ・ディゼンテリエ感染に関連している、本発明1037の方法。
[本発明1040]
本発明1010〜1022のポリペプチドのいずれか1つを含む志賀毒素タイプ2(Stx2)タンパク質の11E10エピトープに特異的に結合する抗Stx2抗体またはその断片であって、該抗体が11E10抗体(ATCC 1907)、キメラ11E10抗体、またはヒト化11E10抗体の該Stx2タンパク質への結合を阻害する、前記抗体、またはその断片。
[本発明1041]
志賀毒素タイプ2(Stx2)タンパク質の11E10エピトープに特異的に結合する抗Stx2抗体、またはその断片であって、該エピトープが本発明1010〜1022のポリペプチドのいずれか1つを含み、該抗体が5C12抗体、キメラ5C12抗体、またはヒト化5C12抗体の前記Stx2タンパク質への結合を阻害する、前記抗体、またはその断片。
[本発明1042]
前記抗体が、配列番号:1, 2, および3に示される配列を含む前記ポリペプチド中のエピトープに特異的に結合する、本発明1040または1041の抗体またはその断片。
[本発明1043]
前記11E10エピトープが立体配座エピトープである、本発明1040または1041の抗体またはその断片。
[本発明1044]
前記抗体がモノクローナル抗体である、本発明1040または1041の抗体、またはその断片。
[本発明1045]
前記抗体がキメラ、ヒト化、または完全ヒト抗体である、本発明1040または1041の抗体、またはその断片。
[本発明1046]
前記抗体がポリクローナル抗体である、本発明1040または1041の抗体、またはその断片。
[本発明1047]
前記抗体がStx2と11E10抗体の間の結合を阻害し、該11E10抗体が0.50 nM以下のK d を持つ、本発明1040の抗体またはその断片。
[本発明1048]
前記抗体がStx2の酵素活性をブロックするかまたはStx2の細胞内分布を変化させる、本発明1040の抗体。
[本発明1049]
前記抗体がIgG、IgM、IgE、IgD、またはIgAである、本発明1040または1041の抗体、またはその断片。
[本発明1050]
前記抗体またはその断片がFab またはFv断片である、本発明1040または1041の抗体、またはその断片。
[本発明1051]
本発明1040〜1050の抗体のいずれか1つおよび薬剤的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
[本発明1052]
本発明1040〜1050の抗体のいずれか1つを産生するハイブリドーマ細胞株。
[本発明1053]
生体試料中のStx2の検出方法であって:
(a) 前記生体試料を本発明1040〜1050の抗体、またはその断片と、該抗体とStx2の間に複合体が形成できる条件下で接触させる工程、および
(b) 該複合体を検出する工程、
を含む、前記方法。
[本発明1054]
前記生体試料が組織、細胞、細胞抽出物、体液、または生検からのものである、本発明1053の方法。
[本発明1055]
前記複合体がELISA、RIA、ウェスタンブロット、免疫沈降、またはフローサイトメトリーを使用して検出される、本発明1053の方法。
[本発明1056]
被験者の志賀毒素関連疾患の診断方法であって:
(a) 該被験者から生体試料を取得する工程、
(b) 該生体試料を本発明1040〜1050の抗体のいずれか1つと、該抗体とStx2の間に複合体が形成できる条件下で接触させる工程、および
(c) 工程(b)の該複合体を検出する工程、
を含み、
該試料中のStx2の存在は、被験者が志賀毒素関連疾患であると診断する、前記方法。
[本発明1057]
前記志賀毒素関連疾患が溶血性尿毒症症候群である、本発明1056の方法。
[本発明1058]
前記志賀毒素関連疾患が大腸菌またはシゲラ・ディゼンテリエ感染である、本発明1056の方法。
[本発明1059]
志賀毒素関連疾患を検出するための免疫検査キットであって、本発明1040〜1050の抗体のいずれか1つと、該抗体を検出する手段とを含む、前記キット。
[本発明1060]
被験者の志賀毒素関連疾患を治療または予防する方法であって、本発明1040〜1050の抗体のいずれか1つの薬剤的有効量を該被験者に投与することを含む、前記方法。
[本発明1061]
前記志賀毒素関連疾患が溶血性尿毒症症候群である、本発明1060の方法。
[本発明1062]
前記志賀毒素関連疾患が大腸菌またはシゲラ・ディゼンテリエ感染に関連している、本発明1060の方法。
一般的に、本発明は、Stx2タンパク質の11E10エピトープの発見に関連した組成物および方法を特徴とする。11E10エピトープは、配列番号:1、2および3に示される配列セットの少なくとも1つ 、2つまたは3つを含むことを我々は発見した。本発明の組成物および方法は、志賀毒素関連疾患の検出、治療、または予防に有用であり得る。例えば、志賀毒素関連疾患(例えば溶血性尿毒症症候群および大腸菌とシゲラ・ディゼンテリエ感染に関連する疾患)を持つ、または発症のリスクがある被験者を、11E10エピトープを含むペプチドで、またはStx2タンパク質の11E10エピトープに特異的に結合する抗体で治療できる。
志賀毒素関連疾患には、志賀毒素産生シゲラ・デォゼンテリエまたは腸管出血性大腸菌(EHEC)(中でも注目すべきは血清型O157:H7)による感染から生じるものを含む。これらの感染は、溶血性貧血、血栓性血小板減少症、および腎不全によって特徴付けられる溶血性尿毒症症候群(HUS)をしばしば生じる。
本発明には、志賀毒素タイプ2(Stx2)タンパク質の11E10エピトープおよび抗体自体に特異的に結合する抗体の産生を含む。望ましくは、このような抗体は検出可能な程度にはStx1に結合しない。標的タンパク質を認識して特異的に結合する抗体の特有の能力は、志賀毒素産生大腸菌(STEC)に関連する疾患の診断と治療の両方に対する方法を提供する。本発明は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、マウスおよび他の哺乳類抗体、抗体断片、二重特異性抗体、抗体二量体または四量体、単鎖抗体(例えば、Fab、二重特異性抗体、およびFab'断片などのscFv'および抗原結合抗体断片)、抗体結合領域に基づく遺伝子組み換え結合領域、キメラ抗体、霊長類化抗体、ヒト化および完全ヒト抗体、領域欠失抗体、並びに検出可能マーカーで標識された、または毒素もしくは放射性核種と連結した抗体を含むがこれに限定されない抗体の産生を提供する。このような抗体は、当技術分野で知られている従来方法で産生される。1つの態様では、本発明は、Stx2の11E10エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体または抗体断片の産生を含み、産生には、配列番号:1、2、または3に示される配列から選択された少なくとも1つ、2つ、または3つの配列を含むポリペプチドの使用を含む。 1つの例は配列番号:8に示されるタンパク質である。
ポリクローナル抗体は、抗原の注射に続いて適当な間隔でその後追加免疫することにより、ウサギまたは他の動物に免疫化することによって産生できる。動物を出血させ、通常ELISAで、精製タンパク質に対して血清を分析する。
本発明の別の実施態様では、モノクローナル抗体は実質的に均一な抗体の集団から得られる(すなわち、集団を含む個別の抗体は、少量存在する可能性のある天然に存在する突然変異を除いて同一である)。従って、モノクローナルという用語は、別個の抗体の混合物としてではない抗体の特徴を示す。
本発明の修飾抗体には、キメラモノクローナル抗体(例えば、ヒト-マウスキメラ)、ヒトモノクローナル抗体、およびヒト化モノクローナル抗体が含まれるがこれに限定されない。キメラ抗体は、ヒト免疫グロブリン定常領域とマウスmAbから由来する可変領域を持つものなど、その異なる部分が異なる動物腫に由来する分子である(例えば、米国特許番号4,816,567 および4,816,397を参照)。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化型は、非ヒト種からの相補性決定領域(CDR)の1つ以上およびヒト免疫グロブリン分子からの骨格領域など、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片(Fv, Fab, Fab', F(ab')2または抗体の他の抗原結合部分配列など)である(米国特許番号5,585,089を参照)。
本発明は、上記の方法を使って産生された抗体(例えば、Stx2の11E10に特異的に結合する抗体)の、志賀毒素関連疾患を持つ、またはこれを発症するリスクのある被験者への投与も特徴とする。
本発明は、Stx2タンパク質に対する免疫反応を刺激する組成物を特徴とする。
実施例1
モノクローナル抗体11E10はStx2のA1サブユニットを認識する。11E10のStx2への結合は、Stx2の細胞毒性および致死作用の両方を中和するが、成熟Aサブユニットのアミノ酸は同一性が55%かつ類似性が68%であるにもかかわらず、モノクローナル抗体はStx1に結合またはこれを中和しない。この研究では、我々は、11E10エピトープを構成するStx2上のセグメントを特定し、その領域の11E10による認識がどのように毒素の不活化につながるかを究明しようとした。これらの目的に向かって、我々はキメラStx1/Stx2分子のセットを産生し、次にこれらのハイブリッド毒素を認識するための11E10の能力をウェスタンブロット分析で、毒素の中和能力をVero細胞細胞毒性分析で評価した。我々は、11E10に対するStx2上の結合エピトープを予測できる可能性のある一連の相違点について、アミノ酸配列とStx1 およびStx2の結晶構造も比較した。これらの評価を通して、11E10エピトープはStx2活性部位を取り囲む3つの不連続領域から成ると我々は結論付けた。11E10がどのようにStx2を中和するかを知るために、我々は、リボソームを標的にするための11E10/Stx2複合体の能力を調べた。インビトロ分析では、11E10のStx2への結合は毒素がタンパク質合成を阻害するのを防止するが、Vero細胞のStx2の全体的細胞分布も変化させることを見出した。11E10モノクローナル抗体のStx2への結合は、毒素の作用の全部でなくても少なくとも一部を中和し、これは毒素がリボソームに達するまたは不活性化するのを防止することによって起こるのではないかと我々は考える。
細菌の菌株、プラスミド、精製Stx1およびStx2、およびモノクローナル抗体11E10および13C4
細菌は、Luria-Bertani(LB)ブロス中またはLB寒天(Becton Dickinson and Company、メリーランド州スパークス)上、組み換えプラスミドの選択に対して必要に応じて100μg/mlのアンピシリンを補充して増殖させた。この研究で使用された細菌の菌株およびプラスミドは、表1に示されている。前述のように、Stx1 およびStx2は親和性クロマトグラフィーで精製され(Melton-CelsaおよびO'Brien (2000) p. 385-406. In Handbook of Experimental Pharmacology, vol. 145. Springer-Verlag, Berlin)、モノクローナル抗体11E10、11F11(Stx2に特異的(Perera ら,上記))、および13C4(Stx1に特異的(Strockbine ら (1985) Infect. Immun. 50:695-700))はこの研究室で産生されて、BEI Resources(バージニア州マナッサス)に寄託した。
stxA1 および stxA2の両方の部分を含む6つのキメラ毒素遺伝子を、スプライス重複延長(SOE)プロトコルのPCRで生成し(Higuchi (1989) p. 61-70. IN H.A. Erlich (ed.), PCR Technology. Stockton Press, New York)、PCR産物をpBluescript II KS (-)(Stratagene、カリフォルニア州ラホヤ)に結合した。キメラ毒素遺伝子は天然プロモーターおよびシャイン・ダルガノ配列を含み、5つのクローンの毒素発現レベルはこれらの条件下十分であった。1つのクローン(pMJS11)のAサブユニットの発現レベルを増加させるために、二回目のPCRで毒素オペロンを増幅し、最適化されたシャイン・ダルガノ配列 [TAAGGAGGACAGCTATG (最適化シャイン・ダルガノ配列はアンダーラインで、StxA2の翻訳開始部位は太字で示されている)配列番号:20]をstxA2の上流に加えた。この後者のPCR産物は、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)誘導性プロモーターを持つpTrcHis2 C発現ベクター(Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド)に結合させた。この研究で使用したすべてのプライマーを表2に示す。この研究のために作られた各構築物のDNA配列は、使用前に確認した。
Stx1 +ABC毒素は、SOEプロトコルにより、Aサブユニットの位置77のチロシン残基をセリン残基に変えることによって部分的にトキソイド化した。Y77S変異は、Vero細胞に対する50%細胞毒性用量(CD50)を、誘導培養物1 mlあたり106から 102 CD50に減少させた。Y77S変異導入後の細胞毒性のこの4桁の減少は、Stx1のY77S変異で以前報告されたものと類似している(Deresiewicz ら (1992) Biochemistry 31:3272-3280)。
Stx1 +ABCトキソイドは、前述のようにニッケル親和性カラムで精製した(Smithら (2006) Infect. Immun. 74:6992-6998)。トキソイドの濃度は、ビシンコニン酸分析(Pierce、イリノイ州ロックフォード)で決定した。ドデシル硫酸ポリアクリルアミドナトリウムゲルの銀染色により、他の小さなバンドが観察されるものの、キメラトキソイドのAおよびBサブユニットが存在する主な2つのバンドであることが判明した(データ非表示)。
His標識Stx2cを発現したクローンは、Stx2で上述のように、PCRで産生した(Robinsonら (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 103:9667-9672)。stx2dクローンは、PCRで大腸菌 EH250とプライマー2DFおよび2DRから産生した(Pierard ら (1998) J. Clin. Microbiol. 36:3317-3322)。PCR産物は発現ベクターpTrcHis2 Cに結合させた。stx2cおよびstx2dが正しく増幅されたことは配列分析で確認された。
精製されたStx1、Stx2またはキメラStx1/Stx2毒素を発現した細菌の超音波溶解物を、ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)にかけ、次に前述のようにウェスタンブロットで分析した(Smith ら、 上記)。Stx1、Stx2Aまたはキメラ毒素を含む超音波溶解物中のAサブユニットの濃度は以下のように推定した。第一に、それぞれStx1 またはStx2の精製Aサブユニットを検出したウサギ抗Stx1 および抗Stx2ウサギポリクローナル抗体の、比較的同等レベルまでの特定希釈を、NIH Image Jソフトウェア(http://rsb.info.nih.gov/nih-image)を使用して決定した。第二に、キメラ含有超音波溶解物をSDS-PAGEで分離し、結果得られたゲルをニトロセルロースに移し、上記で決定されたように希釈されたウサギ抗Stx1 および抗Stx2ウサギポリクローナル抗体の混合物でこれらのブロットをプローブした。第三に、各レーンのキメラAサブユニットに対応するバンドをNIH Image Jプログラムで定量化して、各溶解物試料中の毒素濃度を決定した。第四に、2つの追加的ポリアクリルアミドゲルに、精製Stx1、Stx2またはキメラを含む正規化溶解物の試料を(ステップ3で決定されたように)同等濃度を含むように添加した。次に毒素調製物をSDS-PAGEにかけ、その後ウサギ抗Stx1とウサギ抗Stx2ポリクローナル抗体の混合物(図1B上のパネル)(ブロット1)または11E10モノクローナル抗体(図1B下のパネル)(ブロット2)でウェスタンブロット分析を行った。これらのウェスタンブロットで使用された二次抗体は、ブロット1では1:15,000希釈(図1B上のパネル)の西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)抱合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンG(IgG) (Bio-Rad、カリフォルニア州 ハーキュリーズ)、およびブロット2では1:3,000希釈(図1B下のパネル)のHRP抱合ヤギ抗マウスIgG(Bio-Rad、カリフォルニア州 ハーキュリーズ)であった。結合された二次抗体は、ECL-Plusウェスタンブロット検出キットを使った化学発光で検出した(Amersham Bioscience、イギリス、バッキンガムシャー州リトルチャルフォント)。
Stx1、Stx2、キメラStx1/Stx2毒素、Stx2c、Stx2d、Stx2dact、またはStx2eを含む細菌からの超音波溶解物のインビトロ中和分析は、前述のように11E10を使ってVero細胞(ATCC、バージニア州マナッサス)で実施した((Marquesら (1986) J Infect. Dis. 154:338-341; Smithら., 上記)。つまり、イーグル最小必須培地(EMEM)中の毒素(1〜3個のCD50s)およびEMEM中の精製11E10モノクローナル抗体(0.5 mg/ml)を含む試料の同量を混合して、37℃ および5% CO2で2時間培養した。次に毒素抗体混合物を、96ウェルプレートのサブコンフルエントVero細胞に重ねて、48時間培養した。その後Vero細胞を固定、染色し、600 nm (OD600)での吸光度を測定した。これらの中和実験は重複して少なくとも2回行った。超音波溶解物の毒素の細胞毒性作用を中和するための11E10モノクローナル抗体の能力は、毒素のみまたは毒素と抗体を加えたウェルの細胞生存を比較することによって決定した。抗体による毒素の中和パーセントは、以下の式で計算した。中和パーセント:[(毒素+抗体ウェルの平均OD600 - 毒素のみのウェルの平均OD600 )/(細胞のみのウェルの平均OD600- 毒素のみのウェルの平均OD600)] x 100。11E10モノクローナル抗体は、野生型活性の約65%までStx2を中和した。11E10モノクローナル抗体による毒素誘導体の中和パーセントのレベルを比較しやすくするために、11E10によるStx2の中和量が100%に設定されるようにデータを正規化し、他の毒素の中和レベルはStx2のレベルに対して計算した。
体重が14〜16 gのCD-1雄マウス(Charles River Laboratories、マサチューセッツ州ボストン)から免疫前血清を採取した。これらの血清試料は、マウスがStx1またはStx2への既存の力価を持っているかどうかを判断するために、酵素免疫吸着法(ELISA)で使用した。どのマウスも、研究の開始時にはどちらの毒素にも免疫反応を示さなかった。次にマウスは、疑似接種グループ(以下陰性対照グループと呼ぶ)およびキメラトキソイドで免疫されたグループの2つのグループに分けた。陰性対照グループのマウスは、PBSとTiterMax(油中水アジュバント)(TiterMax, USA Inc.、ジョージア州ノークロス)の混合物で腹腔内免疫した。第二のグループのマウスは、TiterMaxと混合した1 ugのトキソイドで、腹腔内免疫した。マウスには、3週間ごとに合計4回追加接種をおこなった。最後の追加接種から2週間後に、陰性対照グループのマウス5匹とトキソイド免疫マウスの5匹に対してStx1の50%致死量(LD50)の10倍 (1,250 ng)を腹腔内に抗原投与し、陰性対照グループの29匹およびトキソイド免疫マウスの34匹には、Stx2のLD50の5倍(5 ng)を抗原投与した。
ウサギ網状赤血球溶解物、蛍ルシフェラーゼmRNA、およびルシフェリン基質は、Promega Corporation(ワイオミング州マジソン)から購入した。Stx2 (4 ng/μl) を同量の抗体(4 または40 ng/μlで)と混合し、この毒素/抗体混合物の1 μl を網状赤血球溶解物9 μl と混合した。混合物を30℃で培養して、毒素に溶解物中のリボソームを不活化させた。1時間後、ルシフェラーゼmRNAの1アリコートおよび70℃で2分加熱しておいたアミノ酸を加え、溶液をさらに90分間培養して、インビトロのタンパク質合成を進行させた。すべての分析は、3回行った。ルシフェラーゼ活性は、溶解物混合物1 μl を透明96ウェル(Fisher Scientific、ペンシルバニア州ピッツバーグ)の20 μlのルシフェリン基質 に加えることによって測定した。発光は、10分露光下Kodak Image Station 440CFで検出した。発光シグナルは、単一ウェルに対応する円形領域内の合計シグナル強度の総和によって分析した。
8ウェル組織培養スライド(Thermo Fisher Scientific、ニューヨーク州ロチェスター)に、1 X 105 細胞/mlの濃度で Vero細胞を播種し、5% CO2の雰囲気下、37℃で24時間接着させた。Stx2 (10 ng/mlの0.2 ml ) を10 ngの精製11E10モノクローナル抗体と混合、または陰性対照としてPBSと混合した。抗体/毒素またはPBS/毒素溶液をVero細胞と6時間培養し、その後細胞を緩衝化ホルマリン(Formalde-Fresh, Fisher Scientific, Pittsburg, PA)で固定し、PBS中0.001% Triton-X100 (Pierce、イリノイ州ロックフォード)で透過処理した。すべての免疫染色手順は、3%ウシ血清アルブミン(BSA, Sigma、ミズーリ州セントルイス)を含むPBS中で行なわれた。細胞中のモノクローナル抗体11E10の存在は、Alexa-Fluor 488標識ロバ抗マウスIgG(Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド)で検出した。中毒細胞中の合計Stx2をウサギ抗Stx2ポリクローナル抗体で標識して、Alexa-Fluor 488抱合ロバ抗ウサギIgGが二次抗体(Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド)として使用した。Stx2およびエンドソームの二重標識は、それぞれ抗Stx2モノクローナル抗体11F11 (Perera ら, 上記), BEI Resources、バージニア州マナッサス)および抗EEA1 (C-15)ヤギポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology、カリフォルニア州サンタクルーズ)、並びにAlexa-Fluor標識二次抗体で行った。適切な一次および二次抗体と培養した後、37℃で20分間細胞をホルマリンで固定し、スライドをSlowFade培地(Invitrogen、カリフォルニア州カースルバッド)と共に乗せた。反射光蛍光アタッチメント付きOlympus顕微鏡およびSpot CCDデジタルカメラ(Diagnostic Instrument Products、ミシガン州スターリングハイツ)で、結合フルオロフォア標識二次抗体の40倍拡大イメージを取得した。蛍光イメージはAdobe Photoshop(Adobe Systems、カリフォルニア州サンノゼ)で処理して重ね合わした。
初期キメラ毒素のモノクローナル抗体11E10との相互作用
11E10モノクローナル抗体と相互作用するStx2の部分を決定するために、我々はstxA1の領域に対応する位置に挿入されたstxA2遺伝子の異なる領域を含む6つのキメラ毒素オペロンの初期セットを構築した(図1A)。精製Stx1、Stx2または6つの異なるキメラStx1/Stx2毒素を発現する大腸菌DH5αの溶解物のウェスタンブロットを、11E10モノクローナル抗体でプローブした。抗体は、Stx2およびStx2 Aサブユニットの29〜297、1〜158、および29〜128領域からのアミノ酸を含むキメラ毒素と強く反応した(図1B)。11E10によって認識されるStx2の最小部分を持つキメラ毒素は、弱くではあるが、StxA2、領域42〜49からの8つのアミノ酸のみを含んでいた。
キメラ毒素の第一のセットのウェスタンブロットおよび中和分析では、11E10エピトープは、毒素検出のためにStx2 Aサブユニットのアミノ酸42〜49(配列番号:1)を少なくとも必要とすることが示されたが、完全な認識および毒素中和のためには追加的アミノ酸が必要であることも判明した。従って、Stx1およびStx2からの成熟Aサブユニットのアミノ酸配列は、11E10によるStx2の認識および中和に関与する可能性のあるアミノ酸の追加的固有ストレッチを特定するように整列した。次に、Stx (Fraser ら (1994), 上記)とStx2 (Fraserら (2004), 上記)の結晶構造(Protein Data Bankの受入番号はそれぞれ1RQ4および1R4P)をDeep View/Swiss-PDBビューアーを使用して比較し、三次元構造中の毒素間での配列の領域の位置の違いとこのような領域のお互いの近接性を評価した。前述のように、Stx2 Aサブユニットの残基42〜49にわたる8つのアミノ酸は11E10結合部位の一部を形成し、以下、領域Aまたは配列番号:1と称する(図2A、領域A強調アミノ酸)。領域Aからの8つのアミノ酸をStx2結晶構造の中で見ると、それらは毒素構造の中で大きな屈曲を形成しているように見え(図2Bにおいて緑色で示され、黒矢印によって示され、また図2Cにおいても同様に示されている)、さらに、それらはStx2の外面上の、アミノ酸167の周りの活性部位の裂け目の近くにあった。
領域BおよびCが11E10エピトープの一部であるかどうかを判断するために、Stx1上の対応する領域の代わりに、Stx2の領域A、BまたはCのさまざまな組み合わせを含むキメラ毒素の第二のセットを産生した(図3A)。次に、Stx1、Stx2またはキメラ毒素のウェスタンブロットを11E10でプローブした(図3B、下のパネル)。11E10モノクローナル抗体は、領域Aを含むすべての毒素を検出した(Stx2、Stx1 +A、Stx1 +AB、Stx1 +AC、およびStx1 +ABC)(図3B、下のパネル)。領域Aを持たない毒素は11E10モノクローナル抗体では検出されず(Stx1およびStx1 +BC)、これは、領域Aが11E10エピトープの必須成分であることを確認する知見である。しかし、領域AおよびB(Stx1 +AB またはStx1 +ABC)を取り込んだ2つのキメラ毒素は、11E10モノクローナル抗体によって、領域Aのみまたは領域Aと領域Cの組み合わせを含むキメラ毒素よりも強く検出されるように思われた(図3B、下のパネル)。これらの結果をまとめると、領域AおよびBは両方とも毒素の完全11E10認識にとって重要であることを示す。
11E10によってStx2変異体のどれが認識および/または中和されるかを判断するために、Stx1、Stx2、またはStx2変異体(Stx2c、Stx2d、Stx2dactおよびStx2e)をウェスタンブロットで分析した。Stx2およびすべてのStx2変異体は11E10によって認識されたが、Stx2eはより少ない程度で検出された(図4A、下のパネル)。ウェスタンブロット形式での11E10によるStx2eのこの弱い検出は、コロニーブロットで11E10はStx2e産生株を検出できなかったという我々の以前の報告と一致している(Perera ら, 上記)。Stx2eは、Stx2と比較して、領域Bに2つの保存アミノ酸の相違点を持つ(THISV (配列番号:2)よりはむしろAHISL (配列番号:19))。また、領域Aに直接隣接するいくつかのアミノ酸配列の相違点もある(示されていない)。これらの相違点は、ウェスタンブロット上での11E10によるStx2eの認識が低下したためではないかと我々は推測する。
次に我々は、Stx1 +ABCハイブリッド分子のトキソイド化誘導体が、マウスのStx2に対して血清中和または保護反応を誘発するかどうかを解明しようとした。マウスのグループをキメラトキソイドまたは対照としてPBSで免疫した。次に、5匹のトキソイド免疫マウスおよび5匹のPBS免疫マウスの血清を、抗Stx1中和反応について評価した。PBS免疫マウスの血清はどれもStx1中和活性を含んでいなかった。以前の研究から予測されるように、5匹のトキソイド免疫マウスすべてがStx1に対する中和抗体を持っていた(Smith ら (2006) Vaccine 24:4122-4129、Wen ら, 上記)。これらの5匹のマウスの血清に対する抗Stx1中和力価の平均は、バックグランドより4.0 ± 0.9ログ上であった。残りの34匹のトキソイド免疫マウスの血清のうち11個がStx2に対する中和反応をいくらか持っていたが、29匹のPBS免疫マウスの血清のどれも抗Stx2反応を示さなかった(データ非表示)。
a LD50は、Stx1およびStx2に対してそれぞれ125 および1 ng/マウスとして過去に決定した。
b 抗原投与された時のマウスの平均体重は 47.1 gであった。
c フィッシャーの直接確率検定を用いて、グループCおよびD中の生存割合を比較し、p値は0.2667であった。
11E10エピトープがStx2活性部位の切れ目の周りの表面ループから成っているようであるという我々の知見から、11E10はタンパク質合成を阻害する毒素の能力をブロックすることによってStx2を中和するという仮説を立てた。したがって、我々は、ルシフェラーゼmRNAを添加したウサギ網状赤血球タンパク質合成分析で、11E10モノクローナル抗体がStx2のリボソーム不活化作用を中和できるかどうかを評価した。ルシフェラーゼ・レポータータンパク質からのシグナルを、毒素を添加しなかった時に測定されたシグナルと比較して約60%減少させた毒素の濃度が選択された(図5)。分析への11E10の添加によって、Stx2が存在する場合でもウサギ網状赤血球溶解物中でタンパク質合成を起こすことができたが、アイソタイプ適合の無関係な抗体では起こらなかった(図5)。
インビトロタンパク質合成分析で、モノクローナル抗体11E10は、Stx2によるタンパク質合成阻害を防止することがわかったが、我々はさらに、11E10はStx2が中毒Vero細胞の細胞質中のリボソームに達するのを妨げるかもしれないという仮説を立てた。従って、我々は、モノクローナル抗体11E10が標的細胞中のStx2局在を変化させるかどうかを判断しようとした。(11E10結合Stx2はVero細胞に結合でき、11E10はVero細胞に結合したStx2に付着できることを我々は以前見出した(データ非表示))。Stx2を11E10またはPBSと混合して、抗体/毒素またはPBS/毒素混合物をVero細胞と共に培養した。次に、ウサギポリクローナル抗体抗Stx2およびフルオロフォア標識抗ウサギIgG二次抗体で、標的細胞中のStx2の分布を可視化した(図6)。Stx2は、11E10が存在しない場合は細胞質全体に渡って分布されているように見える(図6A)が、11E10の存在下では大部分が核周囲体に集中したままに見える(図6B)。毒素/11E10混合物と共に培養した細胞を抗マウスIgGで染色した時、11E10はStx2と同じ核周囲点状構造で観察された(図 6C)11E10モノクローナル抗体は、毒素が存在しない場合には細胞に入ることができなかった(図6D)。核の周りの点状体内の11E10結合Stx2の局在は、抗体毒素複合体は細胞に入ったが細胞質へは入らなかったことを示唆した。従って我々は、中毒細胞を早期エンドソームマーカー・モノクローナル抗体EEA-1で免疫染色することによって、Stx2または11E10結合Stx2は早期エンドソーム内で局在化しているかを確かめた。染色パターンを重ねた時に橙黄色で示されるように、11E10結合Stx2で中毒させた細胞のStx2の多くは、早期エンドソームマーカーと共局在化した(図6E〜G)。対照的に、Vero細胞をStx2飲みと培養した場合は、毒素は細胞質全体に渡って見られ、少量のみが早期エンドソームマーカーと共局在化した(図6H〜J)。
結果から、11E10モノクローナル抗体エピトープは立体配座であり、結晶構造の毒素の活性部位に近いと思われるStx2 Aサブユニットの3つの非直線領域を含むことが示される(図2C)。11E10エピトープを特定する我々の戦略には、キメラStx1/Stx2毒素の産生を含み、これは、Stx2配列をStx1骨格に配置することにより抗体エピトープの三次元三次構造が維持され、11E10モノクローナル抗体による認識が可能になるという仮説に基づいていた。ウェスタン分析で11E10による認識を可能にしたStxA2の最小領域は、8つのStx2アミノ酸(42NHTPPGSY49) (配列番号:1)からのみ構成されることを我々は見出した。しかし、Stx2(領域A)からのこれらの8つのアミノ酸のみを持つキメラStx1/Stx2は、11E10モノクローナル抗体によって中和されなかった。11E10はStx2を中和するので、我々が特定した8つのアミノ酸は11E10エピトープの必須領域から成るものの、完全な中和エピトープを含まないと考えた。我々はさらに、Stx1 とStx2のアミノ酸配列および結晶構造両方における相違を分析し、11E10の認識および中和に関与している可能性のあるStx2上の追加的領域を特定しようとした。これらの比較を通して、11E10エピトープに寄与する可能性のあるStx2のセグメントの2つ以上を特定した。実際に、これらの領域がStx1上の対応セグメントを置換するために使用される場合、11E10による最も完全な認識および中和のためには、3つの領域すべてが必要であることを我々は見出した。
記述された本発明の方法および組成物のさまざまな変更およびバリエーションは、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者にとっては明らかである。本発明は、特定の望ましい実施態様に関連して記述されているが、当然のことながら、請求されている本発明はこのような特定の実施態様に不当に制限されるべきではない。
Claims (11)
- (i) 配列番号:1;
(ii) 配列番号:1 および 2; または
(iii) 配列番号:1, 2, および3;
並びに非Stx2タンパク質骨格を含む、精製ポリペプチドであって、該配列番号:1、配列番号:1 および 2、または配列番号:1, 2, および3が該非Stx2タンパク質骨格に挿入されており、該ポリペプチドがStx2の抗原性を持つ、前記精製ポリペプチド。 - 前記骨格が、Stx1と実質的に同一のタンパク質、またはその断片を含む、請求項1の精製ポリペプチド。
- 配列番号:8に示されるアミノ酸配列と少なくとも75%の配列同一性を持つアミノ酸配列を含むか、配列番号:8に示されるアミノ酸配列と少なくとも92%の配列同一性を持つアミノ酸配列を含むか、または配列番号:8のアミノ酸64〜122と少なくとも80%の配列同一性を持つ断片を含む、請求項1または2の精製ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドがトキソイド化されている、請求項1〜3のいずれか1つの精製ポリペプチド。
- 請求項1〜4のポリペプチドのいずれか1つをコードしている、単離された核酸分子。
- 請求項5の核酸分子を含む、ポリペプチドを発現することができるベクター。
- 請求項6のベクターを含む宿主細胞。
- 志賀毒素タイプ2(Stx2)タンパク質の11E10 エピトープに特異的に結合する抗Stx2抗体の産生方法における、請求項1〜4のいずれか1つのポリペプチドの使用であって、該方法が、
- 請求項1〜4のいずれか1つのポリペプチドで非ヒト哺乳動物を免疫する工程であって、任意でアジュバントを使用することをさらに含む、前記工程、
- 該非ヒト哺乳動物の組織から、または該組織を使用して作られたハイブリドーマから、Stx2タンパク質の11E10エピトープに特異的に結合する前記抗Stx2抗体を精製する工程、および任意で
- インビトロ中和分析でStx2およびStx1に対する前記抗体をスクリーニングする工程であって、Stx2の細胞毒性作用の少なくとも50%を中和する抗体が、Stx2タンパク質の11E10エピトープに特異的に結合する抗Stx2抗体である、前記工程
を含む、前記使用。 - 医薬として使用するための、請求項1〜4のいずれか1つのポリペプチド。
- 被験者の志賀毒素関連疾患を治療または予防するための、請求項1〜4のいずれか1つのポリペプチド。
- 前記志賀毒素関連疾患が溶血性尿毒症症候群、または大腸菌もしくはシゲラ・ディゼンテリエ感染に関連する疾患である、請求項10のポリペプチド。
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