CN115856296B - 抗志贺氏菌的单克隆抗体及其检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗志贺氏菌的单克隆抗体，具体涉及一种可以结合福氏志贺氏菌的蛋白YhdP的包含特定序列的分离的抗体或其抗原结合部分，该YhdP单克隆抗体可以用于检测食品和临床样品中福氏志贺氏菌。

Description

抗志贺氏菌的单克隆抗体及其检测中的应用

技术领域

本发明涉及基于免疫测定的样品中微生物检测领域，更具体地，本发明涉及用于检测福氏志贺氏菌的方法。

背景技术

福氏志贺氏菌也称福氏痢疾杆菌，是一种非能动的，非孢子形成的，兼性厌氧革兰氏阴性菌，临床上可引起细菌性痢疾，肠道的炎症反应是志贺氏菌病的一个重要特征，主要表现为结肠的水肿、溃疡及炎症。大约99％的病例发生在发展中国家，儿童和灵长类动物有较高的感染率和死亡率。对公共卫生造成了重大的食源性威胁。

福氏志贺氏菌主要通过粪便-口服途径传递。其它可能的传播方式可以来自摄取污染的食物或水和与无生命物体的皮下接触。福氏志贺氏菌感染剂量很低；仅需要100-200个细菌就能引起临床感染。但由于近年来，福氏志贺氏菌的耐药性不断增强，给临床治疗带来了较大困难。因此需要进一步研究抗福氏志贺氏菌的感染机制，从而研制预防福氏志贺氏菌的新的抗菌剂。

细菌细胞包膜是与环境和其他生物的第一道防线和接触点。因此，包膜对于细菌的存活和生理学至关重要，并且通常是抗菌剂的常用目标。革兰氏阴性菌具有由内膜和外膜(分别为IM和OM)分隔的多层包膜。OM是许多抗菌剂的屏障，因为它的脂质结构不对称，磷脂组成内小叶，脂多糖(LPS)组成外小叶。由于脂质合成发生在IM处，因此磷脂和LPS在生长过程中通过细胞包膜运输并在OM处不对称组装。磷脂如何转运到OM仍然未知。有研究表明YhdP通过一种未知的机制参与这一过程。YhdP属于AsmA样氏族，包含与脂质转运蛋白同源的结构域。数据显示，YhdP及其旁系同源物TamB和YdbH在细胞包膜中执行基本功能时是多余的，但并不等效。在AsmA样副同源物中，只有YhdP，TamB和YdbH的组合损失是致命的，且这些蛋白质是OM脂质稳态所必需的，并提出它们是OM生物发生所需的长期需要的磷脂转运蛋白。革兰氏阴性菌的特征是具有两个膜。已经确定了革兰氏阴性外膜生物发生所需的系统，但新合成的磷脂从内膜运输到外膜所需的系统，YhdP蛋白与这一过程有关。

福氏志贺氏菌感染的主要特征在于主要由侵入质粒抗原(IPA)蛋白和外膜蛋白介导的肠粘膜侵入。外膜蛋白参与在结肠上皮细胞壁形成突出的小孔，以便侵入结肠中的其它邻近细胞，这有利于细菌的细胞内和细胞间运动。Yhdp蛋白存在于外膜OM上，可作为检测福氏志贺氏菌侵入细胞后的特征蛋白。

用于鉴定福氏志贺氏菌的常规方法基于纯培养物中的分离，生化和血清学试验。这种方法需要大量的时间来实施，并且也是昂贵的。

本领域中用于快速检测福氏志贺氏菌的检测系统较少。因此，需要产生单克隆抗体用于降低成本，开发基于单克隆抗体的简单和快速鉴定福氏志贺氏菌的方法和试剂盒。

发明内容

本发明针对上述问题，目的在于提供一种可产生针对YhdP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，YhdP单克隆抗体，以及该抗体的制备方法和应用。

本发明采用如下技术方案：0010.一方面，本发明实施例公开了一种可产生YhdP单克隆抗体的杂交瘤细胞株以及YhdP单克隆抗体的制备方法。其包括：

步骤(1)采用纯化的YhdP重组蛋白作为免疫原免疫动物体Balb/c小鼠；

步骤(2)将骨髓瘤细胞SP2/0与免疫后的所述动物体的B淋巴细胞融合，得到杂交瘤细胞；

步骤(3)筛选特异性杂交瘤细胞阳性克隆，对所述阳性克隆进行细胞克隆化，筛选出稳定分泌YhdP单克隆抗体的杂交瘤细胞，所述筛选特异性杂交瘤细胞阳性克隆通过ELISA法进行；

步骤(4)获得YhdP单克隆抗体。

进一步，步骤(4)中，所述获得YhdP单克隆抗体包括：0016.体外培养所述稳定分泌YhdP单克隆抗体的杂交瘤细胞，分离纯化培养液，得到YhdP单克隆抗体。

本发明还提供了通过免疫荧光，蛋白质印迹，间接平板ELISA或斑点ELISA检测食品和临床样品中福氏志贺氏菌的方法和试剂盒。

ELISA法鉴定本发明的单克隆抗体类型为IgG2b型。

一方面，本发明实施例公开了一种分离的抗体或其抗原结合部分，其结合福氏志贺氏菌的蛋白YhdP，其中，所述抗体或其抗原结合部分包含如

SEQ ID NO:1所示的HCDR1、如SEQ ID NO:2所示的HCDR2和如

SEQ ID NO:3所示的HCDR3的重链可变区以及包含如SEQ ID NO:4所示的LCDR1、如SEQ ID NO:5所示的LCDR2和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3的轻链可变区。

在一个实施方式中，分离的抗体或其抗原结合部分的重链可变区(VH)氨基酸序列为SEQ ID NO:7和轻链可变区(VL)氨基酸序列为SEQ ID NO:8。

在一个实施方式中，分离的抗体或其抗原结合部分的包含如

SEQ ID NO:9所示的重链和如SEQ ID NO:10所示的轻链。

编码上述分离的抗体或其抗原结合部分的核苷酸。

一种载体，其包含能够编码上述分离的抗体或其抗原结合部分的核酸分子。0024.一种细胞，其包含上述载体。

本发明的有益效果：0026.本发明应用重组YhdP蛋白为免疫原，免疫Balb/c小鼠，采用经典的细胞融合技术获得稳定分泌YhdP单抗的杂交瘤细胞。其分泌的YhdP单克隆抗体可以用于蛋白质印迹，间接平板ELISA或斑点ELISA检测食品和临床样品中的福氏志贺氏菌。

附图说明

图1免疫荧光检测福氏2a志贺菌301株感染后的定位

图2感染0h、6h、12h、24h、36h、48hWestern Blot监测

具体实施方式

本发明提供了产生抗福氏志贺氏菌YhdP抗体的方法，包括以下步骤：将预先用福氏志贺氏菌全细胞裂解物免疫的产生小鼠脾细胞的抗体与骨髓瘤B细胞融合；

培养杂交瘤细胞株，产生单克隆抗体，将产生抗体的小鼠脾细胞与骨髓瘤B细胞融合；选择对福氏志贺氏菌显示高特异性和亲和力的单克隆抗体。

进一步对产生YhdP抗体进行测序，以发现产生的抗体具有包含

SEQ ID NO:9所示区域的重链：以及包含SEQ ID NO:10所示区域或其一部分的轻链。

在下面的具体实施例中进一步解释本发明，这些具体实施例仅仅是为了举例说明，而不应被解释为限制本发明的范围。

实施例

实施例1-细菌菌株

福氏2a志贺菌301株，从北京市昌平区腹泻患者粪便标本中分离，命名为S.flexneri 2astr.301(简称Sf301)。该菌株一直作为我国福氏2a志贺菌血清型的标准株，由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供。

实施例2-制备抗福氏志贺氏菌YhdP单克隆抗体

(a)YhdP抗原的制备

收获的Sf2a301重悬于无菌水中，加入质量终浓度20g/L溶菌酶处理，加入裂解液振荡裂解后，提取DNA。以此为模板进行PCR反应扩增YhdP的基因，反应条件为：94℃预变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s；72℃延伸3min，共进行30个循环。扩增产物测序正确后克隆入pcDNA3.1中。重组质粒转化宿主菌E.coli DH5α中，阳性克隆接种于LB培养液中，加入终浓度为1mmo1/LIPTG进行诱导，诱导后样品进行SDS-PAGE电泳分析。SDS-PAGE结束后电转移至硝酸纤维素膜，抗His单克隆抗体鉴定。表达产物鉴定正确后，将200ml诱导菌离心后收集菌体，超声裂解后，收集上清，采用Invitrogen公司Ni2+-NTA蛋白纯化试剂盒，对目的蛋白YhdP进行亲和纯化。

(b)小鼠的免疫

用纯化的50μg目的蛋白YhdP混合50μg弗氏完全佐剂(Sigma，India)肌肉免疫BALB/c小鼠(6周龄，雄性)。随后加强免疫两次。

免疫小鼠血清的抗体反应性通过ELISA测定，挑选出最高滴度值为1:16000的小鼠。

(c)通过杂交瘤技术产生单克隆抗体

选择抗体特异性最高的小鼠进行融合反应。

制备饲养层细胞：细胞融合前1-2天制备并饲养巨噬细胞。在96孔板上铺一层饲养细胞层，每孔2×10⁴个细胞。然后置于37℃，6％的CO₂培养箱中培养。0045.无菌取脾细胞，悬浮于5ml HAT培养基中，将1×10⁸/ml脾细胞与

2×10⁷/ml骨髓瘤细胞SP2/0混合，加30ml不完全培养基混匀。1000r/min离心5-10min，将上清尽量吸净，加入预热40℃的50％PEG(PH＝8.0)1ml，边加边轻轻搅拌，然后加入不完全培养基，静置10min，1000r/min离心5min，弃上清，加入HAT培养基重悬，分装96孔板，置于37℃，6％的CO₂培养箱中培养。融合两周后筛选杂交瘤细胞。

通过限制性稀释方法将含有阳性细胞的孔克隆到96孔组织培养板中。ELISA筛选杂交瘤细胞，在间接ELISA中只有8个克隆给出强阳性信号；其中，克隆YhdP-C3-8对YhdP表现出最高的亲和力。选择该克隆以进一步大规模生产抗体。

实施例3-单克隆抗体的测序

(a)mRNA分离

在含有10％(vol/vol)胎牛血清的Eagle培养基中，在5％CO₂湿化室中培养产生抗YhdP抗体的杂交瘤细胞YhdP-C3-8，所述胎牛血清补充有100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素。在细胞生长至密度为10⁶个细胞/ml后，通过以1000×g离心5分钟将它们离心收获。

对于总RNA分离，在含有5×10⁶个细胞/ml的RNA裂解溶液(Sigma，USA)中匀浆细胞，然后根据制造商的说明进行RNA提取。

(b)cDNA合成，免疫球蛋白可变区的PCR扩增

用随机的六脱氧核糖核苷酸引物从mRNA模板合成第一链cDNA。重链(VH)和轻链(VL)的可变区用Taq DNA聚合酶从第一链cDNA中扩增，PCR 30个循环(1个循环在94℃为1分钟，在55℃为1分钟，在72℃为1分钟)。引物

Yh-H-1(SEQ ID NO:11)和Yh-H-2(SEQ ID NO:12)用于扩增VH；引物

Yh-L-1(SEQ ID NO:13)和Yh-L-2(SEQ ID NO:14)用于扩增VL。对扩增的可变重链(SEQ ID NO:9)和轻链(SEQ ID NO:10)产物进行测序，并使用Kabat数据库进行免疫球蛋白的同源性搜索。

实施例4-免疫荧光检测福氏2a志贺菌301株感染后的定位0054.将生长状态良好的Hela细胞传孔板中，次日，每孔加入福氏2a志贺菌301株，分别用多聚甲醛固定感染福氏2a志贺菌301株后的细胞6h、8h、12、24h后的细胞，室温固定20min。弃多聚甲醛，用PBS洗3遍，每次5min，加入0.1％Triton-X-100/PBS，室温透化10min，PBS清洗后，加入BSA室温封闭2h，将YhdP单抗以1:200比例稀释，加入培养皿中，孵育1h后，4℃放置过夜，第二天，用PBST清洗3遍，加入1:400山羊抗小鼠IgG/Dylight二抗，室温避光孵育1h，用PBST清洗2抗，荧光显微镜观察(见图1)。结果显示YhdP单抗可以定位福氏2a志贺菌301株在细胞中的位置。

实施例5-蛋白质印迹分析(Western Blot)

将生长状态良好的Hela细胞传孔板中，次日，每孔加入福氏2a志贺菌301株，感染6h、12h、24h、36h、48h后收获细胞，PBS洗细胞2次，将细胞沉淀中加入100μlPIPA裂解液，轻轻混匀，冰浴裂解30min，离心收集上清，用BCA蛋白定量方法定量细胞裂解液的蛋白浓度，调整蛋白浓度一致，加上样缓冲液制备成蛋白样品，100℃加热变性后，将蛋白样品用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后电转至硝酸纤维素薄膜上。转模完成后，经脱脂牛奶封闭，加YhdP抗体过夜，然后用PBST洗涤三次，加入抗鼠IgG Dy800二抗，室温下避光孵育40min，PBST洗涤三次，之后用Odyssey进行扫描鉴定。结果显示YhdP抗体能够识别福氏2a志贺菌301株感染后的蛋白裂解物(参见图2)。

实施例6-间接平板酶联免疫吸附测定

将100μl体积的福氏2a志贺菌301株或鼠伤寒沙门氏菌制剂加入微量滴定孔中，并用5％牛血清白蛋白(BSA)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中封闭。用PBS洗涤后，加入由小鼠产生的YhdP抗体，将板在37℃孵育60分钟。洗涤孔，然后加入二抗(山羊抗小鼠IgG-HRP，1:1000)并在37℃孵育60分钟。在用PBS再次洗涤之后，向孔中加入100μl TMB/H₂O₂底物，并在室温下孵育约10分钟。结果清楚显示单克隆抗体对福氏志贺氏菌可以特异性识别，但不识别鼠伤寒沙门氏菌。

本发明涉及的部分核苷酸和氨基酸序列如下：

Yh-H-1:GTGTGT GCTTGAAGCCAGTG(SEQ ID NO:11)

Yh-H-2:GTCTTGGAGCGGAGTCAACTCC(SEQ ID NO:12)

Yh-L-1:GAAGAGA TTGTTGCAGC TGGACC(SEQ ID NO:13)

Yh-L-2:AATAAG TGATGCCATT ACTAT(SEQ ID NO:14)

HCDR1：GRFTISRDGGG(SEQ ID NO:1)

HCDR2：CKSLGQDT(SEQ ID NO:2)

HCDR3：YGDSQSIW(SEQ ID NO:3)

LCDR1：VTVLDKLSRLGAGK(SEQ ID NO:4)

LCDR2：WLVNTR(SEQ ID NO:5)

LCDR3：GYGMHWVRQ(SEQ ID NO:6)

重链可变区

GLLEGYLMTPYAKMYSKQIEGSSSVKGRFTISRDGGGWTSRQLFRGCRQACKSLGQDTYTELRL AGKDPFVIQSRLGSSCPTGTTSNGLITIQYGDSQSIWDGCRPASLDHVWLVNTRKLFS(SEQ ID NO:7)

轻链可变区

TYTGQELRLPTGGEGFVIQYPQTVTVLDKLSRLGAGKDSSCPVLISGKQYGDWLVNTRDGCRET IQVTGTSASLSQSIDHVWVVQPLVESGYGMHWVRQGGGRSLRLSCTQS(SEQ ID NO:8)

重链

GLLEGYLMTPYAKMYSKQIEGSSSVKGRFTISRDGGGWTSRQLFRGCRQACKSLGQDTYT

ELRLAGKDPFVIQSRLGSSCPTGTTSNGLITIQYGDSQSIWDGCRPASLDHVWLVNTRKLFS 0077.WGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNTQALTSG0078.VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSCVGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTPECPP 0079.CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDLHHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK 0080.TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQVFLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPLMY 0081.TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTMIVLDSDGSFFLYSKLT 0082.VDKSRWQQGNVFSCSVSNEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:9)

轻链

TYTGQELRLPTGGEGFVIQYPQTVTVLDKLSRLGAGKDSSCPVLISGKQYGDWLVNTRDGCRET IQVTGTSASLSQSIDHVWVVQPLVESGYGMHWVRQGGGRSLRLSCTQSSWDQPEDFATYYCQQLNSFPS PAVLQSSTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVVSVLTVLFYPREQVAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSAVEWESANNDYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTVDNEKSRGEC(SEQ ID NO:10)

Claims (5)

1.一种分离的抗体或其抗原结合部分在制备检测食品和临床样品中福氏志贺氏菌试剂盒中的应用，其中，所述抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、如SEQID NO:2所示的HCDR2和如SEQ ID NO:3所示的HCDR3的重链可变区以及包含如SEQ ID NO:4所示的LCDR1、如SEQ ID NO:5所示的LCDR2和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3的轻链可变区。

2.如权利要求1所述的应用，检测方法为免疫荧光。

3.如权利要求1所述的应用，检测方法为蛋白质印迹。

4.如权利要求1所述的应用，其中分离的抗体或其抗原结合部分包含如所SEQ ID NO:7所示的重链可变区和如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。

5.如权利要求1所述的应用，其中分离的抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO:9所示的重链和如SEQ ID NO:10所示的轻链。