CN111560073B - Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Taq酶5’‑3’聚合酶活性封闭单克隆抗体，其包含含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区和含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区，所述LCDR1的序列如SEQ ID NO：3所示，所述LCDR2的序列如SEQ ID NO：4所示，所述LCDR3的序列如SEQ ID NO：5所示，所述HCDR1的序列如SEQ ID NO：7所示，所述HCDR2的序列如SEQ ID NO：8所示，所述HCDR3的序列如SEQ ID NO：9所示。本发明还公开了所述的单克隆抗体的应用。本发明的单克隆抗体的封闭效果好，封闭率达到近100%。

Description

Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域， 具体地说，是关于一种Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体及其应用。
背景技术
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是体外合成双链DNA的一种方法，其原理类似于天然DNA的复制过程，其特异性主要依赖于其目的片段两端互补的特异性引物。典型的PCR反应有三个步骤：变性，退火，延伸，经过多次循环反应，获得目的片段。
目前，提高PCR扩增特异性的方法有很多，最简单的方法就是采用热启动酶扩增。普通的DNA聚合酶最适温度是72℃，此时酶的活性最佳，小于此温度，酶具有较弱活性，5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性均可发挥作用。这样，在PCR扩增由低温上升至高温的过程中，酶发挥较弱的活性，体系极易错配或形成引物二聚体，尤其是当设计的引物3’端是G或C，错配的链很难重新解开。要提高PCR扩增的特异性和降低反应错配率，可以人为的控制酶的活性，在热启动温度之前让酶不具备活性，这样就避免了在升温过程中（或配置反应体系）发生链的错配，从而保证扩增的特异性。
鉴于单克隆抗体与抗原结合的高亲和力特性，可以利用单克隆抗体封闭聚合酶的聚合酶活性。抗体法热启动酶可以提高PCR扩增的特异性，提高PCR产物的产量，增加长片段的检出率。
聚合酶是生命科学研究的基本工具，在高校、研究所等科研机构和生物技术公司应用极其广泛。成本低廉地生产封闭抗体将大大降低抗体法热启动聚合酶的生产成本。现有的Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体的封闭率通常只在90%左右，且封闭1 U的Taq酶5’-3’聚合酶活性需要的抗体量比较大。因此亟待一种封闭效果好的Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体。
发明内容
本发明采取杂交瘤技术制备抗Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体，筛选到可以完全封闭Taq酶5’-3’聚合酶活性的单克隆抗体，获得分泌高质量抗体的杂交瘤后，通过小鼠腹水大量生产抗体，这使得抗体的生产简单、成本低廉。本发明制备的封闭Taq酶5’-3’聚合酶活性单克隆抗体，可以用来制备Taq热启动酶。本发明中的杂交瘤将使封闭抗体的生产变得十分便利，使国产热启动Taq DNA聚合酶的品质得到改善。
因此，本发明的第一个目的在于提供一种Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体。本发明的第二个目的在于提供一种Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体的应用。本发明的第三个目的是提供一种Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体的制备方法。采用该方法制备出分泌Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体的杂交瘤可利用为低成本大规模抗体生产。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
作为本发明的第一个方面，一种Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体，包含含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区和含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区，其中，
所述LCDR1的序列如SEQ ID NO：3所示，
所述LCDR2的序列如SEQ ID NO：4所示，
所述LCDR3的序列如SEQ ID NO：5所示，
所述HCDR1的序列如SEQ ID NO：7所示，
所述HCDR2的序列如SEQ ID NO：8所示，
所述HCDR3的序列如SEQ ID NO：9所示。
根据本发明，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
作为本发明的第二个方面，上述所述的Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体在Taq DNA聚合酶的热启动PCR反应中的应用。
进一步的，所述Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体用于封闭Taq酶5’-3’聚合酶活性。
作为本发明的第三个方面，上述所述的Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体在Taq DNA聚合酶的突变体的热启动PCR反应中的应用。
作为本发明的第四个方面，一种上述所述的Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体在制备Taq热启动酶中的应用。
作为本发明的第五个方面，一种Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、将重组表达载体pET-28a-Taq转入Rosseta大肠杆菌，诱导表达Taq蛋白；
步骤二、纯化Taq蛋白，SDS-PAGE鉴定蛋白纯化效果；
步骤三、以纯化的Taq蛋白作为免疫原，取雌性小鼠，按照免疫程序进行免疫，间接酶联免疫吸附实验（ELISA）检测免疫后的小鼠效价；
步骤四、取免疫小鼠脾细胞与SP/20细胞融合，ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株；
步骤五、将筛选出的阳性杂交瘤细胞株经过四次亚克隆，得到抗Taq特异性杂交瘤细胞株；抗Taq特异性杂交瘤细胞株制备腹水，并用Protein G亲和层析纯化出抗体；
步骤六、对步骤五获得的抗体进行Taq聚合酶活性封闭性能筛选。
根据本发明，步骤二采用镍柱亲和层析纯化蛋白。
根据本发明，步骤六的Taq聚合酶活性封闭性能筛选，包括：
合成两条具有相互配对的序列的DNA引物，进行PCR扩增，扩增的体系中所有dATP为带3H放射性标记。
本发明的有益效果是：
1、本发明的Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体，其封闭效果好，封闭率达到近100%，且封闭1 U的5’-3’聚合酶活性需要的抗体量不高于0.1 μg。可以用于制备Taq热启动酶，使国产热启动Taq DNA聚合酶的品质得到改善。
2、本发明中的单克隆抗体采用杂交瘤的方式，可以使封闭抗体的生产变得十分便利。
附图说明
图1为纯化后的Taq蛋白SDS-PAGE分析图。
图2为本发明的抗Taq单克隆单克隆抗体SDS-PAGE图。
图3 为本发明的单克隆抗体封闭Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭效率图。
图4为用本发明的单克隆抗体配制的热启动PCR效果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或厂商提供的条件进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径得到。
本发明设计采用分子生物学方法表达一种聚合酶，采用细胞生物学方法制备杂交瘤，筛选到一株分泌完全封闭Taq酶5’-3’聚合酶活性的单克隆抗体的杂交瘤，该发明杂交瘤制备的单克隆抗体可以应用到热启动PCR聚合酶的生产。
1、生物材料
雌性Balb/c（6至10周龄）小鼠，北京维通利华有限公司。
SP2/0骨髓瘤细胞，中科院细胞库。
Rosetta大肠杆菌感受态，上海翌圣生物科技有限公司。
质粒pET-28a-Taq。 上海翌圣生物科技有限公司。
2、实验试剂与耗材
LB培养基粉末，IPTG，镍亲和层析填料，10×PBS，咪唑，SDS-PAGE蛋白预制胶，SDS-PAGE蛋白上样Buffer，考马斯亮蓝染液，蛋白Marker，透析袋，弗式不完全佐剂，弗式完全佐剂，RPMI1640培养基，青链霉素，胎牛血清，L-谷氨酰胺，DMSO，HAT和HT培养基添加利，PEG1450，可溶性单组份TMB底物溶液，脱脂奶粉，96孔酶标板，96孔细胞培养板，24孔细胞培养板，6孔细胞培养板，细胞培养皿，24：1氯仿/异戊醇，核酸沉淀溶液（TCA法）。
3、Taq蛋白序列
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE （SEQ ID NO:1）
实施例1 重组蛋白的诱导表达和亲和纯化
（1）将重组表达载体pET-28a-Taq转化Rosetta大肠杆菌菌株中，诱导表达Taq蛋白。
挑取单克隆Rosetta菌落于5 ml卡那霉素抗性的LB培养基中，过夜培养后，扩大至1 L卡那霉素抗性的LB中培养，培养至OD600为0.8至1.0，加400 μL的1M IPTG，37℃诱导4h。菌液放入1 L离心杯中，4000r/min，15 min。弃上清，加入20 mL PBS重悬菌体，冻于-80℃冰箱。
（2）镍柱亲和层析纯化Taq蛋白，SDS-PAGE鉴定蛋白纯化效果。
常温水浴解冻冻存的菌液，超声破碎300 W，5s/5s，1 h。将破碎后菌液转入高速离心管，15000r/min，离心30min，收集上清与平衡好的镍亲和填料孵育1h。重力层析柱纯化，分别用PBS、含有30 mM 咪唑的PBS、含有50 mM的PBS洗涤杂蛋白，含250 mM咪唑的PBS洗脱杂蛋白，对洗下的蛋白跑SDS-PAGE。结果如图1所示。其分子量为100KDa，与理论值一致。对含有高纯度的目的蛋白的样品进行超滤浓缩，PBS透析换液。
实施例2 小鼠免疫和血清效价测定
以纯化的Taq蛋白作为免疫原，取6周龄的Balb/c雌性小鼠，按照免疫程序进行免疫，间接酶联免疫吸附实验（ELISA）检测免疫后的小鼠效价。具体做法是：
免疫3只六周龄的Balb/c小鼠，首次免疫用弗式完全佐剂乳化Taq蛋白，后面的免疫均用弗式非完全佐剂乳化Taq蛋白，免疫剂量均为每只小鼠100 μg蛋白，每周免疫一次，免疫两个月，采用皮下多点注射的方式。第三次免疫后每次免疫前眼眶采血，用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测血清的效价。更具体做法是用1 μg/mL的Taq蛋白（溶于PBS）包板，5 %脱脂奶粉封闭，用PBS梯度稀释血清，HRP标记羊抗鼠IgG作为二抗，TMB显色，OD450值是阴性对照的2.1倍视为阳性。细胞融合前三天对小鼠效价达到10万的小鼠进行冲击免疫，100 μgTaq（溶于PBS）注入小鼠腹腔。
实施例3 细胞融合和杂交瘤筛选
取免疫小鼠脾细胞与SP/20细胞融合，ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株。具体做法是：
提前培养足够量的SP2/0，不少于108个，保证细胞处于对数生长期。收集SP2/0，用无血清的RPMI1640培养基洗三次。取经冲击免疫的小鼠的脾脏，研磨得到脾细胞，用RPMI1640培养基洗脾细胞三次。脾细胞与SP2/0的细胞数以2：1至5：1的比例混合。1000r/min，10 min，去培养基，于1min内加1 mL PEG1450入细胞中，边加边轻轻搅拌。加完PEG1450后两min内，匀速加入2 mL RPMI1640培养液终止PEG1450的作用，之后2min内加RPMI1640培养基至50 mL体积。1000r/min，10 min，离心去上清。加入含有20% FBS、终浓度为1×HAT的RPMI1640培养液200 mL吹起细胞，将含有细胞的培养液分至10块96孔细胞培养板，放入37℃细胞培养箱中培养。
融合细胞培养4天后，用含有20% FBS、终浓度为1×HAT的1640培养液进行半换液。融合后7至10天后，ELISA检测前一天早晚用含有20% FBS、终浓度为1×HT的1640培养液各进行一次全换液。用1 µg/ mL的Taq蛋白包板，间接ELISA检测融合板细胞培养基，每孔取50μL培养基检测。筛选出阳性杂交瘤细胞株。检测后将阳性孔中的细胞转入到24孔板中培养，培养基含HT（次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的混合剂）。
实施例4 杂交瘤单克隆化
24孔板中细胞培养两天后进行ELISA检测，对阳性孔中细胞计数，取200个细胞入96孔板中培养。培养一周左右，挑取只有1至3个克隆的孔进行ELISA检测，阳性孔细胞转移到24孔培养。这为一次单克隆化，如此重复，进行四次单克隆化。获得52株抗Taq特异性杂交瘤细胞株，分别命名为A1、A2......A51、A52。初次单克隆化用含HT的培养基，以后换为不含HT的培养基。
实施例5 小鼠腹水制备和抗体亲和纯化
将经过四次单克隆化的52株抗Taq特异性杂交瘤细胞株在24孔板、6孔板、培养皿中依次扩大培养，收集细胞离心，用PBS重悬至2×106个/mL，每只小鼠注射106个细胞。注射细胞前一周给每只小鼠腹腔注射1 mL石蜡油。7至10天后小鼠腹水形成，处死小鼠，用注射器抽取腹水。低速离心腹水10min，取中间层，弃下层细胞沉淀和上层油脂。
用十倍腹水体积的PBS稀释腹水，0.4 μm的滤膜过滤。将过滤后的样品与平衡好的Protein G填料孵育1h。重力层析柱纯化，用PBS洗涤杂蛋白，pH2.7的甘氨酸缓存液洗脱目的蛋白，用 pH8.5的 1 M Tris-HCl将洗脱后的样品的pH值调到中性。获得52株抗体,分别命名为T1、T2......T51、T52。OD280测抗体浓度，超滤管浓缩，PBS透析换液，SDS-PAGE检测抗体纯度。结果如图2所示。50%甘油冻存于-20℃。
实施例6 52株抗体封闭Taq酶5’-3’聚合酶活性的性能检测
（1）合成两条DNA引物，引物1为5’-TTACTCTATCACGTCTGACTACGCGTGGA-3’（SEQ IDNO:11），引物2为5’-gacgtgatagagtaaccggtaa-3’（ SEQ ID NO:12），引物1和引物2有相互配对的序列，可以用来PCR扩增，95℃，20 S，室温退火后用于实验。扩增的体系（Taq，退火后的引物，dNTPs，加或不加抗体）中ATP用带3H的放射性dATP，在37℃扩增40 min，之后用等体积的24：1氯仿/异戊醇颠倒充分混匀，4℃高速离心5 min，回收上层水相。在回收的水相中加入等体积的核酸沉淀溶液（TCA法），颠倒混匀，温育。4℃高速离心10 min。去上清留沉淀，用水溶解沉淀，测定放射性含量。先检测0.1µg的抗体封闭1U的Canace的封闭活性。结果如表1所示。
表1 不同抗体封闭性检测结果
Figure 145134DEST_PATH_IMAGE001
结果显示，T40、T51的封闭率达到99%和98%。
（2）针对高封闭活性的抗体T40、T51，封闭1 U的Taq聚合酶活性单克隆抗体用量梯度设置为0.4 µg，0.2 µg，0.1 µg，0.05µg，0.025 µg，0。结果如图3所示。
结果显示， 当封闭1 U的Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体用量为0.1 µg时，实施例5获得的Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体T40、T51的封闭率分别达到99%和98%。
实施例7 Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体的氨基酸序列测序及分析
将筛选到的最终用于抗体生产的杂交瘤交于抗体序列测序服务公司测得抗体的氨基酸序列。Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体T40的具体序列如下：
轻链可变区序列为：
DIVMTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSVDSEMYWYQQKPGSSPRLLIYDTTNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCVDWSTSPLEDFTGTKDKLER （SEQ ID NO:2）
轻链可变区CDR1氨基酸序列为：SVDSE （SEQ ID NO:3）
轻链可变区CDR2氨基酸序列为：DTT （SEQ ID NO:4）
轻链可变区CDR3氨基酸序列为：VDWSTSPLE （SEQ ID NO:5）
重链可变区氨基酸序列为：
EVQLQESGPGLVKPEQSLDLTCTVTNESYVNALTWNWIRQFPGNKLEWMGYIDSTYNKEYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCDFNEPYVAVEKG （SEQ ID NO:6）
重链可变区CDR1氨基酸序列为：NESYVNALT （SEQ ID NO:7）
重链可变区CDR2氨基酸序列为：IDSTYNK （SEQ ID NO:8）
重链可变区CDR3氨基酸序列为：DFNEPYVAVEKG （SEQ ID NO:9）
实施例8 实例验证
以本发明制备的单克隆抗体配制热启动酶检测该抗体对PCR效果的改善。
选取Mouse基因组（GeneID:11816）中4k bp长度的基因组为模板，用本发明的单克隆抗体T40配制热启动Taq酶，如表2的方式配制PCR反应体系，98℃ 3min预变性，98℃10sec、68℃sec/kb 35个循环，72℃ 5min扩增， 跑0.7%琼脂糖胶鉴定。如图4，第1道孔上样为不加抗体的扩增产物，第2道孔上样为加抗体的热启动酶扩增产物。
表2 PCR反应体系
Figure 924871DEST_PATH_IMAGE002
其中，引物是以GeneID:11816上的序列为模板设计的。
结果显示，加抗体T40的热启动酶扩增出的目的条带更亮。可见本发明制备的抗体T40可以有效的提高长片段的扩增产量。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
序列表
<110> 翌圣生物科技（上海）有限公司
<120> Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体及其应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 832
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
35 40 45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val
50 55 60
Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly
65 70 75 80
Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu
85 90 95
Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu
100 105 110
Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys
115 120 125
Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp
130 135 140
Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro
165 170 175
Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn
180 185 190
Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu
195 200 205
Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu
210 215 220
Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys
225 230 235 240
Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val
245 250 255
Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe
260 265 270
Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu
275 280 285
Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly
290 295 300
Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp
305 310 315 320
Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro
325 330 335
Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu
340 345 350
Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro
355 360 365
Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn
370 375 380
Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu
385 390 395 400
Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu
405 410 415
Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu
420 425 430
Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly
435 440 445
Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala
450 455 460
Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His
465 470 475 480
Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp
485 490 495
Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg
500 505 510
Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile
515 520 525
Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr
530 535 540
Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu
545 550 555 560
His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser
565 570 575
Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln
580 585 590
Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala
595 600 605
Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly
610 615 620
Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr
625 630 635 640
Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro
645 650 655
Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly
660 665 670
Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
675 680 685
Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg
690 695 700
Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val
705 710 715 720
Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg
725 730 735
Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro
740 745 750
Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu
755 760 765
Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His
770 775 780
Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala
785 790 795 800
Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro
805 810 815
Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu
820 825 830
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Val Asp Ser Glu Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Thr Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Asp Trp Ser Thr Ser Pro Leu Glu
85 90 95
Asp Phe Thr Gly Thr Lys Asp Lys Leu Glu Arg
100 105
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ser Val Asp Ser Glu
1 5
<210> 4
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asp Thr Thr
1
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Val Asp Trp Ser Thr Ser Pro Leu Glu
1 5
<210> 6
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Glu Gln
1 5 10 15
Ser Leu Asp Leu Thr Cys Thr Val Thr Asn Glu Ser Tyr Val Asn Ala
20 25 30
Leu Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Asp Ser Thr Tyr Asn Lys Glu Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asp Phe Asn Glu Pro Tyr Val Ala Val Glu Lys Gly
100 105
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Asn Glu Ser Tyr Val Asn Ala Leu Thr
1 5
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ile Asp Ser Thr Tyr Asn Lys
1 5
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Asp Phe Asn Glu Pro Tyr Val Ala Val Glu Lys Gly
1 5 10
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttactctatc acgtctgact acgcgtgga 29
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gacgtgatag agtaaccggt aa 22

Claims (5)

1.一种Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体，其特征在于，包含含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区和含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区，其中，
所述LCDR1的序列如SEQ ID NO：3所示，
所述LCDR2的序列如SEQ ID NO：4所示，
所述LCDR3的序列如SEQ ID NO：5所示，
所述HCDR1的序列如SEQ ID NO：7所示，
所述HCDR2的序列如SEQ ID NO：8所示，
所述HCDR3的序列如SEQ ID NO：9所示。
2.如权利要求1所述的Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.一种如权利要求1或2所述的Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体在Taq DNA聚合酶的热启动PCR反应中的应用。
4.一种如权利要求1或2所述的Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体用于封闭Taq酶5’-3’聚合酶活性。
5.一种如权利要求1或2所述的Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体在制备Taq热启动酶中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112409490B (zh) * 2020-12-16 2022-09-16 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 Taq酶5’-3’外切酶活性封闭单克隆抗体及其应用
CN114685671B (zh) * 2020-12-30 2023-09-26 深圳华大生命科学研究院 特异性结合Taq DNA聚合酶的单克隆抗体及其应用
CN113321733B (zh) * 2021-05-19 2022-03-08 厦门同仁心生物技术有限公司 一种TaqDNA聚合酶单克隆抗体及应用，包含该抗体的聚合酶反应体系及应用
CN115785276B (zh) * 2021-08-24 2023-10-03 东莞市朋志生物科技有限公司 一种抗Taq DNA聚合酶的抗体及其应用
CN115141280B (zh) * 2022-06-10 2023-04-21 广东和信健康科技有限公司 一种Taq DNA聚合酶单克隆抗体及其应用
CN115806621B (zh) * 2022-11-25 2023-06-30 厦门康基生物科技有限公司 一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体F2B2及其应用
CN116217730B (zh) * 2022-11-25 2023-09-05 厦门康基生物科技有限公司 一种Taq酶的单克隆抗体F7H6及其应用
CN116284413B (zh) * 2022-11-25 2023-09-05 厦门康基生物科技有限公司 一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体F12H12及其应用
CN115594768B (zh) * 2022-12-12 2023-03-17 珠海宝锐生物科技有限公司 一种分泌抗dna聚合酶单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110747183A (zh) * 2019-10-29 2020-02-04 南京诺唯赞生物科技有限公司 一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用
CN111349167A (zh) * 2018-12-20 2020-06-30 东莞市朋志生物科技有限公司 一种抗Taq DNA聚合酶的抗体及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111349167A (zh) * 2018-12-20 2020-06-30 东莞市朋志生物科技有限公司 一种抗Taq DNA聚合酶的抗体及其应用
CN110747183A (zh) * 2019-10-29 2020-02-04 南京诺唯赞生物科技有限公司 一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用

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