CN111116749B - 重组的人源化gpc3抗体及其制备和应用 - Google Patents

重组的人源化gpc3抗体及其制备和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111116749B
CN111116749B CN201911410030.9A CN201911410030A CN111116749B CN 111116749 B CN111116749 B CN 111116749B CN 201911410030 A CN201911410030 A CN 201911410030A CN 111116749 B CN111116749 B CN 111116749B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gpc3
antibody
recombinant
humanized
variable region
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911410030.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111116749A (zh
Inventor
李伟
赵树杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Fuxiao Biological Technology Co ltd
Original Assignee
Nanjing Fuxiao Biological Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Fuxiao Biological Technology Co ltd filed Critical Nanjing Fuxiao Biological Technology Co ltd
Priority to CN201911410030.9A priority Critical patent/CN111116749B/zh
Publication of CN111116749A publication Critical patent/CN111116749A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111116749B publication Critical patent/CN111116749B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种重组的人源化GPC3抗体及其构建和应用。本发明重组的人源化GPC3抗体，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的碱基序列为SEQUENCE NO:VH，轻链可变区碱基序列为SEQUENCE NO:VL，抗体结合人IgG1 Fc。本发明将目的基因GPC3抗体的轻链可变区碱基序列和重链可变区碱基序列嵌合到CHO‑K1稳定细胞系的染色体中，构件稳定的细胞系，并能够长期稳定存在，在传代过程中不会丢失，能够稳定的表达GPC3抗体。

Description

重组的人源化GPC3抗体及其制备和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种重组的人源化GPC3抗体及其制备和应用。
背景技术
抗体人源化，是重组抗体(单克隆抗体)生产制备实验研究的重要组成部分，到1975年单克隆抗体技术的问世，抗体与抗原特异性结合的应用和抗体人源化的研究得到了广泛的重视和应用。
初期在临床上使用的单抗多数为鼠源性单抗，由于人和小鼠的种属特异性，鼠源性抗体的使用存在种种限制。鼠抗虽然对靶抗原是特异的，可以与靶抗原特异性结合，但它不能激活相应的人体效应系统，如抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、补体依赖的细胞毒作用(CDC)等，从而无法正常的发生抗原-抗体反应。此外，鼠抗体作为外源性蛋白进入人体，会使人体免疫系统产生应答，产生以鼠抗体作为抗原的特异性抗体，即产生人抗鼠抗体(HAMA效应)。由于鼠源性抗体在临床应用上存在种种限制，人们利用重组基因技术对鼠源抗体进行人源化改造，这就是人源化抗体技术，具体的来说就是指此抗体为通过基因工程技术，将人IgG的恒定区C区与鼠IgG可变区V区连接，导入细胞内表达制备而成的抗体。
相较于传统方法制备的多克隆抗体在应用中易受到生产批次的影响，单克隆抗细胞株存在抗体染色体丢失、细胞复苏后停止生长或死亡等风险，而重组抗体具有序列已知，抗体基因可以长期保存，抗体性质稳定，实验重复性好等优点，是一种标准化的抗体生产流程，回避了单多抗生产保存过程中出现的风险因素。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3,GPC-3)，调控着细胞生长、繁殖、分化、黏附和迁移等行为，在肝癌组织中的特异性表达率较高，可高达96％以上，因此，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体(GPC-3抗体)有着极其重要的作用。
而以上所描述的重组抗体的表达，必须通过稳定高效的表达载体实现，杂交瘤细胞有丢失高特异性高活性的风险，或者细胞状态不好乃至死亡，直接用作重组表达载体效果较差。本发明旨在构建一种可以用于重组抗体稳定高效表达的载体细胞系，为后续开发人源化重组抗体奠定基础。
发明内容
本发明提供一种表达稳定高效的重组的人源化GPC3抗体的制备和应用。
解决的技术问题是：传统载体细胞系用于抗体人源化，重组表达稳定性差，效率低，丢失高特异性和高活性的风险较大。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明重组的人源化GPC3抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于：重链可变区的碱基序列为SEQ ID NO.1，轻链可变区碱基序列为SEQ ID NO.2，所述抗体的Fc基因序列为人IgG1 Fc基因序列。
本发明一种稳定分泌GPC3抗体的细胞株GPC3-FX，含有重链可变区的碱基序列SEQID NO.1和轻链可变区碱基序列SEQ ID NO.2。
本发明细胞株GPC3-FX的培育方法，包括以下步骤：
1.1、制备GPC-3抗原工作液；纯化GPC-3抗原蛋白，透析后浓缩；
1.2、动物免疫；将步骤1.1制得的GPC-3抗原工作液与弗氏佐剂等体积混合乳化，免疫小鼠，末次免疫一周后采血，检测抗体效价，采用乙肝疫苗原液腹腔冲击选定的小鼠，3天后取小鼠脾脏，准备进行细胞融合；
1.3、细胞融合前复苏培养骨髓瘤SP2/0细胞株，准备骨髓瘤SP2/0细胞；
1.4、制备小鼠脾细胞悬液；
1.5、细胞融合：将小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，选择阳性孔细胞进行亚克隆，直至获得可稳定分泌GPC-3抗体的细胞株GPC3-FX。
本发明一种人源化重组质粒，包含重链可变区的碱基序列SEQ ID NO.1和轻链可变区碱基序列SEQ ID NO.2。
本发明人源化重组质粒的构建，其特征在于：包括以下步骤：
(1)、重组抗体基因的获得；
所述重链可变区的碱基序列和轻链可变区碱基序列与人源抗体的Fc基因序列进行拼接，制备重组的人源化GPC3抗体重链序列VH-hFc-GPC3；
合成基因片段的两端设计NheI与EcoRI酶切位点，以pUC57为载体，获得携带有重组基因的质粒分别为pUC57-VL-GPC3和pUC57-VH-hFc-GPC3；
(2)制备人源化重组质粒；
将重组的pUC57-VL-GPC3质粒和pUC57-VH-hFc-GPC3质粒与载体pCDNA3.1/ZEO(+)分别使用NheI与EcoRI双酶切，回收VL-GPC3片段、VH-hFc-GPC3片段与pCDNA3.1/ZEO(+)载体片段，并使用T4 Ligase进行连接，分别得到重组质粒pCDNA3.1/ZEO(+)-VL-GPC3与pCDNA3.1/ZEO(+)-VH-hFc-GPC3。
本发明人源化重组质粒的构建，其特征在于：步骤(1)中所述人源抗体的Fc基因序列为人IgG1 Fc基因序列。
本发明一种人源化重组质粒的应用，用于构建稳定表达重组的人源化GPC3抗体的细胞株，其特征在于：包括以下步骤：
A、转染及筛选阳性克隆；
将重组质粒pCDNA3.1/ZEO(+)-VL-GPC3与pCDNA3.1/ZEO(+)-VH-hFc-GPC3，用阳离子质脂体共转染中华仓鼠卵巢细胞CHO-K1，然后筛选整合GPC-3抗体的稳定转染细胞株；
B、氨甲基喋呤MTX的加压培养；
将步骤A形成的所有阳性克隆细胞用胰酶消化后接种到细胞培养皿中混合培养，获得能够在10-6mol/L的氨甲基喋呤MTX正常生长的重组CHO-K1细胞的混合克隆株，命名为CHO/hFc-GPC3。
本发明细胞株的应用，其特征在于：用于制备重组的人源化GPC3抗体，所述人源化GPC3抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的碱基序列为SEQ ID NO.1，轻链可变区碱基序列为SEQ ID NO.2，所述抗体的Fc基因序列为人IgG1 Fc基因序列。
本发明人源化GPC3抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
C、单克隆的扩大培养及蛋白收获；
选择表达水平最高的细胞株CHO/hFc-GPC3于CD CHO培养基培养，待细胞张满时，换用无血清培养基，1-2天后收集细胞培养液，可连续进行收液3-5次；
D、表达蛋白的纯化及初步测定；
采用Protein A Sepharose 4Fast Flo分离介质进行亲和层析，纯化表达蛋白；
E、重组的人源化GPC-3抗体表达量的检测。
本发明制备方法，其特征在于：步骤A中以pEGFP-C1质粒作为指示质粒，以5％的比例与要转染的目的质粒进行混合，在转染过程中作为转染成功与否的指示。
本发明制备重组的人源化GPC3抗体及其制备和应用与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明重组的人源化GPC3抗体，将人源的IgG1的Fc片段替代了鼠源的Fc片段，大大降低了引起抗体HAMA效应的几率，从而降低了在临床IVD诊断方法中为了消除HAMA效应的阻断剂的使用量。
常规方法制备的单克隆抗体，是在杂交瘤中表达的，使用的杂交瘤大多是由小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合而得到的，不稳定，在后续的传代过程中很容易丢失染色体，导致抗体的表达量以及表达序列出现变异。
本发明将目的基因GPC3抗体的轻链可变区碱基序列和重链可变区碱基序列嵌合到CHO-K1稳定细胞系的染色体中，构件稳定的细胞系，并能够长期稳定存在，在传代过程中不会丢失，确保能够稳定的表达GPC3抗体。
下面结合附图对本发明的重组的人源化GPC3抗体及其制备和应用作进一步说明。
附图说明
图1为Protein A Sepharose 4Fast Flo纯化的人源化重组GPC-3抗体SDS-PAGE结果；
图2为人源化重组GPC-3抗体与GPC3重组蛋白的Western blot检测结果。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
其中，真核表达载体pCDNA3.1/ZEO(+)，购于美国Invitrogen公司；
实施例一：GPC3抗体轻链和重链可变区碱基序列的获得
按照以下方法获得：
步骤一、GPC-3抗体细胞株的培育制备：
具体包括以下步骤：
1.1、制备GPC-3抗原工作液；
采用亲和层析和离子交换层析对GPC-3抗原蛋白进行纯化，监测波长为280nm，收集洗脱峰，取少量洗脱蛋白液做电泳分析，其余洗脱蛋白液用0.85％的NaCl溶液在4℃透析48h，然后用超滤膜浓缩至5mg/ml；
1.2、将步骤1.1制得的GPC-3抗原工作液与弗氏佐剂(0天免疫为弗氏完全佐剂，14天、28天、35天免疫为弗氏不完全佐剂)等体积混合乳化后于0天、14天、28天、35天背部皮下多点免疫BALb/c小鼠，0.2mg/只，末次免疫一周后采血，间接ELISA检测抗体效价，血清稀释104倍时OD值为1.089,于末次免疫一周后采用乙肝疫苗原液腹腔冲击选定的小鼠，3天后取小鼠脾脏，准备进行细胞融合；
1.3、细胞融合前复苏培养SP2/0细胞株，融合前3天扩大培养，融合前1天去除RPMI1640细胞培养液(Gibco)，重新添加培养液，准备SP2/0细胞；
1.4、处死免疫小鼠，按常规方法制备小鼠脾细胞悬液；
1.5、细胞融合：将小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，选择阳性孔细胞进行亚克隆，直至获得可稳定分泌GPC-3抗体的细胞株GPC3-FX；
具体按照以下方法进行：
根据脾细胞与SP2/0细胞的计数结果，分别向SP2/0细胞液和小鼠脾细胞悬液中加入适量不完全IMDM培养液(Gibco)，SP2/0细胞晃动混匀，脾细胞用移液管吹打均匀；
然后将脾细胞与SP2/0细胞按1:2合于50ml离心管中，混匀；
加不完全MDM培养液至50ml，离心5min，倒净上清；
轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀，离心管置37℃水浴，准备融合；
将37℃预热的50％的PEG4000lml，用滴管缓慢滴入混合细胞管，边滴边转动离心管，使细胞保存在混匀状态；
静置90s后立即缓慢加入15ml无血清的MDM培养基(Gibco)(37℃)，然后离心5min，弃去上清；
加入MDM完全培养液(Gibco)，混勾，将混悬液分别加至96孔细胞培养板中，100u1/孔，于37℃，5％ C02培养箱内培养；
第2天细胞板加HAT培养液(MDM含1*HAT(Sigma))100u1/孔；每3天换一次HAT培养液，观察是否出现杂交瘤，两周后换HT培养基(MDM含1*的HT(Sigma))，观察融合细胞生长状况；
细胞融合后第七天开始观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清进行抗体ELISA检测；将阳性孔细胞转入24孔板扩大培养，及时做亚克隆；
经3次亚克隆得到稳定分泌抗体的细胞株，命名为GPC3-FX，并将细胞株及时冻存。
步骤二、挑选高效表达的1株GPC3-FX细胞株，进行测序，获得GPC-3抗体的重链可变区与轻链基因序列，其中重链可变区VH碱基组成为SEQ NO.1，轻链VL碱基组成为SEQNO.2；
上述基因测序在苏州金唯智生物科技有限公司完成。
实施例二：人源化重组质粒的获得
具体按照以下方法进行：
(1)、重组抗体基因的获得
以实施例一中得到的GPC3抗体的重链可变区基因VH与人源抗体的Fc基因序列进行拼接，人源抗体的Fc基因序列参考人IgG1 Fc基因序列，构建重组的人源化GPC3抗体的重链序列VH-hFc-GPC3。
合成基因片段的两端设计NheI与EcoRI酶切位点，以pUC57为载体，获得携带有合成基因的质粒分别为pUC57-VL-GPC3(轻链)和pUC57-VH-hFc-GPC3(重链)。
重组人源化GPC3抗体重链序列VH-hFc-GPC3与轻链序列均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
(2)构建人源化重组质粒；
将重组的pUC57-VL-GPC3(轻链)质粒和pUC57-VH-hFc-GPC3(重链)质粒与载体pCDNA3.1/ZEO(+)分别使用NheI与EcoRI双酶切，回收VL-GPC3片段、VH-hFc-GPC3片段与pCDNA3.1/ZEO(+)载体片段，并使用T4DNALigase进行连接，分别得到重组质粒pCDNA3.1/ZEO(+)-VL-GPC3(轻链)与pCDNA3.1/ZEO(+)-VH-hFc-GPC3(重链)。
具体的操作步骤如下：
2-1、重组的pUC57-VL-GPC3(轻链)质粒和pUC57-VH-hFc-GPC3(重链)质粒纯化；
使用PCR产物快速纯化试剂盒(采购自天根生化科技(北京)有限公司产品)对pUC57-VL-GPC3质粒和pUC57-VH-hFc-GPC3质粒进行纯化；
2-2、将纯化后的pUC57-VL-GPC3质粒和pUC57-VH-hFc-GPC3质粒经NheI和EcoRI双酶切，酶切完成后在反应体系中加入1μL DpnI，于37℃反应30min，消化掉模板DNA；
其中使用的酶切体系为：
Figure GDA0003936266940000071
2-3、酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析，切取目的片段，经PCR产物试剂盒(Qigen,Cat No.20021)提取回收VL-GPC3片段、VH-hFc-GPC3片段与pCDNA3.1/ZEO(+)载体片段；
2-4、进行连接反应；
连接反应体系为：约0.1pmol VL-GPC3片段或VH-hFc-GPC3片段，约0.01pmolpCDNA3.1/ZEO(+)载体DNA片段，1μL T4 DNA Ligase缓冲液(NEB)，1μL T4 DNA Ligase(NEB)，加去离子水补足到10μL体系，16℃连接过夜。取3μL反应产物转化至100μL感受态细胞XL-1blue(Agilent)中；
2-5、筛选获得重组质粒；
挑取阳性克隆，经37℃培养12h后，用质粒小提试剂盒(Qigen)提取质粒，分别得到重组质粒pCDNA3.1/ZEO(+)-VL-GPC3(轻链)与pCDNA3.1/ZEO(+)-VH-hFc-GPC3(重链)，并对提取的质粒送到上海生工，进行测序鉴定。
实施例三：利用重组质粒获得人源化重组GPC-3抗体
具体按照以下方法获得：
A、转染及筛选阳性克隆；
选用pEGFP-C1质粒(购自武汉淼灵生物科技有限公司)作为指示质粒，以5％的比例与要转染的目的质粒进行混合，在转染过程中作为转染成功与否的指示。
将构建好的重组质粒pCDNA3.1/ZEO(+)-VL-GPC3(轻链)与pCDNA3.1/ZEO(+)-VH-hFc-GPC3(重链)，以1:2的摩尔比，用阳离子质脂体Lipofectamine 2000(Invitrogen产品)共转染中华仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)，然后筛选整合GPC-3抗体的稳定转染细胞株；
筛选整合的选择培养基包括：浓度为0.8mg/ml的G418(Gibco产品)，浓度为0.1mmol/L的次黄嘌呤，浓度为0.01mmol/L的胸腺嘧啶和浓度为30mg/L的甘氨酸。
B、氨甲基喋呤(MTX)的加压培养；
将上述形成的所有阳性克隆细胞用胰酶消化后接种到细胞培养皿中混合培养，待细胞密度为80-90％后，按照1:100-1:4000的比例接种到新的细胞培养皿中，待细胞长满后，加入氨甲基喋呤(MTX)(Sigma)，浓度从10-8mol/L至10-4mol/L，最终得到能够在10-6mol/L的氨甲基喋呤(MTX)正常生长的重组CHO-K1细胞的混合克隆株，命名为CHO/hFc-GPC3。
C、单克隆的扩大培养及蛋白收获；
选择表达水平最高的基因重组CHO-K1细胞株于1000ml转瓶中用CD CHO培养基培养，待细胞长满时，换用无血清培养基，1-2天后收集细胞培养液，可连续进行收液3-5次。
D、表达蛋白的纯化及初步测定；
利用蛋白A对IgG抗体的特异性吸附作用，采用Protein A Sepharose 4Fast Flo分离介质(Amersham Biosciences)进行亲和层析，纯化表达蛋白，SDS-PAGE结果如图1所示。
E、GPC-3重组抗体表达量的检测；
按照BCA-100蛋白质定量试剂盒(北京赛驰生物,产品货号300001-B)操作说明书进行试验，根据标准蛋白所测平均OD值为纵座标，各孔的蛋白质浓度(mg/m1)为横座标制作标准蛋白曲线，经线性回归拟合得回归方程，将样本的OD值代入，计算出蛋白浓度。
人源化重组GPC-3抗体与GPC3重组蛋白的Western blot检测结果如图2所示。试剂盒操作确定的蛋白定量标准曲线的公式及决定系数R2为：y＝2.5899x+0.0257，R2＝0.9896；R2接近于1，此标准曲线有效，可用于推测被测蛋白的浓度，依据此标准曲线，本实施例对筛选出的重组CHO/hFc-GPC3细胞株所表达的重组的GPC-3抗体进行定量分析，纯化后重组GPC-3抗体蛋白质的浓度达2.89mg/ml。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
SEQUENCE NO：VH
<110> 南京拂晓生物科技有限公司
<120> 重组的人源化GPC3抗体及其制备和应用
<130> 2019.12.25
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgacggtcc tctgcctcct ctacctcctc accgccatcc ccggcatcct atgtgacgtt 60
cagcttcagg agtgtggtcc tggtcttgtt aaaccttgtc aatgtctttg tcttacttgc 120
tgtgttactg gttactgtat cactaactgt tactactgga actggatcag tcaattccct 180
ggtaacaagc ttgagtggat gggttacatc acttacgacg gtgacatcaa ctacaaccct 240
tgtcttaaaa acaggatatg gctgacgagg gacacgtggg aaaaccaatt cttcctgacg 300
ctgaactcgg tgacgacgga agacacggcg acgtactact gcacgagggg ggggaactac 360
gttgctatgg actactgggg tcaaggaaca tcagtaacag tatcatca 408
SEQUENCE NO：VL
<110> 南京拂晓生物科技有限公司
<120> 重组的人源化GPC3抗体及其制备和应用
<130> 2019.12.25
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgatgctac cagtaagtct actagtacta atgatctgga tcgcagcatc atcatcagac 60
gtaatgatga cacagacacc actatcacta ccagtatcac taggagacca ggcatcaatc 120
tcatgcagat catcacagtc actagtaaga tcaaacggaa acacatacct tcactggtac 180
cttcagaagc ctggtcagac tcctaagctt cttatcttca aggttactaa cagtttcact 240
ggtgttcctg acagtttcac tggtactggt actggtactg acttcactct taagatcact 300
ggtgttgagg ctgaggacct tggtgtttac ttctgcactc agactactca ccttcctcct 360
actttcggtg gtggtactaa gcttgagatc aag 393

Claims (8)

1.重组的人源化GPC3抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于：重链可变区的碱基序列为SEQ ID NO.1，轻链可变区碱基序列为SEQ ID NO.2，所述抗体的Fc基因序列为人IgG1 Fc基因序列。
2.一种人源化重组质粒，其特征在于：包含权利要求1所述的重链可变区的碱基序列和轻链可变区碱基序列。
3.权利要求2所述的人源化重组质粒的构建，其特征在于：包括以下步骤：
（1）、重组抗体基因的获得；
所述重链可变区的碱基序列和轻链可变区碱基序列与人源抗体的Fc基因序列进行拼接，制备重组的人源化GPC3抗体重链序列VH-hFc-GPC3；
合成基因片段的两端设计 NheI与EcoRI 酶切位点，以pUC57为载体，获得携带有重组基因的质粒分别为pUC57-VL-GPC3 和 pUC57-VH-hFc-GPC3；
（2）制备人源化重组质粒；
将重组的pUC57-VL-GPC3质粒 和 pUC57-VH-hFc-GPC3质粒与载体pCDNA3.1/ZEO（+）分别使用 NheI 与 EcoRI 双酶切， 回收 VL-GPC3 片段、VH-hFc-GPC3片段与pCDNA3.1/ZEO(+)载体片段，并使用T4 Ligase 进行连接，分别得到重组质粒pCDNA3.1/ZEO(+)-VL-GPC3与pCDNA3.1/ZEO(+)-VH-hFc-GPC3。
4.根据权利要求3所述的人源化重组质粒的构建，其特征在于：步骤（1）中所述人源抗体的Fc基因序列为人IgG1 Fc基因序列。
5.权利要求2所述一种人源化重组质粒用于构建稳定表达权利要求1所述重组的人源化GPC3抗体的细胞株的用途，其特征在于：包括以下步骤：
A、转染及筛选阳性克隆；
将权利要求4所述重组质粒pCDNA3.1/ZEO(+)-VL-GPC3与pCDNA3.1/ZEO(+)-VH -hFc-GPC3，用阳离子质脂体共转染中华仓鼠卵巢细胞CHO-K1，然后筛选整合GPC-3抗体的稳定转染细胞株；
B、氨甲基喋呤MTX的加压培养；
将步骤A形成的所有阳性克隆细胞用胰酶消化后接种到细胞培养皿中混合培养，获得能够在10-6mol/L的氨甲基喋呤MTX正常生长的重组CHO-K1细胞的混合克隆株，命名为CHO/hFc- GPC3。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：步骤A中以pEGFP-C1质粒作为指示质粒，以5%的比例与要转染的目的质粒进行混合，在转染过程中作为转染成功与否的指示。
7.权利要求5所述细胞株的用途，其特征在于：用于制备重组的人源化GPC3抗体，所述人源化GPC3抗体为权利要求1所述抗体。
8.一种人源化GPC3抗体的制备方法，其特征在于：所述人源化GPC3抗体为权利要求7所述的人源化GPC3抗体，制备方法包括以下步骤：
C、单克隆的扩大培养及蛋白收获；
选择表达水平最高的细胞株CHO/hFc- GPC3于CD CHO培养基培养，待细胞张满时，换用无血清培养基，1-2天后收集细胞培养液，可连续进行收液3-5次；
D、表达蛋白的纯化及初步测定；
采用Protein A Sepharose 4 Fast Flo分离介质进行亲和层析，纯化表达蛋白；
E、重组的人源化GPC-3抗体表达量的检测。
CN201911410030.9A 2019-12-31 2019-12-31 重组的人源化gpc3抗体及其制备和应用 Active CN111116749B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911410030.9A CN111116749B (zh) 2019-12-31 2019-12-31 重组的人源化gpc3抗体及其制备和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911410030.9A CN111116749B (zh) 2019-12-31 2019-12-31 重组的人源化gpc3抗体及其制备和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111116749A CN111116749A (zh) 2020-05-08
CN111116749B true CN111116749B (zh) 2023-02-17

Family

ID=70506263

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911410030.9A Active CN111116749B (zh) 2019-12-31 2019-12-31 重组的人源化gpc3抗体及其制备和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111116749B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103596985A (zh) * 2011-04-19 2014-02-19 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3特异的人单克隆抗体及其用途
CN105820249A (zh) * 2004-07-09 2016-08-03 中外制药株式会社 抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 抗体

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105820249A (zh) * 2004-07-09 2016-08-03 中外制药株式会社 抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 抗体
CN103596985A (zh) * 2011-04-19 2014-02-19 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3特异的人单克隆抗体及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN111116749A (zh) 2020-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107217042B (zh) 一种生产无岩藻糖基化蛋白的基因工程细胞系及其建立方法
DK2438171T3 (en) Fucosylerings-deficient cells
JP5432117B2 (ja) 宿主細胞中の組換えタンパク質の発現を増進するための組換え発現ベクター要素（ｒＥＶＥ）
CN111560073B (zh) Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体及其应用
US20090285795A1 (en) Method for the Production of a Monoclonal Antibody to CD20 for the Treatment of B-Cell Lymphoma
MX2010011293A (es) Metodos para producir una proteina policlonal.
US8486895B2 (en) Anti-epidermal growth factor receptor antibodies and uses thereof
KR101114741B1 (ko) 알파-1,6-푸코실 전이효소 발현의 ｓｈｒｎａ-조절된 억제
EP2794651B1 (en) Expression vector element combinations, novel production cell generation methods and their use for the recombinant production of polypeptides
JP2016516412A (ja) 酵母及び他の形質転換細胞中のポリペプチドの高収率発現のための温度シフト
CN104928336A (zh) 用于生产糖基化免疫球蛋白的方法
US8653244B2 (en) Anti-epidermal growth factor receptor antibodies and uses thereof
KR20100065332A (ko) 제조 방법
CN112500485B (zh) 一种抗b7-h3抗体及其应用
JP2009504136A (ja) 慢性リンパ性白血病治療のためのｃｄ５２に対するモノクローナル抗体産生のための組み換え法
WO2013066765A1 (en) Mutation of tup1 in glycoengineered yeast
AU2020306672B2 (en) Mammalian cell lines with SIRT-1 gene knockout
CN111116749B (zh) 重组的人源化gpc3抗体及其制备和应用
CN111533806A (zh) 一种Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体及其应用
CN111647086B (zh) 一种重组小鼠抗人肌酸激酶单克隆抗体、制备方法和应用
CN114773456B (zh) 抗pk34单克隆抗体和杂交瘤细胞系及其制备和纯化方法
EP3783015A1 (en) Mouse anti-human erbb2 monoclonal antibody 10a6, encoding gene, preparation and application thereof
WO2010092335A1 (en) Method for producing protein
CN106478774B (zh) 一种用于蛋白质表达的信号肽
CN104781405A (zh) 用于生产重组蛋白质的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant