KR101114741B1 - 알파-1,6-푸코실 전이효소 발현의 ｓｈｒｎａ-조절된 억제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 포유동물 세포를 이종 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계; 및 포유동물 세포 또는 배양물로부터 이종 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하되, 포유동물 세포내에서 α1,6-푸코실 전이효소의 효소 활성이 α1,6-푸코실 전이효소 mRNA를 표적화하는 shRNA에 의해 감소되는, 포유동물 세포내의 푸코스 개질도가 감소된 이종 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

알파-1,6-푸코실 전이효소 발현의 ＳＨＲＮＡ-조절된 억제{SHRNA-MEDIATED INHIBITION OF EXPRESSION OF ALPHA-1,6-FUCOSYLTRANSFERASE}
본 발명은 RNAi 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 재조합적으로 제조된 단백질, 예컨대 진단용 또는 치료용 항체의 개질을 촉진하는 효소의 번역을 감소시키는 분야에 관한 것이다.
RNAi 조절된 유전자 사일렌싱(silencing)의 현상은 긴 이중 가닥 RNA 분자의 미량주사가 개별적인 유전자의 불활성화를 야기하는 것으로 보고된 예쁜 꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 시스템에서 처음으로 개시되어 있다(미국특허 제US6,506,559호). 나중에, RNAi 조절된 유전자 사일렌싱은 척추동물에서(유럽특허 제EP1114784호), 포유동물에서, 특히 인간 세포에서(유럽특허 제EP1144623호) 개시되었다. 이러한 시스템에서, 유전자 불활성화는 성공적으로 달성되고, 간략하게, 19 내지 29bp의 이중 가닥 RNa 분자가 해당하는 특이적인 유전자의 일시적인 녹다운(knock down)을 위하여 형질감염된다.
RNA 조절된 유전자 불활성화의 기전은 지금까지 조사된 다양한 유기체에서 약간 상이한 것으로 보인다. 그러나, 모든 시스템에서 RNA 조절된 유전자 사일렌싱은 소위 RISC 착물의 부분인 엔도뉴클레아제 아르고노트2(Argonaute2)에 의해 유도된 표적 mRNA의 전사후 감성에 기초한다(국제특허공개공보 제WO03/93430). 감성의 서열 특이성은 RISC 착물에 로딩(loading)된 특이적인 안티센스 RNA 가닥의 뉴클레오티드 서열에 의해 결정된다.
도입의 적절한 가능성은 이중 가닥 RNA 분자 자체의 형질감염, 또는 표적 RNA 분자의 일부와 동일한 서열을 갖는 짧은 이중 가닥 RNA 화합물을 직접 야기하는 DNA 벡터 구성체의 생체내 전사를 포함한다. 많은 경우에 있어서, 소위 shRNA 구성체가 유전자 사일렌싱에 성공적으로 사용되었다. 이러한 구성체는 세포내로의 도입 후, 이의 서열이 원래의 RNA 분자의 줄기에 상응하는 이중 가닥 RNA 화합물로 가공되는 스템-루프(stem-loop) RNA를 코딩한다.
IgG1-형 면역글로불린은 위치 Asn297, 또는 일부 경우에 위치 Asn298에서 Fc 구역에 결합된 2개의 N-연결된 올리고당 쇄를 갖는다. N-연결된 올리고당은 일반적으로 핵 푸코스가 존재하거나 부재하는 트라이만노실 핵 구조로 이루어진 착물 이중안테나(biantennary) 유형이다(문헌[Rademacher, T.W., et al., Biochem. Soc. Symp. 51 (1986) 131-148; Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; Okazaki, A., et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Shinkawa, T., et al., J. Biol. Chem. 278 (2003) 3466-3473]).
미국특허 제US2004/0132140호 및 제US2004/0110704호는 재조합 항체를 발현하는 세포주내의 α1,6-푸코실 전이효소를 억제하기 위한 재조합 방법 또는 유전학 적 방법을 보고한다.
발명의 개요
본 발명은 포유동물 세포를 이종 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계; 및 포유동물 세포 또는 배양물로부터 이종 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 포유동물 세포내에서 푸코스 개질도가 감소된 이종 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 상기 포유동물 세포가 α1,6-푸코실 전이효소 mRNA를 표적화하는 shRNA로 전사되는 서열번호 5 또는 6의 핵산, 및 이종 폴리펩티드를 코딩하는, 바람직하게는 이종 폴리펩티드로서 면역글로불린, 면역글로불린 단편 또는 면역글로불린 접합체를 코딩하는 핵산으로 형질감염되어 있는, 방법을 포함한다.
한 양태에서, shRNA의 전사는 Pol III 프로모터, 바람직하게는 U6 프로모터의 제어하에 있다. 한 양태에서, 포유동물 세포는 네오마이신 선별 표시자를 코딩하는 핵산에 의해 추가로 형질감염된다. 한 양태에서, 포유동물 세포는 CHO 유도된 세포이다. 한 양태에서, 포유동물 세포는 α1,6-푸코실 전이효소 mRNA를 표적화하는 shRNA로 전사되는 서열번호 5 또는 6의 제 1 핵산, 네오마이신 선별 표시자를 코딩하는 제 2 핵산, 및 이종 폴리펩티드를 코딩하는 제 3 핵산을 포함하는 단일 핵산으로 형질감염된다.
본 발명은 또한 서열번호 5의 핵산 및 서열번호 6의 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 제 1 핵산, 네오마이신 선별 표시자를 코딩하는 제 2 핵산, 및 면역글로불린, 면역글로불린 단편 및 면역글로불린 접합체를 포함하는 이종 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 이종 폴리펩티드를 코딩하는 제 3 핵산을 포함하는 핵산을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 세포를 보고한다.
도 1은 shRNAFuT8의 전사를 위한 본 발명에 따른 벡터를 도시한다.
도 2는 shRNAFuT8 및 네오마이신을 사용한 후속 선별, 저 친화성 신경 성장 인자(1-NGFR) 강화, 및 LCA-선별(상부 패널)에 의해, 또는 단지 실시예 4에 개시된 바와 같은 네오마이신 선별에 의해 형질감염된 CHO 세포로부터 단리된, 높은(상부 패널) 및 낮은(하부 패널) 양의 상이하게 푸코실화된 항체를 나타내는 질량 스펙트럼을 도시한다.
도 3은 항체의 아스파라긴에 부착된 탄수화물 구조를 개략적으로 표시한다(GlcNac=N-아세틸글루코사민, Man=만노스, Gal=갈락토스, Fuc=푸코스, NeuAc=N-아세틸뉴라민산).
본 발명은 포유동물 세포를 핵산으로 형질감염시키는 단계; 형질감염된 포유동물 세포를 이종 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계; 및 포유동물 세포 또는 배양물로부터 이종 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, shRNA로 전사되는 핵산 및 이종 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포내에서 푸코스 개질도가 감소된 이종 폴리펩티드를 재조합적으로 제조하는 방법으로서, 상기 포유동물 세포에서 α1,6-푸코실 전이효소의 효소 활성이 α1,6-푸코실 전이효소 mRNA를 표적화하는 전사된 shRNA에 의해 감소되는, 방법을 포함한다.
놀랍게도, 본 발명자들은 shRNA로 전사되는 서열번호 5 또는 6의 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양함으로써 공지된 방법에 비해 감소된 푸코스 개질도를 갖는 면역글로불린, 면역글로불린 단편 또는 면역글로불린 접합체를 수득할 수 있음을 발견하였다.
본 발명은 또한 α1,6-푸코실 전이효소를 표적화하는 shRNA를 전사하기 위한, 서열번호 5 및 서열번호 6으로부터 선택된 (제 1) 발현 카세트, 네오마이신 선별 표시자를 발현하는 (제 2) 발현 카세트, 및 이종 폴리펩티드를 발현하는 (제 3) 발현 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 포함한다.
본 발명을 실시하는데 유용한, 당업자에게 공지된 방법 및 기술은 예를 들어 문헌[Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Glover, N.D., and Hames, B.D., ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (1995), Oxford University Press; Freshney, R.I. (ed.), Animal Cell Culture - a practical approach, IRL Press (1986); Watson, J.D., et al., Recombinant DNA, Second Edition, CHSL Press (1992); Winnacker, E.L., From Genes to Clones, N.Y., VCH Publishers (1987); Celis, J., ed., Cell Biology, Second Edition, Academic Press (1998); Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, Second Edition, Alan R. Liss, Inc., N.Y. (1987)]에 기술되어 있다.
재조합 DNA 기술의 사용은 핵산 및/또는 폴리펩티드의 많은 유도체의 제조를 가능하게 하였다. 이러한 유도체는, 예를 들어 하나의 개별적인 위치 또는 수개의 위치에서 치환, 교체, 교환, 결실 또는 삽입에 의해 개질될 수 있다. 개질 및 유도체화는, 예를 들어 부위 지정된 돌연변이유발에 의해 수행될 수 있다. 이러한 개질은 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA; Hames, B.D., and Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England] 참고).
재조합 기술의 사용은 하나 이상의 이종 핵산을 갖는 다양한 숙주 세포의 형질전환을 가능하게 한다. 비록 상이한 세포의 전사 및 번역, 즉 발현, 조직이 동일한 요소를 사용하지만, 상이한 종에 속하는 세포는 무엇보다도 상이한 소위 코돈 용법을 갖을 수 있다. 이에 따라, 동일한 폴리펩티드(아미노산 서열에 대해)는 상이한 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 또한, 유전자 코드의 퇴화에 기인하여, 상이한 핵산이 동일한 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
본원에 사용된 "핵산"은 폴리뉴클레오티드 분자, 예를 들어 DNA, RNA 또는 이들의 변형을 지칭한다. 이러한 폴리뉴클레오티드 분자는 자연적으로 발생하는 폴리뉴클레오티드 분자, 합성 폴리뉴클레오티드 분자, 또는 하나 이상의 자연적으로 발생하는 폴리뉴크레오티드 분자와 하나 이상의 합성 폴리뉴클레오티드 분자의 조합일 수 있다. 또한, 하나 이상의 뉴클레오티드가 예를 들어 돌연변이에 의해 변화되거나, 결실되거나, 또는 첨가되는 자연적으로 발생하는 폴리뉴클레오티드 분자가 상기 정의에 포괄된다. 핵산은 단리되거나, 다른 핵산, 예를 들어 발현 카세트, 플라스미드, 또는 숙주 세포의 염색체에 통합될 수 있다. 핵산은 또한 개별 뉴클레오티드로 이루어진 이의 핵산 서열에 의해 특징지어 진다.
예를 들어, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 아미노산 서열을 코딩하는 상응하는 핵산 서열로 전환시키는 과정 및 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 따라서, 핵산은 개별 뉴클레오티드로 이루어진 이의 핵산 서열, 및 또한 이에 의해 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 의해 특징지어 진다.
용어 "플라스미드"는 예를 들어 셔틀 및 발현 플라스미드/벡터, 및 형질감염 플라스미드/벡터를 포함한다. 용어 "플라스미드" 및 "벡터"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 전형적으로, "플라스미드"는 또한 복제의 근원(예를 들어, 복제의 ColE1 또는 oriP 근원), 및 박테리아내의 벡터/플라스미드 각각의 복제 및 선별을 위한 선별 표시자(예를 들어, 암피실린, 카나마이신, 테트라사이클린 또는 클로르암페니콜 선별 표시자)를 포함한다.
"발현 카세트"는 세포내에 함유된 하나 이상의 핵산, 예를 들어 구조 유전자의 발현을 위한 필수적인 조절 요소, 예컨대 프로모터 및 폴리아데닐화 부위를 함유하는 구성체를 지칭한다. 선택적으로, 예를 들어 발현된 폴리펩티드의 분비를 가능하게 하는 부가적인 요소가 함유될 수 있다. 함유된 핵산이 전사 후에 폴리펩티드로 번역되지 않고, 예를 들어 shRNA를 형성하는 발현 카세트의 사용이 또한 본 발명의 범위내이다.
"구조 유전자"는 신호 서열이 없는 유전자의 코딩 구역을 나타낸다.
"유전자"는 폴리펩티드 또는 단백질의 발현에 필수적인, 예를 들어 염색체 또는 플라스미드상의 핵산 분절을 나타낸다. 코딩 구역 외에, 유전자는 프로모터, 인트론, 종결자, 및 선택적으로 리더 펩티드를 비롯한 다른 작용성 요소를 포함한다.
"선별 표시자"는 상응하는 선별 시약의 존재하에 선별 표시자를 갖는 세포가 이를 위해, 또는 이에 대해 특이적으로 선별되도록 하는 핵산이다. 유용한 양성 선별 표시자는 항생물질에 대해 내성이 있는 유전자이다. 이러한 선별 표시자는 이것으로 형질전환된 숙주 세포가 상응하는 선별 시약, 예를 들어 항생제의 존재하에 양성적으로 선별되도록 한다. 형질전환되지 않은 숙주 세포는 배양물내에서 선별 조건하에 성장하거나 생존할 수 없다. 선별 표시자는 양성, 음성 또는 이작용성일 수 있다. 양성 선별 표시자는 표시자를 갖는 세포를 선별하도록 하는 반면에, 음성 선별 표시자는 표시자를 갖는 세포가 선별적으로 제거되도록 한다. 전형적으로, 선별 표시자는 숙주 세포의 대사적 또는 이화적 결함을 위한 약물 또는 보충물에 대한 내성을 부여한다. 진핵생물 세포가 사용된 선별 표시자는 예를 들어 아미노글리코시드 인산 전이효소(APH)를 위한 유전자, 예를 들어 하이그로마이신(hyg), 네오마이신(neo) 및 G418 선별 표시자, 다이하이드로폴레이드 환원효소(DHFR), 티미딘 키나제(tk), 글루타민 합성효소(GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소(선별 시약 인돌), 히스티딘올 탈수소효소(선별 시약 히스티딘올 D), 및 푸로마이신, 블레오마이신, 프레오마이신, 클로르암페니콜, 제오신 및 마이코페놀산에 내성을 부여하는 핵산을 포함한다. 추가의 표시 유전자는 예를 들어 국제특허공개공보 제WO92/08796호 및 제WO94/28143호에 기술되어 있다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 세포내에서 발생하는 전사 및/또는 번역 과정을 지칭한다. 숙주 세포내의 목적 생성물의 전사 수준은 세포내에 존재하는 상응하는 mRNA의 양을 기준으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 해당 서열로부터 전사된 mRNA는 PCR 또는 노턴 교배(Northern hybridization)에 의해 정량화될 수 있다(문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] 참고). 해당 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드는 다양한 방법, 예를 들어 ELISA, 폴리펩티드의 생물학적 활성에 대한 분석, 또는 상기 활성에 대해 독립적인 분석, 예컨대 인지되고 폴리펩티드에 결합된 면역글로불린을 사용하는 방사면역분석 또는 웨스턴 블롯팅(Western blotting)을 사용하여 정량화될 수 있다(상기 삼브룩 등의 1989년 문헌 참고).
용어 " 이종 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에"는 포유동물 세포내로 형질감염되는 핵산에 의해 코딩되고, 당업자에게 공지되어 있거나 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있는 이종 폴리펩티드의 발현을 위한 포유동물 세포의 배양에 사용되는 조건을 나타낸다. 이러한 조건이 배양된 포유동물 세포의 유형 및 발현된 단백질의 유형에 따라 변할 수 있음이 또한 당업자에게 공지되어 있다. 일반적으로, 포유동물 세포는 예를 들어 20 내지 40℃의 온도, 및 효과적인 단백질 제조에 충분한 시간 동안, 예를 들어 4 내지 28일 동안 배양된다.
용어 "세포" 또는 "숙주 세포"는 예를 들어 이종 폴리펩티드를 코딩하거나 shRNA를 구성하는 핵산이 도입/형질감염될 수 있는 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 벡터/플라스미드의 증식에 사용되는 원핵생물 세포, 및 핵산의 발현에 사용되는 진핵생물 세포 둘다를 포함한다. 바람직하게는, 진핵생물 세포는 포유동물 세포이다. 바람직하게는, 포유동물 (숙주) 세포는 CHO 세포(예를 들어, CHO K1 또는 CHO DG44), BHK 세포, N50 세포, SP2/0 세포, HEK 293 세포, HEK 293 EBNA 세포, PER.C6 세포 또는 COS 세포와 같은 포유동물 세포로부터 선택된다. 바람직하게는, 포유동물 세포는 하이브리도마, 골수종 및 침식성 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 골수종 세포는 래트 골수종 세포(예컨대, YB2) 및 마우스 골수종 세포(예컨대, N50, SP2/0)를 포함한다.
"폴리펩티드"는 천연적으로 또는 합성적으로 제조되는, 펩티드 결합에 의해 접합된 아미노산으로 이루어진 중합체이다. 약 20개 아미노산 잔기 미만의 폴리펩티드는 "펩티드"로서 지칭될 수 있는 반면에, 2개 이상의 폴리펩티드로 이루어지거나, 100개 초과의 아미노산 잔기의 하나의 폴리펩티드를 포함하는 분자는 "단백질"로서 지칭될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 비-아미노산 성분, 예컨대 탄수화물 기, 금속 이온, 또는 카복실산 에스터를 포함할 수 있다. 비-아미노산 성분은 폴리펩티드가 제조되는 세포에 의해 첨가될 수 있고, 세포의 유형에 따라 변할 수 있다. 폴리펩티드는 이의 아미노산 골격 구조에 의해 본원에 정의된다. 탄수화물 기와 같은 첨가물은 일반적으로 특이적이지 않지만, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "아미노산"은 핵산에 의해 직접적으로 또는 전구체의 형태로 코딩될 수 있는 카복시 α-아미노산으로 이루어진 군, 예컨대 알라닌(세 글자 코드: ala, 한 글자 코드: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파르산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 리신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 트레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 티로신(tyr, Y) 및 발린(val, V)을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "면역글로불린"은 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 코딩된 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어진 단백질을 나타낸다. 이러한 정의는 돌연변이 형태, 즉 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 및 삽입을 갖는 형태, 절단된 형태, 융합된 형태, 키메릭 형태, 및 인간화된 형태와 같은 변형을 포함한다. 인지된 면역글로불린 유전자는 예를 들어 영장류 및 설치류로부터의 무수한 면역글로불린 가변 구역 유전자 및 상이한 불변 구역 유전자를 포함한다. 면역글로불린은 다양한 형식으로, 예를 들어 Fv, Fab 및 (Fab)2, 및 단일 쇄(scFv)로 존재할 수 있다(예를 들어, 문헌[Huston, J.S., et al., Proc. Natal. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426]; 및 일반적으로 문헌[Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition (1984) and Hunkapiller, T., and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16)]). 단클론성 면역글로불린이 바람직하다.
존재하는 경우에 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 각각은 불변 구역(일반적으로 카복실 말단 부분)을 포함할 수 있다. 존재하는 경우에 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 각각은 가변 영역(일반적으로 아미노 말단 부분)을 포함할 수 있다. 면역글로불린의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역은 상이한 구역, 즉 4개의 골격 구역(FR) 및 3개의 고가변 구역(CDR)을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단클론성 면역글로불린"은 실질적인 동종 면역글로불린의 집단으로부터 수득된 면역글로불린, 즉 집단을 포함하는 개별 면역글로불린이 소량으로 존재할 수 있는 천연적으로 발생하는 가능한 돌연변이를 제외하고는 동일한 면역글로불린을 지칭한다. 단클론성 면역글로불린은 고도로 특이적이고, 당일 항원 부위(에피토프)를 표적화한다. 또한, 상이한 항원 부위(결정소 또는 에피토프)를 표적화하는 상이한 면역글로불린을 포함하는 다클론성 면역글로불린 제제와는 대조적으로, 각각의 단클론성 면역글로불린은 항원상의 단일 항원 부위를 표적화한다. 이의 특이성 외에, 단클론성 면역글로불린은 이들이 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않을 채로 합성될 수 있다는 것이다. 수식어 "단클론성"은 면역글로불린의 실질적인 동종 집단으로부터 수득되고, 임의의 특정 방법에 의해 면역글로불린의 생산을 필요로 하지 않는 것으로 해석되지 않는 면역글로불린의 특징을 나타낸다.
비-인간(예를 들어, 설치류) 면역글로불린의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린 및 인간 면역글로불린으로부터 유도된 부분적인 서열을 함유하는 키메릭 면역글로불린이다. 대부분의 경우, 인간화된 면역글로불린은 인간 면역글로불린(수여 면역글로불린)으로부터 유도되고, 이때 고가변 구역으로부터의 잔기는 비-인간 종(공여 면역글로불린), 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 또는 비-인간 영장류의 고가변 영역으로부터의 목적 특이성 및 친화도를 갖는 잔기에 의해 대체된다(예를 들어, 문헌[Morrison, S.L., et al., Proc. Natal. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855]; 미국특허 제5,202,238호; 및 US5,204,244호 참고). 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 골격 구역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화된 면역글로불린은 추가의 개질, 예를 들어 수여 면역글로불린 또는 공여 면역글로불린에서 발견되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 개질은 상응하는 모 서열과 동족이지만 동일하지 않는 상기 수여 또는 공여 면역글로불린의 변형을 야기한다. 이러한 개질은 면역글로불린 성능을 더욱 정제하도록 수행된다.
일반적으로, 인간화된 면역글로불린은 모든 또는 실질적으로 모든 고가변 루프가 비-인간 공여 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR이 인간 수여 면역글로불린의 것인 하나 이상의, 전형적으로 2개의 가변 영역을 실질적으로 모두 포함한다. 인간화된 면역글로불린은 선택적으로 면역글로불린 불변 구역, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부를 또한 포함한다.
비-인간 면역글로불린의 인간화 방법은 당해 분야에 기술되어 있다. 바람직하게는, 인간화된 면역글로불린은 비-인간 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "수입" 잔기로서 지칭되고, 이는 전형적으로 "수입" 가변 영역으로부터 취해진다. 인간화는 인간 면역글로불린의 상응하는 서열에 대해 고가변 영역 서열을 치환함으로써, 윈터(Winter) 및 동료 등의 방법(문헌[Jones, P.T., et al., Nature 321 (1986) 522-525; Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Verhoeyen, M., et al., Science 239 (1988) 1534-1536; Presta, L.G., Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992) 593-596])에 따라 본질적으로 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화된" 면역글로불린은 실질적으로 완전한 인간 가변 영역 미만이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메릭 면역글로불린이다(예를 들어, 미국특허 제US4,816,567호 참고). 실제로, 인간화된 면역글로불린은 전형적으로 일부 고가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 골격 구역 잔기가 설치류 또는 비-인간 영장류 면역글로불린의 유사 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 면역글로불린이다.
면역글로불린의 재조합 제조는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Research 48 (1998) 870-880]에 보고되었다.
바람직하게는, 이종 폴리펩티드는 면역글로불린, 면역글로불린 단편 및 면역글로불린 접합체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 면역글로불린, 면역글로불린 단편 또는 면역글로불린 접합체는 단클론성 면역글로불린, 단클론성 면역글로불린 단편 또는 단클론성 면역글로불린 접합체이다.
본원에 사용된 용어 "면역글로불린 단편"은 면역글로불린의 부분을 나타낸다. 면역글로불린 단편은 Fv, Fab, (Fab)2, 단일 쇄(scFv), 및 단일 중쇄 및 단일 경쇄, 및 골격 구역 1, 골격 구역 2, 골격 구역 3, 골격 구역 4, 고가변 구역 1, 고가변 구역 2, 고가변 구역 3, 각각의 경좨 및 중쇄, Fab-구역, 힌지-구역, 가변 구역, 중쇄 불변 영역 1, 중쇄 불변 영역 2, 중쇄 불변 영역 3 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 구역 및/또는 영역이 결실된 면역글로불린을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "면역글로불린 접합체"는 면역글로불린 및 폴리펩티드의 융합체를 나타낸다. 용어 면역글로불린 접합체는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편과 1 내지 8개, 바람직하게는 2 내지 4개의 폴리펩티드의 융합 단백질을 포함하고, 이에 의해 각각의 폴리펩티드가, 간섭하는 연결기 폴리펩티드가 존재 또는 부재하는, 상이한 N- 또는 C-말단 아미노산에 융합된다. 면역글로불린 접합체가 하나 초과의 비-면역글로불린 폴리펩티드를 포함하는 경우, 각각의 접합된 비-면역글로불린 폴리펩티드는 동일하거나 상이한 아미노산 서열 및/또는 길이를 가질 수 있다.
본원에 사용된 표현 "세포"는 대상 세포 및 이의 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 주요 대상 세포 및 전달체의 수와 관계 없이 이로부터 유도된 배양물을 포함한다. 모든 자손이 계획적인 또는 우연한 돌연변이에 기인하여, DNA 함량이 정확히 동일하지 않을 수 있음이 또한 이해된다. 본래 형질전환된 세포에 대해 선별된 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변형 자손이 포함된다.
본 발명에 따른 이종 폴리펩티드는 재조합 수단에 의해 제조된다. 이러한 방법은 당해 분야에 광범위하게 공지되어 있고, 원핵생물 및 진핵생물 세포에서의 단백질 발현과 함께, 이종 폴리펩티드의 회수 및 단리, 및 약학적으로 허용되는 순도로의 통상적인 정제를 포함한다. 이종 폴리펩티드가 면역글로불린인 경우, 이의 경쇄 및 중쇄 또는 이의 단편 또는 이의 접합체를 코딩하는 핵산은 표준 방법에 의해 발현 카세트에 삽입된다. 면역글로불린을 코딩하는 핵산은 통상적인 과정을 사용하여 용이하게 단리되고, 서열화된다. 하이브리도마 세포는 이러한 핵산의 공급원으로서 역할을 한다. 발현 카세트는 하나 이상의 발현 벡터에 삽입될 수 있고, 이어서 달리 면역글로불린을 생산하지 않는 (숙주) 세포로 형질감염된다. 발현은 적절한 진핵생물 (숙주) 세포에서 수행되고, 면역글로불린은 리시스 후 세포로부터, 또는 상청액으로부터 회수된다.
항체의 재조합 제조는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Research 48 (1998) 870-880]에 기술되어 있다.
상이한 방법이 잘 확립되어 있고, 단백질 회수 및 정제, 예컨대 미생물 단백질을 사용한 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 양이온 교환(카복시메틸 수지), 음이온 교환(아미노 에틸 수지) 및 혼합된-방식 교환), 친티오성 흡착(예컨대, 베타-머캡토에탄올 및 다른 SH 리간드), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피(예를 들어, 페닐-세파로스, 아자-아레노필릭 수지 또는 m-아미노페닐보론산을 사용함), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피(예를 들어, Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질을 사용함), 크기 배제 크로마토그래피 및 전기영동 방법(예컨대, 겔 전기영동, 모세관 전기영동)을 위해 광범위하게 사용된다(문헌[Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102]).
본 발명은 일반적으로 소위 이중-가닥 RNA 뉴클레아제 다이서(Dicer) 및 RISC 착물을 발현하는 모든 살아있는 세포, 즉, RNA 조절된 유전자 사일렌싱이 관찰될 수 있는 모든 세포에 적용가능하다. 따라서, 본 발명은 포유동물 세포주에 주로 적용될 수 있고, 또한 모든 유형의 진핵생물 세포에 적용될 수 있다. 그러나, 재조합 폴리펩티드를 제조하는데 통상적으로 사용되는 세포주, 예컨대 중국 햅스터 난소 세포, 예를 들어 CHO K1(문헌[Jones, C., et al., Cytogenet. Cell Genet. 16 (1976) 387-390]) 또는 CHO DG44(문헌[Urlaub, G, et al., Cell 33 (1983) 405-412; Urlaub, G., et al., Somat. Cell. Mol. Genet. 12 (1986) 555-566]), 인간 태아 신장 세포, 예컨대 HEK 293 세포([문헌Graham, F.L., et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59-74]), 또는 HEK 293 EBNA 세포, NS0 세포(문헌[Barnes L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270]), 및/또는 SP2/0 세포([Shulman, M., et al., Nature 276 (1978) 269-270])가 바람직하다.
본원에서 용어 "α1,6-푸코실 전이효소의 효소 활성의 감소" 및 이의 문법적인 동의어는 이종 폴리펩티드의 발현에 사용되는 세포에서 상기 α1,6-푸코실 전이효소를 코딩하는 특이적 표적 mRNA의 감성을 나타내고, 이는 shRNA 화합물에 의해 조절된다. shRNA 화합물 자체를 shRNA 화합물을 구성하는 적절한 발현 카세트에 의해 (숙주) 세포를 형질감염시킨 후 합성한다. 선택적으로, 후속적으로 RNAi 화합물로 가공되는 RNAi 화합물의 전구체에 의한 형질감염이 가능하다.
본 발명에 따른 RNAi 화합물은 α1,6-푸코실 전이효소를 코딩하는 mRNA(표적화된 mRNA)를 표적화하는 shRNA이다. 지금까지, 2개의 주요한 유전자 사일렌싱 전략이 시험관내 연구를 위해 출현하였다: 작은 간섭 RNA(siRNA) 및 작은 헤어핀 RNA(shRNA)(문헌[Tuschl, T., Nature Biotechnol. 20 (2002) 446-448]). 본 발명에 따른 플라스미드-유도된 shRNA는 리포터 유전자 또는 선별 표시자와의 조합을 위한 선택권, 및 바이러스 벡터를 통한 전달을 제공한다(문헌[Brummelkamp, T.R., and Bernards, R., Nat. Rev. Cancer 3 (2003) 781-789]). RNAi 화합물을 사용한 세포의 형질감염은 표적 mRNA의 감소된 수준, 및 이에 따른 상응하는 폴리펩티드 및 수반하는 상응하는 효소 활성의 감소된 수준을 갖는 세포를 야기한다. mRNA 수준은 5 내지 20%, 바람직하게는 5 내지 15%, 더욱 바람직하게는 5 내지 10%의 mRNA 수준의 상응하는 야생-형의 세포이다. 야생-형의 세포는 표적화된 mRNA가 RNAi 화합물에 의해 감성되지 않은, RNAi 화합물을 코딩하는 핵산의 도입 전의 세포이다.
안정한 세포 클론의 발생은 종종 지루하고 긴 과정이다. 따라서, 한 양태에서, 재조합적으로 발현된 세포 표면 표시자를 사용하는 선별이 형질감염체의 단리에 사용된다. 발현 생산물이 높은 수준의 shRNA 화합물을 발현하는 형질감염체의 강화 및 선별을 위한 표시자로서 세포 표면상에 위치되는 임의의 종류의 유전자를 사용하는 것은 본 발명의 범위내이다. 저-친화성 신경 성장 인자 수용체의 절단된 형태이고, 이에 따라 신호 형질도입에 불활성인 1-NGFR은 세포 표면상에서 발현되고, 세포 생물학적 분석을 위한 매우 유용한 표시자인 것이 증명되었다(문헌[Phillips, K., et al., Nat. Med. 2 (1996) 1154-1156 and Machl, A.W., et al., Cytometry 29 (1997) 371-374]).
본 발명의 범위내에서, 세포 형질전환체는 당해 분해에 공지된 임의의 종류의 형질감염을 사용하여 실질적으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 벡터 DNA는 전기천공 또는 미량주사에 의해 세포에 도입될 수 있다. 선택적으로, 리포펙션(lipofection) 시약, 예컨대 푸젠 6(FuGENE 6, 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Diagnostics GmbH)), X-트림젠(X-tremeGENE, 로슈 다이아그노스틱스 게엠베아), 리포펙트아민(LipofectAmine, 인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corp.)) 또는 뉴클레오펙션(nucleofection, 독일 쾰른 소재 아막사 아게(AMAXA AG))이 사용될 수 있다. 또한 선택적으로, 세포 표면 단백질 및 shRNA 화합물을 위한 발현 카세트를 포함하는 벡터 DNA가 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-결합 바이러스를 기초로 하는 적절한 바이러스 벡터 시스템에 의해 세포내로 도입될 수 있다(문헌[Singer, O., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 5313-5314]).
한 양태에서, 포유동물 세포는 선별 표시자를 코딩하는 핵산으로 형질감염된다. 바람직하게는, 선별 표시자는 하이그로마이신, 푸로마이신 및/또는 네오마이신 선별 표시자로부터 선택된다. 이러한 양태에서, 선별 압력, 즉 선별 시약의 존재하의 배양은 안정적으로 형질감염된 세포주의 선별/성장을 야기한다. 한 양태에서, 선별 압력은 렌스 쿨리나리스 아글루티닌(Lens culinaris agglutinin; LCA)의 첨가이다.
한 양태에서, 본 발명은 포유동물 세포를 이종 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계; 및 포유동물 세포 또는 배양물로부터 이종 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하되, 상기 포유동물 세포가 α1,6-푸코실 전이효소 mRNA를 표적화하는 shRNA로 전사되는 서열번호 5 또는 6의 제 1 핵산; 네오마이신 선별 표시자를 코딩하는 제 3 핵산; 및 이종 폴리펩티드를 코딩하는 제 2 핵산을 포함하는 핵산으로 형질감염된, 포유동물 세포내의 푸코스 개질도가 감소된 이종 폴리펩티드를 재조합적으로 제조하는 방법을 포함한다. 한 양태에서, 포유동물 세포는 단일 핵산으로 형질감염된다. 본원에서 용어 "단일 핵산"은 코딩된 mRNA에 영향을 주지 않는 변화로서 핵산의 발생 및 제조로부터 나타나는 단일 뉴클레오티드 변화에도 불구하고 동일한 핵산 서열을 갖는 핵산의 혼합물을 나타낸다. 본원에서 용어 "동일한 핵산 서열"은 포유동물 세포를 형질감염시키는데 사용된 핵산이 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상, 또는 98% 초과의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 것을 나타낸다.
shRNA 화합물을 구성하는 핵산으로부터 유도된 전사체는 Pol II 프로모터, 예컨대 CMV 프로포터, 또는 Pol III 프로모터, 예컨대 H1, H6 또는 75K 프로모터로부터 전사될 수 있다(문헌[Zhou, H., et al., Nucleic Acids Res. 33 (2005) e62; Brummelkamp, T.R. and Bernards, R., Nat. Rev. Cancer 3 (2003) 781-789; Czauderna, F., et al., Nucleic Acids Res. 31 (2003) e127]).
Pol III 조절된 전사의 경우, 전구체 RNA 생성물의 적절한 3' 가공을 위해 전사된 RNA의 3' 말단에서 TTTT, 바람직하게는 TTTTTT의 Pol III 종결자 서열을 갖는 것이 필수적이다(문헌[Dykxhoorn, D. M., et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4 (2003) 457-467]).
RNAi 화합물은 헤어핀 형태를 갖는 RNA, 즉 shRNA이다. 활성 RNAi 화합물로서, 이러한 분자는, H1 및 U6 프로모터로부터의 전사가 통상적으로 G로부터 출발하는 사실에 기인하여, 이의 5' 말단에서 G 뉴클레오티드로 출발할 수 있다. 분자의 줄기는 전화된 반복 서열에 기인하고, 길이가 19 내지 29개, 바람직하게는 19 내지 23개의 염기 쌍이다. 바람직하게는, 이러한 전화된 반복 서열은 서로 완전히 상보적이고, 임의의 내부적인 부적합한 쌍 없이 이중 가닥 하이브리드를 형성할 수 있다.
분자의 내부 루프는 4 내지 40개, 바람직하게는 4 내지 9개의 뉴클레오티드의 단일 가닥 쇄이다. 이러한 루프의 경우, shRNA 분자로서 작용할 수 없는, 교호 제 2 구조로의 분자의 폴딩(folding)을 방지하기 위하여, 임의의 전화된 반복 서열을 피하는 것이 중요하다.
shRNA의 3' 말단에는 돌출부가 존재할 수 있다. Pol III 프로모터의 사용의 경우, 돌출부는 Pol III 프로모터의 종결자 신호에 기인하여 2 내지 4개의 U 잔기일 수 있다. 세포내에서 발현되는 경우, 이러한 헤어핀 구성체는 유전자 사일렌싱을 조절할 수 있는 활성 이중 가닥 분자로 신속하게 가공된다(문헌[Dykxhoorn, D. M., et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4 (2003) 457-467]).
핵산(DNA)은 4개의 뉴클레오염기 또는 뉴클레오티드 염기 A, C, T 및 G로 구성된다. A는 아데노신을 나타내고, C는 시티딘을 나타내고, T는 티미딘을 나타내고, G는 구아노신을 나타낸다. RNA에서, 티미딘은 우리딘(U)으로 대체된다.
α1,6-푸코실 전이효소 mRNA를 표적화하는 shRNA 화합물은 적절한 발현 카세트로부터 전사된다. 이는 길이가 19 내지 29개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 19 내지 23개의 뉴클레오티드인 줄기를 포함하고, 이의 서열은 불활성화되어야 하는 표적 mRNA와 동일하다/상보적이다.
한 양태에서, α1,6-푸코실 전이효소 mRNA를 표적화하는 shRNA의 줄기의 핵산은 서열번호 1(CCAGAAGGCCCTATTGATC), 서열번호 2(GCCAGAAGGCCCTATTGATC) 및 서열번호 3(GATCAATAGGGCCTTCTGGTA)을 포함하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 양태에서, α1,6-푸코실 전이효소 mRNA를 표적화하는 shRNA의 루프의 핵산은 핵산 TTCAAGAGA(서열번호 4)이다.
한 양태에서, shRNA로 전사되는 핵산은 서열번호5 및 6을 포함하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 즉, shRNA로 전사되는 핵산은 서열번호 5의 핵산 서열 또는 서열번호 6의 핵산 서열을 갖는다.
본 발명에 따른 방법을 사용하여, 약 50개의 인자에 의해 표적 mRNA의 감소가 달성된다. 이러한 감소의 정도는 푸코실화의 감소된 정도를 갖는 이종 폴리펩티드를 합리적으로 높은 수율로 제조하는데 충분하다.
용어 "감소된 푸코스 개질도를 갖는 이종 폴리펩티드" 및 이의 문법적인 동의어는 α1,6-푸코실 전이효소 mRNA를 표적화하는 shRNA로 전사되는 핵산 및 이종 폴리펩티드 코딩하는 핵산으로 형질감염된 포유동물 세포에서 발현된 이종 폴리펩티드를 나타내고, 아스파라긴-연결된 N-아세틸글루코사민의 6-위치에서의 이의 푸코실화는 이종 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 형질감염되지만, α1,6-푸코실 전이효소 mRNA를 표적화하는 shRNA로 전사되는 핵산에 의해서는 형질감염되지 않은, 동일한 유형의 포유동물 세포에서 발현되는 이종 폴리펩티드와 비교하여 감소된다. 한 양태에서, 이종 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 형질감염되었지만, α1,6-푸코실 전이효소 mRNA를 표적화하는 shRNA로 전사되는 핵산으로는 형질감염되지 않은, 동일한 유형의 포유동물 세포에서 발현되는 이종 폴리펩티드의 푸코실화에 대한, α1,6-푸코실 전이효소 mRNA를 표적화하는 shRNA로 전사되는 핵산 및 이종 폴리펩티드 코딩하는 핵산으로 형질감염된 포유동물 세포에서 발현된 이종 폴리펩티드의 푸코실화의 비는 15% 이하이다. 이는 이종 폴리펩티드가 15% 이하까지 푸코실화됨을 나타낸다. 바람직하게는, 푸코실화된 이종 폴리펩티드에 대한 푸코실화되지 않은 이종 폴리펩티드의 비는 0.15 이하, 예를 들어 0.12이다.
"이종 DNA" 또는 "이종 폴리펩티드"는 소정의 숙주 세포내에 천연적으로 존재하지 않는 DNA 분자 또는 폴리펩티드, 또는 DNA 분자의 집단, 또는 폴리펩티드 분자의 집단을 지칭한다. 특정 숙주 세포에 대해 이종인 DNA 분자는 숙주 DNA가 비-숙주 DNA(즉, 외생 DNA)와 조합되는 한, 숙주 세포 종(즉, 내생 DNA)로부터 유도된 DNA를 함유할 수 있다. 예를 들어, 프로모터를 포함하는 숙주 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 폴리펩티드를 코딩하는 비-숙주 DNA 분절을 함유하는 DNA 분자는 이종 DNA 분자인 것으로 간주된다. 반대로, 이종 DNA 분자는 외생 프로모터와 작동가능하게 연결된 내생 구조 유전자를 포함할 수 있다. 비-숙주 DNA 분자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 "이종" 폴리펩티드이다.
"작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 성분의 병렬을 지칭하고, 이때 상기 성분은 이들을 이들의 의도된 방식으로 작용하도록 하는 관계에 있다. 예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서는, 이들이 연결된 서열의 전사를 제어하거나 조절하도록 시스로 작용하는 경우, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적이지만 필수적이지는 않게, "작동가능가게 연결된" DNA 서열은 인접하고, 이때 분비 리더/신호 서열 및 인접하고 판독 프레임내에 있는 폴리펩티드와 같은 구역을 코딩하는 2개의 단백질을 접합시키는 것이 필요하다. 폴리아데닐화 부위는, 전사가 코딩 서열을 통해 폴리아데닐화 서열내로 진행하도록 코딩 서열의 다운스트림 말단에 위치하는 경우, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 연결은 당해 분야에 공지된 재조합 방법, 예를 들어 PCR 방법, 및/또는 편리한 억제 부위에서의 결찰에 의해 수행된다. 편리한 억제 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 연결기는 통상적인 실시에 따라 사용된다.
하기 실시예 및 서열 목록은 본 발명, 및 첨부된 청구의 범위에 설명된 진정한 범위의 이해에 도움을 주도록 제공되었다. 본 발명의 사상에서 벗어남이 없이, 설명된 과정에 개질이 행해질 수 있음이 이해된다.
실시예 1
벡터 클로닝
벡터 pSilencer2.1_U6neo(암비온 인코포레이티드(Ambion Inc.) cat. no. 5764)의 위치 184에서, XhoI 부위를 부위 지정된 돌연변이유발에 의해 도입하였다. 이어서, 1-NGFR(저 친화성 신경 성장 인자; 문헌[Phillips, K., et al., Nat. Med. 2 (1996) 1154-1156 and Machl, A.W., et al., Cytometry 29 (1997) 371-374] 참고) 발현 카세트를 XhoI/HindIII 억제 부위에 클로닝하였다. FuT8 shRNA를 생성하기 위하여, 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하였다:
Figure 112009037268010-pct00001
풀린 FuT8 shRNA를 상응하는 벡터 단편에 결찰하였다(다이제스팅(digesting)된 BamHI/HindIII). 완료된 벡터를 pSilencer2.1_U6neo_1-NGFR_shRNAFuT8(pSilencer)로 지칭하였다.
실시예 2
단일 클론의 선별 및 단리
CHO-DG44 세포를 항체 발현 플라스미드를 사용하여 형질감염시켰다. 예시적인, 항체로서 성장 인자 수용체 1과 같은 인간 인슐린에 결합하는 항체를 사용하였다(서열에 대해서는 예를 들어 국제특허공개공보 제WO2005/005635호 참고).
CHO-DG44 클론(야생-형, pSilencer 없음)을 제조하는 항체를 제조사의 설명서에 따라 푸젠 시약(로슈 다이아크노스틱스 게엠베하)을 사용하여 pSilencer2.1_U6neo_1-NGFR_shRNAFuT8을 사용하여 형질감염시켰다. 안정적으로 형질감염된 세포를 1% 200mM L-글루타민(L-Glutamine; 깁코(Gibco; 등록상표명)) 및 10% 투석된 감마 조사된 소 태아 혈청(cat. no. 1060-017; 깁코(등록상표명), 독일 소재 인비트로젠 게엠베하(Invitrogen GmbH))로 보충된 MEM 알파 미디움(MEM Alpha Medium; cat. no. 22561-021; 깁코(등록상표명), 독일 소재 인비트로젠 게엠베하)에서 배양하였다. 형질감염된 세포를 1주 동안 400㎍/㎖ 네오마이신을 사용하여 선별하였다. 생존한 세포는 생산자의 설명서에 따라 MACSelect-1-NGFR 시스템(밀테나이 바이오텍(Miltenyi Biotec); Cat. 130-091-879))을 사용하여 1-NGFR-강화되었다. 1-NGFR-강화 세포는 0.5mg/㎖ LCA(렌즈 쿨리나리스 어글루티닌)를 사용하여 선별하였다. LCA-선별 세포의 클론을 LCA-선별 풀을 96웰 당 하나의 세포로 희석함으로써 회수하였다.
실시예 3
RNA 단리 및 cDNA 합성 및 정량적인 RT-PCR
전체 RNA를 DNAse 다이제스션(digestion)을 포함하는 RNeasy 미니 키 트(RNeasy Mini Kit; 독일 소재 키아젠 게엠베하(Qiagen GmbH))를 사용하여 단리하였다. 전체 RNA의 동등한 양(400ng)을 고정된 올리고 (dT)18 프라이머를 갖는 트랜스크립터 퍼스트 스트랜드 DNA 신세시스 키트(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit; 독일 소재 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하)를 사용하여 역전사하였다. 샘플을 라이트사이클러 패스트스타트 DNA 마스터 SYBR 그린 I 키트(LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I kit; 독일 소재 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하)를 사용하는 cDNA 합성 후 실시간 PCR에 의해 분석하였다. FuT8(푸코실 전이효소 8) 및 ALAS(5-아미노래불리네이트 합성효소) cDNA의 증폭 및 검출을 위해, 서열-특이적 프라이머를 다음과 같이 사용하였다:
FuT8 정방향: 5'-GGCGTTGGATTATGCTCATT-3' (서열번호 7)
FuT8 역방향: 5'-CCCTGATCAATAGGGCCTTC-3' (서열번호 8)
ALAS 정방향: 5'-CCGATGCTGCTAAGAACACA-3' (서열번호 9)
ALAS 역방향: 5'-CTTCAGTTCCAGCCCAACTC-3' (서열번호 10)
증폭을 하기 조건하에 수행하였다: 95℃에서의 10분의 예비-배양 단계, 및 이어서, 95℃에서 10초, 52℃에서 10초, 및 72℃에서 8초의 45회 사이클(온도 램프 20℃/초). FuT8 cDNA 수준을 라이트사이클러 렐러티브 콴티피케이션 소프트웨어(LightCycler Relative Quantification Software)를 사용하여 하우스키핑 유전자(housekeeping gene) ALAS의 수준으로 정상화하였다. 결과를 하기 표 1에 제시한다.
FuT8 mRNA 발현의 라이트사이클러 RT-PCR 분석
클론: % FuT8-발현 mRNA
야생-형 100(기준)
대조군 shRNA 69
LCA, 클론 1 2
LCA, 클론 2 34
LCA, 클론 3 16
LCA, 클론 4 23
LCA, 클론 5 6
LCA, 클론 6 5
LCA, 클론 7 15
LCA, 클론 8 127
LCA, 클론 9 3
LCA, 클론 10 23
LCA, 클론 11 14
LCA, 클론 1 및 LCA, 클론 9는 약 50- 내지 40-배 감소된 α1,6-푸코실 전이효소 mRNA의 잔여 양을 발현한다.
실시예 4
항체 글리코스트럭처(glycostructure)의 질량 스펙트럼 분석
항체의 각각 Asn297 및 Asn298에서의 당 쇄 이성질형의 상대적인 함량은 하기 기술된 바와 같은 질량 분석에 의해 글리코실화된 완전한 항체 중쇄(HC)에서 측정되었다:
(A) 항체 및 FuT8 shRNA를 발현하는 세포의 배양 상청액으로부터의 항체의 정제
FuT8에 대한 shRNA를 또한 발현하는 세포에 의해 제조된 항체(농도 약 5 내지 20㎍/㎖)를 함유하는 약 5 내지 10㎖의 배양 상청액을 바이알을 전화하면서 밤새 4℃에서 약 100㎕의 단백질 A-세파로스(A-Sepharose, 상표명) CL-4B(30mg/100㎕; 아머샴 파마시아 바이오텍 AB(Amersham Pharmacia Biotech AB))의 현탁액으로 배양하였다. 이어서, 샘플을 에펜도르프(Eppendorf) 원심분리기 5810R에서 약 400xg로 15분 동안 원심분리하여 항체가 결합되는 단백질 A-세파로스를 침전시켰다. 배양 상청액을 완전히 제거하고, 펠렛을 약 50㎕ 이중 증류된 물을 사용하여 3회 세척하였다. 3회 세척 후, 용액을 완전히 제거하고, 약 30 내지 50㎕의 100mM 시트레이트-완충액(pH 2.8)을 펠렛에 첨가하고, 단백질 A에 결합된 항체를 방출하기 위하여 실온에서 15분 동안 진탕하면서 배양하였다. 배양 후, 현탁액을 에펜도르프 원심분리기에서 14,000rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 생성된 상척액을 조심스럽게 제거하였다. 단백질 A 펠렛을 약 30 내지 50㎕의 100mM 시트레이트-완충액(pH 2.8)을 첨가하고, 실온에서 약 15분 동안 진탕하고, 에펜도르프 원심분리기에서 14,000rpm으로 5분 동안 원심분리하여 단백질 A-세파로스를 스피닝 다운(spinning down)함으로써 1회 세척하였다. 상청액을 조심스럽게 제거하고, 제 1 방출 단계의 각각의 용액과 합하였다. 단백질 A 펠렛을 폐기하였다.
(B) ESI-질량 분석에 의한 올리고당 구조 이성질형의 분석
단계 (A)에서 수득된 항체 샘플(약 60㎕, 각각 20 내지 50㎕를 함유함)을 변성시키고, 항체 용액을 3 내지 4M 구아니딘-하이드로클로라이드 및 250mM TCEP로 조정하도록 100㎕의 6M 구아니딘-하이드로클로라이드 용액 및 60㎕의 TCEP-구아니딘-용액(6M 구아니딘-하이드로클로라이드중 1M 트리스(2-카복시에틸)-포스핀 하이드로클로라이드)을 첨가함으로써 경쇄(LC) 및 글리코실화 중쇄(HC)로 감소시켰다. 샘플을 37℃에서 1.5시간 동안 배양하였다. 감소되고, 변성된 샘플을 작동하는 완충액으로서 2% 폼산(V/V) 및 40% 아세토나이트릴(V/V)을 사용한 G25 젤 여과에 의해 탈염시키고, 이어서 약 10,000 해상도의 워터스(Waters)로부터의 Q-Tof2- 또는 LCT-질량 분석기에서 나노스프레이 니들(nanospray needle; 프록세온(Proxeon) Cat No. ES 387)을 사용하는 오프라인 정적 ESI-MS 분석을 거치게 하였다. 기기를 제조사의 지시에 따라 조율하고, 제 1 차 폴리노미얼 피트를 사용하여 500 내지 2,000의 질량 범위인 나트륨 요오드로 조정하였다. 결과를 도 2에 제시한다.
샘플을 측정하는 동안, 일상적으로, 700 내지 2,000의 질량 범위인 30 내지 40 단일 스캔을 기록하고, 10 내지 30 단일 스캔을 첨가하여 평가에 사용된 최종 m/z-스펙트럼을 수득하였다.
HC에 결합된 탄수화물 구조의 동정 및 개별적인 당 구조 이성질형의 상대적인 함량의 계산을 수득된 m/z 스펙트럼으로부터 수행하였다. 물의 질량 링스(lynx) 소프트웨어의 디콘볼루션(deconvolution) 도구는 검출된 개별적인 글리코실화 HC-종의 질량을 계산하는데 사용되었다.
HC에 부착된 각각의 탄수화물 구조는 개별적인 글리코실화 HC-종에 대해 수득된 질량 및 DNA 서열로부터 추론된 비-글리코실화 HC에 대한 질량 사이의 질량 차이를 계산함으로써, 그리고 항체의 공지된 N-연결 글리콜 구조의 이론적인 질량과는 상이한 상기 질량 차이를 비교함으로써 정해졌다.
올리고당 이성질형의 비의 결정을 위해서, 개별적이고 상이하게 글리코실화된 HC-종의 피크 높이를 다른 분자 종, 예컨대 LC의 다른 신호와 중복되지 않는, 수개의 선택된 신호 전하(m/z)-상태로부터 결정되었다. 비의 측정을 위해서, 올리고당 이성질형 , G0 + Fuc 및 G0(도 3 참고)의 피크 높이를 선택된 신호 전하(m/z)-상태로부터 결정하였다(예로서 도 2를 참고). 상이한 푸코실화를 갖는 당 구조의 상대적인 함량은 단지 G0-구조 + 푸코스(G0 + Fuc; 착물, 종결 갈락토스 잔기가 결핍되고 핵-푸코실화를 포함하는 이중안테나 구조)를 함유하는 HC-종, 및 G0-구조 - 푸코스(G0 - Fuc; 도 3a 참고)를 함유하는 HC-종을 함유하는 HC-종의 피크 높이의 비로부터 추론되었다. 이러한 측정을 위하여, 동일한 전하(m/z)-상태내의 상응하는 피크가 사용되었다(예를 들어, G0 - 푸코스 및 m/z 45의 푸코스가 없는 G0). 정량적인 결과는 하기 표 2에 제시된다.
질량 분석에 의해 측정된 푸코실화의 백분율
클론 100 - 푸코실화의 양[%]
LCA, 클론 1 88
LCA, 클론 9 83
실시예 5
ADCC-분석(항체 의존 세포 독성)
LCA 클론 1 및 9, 및 대조군으로서 야생-형 세포에 의해 제조된 항체의 첨가에 의해 유도된 종양 세포 리시스의 검출을 위한 ADCC 분석을 생산자의 설명서에 따라 수행하였다(미국 소재 퍼킨엘머(PerkinElmer)). 작동자 세포로서, 새로이 단리된 말초 혈액 세포를 사용하고, 표적 세포로서 DU145 세포를 사용하였다. 결과를 하기 표 3에 제시한다.
Figure 112009037268010-pct00002
실시예 6
사일렌싱 효과의 안정성
CHO-DG44/야생-형 및 CHO-DG44/LCA-클론 9를 선별 압력 없이 4주 동안 배양하였다. 매주 1x106 세포를 6cm 배양 접시에 위치시켰다. 24시간 후, 세포를 수확하였다. RNA 단리, cDNA-합성, 정량적인 RT-0PCR 및 데이터 분석을 실시예 3과 같이 수행하였다. 결과를 하기 표 4에 제시한다.
세포가 수확된 클론/주 % FuT8 mRNA 발현
야생-형 100(기준)
LCA, 클론 9, 1주 8
LCA, 클론 9, 2주 9
LCA, 클론 9, 3주 9
LCA, 클론 9, 4주 9
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> SHRNA-MEDIATED INHIBITION OF EXPRESSION OF ALPHA-1,6-FUCOSYLTRANSFERASE <130> 24067 FT <150> EP06026653.3 <151> 2006-12-22 <160> 10 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sequence encoding stem of shRNA <400> 1 ccagaaggcc ctattgatc 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sequence encoding stem of shRNA <400> 2 gccagaaggc cctattgatc 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sequence encoding stem of shRNA <400> 3 gatcaatagg gccttctggt a 21 <210> 4 <211> 9 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sequence encoding loop of shRNA <400> 4 ttcaagaga 9 <210> 5 <211> 66 <212> DNA <213> artificial <220> <223> F8shRNA4top <400> 5 gatccgccag aaggccctat tgatcttcaa gagagatcaa tagggccttc tggtattttt 60 tggaaa 66 <210> 6 <211> 66 <212> DNA <213> artificial <220> <223> F8shRNA4bot <400> 6 agcttttcca aaaaatacca gaaggcccta ttgatctctc ttgaagatca atagggcctt 60 ctggcg 66 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> FuT8 forward <400> 7 ggcgttggat tatgctcatt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> FUT8 reverse <400> 8 ccctgatcaa tagggccttc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> ALAS forward <400> 9 ccgatgctgc taagaacaca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> ALAS reverese <400> 10 cttcagttcc agcccaactc 20

Claims (7)

  1. 포유동물 세포를 이종 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계; 및
    상기 포유동물 세포 또는 배양물로부터 이종 폴리펩티드를 회수하여 상기 이종 폴리펩티드를 제조하는 단계
    를 포함하는, 포유동물 세포내에서 푸코스 개질도가 감소된 이종 폴리펩티드를 재조합적으로 제조하는 방법으로서,
    상기 포유동물 세포가 (i) α1,6-푸코실 전이효소 mRNA를 표적화하는 shRNA로 전사되는 서열번호 5 또는 6의 제 1 핵산, 및 (ii) 이종 면역글로불린, 면역글로불린 단편 또는 면역글로불린 접합체를 코딩하는 제 2 핵산으로 형질감염됨을 특징으로 하는, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    포유동물 세포를 배양하는 단계가 렌스 쿨리나리스 아글루티닌(Lens culinaris agglutinin; LCA)의 존재하에 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    포유동물 세포가 (iii) 네오마이신 선별 표시자 또는 저 친화성 신경 성장 인자(1-NGFR)를 코딩하는 제 3 핵산으로 형질감염됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    포유동물 세포가
    α1,6-푸코실 전이효소 mRNA를 표적화하는 shRNA로 전사되는 서열번호 5 또는 6의 제 1 핵산;
    네오마이신 선별 표시자 또는 1-NGFR을 코딩하는 제 2 핵산; 및
    이종 폴리펩티드를 코딩하는 제 3 핵산
    을 포함하는 단일 핵산으로 형질감염됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    포유동물 세포가 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK 293 세포, HEK 293 EBNA 세포, PER.C6 세포 및 COS 세포를 포함하는 포유동물 세포로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 서열번호 5의 핵산 및 서열번호 6의 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 제 1 핵산;
    네오마이신 선별 표시자 또는 1-NGFR을 코딩하는 제 2 핵산; 및
    면역글로불린, 면역글로불린 단편 및 면역글로불린 접합체를 포함하는 이종 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 이종 폴리펩티드를 코딩하는 제 3 핵산
    을 포함하는 핵산.
  7. 제 6 항에 따른 핵산을 포함하는 포유동물 세포.
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