MX2010011293A

MX2010011293A - Metodos para producir una proteina policlonal.

Info

Publication number: MX2010011293A
Application number: MX2010011293A
Authority: MX
Inventors: Finn C Wiberg; Anne Bondgaard Tolstrup; Dietmar Weilguny; Christian Mueller; Lars Soegaard Nielsen; Jonas Heilskov Graversen
Original assignee: Symphogen As
Priority date: 2008-04-23
Filing date: 2009-04-23
Publication date: 2010-12-20
Also published as: WO2009129814A1; EP2280998A1; RU2010147652A; KR20110016899A; SG189793A1; CN102007146A; ZA201006765B; NZ588651A; US20110117605A1; CA2722348A1; JP2011518790A; BRPI0910454A2; AU2009240386A1; IL208163A0

Abstract

La invención se refiere a métodos para producir productos de fármaco que comprenden al menos dos miembros distintos de una proteína policlonal, por ejemplo un anticuerpo policlonal, donde cada miembros distinto se expresa por una población separada de células. Los métodos comprenden al menos un paso inicial en el cual se cultivan de manera separada las poblaciones celulares que expresan los distintos miembros de la proteína policlonal. Las poblaciones celulares individuales, o las proteínas expresadas por las poblaciones celulares individuales, se combinan en un punto posterior del procesamiento de etapa anterior o de etapa posterior para por resultado un producto único de fármaco que comprende los distintos miembros de la proteína policlonal.

Description

METODOS PARA PRODUCIR UNA PROTEINA POLICLONAL Campo de la Invención La presente invención se refiere a métodos para producir productos de fármaco que comprenden al menos dos miembros distintos de una proteína policlonal. La invención comprende al menos un paso inicial, separado de cultivo de células que expresan los distintos miembros de la proteína policlonal. Las líneas celulares o preparaciones de proteína se combinan en un punto posterior, anterior a o antes de, o durante el procesamiento posterior, terminando finalmente con un producto de fármaco que comprende al menos dos miembros distintos de una proteína policlonal .

Antecedentes de la Invención La producción de proteínas policlonales , recombinantes es una tecnología relativamente nueva. La vasta mayoría de productos de fármaco recombinantes se producen como productos monoclonales usando una línea celular seleccionada, derivada de una célula clonal que expresa el producto deseado. Los métodos de producción de etapa anterior y de etapa posterior en este caso se pueden optimizar para el producto de fármaco, monoclonal, específico.

En años recientes se han desarrollado métodos redituables para producir anticuerpos recombinantes y otros productos de proteína, in vivo, usando animales transgénicos Ref . : 214025 que expresan el producto recombinante en leche (mamíferos) o huevos' (pollos) o plantas transgénicas que expresan el producto recombinante a todo lo largo de la planta o en un órgano separado (tubérculo, semilla, hoja) . Sin embargo, estos métodos aún tienen que ser adaptados a la producción de productos de proteínas policlonales .

En la WO 2004/009618 se describe un método para producir un producto de fármaco policlonal, el cual se refiere al uso de una línea de células monoclonales que expresan anticuerpos que tienen cadenas ligeras idénticas. De acuerdo a este documento, se puede producir una mezcla de anticuerpos mediante la expresión en un hospedador recombinante de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una cadena ligera común y secuencias de ácido nucleico que codifican para al menos dos diferentes cadenas pesadas con una diferente región variable capaz de aparearse con la cadena ligera, común.

La WO 2004/061104 proporciona una solución al problema de mezclar cadena pesadas y ligeras de anticuerpo, que es inherente al método descrito en la WO 2004/009618, al tener solo un producto de expresión integrado en una ubicación específica del genoma de las células de expresión, usando integración específica del sitio. Esta solución permite la generación de una línea de células policlonales productoras que es capaz de expresar distintos miembros de una protelna policlonal, de modo que se puede producir la proteína policlonal, por ejemplo un anticuerpo policlonal, en un lote individual usando un banco de células, que se expande en un biorreactor. El sobrenadante subsiguientemente se purifica usando un método de purificación de etapa posterior, que da por resultado una sustancia de fármaco que se formula en un producto de fármaco. Los ejemplos de anticuerpos policlonales recombinantes producidos usando este método incluyen un anticuerpo anti-RhesusD, policlonal, recombinante (WO 2006/007850) y un anticuerpo anti-virus de vaccinia, policlonal, recombinante (WO 2007/065433) .

La WO 2008/145133 describe un método para producir una composición de proteína policlonal, recombinante, en particular una composición de anticuerpo policlonal, recombinante, por medio de integración aleatoria, en donde se transfectan de manera separada células hospedadoras con un conjunto de vectores de expresión cada uno que comprende al menos una copia de un ácido nucleico distinto que codifica para un miembro distinto de la proteína policlonal bajo condiciones que evitan la integración específica al sitio de los vectores de expresión en el genoma de las células.

A pesar de estas ventajas en la producción de proteínas policlonales, permanece la necesidad por proporcionar métodos alternativos de producción, por ejemplo, para caso donde uno o más miembros de la proteína policlonal requieren condiciones particulares para la expresión y/o purificación, o para condiciones donde se prefiera procesamiento separado en etapa anterior.

Breve Descripción de la Invención En un primer aspecto, la invención se refiera a un método para producir un producto de fármaco que comprende al menos dos miembros distintos de una proteína policlonal, el método que comprende los pasos de : a) - proporcionar al menos dos poblaciones de células, en donde cada población codifica para un miembro distinto de la proteína policlonal y se encierra en un recipiente físicamente separado que comprende medio de cultivo y células que expresan la proteína, en donde el método comprende una parte de etapa anterior, que comprende los pasos de : i) expandir las por lo menos dos poblaciones de células en uno o más pasos de una serie de siembra en recipientes separados; ii) expandir células de la serie de siembra en uno o más pasos de una serie de inoculación; iii) cultivar células de la serie de inoculación en una fase de producción bajo condiciones que favorezcan la expresión de los miembros de proteína, para expresar los por lo menos dos. miembros distintos de proteína; _en donde las por lo. menos dos poblaciones de células se mantienen separadas al menos durante la serie de siembra; ~ b) recolectar la proteína expresada; c) realizar al menos un paso de purificación en la proteína recolectada; d) obtener la sustancia purificada de fármaco; y e) formular la sustancia purificada de fármaco en un producto de fármaco policlonal.

El rasgo caracterizante del método es que la por lo menos dos poblaciones de células que codifican cada una para un miembro distinto de la proteína policlonal se mantienen separadas en recipiente físicamente separados al menos durante las fases iniciales de la expansión celular. En otras modalidades como se describirá en la presente, -—las poblaciones de células que expresan los distintos miembros de la proteína policlonal se mantienen separados durante una parte más larga o durante la parte completa del procesamiento de etapa anterior. En aún modalidades adicionales, los distintos miembros expresados de . la proteína policlonal se mantiene separados durante parte de o posiblemente el procesamiento completo de etapa posterior, que se termina cuando se obtiene la sustancia purificada de fármaco. Las ventajas de las diferentes modalidades se describen en detalle más adelante.

Las por lo menos dos diferentes poblaciones de células se pueden mantener separadas al menos hasta e incluyendo la serie de inoculación, y en modalidades adicionales, las por lo menos dos diferentes poblaciones de células se mantiene separadas al menos hasta e incluyendo la fase de producción.

Los por lo menos dos distintos miembros de proteína, expresados por las por lo menos dos poblaciones de células se pueden mantener adicionalmente separadas al menos hasta e incluyendo la recolección de la proteína, de modo que se puede recolectar de manera separada cada miembro distinto.

En algunas modalidades, los por lo menos dos distintos miembros de proteina expresados por las al menos dos poblaciones de células se mantienen separados al menos hasta e incluyendo al menos un paso de purificación, permitiendo diferentes pasos de purificación inicial de diferentes miembros distintos. Por ejemplo, los miembros de proteína se pueden mantener separados al menos hasta e incluyendo un paso de cromatografía de afinidad.

La invención también incluye modalidades en donde los por lo menos dos distintos miembros de proteína expresados por las al menos dos poblaciones de células se mantienen separados al menos hasta incluyendo la obtención de la sustancia de fármaco.

Como una alternativa a la producción de la proteína policlonal en organismos de células individuales en recipientes separados, la producción puede tomar lugar en unidades físicamente separadas en la forma de organismo multicelulares, cada organismo multicelular que expresa un miembro de la proteína policlonal. Estos organismos multicelulares pueden ser plantas, caso en el cual la unidad físicamente separada es una planta o un órgano de planta. Los organismos multicelulares también pueden ser un animal no humano, transgénico, tal como un ave que se ha modificado genéticamente para expresar y segregar un miembro distinto de la proteína policlonal en un huevo. El animal no humano, transgénico, puede ser de manera alternativa un mamífero, donde el miembro distinto de la proteína policlonal se segrega en la leche. El mamífero puede ser por ejemplo una oveja, cabra, vaca, camello o búfalo.

Definiciones La producción de proteínas en células mamíferas, por ejemplo, células CHO (de ovario de hámster Chino), puede emplear un proceso semi-continuo por el que se cultivan células en una "serie de siembra" durante varios periodos de tiempo y subsiguientemente se transfieren a termentadores de inoculo (""serie de inoculación") para iniciar el proceso de amplificación celular en camino a la producción a mayor escala de la proteína de interés. De esta manera, las células usadas para la producción de proteína están en cultivo durante varios periodos de tiempo hasta una edad máxima predefinida de la célula. Los parámetros del proceso de cultivo celular, tal como densidad de siembra, pH, D02 y temperatura, duración del cultivo de producción, condiciones de operación de la recolección, etc., son una función de la línea celular particular y del medio de cultivo usado, y se pueden determinar empíricamente sin experimentación indebida. Para los propósitos de la presente invención, la fase' de "serie de siembra" incluye los pasos de descongelar las células y los pasos de expansión inicial. Estos pasos se llevan a cabo típicamente en cajas de Pétri, matraces agitadores, matraces en T, bolsas de plástico, matraces con agitación centrífuga, tubos de centrífuga, placas de múltiples concavidades, botellas de rodamiento, u otras botellas, es decir, recipientes que no están equipados con tubería para transferir muestras de un recipiente al otro. La "serie de inoculación" inicia cuando el primer biorreactor o fermentador (biorreactor de acero o biorreactor desechable) se inocula con células de la "serie de siembra" . Una vez que se han transferido las células al biorreactor de inoculación, la transferencia subsiguiente a otros biorreactores toma lugar típicamente a través de un sistema cerrado de tubería que permite que las células se bombeen de un recipiente al otro .

El "producto de fármaco" significa una forma de dosis - terminada, por ejemplo, tableta, cápsula, solución o producto liofilizado, que contiene una "sustancia de fármaco" en general, pero no necesariamente, en asociación con uno o más ingredientes diferentes. Una "sustancia de fármaco" se produce usualmente en lotes grandes, que subsiguientemente se formulan en un "producto de fármaco" al combinarlo con otros ingredientes. En el contexto de la presente invención, el producto de fármaco contendrá la mezcla final de proteína policlonal que comprende los distintos miembros de la proteína policlonal. Dependiendo del escenario particular de producción, la sustancia de fármaco también ser una mezcla policlonal que contiene todos los distintos miembros de la proteína policlonal, o una sustancia de fármaco puede contener uno o solo algunos de los distintos miembros de la proteína policlonal. En este último caso, se formularán dos o más sustancias de fármaco en un producto de fármaco individual.

El término "contenedor" o "recipiente" se refiere a un recipiente o contenedor adaptado para cultivar in vitro células. Los ejemplos de recipientes incluyen cajas de Petri, matraces agitadores, matraces en T, bolsas de plástico, matraces con "agitación centrífuga, tubos de centrífuga, placas de múltiples concavidades, botellas de rodamiento, biorreactores de acero u otros biorreactores desechables, y biorreactores de plástico y otros desechables.

Por "proteína" o "polipéptido" se quiere decir cualquier cadena de aminoácidos, a pesar de la longitud o modificación post-transduccional . Las proteínas pueden existir como monómeros o multímeros, que comprenden dos o más cadenas montadas de polipéptido, fragmentos de proteínas, polipéptidos ,. oligopéptidos o péptidos.

Como se usa en la presente, el término "proteína policlonal" o "policlonalidad" se refiere a una composición de proteína que comprende moléculas de proteína diferentes, pero homologas, seleccionadas preferentemente de la superfamilia de inmunoglobulinas . De esta manera, cada molécula de proteína es homologa a las otras moléculas de la composición, pero también contiene uno o más tramos de la secuencia variable de polipéptido que se caracterizan por diferencias en la secuencia de aminoácidos entre los miembros individuales . de la proteína policlonal. Los ejemplos conocidos de estas proteínas policlonales incluyen moléculas de anticuerpo o de inmunoglobulina, receptores de células T y receptores de células B. Una proteína policlonal puede consistir de un subconjunto definido de moléculas de proteína definidas por una característica común tal como actividad de unión compartida hacia una diana deseada, por ejemplo, en el caso de un anticuerpo policlonal contra el antígeno diana, deseado .

El término "un miembro distinto de una proteína policlonal recombinante" denota una molécula de proteína de una composición de proteína que comprende moléculas de proteína, diferentes, pero homologas, donde cada molécula de proteína es homologa a las otras moléculas de la composición, pero también contiene uno o más tramos de la secuencia variable de polipéptido que se caracterizan por diferencias en la secuencia de aminoácidos entre los miembros individuales de la proteína policlonal.

Cada "población de células" que codifica para un miembro distinto de la proteína policlonal se deriva de un banco de células monoclonales individuales o un cultivo de células monoclonales, donde el banco de células monoclonales o cultivo de células monoclonales se deriva de una célula única como se describe en otra parte de la presente.

El término "recolectar" como se usa -en la presente se refiere a la recolección del sobrenadante que contiene la proteína expresada, en tanto que los pasos subsiguientes para aislar la proteína deseada del sobrenadante, incluyendo clarificación, se consideran en general que son pasos de purificación .

El término "anticuerpo" describe un componente funcional del suero y frecuentemente se refiere ya sea como -una colección de moléculas (anticuerpos o inmunogloculinas) o como una molécula (la molécula de anticuerpo o molécula de inmunoglobulina) . Una molécula de anticuerpo es capaz de unirse a o de reaccionar con un determinante antigénico específico (el antígeno o el epitopo antigénico), -que a su vez puede conducir a · inducción de mecanismos efectores, inmunológicos . Una -molécula de anticuerpo individual usualmente se considera como monoespecífica, y una composición de moléculas de anticuerpo puede ser monoclónal (es decir, que consiste de moléculas idénticas de anticuerpo) o policlonal (es decir, que consiste de diferentes moléculas de anticuerpos que reaccionan . con los- mismos o diferentes epitopos en el mismo antígeno o aún en distintos antígenos diferentes) . Cada molécula de anticuerpo tiene una estructura única que le permite unirse de manera específica a su correspondiente antígeno, y todas las moléculas naturales de anticuerpo tienen la misma estructura total básica de dos cadenas ligeras idénticas y dos - cadenas pesadas idénticas. Los anticuerpos también se conocen colectivamente como inmunoglobulínas . Los términos anticuerpo o anticuerpos como se usa en al presente también se propone que incluyan anticuerpos quiméricos y de cadena individual, así como fragmentos de unión de los anticuerpos, tal como Fab, fragmentos Fv o fragmentos scFv, y forma multiméricas tal como moléculas diméricas de IgA o IgM pentavalente.

El término "inmunoglobulina" se usa comúnmente como una designación colectiva de la mezcla de anticuerpos encontrada en sangre o suero, pero también se puede usar para designar una mezcla de anticuerpos derivados de otras fuentes .

El término "anticuerpo policlonal" describe una composición de diferentes moléculas de anticuerpo que son capaces de unirse a o de reaccionar con varios determinantes antigénicos, específicos,- diferentes en el mismo antígeno o en diferentes antígenos. Usualmente, la variabilidad de un anticuerpo policlonal se piensa que está localizada en las llamadas regiones variables del anticuerpo policlonal. Sin embargo, en -el contexto de la presente invención, también se puede entender ' la policlonalidad para describir diferencias entre las moléculas individuales de anticuerpo que residen en las .llamadas regiones constantes, por ejemplo, como en el caso de mezclas de anticuerpos que contienen dos o más isotipos de anticuerpo tal como los isotipos humanos IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 , IgAl , lgG2, o los isotipos murinos IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3 , e IgA. El término "anticuerpo policlonal" como se usa en la presente también se piensa como una mezcla de dos o más anticuerpos monoclonales.

El término "una biblioteca de moléculas de ácido nucleico variante de interés" se usa para describir una colección de moléculas de ácido nucleico que codifican colectivamente para una "proteína policlonal recombinante de interés" . Cuando se usa para transfección, la biblioteca de moléculas variantes de - ácido nucleico de interés está contenida en una biblioteca de vectores de expresión. Esta biblioteca tiene típicamente al menos 3, 5, 10, 20, 50, 1000, 104, 10s o 106 miembros distintos.

Como se usa en la presente, el término "operablemente enlazado" se refiere a un segmento que se enlaza a otro segmento cuando se coloca en una relación funcional con el otro segmento. Por ejemplo, el ADN que codifica para una secuencia de señal se enlaza de manera operable al ADN que codifica para un polipéptido si se expresa como una guía que participa en la transferencia de polipéptido al retículo endoplásmico . También, un promotor o intensificador se enlaza de manera operable a una secuencia codificante si estimula la transmisión de la secuencia.

El término "transíección" se usa en la presente como un término amplio para introducir ADN extraño en una célula. El término también se propone que cubra otros métodos equivalentes funcionales para introducir ADN extraño en una célula, tal como transformación, infección, transducción, o fusión de una célula donadora y una célula aceptadora.

Los términos "secuencia variable de polipéptido" y "región variable" se usan de manera indistinta.

El término "promotores a la par" se refiere a un par de promotores que se colocan en proximidad cercana de modo que se presente en direcciones opuestas la transcripción de dos fragmentos génicos activados por los promotores. Un promotor a la par también se puede construir con un rellenador compuesto de ácidos nucleicos irrelevantes entre- los dos promotores . Este fragmento o rellenador puede contener fácilmente más de 500 nucleótidos. Los promotores a la par también se pueden nombrar promotores bi-direccionales .

El término "planta" se refiere a un organismo que es un miembro del reino Plantae. Una planta para los propósitos de la presente invención incluye aquellos órganos de una planta que se requieren para el crecimiento independiente de una planta (por ejemplo, raíces, tallos, hojas) . Cuando el término planta se propone que cubra células vegetales aisladas, esto se señala de forma clara.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1.- Ilustración esquemática de un escenario de producción de la invención (serie separada de siembra/inoculación) .

Figura 2.- Ilustración esquemática de otro escenario de producción de la invención (fase separada de producción) .

Figura 3. - Área relativa de cada uno de los seis anticuerpos anti-vaccinia después de 7 días de cultivo en una población mezclada para detalles (ver Ejemplo 1) .

Figura 4.- Cantidades relativas de seis diferentes anticuerpos anti-RSV después de 12 días de cultivo en una población mezclada (ver Ejemplo 3).

Descripción Detallada de la Invención La producción de anticuerpos policlonales recombinantes expresados en células productoras generadas por integración de la construcción de expresión se puede realizar como una producción de lote único. De manera ventajosa, las líneas de células individuales o los clones celulares se seleccionan de manera apropiada para velocidades similares de crecimiento antes del mezclado de las líneas celulares en un recipiente de cultivo a fin de evitar la excrescencia de una o unas pocas líneas celulares.

Puede haber situaciones donde sea difícil o imposible alinear o emparejar las velocidades de crecimiento de las líneas celulares individuales de la manera deseada, por ejemplo, si la producción de una proteína/anticuerpo recombinante , particularmente deseado, tiene influencia en la velocidad de crecimiento de la línea celular en una dirección negativa. También, puede haber situaciones donde son deseables muy distintas relaciones de los diferentes miembros de la proteína policlonal. Estos casos pueden ser, por ejemplo, donde son deseables cantidades muy desiguales de miembros de proteína policlonal en la composición, por ejemplo debido a diferentes afinidades a la diana. Por ejemplo, si se desea una composición policlonal que contiene seis miembros de proteína con relaciones entre los miembros individuales por ejemplo de 20:5:1:1:1:0.5, sería más factible controlar y obtener esta composición al mantener separados los distintos miembros durante al menos parte del proceso de producción. Otro ejemplo puede ser en casos donde se han usado dos o más líneas celulares parenterales , diferentes para transfección y expresión de los distintos productos recombinantes, caso en el cual las condiciones de cultivo celular para las dos o más líneas celulares pueden ser diferentes, por ejemplo la composición óptima del medio para la expansión de las células y/o expresión del miembro distinto de la proteína policlonal.

Un método alternativo para producir estas proteínas recombinantes que puede ayudar a evadir el requisito de velocidades similares de crecimiento de las líneas celulares de expresión, individuales, es mantener separadas las líneas celulares al menos durante la parte de la serie de siembra del proceso de etapa anterior. Las líneas celulares que expresan diferentes anticuerpos entonces se pueden combinar en una etapa posterior, por ejemplo, antes de o durante la serie de inoculación, o antes de o durante la fase de producción. Una ventaja de este método es que el número de duplicaciones de población del cultivo celular mezclado se puede reducir dramáticamente, lo que hace más fácil controlar las relaciones de los miembros individuales de la proteína policlonal en el producto de fármaco final, aún si las líneas celulares individuales exhiben diferentes velocidades de crecimiento. La fabricación separada se puede continuar durante uno -o más pasos del procesamiento de etapa posterior, y se pueden mantener aún separados los distintos miembros de la protelna hasta el punto donde se ha purificado la sustancia de fármaco al grado requerido. En este último caso, las sustancias de -fármaco entonces se combinan para formar el producto final de fármaco, que comprende al menos dos miembros distintos de una proteína policlonal, tal como dos o más anticuerpos diferentes que seleccionan como objetivo o diana los mismos o diferentes antígenos.

Un elemento importante de la invención es que si la combinación toma lugar durante el crecimiento de las líneas celulares, o en un punto donde se han separado proteínas de las líneas celulares, el producto final siempre es un producto de fármaco, policlonal, individual que comprende al menos dos miembros distintos de una proteína policlonal, tal como dos o más anticuerpos diferentes que se selecciona como objetivo o diana los mismos o diferentes antígenos.

En una modalidad, los miembros individuales de la proteína policlonal se mantienen separados hasta la recolección del sobrenadante que contiene las proteínas recombinantes , individuales. Estos productos entonces se mezclan a.ntes de la purificación de etapa posterior para simplificar el proceso de CMC y reducir costos.

En casos donde los miembros individuales de la proteína policlonal no se puedan purificar usando los mismos métodos, también se pueden mezclar en una etapa posterior durante el procedo de purificación de etapa posterior o aún al término de la purificación antes de preparar el producto final de fármaco.

Será evidente que los miembros individuales de la proteína policlonal, si no se mezclan en una etapa anterior o se producen conjuntamente después del mezclado de dos o más poblaciones de células, se mezclarán conjuntamente no más tarde que durante la formulación del producto de fármaco policlonal .

La producción de las líneas celulares de expresión, individuales, que producen cada uno de los componentes del producto final se realiza preferencialmente por cultivo en equipo de bajo costo tal como biorreactores desechables, por ejemplo, Bolsas ave, que están comercialmente disponibles en varios tamaños diferentes de bolsa, pero también es posible correr múltiples biorreactores no desechables en casos donde sea bajo el volumen de las corridas de producción individual, por ejemplo por debajo de 50 L o preferentemente por abajo de 20 L o 10 L. El cultivo de la proteína recombinante de cada una de las líneas celulares individuales se realiza preferencialmente en paralelo, pero también se puede realizar de manera secuencial en dos o más grupos.

El material de inoculación para cada recipiente de producción (por ejemplo, Bolsas Wave u otros tipos de biorreactores) se obtiene al preparar primero un Banco de Células Maestras (MCB) potencialmente seguido por un Banco de Células Trabajadoras (WCB) , para cada clon o línea celular, productora de proteína, individual. Se usa un frasco de cada una de las WCB (o MCB) para la siembra de recipientes separados de cultivo. La serie de siembra se diseña para la expansión de cada una de estas líneas celulares hasta que se han obtenido suficientes células para la inoculación del biorreactor de inoculación.

Cuando es factible, la parte separada de la producción se realiza de manera preferencial usando las mismas condiciones para la expresión de diferentes miembros de proteína, por ejemplo incluyendo los mismos ingredientes del medio y soluciones de alimentación adicionadas (tal como glucosa, glutamina, agentes selectivos potenciales tal como G418, vitaminas, minerales, proteínas, hidrolisádos, etc.), así como parámetros de proceso de cultivo tal como pH, DOT (tensión de oxígeno disuelto) , presión de C02 y temperatura. Esto es importante a fin de facilitar el proceso de control de calidad, donde se necesitan afrontar factores tal como reducción de la proteína de la célula hospedadora, remoción de agentes selectivos adicionados y remoción de factores de crecimiento adicionados. También es altamente importante a fin de obtener modificaciones similares post-transduccionales de las proteínas recombinantes , tal como el patrón de glicosilación.

De manera similar, cualquier parte separada de la purificación se realiza de manera preferente usando columnas, amortiguadores, perfiles de elusión, etc., similares al grado posible.

Para permitir un proceso analítico y de etapa posterior, refinado., eficiente en el costo y en el tiempo> se prefiere que sean tan similares como sean posible las características fisicoquímicas de los distintos miembros individuales de proteína en la composición policlonal. Esto se asegura mejor al mantener idénticas las partes constantes de la molécula. En el caso de anticuerpos, se usa de manera preferente el mismo vector de expresión para producir cada una de las moléculas individuales recombinantes de anticuerpo, y las secuencias primarias de estos difieren preferencialmente solo en la región variable de la cadena pesada y ligera, respectivamente. En el escenario más preferido, las partes constantes de las moléculas de anticuerpo, como se codifican por la construcción de expresión, son exactamente las mismas para todos los miembros de la composición de anticuerpos policlonales , por ejemplo, una molécula de isotipo IgGl . Además, las cadenas ligeras también so preferentemente del mismo tipo ya sea Kappa o Lambda en el caso de anticuerpos humanos. El mantener idénticas como sea posible la parte principal de las moléculas de anticuerpo permite la purificación, de anticuerpos recombinantes a alta pureza usando un procedimiento sin el riesgo de perder diversidad. También facilita el establecimiento de métodos analíticos necesarios para la caracterización, control de calidad y liberación del producto de fármaco fabricado.

El proceso de purificación de proteína es típicamente un proceso de múltiples pasos que se desarrolla en base a las características fisicoquímicas del anticuerpo u otras moléculas de proteina, y para cada caso existe un riesgo de pérdida de diversidad, es decir, de perder uno o más de los componentes individuales del producto. El proceso puede incluir, por ejemplo, varios pasos cromatográficos, incluyendo un paso de captura que puede ser unión a proteína A o de manera alternativa a proteína G, un paso de cromatografía de intercambio aniónico y un paso de cromatografía basado en interacción hidrófoba. Además puede incluir incubación a pH bajo así como varios pasos de filtración. Es evidente para los expertos en la técnica que las diferencias en cualquiera de estas características fisicoquímicas entre las moléculas puede impedir la recuperación exitosa de un producto de anticuerpo policlonal puro y diverso .

Con respecto a los métodos de control de calidad analítica es evidente para aquellos expertos en la técnica que todos los ensayos de caracterización necesarios para obtener la aprobación reglamentaria de un producto de anticuerpo recombinante, por ejemplo correlación peptídica, exclusión de tamaño, SDS-PAGE, Western Blot, análisis de aminoácidos, correlación de puentes de disulfuro y grupos sulfidrilo libres y caracterización de mono- y oligo-sacáridos, pueden resultar ser difíciles de realizar a un grado satisfactorio si no es idéntica o similar la región constante entre las moléculas. : Los métodos para caracterización estructural de anticuerpos policlonales recombinantes y otras proteínas policlonales, y para caracterización de líneas celulares policlonales que expresan estas proteínas policlonales, se describen en la WO 2006/007853.

Diferentes Escenarios de Fabricación Expresión Recombinante en Recipientes de Cultivo Las células mamíferas cultivadas han llegado a ser el sistema dominante para la producción de proteínas recombinantes para aplicaciones clínicas debido a su capacidad para plegado, montaje y modificación post-transduccional apropiada. Se han -empleado dos formatos principales para la producción de proteínas recombinantes en células mamíferas: cultivos de células adherentes y cultivos en suspensión. Estos últimos son con mucho los más comunes.

En un proceso de producción por lote de alimentación, o lote simple, pueden presentarse volúmenes de aumento de escala a muy grandes mediante la dilución del contenido de un biorreactor en 5-20 volúmenes de medio fresco mantenido precalentado en un reactor más grande. El proceso de descongelar las células depositadas a la producción real a gran escala consiste de tres fases separadas, la serie de siembra, la serie de inoculación y la fase de producción. La serie de siembra se realiza usualmente en recipientes más pequeños de cultivo celular iniciando de volúmenes pequeños de unos pocos mL de cultivo justo después de descongelar las células depositadas y hasta varios litros de cultivo celular, tal como 5-100 L de cultivo, para proporcionar células frescas para el aumento en escala durante el periodo elegido para la producción. La serie de inoculación inicia cuando la suspensión celular generada durante la serie de siembra se transfiere al reactor de inoculación (también llamado reactor de siembra) y su volumen se expande de modo que se genera un número suficiente de células para inoculación del biorreactor de producción final - ( urm, 2004, Nature Biotechnology, 22 (11) : 1393-1398) .

Para la producción de proteínas recombinantes monoclonales es típicamente posible mantener las células descongeladas en la etapa de la serie de siembra o de manera alternativa en el reactor de inoculación para un número extendido de duplicaciones de población. Esto proporciona la posibilidad de sembrar más de un bioreactor de producción con células descongeladas de la misma ampolleta, y también proporciona células de respaldo para situaciones donde la fabricación se somete a retrasos, por ejemplo debido a cuestiones técnicas. Sin embargo, cuando se producen proteínas policlonales, recombinantes , es necesario establecer límites estrictos y mantener control completo durante las varias generaciones, y típicamente no es posible mantener una serie de siembra de un banco de células policlonales durante periodos prolongados de tiempo. Esto es debido al hecho que aún cuando se hacen corresponder tan cerca como sea posible las velocidades de crecimiento de las diferentes líneas celulares, las líneas celulares individuales en la composición de células policlonales exhibirán siembre velocidades ligeramente diferentes de crecimiento y de productividad, conduciendo a desviaciones de la composición durante periodos prolongados de cultivo. Esto adiciona más limitantes y menos flexibilidad al proceso de fabricación en comparación a aquel de un proceso de fabricación de proteínas monoclonales , y puede dar por resultado un mayor riesgo de falla de fabricación, por ejemplo en casos de problemas técnicos con los reactores de producción que conduce a retrasos.

En el caso de la fabricación por lote o por lote de alimentación, que es la tecnología preferida para producir anticuerpos recombinantes, la mayoría de las duplicaciones de población toma lugar realmente antes de la inoculación del reactor de producción. Un proceso típico de etapa anterior puede, con respecto a duplicaciones de población parecerse a esto: para generar un pWCB por expansión de un frasco de un pMCB, se necesitan 8-12 duplicaciones de población. La expansión de la serie de siembra requerirá típicamente 10-20 duplicaciones dependiendo de la escala final de producción, en tanto que el número de duplicaciones de población que toma lugar en el reactor de inoculación será típicamente de 2-5 generaciones. En el reactor de producción de lotes de alimentación, las células pasan a través de un número relativamente bajo de generaciones, tal como 5-8. En total, se necesitan 25-43 generaciones para terminar el proceso de etapa anterior cuando se usa un proceso de producción de lote único iniciando de un banco de células maestras policlonales . De estas, se presentan aproximadamente 20-37 duplicaciones poblacionales antes de la inoculación del recipiente de producción. Será evidente que entre más corto es el periodo de cultivo mezclado, más fiable es controlar y mantener una relación deseada de composición. De esta manera, para productos policlonales donde es difícil obtener velocidades similares de crecimiento donde es crítico obtener una relación de composición de límites muy estrechos, será ventajoso mantener las líneas celulares individuales en recipientes separados durante las fases iniciales del proceso de producción y mezclar las células en un punto posterior en el tiempo.

Los productos de proteína recombinantes expresan típicamente in vitro usando células aisladas que expresan un producto de proteína heterologa o endógena al cultivar estas células en medio líquido, o semisólido bajo condiciones que favorecen la expresión del producto de proteína. Estos métodos son particularmente ventajosos para la expresión de productos segregados de proteína puesto que se pueden separar fácilmente de las células como un primer paso de la purificación de la proteína.

Los recipientes usados para cultivo se pueden seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste de matraces agitadores, botellas de rodamiento, matraces en T y biorreactores desechables o no desechables. En modalidades preferidas, los recipientes comprenden uno. o más recipientes desechables. Los recipientes desechables pueden incluir las llamadas Bolsas Wave que están disponibles de varios fabricantes en diferentes tamaños que varían desde 10 L y hasta más de 1000 litros. Los biorreactores desechables adecuados incluyen pero no se limitan a BI0STATMR CultiBag (Sartorius Stedim Biotech) , Cell Maker LiteMR (Cellexus Biosystems) , BiowaveMR (Wave Biotech AG) , Bolsas Wave Biotech LLC (GE Healthcare), Biorreactores de uso único S.U.B. (Hyclone Thermo Fisher Scientific) y FlexFactory"* (Xcellerex) . Puesto que la presente invención comprende el uso de biorreactores separados para distintos miembros de la proteína policlonal ya sea en la producción en paralelo o en serie durante al menos parte del proceso de etapa anterior, es · una ventaja usar los biorreactores desechables relativamente económicos en lugar de tanques costosos de acero. Además, los biorreactores desechables adicionan flexibilidad a los métodos de la invención puesto que es más fácil y menos costoso incrementar el número de biorreactores en comparación a usar múltiples tanques de acero.

En tanto que se han - desarrollado métodos para la expresión de diferentes miembros de una proteína policlonal, estos métodos son en algunos casos inadecuados. Por ejemplo, si la proteína policlonal comprende diferentes miembros de proteína que no se puede purificar usando el mismo procedimiento de proceso de etapa posterior, entonces no es una ventaja expresar los distintos miembros en un lote único. También, si por alguna razón se desea expresar un miembro distinto en un tipo celular particular y otros miembros en otro tipo celular, entonces es menos preferible la producción en lote único .

Finalmente, puede haber casos donde la diferencia en el nivel de expresión y/o velocidad de crecimiento de diferentes clones celulares que expresan diferentes miembros de una proteína policlonal es grande de modo que sea desventajoso combinar los. diferentes clones en un tanque de células policlonales .

Serie Separada de Siembra Una modalidad de la presente invención dispone de tener diferentes bancos de células monoclonales que se descongelan en recipientes separados de cultivo, tal que se pueden usar., condiciones óptimas de descongelación y adaptación para cada clon que expresa un miembro distinto de la proteína policlonal. Durante estos pasos iniciales de descongelación y adaptación, está bajo presión la viabilidad de las células, y aún diferencias menores en la supervivencia entre los clones en estas etapas tempranas, puede tener un efecto dramático en la distribución relativa de los miembros de proteína en el producto final.

De acuerdo a esta modalidad de la invención, las líneas individuales de células productoras que expresan los diferentes miembros de la proteína policlonal se mantienen separadas durante la descongelación, adaptación y expansión de la serie de siembra. Los clones entonces se pueden mezclar de acuerdo a los criterios deseados y se -cultivan en un lote único para la serie de inoculación, fase de producción, recolección y procesamiento de etapa posterior.

Serie Separada de Inoculación .

¦ En una modalidad adicional, los diferentes clones que expresan los diferentes miembros distintos de la proteína policlonal se mantienen separados hasta e incluyendo la serie de inoculación (Figura 1) . De acuerdo a esta modalidad, es posible tener el mismo número de células para cada línea individual de células productoras al inicio de la fase producción. Como se menciona anteriormente, la fase policlonal es relativamente corta en esta modalidad, con un número limitado de divisiones celulares, de modo que cualquier diferencia en la velocidad de crecimiento entre los clones celulares tendrá efecto limitado en la composición. De esta manera, es más fácil combinar diferentes líneas individuales de células productoras para obtener una distribución predeterminada de los distintos miembros de la proteína policlonal al final de la fase producción.

Una ventaja importante de usar una serie separa de siembra, y en particular de usar una serie separa de siembra y una serie separada de inoculación, es que se reduce el número de generaciones desde el punto en el cual se mezclan los clones separados y hasta el final de la fase de producción. Como resultado, se reduce al mínimo el número total de generaciones en las cuales se mezclan los diferentes clones celulares y se cultivan conjuntamente. Esto permite una mayor estabilidad y uniformidad total en el producto final de lote a lote, y de esta manera un mayor grado de control sobre el resultado final, puesto que hay menos generaciones en las cuales uno o más clones tengan la posibilidad de crecer más o producir mayor cantidad de otros clones en la mezcla de diferentes clones celulares.

Otra ventaja de este planteamiento en comparación a usar por ejemplo un banco de células maestras policlonales es que se permite mayor flexibilidad en adaptación de la mezcla policlonal como se necesite. Por ejemplo, si se encuentra que uno de los clones celulares en un MCB policlonal es inestable o de otro modo sub-óptimo, el MCB policlonal completo tendrá que ser recreado. En contraste, la presente invención permite que se remueva un clon sub-óptimo individual o se reemplace de manera alternativa por un nuevo clon que produce la mima proteína con menos tiempo y esfuerzo. También hace posible adicionar de manera relativamente fácil un nuevo clon que produce una nueva proteína a una mezcla existente de clones que producen una proteína policlonal establecida. Además, este planteamiento hace más fácil aumentar en escala la fase de producción en tanto que reduce al mínimo los riesgos de cambios en la composición de proteína final, por ejemplo, usando Bolsas Wave u otros biorreactores desechables para la serie de siembra y de inoculación.

Una ventaja aún adicional es la posibilidad de moverse más rápidamente en el desarrollo pre-clínico de un anticuerpo policlonal u otra proteína terapéutica una vez que se han identificado los distintos miembros deseados de la proteína policlonal. Esto es debido a que una vez que se han identificado los miembros individuales adecuados de la proteína, solo es necesario probar la estabilidad de los clones individuales, que entonces se pueden usar directamente para procesos de producción, es decir, sin que tenga que pasar tiempo adicional en estudios de estabilidad de un banco de células maestras policlonales y un banco de células trabajadoras policlonales. Adicionalmente, para prueba pre-clínica y clínica de fase I/II también puede ser posible realizar la producción en base a los MCB sin tener que pasar tiempo en la generación y prueba de los WCB.

Fase Separada de Producción En una modalidad aún adicional, la fase de producción también se lleva a cabo de manera separada para distintos miembros de la proteína policlonal (Figura 2) . Esto permite la expresión de diferentes miembros en diferentes tipos celulares y/o bajo diferentes condiciones y también permite situaciones donde no se puede llevar a cabo el procesamiento completo de etapa posterior para todos los miembros distintos de la proteína policlonal en uno y el mismo procedimiento. Este escenario también proporciona libertad completa con respecto a la selección de plataformas de expresión para los distintos miembros de la proteína policlonal .

De esta manera, por ejemplo, se puede expresar un miembro en células de levadura y uno se puede expresar en células mamíferas. De manera alternativa o adicionalmente , un miembro de proteína se puede dispersar por ejemplo en células vegetales aisladas in vitro y uno se puede expresar en bacterias, si así se desea. Se conoce en la técnica que diferentes especies dan por resultado diferentes modificaciones post-transduccionales de la proteína expresada. De esta manera, se puede producir un producto con diferentes modificaciones post-transduccionales y someter a un procesamiento común o parcialmente común de etapa posterior.

Este escenario de producción también permite el uso de diferentes modos de cultivo para diferentes miembros de la proteína policlonal. Se puede producir un miembro usando un proceso por lotes, en tanto que los otros miembros se pueden producir usando un proceso de lote de alimentación o de perfusión.

Una ventaja adicional de tener una fase separada de producción para distintos miembros de la proteína policlonal es que se pueden mezclar o combinar los distintos miembros de la proteína antes del procesamiento de etapa posterior en una relación pre-determinada . Esto reduce cualquier distribución sesgada que pueda provocar potencialmente diferencias en la velocidad de .proliferación y/o en los niveles de expresión.

Una ventaja adicional es que se puede realizar la producción en serie de los distintos miembros de proteína.

Esto permite la producción de una proteina policlonal compleja con muchos miembros distintos de proteina en uno o unos pocos biorreactores . Los distintos miembros de proteina expresados se pueden recolectar después de la expresión uno después del otro o unos pocos en un momento y almacenar hasta que se expresen todos los miembros. La proteína policlonal entonces se puede purificar usando un procedimiento de procesamiento de etapa posterior.

Recolección Separada Después de la expresión separada de los distintos miembros de proteína, el paso subsiguiente de recolección se puede realizar de manera separada para uno o más miembros de la proteína policlonal, o se pueden recolectar dos o más miembros usando un procedimiento común.

Se puede obtener el producto expresado de proteína al recolectar el sobrenadante o las células de diferentes biorreactores, o en el caso de producción en plantas o animales, al aislar la proteína de plantas recolectadas o por ejemplo de leche o huevos de animales transgénicos .

Primer Paso Separado de Purificación La primera fase del proceso de etapa posterior (DSP) incluye típicamente uno o más pasos para separar el producto de proteína de las células y desechos celulares (paredes celulares, membranas y fragmentos). Esto se puede hacer usando procedimientos para clarificación, incluyendo pero no limitado a centrifugación y filtración. Cuando se produzcan de manera separada los distintos miembros, la clarificación inicial se puede llevar a cabo de manera separada para los distintos miembros o conjuntamente para dos o más de los miembros, aunque en casos de producción separada y recolección separada de las distintas proteínas, los sobrenadantes recolectados de manera separa también se clarificarán típicamente de forma separada.

Después de la clarificación, el siguiente paso puede incluir un paso de cromatografía de afinidad, tal como purificación en proteína A o proteína G llevada a cabo en un modo de unión y elusión (modo de captura). Este paso de purificación es típicamente muy eficiente en deshacerse de la vasta mayoría de contaminantes (proteína de célula hospedadora, ADN, virus, ingredientes del medio) . Puesto que las proteasas y otras enzimas pueden constituir parte de los contaminantes, la eliminación de estos en una etapa temprana es importante para la estabilidad del producto de proteína.

Además, un paso inicial de cromatografía de afinidad da por resultado típicamente una reducción significativa en el volumen, haciendo más fácil y más conveniente almacenar el producto de proteína parcialmente purificado después de este paso de purificación. En el caso de producción en serie, es una ventaja realizar un paso de reducción de volumen inmediatamente o brevemente después de recolectar la proteína. También, por razones de estabilidad del producto de proteína, es una ventaja remover la mayor parte de los contaminantes tan rápido como sea posible después de la recolección de la proteína. Se pueden descongelar subsiguientemente las alícuotas congeladas cada una que comprende un miembro distinto de una proteína policlonal, se mezclan y se someten a DSP adicional.

También se puede aplicar un paso inicial separado de cromatografía para al menos uno de los distintos miembros si, por ejemplo, los distintos miembros de la proteína policlonal incluyen anticuerpos con diferentes isotipos que no se pueden capturar en la misma columna, o si la producción de los miembros individuales está separada en tiempo. Por ejemplo, la proteína policlonal puede ser un anticuerpo policlonal que comprende al menos un miembro distinto de anticuerpo que se puede purificar en una columna de proteína A y al menos otro miembro distinto de anticuerpo que se puede purificar en una columna de proteína G. La parte restante de procesamiento de etapa posterior se puede llevar a cabo como un proceso.

Pasos Adicionales Separados de Cromatografía En otras modalidades, también se manera separada se puede llevar a cabo procesamiento adicional de etapa posterior para los distintos miembros de proteína. Esto, puede ser ventajoso si se esperan velocidades muy diferentes de recuperación para un paso particular de purificación y/o los diferentes miembros difieren demasiado con respecto al tamaño, carga y/o hidrofobicidad que no se puede usar un procedimiento común de purificación. La presencia de contaminantes muy diferentes para diferentes miembros distintos de proteína también puede justificar el uso de pasos separados de cromatografía.

Esta modalidad permite . la optimización de los pasos para cada miembro distintó de proteína para mantener altas velocidades de recuperación para todos los miembros de proteína. Esto puede dar por resultado menos pérdida durante el procesamiento de etapa posterior.

Preparación Separada de Sustancia de Fármaco En una modalidad aún adicional de la invención, todos los pasos hasta obtener la "sustancia de fármaco" se llevan a cabo de manera separa para los distintos miembros de la proteína. En ese escenario, la sustancia de fármaco que comprende diferentes miembros en la proteína policlonal se pueden producir en paralelo o en serie. Esto hace posible combinar distintos miembros de proteína en una relación predeterminada precisa. Esto puede ser una ventaja si la relación precisa es importante para la función. El procesamiento completo de etapa anterior y de etapa posterior es separado y se puede optimizar para cada miembro distinto de proteína. Esto puede conducir a mayores niveles de expresión y mayores velocidades de recuperación. Usando esta modalidad de la invención, es posible derivatizar uno o más miembros del producto de proteína, por ejemplo, para enlazar una toxina, un polímero, u otro grupo no de proteína a uno o más pero no todos los distintos miembros de proteína. Esta derivatización requiere que la proteína se haya purificado antes de la derivatización. Además, la derivatización tiene el resultado que el producto derivatizado no se puede purificar fácilmente junto con los otros miembros distintos no derivatizados de la proteína. Los ensayos separados de caracterización y/o liberación para cada miembro distinto de la proteína policlonal se pueden llevar a cabo de manera individual para cada una de las sustancias de fármaco que comprende un miembro distinto de la proteína policlonal. Si se derivatizan uno o más de los distintos miembros, puede ser una ventaja ser capaces de llevar a cabo ensayos particulares de liberación o caracterización en este miembro distinto aislado .

Las sustancias de fármaco obtenidas finalmente se formulan en un producto de fármaco junto con los excipientes, portadores farmacéuticos requeridos, etc.

Escenarios Específicos de Producción En lo siguiente, se describirán paso por paso los diferentes escenarios de producción para la producción de un producto de anticuerpo de acuerdo a la invención. Estos se proporcionan como ejemplos no limitantes. 1) Series Parcialmente Separadas de Siembra y Mezclado Antes de Producción Este escenario incluye los siguientes pasos (referirse a la Figura 1) : - transfección en mezclas, - selección, - examen para clones de alta producción, - crecimiento separado a una cierta etapa de la serie de siembra/inoculación, - mezclado, - producción en lote único de producto policlonal. El escenario incluye inicialmente proporcionar un conjunto de vectores de expresión que codifican para cada uno de los distintos miembros de la proteína policlonal. Cada uno de los vectores de expresión se transfecta en el genoma de células hospedadoras adecuadas de forma separada, de modo que una célula exprese solo un miembro de la proteína policlonal. La selección de clones transíectados se puede realizar por ejemplo usando un marcador genético, dominante, co-expresado tal como marcador de resistencia a fármaco.

Se pueden seleccionar clones de células individuales de alta producción usando protocolos para examen de alto rendimiento. Adicionalmente se examinan los- clones para parámetros apropiados del biorreactor y para productividad específica de células y títulos máximos.

Los clones que codifican para cada uno de los distintos miembros de la proteína policlonal se pueden alinear subsiguientemente en grupos usando datos de los parámetros del biorreactor, de la productividad y de los títulos de acuerdo a un algoritmo para la producción policlonal. Se elije el mejor conjunto productor (es decir, equilibrando la productividad y estabilidad de composición) . De manera alternativa, se pueden realizar experimentos para probar las combinaciones de clones que proporcionan los mejores resultados de co-cultivo.

Para cada miembro distinto de la proteína policlonal, se genera un banco de células maestras (MCB) . Cada MCB entonces se usa en una serie separada de siembra. Las series separadas de siembra entonces se usan para inocular un biorreactor de acuerdo a criterios especificados en base a los datos de los pasos de caracterización o en base a los resultados experimentales . El inoculo entonces se usa en la producción de lote único en un biorreactor y la proteína policlonal recolectada se somete a un proceso individual de etapa posterior. 2) Producción Separada en Líneas Individuales de Células Productoras, Mezclado Antes de la Purificación Este escenario incluye los siguientes pasos (referirse a la Figura 2) : - transfección de células en mezclas, - selección de transfectantes , examen para líneas/clones celulares de alta producción, - producción y mezclado separados antes de la purificación.

El escenario incluye inicialmente proporcionar un conjunto de vectores de expresión que codifican para cada uno de los distintos miembros de la proteína policlonal. Cada uno de los vectores de expresión se transfecta en el genoma de células hospedadoras adecuadas de manera separada, de modo que una célula exprese solo un miembro de la proteína policlonal. De manera subsiguiente, la selección de un marcador genético dominante co-expresado tal como un marcador de resistencia a- fármaco se lleva a cabo para seleccionar clones transfectados .

Se pueden seleccionar clones celulares individuales de alta producción usando protocolos para examen de alto rendimiento. Adicionalmente se pueden examinar clones para parámetros apropiados del biorreactor y para productividad específica de células y títulos máximos.

Los mejores clones que codifican para cada uno de los distintos miembros de la proteína policlonal se eligen y se genera un banco de células maestras, MCB , para cada miembro distinto de la proteína policlonal. Cada MCB entonces se usa en la producción tradicional de etapa anterior. Los sobrenadantes de todas las corridas de biorreactor para cada miembro distinto de proteína policlonal se recolectan en tanques/recipientes de retención y se mezclan, y el sobrenadante pol'iclonal ' mezclado entonces se purifica. Opcionalmente , se puede llevar a cabo un paso de reducción de volumen antes de la recolección en tanques de retención. Los pasos de reducción de volumen pueden comprender ultrafiltración o cromatografía de afinidad, por ejemplo, cromatografía en proteína A. El paso de reducción de volumen se lleva a cabo de manera separada para distintos miembros de proteína . 3) Producción y Purificación Separada, Mezclado de Proteínas Purificadas' Este escenario incluye los siguientes pasos: - transfección en mezclas, - selección, - selección de clones de alta producción, - producción separada, - purificación separada, - mezclado de anticuerpos purificados (sustancias de fármaco) .

El escenario es idéntico al escenario 2 hasta el final del proceso de etapa anterior. Los distintos miembros de la pro teína policlonal entonces se someten a procesamiento tradicional separado de etapa posterior. Las sustancias de fármaco purificadas de todas" las corridas para cada miembro distinto de proteína policlonal se recolectan y se almacenan opcionalmente y se mezclan de acuerdo a los criterios especificados para obtener el producto final de fármaco.

Mezclado de Células y Proteínas Cuando quiera que se mezclen diferentes poblaciones de células durante la parte de procesamiento de etapa anterior de la fabricación, esto afectará la composición de la proteína policlonal obtenida como el producto final.

Un planteamiento para mezclar células incluye mezclar o combinar números iguales de células de al menos dos poblaciones diferentes de células. Sin embargo, si diferentes poblaciones de células tienen diferentes niveles de expresión o diferentes velocidades de crecimiento, esto no puede conducir a una distribución igual de los distintos miembros de proteína en el producto final. A fin de compensar esto, se pueden combinar diferentes números de células de al menos dos poblaciones diferentes de células. Las células de diferentes poblaciones de esta manera se pueden combinar para obtener una población de células policlonales capaz de expresar cantidades aproximadamente iguales de los distintos miembros de la proteína policlonal, tal como mezclándolos en una relación pre-definida, que se puede determinar de manera experimental .

En otras modalidades, las células de al menos dos poblaciones diferentes de células se combinan en una relación que da una relación pre-definida de los distintos miembros de proteína en la sustancia de fármaco o el producto de fármaco. Esto sé puede hacer al usar conocimiento a cerca de los niveles de expresión y/o velocidad de crecimiento de las diferentes poblaciones de células y/o conocimiento acerca de la recuperación de los distintos miembros en al menos un paso de purificación para calcular la relación antes de combinar las células. De manera alternativa, las relaciones de mezclado adecuadas para obtener un resultado deseado se pueden determinar de manera empírica en base a los datos experimentales .

Cuando se lleva a cabo la combinación al final del procesamiento de etapa anterior o durante el procesamiento de etapa posterior esto se puede hacer simplemente al combinar volúmenes iguales de cultivos celulares de los distintos miembros de- la proteína policlonal. De manera alternativa, se pueden combinar cantidades iguales de los distintos miembros de la proteína policlonal si se ha obtenido esta información.

Los por lo menos dos miembros distintos de la proteína policlonal se pueden combinar en una relación que da una relación pre-definida de los distintos miembros de proteína, en la sustancia de fármaco o producto de fármaco. Esto se puede hacer al usar conocimiento cerca de la recuperación de los distintos miembros en al menos un paso de purificación para calcular la relación antes de la combinación.

Proteínas Policlonales En la mayoría de las modalidades de la invención, la proteína policlonal no está asociada de forma natural con las células que expresan los miembros de proteína, y el sistema de expresión es recombinante .

La presente invención proporciona métodos para la producción consistente de proteínas policlonales recombinantes que se segregan de manera preferente y se seleccionan de manera más preferente de la superfamilia de inmunoglobulinas , una familia de proteínas con dominios tipo inmunoglobulina. La mayoría de los miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas están comprendidos en eventos de reconocimiento en superficie celular. El análisis de secuencias sugiere que los anticuerpos, receptores de cé^las T, moléculas de MHC, algunas moléculas de adhesión celular y receptores de citocinas son altamente homólogos. Especialmente, los miembros de esta familia que contienen regiones variables son adecuados para la generación de proteínas policlonales recombinantes de acuerdo a la presente invención. Estos miembros incluyen anticuerpos, anticuerpos unidos a membrana (receptores de células B) , fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadena individual (scFv) , receptores de células T (TcR) , TcR solubles, fragmentos de dominio variable de TcR, fragmentos de dominio variable de TcR enlazados a un ligador polipeptídico, y otros fragmentos derivados de anticuerpos o de TcR. En particular, se contempla que la presente invención se puede usar para la elaboración y producción a gran escala de anticuerpos policlonales , terapéuticos, recombinantes o fragmentos de anticuerpo y fragmentos de TcR y TcR. En una modalidad preferida, la proteína policlonal es un anticuerpo policlonal o un fragmento de anticuerpo policlonal.

La proteína policlonal recombinante de la presente invención se refiere a una composición de proteína que comprende moléculas de proteína diferentes, pero homologas, donde las diferencias reflejan por ejemplo una diversidad que se presenta de forma natural. De esta manera, cada molécula de protelna es homologa a las otras moléculas de la composición, pero también contiene uno o más tramos de la secuencia variable de polipéptido caracterizada por diferencias en la secuencia de aminoácidos entre los miembros individuales de la proteína policlonal. Las diferencias en las secuencias de aminoácidos que constituyen la secuencia variable de polipéptido pueden ser tan pocas como un aminoácido pero normalmente constituirán más de un aminoácido. La variabilidad natural de un anticuerpo policlonal o TcR está en general localizada en las llamadas regiones variables o regiones V de las cadenas de polipéptido .

En una modalidad de la presente invención, los miembros individuales en una proteína policlonal comprenden regiones variables que son de entre aproximadamente 80 y 120 aminoácidos de largo. Las regiones variables pueden comprender dominios hiper-variables , por ejemplo, regiones determinantes de complementariedad (CDR) . En los TcR que se presentan de manera natural, hay cuatro CDR en cada región variable. En los anticuerpos que se presentan de manera natural, hay tres CDR en la cadena pesada y tres CDR en la cadena ligera.

En una modalidad adicional de la presente invención, las regiones variables de los miembros individuales de una proteína policlonal comprenden al menos un dominio hiper-variable que es de entre 1 y 26 aminoácidos de largo, preferentemente de entre 4 y 16 aminoácidos de largo. Este dominio hiper-variable puede corresponderá una región CDR3. Para anticuerpos, cada región variable incluye de manera, preferente tres dominios hiper-variables . Estos pueden corresponder a CDRl, CDR2 y CER3. Para cada TcR, cada región variable constituye preferentemente cuatro dominios hiper-variables . Estos púeden corresponder a CDRl, CDR2 , CDR3 y CDR . Los dominios hiper-variables pueden constituir solos las secuencias variables dentro de una región variable de una proteína policlonal recombinante de la presente invención.

En el contexto de la presente invención, también la variabilidad en la secuencia de polipéptido (la policlonalidad) se puede entender para describir las diferencias entre las moléculas individuales de anticuerpo que residen en las llanadas regiones constantes o regiones C de las cadenas de polipéptido del anticuerpo, por ejemplo, como en el caso de mezclas de anticuerpos que contienen dos o más isotipos deferentes de anticuerpo, tal como los isotipos humanos IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgM, IgD, y IgE, o los isotipos murinos IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3 , IgM, y IgA. De esta manera, un anticuerpo policlonal recombinante puede comprender moléculas de anticuerpo que se caracterizan por diferencias de secuencia entre las moléculas individuales de anticuerpo en la región variable (región V) o la región constante (región C) o ambas. De manera preferente, los anticuerpos son del mismo isotipo, puesto que esto facilita considerablemente - la purificación y caracterización subsiguiente. También es concebible combinar anticuerpos de diferentes isotipos, o de manera preferente, de- diferentes sub-clases. Por ejemplo, se pueden combinar anticuerpos de los isotipos IgGl, IgG2 y IgG4 , puesto que estos se purifican todos conjuntamente usando cromatografía de afinidad de Proteína ?. En el caso de anticuerpos, de diferentes isotipos o subclases, la policlonalidad puede presentarse en el par constante o en el dominio variable, o en ambos. En una modalidad preferida, todos los anticuerpos que constituyen el anticuerpo policlonal tienen la misma región constante para facilitar adicionalmente la purificación. De manera más preferente, los anticuerpos tienen la misma región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena ligera también puede ser la misma a través de distintos anticuerpos. En una modalidad, las por lo menos dos poblaciones de células son de "esta manera idénticas excepto por las diferencias en las secuencias del vector de expresión que codifican para los distintos miembros de la proteina. Las por lo menos dos poblaciones celulares pueden ser, por ejemplo, idénticas excepto por las diferencias en al menos una secuencia de vector de- expresión que codifica para una región variable de los distintos miembros de la proteina.

En una modalidad preferida de la invención, la proteína policlonal recombinante es un anticuerpo policlonal _...r.ecombinante o fragmento de anticuerpo. En la otra modalidad preferida de la invención, la proteína policlonal recombinante es un~ TcR o fragmento de TcR, policlonal, recombinante .

La policlonalidad en la llamada región constante, particularmente la cadena pesada de los anticuerpos, es de interés con respecto ..a la aplicación terapéutica de los anticuerpos. Los varios isotipos de inmunoglobulina tienen diferentes funciones biológicas (resumidas en la Tabla 1) que pueden ser deseables para combinarse cuando se utilizan anticuerpos para el tratamiento, debido a que pueden estar implicados diferentes isotipos de inmunoglobulina en diferentes aspectos de respuestas inmunitarias naturales (Canfield y Morrison 1991. J.Exp.Med. 173, 1483-91; Kumpel et al. 2002. Transfus. Clin. Biol. 9, 45.-53; Stirnadel et al. 2000. Epidemiol. Infect.124, 153-162).

Tabla 1: Funciones biológicas de los isotipos de inmunoglobulinas humanas Como de describe anteriormente, la policlonidad puede residir en la parte constante, de modo que al menos un • miembro distinto de la proteína policlonal puede comprender una región constante, y al menos otro miembro distinto comprende una diferente región constante. También puede ser preferible tener diferentes patrones de glicosilación en las proteínas expresadas, que se pueden obtener a través del uso de diferentes células hospedadoras para distintos miembros de la proteína policlonal. Al menos un miembro distinto de la proteína policlonal puede comprender de esta manera un patrón de glicosilación, en tanto que otro miembro distinto comprende un diferente patrón de glicosilación.

En otras modalidades, se obtiene la policlonalidad a través de la derivatización de uno o más de -los distintos miembros de la proteína policlonal. Por ejemplo, al menos un miembro distinto de la proteína policlonal se puede derivatizar usando un método químico para modificación de la proteína tal como acoplamiento a una toxina y al menos otro miembro distinto no se derivatiza. Se pueden emplear diferentes tipos de derivatización química para diferentes miembros distintos de la proteína policlonal.

La proteína policlonal puede comprender al menos 3 miembros distintos, tal como al menos 4 miembros distintos, por ejemplo al menos 5 miembros distintos, tal como al menos 6 miembros distintos, por ejemplo al menos 7 miembros distintos,. tal como al menos 8 miembros distintos, por ejemplo al menos 9 miembros distintos, tal como al menos 10 miembros distintos, por ejemplo al menos 15 miembros distintos, tal como al menos 20 miembros distintos, por ejemplo al menos 25 miembros distintos. Para la mayoría de los propósitos, el número de miembros distintos en la proteína policlonal es menos de 50, tal como menos de 45, por ejemplo menos de 40, tal como menos de 35, por ejemplo menos de 30, tal como menos de 25, por ejemplo menos de 20, tal como menos de 15, por ejemplo menos de 10, tal como menos de 5.

En los diferentes escenarios de producción descritos anteriormente se va a entender que la fase separada de la producción se puede llevar a cabo para cada uno de- los distintos miembros, por ejemplo todos los distintos miembros se expresan de manera individual. Sin embargo, también es concebible que solo uno, dos o tres miembros distintos se produzcan de manera separada, en tanto que se producen o elaboran otros miembros en un lote único o en unos pocos lotes individuales .

La Célula Hospedadora Se pueden generar células hospedadoras de cualquier célula que pueda integrar el ADN en sus cromosomas o retener elementos extra-cromosómicos tal como plásmidos, mini-cromosomas, YAC (cromosomas artificiales de Levadura) , MAC (cromosomas artificiales de Ratón) , o HAC (cromosomas artificiales de Humanos) . Los MAC y los -HAC se describen en detalle en la WO 97/40183.

Las células hospedadoras pueden ser procarióticas o eucarióticas, y en algunos casos se pueden usar células procarióticas para la expresión de uno o más de los distintos miembros y se pueden usar células eucarióticas para uno o más de otros miembros distintos.' Las células eucarióticas pueden ser de un organismo eucariótico seleccionado del grupo que consiste de plantas, levadura, hongos, vertebrados e invertebrados. De manera alternativa, las células eucarióticas también pueden ser un hibridoma o células B inmortalizadas para la expresión de anticuerpos .

De manera preferente, se usan células mamíferas tal como células CHO, células COS, células BHK, células de mieloma (por ejemplo, células Sp2/0, YB2/0 o NSO) , fibroblastos tal como NIH 3T3, células humanas inmortalizadas tal como células HeLa, células HEK 293 o células PER..C6. Sin embargo, también se pueden emplear células eucarióticas o procarióticas no mamíferas, tal como células vegetales, células insectiles, células de levadura, hongos, bacterias tal como E. coli. En una modalidad preferida, la célula hospedadora es una célula mamífera tal como una célula CHO.

En una modalidad de la presente invención, la línea celular que se va a usar como material de inicio se sub-clona al realizar dilución limitante de la línea celular hacia abajo al nivel de la célula individual, seguido por crecimiento de cada célula individual a una nueva población de células antes de la transfección con una biblioteca de vectores de interés. Esta sub-clonación también se puede realizar más adelante en el proceso de selección de la línea celular correcta, si se desea. Otros métodos para clonación de células individuales incluyen: clonación FACS (Brezinsky et 'al. J. 2003. Immunol Methods 277, 141-155), tecnología LEAPMR (de Cyntellect, San Diego, California, EUA) , y ClonePix (de Genetíx, RU) . De esta manera, se deriva una población particular de células de una célula clonada que expresa un miembro distinto de la proteína policlonal.

Se pueden usar otros sistemas de producción o elaboración además de la producción recombinante tradicional en células mamíferas aisladas y bacterias aisladas.

Por ejemplo, los anticuerpos se pueden expresar de manera recombinante en hongos, levadura y plantas intactas, en aves transgénicas (recuperando el anticuerpo de los huevos) y en animales transgénicos (recuperando el anticuerpo de la leche) .

En la técnica se conocen métodos para la elaboración de anticuerpos en hongos, por ejemplo como se describe en la WO 2005/070962; Nyyssonen et al. 1993, Nat Biotech 11:591-5; y en Ward et al. 2004, Ap l . Environ.

Microbiol. 70: 2567-76.

Los métodos para la elaboración de anticuerpos monoclonales en levaduras se- conocen en la técnica, por ejemplo, como se describe en Li et al., 2006, Nature Biotech. 24 (2) : 219-215.

En la técnica se conocen métodos para la elaboración o producción de anticuerpos monoclonales en plantas intactas, por ejemplo como se describe en Bouquin et al., 2002, Transgenic Res. 11: 115-22; Hood et al., 2002, Curr. Opin. Biotechnol. 13:630-5; y en Stoger et al., 2004, Methods Mol. Biol. 248:301-318.

En la técnica se conocen métodos para la elaboración de anticuerpos monoclonales en aves,- donde el producto de anticuerpo se encuentra en el huevo, por ejemplo como se- describe en Zhu et al., 2005, Nature Biotech. 23: 1159-69.

También se pueden producir de manera recombinante los anticuerpos en animales trasngénicos , donde el producto de anticuerpo recombinante se puede encontrar en la leche. Los ejemplos de estos métodos se describen en las siguientes referencias: Behboodi et al., 2005, Cloning Stem Cells 7: 107-18; Hodges et al., 2003, Reprod. Biol. Endocrinol . 1:81; Houdebine' LM. 2002, Curr Opin. Biotechnol 13:625-9; Jang et al., 2006, Theriogenology 65:1800-12; Lai et al., 2003, Reprod. Biol. Endocrinol. 1:82; Lonberg N. 2005, Nature Biotech. 23:1117-25; Santora et al . , 2006, Biomed. Chromatogr. 20:843-56; Tang et al . , 2008, Transgenic Res; y Young et al . , 1998, Res Immunol 149:609-10.

Vector para Integración Un vector adecuado comprende un gen de selección adecuado. Los genes de selección adecuados para el uso en la expresión en células mamíferas incluyen, pero, no se limitan a, genes que permiten selección nutricional, tal como el gen de timidina-cinasa (TK) , el gen de glutamina- sintetasa (GS) , el gen de triptófano-sintasa (trpB) o el gen de histidinol-deshidrogenasa (hisD) . Los marcadores de selección que se pueden usar incluyen genes de resistencia anti-metabolitos que confieren resistencia a fármacos, tal como el gen de dihidrofoliato-reductasa (dhfr) , que se puede seleccionar con medio deficiente en hipoxantina y timidina y se selecciona adicionalmente con metotrexato, el gen de xantina-guanina-fosforibosiltransferasa (gpt) , que se puede seleccionar con ácido micofenólico, el gen de neomicina-fosfotransferasa (neo) que se puede seleccionar con G418 en células eucarióticas y neomicina o canamicina en células procarióticas , el gen de higromicina B-fosfotransferasa (hyg, hph, hpt) , que se puede seleccionar con higromicina, el gen de puromicina-N-acetil-transferasa (pac) , que se puede seleccionar con puromicina, o el gen de Blasticidina S-desaminasa (Bsd) , que se puede seleccionar con blasticidina. y el gen de resistencia ..a Zeocina (Sh ble), que media la resistencia hacia Zeocina y Bleomicina. Finalmente, también se pueden usar genes que codifican para proteínas que permiten la clasificación, por ejemplo, por citometría de flujo como marcadores de selección, tal como la proteína fluorescente verde (GFP) , el receptor del factor de crecimiento de nervios (NGFR) u otras proteínas de membrana, o bet-galactosidasa (LacZ) .

De manera preferente, el marcador seleccionable codifica para un producto génico para el cual es deficiente la célula hospedadora, que evita la adición por ejemplo de un antibiótico al medio de cultivo. En otra modalidad preferida, se cultivan de manera continua a células bajo condiciones que favorecen el crecimiento de células que expresan el marcador seleccionable. Esto es particularmente útil cuando el marcador seleccionable es un producto génico en el cual es deficiente la célula hospedadora, puesto que permite el uso de condiciones de selección a todo lo largo del periodo de cultivo sin la adición por ejemplo de antibióticos.

En el caso de expresión de proteínas diméricas o multiméricas , un vector de expresión puede codificar para todas las subunidades de un miembro distinto de la proteína policlonal.. De manera alternativa, los vectores de expresión pueden incluir dos o más subconjuntos de vectores de expresión,, donde un primer subconjunto comprende" secuencias variantes de ácido nucleico que codifican para una subunidad de la proteína, y un segundo subconjunto comprende secuencias variantes de ácido nucleico que codifican para otra subunidad de la proteína, tal que cada transfección se realiza con un miembro del primer subconjunto y un miembro del segundo subconjunto de vectores de expresión. En el caso de anticuerpos, los vectores de expresión pueden estar constituidos- por dos subconjuntos de vectores de expresión, donde el primer subconjunto comprende secuencias variantes de ácido nucleico que codifican para una cadena pesada de anticuerpo, y el segundo subconjunto comprende secuencias variantes de ácido nucleico que codifican para una cadena ligera de anticuerpo, tal que cada transfección -se realice con un miembro del primer subconjunto y un miembro del segundo subconjunto de vectores de expresión.

El marcador de selección puede estar localizado en un vector separado de expresión, de modo que se realice la co-transfección con un vector de expresión que codifica para el marcador de selección y uno o más vectores de expresión que codifican para la proteína de interés o para las subunidades de la proteína de interés . El marcador de selección también puede estar localizado en el vector de , expresión que codifica para la proteína de interés. En este último caso, el marcador de selección está localizado preferentemente en un trascripto que también codifica para la proteína de interés o una de sus subunidades. Esto se puede hacer, por ejemplo, usando una construcción IRES. En el caso de una proteína multimérica, tal como un anticuerpo multimérico, el marcador de selección está localizado preferentemente en el trascripto que codifica para la subunidad más grande, por ejemplo la cadena pesada de un anticuerpo.

El vector para la integración del gen de interés comprende además ADN que codifica para un miembro de la proteína policlonal recombinante de interés, presidido por su propio motor que dirige la expresión de la proteína, por ejemplo, un promotor mamífero para la expresión en células mamíferas. Si un miembro de la proteína policlonal recombinante de interés comprende más de una cadena de proteína, por ejemplo, si el miembro es un anticuerpo o receptor de células T, el ADN que codifica para las cadenas individuales de la proteína se puede preceder por su propio promotor que dirige altos niveles de expresión (bi-direccional o uni-direccional) de cada una de las cadenas. En una expresión bi-direccional , se puede usar una configuración de promotor a la par en el vector de expresión, y para una expresión unidireccional se pueden usar para la expresión dos promotores o un promotor combinado por ejemplo con una secuencia IRES. Un vector de expresión bi-cistrónico con dos diferentes subunidades codificadas por el mismo transcripto y separadas por una secuencia IRES es igualmente concebible.

Las configuraciones adecuadas de promotor a la par son, por ejemplo, el promotor AdMLP junto con el promotor de metalotioneina-1 de ratón en ambas orientaciones, el promotor AdMLP junto con el promotor de factor- 1 de alargamiento en ambas orientaciones, el promotor de CMV junto con el promotor de MPSV en ambas orientaciones, o el promotor de CMV usado en ambas- orientaciones.

En el caso de anticuerpos, la experiencia ha mostrado que la cantidad de cadena pesada expresada por una célula no debe exceder la cantidad de cadena ligera. Por lo tanto, el promotor que dirige la expresión de la cadena ligera es preferentemente al menos tan fuerte como el promotor que dirige la expresión de la cadena pesada.

Una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia guía funcional se puede incluir en el vector de expresión para dirigir el producto génico al retículo endoplásmico o a una ubicación específica dentro de la célula tal como un organelo. Una señal fuerte de poliadenilación puede - estar situada 3' de la secuencia de ADN que codifica para la proteína. La señal de poliadenilación asegura la terminación y poliadenilación del trascripto naciente de ARN y se correlaciona con la estabilidad del mensaje. El ADN que codifica para un miembro de la proteína policlonal recombinante de interés puede codificar, por ejemplo, para ambas cadenas pesada y ligera de un anticuerpo o fragmentos de anticuerpo, cada secuencia génica que está presidida opcionalmente por sus propios elementos promotores mamíferos y/o seguida por señales fuertes poli A que dirigen la expresión de alto nivel de cada una de las dos cadenas. .

El vector de expresión para la integración puede tener elementos reguladores, transcripcionales., adicionales, tal como intensificadores , anti-represores , o UCOE (elementos ubicuos de abertura de cromatina) para la expresión incrementada en el sitio de la integración. Los intensificadores son secuencias de ácido nucleico que interactúan específicamente con las proteínas nucleares, comprendidas en la trascripción. Los UCOE abren la cromatina o mantienen la cromatina en un estado abierto y facilitan la expresión reproducible de un gen operablemente enlazado (descrito en más detalle en WO 00/05393 y Benton et al., Cytotechnology 38:43-46, 2002). -Los intensificadores adicionales incluyen Regiones de Unión de Matriz (MAR) como se describe por ejemplo en Girod & Mermod 2003 ("Chapter 10: Use of scaffold/matrix-attachment regions for protein production" , pp 359-379 in Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, SC Makrides (ed.), 2003, Elsevier Science BV) . Los elementos anti-represores incluyen pero no se limitan a elementos STAR (Kwaks et al., Nat Biotechnol. 2003 May; 21 (5) : 553 -8 ) . Cuando se integran uno o más de los elementos reguladores descritos en lo anterior en el cromosoma de una célula hospedadora se llaman elementos reguladores heterólogos .

Si se necesitan incrementar los niveles de expresión, se puede realizar la amplificación génica usando selección para un gen de DHFR o un gen de glutamina- sintasa (GS) , un gen de hprt (hipoxantina- fosforibosiltransferasa) o un gen de triptofano-sintasa . Esto requiere el uso de vectores que comprenden un marcador de selección.

Cultivo de Células Productoras Durante el paso de cultivo, se cultivan las células transformadas al preparar y cultivar un inoculo (la serie de siembra) al aumentar en escala el inoculo en un biorreactor individual o en una serie de biorreactores (la serie de inoculación) , y al producir y acumular la proteína del inoculo (la fase de producción) .

En la fase de la serie de siembra, las células transformadas del paso de transformación se recuperan en un medio de cultivo de inoculo para crear un inoculo. Las células h.ospedadoras transformadas se cultivan por métodos conocidos en la técnica en un medio líquido que contiene fuentes asimilables de carbono (carbohidratos tal como glucosa o lactosa), nitrógeno (aminoácidos, péptidos, proteínas o sus productos de degradación tal como peptonas, sales de amonio o similares) , y sales inorgánicas (sulfatos, fosfatos y/o, carbonatos de sodio, potasio, magnesio y calcio) . El medio de cultivo de inoculo incluye de manera preferente un medio nutriente convencional tal como Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) (Sigma) , Ham's FIO (Sigma) , Medio Esencial Mínimo (MEM) (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) o NCTC-135. El medio de cultivo es preferentemente un medio libre de suero, y de manera más preferente un medio libre de proteínas animales tal como EX-CELLMR 302 (SAFC Biosciences) , de manera aún más preferente un medio libre de proteína tal como EX-CELLR 325 (SAFC Biosciences) , y de manera más preferente un medio químicamente definido tal como 0ptiCH0MR (Invitrogen) , o ProCH04™ o PowerCH02-CDMR (Lonza BioWhittaker) .

Se puede complementar cualquiera de estos medios como sea necesario con aminoácidos (glutamina) , hormonas o factores de crecimiento (insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico) , vitaminas, sales (sulfato de zinc, cloruro de sodio, fosfato) amortiguadores, nucleótidos, antibióticos, agentes tensioactivos iónicos, y/o glucosa o una fuente equivalente de energía. El medio puede contener además elementos traza que son sustancias promotoras de crecimiento, tal como quelatos de hierro (por ejemplo, quelato B, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) , y/o manganeso. Durante la serie de siembra, para asegurar el crecimiento celular rápido se monitorizan las condiciones de cultivo, tal como temperatura, pH y similares.

Durante la serie de inoculación, el inoculo se aumenta en escala en medio de aumento de escala a través de pasos secuenciales de cultivo. Estos pasos se pueden realizar en ún recipiente adecuado, que incluyen matraces de cultivo celular, botellas de agitación, botellas de rodamiento, biorreactores giratorios, y matraces de agitación centrífuga. De manera preferente, la serie de inoculación se lleva a cabo en un biorreactor, de modo que las células se pueden transferir a un reactor de producción a través de un sistema cerrado de tubería. El medio de aumento de escala también incluye un medio nutriente convencional y puede incluir aminoácidos suministrados por hidrolizados (por ejemplo, HySoy"11, Quest International, Chicago, IL) , hormonas u otros factores de crecimiento, vitaminas, sales, amortiguadores, nucleótidos, antibióticos, agentes tensioactivos iónicos, quelatos de hierro, y glucosa o una fuente equivalente de energía. Durante la serie de inoculación en los biorreactores, se monitorizan el pH, la saturación de oxígeno y los productos residuales del inoculo.

Durante la fase de producción, las células se transfieren a un tanque de agitación o biorreactor de ventilación o un biorreactor desechable ó de uso único y se alimentan con un medio de crecimiento complejo que contiene azúcares, aminoácidos, sales, elementos traza y factores de crecimiento, que se combinan en cantidades para mantener el pH, osmolaridad, y otros parámetros esenciales del medio de crecimiento para crecimiento celular consistente, fuerte y rápido. Los ejemplos de estas soluciones de alimentación comercialmente disponibles son el refuerzo celular 1-6 (Hyclone) y EfficientFeedMR A y B (Invitrogen) . De manera alternativa, se pueden usar soluciones de alimentación hechas a medida que corresponden a las necesidades de las células particulares de producción. El uso de compuestos osmoprotectores, tal como betaina o prolina, por ejemplo, r puede proteger a las células de estrés osmóticos en tanto que mejora la productividad de los anticuerpos. Durante la fase de producción también se controlan la temperatura, oxígeno disuelto, pH, presión, velocidad de flujo de gas y velocidad de agitación. Durante la fase de producción, las células expresan la proteína internamente o segregan la proteína en el medio circundante. Aquellas células que expresan la proteína dentro de sus estructuras se pueden fragmentar química o mecánicamente a fin de recolectar la proteína. Las células más complejas tal como las células mamíferas pueden producir productos celulares glicosilados y segregar la proteína en el medio de cultivo celular para aislamiento.

Recolección y Purificación Durante el paso de recolección, la proteína se remueve del cultivo celular por cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, cuando las proteínas se producen de manera intracelular por las células transformadas, se puede usar centrifugación o ultrafiltración para remover las células hospedadoras o células lisadas. Donde la proteína se segrega en el medio, la proteína se puede remover de la mezcla de compuestos alimentados a las células y de los subproductos de las células mismas al usar filtros comercialmente disponibles para la concentración de proteína, por ejemplo unidades de ultrafiltración AmiconMR o Millipore PelliconMR.

Durante el paso de purificación, las proteínas se someten a uno o más pasos de purificación, incluyendo varios métodos de cromatografía. Los ejemplos de estos procedimientos de purificación incluyen cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de intercambio catiónico, así como varios métodos de filtración, tal como filtración por flujo tangencial usando membranas PelliconMR (Millipore Billerica, MA) , nanofiltración usando filtros de DVSO (Pall Corporation, East Hills, NY) , por ejemplo para reducir la contaminación viral potencial, y filtración sin salida de tamaño apropiado (tal como filtros de 0.45 m y 0.2 µp?) , fraccionamiento usando cromatografía de interacción hidrófoba (por ejemplo, en fenil-sefarosa) , precipitación con etanol, enfoque isoeléctrico, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en Heparina-SefarosaMR, cromatoenfoque , SDS-PAGE, precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía de afinidad (por ejemplo, usando proteína A, proteína G, un anticuerpo, un sustrato específico, ligando o antígeno como el reactivo de captura) .

Las proteínas de la presente invención también se pueden modificar o derivatizar. Los ejemplos de esta modificación incluyen modificaciones post-transduccionales . Tal como glicosilación (tanto O-enlazada como N-enlazada) , acetilación, fosforilación, ubiquitinación, conjugación polimérica, y similares. Algunas de estas modificaciones se pueden llevar a cabo in vivo usando la maquinaria de células hospedadoras , en tanto que otras requieren métodos in vi tro después del aislamiento de la proteína de la célula hospedadora.

Se entiende que las proteínas de la invención se pueden mezclar con un portador farmacéuticamente aceptable, o diluir por un portador y/o encerrar dentro de un portador, que puede estar, por ejemplo, en la forma de una cápsula, sobrecito, papel u otro recipiente. Cuando el portador sirve como un diluyente, puede ser un material sólido, semi-sólido o líquido que actúa como un vehículo, excipiente o medio para el ingrediente activo. Los portadores adecuados farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, uno o más de agua, solución salina, solución salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden comprender además cantidades menores de sustancias auxiliares tal como agentes humectantes o emulsionantes, conservadores o amortiguadores que mejoran la vida en anaquel o la efectividad de las proteínas. Las composiciones se pueden formular, como es bien conocido en la técnica, para proporcionar liberación rápida, sostenida o retrasa del ingrediente activo.

Las proteínas de esta invención pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas sólidas, semi-sólidas y líquidas de dosis, tal como tabletas, pildoras, polvos, soluciones líquidas, dispersiones o suspensiones, liposomas, supositorios, soluciones inyectables e infundibles. De esta manera, la composición puede estar en la forma de tabletas, pastillas, sobrecitos, cápsulas amiláceas, elíxires, suspensiones, aerosoles tal como un sólido o en un medio líquido o ungüentos que contiene por ejemplo hasta 10 % en peso, del compuesto activo, cápsulas blandas y duras de gelatina, supositorios, soluciones de inyección, suspensiones, polvos' envasados estériles y como un parche tópico. La forma preferida depende del modo propuesto de administración y de la aplicación terapéutica. Para administración parenteral por inyección o infusión, una formulación típica estará en la forma de una solución o suspensión, posiblemente basada en un producto liofilizado.

Después de la purificación, se valora típicamente la presencia y/o las cantidades o la distribución relativa de todos los miembros distintos en el anticuerpo policlonal, por ejemplo, por cromatografía de intercambio iónico o usando métodos basados en espectroscopia de masa, tal como el método de péptido marcador descrito en la O 2006/0.07853. Los métodos para la caracterización de una composición de anticuerpo policlonal se describen en detalle en WO 2006/007853. También se puede realizar la determinación de la presencia y/o de la cantidad de cada miembro de la proteína policlonal en otros puntos- durante la producción de etapa anterior o de etapa posterior, como se desee. En una modalidad, el método de la invención comprende de esta manera al menos un paso durante la producción y/o después de la purificación para verificar la .presencia y/o la cantidad de cada miembro en la proteína policlonal.

Una característica adicional, preferida de los distintos miembros de la proteína policlonal, es la homogeneidad de proteína, de modo que se pueden purificar fácilmente las proteínas. Un perfil de cromatografía de intercambio iónico con un pico distinto se prefiere para facilidad de caracterización. Esto aplica tanto a los distintos miembros de la proteína policlonal como al producto final de fármaco y a la composición final de la sustancia de fármaco. También es preferible cuando se combinan los distintos miembros que se pueden distinguir usando cromatografía de intercambio iónico u otros métodos de caracterización de proteínas, de modo que la composición con todos los distintos miembros se pueden caracterizar en una corrida. De esta manera, los distintos miembros de la proteína se eligen preferentemente para permitir la identificación de los distintos miembros de la proteína en un paso de caracterización después la purificación.

El producto final de fármaco comprende la proteína policlonal formulada para la administración (o posiblemente en forma liofilizada adecuada para la reconstitución con, por ejemplo, agua estéril antes de la administración) , un envase adecuado, y una inserción en envase con información de prescripción así como referencia a una autorización para la comercialización.

Expresión de Proteínas de Interés en Organismos Separados Al usar este escenario, las ventajas de usar métodos de procesamiento de etapa anterior de bajo costo que dependen de la expresión in vivo en un organismo intacto, se pueden aplicar a la elaboración o producción de productos de proteínas policlonales . La expresión recombinante de productos de proteína en plantas y en animales aún está en sus inicios . Los métodos para expresar diferentes miembros de un producto de proteína policlonal en un organismo pueden probar ser difíciles puesto que se necesitan insertar varios genes independientemente uno del otro en una célula que puedan dividirse y diferenciarse de manera subsiguiente en un organismo intacto. Por lo tanto, puede ser ventajoso ser capaces de expresar solo un miembro distinto de una proteína policlonal en un organismo.

Para los animales, se han desarrollado métodos para insertar una construcción heteróloga de expresión en células madre o células de huevo y asegurar que el producto codificado se exprese de manera subsiguiente y se segregue en la leche (en el caso de mamíferos) o en el huevo (en el caso de aves) . La presente invención se puede extender a animales de modo que un animal exprese un miembro de la proteína policlonal, después de lo cual se puede combinar la leche o huevos que contiene el producto de proteína y someter a un procedimiento único de procesamiento de etapa posterior. De manera alternativa, se pueden realizar de manera separada uno o más pasos del procesamiento de etapa posterior para uno o más de los distintos miembros de la proteína. La misma especie de animal normalmente se usará para expresar todos los miembros de la proteína policlonal a fin de facilitar el procesamiento de etapa posterior y la caracterización subsiguiente.

Para plantas, se han desarrollado igualmente métodos para la expresión de proteínas heterólogas . Algunos métodos dependen de la expresión del producto en un órgano particular de la planta tal como en un tubérculo de patata, en las hojas, en las semillas, o en las flores. Esta expresión específica del órgano puede facilitar el procesamiento de etapa posterior, en particular si se pueden evitar partes ricas en fibra de la planta. Usando estos métodos, se pueden expresar productos de proteína recombinante en altas cantidades usando métodos de bajo costo para cultivar plantas. De esta manera una planta individual expresará un miembro de la proteína policlonal, y se pueden combinar los diferentes miembros antes de, durante o después del procesamiento de etapa posterior. La misma especie y variedad de planta normalmente se usará para expresar todos los miembros de la proteína policlonal.

Usos Terapéuticos de Composiciones Preparadas de Acuerdo a la Invención Las composiciones farmacéuticas preparadas de acuerdo a la presente¦- invención se pueden usar para el tratamiento, mejora o prevención de una enfermedad en un mamífero. Las "enfermedades que se pueden tratar con las presentes composiciones farmacéuticas incluyen cáncer, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias, alergia, asma y otras enfermedades respiratorias, enfermedades autoinmunitarias , enfermedades cardiovasculares, enfermedades del sistema nervioso central, enfermedades metabólicas y endocrinas, y rechazos de trasplante.

Además, los anticuerpos policlonales producidos de acuerdo con la invención se pueden usar para propósitos de diagnóstico, por ejemplo, en equipos de diagnóstico, y en equipos para uso ambiental, por ejemplo para la detección de contaminantes .

Ejemplos Ejemplo 1.- Expansión Celular Separada, Producción Mezclada en Matraces Agitadores Vista general Se contaron seis diferentes poblaciones de células y se mezclaron en relaciones celulares iguales (1:1:1:1:1:1) y se usaron para sembrar un biorreactor en donde cada población de células produjo un anticuerpo diferente. Las células se cultivaron durante 7 días, después de lo cual se cuantificó la cantidad de cada uno de los seis anticuerpos usando cromatografía de intercambio iónico (IEX) . El experimento se repitió _ dos veces y se investigó la reproducibilidad de lote a lote la composición obtenida de anticuerpo policlonal.

Materiales y métodos Línea Celular La línea celular, productora, parental usada es un derivado de la línea GD44 de células CHO, negativa a DHFR obtenida de Lawrence Chasin, Columbia University. Se tranfectaron células DG44 con un cADN para el transactivador E1A tipo 5 de adenovirus en el vector pcADN3.1+ (Invitrogen) . Se seleccionaron transfectantes con Geneticin (Invitrogen) a una concentración de 500 pg/ml . Después de la selección, las células se clonaron en células individuales por dilución limitante. Se probaron los clones para la expresión del anticuerpo por transfección transiente con un plásmido de anticuerpo. Un clon individual mostró un nivel de expresión en el ensayo transiente que se mejoró por un factor de 3 en comparación a la línea no transfectada de células DG44. En comparaciones realizadas con transfección estable, las mezclas seleccionadas mostraron un nivel incrementado 4-5 veces de expresión en comparación a la línea tipo silvestres de células DG44. Este clon (llamado ECHO) se sub-clonó dos veces y pareció ser estable con respecto a la expresión de anticuerpo .

Plásmidos de Expresión de Anticuerpo Los plásmidos usados de expresión de anticuerpo IgGl se construyeron de modo que las regiones codificantes para cadena pesada (región constante VH + gamma 1) y ligera (kappa 02-286) se expresaron usando dos promotores idénticos de CMV, humanos, a la par, con un elemento separador entre estos. La selección para los transfectantes se llevó a cabo usando un cásete de cADN de dihidrofoliato-reductasa (DHFR) de ratón por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) localizado en la dirección 3' de la secuencia codificante de cadena pesada. Se eligieron seis anticuerpos diferentes que se dirigieron contra diferentes proteínas superficiales de virus de Vaccinia. La Tabla 2 muestra los anticuerpos y los clones de ECHO que los expresan.

Tabla 2. Anticuerpos y Clones de ECHO Transfección de Células ECHO Se sembraron células ECHO en matraces T80 a una densidad de 0.3 x 10e células/por matraz en medio MEM-alfa (con nucleósidos) (Invitrogen) con suero de becerro fetal al 10 % (FCS) (Invitrogen) . En el espacio de una hora de la siembra, las células de transfectaron con FugeneMR6 (Roche) : - Se mezclaron 10 µ? de FugeneMR6 con 490 µ? de medio Eagle modificado de Dulbecco y se dejó incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente .

- Se adicionaron 5 pg de plásmido de expresión y la mezcla se incubó durante 15 minutos adicionales a temperatura ambiente.

La mezcla se adicionó al matraz de cultivo celular.

Al siguiente día, el medio con los reactivos de transfección se aspiró, cada matraz se lavó una vez con 5 mi de medio MEM-alfa (sin nucleósidos) con FCS dializado al 10 % (Invitrogen) (MEMalfa-) y 10 mi del mismo medio se adicionaron conjuntamente con metotrexato a una concentración de 2 nM. El medio se cambio dos veces por semana. Después de 15 días, las células se trataron con tripsina y se transfirieron todas las células a nuevos matraces.

Para la producción de clones de células individuales, las células en las mezclas se tiñeron para el anticuerpo asociado a. superficie y se clasificaron por células individuales con FACS usando un FACS-Aria (Becton-Dickinson) . Después de aproximadamente 1 semana, las concavidades se inspeccionaron por microscopio para la presencia de clones individuales. Después de aproximadamente 2 semanas , se valoraron los sobrenadantes de las concavidades con un clon individual cada uno en una dilución individual por ELISA de IgG y "en base al valor de ELISA y a la inspección visual de las concavidades, se seleccionaron 24 clones que representan cada anticuerpo para la adaptación al cultivo en suspensión libre de suero.

Adaptación a Cultivo en Suspensión Libre de Suero Las células se trataron con tripsina y se contaron.

Se centrifugaron 5.0 x 106 células y se re-suspendieron en 10 mi de medio libre de suero ProCH04MR (Lonza) + L-glutamina 4 mM (Invitrogen) + 1/100 MEM NEAA (Invitrogen) . Las células se transfirieron a tubos de cultivo celular de 50 mi (TRP, Suiza) y se incubaron en un agitador a 37 °C. Las densidades celulares se contaron dos veces por semana y cada vez los cultivos se diluyeron a 0.5 x 106 células por mi (para las primeras 2 semanas) o a 0.3. x 106 células por mi (para el periodo restante). Después de 4-5 semanas, el tiempo de duplicación para la mayoría de los clones se aproximó a 30 horas, punto de tiempo en el cual se consideró que se adaptaron al cultivo libre de suero. Al final del periodo de adaptación, las células se valoraron por ELISA, se congelaron y usaron para experimentos de expresión.

Descongelación y Expansión Cada una de las seis diferentes líneas celulares se descongeló en medio ProCH04MR calentado a 37°C. La suspensión celular se centrifugó cuatro minutos a 800 rpm (160 G) , el sobrenadante se removió, y el sedimento celular se re-suspensión en 12 mi de medio ProCH04MR a 37°C. La suspensión celular entonces se transfirió a un matraz T75 y se colocó en una incubadora a 37°C y 5 % de C02. En el día 2, el cultivo se ajustó a 5.0 x 105 células/ml en medio ProCH04MR en un agitador o un frasco/biorreactor de 50 mi. Durante la expansión celular, la concentración celular se ajustó a 0.5 x 106 células/ml dos veces o tres veces por semana. Después de una semana de expansión, cada una de las seis líneas celulares se ajustó con 0.5 x 106 célula/ml en 60-80 mi de medio en agitadores de 500 mi.

Cultivo Cuando se siembran los agitadores, las seis líneas celulares se mezclaron y se dividió el inoculo en dos agitadores de 250 mi. De forma breve, antes del mezclado, las muestras de cada linea celular se contaron tres veces y se usó la cuenta promedio de células viables. Un volumen de cada clon que corresponde a 15.0 x 106 células se tomó y se mezclaron los seis volúmenes completamente y se hizo una nueva cuenta celular. En base a esta cuenta celular, se establecieron dos agitadores de 250 mi con una concentración celular (mezclada) de 0.5 x 106/ml. El valor calculado para cada agitador se transfirió a un tubo de 50 mi y se centrifugó a 800 rpm (160 G) durante 4 minutos. El sobrenadante se descartó y las células se re-suspendieron en 50 mi del medio ProCH04MR y se transfirieron a un agitador de 250 mi. Los agitadores entonces se colocaron en una incubadora a 37 °C y 5 % de C02 en una mesa de agitación a 100 rpm y una amplitud de 2.6 cm.

El experimento se llevó a cabo en dos días separados ; el día 1 con los números 1A y IB de experimento y el día 2 con los números 2A y 2B de experimento. El cultivo se corrió durante 7 días, después de lo cual los sobrenadantes se salvaron para el perfilado IEX.

Análisis de Composición de IgG Se cargaron 5-10 mi de sobrenadante de medio filtrado a 0.22 pm en una columna MabSelect SuReMR de 1 mi (GE Healthcare) . La columna se lavó con 10 mi de PBS, pH 7.4 y se eluyó con glicina 0.1 M, pH 2.7 como se describe por el fabricante. El material de proteína mezclado se dializó dos veces contra NaCl 40 mM, Na-acetato 50 mM, pH 5.0 y se determinó la concentración total de IgG al medir la absorbancia 280 nm.

Se cargaron 60 pg de mezcla de IgG en la columna de intercambio catiónico débil PolyCat A (100x4, 6 ra, 3 pm, 1500 Á) de PolyLC. La proteína se eluyó al aplicar un gradiente de NaCl 150 a 500 mM en un amortiguador de acetato de sodio pH 5.0 a una velocidad de flujo de 1 ml/min durante 72 minutos. La absorbancia a 215 nM, del producto eluido se monitorizó y se determinaron cantidades relativas de IgG individuales por integración de la señal. A fin de comparar diferentes muestras, la cantidad total de anticuerpo se ajustó a 100 % y se calculó la relación de cada uno de- los seis anticuerpos. Resultados El sobrenadante de los matraces agitadores que contienen las poblaciones mezcladas se recolectó después de 7 días y se analizaron los perfiles IEX. El área relativa de cada anticuerpo se da en la Tabla .3 y en la Figura 3.

- Tabla 3. Área relativa de cada anticuerpo después de 7 días de cultivo en una población mezclada La tabla muestra que - La variación en las cantidades de cada uno de los seis anticuerpos entre dos diferentes matraces agitadores mezclados al mismo tiempo es muy pequeña. Probablemente está dentro de los límites de desviación estándar del método.

- Las células mezcladas en los diferentes días tiene también una variación muy pequeña, indicando que es posible mezclar seis diferentes poblaciones de células en relaciones celulares iguales y cultivarlas conjuntamente, lo que da por resultado la misma cantidad relativa de cada uno de los seis anticuerpos después del cultivo.

Ejemplo 2: Cultivo Separado de Etapa Anterior en Biorreactores de Lote de Alimentación, Mezclado Antes Purificación Vista General En biorreactores durante 13-14 días se cultivaron individualmente cinco diferentes líneas de células ECHO que expresan cinco diferentes anticuerpos de IgG. Después del cultivo, las fracciones que contienen los anticuerpos se mezclaron (2:1:1:1:1) durante la purificación a fin de obtener una composición de anticuerpos en la sustancia de fármaco a granel (BDS) .

Los plásmidos de expresión, células, etc., fueron como en el Ejemplo 1 con la excepción que sólo se expresaron cinco anticuerpos (ver Tabla 4) .

Tabla 4. Anticuerpos y clones de ECHO Descongelación y Expansión Cada una de las cinco diferentes líneas celulares se descongeló en medio ProCH04MR calentado a 37°C. La suspensión celular se centrifugó 4 minutos a 800 rpm (160 G) , el sobrenadante se removió, y el sedimento celular se re-suspendió en 12 mi de medio ProCH04MR a 37 °C. La suspensión celular se transfirió entonces a un matraz T75 y se colocó en una incubadora a 37 °C y C02 al 5 %. En el día 2, el cultivo se ajustó a 5.0xl05 células/ml en medio ProCH04MR en un agitador o un "biorreactor" de tubo de 50 ral. Durante la expansión celular, se ajustó la concentración celular a 0.5 x 106/ml dos veces o tres veces por semana. Después de una semana de expansión, cada una de las cinco líneas se transfirió al medio de producción, libre de suero EX-CELLMR 302 (SAFC) + L-glutamina 4 mM. Las líneas celulares se ajustaron con 0.5 x 106 células/ml en 60-80 mi de medio en agitadores de 500 mi y se cultivaron durante dos semanas hasta la inoculación del biorreactor.

Cultivo y Mezclado Durante Purificación Se llevaron a cabo los cultivos en seis biorreactores de volumen de trabajo de 500 mi (DASGIP AG) con control automático de pH, oxígeno disuelto, temperatura, perfil de alimentación y mezclado de gas. Cada uno de los seis biorreactores se inoculó con 5.0xl05/ml de células viables en EX-CELLMR 302 + L-glutamina 4 mM. Durante las corridas de los biorreactores, se alimentaron las células en una base diaria con medio EX-CELLMR 302 complementado con una solución concentrada de alimentación, glutamina y glucosa a un volumen final de 500 mi. Los cultivos se recolectaron después de 13-14 días y después de un paso de clarificación (centrifugación a 1942. G durante 15 minutos) cada uno de los seis sobrenadantes se filtro estéril a través de un Filtro de Membrana GP Express Plus de 0.22 µp? (Millipore) .

Se mezclaron volúmenes iguales de cada uno de los sobrenadantes filtrados a fin de obtener una composición de anticuerpos. La composición de anticuerpos se purificó por captura en Proteína A y se analizó por cromatografía de intercambio iónico (IEX) .

Análisis de Composición de IgG por Cromatografía de Intercambio Iónico Se purificaron por afinidad 5-10 mi de composición de anticuerpo, filtrada a 0.22 µ??, al cargarla sobre una columna MabSelect SuReMR de 1 mi (GE Healthcare) . La columna se lavó con 10 mi de PBS, pH 7.4 y se eluyó con glicina 0.1 M, pH 2.7 como se describe por el fabricante. La purificación se llevó a cabo en un sistema Ákta Express (GE Healthcare) . El material de proteína mezclado se dializó dos veces contra NaCl 40 TiM, a-acetato 50 mM pH 5.0 y se determinó la concentración total de IgG al medir la absorbancia 280 nm.

Se cargaron 80 g de mezcla de IgG en una columna de intercambio catiónico débil (PolyCat A, 100x4, 6 mm, 3 µp?, 1500 Á) de PolyLC. La proteína se eluyó al aplicar un gradiente de NaCl 150 a 500 mM en amortiguador de acetato de sodio pH 5.0 a una velocidad de flujo de 1 ml/min durante 72 minutos. Se monitorizó la absorbancia a 215 nM, del producto eluido, y se determinaron cantidades relativas de las IgG individuales por integración de la señal. La cantidad total de anticuerpo se ajustó a 100 % y se calculó la relación de cada uno de los cinco anticuerpos .

Análisis de Composición de IgG por HPLC Se analizó el contenido de IgG en muestras de sobrenadante de los biorreactores usando un analizador RX Daytona (Randox) y un método inmunoturbidimétrico de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Resultados Se llevaron a cabo los cultivos en seis biorreactores con un volumen de trabajo de 500 mi. Cada uno de los seis biorreactores se inoculó con 5.0 x 105/ml células viables, y se recolectó después de 13-14 días de cultivo. El ajuste del cultivo del biorreator, la concentración de los anticuerpos en la recolección y la fracción volumétrica en el paso de mezclado se da en la Tabla 5. Las concentraciones de los anticuerpos en la recolección difieren debido a las diferentes propiedades de los clones. Los dos cultivos con el mismo clon, CH 020-3 y CHM020-4, contuvieron concentraciones muy similares de anticuerpo en la recolección, indicando la fortaleza del proceso.

Tabla 5. Ajuste e cultivo, contenido de anticuerpos en la recolección y fracción volumétrica en el paso de mezclado Los anticuerpos se mezclaron después de la clarificación y filtración estéril al mezclar volúmenes iguales de los seis cultivos completos. La composición de anticuerpo entonces se purificó adicionalmente por cromatografía de afinidad y se analizó usando cromatografía de intercambio catiónico (CIEX) . La cantidad relativa de cada uno de los cinco anticuerpos se da en la Tabla 6 como se estima por cromatografía CIEX.

Tabla 6. Cantidad relativa de cada anticuerpo después de mezclado como se cuantifica por CIEX.

Anticuerpo Cuantificación por CIEX de IgG en mezcla (%) Sym002-303 17.4 Sym002 -286 23.9 Anticuerpo Cuantificación por CIEX de IgG en mezcla (%) Sym002-186 47.9 Sym002-235 3.8 Sym002-482 7.0 La tabla muestra que: Se pueden mezclar varios anticuerpos en una composición de anticuerpos policlonales y se purifican usando el procedimiento descrito.

- Una proteína policlonal producida usando este procedimiento se puede ajustar a una composición predeterminada al ajustar la cantidad de cada fracción que contienen anticuerpo.

Ejemplo 3: Series Separadas de Siembra Seguidas por Producción de Lote, de Alimentación en Lote Individual en Biorreactores Vista General Se contaron seis diferentes poblaciones de células y se mezclaron a relaciones celulares iguales (1:1:1:1:1:1) y se usaron para sembrar un biorreactor, en donde cada población celular produjo un diferente anticuerpo. Las células se cultivaron durante 12 días, después de lo cual se cuantifico la cantidad de cada, uno de los seis anticuerpos en el biorreactor usando cromatografía de intercambio iónico (IEX) . El experimento se repitió 8 veces y se investigó la variación entre los cultivos celulares mezclados.

Materiales y Métodos Línea Celular La línea celular usada fue la línea de células ECHO descrita en el Ejemplo 1.

Plásmidos de Expresión de Anticuerpo Los plásmidos de expresión de anticuerpo de IgG 1, usados, se construyeron de modo que se expresaron las regiones codificantes para la cadena pasada (VH + región constante gamma 1) y ligera usando dos promotores de CMV humanos, a la par, idénticos, con un elemento separador entre estos. Se llevó a cabo la selección de los transfectantes usando un cásete de cADN de hidrofoliato-reductasa (DHFR) de ratón activado por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) localizado en la dirección 5' de la secuencia codificante de cadena pesada. Para el experimento, se eligieron seis diferentes anticuerpos (numerados como 810, 816, 824, 853, 856, y 894) que se dirigieron contra los antígenos F y G del virus sincitial respiratorio (RS) .

Transfección de Células ECHO El método de transfección siguió el método de transfección descrito en el Ejemplo 1.

Se centrifugaron 5.0xl06 células y se re-suspendieron en 10 mi de medio libre de suero ProCH04MR (Lonza) + L-glutamina 4 mM (Invitrogen) + 1/100 MEM NEAA (Invitrogen) . Las células se transfirieron a tubos de cultivo celular de 50 mi (TPP, Suiza) y se incubaron en un agitador a 37°C. Las densidades celulares se contaron dos veces por semana y cada vez los cultivos se diluyeron a 0.5 x 106 células por mi (durante las primeras 2 semanas) o a 0.3 x 106 células por mi (para el periodo restante) . Después de 4-8 semanas, el tiempo de duplicación para la mayoría de los clones alcanzó 30 horas, punto en el cual se consideró que se adaptaron al cultivo libre de suero. Las células entonces se transfirieron a medio libre de suero PowerCH02MR (Lonza) + L-glutamina 4 mM (Invitrogen) + 1/100 MEM NEAA (Invitrogen) . Después de 2-3 semanas, cuando el tiempo de duplicación está por debajo de 35 horas, las células se consideraron adaptadas, después de los cual se valoraron para la productividad de anticuerpo por ELISA,, y se congelaron y usaron para experimentos de expresión .

Descongelación y Expansión Cada uno de los seis diferentes clones se descongeló en medio PowerCH02R calentado a 37 °C. La suspensión celular se centrifugó cuatro minutos a 800 rpm (160 G) , el sobrenadante se removió, y el sedimento celular se re-suspensión en 12 mi de medio PowerCH02MR a 37°C. La suspensión celular se transfirió entonces a un matraz T75 y se colocó en una incubadora a 37 °C y C02 al 5 %. En el día 2, el cultivo se ajustó a 5.0 x 105 células/ml en medio PowerCH02MR en un agitador o en un tubo de cultivo celular de 50 mi. Durante la expansión celular, la concentración celular se ajustó a 0.5xl06/ml dos veces o tres veces por semana. Después de 31 días de expansión, cada uno de los seis clones se ajustó en dos diferentes matraces agitadores (serie A y B) , que da un total de 12 matraces agitadores, con 0.5xl06 células/ml en 60-80 mi en agitadores de 500 mi.

Cultivo Después de un total de 35 días de expansión por serie de siembra de las líneas celulares individuales productoras de anticuerpo, cada uno de los cuatro biorreactores se sembró con una mezcla de los seis clones. Este experimento se repitió dos veces, que da un total de 8 biorreactores como se describe más adelante. De forma breve, antes del mezclado, cada clon se contó tres veces y se usó la cuenta celular viable, promedio. Se tomó un volumen de cada clon que corresponde a 25.0xl06 células y la "mezcla de seis clones" se mezcló completamente y se produjo una nueva cuenta celular. En base a esta cuenta celular, un biorreactor de 500 mi con una concentración celular (mezclada) de 0.3xlOe/ml se ajustó al adicionar medio PowerCH02MR + 20 % p/p de un medio de alimentación. El resto de la "mezcla de seis clones" se muestreo para el análisis de perfil IEX. El biorreactor entonces se cultivó con DO controlado a 30 %, pH 7.0 ± 0.1, 80 rpm. Las muestras se tomaron para el perfilado de IEX después de 4, 8 y 12 días.

Los Ocho Biorreactores A fin de investigar la fortaleza y consistencia de lote a lote del proceso, se usaron clones de los 12 matraces agitadores para sembrar 8 biorreactores como sigue: Para el biorreactor 1, se tomaron células de cada uno de los seis clones de la serie A de la serie de siembra de matraces agitadores.

Para el biorreactor 2, se tomaron células independientemente de la serie A de la serie de siembra de matraces agitadores de la misma manera como para el biorreactor 1.

Para el biorreactor 3, se tomaron células de cada uno de los seis clones de la serie B de la serie de siembra de los matraces agitadores.

Para el biorreactor 4, se tomaron células independientemente de la serie B de la serie de siembra de matraces agitadores de la misma manera como para el biorreactor 1.

Para los biorreactores 5 a 8, se tomaron células independientemente de la misma manera como se describe para los biorreactores 1 a 4. Se sembraron los biorreactores 5 a 8 dos días después de los biorreactores 1 a 4.

Purificación de Anticuerpo y Análisis por CIEX de la Composición de IgG Se cargaron 5-10 mi de sobrenadante de medio filtrado a 0.2 µp? en una columna MabSelect SuReMR de 1 mi (GE Healthcare) . La columna se lavó con 10 mi de PBS, pH 7.4 y se eluyó con glicina 0.1 M, pH 2.7 como se describe por el fabricante. El material de proteína, mezclado se dializó dos veces contra NaCl 40 mM, a-acetato 50 mM, pH 5.0, y se determinó la concentración total de IgG al medir la absorbancia 280 nm.

Se cargaron 60 g de mezcla de IgG sobre la . columna de intercambio catiónico débil PolyCat A (100x4, 6 m, 3 µp?, 1500 Á) de PolyLC. La proteína se eluyó al aplicar un gradiente de NaCl 150 a 500 mM en un amortiguador de acetato de sodio pH 5.0 a un flujo de 1 ml/min durante 72 minutos. La absorbancia a 215 nM, del producto eluido se monitorizó y se determinaron las cantidades relativas de las IgG individuales por la integración de la señal. A fin de comparar diferentes muestras, la cantidad total de- anticuerpo se ajustó a 100 % y se calculó la cantidad relativa de cada uno de los seis anticuerpos.

Resultados Los sobrenadantes de los 8 biorreactores que contienen las poblaciones mezcladas se recolectaron después de 12 días y se analizaron los perfiles de IEX después de la - filtración y purificación por captura en proteína A. El área relativa de cada anticuerpo se da en · la Tabla 7 y en la Figura 4..

Tabla 7. Área relativa de cada anticuerpo después de 12 días de cultivo en una población mezclada La Tabla 7 muestra que la variación en las cantidades de cada uno de los seis anticuerpos producidos en un cultivo mezclado es muy pequeña (presumiblemente dentro de límites de detección del método) , a pesar del hecho que los cultivos mezclados se sembraron con clones de diferentes matraces agitadores, en diferentes días, y con células tomadas independientemente una de la otra.

Los cromatogramas de IEX en la Figura 4 muestran la cantidad relativa de cada anticuerpo después de 12 días de cultivo. ? pesar de la variación deliberada al ajustar los biorreactores , las distribuciones resultantes para cada uno de los seis anticuerpos en los 8 biorreactores es altamente similar, indicando que el proceso es fuerte y altamente repetible. Además, este experimento demuestra que los 8 cultivos separados se pueden llevar a cabo sin ningún problema técnico, sugiriendo que el proceso es adecuado para la producción a gran escala de un anticuerpo policlonal o de otra proteína policlonal.

Ejemplo 4: Producción Separada en Animales, Mezclado Antes de DSP Se clonaron genes de cadena pesada y ligera de IgG en un vector apropiado de expresión dependiendo del animal de elección, con la expresión de los dos genes que está bajo el control de promotores de beta-caseína que dirigen la expresión génica a la glándula mamaria y usando un gen de marcador seleccionable . La construcción de expresión se transfectó (por ejemplo, usando LipofectAMINEMR, o similar) en un línea apropiada de células donadoras (por ejemplo, células de fibroblastos fetales) . Se seleccionaron células resistentes al marcador de selección por cultivo subsiguiente en medio apropiado. Las líneas celulares individuales se valoraron por PCR y transferencia Southern para detectar la presencia de ambos transgenes. La caracterización adicional de líneas celulares candidatas por hibridación in situ con fluorescencia (FISH) debe confirmar la co-localización de los transgenes de cadena pesada y ligera en un cromosoma individual . Las líneas celulares correctamente transfectadas se usan en transferencia nuclear de células somáticas (SC T) , usando electrofusión a oocitos enucleados (citoplastos) . Los blastocitos de SCNT entonces se transfirieron al útero con el cuerpo lúteo del animal receptor. Los receptores se regresaron al rebaño para esperar las evaluaciones subsiguientes para determinación de preñez . La descendencia se analizó por análisis de PCR de biopsias cutáneas para los genes H y L de IgG.

La descendencia clonada positiva se sometió a lactación hormonal y se ordeñaron para recolectar muestras para valorar la expresión de IgG. Se usaron animales clonados con niveles satisfactorios de IgG en la leche como animales fundadores para el rebaño de producción. Se genera un rebaño para cada anticuerpo usando este método. La leche de esta colección de rebaño se analiza para niveles de IgG por ELISA (o similares) y se almacena a aproximadamente 4°C en tanques de retención. El mezclado de la leche antes de la purificación se puede hacer en base a los niveles de IgG, o de manera alternativa se pueden purificar de forma separada los lotes de leche.

Se pueden aplicar métodos similares para producir plantas intactas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para, llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Método para producir un producto de f rmaco que comprende al menos dos miembros distintos de proteína de una proteína policlonal, caracterizado porque comprende los pasos de: a) proporcionar al menos dos poblaciones de células, en donde cada población codifica para un miembro distinto de la proteína policlonal y está encerrado en un recipiente físicamente separado que comprende medio de cultivo y células que expresan la proteína, en donde el método comprende una parte de etapa anterior, que comprende los pasos de: i) expandir las al menos dos poblaciones de células en uno o más pasos de una serie de siembra en recipientes separados ; ii) expandir células de la serie de siembra en uno o más pasos de una serie de inoculación; iii) cultivar células de la serie de inoculación en una fase de producción bajo condiciones que favorecen la expresión de los miembros de proteína, para expresar los al menos dos miembros distintos de proteína; b) recolectar la proteína expresada; c) realizar al menos un paso de purificación 3' en la proteína recolectada; . d) obtener la sustancia de fármaco purificada; y e) formular la sustancia de fármaco purificada en un producto de fármaco policlonal; en donde las al menos dos poblaciones de células se mantiene separada al menos durante la serie de siembra, y en donde al menos parte de la purificación de etapa posterior se lleva a cabo en una mezcla que comprende los miembros individuales de la proteína policlonal.

2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las al menos dos poblaciones de células se mantienen separadas al menos hasta la serie de inoculación inclusive.

3. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las al menos dos poblaciones de células se mantienen separadas al menos hasta la fase de producción inclusive .

4. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los al menos dos miembros distintos de proteína, expresados por las al menos dos poblaciones de células, se mantienen separados al menos hasta la recolección de la proteína.

5. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los al menos dos miembros distintos de proteína, expresados por las al menos dos poblaciones de células, se mantienen separados hasta al menos un paso de purificación inclusive.

6. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque se combinan números iguales de células de las al menos dos poblaciones de células .

7-. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque se combinan diferentes números de células de las al menos dos poblaciones de células.

8. Método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque las células de diferentes poblaciones se combinan para obtener una población de células policlonales capaz de expresar cantidades aproximadamente iguales de los distintos miembros de la proteína policlonal.

9. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque las células de las al menos dos poblaciones de células se mezclan en una relación pre-definida .

10. Método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque las células de . las al menos dos poblaciones de células se combinan en una relación que da una relación pre-definida de los distintos miembros de proteína en la sustancia o producto de fármaco.

11. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque se combinan volúmenes iguales de cultivos celulares de los distintos 5 miembros de la proteína policlonal.

12. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque se combinan cantidades iguales de los distintos miembros de la proteína policlonal . 10

13. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque los al menos dos miembros distintos de la proteína policlonal se combinan en una relación que da una relación pre-definida de los distintos miembros de proteína en la sustancia de fármaco o 15 producto de fármaco.

14. Método de .conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque al menos un miembro distinto de la proteína se mantiene separado de los otros miembros durante al menos un paso inicial de -20 purificación.

15. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la parte separada del método de producción se realiza en paralelo para al menos dos poblaciones distintas de células y/o al menos 25 dos miembros distintos de proteína, expresados por las al menos dos poblaciones de células.

16. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizado porque la parte separada del método de producción se realiza én serie para al menos dos distintas poblaciones de células y/o al menos dos distintos miembros de proteina expresados por al menos dos poblaciones de células.

17. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la parte separada del método de producción se realiza usando los mismos ingredientes de medio y los mismos parámetros de proceso para la expresión de diferentes miembros de la proteína .

18. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las al menos dos poblaciones de células son idénticas excepto por las diferencias en las secuencias del vector de expresión que codifican para los distintos miembros de la proteína.

19. Método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque las al menos dos poblaciones de células son idénticas excepto por las diferencias en al menos una secuencia de vector de expresión que codifica para una región variable de los distintos miembros de la proteína.

20. Método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque al menos un miembro distinto de la proteína policlonal comprende una región constante, y al menos otro miembro distinto comprende una diferente región constante .

21. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque al menos un miembro distinto de la proteína policlonal comprende un patrón de glicosilación, y al menos otro miembro distinto comprende un diferente patrón de glicosilación.

22. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la proteína policlonal comprende al menos tres miembros distintos.

23. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se segrega la proteína policlonal .-

24. Método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la proteína policlonal es un anticuerpo policlonal o fragmento de anticuerpo policlonal.

25. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la proteína policlonal es una proteína multimérica.

26. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25, caracterizado porque las células son procarióticas .

27. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25, caracterizado porque las células son eucarióticas .

28. Método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque las células eucarióticas son de un organismo eucariótico seleccionado del grupo que consiste de plantas, levadura, hongos, vertebrados e invertebrados.

29. Método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque las células eucarióticas son célula mamíferas.

30. Método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque las células mamíferas se seleccionan del grupo que consiste de células de ovario de hámster Chino (CHO) , células COS, células BHK, células de mieloma, células NIH 3T3, células de fibroblastos, células amnion, células humanas inmortalizadas tal como células HeLa, células HEK293 y células PER.C6.

31.. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque además comprende al menos un paso, durante la producción y/o después de la purificación para verificar la presencia y/o la cantidad de cada miembro de la proteína policlonal.