KR20110016899A - 폴리클로날 단백질을 제조하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 폴리클로날 단백질, 예를 들어 폴리클로날 항체의 2개 이상의 별개의 구성원(member)을 포함하는 약제 생성물(drug product)을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 각각의 별개의 구성원은 독립된 세포 개체군에 의해 발현된다. 본 발명의 방법은 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들을 발현하는 세포 개체군들을 개별적으로 배양하는 시작 단계를 적어도 포함한다. 개별적 세포 개체군들, 또는 이러한 개별적 세포 개체군들에 의해 발현된 단백질들은, 업스트림의 나중 시점(later point) 또는 다운스트림 처리에서 배합되어 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들을 포함하는 하나의 약제 생성물을 생성시킨다.
Description
발명의 분야
본 발명은 폴리클로날 단백질의 2개 이상의 별개의 구성원(member)을 포함하는 약제 생성물(drug product)을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들을 발현하는 세포들의 독립된 초기 배양 단계를 적어도 포함한다. 세포주들 또는 단백질 제제(preparation)들은 업스트림의 나중 시점(later point)에서 배합되거나 다운스트림 처리(downstream processing) 이전에 또는 다운스트림 처리 동안 배합되어, 궁극적으로 폴리클로날 단백질의 2개 이상의 별개의 구성원을 포함하는 하나의 약제 생성물(drug product)을 생성시킨다.
발명의 배경
재조합 폴리클로날 단백질을 제조하는 것은 비교적 신기술이다. 대다수의 재조합 약제 생성물은, 요망되는 생성물을 발현하는 하나의 클로날 세포로부터 유래된 선택 세포주(selected cell line)를 사용하여 모노클로날 생성물로서 제조된다. 이러한 경우 업스트림 및 다운스트림 제조 방법은 특정 모노클로날 약제 생성물에 대하여 최적화될 수 있다.
밀크(milk) (포유동물) 또는 알(egg) (닭)에서 재조합 생성물을 발현하는 트랜스제닉(transgenic) 동물을 사용하거나 식물 전체에 걸쳐 또는 독립된 기관 (괴경(tuber), 종자(seed), 잎(leaf))에서 재조합 생성물을 발현하는 트랜스제닉 식물을 사용하여 생체내에서 재조합 항체 및 다른 단백질 생성물을 제조하는 비용 효과적인 방법들이 최근 수 년에 걸쳐 개발되었다. 그러나, 이러한 방법들은 아직까지 폴리클로날 단백질 생성물을 제조하도록 적합된 적이 없었다.
폴리클로날 약제 생성물을 제조하기 위한 한 가지 방법이 WO 2004/009618에 기재되어 있는데, 이는 동일한 경쇄를 지닌 항체를 발현하는 모노클로날 세포주를 사용하는 것에 관한 것이다. 이러한 문헌에 따르면, 공통된 경쇄를 엔코딩하는 핵산 서열과 그러한 공통된 경쇄와 쌍을 이룰 수 있는 상이한 가변 영역을 지닌 2개 이상의 상이한 경쇄를 엔코딩하는 핵산 서열들을 재조합 숙주에서 발현시킴으로써, 항체들의 혼합물이 생성될 수 있다.
WO 2004/061104는, WO 2004/009618에 기재된 방법에 내재하는, 항체 중쇄와 경쇄가 스크램블링(scrambling)되는 문제에 대한 해결책을 제공하는데, 이러한 해결책은 부위-특이적 통합(site-specific integration)을 사용하여 발현 세포의 게놈의 특정 위치에 단지 하나의 발현 작제물(expression construct)이 통합되게 하는 것이다. 이러한 해결책에 의해 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원을 발현할 수 있는 폴리클로날 제조용 세포주가 생성될 수 있는데, 이에 따라 폴리클로날 단백질, 예를 들어 폴리클로날 항체가, 하나의 바이오리액터에서 증식되는 하나의 세포 뱅크(cell bank)를 사용하여 하나의 뱃치(batch)로 제조될 수 있게 된다. 후속하여 상층액이 하나의 다운스트림 정제 방법을 사용하여 정제됨으로써, 하나의 약제 생성물로 제형화되는 하나의 약제 물질이 생성된다. 이러한 방법을 사용하여 제조된 재조합 폴리클로날 항체의 예로는 재조합 폴리클로날 항-RhesusD 항체 (WO 2006/007850)와 재조합 폴리클로날 항-우두(anti-Vaccinia) 바이러스 항체 (WO 2007/065433)가 있다.
WO 2008/145133에는 무작위 통합(random integration)에 의해 재조합 폴리클로날 단백질 조성물, 특히 재조합 폴리클로날 항체 조성물을 제조하는 방법이 기재되어 있는데, 여기서 숙주 세포는 일련의 발현 벡터로 개별적으로 트랜스펙션되고, 상기 발현 벡터 각각은 상기 세포의 게놈내로 이러한 발현 벡터가 부위-특이적으로 통합되지 못하게 하는 조건하에서 상기 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원을 엔코딩하는 별개의 핵산의 카피(copy)를 하나 이상 포함한다.
폴리클로날 단백질을 제조하는 데에 있어서의 이러한 진보에도 불구하고, 여전히 대안적인 제조 방법을 제공할 필요가 있는데, 이는 예를 들어 폴리클로날 단백질의 하나 이상의 구성원이 발현 및/또는 정제를 위해 특정한 조건을 필요로 하는 경우 또는 독립된 업스트림 처리가 바람직한 상황에 대해 그러하다.
발명의 개요
첫 번째 양태에 있어서, 본 발명은 폴리클로날 단백질의 2개 이상의 별개의 단백질 구성원을 포함하는 약제 생성물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은,
a) 2개 이상의 세포 개체군을 제공하는 단계로서, 여기서 각각의 개체군은 상기 폴리클로날 단백질의 하나의 별개의 구성원을 엔코딩하며 상기 단백질을 발현하는 세포와 배양 배지를 함유하는 물리적으로 독립된 용기(container)에 들어있고, 여기서 상기 방법은 하기 단계 i) 내지 iii)을 포함하는 업스트림 파트(upstream part)를 포함하고:
i) 상기 2개 이상의 세포 개체군을 독립된 용기에서 하나 이상의 시드 트레인(seed train) 단계로 증식시키는 단계;
ii) 상기 시드 트레인으로부터의 세포를 하나 이상의 이노컬럼 트레인(inoculum train) 단계로 증식시키는 단계;
iii) 상기 단백질 구성원들의 발현에 유리한 조건하에서 생산기(production phase)에서 상기 이노컬럼 트레인으로부터의 세포를 배양함으로써 상기 2개 이상의 별개의 단백질 구성원을 발현시키는 단계;
상기 2개 이상의 세포 개체군은 적어도 상기 시드 트레인 동안에는 독립된 상태로 유지되는, 2개 이상의 세포 개체군을 제공하는 단계;
b) 상기 발현된 단백질을 수거하는 단계;
c) 상기 수거된 단백질에 대해 1회 이상의 정제 단계를 수행하는 단계;
d) 정제된 약제 물질을 수득하는 단계; 및
e) 정제된 약제 물질을 폴리클로날 약제 생성물로 제형화하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 특징은 폴리클로날 단백질의 하나의 별개의 구성원을 각각 엔코딩하는 상기 2개 이상의 세포 개체군이 적어도 세포 증식 초기 동안 물리적으로 독립된 용기에서 독립된 상태로 유지된다는 것이다. 본원에서 설명되는 다른 구체예들에서, 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들을 발현하는 세포 개체군은 보다 긴 파트(longer part) 동안 또는 업스트림 처리의 전체 파트(entire part) 동안 독립된 상태로 유지된다. 추가의 구체예들에서, 폴리클로날 단백질의 발현된 별개의 구성원은 다운스트림 처리의 일부분 또는 가능하게는 전체 다운스트림 처리 동안 독립된 상태로 유지되는데, 상기 다운스트림 처리는 정제된 약제 물질이 수득되는 경우 완결된다. 다양한 구체예의 이점은 이하에서 상세히 설명된다.
상기 2개 이상의 상이한 세포 개체군은 적어도 이노컬럼 트레인 이전까지 그리고 이노컬럼 트레인 도중에 독립된 상태로 유지될 수 있고, 추가의 구체예들에서 상기 2개 이상의 상이한 세포 개체군은 적어도 생산기 이전까지 그리고 생산기 도중에 독립된 상태로 유지된다.
상기 2개 이상의 세포 개체군에 의해 발현되는 상기 2개 이상의 별개의 단백질 구성원은 적어도 단백질 수거 이전까지 그리고 단백질 수거 도중에 추가로 독립된 상태로 유지될 수 있는데, 이에 따라 각각의 별개의 구성원이 개별적으로 수거될 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 2개 이상의 세포 개체군에 의해 발현되는 상기 2개 이상의 별개의 단백질 구성원은 적어도 1회 이상의 정제 단계 이전까지 그리고 1회 이상의 정제 단계 도중에 독립된 상태로 유지되어, 상기 별개의 구성원의 상기 초기 정제 단계를 가능하게 한다. 예를 들어, 상기 단백질 구성원들은 적어도 친화성 크로마토그래피 단계 이전까지 그리고 친화성 크로마토그래피 단계 도중에 독립된 상태로 유지될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 2개 이상의 세포 개체군에 의해 발현되는 2개 이상의 별개의 단백질 구성원이 적어도 약제 물질을 수득하기 이전까지 그리고 약제 물질을 수득하는 도중에 독립된 상태로 유지된다.
독립된 용기내의 단세포 생물(single-celled organism)에서 폴리클로날 단백질을 생산하기 위한 대안으로서, 물리적으로 독립된 유닛(unit)에서 다세포 생물의 형태로 생산이 일어날 수 있는데, 각각의 다세포 생물은 폴리클로날 단백질의 하나의 구성원을 발현한다. 이러한 다세포 생물은 식물일 수 있는데, 이러한 경우 물리적으로 독립된 유닛은 식물 또는 식물 기관이다. 또한, 다세포 생물은 트랜스제닉 비-사람(non-human) 동물, 예를 들어 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원을 발현하여 알에 분비하도록 유전자변형된 조류일 수 있다. 트랜스제닉 비-사람 동물은 또한 포유동물일 수 있는데, 여기서 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원은 밀크로 분비된다. 이러한 포유동물은 예를 들어 양, 염소, 소, 낙타 또는 버팔로일 수 있다.
정의
포유동물 세포, 예를 들어 CHO (차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary)) 세포에서의 단백질 생산에는 반연속식 공정이 사용될 수 있는데, 이러한 공정에 의하면 세포가 다양한 시간의 기간 동안 "시드 트레인(seed train)"에서 배양된 후 이노컬럼 발효기(inoculum fermentor) ("이노컬럼 트레인(inoculum train)")으로 전달되어 관심있는 단백질을 보다 큰 규모로 생산시키는 세포 증폭 공정이 개시된다. 따라서, 단백질 생산을 위해 사용되는 세포는 소정의 최대 세포 수명(cell age)까지 다양한 시간의 기간 동안 배양 상태로 존재한다. 세포 배양 공정의 파라미터, 예를 들어 시드 밀도(seed density), pH, DO2 및 온도, 생산 배양의 지속기간, 수거 동작 조건 등은 사용되는 특정 세포주 및 배양 배지에 따라 달라지고, 과도한 실험없이 경험적으로 결정될 수 있다. 본 발명의 목적상, "시드 트레인" 시기(phase)는 세포를 해동(thawing)시키는 단계 및 초기 증식 단계를 포함한다. 이러한 단계들은 페트리 디쉬(Petri dish), 진탕 플라스크(shaker flask), T-플라스크, 플라스틱 백(plastic bag), 스피너 플라스크(spinner flask), 원심분리 튜브, 멀티웰 플레이트(multiwell plate), 롤러병(roller bottle), 또는 다른 병, 즉, 샘플을 하나의 용기에서 다른 용기로 전달하는 배관을 갖추지 않은 용기에서 전형적으로 수행된다. "이노컬럼 트레인"은 첫 번째 바이오리액터 또는 발효기 (스틸(steel) 바이오리액터 또는 1회용 바이오리액터)에 "시드 트레인"으로부터의 세포가 접종된 경우에 개시된다. 세포가 이노컬럼 바이오리액터로 전달된 경우, 하나의 용기에서 다른 용기로 세포가 펌핑될 수 있게 하는 폐쇄형 배관 시스템을 통해 다른 바이오리액터들로의 후속 전달이 전형적으로 일어난다.
"약제 생성물"은 최종 투여형(finished dosage form), 예를 들어 정제, 캡슐, 용액 또는 동결건조 생성물을 의미하며, 이는 "약제 물질"을, 반드시 그러한 것은 아니지만 일반적으로 하나 이상의 다른 성분들과 함께 함유한다. "약제 물질"은 통상적으로 거대한 뱃치(batch)로 제조되는데, 이러한 뱃치는 그러한 약제 물질을 다른 성분들과 배합함으로써 후속하여 "약제 생성물"로 제형화된다. 본 발명과 관련하여, 약제 생성물은 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들을 포함하는 최종 폴리클로날 단백질 혼합물을 함유한다. 특정 제조 시나리오에 따라, 또한 약제 물질은 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원 전부를 함유하는 폴리클로날 혼합물일 수 있거나, 약제 물질은 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들 중 하나 또는 단지 일부를 함유할 수 있다. 약제 물질이 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들 중 일부를 함유하는 경우, 2개 이상의 약제 물질이 하나의 약제 생성물로 제형화된다.
"용기" 또는 "베셀(vessel)"이란 용어는 시험관내 세포 배양을 위해 적합된 베셀 또는 용기를 지칭한다. 용기의 예로는 페트리 디쉬, 진탕 플라스크, T-플라스크, 플라스틱 백, 스피너 플라스크, 원심분리 튜브, 멀티웰 플레이트, 롤러병, 다른 병, 스틸 바이오리액터 또는 다른 재사용가능한(non-disposable) 바이오리액터, 및 플라스틱 또는 다른 1회용 바이오리액터가 있다.
"단백질" 또는 "폴리펩티드"라 함은 길이 또는 번역후 변형과 무관하게 임의의 아미노산 사슬을 의미한다. 단백질은 단량체 또는 다량체로서 존재할 수 있으며, 2개 이상의 어셈블링된 폴리펩티드 사슬, 단백질 단편, 폴리펩티드, 올리고펩티드 또는 펩티드를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "폴리클로날 단백질" 또는 "폴리클로날리티(polyclonality)"는, 바람직하게는 면역글로불린 수퍼패밀리(superfamily)로부터 선택된, 다양하지만 상동인(homologous) 단백질 분자들을 포함하는 단백질 조성물을 지칭한다. 따라서, 각각의 단백질 분자는, 조성물의 다른 분자들과 상동이지만 폴리클로날 단백질의 개별 구성원들 간의 아미노산 서열의 차이에 의해 특성화되는 하나 이상의 연속된 가변 폴리펩티드 서열을 또한 함유한다. 이러한 폴리클로날 단백질의 알려진 예로는 항체 또는 면역글로불린 분자, T 세포 수용체 및 B 세포 수용체가 있다. 폴리클로날 단백질은 요망되는 표적에 대한 공유(shared) 결합 활성과 같은 공통된 특징에 의해 규정되는 단백질 분자들의 규정된 서브셋(subset)으로 구성될 수 있는데, 예를 들어, 요망되는 표적 항원에 대한 폴리클로날 항체의 경우에 그러하다.
"재조합 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원"이란 용어는 다양하지만 상동인 단백질 분자들을 포함하는 단백질 조성물의 하나의 단백질 분자를 나타내는데, 여기서 각각의 단백질 분자는, 조성물의 다른 분자들과 상동이지만 폴리클로날 단백질의 개별 구성원들 간의 아미노산 서열의 차이에 의해 특성화되는 하나 이상의 연속된 가변 폴리펩티드 서열을 또한 함유한다.
폴리클로날 단백질의 하나의 별개의 구성원을 엔코딩하는 각각의 "세포 개체군"은 개별적인 모노클로날 세포 뱅크 또는 모노클로날 세포 배양물로부터 유래되는데, 여기서 모노클로날 세포 뱅크 또는 모노클로날 세포 배양물은 본원 명세서의 다른 부분에 기재된 바와 같이 하나의 세포로부터 유래된다.
본원에 사용된 용어 "수거(harvest)"는 발현된 단백질을 함유하는 상층액을 수거하는 것을 지칭하고, 정화(clarification)를 포함하는, 상층액으로부터 요망되는 단백질을 분리하는 후속 단계들은 일반적으로 정제 단계로서 간주된다.
"항체"란 용어는 혈청의 기능적 성분을 나타내고, 종종 분자들 (항체 또는 면역글로불린)의 집합체(collection) 또는 하나의 분자 (항체 분자 또는 면역글로불린 분자)로서 지칭된다. 항체 분자는 특정 항원 결정기 (항원 또는 항원 에피토프)에 결합하거나 이와 반응할 수 있고, 이는 결과적으로 면역학적 이펙터 메커니즘을 유도시킬 수 있다. 개별 항체 분자는 통상적으로 단일특이적(monospecific)인 것으로 간주되고, 항체 분자들의 조성물은 모노클로날 (즉, 동일한 항체 분자들로 구성됨) 또는 폴리클로날 (즉, 동일한 항원 또는 별개의 상이한 항원들상의 동일하거나 상이한 에피토프와 반응하는 다양한 항체 분자들로 구성됨)일 수 있다. 각각의 항체 분자는 이러한 항체 분자가 이의 상응하는 항원에 특이적으로 결합할 수 있게 하는 독특한 구조를 지니고, 모든 천연 항체 분자는 2개의 동일한 경쇄와 2개의 동일한 중쇄를 지닌 동일한 전반적 기본 구조를 지닌다. 또한, 항체는 집합적으로 면역글로불린으로서 공지되어 있다. 또한, 본원에 사용된 항체 또는 항체들이란 용어는 키메라 및 단일 사슬 항체 뿐만 아니라 항체의 결합성 단편, 예를 들어 Fab, Fv 단편 또는 scFv 단편, 그리고 다량체 형태, 예를 들어 이량체 IgA 분자 또는 5가(pentavalent) IgM을 포함하도록 의도된다.
"면역글로불린"이란 용어는 통상적으로 혈액 또는 혈청에서 발견되는 항체들의 혼합물의 집합적 명칭으로서 사용되지만, 또한 다른 공급원으로부터 유래된 항체들의 혼합물을 표시하기 위해 사용될 수 있다.
"폴리클로날 항체"란 용어는 동일한 항원 또는 상이한 항원들상의 수 개의 다양한 특정 항원 결정기에 결합하거나 이들과 반응할 수 있는 상이한 항체 분자들의 조성물을 나타낸다. 통상적으로, 폴리클로날 항체의 가변성은 폴리클로날 항체의 소위 가변 영역에 존재하는 것으로 생각된다. 그러나, 본 발명과 관련하여, 폴리클로날리티는, 예를 들어 2개 이상의 항체 이소타입(isotype), 예를 들어 사람 이소타입 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 및 IgA2, 또는 뮤린(murine) 이소타입 IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgA를 함유하는 항체들의 혼합물의 경우에서와 같이, 소위 불변 영역에 존재하는 개별 항체 분자들 간의 차이를 나타내는 것으로 또한 이해될 수 있다. 또한, 본원에 사용된 용어 "폴리클로날 항체"는 2개 이상의 모노클로날 항체의 혼합물로서 생각될 수 있다.
"관심있는 상이한 핵산 분자들의 라이브러리(library)라는 용어는 "관심있는 재조합 폴리클로날 단백질"을 집합적으로 엔코딩하는 핵산 분자들의 집합체를 나타내기 위해 사용된다. 트랜스펙션을 위해 사용되는 경우, 관심있는 상이한 핵산 분자들의 라이브러리는 발현 벡터들의 라이브러리에 함유된다. 그러한 라이브러리는 전형적으로 적어도 3개, 5개, 10개, 20개, 50개, 1000개, 104개, 105개 또는 106개의 별개의 구성원을 지닌다.
본원에 사용된 용어 "작동적으로 결합된(operably linked)"은, 다른 세그먼트와 기능적 관계를 지니도록 배치되는 경우, 하나의 세그먼트(segment)가 또 다른 세그먼트에 결합되어 있음을 지칭한다. 예를 들어, 신호 서열을 엔코딩하는 DNA는, 이러한 DNA가 폴리펩티드를 소포체(endoplasmic reticulum)로 전달하는 데에 참여하는 리더(leader)로서 발현되는 경우 그러한 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA에 작동적으로 결합된 것이다. 또한, 프로모터 또는 인핸서는, 이러한 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사를 자극하는 경우, 코딩 서열에 작동적으로 결합된 것이다.
"트랜스펙션"이란 용어는 본원에서 외래 DNA를 세포내로 도입시키는 것과 관련하여 광범위한 용어로서 사용된다. 또한, 이러한 용어는 외래 DNA를 세포내로 도입시키는 다른 기능적으로 동등한 방법을 포함하도록 의도되는데, 이러한 방법으로는 예를 들어 형질전환(transformation), 감염(infection), 형질도입(transduction), 또는 도너(donor) 세포와 억셉터(acceptor) 세포의 융합이 있다.
"가변 폴리펩티드 서열" 및 "가변 영역"은 상호교환적으로 사용된다.
"헤드-투-헤드(head-to-head) 프로모터"란 용어는, 프로모터에 의해 유도되는 2개의 유전자 단편의 전사가 반대 방향으로 일어나도록 매우 근접하게 배치되는 프로모터 쌍을 지칭한다. 또한, 헤드-투-헤드 프로모터는 무관한 핵산들로 이루어진 스터퍼(stuffer)가 2개의 프로모터 사이에 존재하는 형태로 작제될 수 있다. 이러한 스터퍼 단편은 500개 이상의 뉴클레오티드를 용이하게 함유할 수 있다. 또한, 헤드-투-헤드 프로모터는 양방향(bi-directional) 프로모터로 일컬어질 수 있다.
"식물"이란 용어는 식물계(Plantae kingdom)의 구성원인 생물을 지칭한다. 본 발명의 목적상 식물은 식물의 독립적인 생장을 위해 필요한 식물의 기관들 (예를 들어, 뿌리, 줄기, 잎)을 포함한다. 식물이란 용어가 분리된 식물 세포를 포함하도록 의도되는 경우, 이는 명백히 언급된다.
도면의 설명
도 1은 본 발명의 생산 시나리오를 개략적으로 나타낸 도면이다 (독립된 시드/이노컬럼 트레인).
도 2는 본 발명의 또 다른 생산 시나리오를 개략적으로 나타낸 도면이다 (독립된 생산기).
도 3은 혼합된 개체군에서 7일 배양한 후의 6개의 항-우두 항체 각각의 상대 면적을 도시한다 (상세한 사항에 대해서는 실시예 1이 참조됨).
도 4는 혼합된 개체군에서 12일 배양한 후의 6개의 상이한 항-RSV 항체의 상대량을 도시한다 (실시예 3 참조).
발명의 상세한 설명
발현 작제물의 통합에 의해 생성된 생산 세포(producer cell)에서 발현되는 재조합 폴리클로날 항체를 제조하는 것은 단일 뱃치 생산으로서 수행될 수 있다. 유리하게는, 세포주들 중 하나 또는 몇몇의 아웃그로쓰(outgrowth)를 방지하기 위해, 하나의 배양 용기에서 세포주들을 혼합하기 전에 개별 세포주들 또는 세포 클론들이 유사한 성장 속도에 대해 적절하게 선택된다.
개별 세포주들의 성장 속도를 요망되는 방식으로 정렬시키기 어렵거나 불가능한 것으로 판명되는 상황이 존재할 수 있는데, 예를 들어 특히 요망되는 재조합 단백질/항체의 생산이 세포주의 성장 속도에 네거티브한 방향으로 영향을 미치는 경우가 그러하다. 또한, 폴리클로날 단백질의 상이한 구성원들의 매우 독특한 비율이 바람직한 상황이 존재할 수 있다. 예를 들어, 그러한 경우는, 예를 들어 표적에 대한 상이한 친화성으로 인해, 조성물 중의 폴리클로날 단백질 구성원들의 매우 불균등한 양이 바람직한 경우일 수 있다. 예를 들어, 개별 구성원들 간의 비가 예를 들어 20:5:1:1:1:0.5인 6개의 단백질 구성원을 함유하는 폴리클로날 조성물이 요망되는 경우, 제조 공정의 적어도 일부 동안 별개의 구성원들을 독립된 상태로 유지시킴으로써 그러한 조성물을 제어하고 수득하는 것이 더욱 실행가능하다. 또 다른 예는 2개 이상의 상이한 모세포주(parental cell line)가 별개의 재조합 생성물들의 트랜스펙션 및 발현을 위해 사용된 경우에 존재할 수 있고, 이러한 경우 2개 이상의 세포주에 대한 세포 배양 조건이 상이할 수 있는데, 예를 들어 세포의 증식 및/또는 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원의 발현을 위한 최적의 배지 조성이 상이할 수 있다.
개별적인 발현 세포주들의 유사한 성장 속도에 대한 요건을 회피하는 것을 도와줄 수 있는 그러한 재조합 단백질을 제조하기 위한 또 다른 방법은 적어도 업스트림 공정의 시드 트레인 파트 동안 세포주들을 독립된 상태로 유지시키는 것이다. 그 후, 상이한 항체를 발현하는 세포주들은 후기(later stage), 예를 들어 이노컬럼 트레인 이전에 또는 이노컬럼 트레인 동안에 배합되거나, 생산기 이전에 또는 생산기 동안에 배합될 수 있다. 이러한 방법의 한 가지 이점은 혼합된 세포 배양물의 개체군 배가(population doubling) 횟수가 현저하게 감소될 수 있다는 것이고, 이는 개별 세포주들이 다양한 성장 속도를 나타낸다고 하더라도 최종 약제 생성물에서 폴리클로날 단백질의 개별 구성원들의 비율을 제어하는 것을 보다 용이하게 한다. 다운스트림 처리의 하나 이상의 단계 동안 독립된 제조과정이 계속될 수 있고, 요구되는 정도로 약제 물질이 정제되는 시점까지 별개의 단백질 구성원들이 독립된 상태로 유지될 수도 있다. 요구되는 정도로 약제 물질이 정제되는 시점까지 별개의 단백질 구성원들이 독립된 상태로 유지되는 경우, 그 후 약제 물질은 최종 약제 생성물을 형성하도록 배합되는데, 이러한 최종 약제 생성물은 폴리클로날 단백질의 2개 이상의 별개의 구성원, 예를 들어 동일하거나 상이한 항원을 표적화하는 2개 이상의 상이한 항체를 포함한다.
본 발명의 하나의 중요한 요소는, 배합이 세포주의 성장 동안에 일어나든지 단백질이 세포주로부터 분리된 시점에서 일어나든지 간에, 항상 최종 생성물이, 동일하거나 상이한 항원을 표적화하는 2개 이상의 상이한 항체와 같은 폴리클로날 단백질의 2개 이상의 별개의 구성원을 포함하는 하나의 폴리클로날 약제 생성물이라는 점이다.
한 가지 구체예에서, 폴리클로날 단백질의 개별 구성원들은 개별 재조합 단백질들을 함유하는 상층액을 수거할 때까지 독립된 상태로 유지된다. 그 후, 이러한 생성물들은, CMC 공정을 단순화하고 비용을 감소시키기 위해 다운스트림 정제 전에 혼합된다.
폴리클로날 단백질의 개별 구성원들이 동일한 방법을 사용하여 정제될 수 없는 경우, 이러한 구성원들은 다운스트림 정제 공정 동안의 후기에 또는 최종 약제 생성물을 제조하기 전의 정제의 완결시에 또한 혼합될 수 있다.
폴리클로날 단백질의 개별 구성원들은, 초기에 혼합되지 않거나 2개 이상의 세포 개체군의 혼합 후에 함께 제조되지 않는 경우, 늦어도 폴리클로날 약제 생성물의 제형화 동안에는 함께 혼합된다는 것이 명백하다.
최종 생성물의 성분들 각각을 생산하는 개별적인 발현 세포주를 제조하는 것은, 저가(low-cost) 장비, 예를 들어 많은 다양한 백 크기(bag size)로 시판되는 웨이브 백스(Wave Bags)와 같은 1회용 바이오리액터에서 배양함으로써 이루어지는 것이 바람직하지만, 개별 생산 실행(production run) 부피가 예를 들어 50 L 미만 또는 바람직하게는 20 L 또는 10 L 미만으로 적은 경우에는 다수의 재사용가능한 바이오리액터를 가동시키는 것이 또한 가능하다. 개별 세포주 각각으로부터의 재조합 단백질을 배양하는 것은 바람직하게는 병렬적으로 이루어지지만, 또한 2개 이상의 군에서 순차적으로 수행될 수 있다.
각각의 제조 용기 (예를 들어, 웨이브 백스 또는 다른 유형의 바이오리액터)를 위한 접종 물질은, 각각의 개별 단백질 생산 세포주 또는 클론에 대해, 먼저 마스터 세포 뱅크(Master Cell Bank, MCB)를 제조한 후 가능하게는 작업용 세포 뱅크(Working Cell Bank, WCB)를 제조함으로써 수득된다. 독립된 배양 용기의 시딩을 위해 WCB (또는 MCB) 각각으로부터의 바이알(vial)이 사용된다. 이노컬럼 바이오리액터를 접종하기에 충분한 세포가 수득될 때까지 이러한 세포주들 각각의 증식을 위해 시드 트레인이 설계된다.
실행가능한 경우, 상이한 단백질 구성원들의 발현을 위해 동일한 조건을 사용하여 제조의 독립된 파트가 수행되는 것이 바람직하며, 이러한 조건으로는 예를 들어 동일한 배지 성분들 및 첨가된 공급 용액(feed solution) (예를 들어, 글루코오스, 글루타민, 잠재적 선택제(potential selective agent), 예를 들어 G418, 비타민, 미네랄, 단백질, 가수분해물(hydrolysate) 등) 뿐만 아니라 배양 공정 파라미터, 예를 들어 pH, DOT (용존 산소 장력(dissolved oxygen tension)), CO2 압력 및 온도가 있다. 이는, 숙주 세포 단백질 감소, 첨가된 선택제의 제거 및 첨가된 성장 인자의 제거와 같은 요인들이 다루어질 필요가 있는, 품질 관리 공정을 용이하게 하기 위해 중요하다. 또한, 이는 당화 패턴과 같은 재조합 단백질의 유사한 번역후 변형을 수득하기 위해 매우 중요하다.
유사하게는, 정제의 임의의 독립된 파트가, 가능한 정도까지 유사한 컬럼, 완충액, 용리 프로파일 등을 사용하여 수행되는 것이 바람직하다.
원활하고 비용 및 시간 효율적인 다운스트림 및 분석 공정을 가능하게 하기 위해, 폴리클로날 조성물 중의 개별적인 별개의 단백질 구성원들의 물리화학적 특성이 가능한 한 유사한 것이 바람직하다. 이는 분자들의 불변 부분들을 동일하게 유지시킴으로써 가장 잘 보장된다. 항체의 경우, 개별적인 재조합 항체 분자들 각각을 생산하기 위해 동일한 발현 벡터가 사용되는 것이 바람직하고, 이러한 항체 분자들의 주요 서열은 각각 중쇄 및 경쇄의 가변 영역에서만 상이한 것이 바람직하다. 가장 바람직한 시나리오에 있어서, 발현 작제물에 의해 엔코딩되는, 항체 분자의 불변 부분은 폴리클로날 항체 조성물의 모든 구성원에 대해 정확하게 동일한데, 이는 예를 들어 예를 들어 IgG1 이소타입 분자이다. 또한, 경쇄도 바람직하게는 동일한 유형인데, 사람 항체의 경우에 카파 또는 람다이다. 항체 분자들의 주된 부분을 가능한 한 동일하게 유지시킴에 의해 다양성(diversity)을 잃을 위험없이 하나의 절차를 사용하여 재조합 항체들을 고순도로 정제할 수 있게 된다. 또한, 이는 특성화, 품질 관리 및 제조된 약제 생성물의 방출을 위해 필요한 분석 방법들의 확립을 용이하게 한다.
단백질 정제 공정은 전형적으로 다단계 공정으로서 항체 또는 다른 단백질 분자의 물리화학적 특성을 기초로 하여 개발되며, 각각의 단계에는 다양성을 잃을 위험, 즉, 개별 생성물 성분들 중 하나 이상을 잃을 위험이 존재한다. 상기 공정은, 예를 들어 단백질 A 결합 또는 대안적으로 단백질 G 결합일 수 있는 포획 단계, 음이온 교환 크로마토그래피 단계 및 소수성 상호작용을 기반으로 하는 크로마토그래피를 포함하는 수 개의 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있다. 이는 낮은 pH에서의 인큐베이션 뿐만 아니라 수 개의 여과 단계를 추가로 포함할 수 있다. 분자들 간의 이러한 물리화학적 특성들 중 어느 하나의 차이가 순수하고 다양한 폴리클로날 항체 생성물의 성공적인 회수를 방해할 수 있다는 것이 당업자에게 명백하다
분석용 품질 제어 방법과 관련하여, 재조합 항체 생성물의 규제당국 승인을 획득하기 위해 필요한 모든 특성화 검정, 예를 들어 펩티드 맵핑(peptide mapping), 크기 배제(size exclusion), SDS-PAGE, 웨스턴 블롯, 아미노산 분석, 이황화물 다리의 맵핑 및 유리된 설프히드릴 기 및 모노사카라이드와 올리고사카라이드 특성화는, 분자들 간에 불변 영역이 동일하거나 유사하지 않은 경우 만족할 만한 정도로 수행하기가 어려운 것으로 판명될 수 있다는 것이 당업자에게 명백하다. 재조합 폴리클로날 항체 및 다른 폴리클로날 단백질을 구조적으로 특성화하는 방법 및 그러한 폴리클로날 단백질을 발현하는 폴리클로날 세포주를 특성화하는 방법은 WO 2006/007853에 기재되어 있다.
다양한 제조 시나리오
배양 용기에서의 재조합 발현
배양된 포유동물 세포들은, 이들의 적절한 폴딩(folding), 어셈블리(assembly) 및 번역후 변형 능력으로 인해 임상 적용을 위한 재조합 단백질을 제조하는 데에 유력한 시스템이 되었다. 포유동물 세포에서 재조합 단백질을 생산하기 위해 두 가지 주된 포맷(format), 즉, 유착 세포(adherent cell) 배양과 현탁 배양이 사용되어 왔다. 현탁 배양이 단연 가장 통상적이다.
심플 뱃치(simple batch) 또는 페드 뱃치(fed batch) 생산 공정에서, 매우 거대한 부피로 스케일업(scale-up)시키는 것은 보다 큰 리액터에서 미리 가온된(prewarmed) 상태로 유지시킨 5 내지 20 부피의 새로운 배지내로 바이오리액터의 함유물을 희석시킴으로써 이루어질 수 있다. 뱅크 세포(banked cell)의 해동으로부터 실제의 대규모 생산까지의 공정은 3개의 독립된 시기, 즉, 시드 트레인, 이노컬럼 트레인 및 생산기로 구성된다. 시드 트레인은 통상적으로, 생산을 위해 선택된 기간 동안 스케일업을 위한 새로운 세포를 제공하기 위해, 뱅크 세포의 해동 직후의 수 mL의 적은 배양물 부피에서 출발하여 5 내지 100 L의 배양물과 같은 수 리터의 세포 배양물에 이르기까지 보다 작은 세포 배양 베셀들에서 수행된다. 이노컬럼 트레인은, 시드 트레인 동안 생성된 세포 현탁액이 이노컬럼 리액터 (시드 리액터(seed reactor)로도 일컬어짐)로 전달된 경우 개시되고, 이의 부피는 최종 생산 바이오리액터의 접종을 위해 충분한 세포수가 생성되도록 증식된다 (Wurm, 2004, Nature Biotechnology, 22 (11): 1393-1398).
모노클로날 재조합 단백질을 제조하는 것과 관련하여, 시드 트레인 스테이지 또는 대안적으로 이노컬럼 리액터에서 해동된 세포를 연장된 개체군 배가 횟수 동안 유지시키는 것이 전형적으로 가능하다. 이는 샘플 앰풀(ampoule)로부터 해동된 세포를 사용하여 하나 이상의 생산 바이오리액터를 시딩할 가능성을 제공하고, 또한 제조과정이 예를 들어 기술적인 문제로 인해 지연되어야 하는 상황의 경우 백업(backup) 세포를 제공한다. 그러나, 재조합 폴리클로날 단백질을 제조하는 경우, 세대수(number of generations)에 대해 엄격한 제한을 설정하고 그러한 세대수에 걸쳐 철저한 제어를 유지할 필요가 있고, 폴리클로날 세포 뱅크로부터 장기간 동안 시드 트레인을 유지하는 것은 전형적으로 가능하지 않다. 이는 상이한 세포주들의 성장 속도가 가능한 한 근접하게 맞추어지는 경우라도 폴리클로날 세포 조성물내의 개별 세포주들은 항상 약간 상이한 성장 속도와 생산 속도(productivity rate)를 나타냄으로써 장기간의 배양에 걸쳐 조성의 드리프트(drift)를 야기한다는 사실에 기인한다. 이는 모노클로날 단백질 제조 공정과 비교하여 상기 제조 공정에 보다 많은 제약 및 보다 적은 유연성을 더해주고, 예를 들어 지연(delay)을 야기하는 생산 리액터와 관련된 기술적인 문제인 경우, 제조 장애라는 보다 큰 위험을 초래할 수 있다.
재조합 항체를 제조하기 위한 바람직한 기술인 뱃치 또는 페드 뱃치 제조의 경우, 대부분의 개체군 배가는 실제로 생산 리액터의 접종 전에 일어난다. 전형적인 업스트림 공정은 개체군 배가와 관련하여 다음과 같이 여겨질 수 있다: pMCB으로부터 바이알의 증식에 의해 pWCB를 생성시키기 위해서는 8 내지 12회의 개체군 배가가 필요하다. 시드 트레인 증식은 최종 제조 규모에 따라 전형적으로 10 내지 20회의 배가를 필요로 하며, 이노컬럼 리액터에서 일어나는 개체군 배가 횟수는 전형적으로 2 세대 내지 5 세대이다. 페드 뱃치 생산 리액터의 경우, 세포는 비교적 적은 세대수, 예를 들어 5 내지 8 세대를 겪게 된다. 종합해 보면, 폴리클로날 마스터 세포 뱅크로부터 출발하여 단일-뱃치 제조 공정을 사용하는 경우 업스트림 공정을 완결하는 데에는 약 25 내지 43 세대가 필요하다. 이 중에서, 약 20 내지 37회의 개체군 배가가 생산 베셀의 접종 전에 일어난다. 혼합 배양 기간이 짧을 수록 요망되는 조성비를 제어하고 유지시키는 것이 더욱 실행가능해진다는 것이 명백하다. 따라서, 유사한 성장 속도를 수득하는 것이 어렵거나 매우 협소한 한계의 조성비를 수득하는 것이 결정적인 폴리클로날 생성물의 경우, 제조 공정의 초기 동안 독립된 용기에서 개별 세포주들을 유지하고 나중 시점에서 세포들을 혼합하는 것이 유리하다.
재조합 단백질 생성물은 이종성 또는 내인성 단백질 생성물을 발현하는 분리된 세포들을 사용하여 시험관내에서 전형적으로 발현되는데, 이는 상기 단백질 생성물의 발현에 유리한 조건하에서 상기 세포들을 액체 또는 반고체 배지내에서 배양함으로써 이루어진다. 이러한 방법은 분비된 단백질 생성물의 발현을 위해 특히 유리한데, 이는 상기 단백질 생성물이 단백질 정제의 첫 번째 단계로서 세포들로부터 용이하게 분리될 수 있기 때문이다.
배양을 위해 사용되는 용기는, 예를 들어 진탕 플라스크, 롤러병, T-플라스크 및 1회용 또는 재사용가능한 바이오리액터로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 용기는 하나 이상의 1회용 용기를 포함한다. 1회용 용기는, 10 L 내지 1000 리터를 초과하는 크기에 이르기까지 다양한 크기로 다수의 제조업체로부터 구입할 수 있는, 소위 웨이브 백스를 포함할 수 있다. 적절한 1회용 바이오리액터는 비제한적으로 BIOSTAT® CultiBag (Sartorius Stedim Biotech), Cell Maker Lite2™ (Cellexus Biosystems), Biowave® (Wave Biotech AG), Wave Biotech LLC (GE Healthcare) 백, Single-Use Bioreactors S.U.B. (Hyclone Thermo Fisher Scientific) 및 FlexFactory™ (Xcellerex)가 있다. 본 발명이 업스트림 공정의 적어도 일부에 대해 병렬식 또는 연속식 제조과정에서 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들에 대해 독립된 바이오리액터를 사용하는 것을 포함하기 때문에, 비용이 많이 드는 스틸 탱크 대신 비교적 저렴한 1회용 바이오리액터를 사용하는 것이 유리하다. 또한, 1회용 바이오리액터는 본 발명의 방법에 유연성을 더해주는데, 이는 다용도 스틸 탱크들을 사용하는 것에 비해 바이오리액터의 개수를 증가시키는 것이 보다 용이하고 비용이 덜 들기 때문이다.
폴리클로날 단백질의 상이한 구성원들의 발현을 위한 방법들이 개발되었지만, 이러한 방법들은 일부 경우에는 부적당하다. 예를 들어 폴리클로날 단백질이 동일한 다운스트림 공정 절차를 사용하여 정제될 수 없는 상이한 단백질 구성원들을 포함하는 경우, 단일 뱃치로 별개의 구성원들을 발현시키는 것은 유리하지 않다. 또한, 어떤 이유로 하나의 별개의 구성원을 특정 세포 유형에서 발현시키고 나머지 구성원들을 또 다른 세포 유형에서 발현시키고자 하는 경우, 단일 배치 제조과정은 덜 바람직하다.
최종적으로, 폴리클로날 단백질의 상이한 구성원들을 발현하는 상이한 세포 클론의 발현 수준 및/또는 성장 속도의 차이가 너무 커서 상이한 클론들을 폴리클로날 세포 뱅크에서 배합하는 것이 불리한 경우가 있을 수 있다.
독립된 시드 트레인
본 발명의 한 가지 구체예는, 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원을 발현하는 각각의 클론에 대해 최적의 해동 및 적응(adaptation) 조건이 사용될 수 있도록, 독립된 배양 용기에서 해동되는 상이한 모노클로날 세포 뱅크들을 제공하는 것에 의존한다. 이러한 초기 해동 및 적응 단계 동안, 세포의 생존성(viability)이 압박을 받으며, 이러한 초기 단계에서 클론들 간의 생존률의 미약한 차이라도 최종 생성물내의 단백질 구성원들의 상대적 분포에 대해 현저한 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 이러한 구체예에 따르면, 폴리클로날 단백질의 상이한 구성원들을 발현하는 생산 세포주는 해동, 적응 및 시드 트레인 증식 동안 독립된 상태로 유지된다. 그 후, 클론들은 요망되는 기준에 따라 혼합될 수 있고, 이노컬럼 트레인, 생산기, 수거 및 다운스트림 처리를 위해 하나의 단일 뱃치에서 배양될 수 있다.
독립된 이노컬럼 트레인
추가의 구체예에서, 폴리클로날 단백질의 상이한 별개의 구성원들을 발현하는 상이한 클론들이 이노컬럼 트레인 이전까지 그리고 이노컬럼 트레인 도중에서 독립된 상태로 유지된다 (도 1). 이러한 구체예에 따르면, 생산기의 출발시에 각각의 개별 생산 세포주에 대해 동일한 세포수를 제공하는 것이 가능하다. 상기 언급된 바와 같이, 폴리클로날 시기는 이러한 구체예에서 제한된 세포 분열 횟수를 지니며 비교적 짧아서 세포 클론들 간의 성장 속도의 임의의 차이가 조성에 대해 제한된 효과를 나타낸다. 이러한 방식에서는, 생산기의 종료시에 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들의 소정의 분포를 수득하기 위해 상이한 개별적인 생산 세포주들을 배합하는 것이 보다 용이해진다.
독립된 시드 트레인을 사용하는 것과 관련된, 특히 독립된 시드 트레인과 독립된 이노컬럼 트레인을 사용하는 것과 관련된, 중요한 이점은, 독립된 클론들이 풀링되는(pooled) 시점에서 생산기의 종료시까지의 세대수가 감소된다는 것이다. 결과적으로, 상이한 세포 클론들이 풀링되어 함께 배양되는 전체 세대수가 최소화된다. 이는 뱃치를 거듭할 수록 최종 생성물내의 전반적인 안정성과 균일성이 더 커지게 할 수 있는데, 그 이유는 상이한 세포 클론들의 혼합물에서 하나 이상의 클론이 다른 클론들 보다 크게 성장하거나 큰 생산성을 나타낼 가능성을 지니는 세대가 보다 적기 때문이다.
예를 들어 폴리클로날 마스터 세포 뱅크를 사용하는 것과 비교하여 이러한 방법의 또 다른 이점은 필요에 따라 폴리클로날 혼합물을 적응시키는 데에 있어서 보다 높은 유연성을 가능하게 한다는 점이다. 예를 들어, 폴리클로날 MCB내의 세포 클론들 중 하나가 불안정하거나 그렇지 않은 경우 부최적(suboptimal)인 것으로 밝혀진 경우, 전체 폴리클로날 MCB는 재생성(recreated)되어야 할 것이다. 대조적으로, 본 발명은 하나의 부최적 클론이 제거될 수 있게 하거나 대안적으로 상기 부최적 클론이 적은 시간과 노력으로 동일한 단백질을 생산하는 새로운 클론에 의해 대체될 수 있게 한다. 또한, 확립된 폴리클로날 단백질을 생산하는 클론들의 기존 혼합물에 새로운 단백질을 생산하는 새로운 클론을 비교적 용이하게 추가하는 것을 가능하게 한다. 또한, 이러한 방법은, 예를 들어 시드 및 이노컬럼 트레인을 위해 웨이브 백스 또는 다른 1회용 바이오리액터를 사용하여, 최종 단백질 조성이 변화될 위험을 최소화하며 생산기를 업스케일(upscale)하는 것을 보다 용이하게 한다
추가의 이점은, 폴리클로날 단백질의 요망되는 별개의 구성원들이 확인된 경우, 폴리클로날 항체 또는 다른 치료용 단백질의 전임상 개발로 보다 신속히 옮겨갈 수 있는 가능성이다. 이는 적절한 개별 단백질 구성원들이 확인된 경우, 이후 생산 목적으로 직접 사용될 수 있는 개별 클론의 안정성을 시험할 필요성만이 있기 때문인데, 즉, 폴리클로날 마스터 세포 뱅크 및 폴리클로날 작업용 세포 뱅크의 안정성 연구에 추가의 시간을 소비할 필요가 또한 없어진다. 또한, 전임상 및 임상 I/II상 시험의 경우, WCB의 생성 및 시험에 시간을 소비할 필요없이 MCB를 기초로 하여 제조과정을 수행하는 것이 또한 가능할 수 있다.
독립된 생산기
추가의 구체예에서, 생산기는 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들에 대해 또한 개별적으로 수행된다 (도 2). 이는 상이한 세포 유형에서 및/또는 상이한 조건하에서 상이한 구성원들의 발현을 가능하게 하고, 또한 완전한 다운스트림 처리가 하나의 동일한 절차로 폴리클로날 단백질의 모든 별개의 구성원에 대해 수행될 수 없는 상황을 가능하게 한다. 또한, 이러한 시나리오는 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들에 대한 발현 플랫폼을 선택하는 것과 관련하여 완전한 자유를 제공한다.
따라서, 예를 들어, 하나의 구성원은 효모 세포에서 발현될 수 있고, 하나의 구성원은 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 또한, 하나의 단백질 구성원은 예를 들어 시험관내에서 분리된 식물 세포에서 발현될 수 있고, 하나의 단백질 구성원은 요망되는 경우 세균에서 발현될 수 있다. 다양한 종이 발현 단백질의 다양한 번역후 변형을 일으킨다는 것이 당 분야에 공지되어 있다. 이러한 방식으로, 그렇게 다양한 번역후 변형을 지닌 생성물이 제조될 수 있고, 하나의 공통된 또는 부분적으로 공통된 다운스트림 처리에 적용될 수 있다.
또한, 이러한 제조 시나리오는 폴리클로날 단백질의 상이한 구성원들에 대해 상이한 배양 방법을 사용할 수 있게 한다. 하나의 구성원은 뱃치 공정을 사용하여 제조될 수 있으며, 다른 구성원들은 페드-뱃치 또는 퍼퓨젼(perfusion) 공정을 사용하여 제조될 수 있다.
폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들에 대해 독립된 생산기를 제공하는 것과 관련된 추가의 이점은 별개의 단백질 구성원들이 소정의 비율로 다운스트림 처리 전에 혼합되거나 배합될 수 있다는 점이다. 이는 증식 속도 및/또는 발현 수준의 차이에 의해 잠재적으로 일어날 수 있는 임의의 편중 분포(skewed distribution)를 감소시킨다.
추가의 이점은 별개의 단백질 구성원들의 연속 제조가 수행될 수 있다는 점이다. 이는 하나 또는 수 개의 바이오리액터에서 많은 별개의 단백질 구성원을 지닌 복잡한 폴리클로날 단백질의 제조를 가능하게 한다. 발현된 별개의 단백질 구성원들은 발현 후에 차례로 또는 한 번에 수 개씩 수거될 수 있고, 모든 구성원이 발현될 때까지 저장될 수 있다. 그 후, 폴리클로날 단백질은 하나의 다운스트림 처리 절차를 사용하여 정제될 수 있다.
독립된 수거
별개의 단백질 구성원들의 독립된 발현 후, 후속 수거 단계가 폴리클로날 단백질의 하나 이상의 구성원에 대해 개별적으로 수행되거나, 2개 이상의 구성원이 공통된 절차를 사용하여 수거될 수 있다.
발현된 단백질 생성물은 상이한 바이오리액터로부터 상층액 또는 세포를 수집함으로써 수득될 수 있거나, 식물 또는 동물에서의 생산인 경우에는 수거된 식물로부터 또는 트랜스제닉 동물의 밀크 또는 알로부터 단백질을 분리함으로써 수득될 수 있다.
독립된 첫 번째 정제 단계
다운스트림 공정(DSP)의 제 1기는 전형적으로 세포 및 세포 파편 (세포벽, 막 및 단편)으로부터 단백질 생성물을 분리하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 이는 원심분리 및 여과를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 정화를 위한 절차를 사용하여 수행될 수 있다. 별개의 구성원들이 개별적으로 제조된 경우, 초기 정화는 별개의 구성원들에 대해 개별적으로 수행되거나 구성원들 중 둘 이상에 대해 공동으로 수행될 수 있지만, 별개의 단백질들의 독립된 제조 및 수거의 경우에는 개별적으로 수거된 상층액이 또한 개별적으로 정화된다.
정화 후, 다음 단계는 친화성 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있는데, 이는 예를 들어 결합(bind) 및 용리(elute) 모드 (catch mode)로 수행되는 단백질 A 또는 단백질 G 정제이다. 이러한 정제 단계는 대부분의 오염물 (숙주 세포 단백질, DNA, 바이러스, 배지 성분)을 제거하는 데에 있어서 전형적으로 매우 효율적이다. 프로테아제 및 다른 효소가 오염물의 일부를 구성할 수 있으므로, 이들을 초기에 제거하는 것은 단백질 생성물의 안정성을 위해 중요하다.
또한, 초기 친화성 크로마토그래피 단계는 전형적으로 현저한 부피 감소를 일으키며, 이는 이러한 정제 단계 후의 부분적으로 정제된 단백질 생성물을 저장하는 것을 보다 용이하고 보다 편리하게 해준다. 연속 생산의 경우, 단백질을 수거하자 마자 즉시 또는 수거한 직후에 부피 감소 단계를 수행하는 것이 유리하다. 또한, 단백질 생성물의 안정성과 관련된 이유로, 단백질을 수거한 후 오염물의 대부분을 가능한 한 신속히 제거하는 것이 유리하다. 폴리클로날 단백질의 하나의 별개의 구성원을 각각 포함하는 동결된 분액(aliquot)이 후속하여 해동되고, 혼합되고 추가의 DSP에 적용될 수 있다.
예를 들어 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들이 동일한 컬럼상에서 포획될 수 없는 다양한 이소타입을 지닌 항체를 포함하거나 개별 구성원들의 생산이 시간을 두고 이루어지는 경우, 독립된 초기 크로마토그래피 단계가 별개의 구성원들 중 하나 이상에 대해 또한 적용될 수 있다. 예를 들어, 폴리클로날 단백질은, 단백질 A 컬럼상에서 정제될 수 있는 하나 이상의 별개의 항체 구성원 및 단백질 G 컬럼상에서 정제될 수 있는 하나 이상의 다른 별개의 항체 구성원을 포함하는 폴리클로날 항체일 수 있다. 다운스트림 처리의 나머지 부분은 하나의 공정으로서 수행될 수 있다.
독립된 추가의 크로마토그래피 단계
다른 구체예에서, 추가의 다운스트림 처리가 별개의 단백질 구성원들에 대해 개별적으로 또한 수행될 수 있다. 이는 매우 다양한 회수율이 특정 정제 단계에 대해 예상되고/되거나 별개의 구성원들이 크기, 전하 및/또는 소수성과 관련하여 크게 달라서 하나의 공통된 정제 절차가 사용될 수 없는 경우에 유리할 수 있다. 또한, 다양한 별개의 단백질 구성원들에 대해 매우 다양한 오염물이 존재한다는 것은 독립된 크로마토그래피 단계들을 사용하는 것을 정당화해줄 수 있다.
이러한 구체예는 모든 단백질 구성원에 대해 높은 회수율을 유지하기 위해 각각의 별개의 단백질 구성원에 대한 단계들을 최적화할 수 있게 해준다. 이는 다운스트림 처리 동안 손실을 덜 발생시킬 수 있다.
약제 물질의 독립된 제조
본 발명의 추가의 구체예에서, "약제 물질"을 수득하기까지의 모든 단계는 별개의 단백질 구성원들에 대해 개별적으로 수행된다. 이러한 시나리오에서, 폴리클로날 단백질의 상이한 구성원들을 포함하는 약제 물질은 병렬적으로 또는 연속적으로 제조될 수 있다. 이는 별개의 단백질 구성원들을 정확한 소정의 비율로 배합하는 것을 가능하게 한다. 이는 정확한 비율이 기능상 중요한 경우에 유리할 수 있다. 완전한 업스트림 및 다운스트림 처리는 독립되어 있고, 각각의 별개의 단백질 구성원에 대해 최적화될 수 있다. 이는 보다 높은 발현 수준 및 회수율을 유도할 수 있다. 본 발명의 이러한 구체예를 사용하는 경우, 단백질 생성물의 하나 이상의 구성원을 유도체화시키는 것이 가능한데, 예를 들어 독소, 폴리머 또는 또 다른 비-단백질(non-protein) 기를 별개의 단백질 구성원들 전부는 아니지만 이들 중 하나 이상에 결합시킬 수 있다. 이러한 유도체화는 단백질이 유도체화 전에 정제될 필요가 있게 한다. 또한, 유도체화는 유도체화된 생성물이 다른 별개의 유도체화되지 않은 단백질 구성원들과 함께 용이하게 정제될 수 없게 하는 결과를 나타낸다. 폴리클로날 단백질의 각각의 별개의 구성원에 대한 독립된 특성화 및/또는 방출 검정(release assay)이 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원을 포함하는 약제 물질 각각에 대해 개별적으로 수행될 수 있다. 별개의 구성원들 중 하나 이상이 유도체화되는 경우, 이러한 별개의 구성원 단독에 대해 특정 방출 또는 특성화 검정을 수행할 수 있는 것이 유리할 수 있다.
수득된 약제 물질(들)은 필요로 하는 약제학적 부형제, 담체 등과 함께 약제 생성물로 최종 제형화된다.
특정 제조 시나리오
하기에서는 본 발명에 따른 항체 생성물을 생산하기 위한 다양한 제조 시나리오가 단계별로 설명된다. 이들은 비제한적인 예로서 제공된다.
1) 부분적으로 독립된 시드 트레인 및 생산 전의 혼합
본 시나리오는 하기 단계들을 포함한다 (도 1 참조):
· 풀(pool)에서의 트랜스펙션
· 선택
· 고생산성 클론(high-producing clone)에 대한 스크리닝
· 시드/이노컬럼 트레인의 특정 스테이지까지의 독립된 성장
· 혼합
· 폴리클로날 생성물의 단일-뱃치 생산
상기 시나리오는 먼저 별개의 폴리클로날 단백질 구성원들 각각을 엔코딩하는 일련의 발현 벡터를 제공하는 것을 포함한다. 발현 벡터 각각은 적절한 숙주 세포의 게놈내로 개별적으로 트랜스펙션되어, 하나의 세포가 폴리클로날 단백질의 단지 하나의 구성원을 발현하게 한다. 트랜스펙션된 클론의 선택은 예를 들어 약제 내성 마커와 같은 동시발현된(co-expressed) 우세한 유전자 마커를 사용하여 수행될 수 있다.
고생산성 단일 세포 클론들은 고처리량 스크리닝을 위한 프로토콜을 사용하여 선택될 수 있다. 클론들은 적절한 바이오리액터 파라미터에 대해 그리고 세포 특이적 생산성 및 최대 역가(titer)에 대해 추가로 스크리닝된다.
그 후, 별개의 폴리클로날 단백질 구성원들 각각을 엔코딩하는 클론들은, 폴리클로날 생산에 대한 알고리듬에 따른 바이오리액터 파라미터, 생산성 및 역가에 대한 데이터를 사용하여 그룹별로 정렬될 수 있다. 최상의 생산 세트(set) (즉, 생산성과 조성 안정성이 균형을 이룸)가 선택된다. 또한, 최상의 공동배양(co-culture) 결과를 제공하는 클론들의 배합물을 시험하기 위한 실험이 수행될 수 있다.
각각의 별개의 폴리클로날 단백질 구성원에 대해, 마스터 세포 뱅크(MCB)가 생성된다. 그 후, 각각의 MCB는 독립된 시드 트레인에서 사용된다. 그 후, 특성화 단계들로부터의 데이터 또는 실험 결과들을 기초로 하여 특정 기준에 따라 바이오리액터를 접종하기 위해 독립된 시드 트레인이 사용된다. 그 후, 이노컬럼이 하나의 바이오리액터에서 단일 뱃치 생산으로 사용되고, 수거된 폴리클로날 단백질은 하나의 다운스트림 공정에 적용된다.
2) 개별적인 생산 세포주에서의 독립된 생산, 정제 전의 혼합.
본 시나리오는 하기 단계들을 포함한다 (도 2 참조):
· 풀에서의 세포의 트랜스펙션
· 트랜스펙턴트(transfectant)의 선택
· 고생산성 세포주들/클론들에 대한 스크리닝
· 독립된 생산 및 정제 전의 혼합
상기 시나리오는 먼저 별개의 폴리클로날 단백질 구성원들 각각을 엔코딩하는 일련의 발현 벡터를 제공하는 것을 포함한다. 발현 벡터 각각은 적절한 숙주 세포의 게놈내로 개별적으로 트랜스펙션되어, 하나의 세포가 폴리클로날 단백질의 단지 하나의 구성원을 발현하게 한다. 후속하여, 트랜스펙션된 클론을 선택하기 위해 약제 내성 마커와 같은 동시발현되는 우세한 유전자 마커에 대한 선택이 수행된다.
고생산성 단일 세포 클론들은 고처리량 스크리닝을 위한 프로토콜을 사용하여 선택될 수 있다. 클론들은 적절한 바이오리액터 파라미터에 대해 그리고 세포 특이적 생산성 및 최대 역가에 대해 추가로 스크리닝된다.
별개의 폴리클로날 단백질 구성원들 각각을 엔코딩하는 최상의 클론이 선택되고, 마스터 세포 뱅크인 MCB가 각각의 별개의 폴리클로날 단백질 구성원에 대해 생성된다. 그 후, 각각의 MCB가 통상적인 업스트림 생산에서 사용된다. 각각의 별개의 폴리클로날 단백질 구성원에 대한 모든 바이오리액터 실행으로부터의 상층액이 홀드(hold) 탱크/용기에서 수집되고, 혼합된 후, 혼합된 폴리클로날 상층액이 정제된다. 임의로, 홀드 탱크에서 수집되기 전에 부피 감소 단계가 수행될 수 있다. 부피 감소 단계들은 한외여과 또는 친화성 크로마토그래피, 예를 들어 단백질 A 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 부피 감소 단계는 별개의 단백질 구성원들에 대해 개별적으로 수행된다.
3) 독립된 생산 및 정제, 정제된 단백질들의 혼합
본 시나리오는 하기 단계들을 포함한다:
· 풀에서의 트랜스펙션
· 선택
· 고생산성 클론들에 대한 스크리닝
· 독립된 생산
· 독립된 정제
· 정제된 항체들 (약제 물질들)의 혼합
상기 시나리오는 업스트림 공정의 종료시까지는 시나리오 2와 동일하다. 그 후, 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들이 통상적인 독립된 다운스트림 처리에 적용된다. 각각의 별개의 폴리클로날 단백질에 대한 모든 실행으로부터의 정제된 약제 물질이 수집되고, 임의로 저장되고, 특정 기준에 따라 혼합되어 최종 약제 생성물이 수득된다.
세포들 및 단백질들의 혼합
상이한 세포 개체군들이 제조의 업스트림 처리 파트 동안 혼합되는 경우에는 언제든지, 이는 최종 생성물로서 수득된 폴리클로날 단백질의 조성에 영향을 미친다.
세포들을 혼합하기 위한 한 가지 방법은 2개 이상의 상이한 세포 개체군의 세포들을 동일한 개수로 혼합하거나 배합하는 것을 포함한다. 그러나, 상이한 세포 개체군들이 상이한 발현 수준 또는 다양한 성장 속도를 지니는 경우, 최종 생성물에서 별개의 단백질 구성원들의 동일한 분포를 유도하지 않을 수 있다. 이를 보상하기 위해, 2개 이상의 상이한 세포 개체군의 세포들이 다양한 개수로 배합될 수 있다. 따라서, 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들을 거의 동일한 양으로 발현할 수 있는 폴리클로날 세포 개체군을 수득하도록 상이한 개체군들로부터의 세포들이 배합될 수 있는데, 예를 들어 실험적으로 결정될 수 있는 소정의 비율로 세포들이 혼합될 수 있다.
다른 구체예들에서, 2개 이상의 상이한 세포 개체군으로부터의 세포들은 약제 물질 또는 약제 생성물에서 별개의 단백질 구성원들의 소정의 비율을 제공하는 비율로 배합된다. 이는 상이한 세포 개체군들의 발현 수준 및/또는 성장 속도에 대한 지식 및/또는 세포들을 배합하기 전에 그러한 비율을 계산하기 위한 하나 이상의 정제 단계에서의 별개의 구성원들의 회수에 대한 지식을 사용하여 이루어질 수 있다. 또한, 요망되는 결과를 수득하기에 적절한 혼합 비율은 실험 데이터를 기초로 하여 경험적으로 결정될 수 있다.
업스트림 처리의 종료시에 또는 다운스트림 처리 동안 배합이 수행되는 경우, 이는 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들의 세포 배양물들로부터의 동일한 부피를 배합함으로써 간단히 이루어질 수 있다. 또한, 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들의 동일한 양이 배합될 수 있는데, 이는 그러한 정보가 수득된 경우에 그러하다.
폴리클로날 단백질의 2개 이상의 별개의 구성원이, 약제 물질 또는 약제 생성물에서 별개의 단백질 구성원들의 소정의 비율을 제공하는 비율로 배합될 수 있다. 이는 배합하기 전에 그러한 비율을 계산하기 위한 하나 이상의 정제 단계에서의 별개의 구성원들의 회수에 대한 지식을 사용함으로써 이루어질 수 있다.
폴리클로날 단백질
본 발명의 대부분의 구체예에서, 폴리클로날 단백질은 단백질 구성원들을 발현하는 세포들과 천연적으로 관련되어 있지 않고, 발현 시스템은 재조합 시스템이다.
본 발명은, 바람직하게는 분비되고 더욱 바람직하게는 면역글로불린-유사(immunoglobulin-like) 도메인을 지닌 단백질 패밀리인 면역글로불린 수퍼패밀리로부터 선택되는 재조합 폴리클로날 단백질의 일관된 제조를 위한 방법을 제공한다. 면역글로불린 수퍼패밀리의 구성원들의 대부분은 세포 표면 인식 사건에 관여한다. 서열 분석은 항체, T 세포 수용체, MHC 분자, 일부 세포 유착 분자 및 사이토카인 수용체가 매우 상동성임을 제시한다. 특히, 가변 영역을 함유하는 이러한 패밀리의 구성원들은 본 발명에 따른 재조합 폴리클로날 단백질을 생성시키는 데에 적합하다. 이러한 구성원들로는 항체, 막 결합된(membrane bound) 항체 (B 세포 수용체), Fab 단편, Fv 단편, 단일 사슬 Fv (scFv) 단편, T 세포 수용체 (TcR), 가용성 TcR, TcR 가변 도메인 단편, 폴리펩티드 링커에 의해 결합된 TcR 가변 도메인 단편, 및 다른 항체 또는 TcR 유래된 단편이 있다. 특히, 본 발명은 재조합 폴리클로날 치료용 항체 또는 항체 단편 그리고 TcR 및 TcR 단편의 대규모 제조 및 생산을 위해 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 폴리클로날 단백질은 폴리클로날 항체 또는 폴리클로날 항체 단편이다.
본 발명의 재조합 폴리클로날 단백질은 상이하지만 상동성인 단백질 분자들을 포함하는 단백질 조성물을 지칭하는데, 여기서 상이하다는 것은 예를 들어 천연적 다양성을 반영한다. 따라서, 각각의 단백질 분자는 조성물의 다른 분자들과 상동이지만, 폴리클로날 단백질의 개별적인 구성원들 간의 아미노산 서열 차이를 특징으로 하는 하나 이상의 연속된 가변 폴리펩티드 서열을 또한 함유한다. 가변 폴리펩티드 서열을 구성하는 아미노산 서열에서의 차이는 하나의 아미노산과 같이 작을 수 있지만 통상적으로 1개가 넘는 아미노산을 구성할 것이다. 폴리클로날 항체 또는 TcR의 천연적 가변성은 일반적으로 폴리펩티드 사슬의 소위 가변 영역 또는 V-영역에 존재한다.
본 발명의 한 가지 구체예에서, 폴리클로날 단백질의 개별 구성원들은 약 80개 내지 120개 아미노산 길이인 가변 영역을 포함한다. 가변 영역은 과가변(hyper-variable) 영역, 예를 들어 상보성 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다. 천연 TcR의 경우, 각각의 가변 영역에는 4개의 CDR이 존재한다. 천연 항체의 경우, 중쇄에 3개의 CDR이 존재하고 경쇄에 3개의 CDR이 존재한다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 폴리클로날 단백질의 개별 구성원들의 가변 영역은 길이가 1개 내지 26개 아미노산, 바람직하게는 4개 내지 16개 아미노산인 하나 이상의 과가변 도메인을 포함한다. 이러한 과가변 도메인은 CDR3 영역에 상응할 수 있다. 항체의 경우, 각각의 가변 영역은 바람직하게는 3개의 과가변 도메인을 포함한다. 이들은 CDRl, CDR2 및 CDR3에 상응할 수 있다. TcR의 경우, 각각의 가변 영역은 바람직하게는 4개의 과가변 도메인을 구성한다. 이들은 CDRl, CDR2, CDR3 및 CDR4에 상응할 수 있다. 과가변 도메인은 본 발명의 재조합 폴리클로날 단백질의 가변 영역내에서 단독으로 가변 서열을 구성할 수 있다.
본 발명과 관련하여, 폴리펩티드 서열내의 가변성 (폴리클로날리티)은, 예를 들어 2개 이상의 상이한 항체 이소타입, 예를 들어 사람 이소타입 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD, 및 IgE, 또는 뮤린 이소타입 IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, 및 IgA을 함유하는 항체들의 혼합물의 경우에서와 같이, 항체 폴리펩티드 사슬의 소위 불변 영역 또는 C 영역에 존재하는 개별적인 항체 분자들 간의 차이를 설명하는 것으로 또한 이해될 수 있다. 따라서, 재조합 폴리클로날 항체는 가변 영역 (V 영역) 또는 불변 영역 (C 영역) 또는 둘 모두의 영역에서의 개별적인 항체 분자들 간의 서열 차이를 특징으로 하는 항체 분자들을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항체들은 동일한 이소타입인데, 그 이유는 이 경우 후속 정제 및 특성화가 상당히 용이해지기 때문이다. 또한, 다양한 이소타입 또는 바람직하게는 다양한 서브클래스를 배합하는 것이 또한 고려될 수 있다. 예를 들어, 이소타입 IgG1, IgG2 및 IgG4의 항체가 배합될 수 있는데, 그 이유는 이들 모두가 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 함께 정제될 수 있기 때문이다. 다양한 이소타입 또는 서브클래스의 항체들인 경우, 폴리클로날리티는 불변 부분 또는 가변 도메인, 또는 둘 모두에 존재할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 폴리클로날 항체를 구성하는 모든 항체는 정제를 추가로 용이하게 하기 위해 동일한 불변 영역을 지닌다. 더욱 바람직하게는, 항체들은 중쇄의 동일한 불변 영역을 지닌다. 경쇄의 불변 영역은 또한 별개의 항체들에 걸쳐 또한 동일할 수 있다. 따라서, 한 가지 구체예에서, 2개 이상의 세포 개체군은 별개의 단백질 구성원들을 엔코딩하는 발현 벡터 서열의 차이를 제외하고는 동일하다. 2개 이상의 세포 개체군은, 예를 들어 별개의 단백질 구성원들의 가변 영역을 엔코딩하는 하나 이상의 발현 벡터 서열의 차이를 제외하고는 동일할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 재조합 폴리클로날 단백질은 재조합 폴리클로날 항체 또는 항체 단편이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 재조합 폴리클로날 단백질은 재조합 폴리클로날 TcR 또는 TcR 단편이다.
소위 불변 영역, 특히 항체의 중쇄에서의 폴리클로날리티는 항체의 치료 용도와 관련하여 관심을 끈다. 다양한 면역글로불린 이소타입은 다양한 생물학적 기능을 지니며 (표 1에 요약되어 있음), 이는 치료를 위해 항체를 이용하는 경우 조합하는 것이 바람직할 수 있는데, 이는 면역글로불린의 다양한 이소타입이 자연 면역 반응의 다양한 일면에 관여할 수 있기 때문이다 (Canfield and Morrison 1991. J. Exp. Med. 173, 1483-91 ; Kumpel et al. 2002. Transfus. Clin. Biol. 9, 45.-53; Stirnadel et al. 2000. Epidemiol. Infect.124, 153-162).
표 1: 사람 면역글로불린 이소타입의 생물학적 기능
상기 설명된 바와 같이, 폴리클로날리티는 불변 부분에 존재할 수 있어서, 폴리클로날 단백질의 하나 이상의 별개의 구성원은 하나의 불변 영역을 포함할 수있고, 하나 이상의 다른 별개의 구성원은 상이한 불변 영역을 포함한다. 발현 단백질들에 대해 상이한 당화 패턴을 제공하는 것이 또한 바람직할 수 있는데, 이는 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들에 대해 상이한 숙주 세포를 사용함으로써 수득될 수 있다. 따라서, 폴리클로날 단백질의 하나 이상의 별개의 구성원은 하나의 당화 패턴을 포함할 수 있고, 하나 이상의 다른 별개의 구성원은 상이한 당화 패턴을 포함한다.
다른 구체예들에서, 폴리클로날리티는 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들 중 하나 이상의 유도체화를 통해 수득된다. 예를 들어, 폴리클로날 단백질의 하나 이상의 별개의 구성원은 독소에 커플링시키는 것과 같은 단백질의 변형을 위한 화학적 방법을 사용하여 유도체화될 수 있고, 하나 이상의 다른 별개의 구성원은 유도체화되지 않는다. 폴리클로날 단백질의 상이한 별개의 구성원들에 대해 상이한 유형의 화학적 유도체화가 사용될 수 있다.
폴리클로날 단백질은 3개 이상의 별개의 구성원, 예를 들어 4개 이상의 별개의 구성원, 예를 들어 5개 이상의 별개의 구성원, 예를 들어 6개 이상의 별개의 구성원, 예를 들어 7개 이상의 별개의 구성원, 예를 들어 8개 이상의 별개의 구성원, 예를 들어 9개 이상의 별개의 구성원, 예를 들어 10개 이상의 별개의 구성원, 예를 들어 15개 이상의 별개의 구성원, 예를 들어 20개 이상의 별개의 구성원, 예를 들어 25개 이상의 별개의 구성원을 포함할 수 있다. 대부분의 목적을 위해, 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원 개수는 50개 이하, 예를 들어 45개 이하, 예를 들어 40개 이하, 예를 들어 35개 이하, 예를 들어 30개 이하, 예를 들어 25개 이하, 예를 들어 20개 이하, 예를 들어 15개 이하, 예를 들어 10개 이하, 예를 들어 5개 이하이다.
상기 설명된 다양한 제조 시나리오에서, 예를 들어 모든 별개의 구성원이 개별적으로 발현되도록, 별개의 구성원들 각각에 대해 독립된 제조 시기가 수행될 수 있다. 그러나, 단지 1개, 2개 또는 3개의 별개의 구성원이 개별적으로 제조되며 다른 구성원들은 하나의 뱃치 또는 수 개의 단일 뱃치에서 제조되는 것이 또한 고려될 수 있다.
숙주 세포
숙주 세포는 DNA를 자신의 염색체내로 통합시킬 수 있거나 염색체외 엘리먼트, 예를 들어 플라스미드, 미니-염색체(mini-chromosome), YAC (효모 인공 염색체), MAC (마우스 인공 염색체), 또는 HAC (사람 인공 염색체)를 보유할 수 있는 임의의 세포로부터 생성될 수 있다. MAC와 HAC는 WO 97/40183에 상세히 설명되어 있다.
숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있고, 일부 경우에 원핵 세포는 별개의 구성원들 중 하나 이상의 발현을 위해 사용될 수 있고, 진핵 세포는 하나 이상의 다른 별개의 구성원들에 대해 사용될 수 있다.
진핵 세포는 식물, 효모, 진균, 척추동물 및 무척추동물로 구성된 군으로부터 선택되는 진핵 생물로부터 유래될 수 있다. 또한, 진핵 세포는 항체의 발현을 위한 하이브리도마 또는 불멸화된 B-세포일 수도 있다.
바람직하게는, 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포, COS 세포, BHK 세포, 골수종 세포 (예를 들어, Sp2/0, YB2/0 또는 NSO 세포), 섬유아세포, 예를 들어 NIH 3T3, 불멸화된 사람 세포, 예를 들어 HeLa 세포, HEK 293 세포 또는 PER.C6 세포가 사용된다. 그러나, 포유동물이 아닌 진핵 또는 원핵 세포, 예를 들어 식물 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 진균, 세균, 예를 들어 E. coli 등이 또한 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포이다.
본 발명의 한 가지 구체예에서, 출발 물질로서 사용하려는 세포주는, 세포주를 단일 세포 수준으로 내려가도록 제한 희석을 수행한 후, 각각의 단일 세포를 새로운 세포 개체군이 되도록 성장시킨 후 관심있는 벡터들의 라이브러리로 트랜스펙션시킴으로써, 서브-클로닝(sub-cloning)된다. 또한, 이러한 서브-클로닝은 요망되는 경우 올바른 세포주를 선택하는 과정에서 나중에 수행될 수 있다. 단일 세포 클로닝을 위한 다른 방법들로는 다음과 같은 것들이 있다: FACS 클로닝 (Brezinsky et al. J. 2003. Immunol Methods 277, 141-155), LEAP™ 기술 (Cyntellect, San Diego, California, USA), 및 클론픽스(ClonePix) (Genetix, UK). 이러한 방식으로, 특정 세포 개체군이 폴리클로날 단백질의 하나의 별개의 구성원을 발현하는 하나의 클로닝된 세포로부터 유래된다.
분리된 포유동물 세포 및 세균에서의 통상적인 재조합적 제조에 더하여 다른 제조 시스템이 사용될 수 있다.
예를 들어, 항체는 진균, 효모 및 온전한 식물에서, 트랜스제닉 조류에서 (알로부터 항체를 회수함) 그리고 트랜스제닉 포유동물에서 (밀크로부터 항체를 회수함) 재조합적으로 발현될 수 있다.
진균에서 항체를 제조하는 방법은 당 분야에 공지되어 있는데, 예를 들어 WO 2005/070962; 문헌 [Nyyssonen et al. 1993, Nat Biotech 11:591-5]; 및 문헌 [Ward et al. 2004, Appl. Environ. Microbiol. 70:2567-76]에 기재되어 있다.
효모에서 모노클로날 항체를 제조하는 방법은 당 분야에 공지되어 있는데, 예를 들어 문헌 [Li et al., 2006, Nature Biotech. 24(2):219-215]에 기재되어 있다.
온전한 식물에서 모노클로날 항체를 제조하는 방법은 당 분야에 공지되어 있는데, 예를 들어 문헌 [Bouquin et al., 2002, Transgenic Res. 11:115-22]; 문헌 [Hood et al., 2002, Curr. Opin. Biotechπol. 13:630-5]; 및 문헌 [Stoger et al., 2004, Methods MoI. Biol. 248:301-318]에 기재되어 있다.
조류에서 모노클로날 항체를 제조하는 방법으로서, 그러한 항체 생성물이 알에 존재하는, 방법은 당 분야에 공지되어 있는데, 예를 들어 문헌 [Zhu et al., 2005, Nature Biotech. 23: 1159-69]에 기재되어 있다.
또한, 항체는 트랜스제닉 포유동물에서 재조합적으로 제조될 수 있는데, 여기서 재조합 항체 생성물은 밀크에 존재할 수 있다. 이러한 방법들의 예는 하기 참고문헌에 기재되어 있다: Behboodi et al., 2005, Cloning Stem Cells 7:107-18; Hodges et al., 2003, Reprod. Biol. Endocrinol. 1:81; Houdebine LM. 2002, Curr Opin. Biotechnol 13:625-9; Jang et al., 2006, Theriogenology 65:1800-12; Lai et al., 2003, Reprod. Biol. Endocrinol. 1:82; Lonberg N. 2005, Nature Biotech. 23:1117-25; Santora et al., 2006, Biomed. Chromatogr. 20:843-56; Tang et al., 2008, Transgenic Res; 및 Young et al., 1998, Res Immunol 149:609-10.
통합용 벡터
적절한 벡터는 적절한 선택 유전자를 포함한다. 포유동물 세포 발현에서 사용되는 적절한 선택 유전자로는 비제한적으로 영양에 의한 선택(nutritional selection)을 가능하게 하는 유전자, 예를 들어 티미딘 키나아제 유전자 (TK), 글루타민 신쎄타아제(synthetase) 유전자 (GS), 트립토판 신타아제(synthase) 유전자 (trpB) 또는 히스티디놀 데히드로게나아제 유전자 (hisD)가 있다. 사용될 수 있는 선택 마커로는 약제 내성을 부여하는 항대사물질 내성 유전자, 예를 들어 히포크산틴과 티미딘 결핍 배지를 사용하여 선택될 수 있고 메토트렉세이트를 사용하여 추가로 선택될 수 있는 디히드로폴레이트 리덕타아제(reductase) 유전자 (dhfr), 미코페놀산을 사용하여 선택될 수 있는 크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (gpt), 진핵 세포에서 G418을 사용하거나 원핵 세포에서 카나마아신을 사용하여 선택될 수 있는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자 (neo), 히드로마이신을 사용하여 선택될 수 있는 히드로마이신 B 포스포트랜스퍼라아제 (hyg, hph, hpt) 유전자, 퓨로마이신(puromycin)을 사용하여 선택될 수 있는 퓨로마이신 N-아세틸-트랜스퍼라아제 유전자 (pac), 또는 블라스티시딘을 사용하여 선택될 수 있는 블라스티시딘 S 디아미나아제 유전자 (Bsd), 및 제오신(Zeocin)과 블레오마이신에 대한 내성을 매개하는 제오신 내성 유전자 (Sh ble)가 있다. 최종적으로, 예를 들어 유량 세포측정에 의해 분류(sorting)를 가능하게 하는 단백질을 엔코딩하는 유전자가 또한 선택 마커로서 사용될 수 있는데, 그 예로는 녹색 형광 단백질 (GFP), 신경 성장 인자 수용체 (NGFR) 또는 다른 막 단백질, 또는 베타-갈락토시다아제 (LacZ)가 있다.
바람직하게는, 선택성 마커(selectable marker)는 숙주 세포에게 없는 유전자 생성물을 엔코딩하는데, 이에 의해 예를 들어 배지에 항생제를 첨가하는 것이 회피된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 세포들은 선택성 마커를 발현하는 세포의 성장을 유리하게 하는 조건하에서 연속적으로 배양된다. 이는 선택성 마커가 숙주 세포에게 없는 유전자 생성물인 경우 특히 유용한데, 그 이유는 예를 들어 항생제를 첨가함이 없이 배양 기간 전체에 걸쳐 선택 조건을 이용할 수 있게 해주기 때문이다.
이량체 또는 다량체 단백질 발현의 경우, 하나의 발현 벡터가 별개의 폴리클로날 단백질 구성원의 모든 서브유닛(subunit)을 엔코딩할 수 있다. 또한, 발현 벡터는 발현 벡터의 2개 이상의 서브셋을 포함할 수 있는데, 여기서 첫 번째 서브셋은 단백질의 하나의 서브유닛을 엔코딩하는 다양한 핵산 서열을 포함하고 두 번째 서브셋은 단백질의 또 다른 서브유닛을 엔코딩하는 다양한 핵산 서열을 포함하여, 각각의 트랜스펙션이 발현 벡터의 첫 번째 서브셋으로부터의 구성원과 발현 벡터의 두 번째 서브셋에 대한 구성원을 사용하여 수행되게 한다. 항체의 경우, 발현 벡터는 발현 벡터의 2개의 서브셋에 의해 구성될 수 있는데, 여기서 첫 번째 서브셋은 항체 중쇄를 엔코딩하는 다양한 핵산 서열을 포함하고 두 번째 서브셋은 항체 경쇄를 엔코딩하는 다양한 핵산 서열을 포함하여, 각각의 트랜스펙션이 발현 벡터의 첫 번째 서브셋으로부터의 구성원과 발현 벡터의 두 번째 서브셋에 대한 구성원을 사용하여 수행되게 한다.
선택 마커는 개별 발현 벡터상에 존재할 수 있는데, 이로써 선택 마커를 코딩하는 발현 벡터와 관심있는 단백질 또는 관심있는 단백질의 서브유닛을 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터를 사용하여 코-트랜스펙션(co-transfection)이 수행된다. 또한, 선택 마커는 관심있는 단백질을 코딩하는 발현 벡터상에 존재할 수 있다. 선택 마커가 관심있는 단백질을 코딩하는 발현 벡터상에 존재하는 경우, 선택 마커는 바람직하게는 관심있는 단백질 또는 이의 서브유닛들 중 하나를 또한 엔코딩하는 전사체(transcript)상에 존재한다. 이는 예를 들어 IRES 작제물을 사용하여 이루어질 수 있다. 다량체 단백질, 예를 들어 다량체 항체의 경우, 바람직하게는 선택 마커는 가장 큰 서브유닛, 예를 들어 항체의 중쇄를 엔코딩하는 전사체상에 존재한다.
관심있는 유전자의 통합을 위한 벡터는 관심있는 재조합 폴리클로날 단백질의 하나의 구성원을 엔코딩하는 DNA를 추가로 포함하는데, 이러한 DNA는 단백질의 발현을 유도하는 그 자체의 프로모터, 예를 들어 포유동물 세포에서의 발현을 위한 포유동물 프로모터 다음에 위치할 수 있다. 관심있는 재조합 폴리클로날 단백질의 구성원이 하나 이상의 단백질 사슬을 포함하는 경우, 예를 들어 구성원이 항체 또는 T 세포 수용체인 경우, 단백질의 개별 사슬을 엔코딩하는 DNA는 사슬 각각의 고수준 발현 (양방향(bi-directional) 또는 일방향(uni-directional))을 유도하는 그 자체의 프로모터 다음에 위치한다. 양방향 발현의 경우, 발현 벡터내에서의 헤드-투-헤드 프로모터 배열이 사용될 수 있고, 일방향 발현의 경우에는 예를 들어 IRES 서열과 조합된 2개의 프로모터 또는 하나의 프로모터가 발현을 위해 사용될 수 있다. 동일한 전사체에 의해 엔코딩되며 IRES 서열에 의해 분리되어 있는 2개의 상이한 서브유닛을 지닌 비-시스트론(bi-cistronic) 벡터가 마찬가지로 고려될 수 있다.
적절한 헤드-투-헤드 프로모터 배열은 예를 들어 두 배향(orientation) 모두로 사용되는 AdMLP 프로모터와 마우스 메탈로티오네인-1 프로모터, 두 배향 모두로 사용되는 AdMLP 프로모터와 신장 인자(elongation factor)-1 프로모터, 두 배향 모두로 사용되는 CMV 프로모터와 MPSV 프로모터, 또는 두 배향 모두로 사용되는 CMV 프로모터이다.
항체의 경우, 경험에 따르면 세포에 의해 발현되는 중쇄의 양은 경쇄의 양을 초과할 수 없는 것으로 나타났다. 따라서, 경쇄의 발현을 유도하는 프로모터는 바람직하게는 중쇄의 발현을 유도하는 프로모터 만큼 강력하거나 그 보다 더 강력하다.
기능적 선도 서열(functional leader sequence)을 엔코딩하는 핵산 서열은, 소포체 또는 세포내의 특정 위치, 예를 들어 세포소기관으로 유전자 생성물을 유도하도록 발현 벡터에 포함될 수 있다. 강력한 폴리아데닐화 신호는 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열의 3'에 위치할 수 있다. 폴리아데닐화 신호는 발생기(nascent) RNA 전사체의 종결 및 폴리아데닐화를 보장하고, 메시지(message) 안정성과 상호관련된다. 관심있는 재조합 폴리클로날 단백질의 구성원을 엔코딩하는 DNA는 예를 들어 항체 또는 항체 단편의 중쇄와 경쇄 둘 모두를 엔코딩할 수 있는데, 각각의 유전자 서열은 임의로 이의 자체 포유동물 프로모터 엘리먼트 다음에 존재하고/하거나 두 사슬 각각의 고수준 발현을 유도하는 강력한 폴리 A 신호의 앞에 존재한다.
통합을 위한 발현 벡터는 통합 부위에서의 증가된 발현을 위해 추가의 전사 조절 엘리먼트, 예를 들어 인핸서, 항-리프레서(anti-repressor), 또는 UCOE (ubiquitous chromatin opening element)를 함유할 수 있다. 인핸서는 전사에 관여하는 핵 단백질과 특이적으로 상호작용하는 핵산 서열이다. UCOE는 크로마틴을 개방시키거나 크로마틴을 개방된 상태로 유지시키고, 작동적으로 결합된 유전자의 재현가능한 발현을 촉진시킨다 (WO 00/05393과 문헌 [Benton et al., Cytotechnology 38:43-46, 2002]에 더욱 상세히 설명되어 있음). 추가의 인핸서로는 예를 들어 문헌 [Girod & Mermod 2003 ("Chapter 10: Use of scaffold/matrix-attachment regions for protein production", pp 359-379 in Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, SC Makrides (ed.), 2003, Elsevier Science BV)]에 기재된 매트릭스 어태치먼트 리전(Matrix Attachment Region, MAR)이 있다. 항-리프레서 엘리먼트로는 비제한적으로 STAR 엘리먼트가 있다 (Kwaks et al., Nat Biotechnol. 2003 May;21(5): 553-8). 상기 기재된 조절 엘리먼트들 중 하나 이상이 숙주 세포의 염색체내로 통합되는 경우, 이들은 이종성 조절 엘리먼트라고 일컬어진다.
발현 수준이 증가될 필요가 있는 경우, DHFR 유전자 또는 글루타민 신쎄타아제 (GS) 유전자, hprt (히포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라아제) 또는 트립토판 신쎄타아제 유전자에 대한 선택을 사용하여 유전자 증폭이 수행될 수 있다. 이는 그러한 선택 마커를 포함하는 벡터를 사용하는 것을 필요로 한다.
생산 세포의 배양
배양 단계 동안, 형질전환된 세포는 이노컬럼 (시드 트레인)을 제조 및 배양하고, 이노컬럼을 하나의 바이오리액터 또는 일련의 바이오리액터에서 스케일업(scaling up)시키고 (이노컬럼 트레인), 이노컬럼으로부터 단백질을 생산 및 축적시킴 (생산기)으로써 배양된다.
시드 트레인 시기에서, 형질전환 단계로부터의 형질전환된 세포가 이노컬럼 배양 배지내로 회수되어 이노컬럼이 생성된다. 형질전환된 숙주 세포는, 동화가능한 탄소원 (글루코오스 또는 락토오스와 같은 탄수화물), 질소원 (아미노산, 펩티드, 단백질 또는 이들의 분해 생성물, 예를 들어 펩톤, 암모늄염 등) 및 무기염원 (나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘의 설페이트, 포스페이트 및/또는 카보네이트)을 함유하는 액체 배지에서 당 분야에 공지된 방법에 의해 배양된다. 이노컬럼 배양 배지는 바람직하게는 통상적인 영양 배지, 예를 들어 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM) (Sigma), Ham's FlO (Sigma), 최소 필수 배지(Minimal Essential Medium, MEM) (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) 또는 NCTC-135를 포함한다. 배양 배지는 바람직하게는 무혈청 배지, 더욱 바람직하게는 EX-CELL® 302 (SAFC Biosciences)와 같은 동물 단백질이 없는 배지, 더욱 더 바람직하게는 EX-CELL® 325 (SAFC Biosciences)와 같은 단백질 비함유 배지, 가장 바람직하게는 OptiCHO™ (Invitrogen), 또는 ProCHO4™ 또는 PowerCHO2-CD™ (Lonza BioWhittaker)와 같은 화학적 규명 배지(chemically defined medium)이다.
이러한 배지들 중 어느 하나에는 필요에 따라 아미노산 (글루타민), 호르몬 또는 다른 성장 인자 (인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 비타민, 염 (징크 설페이트(zinc sulfate), 소듐 클로라이드, 포스페이트), 완충제, 뉴클레오티드, 항생제, 이온성 계면활성제, 및/또는 글루코오스 또는 동등한 에너지원이 보충될 수 있다. 배지는, 성장 촉진 물질, 예를 들어 철 킬레이트(iron chelate) (예를 들어, 킬레이트 B (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)) 및/또는 망간인 미량 원소들을 추가로 함유할 수 있다. 시드 트레인 동안, 신속한 세포 성장을 보장하기 위해 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 모니터링된다.
이노컬럼 트레인 동안, 이노컬럼은 순차적인 배양 단계들을 통해 스케일-업 배지에서 스케일-업된다. 이러한 단계들은 세포 배양 플라스크, 교반 병(stir bottle), 롤러병, 회전 바이오리액터 및 스피너 플라스크(spinner flask)를 포함하는 임의의 적절한 용기에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 이노컬럼 트레인은 바이오리액터에서 수행되는데, 이로써 세포는 폐쇄형 배관 시스템을 통해 생산 바이오리액터로 전달될 수 있다. 스케일-업 배지는 통상적인 영양 배지를 또한 포함하고, 가수분해물 (예를 들어, HySoy® (Quest International, Chicago, IL)), 호르몬 또는 다른 성장 인자, 비타민, 염, 완충제, 뉴클레오티드, 항생제, 이온성 계면활성제, 철 킬레이트, 및 글루코오스 또는 동등한 에너지원에 의해 공급되는 아미노산을 포함할 수 있다. 바이오리액터에서의 이노컬럼 트레인 동안, 이노컬럼의 pH, 산소 포화 및 폐기물이 모니터링된다.
생산기 동안, 세포는 교반 탱크 또는 에어리프트(airlift) 바이오리액터 또는 1회용 또는 1회-사용 바이오리액터로 전달되고, 이러한 세포에, 일관되고 확고하고 신속한 세포 성장을 위해 성장 배지의 pH, 삼투몰농도(osmolality) 및 다른 필수 파라미터를 유지하도록 하는 양으로 배합되는, 당, 아미노산, 염, 미량 원소 및 성장 인자를 함유하는 복합 성장 배지가 공급된다. 이러한 시판되는 공급 용액의 예는 셀 부스트(Cell Boost) 1-6 (Hyclone)와 EfficientFeed™ A 및 B (Invitrogen)이다. 또한, 특정 생산 세포의 필요에 맞는 맞춤형(custom made) 공급 용액이 사용될 수 있다. 예를 들어, 베타인 또는 프롤린과 같은 삼투보호(osmoprotectant) 화합물이 사용되면 삼투 스트레스로부터 세포를 보호하며 항체 생산성을 향상시킬 수 있다. 또한, 온도, 용존 산소, pH, 압력, 가스 흐름 속도 및 교반 속도가 생산기 동안 제어된다. 생산기 동안, 세포는 단백질을 내부에 발현하거나 단백질을 주위 배지내로 분비한다. 단백질을 자신의 구조내에서 발현하는 세포는 그러한 단백질을 수거하기 위해 화학적으로 또는 기계적으로 단편화될 수 있다. 포유동물 세포와 같은 더욱 복잡한 세포는 당화된 세포 생성물을 생산할 수 있고, 분리를 위해 세포 배양 배지내로 단백질을 분비할 수 있다.
수거 및 정제
수거 단계 동안, 단백질은 당 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 세포 배양물로부터 분리된다. 예를 들어, 단백질이 형질전환된 세포에 의해 세포내에서 생산되는 경우, 숙주 세포 또는 용해된 세포를 제거하기 위해 원심분리 또는 한외여과가 사용될 수 있다. 단백질이 배지내로 분비되는 경우, 단백질은, 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amicon® 또는 Millipore Pellicon® 한외여과 유닛을 사용함으로써, 세포에 공급된 화합물들의 혼합물로부터 그리고 세포 자체의 부산물로부터 분리될 수 있다.
정제 단계 동안, 단백질은 다양한 크로마토그래피 방법을 포함하는 하나 이상의 정제 단계에 적용된다. 그러한 정제 절차의 예로는 음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피 뿐만 아니라 다양한 여과 방법, 예를 들어 Pellicon® 막 (Millipore, Billerica, MA)을 사용하는 접선 흐름 여과(tangential flow filtration), 예를 들어 잠재적인 바이러스 오염을 감소시키기 위한 DVSO 필터 (Pall Corporation, East Hills, NY)를 사용하는 나노여과, 적절한 사이즈 데드 엔드(size dead end) 여과 (예를 들어, 0.45 μm 및 0.2 μm 필터), 소수성 상호작용 크로마토그래피 (예를 들어, 페닐 세파로오스상에서의 크로마토그래피)를 사용하는 분별(fractionation), 에탄올 침전, 등전 집중법(isoelectric focusing), 역상 HPLC, 실리카상에서의 크로마토그래피, 헤파린 세파로오스™(Heparin Sepharose™)상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱(chromatofocusing), SDS-PAGE, 암모늄 설페이트 침전, 히드록시아파타이트(hydroxylapatite) 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 포획 시약으로서 단백질 A, 단백질 G, 항체, 특이적 기질, 리간드 또는 항원을 사용함)가 있다.
또한, 본 발명의 단백질은 변형되거나 유도체화될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 번역후 변형, 예를 들어 당화 (O-결합 및 N-결합 둘 모두), 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, 폴리머 컨쥬게이션 등이 있다. 이러한 변형들 중 일부는 숙주 세포 기구(machinery)를 사용하여 생체내에서 수행될 수 있고, 다른 것들은 숙주 세포로부터 단백질을 분리한 후 시험관내 방법을 필요로 한다.
본 발명의 단백질은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합되거나, 담체에 의해 희석되고/거나 담체내에 넣어질 수 있는 것으로 이해되는데, 담체내에 넣어지는 경우에 이는 예를 들어 캡슐, 샤세(sachet), 종이 또는 다른 용기의 형태로 존재할 수 있다. 담체가 희석제로서 기능하는 경우, 이는 활성 성분에 대한 비히클, 부형제 또는 배지로서 작용하는 고체, 반고체 또는 액체 물질일 수 있다. 약제학적으로 허용되는 적절한 담체로는 예를 들어 물, 식염수, 포스페이트 완충 식염수, 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올 등 뿐만 아니라 이들의 조합물 중 하나 이상이 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는, 단백질의 저장 수명 또는 효과를 향상시키는, 소량의 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 에멀젼화제, 방부제 또는 완충제를 추가로 포함할 수 있다. 조성물은 당 분야에 널리 공지된 바와 같이 활성 성분의 신속한 방출, 지속 방출 또는 지연 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다.
본 발명의 단백질은 다양한 형태로 존재할 수 있다. 이러한 형태로는 예를 들어 고체, 반고체 및 액체 투여형, 예를 들어 정제, 알약, 분말, 액체 용액, 분산액 또는 현탁액, 리포솜, 좌약, 주사 및 주입 용액이 있다. 따라서, 조성물은 정제, 로젠지(lozenge), 샤세, 카세(cachet), 엘릭서, 현탁액, 에어로졸 (고체로서 또는 액체 매질에 함유된 형태) 또는 예를 들어 10 중량% 이하의 활성 화합물의 함유하는 연고, 연질 및 경질 젤라틴 캡슐, 좌약, 주사 용액, 현탁액, 멸균 패키징된(packaged) 분말의 형태로 그리고 국소 패치(topical patch)로서 존재할 수 있다. 바람직한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료적 용도에 좌우된다. 주사 또는 주입에 의한 비경구 투여의 경우, 전형적인 제형은, 가능하게는 동결건조된 생성물을 기반으로 하는, 용액 또는 현탁액의 형태로 존재한다.
정제 후, 폴리클로날 항체의 모든 별개의 구성원의 존재 및/또는 양 또는 상대적 분포가, 예를 들어 이온-교환 크로마토그래피에 의해 또는 WO 2006/007853에 기재된 마커 펩티드 방법과 같은 질량 분석법 기반 방법을 이용하여, 전형적으로 평가된다. 폴리클로날 항체 조성물을 특성화하는 방법은 WO 2006/007853에 상세히 기재되어 있다. 또한, 폴리클로날 단백질의 각각의 구성원의 존재 및/또는 양을 결정하는 것은 요망되는 경우 업스트림 또는 다운스트림 제조 동안 다른 시점들에서 수행될 수 있다. 따라서, 한 가지 구체예에서, 본 발명의 방법은 제조 동안 및/또는 정제 후에 폴리클로날 단백질의 각각의 구성원의 존재 및/또는 양을 확인하기 위한 하나 이상의 단계를 포함한다.
폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들의 추가의 바람직한 특징은 단백질 균질성(protein homogeneity)인데, 이로써 단백질들은 용이하게 정제될 수 있다. 하나의 별개의 피크를 지닌 이온 교환 크로마토그래피가 특성화를 용이하게 하기 위해 바람직하다. 이는 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들 그리고 최종 약제 생성물과 약제 물질 조성물 둘 모두에 적용된다. 별개의 구성원들을 배합하는 경우 이러한 구성원들이 이온 교환 크로마토그래피 또는 다른 단백질 특성화 방법을 사용하여 구별될 수 있는 것이 또한 바람직한데, 이로써 모든 별개의 구성원을 지닌 조성물이 1회 실행으로 특성화될 수 있게 된다. 따라서, 바람직하게는 별개의 단백질 구성원들은, 정제 후에 특성화 단계에서 별개의 단백질 구성원들을 확인할 수 있도록 선택된다.
최종 약제 생성물은 투여용으로 제형화된 폴리클로날 단백질 (또는 가능하게는, 투여하기 전에 예를 들어 멸균수로 재구성하기에 적절한 동결건조된 형태), 적절한 패키징(packaging), 그리고 처방 정보(prescription information) 뿐만 아니라 판매 허가에 관한 사항이 기재된 패키지 인서트(package insert)를 포함한다.
독립된 생물에서의 관심있는 단백질의 발현
본 시나리오를 사용함에 의해, 온전한 생물에서의 생체내 발현을 필요로 하는, 비용이 적게 드는 업스트림 처리 방법을 사용하는 것과 관련된 이점이 폴리클로날 단백질 생성물의 제조에 적용될 수 있다. 식물과 동물에서 단백질 생성물을 재조합적으로 발현시키는 것은 여전히 초보적인 상태이다. 하나의 생물에서 폴리클로날 단백질 생성물의 상이한 구성원들을 발현시키는 방법은 어려운 것으로 판명될 수 있는데, 이는, 후속해서 분열하여 온전한 생물로 분화될 수 있는 세포에 수 개의 유전자가 서로 독립적으로 삽입될 필요가 있기 때문이다. 따라서, 하나의 생물에서 폴리클로날 단백질의 단지 하나의 별개의 구성원을 발현시킬 수 있는 것이 유리할 수 있다.
동물의 경우, 이종성 발현 작제물을 줄기 세포 또는 난 세포(egg cell)내로 삽입시키고 엔코딩되는 생성물이 후속해서 발현되어 밀크 (포유동물의 경우) 또는 알 (조류의 경우)로 분비됨을 보장하기 위한 방법이 개발되었다. 본 발명은 동물로 확장될 수 있는데, 이로써 하나의 동물이 폴리클로날 단백질의 하나의 구성원을 발현한 후, 단백질 생성물을 함유하는 밀크 또는 알이 합쳐져서 하나의 다운스트림 처리 절차에 적용될 수 있게 한다. 또한, 다운스트림 처리의 하나 이상의 단계가 별개의 단백질 구성원들 중 하나 이상에 대해 개별적으로 수행될 수 있다. 다운스트림 처리 및 후속 특성화를 용이하게 하도록 통상적으로 동일한 동물 종이 폴리클로날 단백질의 모든 구성원을 발현시키기 위해 사용된다.
식물의 경우, 이종성 단백질을 발현시키기 위한 방법이 마찬가지로 개발되었다. 일부 방법은 식물의 특정 기관, 예를 들어 감자 괴경, 잎, 종자 또는 꽃에서 생성물을 발현시키는 것에 의존한다. 이러한 기관 특이적 발현은, 특히 식물의 섬유소가 풍부한(fiber-rich) 부분이 회피될 수 있는 경우, 다운스트림 처리를 용이하게 할 수 있다. 이러한 방법을 사용하는 경우, 비용이 적게 드는 식물 성장 방법을 사용하여 재조합 단백질 생성물이 대량으로 발현될 수 있다. 따라서, 하나의 식물이 폴리클로날 단백질의 하나의 구성원을 발현하고, 상이한 구성원들이 다운스트림 처리 전에, 다운스트림 처리 동안 또는 다운스트림 처리 후에 배합될 수 있다. 폴리클로날 단백질의 모든 구성원을 발현하기 위해 동일한 종의 다양한 식물이 사용된다.
본 발명에 따라 제조된 조성물의 치료적 용도
본 발명에 따라 제조된 약제학적 조성물은 포유동물의 질병을 치료하거나 개선시키거나 예방하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 의해 치료될 수 있는 질병으로는 암, 감염성 질병, 염증성 질병, 알레르기, 천식 및 그 밖의 호흡기 질병, 자가면역 질병, 심혈관 질병, 중추신경계 질병, 대사 및 내분비 질병, 및 이식 거부반응(transplantation rejection)이 있다.
또한, 본 발명에 따라 생성된 폴리클로날 항체는 진단 목적을 위해, 예를 들어 진단 키트로 사용될 수 있고, 환경 용도를 위한 키트로, 예를 들어 오염물을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1: 독립된 세포 증식, 진탕 플라스크에서의 혼합 생산
개관
6개의 상이한 세포 개체군을 계수하고, 동일한 세포 비율 (1:1:1:1:1:1)로 혼합하고, 이를 사용하여 바이오리액터를 시딩(seeding)하였는데, 여기서 각각의 세포 개체군은 상이한 항체를 생산하였다. 세포를 7일간 배양한 후, 이온 교환 크로마토그래피 (IEX)를 사용하여 6개 항체 각각의 양을 정량하였다. 실험을 2회 반복하고, 수득된 폴리클로날 항체의 뱃치에 따른 재현성을 조사하였다.
재료 및 방법
세포주
사용되는 모(parental) 생산 세포주는 콜롬비아 유니버시티(Columbia University)의 로렌스 체이슨(Lawrence Chasin)으로부터 입수한 DHFR-네거티브 CHO 세포주 DG44의 유도체이다. DG44 세포를 벡터 pcDNA3.1+ (Invitrogen)내의 아데노바이러스 타입 5 트랜스액티베이터(transactivator) E1A에 대한 cDNA로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙턴트(Transfectant)를 500 μg/ml의 농도로 제네티신(Geneticin) (Invitrogen)을 사용하여 선택하였다. 선택 후, 세포를 제한 희석에 의해 단일-세포 클로닝하였다. 클론을 항체 플라스미드에 의한 일시적 트랜스펙션에 의해 항체 발현에 대해 시험하였다. 하나의 클론이 트랜스펙션되지 않은 DG44 세포주와 비교하여 3배 개선된 일시적 검정(transient assay)에서의 발현 수준을 나타내었다. 안정한 트랜스펙션을 이용하여 수행된 비교에서, 선택된 풀(pool)은 야생형 DG44 세포주와 비교하여 4배 내지 5배 증가된 발현 수준을 나타내었다. 이러한 클론 (ECHO라 일컬어짐)을 2회 서브-클로닝하였고, 이는 항체 발현과 관련하여 안정한 것으로 나타났다.
항체 발현 플라스미드
중쇄 (VH + 감마 1 불변 영역)과 경쇄 (카파 02-286)에 대한 코딩 영역이 스페이서(spacer) 엘리먼트가 사이에 존재하는 2개의 동일한 헤드-투-헤드 사람 CMV 프로모터를 사용하여 발현되도록, 사용되는 IgG1 항체 발현 플라스미드를 작제하였다. 트랜스펙턴트의 선택은, 중쇄 코딩 서열의 다운스트림에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)에 의해 가동되는 마우스 디히드로폴레이트 리덕타아제 cDNA (DHFR) 카세트를 사용하여 수행하였다. 상이한 우두 바이러스 표면 단백질들에 대해 유도된 6개의 상이한 항체를 선택하였다. 표 2는 항체 및 이러한 항체를 발현하는 ECHO 클론을 나타낸다.
표 2. 항체 및 ECHO 클론
ECHO 세포의 트랜스펙션
ECHO 세포를 10% 우태아 혈청(FCS) (Invitrogen)을 지닌 MEM 알파 배지 (뉴클레오시드 함유) (Invitrogen)내에서 T80 플라스크에 플라스크 당 0.3 x 106개 세포의 밀도로 시딩하였다. 시딩한 지 1시간 이내에 세포를 Fugene®6 (Roche)로 트랜스펙션시켰다:
· 10㎕의 Fugene®6를 490㎕의 둘베코 변형 이글 배지와 혼합하고, 실온에서 5분간 인큐베이션시켰다
· 5㎍의 발현 플라스미드를 첨가하고, 믹스(mix)를 실온에서 추가 15분간 인큐베이션시켰다
· 혼합물을 세포 배양 플라스크에 첨가하였다
다음날, 트랜스펙션 시약을 함유하는 배지를 흡인하고, 각각의 플라스크를 10% 투석된 FCS (Invitrogen)가 함유된 5 ml의 MEM 알파 배지 (뉴클레오시드 비함유) (MEMalpha-)으로 1회 세척하고, 10 ml의 동일한 배지를 2 nM 농도의 메토트렉세이트와 함께 첨가하였다. 배지를 매주 2회 교환하였다. 15일 후, 세포를 트립신처리하고, 모든 세포를 새로운 플라스크로 옮겼다.
단일-세포 클론의 생산을 위해, 풀내의 세포를 표면 결합된(surface-associated) 항체에 대해 염색하고, FACS-Aria (Becton-Dickinson)를 사용하여 FACS 단일-세포를 분류하였다. 약 1주일 후, 단일 클론의 존재에 대해 현미경으로 웰(well)들을 검사하였다. 약 2주 후, 단일 클론을 지닌 웰로부터의 상층액을 IgG ELISA에 의해 그리고 ELISA 값 및 웰의 육안 검사(visual inspection)를 기초로 하여 각각 1회 희석으로 검정하고, 각각의 항체를 나타내는 24개의 클론을 무혈청 현탁 배양에 대해 적응시키기 위해 선택하였다.
무혈청 현탁 배양에 대한 적응
세포들을 트립신처리하고 계수하였다. 5.0 x 106개 세포를 원심분리하고, 10 ml ProCHO4™ 무혈청 배지 (Lonza) + 4 mM L-글루타민 (Invitrogen) + 1/100 MEM NEAA (Invitrogen) 중에 재현탁시켰다. 세포를 50 ml 세포 배양 튜브 (TRP, Switzerland)에 옮기고, 37℃에서 진탕기상에서 인큐베이션시켰다. 세포 밀도를 매주 2회 계수하고, 매번 배양액을 ml 당 0.5 x 106개 세포 (최초 2주간)로 또는 0.3 x 106개 세포 (나머지 기간 동안)로 희석시켰다. 4 내지 5주 후, 대부분의 클론에 대한 배가 시간은 30시간에 근접하였고, 이 시점에서 이러한 클론들이 무혈청 배양에 대해 적응한 것으로 간주되었다. 적응 기간의 종료시에, ELISA에 의해 세포들을 검정하고, 동결시키고, 발현 실험을 위해 사용하였다.
해동 및 증식
6개의 상이한 세포주 각각을 37℃로 가열된 ProCHO4™ 배지에서 해동시켰다. 세포 현탁액을 800 rpm (160 G)에서 4분 원심분리시키고, 상층액을 분리하고, 세포 펠릿(pellet)을 37℃에서 12 ml ProCH04™ 배지 중에 재현탁시켰다. 그 후, 세포 현탁액을 T75 플라스크로 옮기고, 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터에 넣었다. 2일째에, 배양물을 진탕기 또는 50 ml 바이알/바이오리액터내에서 ProCHO4™ 배지 중에서 5.0 x 105개 세포/ml로 조정하였다. 세포 증식 동안, 세포 농도를 매주 2회 또는 3회에 걸쳐 0.5 x 106개 세포/ml로 조정하였다. 증식시킨 지 1주 후에, 6개의 세포주 각각을 500 ml 진탕기내의 60-80 ml 배지 중에서 0.5 x 106개 세포/ml로 셋업(set up)시켰다.
배양
진탕기를 시딩한 경우, 6개의 세포주를 혼합하고, 이노컬럼을 2개의 250 ml 진탕기에 나누었다. 요약하면, 혼합하기 전에, 각각의 세포주로부터의 샘플을 3회 계수하고, 생존가능한 평균 세포 카운트(count)를 사용하였다. 15.0 x 106개 세포에 상응하는 각각의 클론의 부피를 취하고, 6개의 부피를 철저히 혼합하고, 새로운 세포 카운트를 수득하였다. 이러한 세포 카운트를 기초로 하여, 0.5 x 106개/ml의 (혼합) 세포 농도를 지닌 2개의 250 ml 진탕기를 셋업시켰다. 각각의 진탕기에 대한 계산된 부피를 50 ml 튜브로 옮기고, 800 rpm (160 G)에서 4분간 원심분리하였다. 상층액을 버리고, 세포를 50 ml ProCHO4™ 배지 중에 재현탁시키고, 250 ml 진탕기로 옮겼다. 그 후, 진탕기를 100 rpm과 2.6 cm 진폭의 진탕 테이블(shaking table)상의 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터에 넣었다.
실험을 독립된 2일에 걸쳐 수행하였는데, 1일째에는 실험 번호 1A와 1B를 사용하였고, 2일째에는 실험 번호 2A와 2B를 사용하였다. 배양을 7일간 실행하였고, 그 후 상층액을 IEX 프로파일링(profiling)을 위해 보존하였다.
IgG 조성의 분석
5-10 ml의 0.22 μm 여과된 배지 상층액을 1 ml MabSelect SuRe™ 컬럼 (GE Healthcare)상으로 로딩시켰다. 제조업자에 의해 기술된 바와 같이, 컬럼을 10 ml PBS (pH 7.4)로 세척하고, 0.1 M 글리신 (pH 2.7)을 사용하여 용리시켰다. 풀링된 단백질 물질을 40 mM NaCl, 50 mM Na-아세테이트 (pH 5.0)에 대해 2회 투석시키고, 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 전체 IgG 농도를 결정하였다.
60 μg IgG 혼합물을 PolyLC로부터의 약한 양이온 교환 컬럼 PolyCat A (100x4, 6 mm, 3 μm, 1500 Å)상으로 로딩시켰다. 72분에 걸쳐 1 ml/분의 흐름 속도로 Na-아세테이트 (pH 5.0) 중의 150 내지 500 mM NaCl의 구배를 적용함으로써 단백질을 용리시켰다. 용리액의 215 nm 흡광도를 모니터링하고, 신호를 적분함에 의해 개별 IgG들의 상대량을 결정하였다. 다양한 샘플을 비교하기 위해, 항체의 전체량을 100%로 설정하고, 6개의 항체 각각의 비율을 계산하였다.
결과
혼합된 개체군을 함유하는 진탕 플라스크로부터의 상층액을 7일 후에 수거하여 IEX 프로파일을 분석하였다. 각각의 항체의 상대 면적은 표 3과 도 3에 제공되어 있다.
표 3. 혼합된 개체군에서의 7일 배양 후의 각각의 항체의 상대 면적
상기 표는 다음과 같은 사항을 나타낸다:
· 동시에 혼합된 2개의 상이한 진탕 플라스크 간의 6개 항체 각각의 양의 변화는 매우 작다. 이는 상기 방법의 표준 편차 한계에 속하는 것으로 여겨진다.
· 날(day)을 달리하여 혼합된 세포들도 매우 작은 변화를 지니는데, 이는 6개의 상이한 세포 개체군을 동일한 세포 비율로 혼합하고 이들을 함께 배양함으로써 배양 후에 그러한 6개 항체 각각의 동일한 상대량을 생성시키는 것이 가능함을 나타낸다.
실시예 2: 페드 뱃치 바이오리액터에서의 독립된 업스트림 배양, 정제 전의 혼합
개관
5개의 상이한 IgG 항체를 발현하는 5개의 상이한 ECHO 세포주를 바이오리액터에서 13-14일간 개별적으로 배양하였다. 배양 후, 항체 함유 분획을 정제 동안 혼합 (2:1:1:1:1)하여 벌크(bulk) 약제 물질 (BDS) 형태로 항체의 조성물을 수득하였다.
발현 플라스미드, 세포 등은 실시예 1에서와 같았지만, 5개의 항체만이 발현되었다 (표 4 참조).
표 4. 항체 및
ECHO
클론
해동 및 증식
5개의 상이한 세포주 각각을 37℃로 가열된 ProCHO4™ 배지에서 해동시켰다. 세포 현탁액을 800 rpm (160 G)에서 4분 원심분리시키고, 상층액을 분리하고, 세포 펠릿을 37℃에서 12 ml ProCHO4™ 배지 중에 재현탁시켰다. 그 후, 세포 현탁액을 T75 플라스크로 옮기고, 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터에 넣었다. 2일째에, 배양물을 진탕기 또는 50 ml 튜브 "바이오리액터"내에서 ProCHO4™ 배지 중에서 5.0 x 105개 세포/ml로 조정하였다. 세포 증식 동안, 세포 농도를 매주 2회 또는 3회에 걸쳐 0.5 x 106개 세포/ml로 조정하였다. 증식시킨 지 1주 후에, 5개의 세포주 각각을 무혈청 생산 배지 EX-CELL® 302 (SAFC) + 4 mM L-글루타민으로 옮겼다. 세포주를 500 ml 진탕기내의 60-80 ml 배지 중에서 0.5 x 106개 세포/ml로 셋업시키고, 바이오리액터 접종 전까지 2주간 배양하였다.
배양 및 정제 동안의 혼합
pH, 용존 산소, 온도, 공급 프로파일 및 가스 혼합을 자동 제어하며 6개의 500 ml 작업용 부피 바이오리액터 (DASGIP AG)에서 배양을 수행하였다. 6개의 바이오리액터 각각을 EX-CELL® 302 + 4 mM L-글루타민 중의 5.0 x 105개/ml의 생존가능한 세포로 접종하였다. 바이오리액터 실행 동안, 농축된 공급 용액, 글루타민 및 글루코오스가 보충된 EX-CELL® 302 배지를 500 ml의 최종 부피로 하여 하루 단위로 세포에 공급하였다. 13-14일 후 배양물을 수거하고, 정화 단계 (1942 G에서 15분간 원심분리) 후, 6개의 상층액 각각을 0.22 μm GP 익스프레스 플러스 멤브레인 필터(Express Plus Membrane Filter) (Millipore)를 통해 멸균 여과시켰다.
여과된 상층액 각각의 동일한 부피를 혼합하여 항체의 조성물을 수득하였다. 단백질 A 포획(Protein A capture)에 의해 항체 조성물을 정제하고, 이온 교환 크로마토그래피 (IEX)에 의해 분석하였다.
이온 교환 크로마토그래피에 의한 IgG 조성물의 분석
5-10 ml의 0.22 μm 여과된 항체 조성물을, 이를 1 ml MabSelect SuRe™ 컬럼 (GE Healthcare)상으로 로딩시킴으로써 친화성 정제하였다. 제조업자에 의해 기술된 바와 같이, 컬럼을 10 ml PBS (pH 7.4)로 세척하고, 0.1 M 글리신 (pH 2.7)을 사용하여 용리시켰다. 액타 익스프레스 시스템(Akta Express system) (GE Healthcare)상에서 정제를 수행하였다. 풀링된 단백질 물질을 40 mM NaCl, 50 mM Na-아세테이트 (pH 5.0)에 대해 2회 투석시키고, 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 전체 IgG 농도를 결정하였다.
80 μg IgG 혼합물을 PolyLC로부터의 약한 양이온 교환 컬럼 (PolyCat A, 100x4, 6 mm, 3 μm, 1500 Å)상으로 로딩시켰다. 72분에 걸쳐 1 ml/분의 흐름 속도로 Na-아세테이트 (pH 5.0) 중의 150 내지 500 mM NaCl의 구배를 적용함으로써 단백질을 용리시켰다. 용리액의 215 nm 흡광도를 모니터링하고, 신호를 적분함에 의해 개별 IgG들의 상대량을 결정하였다. 항체의 전체량을 100%로 설정하고, 5개의 항체 각각의 비율을 계산하였다.
HPLC에 의한 IgG 조성의 분석
제조업자의 지시사항에 따라 RX 데이토나 어낼라이저(Daytona analyzer) (Randox)와 면역비탁법(immunoturbidimetric method)을 사용하여 바이오리액터로부터의 상층액 샘플내의 IgG 함량을 분석하였다.
결과
6개의 500 ml 작업용 부피 바이오리액터에서 배양을 수행하였다. 6개의 바이오리액터 각각을 5.0 x 105개/ml의 생존가능한 세포로 접종하고, 배양한 지 13-14일 후에 수거하였다. 바이오리액터 배양 셋업, 수거시의 항체 농도 및 혼합 단계에서의 부피 분율은 표 5에 제공되어 있다. 수거시의 항체 농도는 클론의 상이한 특성으로 인해 달라진다. 동일한 클론을 사용한 2가지 배양물, 즉, CHM020-3과 CHM020-4는 수거시에 매우 유사한 항체 농도를 함유하였는데, 이는 공정 확고성(process robustness)을 나타낸다.
표 5. 배양 셋업, 수거시의 항체 함량 및 혼합 단계에서의 부피 분율.
정화 및 멸균 여과 후에, 모든 6개의 배양물을 동일한 부피로 혼합함으로써 항체들을 혼합하였다. 그 후, 친화성 크로마토그래피에 의해 항체 조성물을 추가로 정제하고, 양이온 교환 크로마토그래피 (CIEX)를 사용하여 분석하였다. CIEX 크로마토그래피에 의해 평가된 5개 항체 각각의 상대량은 표 6에 제공되어 있다
표 6. CIEX에 의해 정량된, 혼합 후의 각각의 항체의 상대량.
상기 표는 다음과 같은 사항을 나타낸다:
· 수 개의 항체가 폴리클로날 항체 조성물로 혼합될 수 있고, 설명된 절차를 사용하여 정제될 수 있다.
· 이러한 절차를 사용하여 수득한 폴리클로날 단백질은, 각각의 항체 함유 분획의 양을 조정함으로써 소정의 조성으로 조정될 수 있다.
실시예 3: 독립된 시드 트레인에 이은 바이오리액터에서의 단일-뱃치 페드 뱃치 생산
개관
6개의 상이한 세포 개체군을 계수하고, 동일한 세포 비율 (1:1:1:1:1:1)로 혼합하고, 바이오리액터를 시딩하기 위해 사용하였는데, 여기서 각각의 세포 개체군은 상이한 항체를 생산하였다. 세포들을 12일간 배양한 후, 이온 교환 크로마토그래피 (IEX)를 사용하여 바이오리액터내의 6개 항체 각각의 양을 정량하였다. 실험을 8회 반복하고, 혼합된 세포 배양물들 간의 변화를 조사하였다.
재료 및 방법
세포주
사용되는 세포주는 실시예 1에 기재된 ECHO 세포주였다.
항체 발현 플라스미드
중쇄 (VH + 감마 1 불변 영역)와 경쇄에 대한 코딩 영역이 스페이서 엘리먼트가 사이에 존재하는 2개의 동일한 헤드-투-헤드 사람 CMV 프로모터를 사용하여 발현되도록, 사용되는 IgG1 항체 발현 플라스미드를 작제하였다. 트랜스펙턴트의 선택은, 중쇄 코딩 서열의 다운스트림에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)에 의해 가동되는 마우스 디히드로폴레이트 리덕타아제 cDNA (DHFR) 카세트를 사용하여 수행하였다. 실험을 위해, 호흡기 세포융합(respiratory syncytial) (RS) 바이러스 항원 F 및 G에 대해 유도된 6개의 상이한 항체 (810, 816, 824, 853, 856 및 894로 번호매겨짐)를 선택하였다.
ECHO 세포의 트랜스펙션
트랜스펙션 방법은 실시예 1에 설명된 트랜스펙션 방법을 따른다.
무혈청 현탁 배양에 대한 적응
세포들을 트립신처리하고 계수하였다. 5.0 x 106개 세포를 원심분리하고, 10 ml ProCHO4™ 무혈청 배지 (Lonza) + 4 mM L-글루타민 (Invitrogen) + 1/100 MEM NEAA (Invitrogen) 중에 재현탁시켰다. 세포를 50 ml 세포 배양 튜브 (TRP, Switzerland)에 옮기고, 37℃에서 진탕기상에서 인큐베이션시켰다. 세포 밀도를 매주 2회 계수하고, 매번 배양액을 ml 당 0.5 x 106개 세포 (최초 2주간)로 또는 0.3 x 106개 세포 (나머지 기간 동안)로 희석시켰다. 4 내지 5주 후, 대부분의 클론에 대한 배가 시간은 30시간에 근접하였고, 이 시점에서 이러한 클론들이 무혈청 배양에 대해 적응한 것으로 간주되었다. 그 후, 세포들을 PowerCHO2™ 무혈청 배지 (Lonza) + 4 mM L-글루타민 (Invitrogen) + 1/100 MEM NEAA (Invitrogen)으로 옮겼다. 2-3주 후, 배가 시간이 35시간 미만이 된 경우, 세포들은 적응된 것으로 간주되었고, 그 후 ELISA에 의해 세포들을 항체 생산성에 대해 검정하고, 동결시키고, 발현 실험을 위해 사용하였다.
해동 및 증식
6개의 상이한 클론 각각을 37℃로 가열된 PowerCHO2™ 배지에서 해동시켰다. 세포 현탁액을 800 rpm (160 G)에서 4분 원심분리시키고, 상층액을 분리하고, 세포 펠릿을 37℃에서 12 ml PowerCHO2™ 배지 중에 재현탁시켰다. 그 후, 세포 현탁액을 T75 플라스크로 옮기고, 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터에 넣었다. 2일째에, 배양물을 진탕기 또는 50 ml 세포 배양 튜브내에서 PowerCHO2™ 배지 중에서 5.0 x 105개 세포/ml로 조정하였다. 세포 증식 동안, 세포 농도를 매주 2회 또는 3회에 걸쳐 0.5 x 106개 세포/ml로 조정하였다. 증식시킨 지 31일 후에, 6개의 클론 각각을 2개의 상이한 진탕 플라스크 (시리즈 A 및 B)에서 셋업시킴으로써, 전체 12개의 진탕 플라스크를 제공하는데, 이는 500 ml 진탕기내에 60-80 ml로 0.5 x 106개/ml를 함유한다.
배양
개별 항체 생산 세포주를 시드 트레인 증식시킨 지 총 35일 후, 4개의 바이오리액터 각각을 6개 클론의 혼합물로 시딩하였다. 이러한 실험을 2회 반복하여, 하기 설명되는 바와 같이 총 8개의 바이오리액터를 제공하였다. 요약하면, 혼합하기 전에, 각각의 클론을 3회 계수하고, 생존가능한 평균 세포 카운트를 사용하였다. 25.0 x 106개 세포에 상응하는 각각의 클론의 부피를 취하고, "6개 클론 믹스"를 철저히 혼합하고, 새로운 세포 카운트를 수득하였다. 이러한 세포 카운트를 기초로 하여, PowerCHO2™ 배지 + 20% (w/w)의 공급 배지를 첨가함으로써 0.3 x 106개/ml의 (혼합) 세포 농도를 지닌 500 ml 바이오리액터를 셋업시켰다. "6개 클론 믹스"의 나머지 부분을 IEX 프로파일 분석을 위해 샘플링하였다. 그 후, 바이오리액터를 30%의 DO, pH 7.0 ± 0.1, 80 rpm로 제어하며 배양하였다. IEX 프로파일링을 위해 4일, 8일 및 12일 후에 샘플을 취하였다.
8개의 바이오리액터
공정의 확고성 및 뱃치에 따른 일관성을 조사하기 위해, 12개의 진탕 플라스크로부터의 클론을 사용하여 다음과 같이 8개의 바이오리액터를 시딩하였다:
바이오리액터 1에 대해, 진탕 플라스크 시드 트레인 시리즈 A의 6개 클론 각각으로부터 세포들을 취하였다.
바이오리액터 2에 대해, 바이오리액터 1의 경우와 동일한 방식으로 진탕 플라스크 시드 트레인 시리즈 A로부터 독립적으로 세포들을 취하였다.
바이오리액터 3에 대해, 진탕 플라스크 시드 트레인 시리즈 B의 6개 클론 각각으로부터 세포들을 취하였다.
바이오리액터 4에 대해, 바이오리액터 1의 경우와 동일한 방식으로 진탕 플라스크 시드 트레인 시리즈 B로부터 독립적으로 세포들을 취하였다.
바이오리액터 5 내지 8에 대해, 바이오리액터 1 내지 4에 대해 설명된 바와 동일한 방식으로 독립적으로 세포들을 취하였다. 바이오리액터 5 내지 8은 바이오리액터 1 내지 4를 시딩한 지 2일 후에 시딩하였다.
항체 정제 및 IgG 조성의 CIEX 분석
5-10 ml의 0.22 μm 여과된 배지 상층액을 1 ml MabSelect SuRe™ 컬럼 (GE Healthcare)상으로 로딩하였다. 제조업자에 의해 기술된 바와 같이, 컬럼을 10 ml PBS (pH 7.4)로 세척하고, 0.1 M 글리신 (pH 2.7)을 사용하여 용리시켰다. 풀링된 단백질 물질을 40 mM NaCl, 50 mM Na-아세테이트 (pH 5.0)에 대해 2회 투석시키고, 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 전체 IgG 농도를 결정하였다.
60 μg IgG 혼합물을 PolyLC로부터의 약한 양이온 교환 컬럼 PolyCat A (100x4, 6 mm, 3 μm, 1500 Å)상으로 로딩시켰다. 72분에 걸쳐 1 ml/분의 흐름으로 Na-아세테이트 (pH 5.0) 중의 150 내지 500 mM NaCl의 구배를 적용함으로써 단백질을 용리시켰다. 용리액의 215 nm 흡광도를 모니터링하고, 신호를 적분함에 의해 개별 IgG들의 상대량을 결정하였다. 다양한 샘플을 비교하기 위해, 항체의 전체량을 100%로 설정하고, 6개의 항체 각각의 상대량을 계산하였다.
결과
혼합된 개체군을 함유하는 8개의 바이오리액터로부터의 상층액을 12일 후에 수거하고, 여과 및 단백질 A 포획 정제 후에 IEX 프로파일을 분석하였다. 각각의 항체의 상대 면적은 표 7과 도 4에 제공되어 있다.
표 7. 혼합된 개체군에서 배양한 지 12일 후의 각각의 항체의 상대 면적.
표 7은, 혼합된 배양물이 상이한 진탕 플라스크로부터의 클론으로 상이한 날에 시딩되었고 세포들이 서로 독립적으로 취해졌다는 사실에도 불구하고, 혼합된 배양물에서 생산된 6개 항체 각각의 양의 변화가 매우 작았음 (아마도 방법의 검출 한계에 속할 정도임)을 나타낸다.
도 4의 IEX 크로마토그램은 12일 배양 후의 각각의 항체의 상대량을 나타낸다. 바이오리액터 셋업시의 의도적 변화에도 불구하고, 8개의 바이오리액터내의 6개 항체 각각의 결과적인 분포는 매우 유사하였는데, 이는 공정이 확고하고 매우 반복가능함을 나타낸다. 또한, 본 실시예는 8개의 독립된 배양이 임의의 기술적 문제없이 수행될 수 있음을 입증해주는데, 이는 공정이 폴리클로날 항체 또는 다른 폴리클로날 단백질의 대규모 제조에 적합함을 제시한다.
실시예 4: 동물에서의 독립된 생산, DSP 이전의 혼합
IgG 중쇄 및 경쇄 유전자를 선택된 동물에 따라 적절한 발현 벡터내로 클로닝하였는데, 상기 2개의 유전자의 발현은 유선(mammary gland)으로 유전자 발현을 유도하는 베타 카제인 프로모터의 제어를 받으며 선택성 마커 유전자를 사용한다. 발현 작제물을 적절한 도너 세포주 (예를 들어, 태아 섬유아세포(fetal fibroblast cell))내로 트랜스펙션 (예를 들어, LipofectAMINE™ 또는 이와 유사한 물질을 사용함)시켰다. 적절한 배지에서 후속 배양함으로써 선택 마커 내성 세포를 선택하였다. 개별적인 세포주들을 PCR과 서던 블롯팅에 의해 검정하여 둘 모두의 트랜스진(transgene)의 존재를 검출하였다. 형광 인시튜(in situ) 하이브리드화 (FISH)에 의한 후보 세포주의 추가 특성화에 의해 중쇄 및 경쇄 트랜스진이 하나의 염색체상에 함께 존재(co-localization)함이 확인될 수 있었다. 올바르게 트랜스펙션된 세포주를 핵제거된(enucleated) 난모세포 (사이토플라스트(cytoplast))로의 전기융합(electrofusion)을 사용하는 체세포 핵 전달 (SCNT)에서 사용하였다. 그 후, SCNT 배반포(blastocyst)를, 수용(recipient) 동물의 황체(corpus luteum)를 지닌 자궁내로 전달하였다. 수용 동물을 무리에 돌려 보내어 수태(pregnancy) 결정을 위한 후속 평가를 기다렸다. 피부 생검조직의 PCR 분석에 의해 IgG H 및 L 유전자에 대해 자손을 분석하였다.
포지티브 클로닝된(positive cloned) 자손을 호르몬성 유즙분비(hormonal lactation)에 적용시키고, IgG 발현을 검정하기 위해 밀크를 짜내어 샘플을 수집하였다. 밀크의 IgG 수준이 만족스러운 클로닝된 동물을 생산 무리(production herd)를 위한 시조 동물(founder animal)로서 사용하였다. 이러한 방법을 사용하여 각각의 항체에 대한 무리를 생성시켰다. 이러한 일련의 무리로부터의 밀크를 ELISA (또는 이와 유사한 방법)에 의해 IgG 수준에 대해 검정하고, 홀드 탱크에서 약 4℃로 저장하였다. 정제 전에 밀크를 혼합하는 것은 IgG 수준을 기초로 하여 이루어질 수 있거나, 밀크 뱃치가 개별적으로 정제될 수 있다.
유사한 방법들이 온전한 식물에서의 제조에 적용될 수 있다.
Claims (33)
- 폴리클로날 단백질의 2개 이상의 별개의 단백질 구성원(member)을 포함하는 약제 생성물(drug product)을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은,
a) 2개 이상의 세포 개체군을 제공하는 단계로서, 여기서 각각의 개체군은 상기 폴리클로날 단백질의 하나의 별개의 구성원을 엔코딩하며 상기 단백질을 발현하는 세포와 배양 배지를 함유하는 물리적으로 독립된 용기에 들어있고, 여기서 상기 방법은 하기 단계 i) 내지 iii)을 포함하는 업스트림 파트(upstream part)를 포함하고:
i) 상기 2개 이상의 세포 개체군을 독립된 용기에서 하나 이상의 시드 트레인(seed train) 단계로 증식시키는 단계;
ii) 상기 시드 트레인으로부터의 세포를 하나 이상의 이노컬럼 트레인(inoculum train) 단계로 증식시키는 단계;
iii) 상기 단백질 구성원들의 발현에 유리한 조건하에서 생산기(production phase)에서 상기 이노컬럼 트레인으로부터의 세포를 배양함으로써, 상기 2개 이상의 별개의 단백질 구성원을 발현시키는 단계;
상기 2개 이상의 세포 개체군은 적어도 상기 시드 트레인 동안에는 독립된 상태로 유지되는, 2개 이상의 세포 개체군을 제공하는 단계;
b) 상기 발현된 단백질을 수거하는 단계;
c) 상기 수거된 단백질에 대해 1회 이상의 정제 단계를 수행하는 단계;
d) 정제된 약제 물질을 수득하는 단계; 및
e) 정제된 약제 물질을 폴리클로날 약제 생성물로 제형화하는 단계를 포함하는,
폴리클로날 단백질의 2개 이상의 별개의 단백질 구성원을 포함하는 약제 생성물을 제조하는 방법. - 제 1항에 있어서, 상기 2개 이상의 세포 개체군이, 적어도 상기 이노컬럼 트레인 이전까지 그리고 상기 이노컬럼 트레인 도중에 독립된 상태로 유지되는, 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 2개 이상의 세포 개체군이 적어도 상기 생산기 이전까지 그리고 상기 생산기 도중에 독립된 상태로 유지되는, 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 2개 이상의 세포 개체군에 의해 발현된 상기 2개 이상의 별개의 단백질 구성원이 적어도 상기 단백질을 수거하기 이전까지 그리고 상기 단백질을 수거하는 도중에 독립된 상태로 유지되는, 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 2개 이상의 세포 개체군에 의해 발현된 상기 2개 이상의 별개의 단백질 구성원이 적어도 1회 이상의 정제 단계 이전까지 그리고 1회 이상의 정제 단계 도중에 독립된 상태로 유지되는, 방법.
- 제 1항에 있어서,상기 2개 이상의 세포 개체군에 의해 발현된 상기 2개 이상의 별개의 단백질 구성원이 적어도 상기 약제 물질을 수득하기 이전까지 그리고 상기 약제 물질을 수득하는 도중에 독립된 상태로 유지되는, 방법.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 세포 개체군의 세포들이 동일한 개수로 배합되는, 방법.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 세포 개체군의 세포들이 상이한 개수로 배합되는, 방법.
- 제 8항에 있어서, 상기 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들을 거의 동일한 양으로 발현시킬 수 있는 폴리클로날 세포 개체군을 수득하도록, 상이한 개체군으로부터의 세포들이 배합되는, 방법.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 세포 개체군으로부터의 세포들이 소정의 비율로 혼합되는, 방법.
- 제 10항에 있어서, 상기 2개 이상의 세포 개체군으로부터의 세포들이, 상기 약제 물질 또는 생성물에서 상기 별개의 단백질 구성원들의 소정의 비율을 제공하는 비율로 배합되는, 방법.
- 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들의 세포 배양물로부터의 동일한 부피가 배합되는, 방법.
- 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원들의 동일한 양이 배합되는, 방법.
- 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리클로날 단백질의 2개 이상의 별개의 구성원이, 상기 약제 물질 또는 약제 생성물에서 상기 별개의 단백질 구성원들의 소정의 비율을 제공하는 비율로 배합되는, 방법.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 별개의 단백질 구성원이 1회 이상의 초기 정제 단계 동안 다른 구성원(들)과 독립된 상태로 유지되는, 방법.
- 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제조 방법의 독립된 파트(separate part)가, 2개 이상의 별개의 세포 개체군 및/또는 상기 2개의 별개의 세포 개체군에 의해 발현된 2개 이상의 별개의 단백질 구성원에 대해 병렬적으로 수행되는, 방법.
- 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제조 방법의 독립된 파트가, 2개 이상의 별개의 세포 개체군 및/또는 상기 2개 이상의 세포 개체군에 의해 발현된 2개 이상의 별개의 단백질 구성원에 대해 연속적으로 수행되는, 방법.
- 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a) 동안 배양을 위해 사용되는 용기가, 진탕 플라스크(shaker flask), 롤러병(roller bottle), T-플라스크, 및 재사용가능한(non-disposable) 바이오리액터와 1회용(disposable) 바이오리액터로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제조 방법의 독립된 파트가, 상이한 단백질 구성원들의 발현을 위해 동일한 배지 성분과 공정 파리미터(process parameter)를 사용하여 수행되는, 방법.
- 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 세포 개체군이, 상기 별개의 단백질 구성원들을 엔코딩하는 발현 벡터 서열의 차이를 제외하고는 동일한, 방법.
- 제 20항에 있어서, 상기 2개 이상의 세포 개체군이, 상기 별개의 단백질 구성원들의 가변 영역을 엔코딩하는 하나 이상의 발현 벡터 서열의 차이를 제외하고는 동일한, 방법.
- 제 20항에 있어서, 상기 폴리클로날 단백질의 하나 이상의 별개의 구성원이 하나의 불변 영역을 포함하고, 하나 이상의 다른 별개의 구성원이 상이한 불변 영역을 포함하는, 방법.
- 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리클로날 단백질의 하나 이상의 별개의 구성원이 하나의 당화 패턴을 포함하고, 하나 이상의 다른 별개의 구성원이 상이한 당화 패턴을 포함하는, 방법.
- 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리클로날 단백질이 3개 이상의 별개의 구성원을 포함하는, 방법.
- 제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리클로날 단백질이 분비되는, 방법.
- 제 25항에 있어서, 상기 폴리클로날 단백질이 폴리클로날 항체 또는 폴리클로날 항체 단편인, 방법.
- 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리클로날 단백질이 다량체 단백질(multimeric protein)인, 방법.
- 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 원핵 세포인, 방법.
- 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 진핵 세포인, 방법.
- 제 29항에 있어서, 상기 진핵 세포가, 식물, 효모, 진균, 척추동물 및 무척추동물로 구성된 군으로부터 선택된 진핵 생물로부터 유래되는, 방법.
- 제 29항에 있어서, 상기 진핵 세포가 포유동물 세포인, 방법.
- 제 31항에 있어서, 상기 포유동물 세포가, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, COS 세포, BHK 세포, 골수종 세포, NIH 3T3 세포, 섬유아세포, 양막 세포(amnion cell), 불멸화된(immortalised) 사람 세포, 예를 들어 HeLa 세포, HEK293 세포 및 PER.C6 세포로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 제조 동안 및/또는 정제 후에, 상기 폴리클로날 단백질의 각각의 구성원의 존재 및/또는 양을 확인하기 위한 하나 이상의 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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