CN102007146A - 用于制备多克隆蛋白质的方法 - Google Patents
用于制备多克隆蛋白质的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102007146A CN102007146A CN2009801131977A CN200980113197A CN102007146A CN 102007146 A CN102007146 A CN 102007146A CN 2009801131977 A CN2009801131977 A CN 2009801131977A CN 200980113197 A CN200980113197 A CN 200980113197A CN 102007146 A CN102007146 A CN 102007146A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- protein
- polyclone
- antibody
- kinds
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 242
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 222
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 151
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 70
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 19
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 275
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 48
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 44
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 35
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 28
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 claims description 27
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 claims description 26
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 26
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 26
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 25
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 20
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 19
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 7
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 7
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 5
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 5
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 5
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 claims description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 4
- 239000012533 medium component Substances 0.000 claims description 4
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 claims description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 2
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 claims 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 abstract description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 189
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 91
- 239000000047 product Substances 0.000 description 33
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 20
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 17
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 16
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 16
- 238000013411 master cell bank Methods 0.000 description 16
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 12
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 12
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 12
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 12
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 10
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 10
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 10
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 101710153593 Albumin A Proteins 0.000 description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 8
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 6
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 6
- 229960004249 sodium acetate Drugs 0.000 description 6
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 5
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 238000013331 inoculum cultivation Methods 0.000 description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 4
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 4
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 4
- 244000144980 herd Species 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 4
- 101100230376 Acetivibrio thermocellus (strain ATCC 27405 / DSM 1237 / JCM 9322 / NBRC 103400 / NCIMB 10682 / NRRL B-4536 / VPI 7372) celI gene Proteins 0.000 description 3
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 3
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 3
- 239000000306 component Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- -1 glucose or lactose) Chemical class 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 210000000688 human artificial chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 238000012784 weak cation exchange Methods 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 2
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 2
- 101710197208 Regulatory protein cro Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 108700007696 Tetrahydrofolate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 108010075344 Tryptophan synthase Proteins 0.000 description 2
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 2
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 239000012512 bulk drug substance Substances 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 2
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 2
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010374 somatic cell nuclear transfer Methods 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 2
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010045123 Blasticidin-S deaminase Proteins 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 101100495352 Candida albicans CDR4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101001091269 Escherichia coli Hygromycin-B 4-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 101150003028 Hprt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 description 1
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 101150062031 L gene Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 101100261636 Methanothermobacter marburgensis (strain ATCC BAA-927 / DSM 2133 / JCM 14651 / NBRC 100331 / OCM 82 / Marburg) trpB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710202061 N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000007339 Nerve Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010032605 Nerve Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 101100124346 Photorhabdus laumondii subsp. laumondii (strain DSM 15139 / CIP 105565 / TT01) hisCD gene Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 208000018569 Respiratory Tract disease Diseases 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 101001091268 Streptomyces hygroscopicus Hygromycin-B 7''-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102100037116 Transcription elongation factor 1 homolog Human genes 0.000 description 1
- 102000002070 Transferrins Human genes 0.000 description 1
- 108010015865 Transferrins Proteins 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 108010027570 Xanthine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- BOXNENYOGRMVAM-UHFFFAOYSA-L [Na+].[Na+].[O-]P([O-])(Cl)=O Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]P([O-])(Cl)=O BOXNENYOGRMVAM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N ac1ldcw0 Chemical compound Cl.C1CN(C)CCN1C1=C(F)C=C2C(=O)C(C(O)=O)=CN3CCSC1=C32 LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 238000010372 cloning stem cell Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 229940052810 complex b Drugs 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000011038 discontinuous diafiltration by volume reduction Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000012444 downstream purification process Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 208000030172 endocrine system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007159 enucleation Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 101150113423 hisD gene Proteins 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-FWAVGLHBSA-N hygromycin A Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](C(=O)C)O[C@@H]1Oc1ccc(\C=C(/C)C(=O)N[C@@H]2[C@@H]([C@H]3OCO[C@H]3[C@@H](O)[C@@H]2O)O)cc1O YQYJSBFKSSDGFO-FWAVGLHBSA-N 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012499 inoculation medium Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 150000002505 iron Chemical class 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004719 natural immunity Effects 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000010458 rotten stone Substances 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007390 skin biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 101150081616 trpB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150111232 trpB-1 gene Proteins 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000021247 β-casein Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
- A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
Abstract
本发明涉及用于制备药物产品的方法，所述药物产品包含多克隆蛋白质(例如多克隆抗体)的至少两种独特成员，其中每种独特成员是通过不同细胞群体表达的。该方法至少牵涉初始步骤，其中分开培养表达多克隆蛋白质的独特成员的细胞群体。在上游或下游加工以后的点组合各细胞群体或由各细胞群体表达的蛋白质以产生包含多克隆蛋白质的独特成员的单一药物产品。
Description
发明领域
本发明涉及用于制备药物产品的方法，所述药物产品包含多克隆蛋白质的至少两种独特(distinct)成员。该发明至少牵涉表达多克隆蛋白质的独特成员的细胞的初始分开培养步骤。在上游加工以后的点或下游加工前或过程中组合细胞系或蛋白质制备物，最终结束于包含多克隆蛋白质的至少两种独特成员的一种药物产品。
发明背景
重组多克隆蛋白质的制备是一项相对较新的技术。大多数重组药物产品使用源自表达想要产物的一种克隆细胞的选定细胞系制备为单克隆产品。在此情况中，上游和下游制备方法可以针对特定的单克隆药物产品进行优化。
最近多年中已经开发出用于制备重组抗体和其它蛋白质产物的节省成本的方法，其在体内使用在奶(哺乳动物)或蛋(鸡)中表达重组产物的转基因动物或者遍及整个植物或者在不同器官(块茎、种子、叶)中表达重组产物的转基因植物来进行。然而，还没有改编这些方法来制备多克隆蛋白质产物。
WO 2004/009618中披露了一种用于制备多克隆药物产品的方法，其关注表达具有相同的轻链的抗体的单克隆细胞系的用途。根据此文件，抗体的混合物可以通过在编码常见的轻链的核酸序列和编码至少两种能够与常见的轻链配对且具有不同可变区的不同重链的核酸序列的重组宿主中表达来生成。
WO 2004/061104提供了WO 2004/009618中所述方法固有的使重和轻抗体链混杂的问题的解决办法，其通过使用定点特异整合来仅使一个表达构建体整合在基因组的特定位置来进行。这种解决办法使得能够生成多克隆制备细胞系，其能够表达多克隆蛋白质的独特成员，从而可以使用在一个生物反应器中扩充的一种细胞库在单一批次中制备多克隆蛋白质，例如多克隆抗体。随后，使用一种下游纯化方法来纯化上清液，产生配制成一种药物产品的一种药物物质。使用这种方法制备的重组多克隆抗体的例子包括重组多克隆抗猕猴D抗体(WO 2006/007850)和重组多克隆抗牛痘病毒抗体(WO2007/065433)。
WO 2008/145133披露了一种依靠随机整合来制备重组多克隆蛋白质组合物，特别是重组多克隆抗体组合物的方法，其中在避免将表达载体定点整合入细胞的基因组中的条件下各包含编码多克隆蛋白质的独特成员的至少一个拷贝的独特核酸的一套表达载体分开转染宿主细胞。
尽管在制备多克隆蛋白质中的这些进展，仍然需要提供备选的制备方法，例如对于多克隆蛋白质的一个或多个成员需要用于表达和/或纯化的特定条件的情况，或者对于优选不同上游加工的条件。
发明概述
在第一方面，本发明涉及一种用于制备药物产品的方法，所述药物产品包含多克隆蛋白质的至少两种独特的蛋白质成员，所述方法包括下列步骤：
a)提供至少两个细胞群体(two populations of cells)，其中每个群体编码所述多克隆蛋白质的一种独特成员，并且装入包含培养基和表达所述蛋白质的细胞的物理上分开的容器中，其中所述方法包括上游部分，其包括下列步骤：
i)在分开的容器中在种子培养(seed train)的一个或多个步骤中扩充所述至少两个细胞群体；
ii)在接种物培养的一个或多个步骤中从所述种子培养物扩增细胞；
iii)在促进所述蛋白质成员表达的条件下在生产期中从所述接种物培养物培养细胞，从而表达所述至少两种独特的蛋白质成员；
其中至少在所述种子培养期间将所述至少两个细胞群体保持分开；
b)收获所表达的蛋白质；
c)对所收获的蛋白质实施至少一个纯化步骤；
d)获得纯化的药物物质；并
e)将纯化的药物物质配制成多克隆药物产品。
方法的特征化特征在于至少在细胞扩充的初始阶段过程中在物理上分开的容器中将各编码多克隆蛋白质的一个独特成员的所述至少两个细胞群体保持分开。在如本文中会描述的其它实施方案中，在较长的部分期间或者在上游加工的整个部分期间将表达多克隆蛋白质的独特成员的细胞群体保持分开。在又一些实施方案中，在下游加工的部分或者可能为整个下游加工期间将多克隆蛋白质的表达的独特成员保持分开，所述下游加工在获得纯化的药物物质时完成。下文更为详细地描述不同实施方案的优点。
可以将所述至少两种不同细胞群体保持分开，至少直到和包括所述接种物培养，并且在别的实施方案中，将所述至少两种不同细胞群体保持分开，至少直到和包括所述生产期。
可以进一步将由所述至少两个细胞群体所表达的所述至少两种独特蛋白质成员保持分开，至少直到和包括所述蛋白质收获，使得可以分开收获每种独特的成员。
在一些实施方案中，将由所述至少两个细胞群体所表达的所述至少两种独特蛋白质成员保持分开，至少直到和包括至少一个纯化步骤，容许不同独特成员的不同初始纯化步骤。例如，可以将蛋白质成员保持分开，至少直至和包括亲和层析步骤。
本发明还包括如下的实施方案，其中将由所述至少两个细胞群体所表达的所述至少两种独特蛋白质成员保持分开，至少直到和包括获得所述药物物质。
作为在不同容器中在单细胞的生物体中生成多克隆蛋白质的备选，可以在物理上分开的单元中以多细胞生物体形式进行生成，每种多细胞生物体表达多克隆蛋白质的一个成员。这些多细胞生物体可以是植物，在此情况中物理上分开的单元是植物或植物器官。多细胞生物体也可以是转基因非人动物，诸如已经进行过遗传修饰以表达多克隆蛋白质的独特成员并将其分泌到蛋(egg)的禽(bird)。或者，转基因非人动物可以是哺乳动物，其中将多克隆蛋白质的独特成员分泌到奶。例如，哺乳动物可以是绵羊、山羊、母牛(cow)、骆驼或水牛。
定义
哺乳动物细胞，例如CHO(中国仓鼠卵巢)细胞中的蛋白质生成可以采用半连续方法，由此在“种子培养”中培养细胞达多个时间期限，并且随后将它们转移到接种物发酵罐(“接种物培养”)以启动在感兴趣的蛋白质的较大规模生成途中的细胞扩增过程。如此，用于蛋白质生产的细胞处于培养中达多个时间期限，直至最大的预先规定的细胞龄(cell age)。细胞培养方法的参数，诸如种子密度、pH、DO2和温度、生产培养的持续时间、收获的操作条件等是所使用的特定细胞系和培养基的函数，并且可以凭经验确定，而无需过度实验。为了本发明的目的，“种子培养”阶段包括来自融化细胞的步骤和初始扩增步骤。这些步骤通常在培养皿、摇瓶、T-烧瓶、塑料袋、旋转器烧瓶、离心管、多孔板、转瓶、或其它瓶，即没有装备有将样品从一个容器转移到另一个的管道的容器中进行。在用来自“种子培养”的细胞接种第一生物反应器或发酵罐(钢生物反应器或一次性生物反应器)时开发“接种物培养”。一旦已经将细胞转移到接种物生物反应器，向其它生物反应器的后续转移通常通过密闭的管道系统发生，所述密闭的管道系统容许细胞从一个容器抽到另一个。
“药物产品”意为完成的剂量形式，例如片剂、胶囊、溶液或冻干的产物，其含有一般但不必要与一种或多种其它成分联合的“药物物质”。“药物物质”通常以大批次制备，它随后通过将其与其它成分组合而被制备成“药物产品”。在本发明的上下文中，药物产品会含有最终的多克隆蛋白质混合物，其包含多克隆蛋白质的独特成员。根据特定的制备方案(scenario)，药物物质也可以是含有多克隆蛋白质的所有独特成员的多克隆混合物，或者药物物质可以含有一种或仅仅一些多克隆蛋白质的独特成员。在后一种情况中，会将两种或更多种药物物质配制成单一的药物产品。
术语“容器”或“器皿”指适合于体外培养细胞的器皿或容器。容器例子包括培养皿、摇瓶、T-烧瓶、塑料袋、旋转器烧瓶、离心管、多孔板、转瓶(roller bottle)、其它瓶、钢的生物反应器或其它非一次性生物反应器、和塑料或其它一次性生物反应器。
“蛋白质”或“多肽”是指任何氨基酸链，不管长度或翻译后修饰。蛋白质可以单体或多聚体形式存在，所述多聚体包含两个或更多个装配的多肽链、蛋白质片段、多肽、寡肽或肽。
如本文中所使用的，术语“多克隆蛋白质”或“多克隆性”是指包含不同但是同源的蛋白质分子的蛋白质组合物，优选地，选自免疫球蛋白超家族。如此，各蛋白质分子与所述组合物的其它分子同源，但也含有一段或多段可变多肽序列，其特征在于多克隆蛋白质的单独(individual)成员之间的氨基酸序列的差异。已知的这类多克隆蛋白质例子包括抗体或免疫球蛋白分子、T细胞受体和B细胞受体。多克隆蛋白质可能由确定的蛋白质分子亚类构成，所述蛋白质分子亚类通过共同特征诸如对想要的靶标共享的结合活性进行定义，例如在针对想要的目的抗原的多克隆抗体的情况下。
术语“重组多克隆蛋白质的独特成员”指蛋白质组合物中的一个蛋白质分子，所述蛋白质组合物包含不同的但同源的蛋白质分子，其中各蛋白质分子与组合物的其它分子同源，但也含有一段或多段可变多肽序列，其以所述多克隆蛋白质的单一成员之间的氨基酸序列差异为特征。
编码多克隆蛋白质的一种独特成员的每个“细胞群体”源自单个单克隆细胞库或单克隆细胞培养物，其中所述单克隆细胞库或单克隆细胞培养物源自单细胞，如本文中在别处描述的。
如本文中所描述的，术语“收获”指收获含有所表达的蛋白质的上清液，而一般认为用于从所述上清液分离想要的蛋白质的后续步骤(包括澄清)是纯化步骤。
术语“抗体”描述血清的功能性组分并且通常称为分子(抗体或免疫球蛋白)集合或一个分子(抗体分子或免疫球蛋白分子)。抗体分子能够结合到或与特定抗原决定簇(抗原或抗原表位)反应，这反过来可以导致免疫效应物机能的诱导。单个抗体分子通常被认为是单特异性的，而抗体分子组合物可以是单克隆的(即，由相同的抗体分子构成)或多克隆的(即由不同的抗体分子构成，所述不同抗体分子与同一抗原或甚至独特的、不同抗原上的相同或不同的表位起反应)。各抗体分子具有使其特异性结合到其相应的抗原的独特结构，并且所有天然抗体分子具有两条一致的轻链和二条一致的重链的相同的总体基本结构。抗体也统称为免疫球蛋白。如本文中所使用的，术语抗体也意图包括嵌合的和单链抗体，以及抗体的结合片段，诸如Fab、Fv片段或scFv片段、和多聚体形式，诸如二聚体IgA分子或五价IgM。
术语“免疫球蛋白”通常用作在血液或血清中找到的抗体混合物的集合名称，但也可用于指明源自其它来源的抗体混合物。
术语“多克隆抗体”描述了不同抗体分子的组合物，所述不同抗体分子能与几种在相同或不同抗原上的不同特异性抗原决定簇结合或反应。通常地，多克隆抗体的可变性被认为位于所谓的多克隆抗体可变区。然而，在本发明上下文中，要理解多克隆性也描述单一抗体分子之间存在于所谓恒定区上的差异，例如在包含二个或更多个抗体同种型诸如人类同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2，或鼠同种型IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA的抗体混合物的情况中。如本文中所使用的，术语“多克隆抗体”也可以认为两种或更多种单克隆抗体的混合物。
术语“感兴趣的变体核酸分子的文库”用于描述共同编码“感兴趣的重组多克隆蛋白质”的核酸分子集合。在用于转染时，感兴趣的变体核酸分子的文库包含在表达载体的文库中。所述文库通常具有至少3、5、10、20、50、1000、104、105或106个独特的成员。
如本文中所使用的，术语“可操作连接的”指当被置于与另一区段的功能关系时，与该另一区段连接的区段。例如，若编码信号序列的DNA被表达为参与多肽转移至内质网的前导，则该编码信号序列的DNA与编码该多肽的DNA可操作连接。还有，若启动子或增强子刺激编码序列的转录，则该启动子或增强子与该编码序列可操作连接。
术语“转染”在本文中用作将外来DNA导入细胞的广义术语。所述术语也想要涵盖其它将外来DNA导入细胞的功能等同的方法，诸如转化、感染、转导或供体细胞和受体细胞的融合。
术语“可变多肽序列”和“可变区”可互换使用。
术语“头对头启动子(head-to-head promoters)”指被置于非常近距离的启动子对，以使由所述启动子驱动的两个基因片段转录以相反的方向发生。头对头启动子也可以用由两个启动子之间不相关核酸构成的填充物来构建。此填充物片段可以容易地含有超过500个核苷酸。头对头启动子也可以称作双向启动子。
术语“植物”指作为植物界成员的生物体。为了本发明的目的，植物包括植物中植物的独立生长所需要的那些器官(例如根、茎、叶)。当术语植物意图涵盖分离的植物细胞时，这被明确规定。
附图简述
图1：本发明的生产方案的示意图(不同的种子/接种物培养)。
图2：本发明的另一种生产方案的示意图(不同的生产阶段)。
图3：在混合群体中培养7天后六种抗牛痘抗体之每一种的相对区域(关于详情，参见实施例1)。
图4：在混合群体中培养12天后六种不同抗RSV抗体的相对量(参见实施例3)。
发明详述
可以以单批生产进行重组多克隆抗体的制备，所述重组多克隆抗体在通过表达构建体的整合生成的生产者细胞中表达。有利地，对各细胞系或细胞克隆适当地选择相似的生长率，之后在一个培养容器中混合细胞系以避免一种或几种细胞系的长出。
可能有这样的情况，其中证明难以或不可能以想要的方式比对各细胞系的生长率，例如如果特别想要的重组蛋白/抗体的生成以反方向影响细胞系的生长率。还有，可能有这样的情况，其中多克隆蛋白质的不同成员的非常独特的比率是想要的。例如，此类情况可以是其中组合物中非常不等量的多克隆蛋白质成员是想要的，例如由于对靶物的不同亲和力。例如，如果以例如20∶5∶1∶1∶1∶0.5的个体成员间比率含有六种蛋白质成员的多克隆组合物是想要的，那么通过在制备过程的至少一部分期间保持独特的成员分开来控制和获得所述组合物会是更可行的。另一个例子可在如下的情况中，其中已经使用两种或更多种不同亲本细胞系来转染和表达独特的重组产物，在此情况中两种或更多种细胞系的细胞培养条件可以是不同的，例如对于扩增细胞和/或表达多克隆蛋白质的独特成员最佳的培养基成分。
一种用于制备此类重组蛋白的备选方法是至少在上游过程的种子培养部分期间将细胞系保持分开，所述方法可以有助于避开要求各表达细胞系的相似生长率。然后可以在较晚的阶段，例如接种物培养前或过程中，或者生产阶段前或者过程中组合表达不同抗体的细胞系。此方法的一个优点在于混合细胞培养物的群体加倍数目可以得到显著降低，这使其更容易控制多克隆蛋白质的各成员在最终的药物产品中的比率，即使各细胞系展现出不同的生长率。可以在下游加工的一个或多个步骤过程中继续分开制备，并且甚至可以将独特的蛋白质成员保持分开，直至药物物质已经被纯化到要求的程度的点。在后一种情况中，然后组合药物物质以形成最终的药物产品，其包含多克隆蛋白质的至少两种独特成员，诸如靶向相同或不同抗原的两种或更多种不同抗体。
本发明的一项重要要素在于组合是在细胞系生长过程中发生，还是在已经从细胞系分离出蛋白质的点时发生，最终产物总是单一多克隆药物产品，其包含多克隆蛋白质的至少两种独特成员，诸如靶向相同或不同抗原的两种或更多种不同抗体。
在一个实施方案中，将多克隆蛋白质的各成员保持分开，直至收获含有各重组蛋白的上清液。然后混合这些产物，之后进行下游纯化以简化CMC过程并降低成本。
在不能使用相同的方法来纯化多克隆蛋白质的各成员的情况中，也可以在下游纯化过程期间的较迟阶段或者甚至在完成纯化后混合它们，之后制备最终的药物产品。
会显而易见的是，会在不迟于配制多克隆药物产品过程中将多克隆蛋白质的各成员(如果不在较早的阶段混合或者不在混合两种或更多种细胞群体后一起制备)混合在一起。
通过在低成本设备诸如一次性生物反应器(例如Wave袋，其是在许多不同袋大小上在商业上可获得)中培养来优先完成生成最终产品的成分之每种的各表达细胞系的制备，但是在各生产运行的体积为低的，例如50L以下或者优选20L或10L以下的情况中运行多个非一次性生物反应器也是有可能的。优先地，平行地完成从各细胞系之每种培养重组蛋白，但是也可以在两个或更多个组中序贯进行。
如下获得每种制备容器(例如Wave袋或其它类型的生物反应器)的接种材料，即首先制备每种个别蛋白质生产者细胞系或克隆的主细胞库(Master Cell Bank，MCB)，潜在地接着为工作细胞库(Working Cell Bank，WCB)。使用来自WCB(或MCB)之每种的小瓶来接种分开的培养容器。将种子培养设计用于扩增这些细胞系之每种，直至已经获得足以接种接种物生物反应器的细胞。
当可行时，优先地，使用相同条件来进行制备的不同部分以表达不同的蛋白质成员，例如包括相同的培养基成分和所添加的进料溶液(诸如葡萄糖、谷氨酰胺、潜在的选择剂，诸如G418、维生素、矿物、蛋白质、水解产物等)以及培养过程参数诸如pH、DOT(溶解氧张力)、CO2压力和温度。这是重要的，以便促进质量控制过程，其中需要解决诸如宿主细胞蛋白质降低、所添加选择剂的除去和所添加生长因子的除去等因素。它也是高度重要的，以便获得对重组蛋白的类似的翻译后修饰，诸如糖基化样式。
类似地，优选地，使用类似的柱、缓冲液、洗脱谱(elution profile)等来以可能的程度进行纯化的任何不同部分。
为了实现平稳的、成本和时间有效的下游和分析过程，多克隆组合物中各种独特的蛋白质成员的物理-化学特征尽可能地相似是优选的。这通过将分子的恒定部分保持相同来最好地确保。在抗体的情况中，优先使用相同的表达载体来生成各种重组抗体分子之每种，并且优先地，这些的一级序列分别仅在重链和轻链的可变区上有所不同。在最优选的方案中，抗体分子的恒定部分(如由表达构建体编码的)对于多克隆抗体组合物的所有成员(例如IgG1同种型分子)是完全相同的。另外，优选地，轻链也是相同类型的，在人抗体的情况中或是κ或是λ。将抗体分子的主要部分保持尽可能地相同使重组抗体能够使用一种方法来纯化至高纯度，而没有丧失多样性的风险。它还促进建立表征、质量控制和所制备药物产品的推广所需要的分析方法。
蛋白质纯化过程(process)通常是一种多步骤过程，其基于抗体或其它蛋白质分子的物理-化学特征开发，并且对于每个步骤，有丧失多样性的风险，即有丧失一种或多种各产品成分的风险。该过程可以包括例如数个层析步骤，包括可以是蛋白A或者蛋白G结合的捕捉步骤、阴离子交换层析步骤和基于疏水性相互作用的层析步骤。它可以进一步包括于低pH的温育以及数个过滤步骤。对于本领域技术人员明显的是，各分子间的这些中任何的物理-化学特征的差异可以阻止纯的且多种多样的多克隆抗体产物的成功回收。
关于分析质量控制方法，对于本领域技术人员明显的是，获得重组抗体产品的规章批准所必需的所有表征测定法(例如肽作图、大小排阻、SDS-PAGE、Western印迹、氨基酸分析、二硫化物桥和游离的氢硫基基团的定位和单糖和寡糖表征)可以证明难以以令人满意的程度进行，如果恒定区在分子间不是相同的或相似的话。用于重组多克隆抗体和其它多克隆蛋白质的结构表征和用于表达此类多克隆蛋白质的多克隆细胞系的表征的方法披露于WO 2006/007853。
不同的制备方案
培养容器中的重组体表达
培养的哺乳动物细胞由于其正确折叠、装配和翻译后修饰的能力而已经变为用于制备供临床应用的重组蛋白的主要系统。已经采用了两种主要的形式来在哺乳动物细胞中生成重组蛋白：贴壁细胞的培养物和悬浮培养物。后一种是到目前为止最常见的。
在简单批次或补料分批生产过程中，放大到非常大的体积可以通过将生物反应器的内容物稀释到较大反应器中保持预热的5-20个体积的新鲜培养基中来发生。从融化储存的细胞到实际的大规模生产的过程由三个分开的阶段组成：种子培养、接种物培养和生产阶段。通常在较小的细胞培养容器中进行种子培养，其从融化储存的细胞后立即的几mL培养物的小体积开始，并且直至数升的细胞培养物，诸如5-100L培养物，以在选择用于生产的时期期间为放大提供新鲜的细胞。当将种子培养过程中生成的细胞悬液转移到接种物反应器(也称作种子反应器)时开始接种物培养，并且扩充其体积，使得生成足够的细胞数目用于接种最终的生产生物反应器(Wurm，2004，Nature Biotechnology，22(11)：1393-1398)。
为了制备单克隆重组蛋白，在种子培养阶段中或者在接种物反应器中维持融化的细胞达延长的群体加倍数目通常是有可能的。这提供了用自相同的安瓿融化的细胞接种超过一个生产生物反应器的可能性，而且它还为如下的情况提供了备份细胞(backup cell)，其中制备受到延迟，例如由于技术问题。然而，当制备重组多克隆蛋白质时，对世代数目设置严格的限制并对世代数目维持彻底的控制是必要的，并且将来自多克隆细胞库的种子培养维持延长的时间期限通常是没有可能的。这是由于如下的实情，即即使在不同细胞系的生长率尽可能接近地匹配时，多克隆细胞组合物中的各细胞系总会展现出略微不同的生长和生产率，导致在延长的培养时期里组合物的漂移。这向制备过程添加比单克隆蛋白质制备过程更多的约束和更少的灵活性，而且可以导致制备失败的风险更高，例如在导致延迟的关于生产反应器的技术问题的情况中。
在批次或补料分批制备(其是用于制备重组抗体的优选技术)的情况中，大多数群体加倍实际上在接种生产反应器前发生。典型的上游过程就群体加倍而言可以像这样：为了通过扩增来自pMCB的小瓶来生成pWCB，需要8-12个群体加倍。种子培养扩增通常会需要10-20个加倍，这取决于最终的制备规模，而在接种物反应器中发生的群体加倍的数目通常会是2-5个世代。在补料分批生产反应器中，细胞经历相对较低数目的世代，诸如5-8。整个地，在使用起始于多克隆主细胞库的单批制备过程时需要约25-43个世代来完成上游过程。这些之中，约20-37个群体加倍在接种生产容器前发生。会显而易见的是，混合培养期间越短，控制和维持想要的组分比率越可行。如此，对于难以获得类似的生长率或者获得非常窄的限度的组分比率是至关重要的多克隆产物，在制备过程的初始阶段期间在分开的容器中维持各种细胞系并在晚期点时及时混合细胞会是有利的。
通常使用表达异源或内源蛋白质产物的分离的细胞通过在有利于蛋白质产物表达的条件下在液体或半固体培养基中培养这些细胞来在体外表达重组蛋白产物。这些方法对于表达分泌型蛋白质产物是特别有利的，因为这些可以容易地从细胞分离，作为蛋白质纯化的第一步。
用于培养的容器可以例如选自下组：摇瓶、转瓶、T-烧瓶、和一次性或非一次性生物反应器。在优选的实施方案中，容器包括一种或多种一次性容器。一次性容器可以包括所谓的Wave袋，其在范围为10L和直至超过1000升的不同大小上可获自许多制造商。合适的一次性生物反应器包括但不限于BIOSTAT
CultiBag(Sartorius Stedim Biotech)、Cell Maker Lite2TM(Cellexus Biosystems)、Biowave
(Wave Biotech AG)、Wave Biotech LLC(GE Healthcare)袋、一次性生物反应器S.U.B.(Hyclone Thermo Fisher Scientific)和FlexFactoryTM(Xcellerex)。因为本发明牵涉对平行或系列制备中的多克隆蛋白质的独特成员使用分开的生物反应器，用于上游过程的至少一部分，使用相对便宜的一次性生物反应器替代昂贵的钢罐是有利的。另外，一次性生物反应器将灵活性添加到本发明的方法，因为与使用多次使用的钢罐相比，更容易且花费更少地增加生物反应器的数量。
虽然已经开发出方法来表达多克隆蛋白质的不同成员，在一些情况中，这些方法是不适当的。例如如果多克隆蛋白质包含不能使用相同的下游过程方法纯化的不同蛋白质成员，那么在单一批次中表达独特成员没有优点。还有，如果出于一些原因，希望在特定的细胞类型中表达一种独特的成员而在另一种细胞类型中表达其它成员，那么单一批次制备是较不优选的。
最后，可以有如下的情况，其中表达多克隆蛋白质的不同成员的不同细胞克隆的表达水平和/或生长率的差异如此之大以至于在多克隆细胞库中组合不同克隆是不利的。
分开的种子培养
本发明的一个实施方案依赖于具有分开的培养容器中融化的不同单克隆细胞库，从而可以对表达多克隆蛋白质的独特成员的每个克隆使用最佳的融化和适应条件。在融化和适应的这些初始步骤过程中，细胞的生存力在压力下，并且即使这些早期步骤中各克隆间存活率的次要差异也可以对最终产品中的蛋白质成员的相对分布具有显著的影响。
根据本发明的此实施方案，在融化、适应和种子培养扩增过程中将表达多克隆蛋白质的不同成员的各生产者细胞系保持分开。然后可以根据想要的标准来混和克隆，并在一个单一批次中培养，用于接种物培养、生产阶段、收获和下游加工。
分开的接种物培养
在别的实施方案中，将表达多克隆蛋白质的不同独特成员的不同克隆保持分开，直至和包括接种物培养(图1)。根据此实施方案，在生产阶段开始时每个单独的生产者细胞系有可能具有相同的细胞数目。如上文所提及的，多克隆阶段在此实施方案中是相对较短的，具有有限数目的细胞分裂，从而细胞克隆间生长率的任何差异会对组合物具有有限的影响。这样，更容易组合不同的个体生产者细胞系以在生产阶段结束时获得多克隆蛋白质的独特成员的预先确定的分布。
使用分开的种子培养，并且特别是使用分开的种子培养和分开的接种物培养的一项重要优点在于从合并不同克隆的点直至生产阶段结束的世代数目是降低的。因此，使将不同细胞克隆合并并且培养在一起的世代的总数目最小化。这容许批次间在最终产物中更大的总体稳定性和一致性，并且如此对最终结果更大程度的控制，因为有更少的如下世代，其中一个或多个克隆具有长得比不同细胞克隆的混合物中的其它克隆快或者在生产上超过不同细胞克隆的混合物中的其它克隆的可能性。
此办法与例如使用多克隆主细胞库相比的另一项优点在于它容许根据需要在改编多克隆混合物中更大的灵活性。例如，如果发现多克隆MCB中的细胞克隆之一是不稳定的或者在其它方面欠佳，那么会不得不再创建整个多克隆MCB。比较而言，本发明容许以较少的时间和努力除去或者备选地用生成相同蛋白质的新克隆替换单个欠佳的克隆。它还使得有可能相对容易地将生成新蛋白质的新克隆添加到生成已建立的多克隆蛋白质的克隆的现有混合物。另外，此办法使得更容易提高生产阶段，同时使最终的蛋白质组合物中的变化风险最小化，例如使用Wave袋或其它一次性生物反应器进行种子和接种物培养。
又一项优点在于一旦已经鉴定出多克隆蛋白质的想要的独特成员便更快速地移入多克隆抗体或其它治疗性蛋白质的临床前开发的可能性。这是由于一旦已经鉴定出合适的个体蛋白质成员，仅必需测试个体克隆的稳定性，然后可以直接使用所述个体克隆来进行生产目的，即也不必在多克隆主细胞库和多克隆工作细胞库的稳定性研究上花费额外的时间。此外，对于临床前和临床I/II期测试，基于MCB进行制备，而不必在WCB的生成和测试上花费时间也可以是有可能的。
分开的生产阶段
在又一个实施方案中，也分开对多克隆蛋白质的独特成员实施生产阶段(图2)。这容许在不同的细胞类型中和/或在不同的条件下表达不同成员，而且还容许如下的情况，其中不能在一种且相同的方法中对多克隆蛋白质的多有独特成员实施完整的下游加工。此方案还提供了关于对表达平台选择多克隆蛋白质的独特成员的完全自由。
如此，例如，可以在酵母细胞中表达一种成员，而可以在哺乳动物细胞中表达一种。或者/另外，例如可以在分离的植物细胞中在体外表达一种蛋白质成员，并且可以在细菌中表达一种，若想要这样的话。本领域中已知的是，不同物种导致对所表达蛋白质的不同的翻译后修饰。这样，可以制备具有此类不同翻译后修饰的产物，并进行一种常见的或部分常见的下游加工。
此制备方案还使不同培养模式能够用于多克隆蛋白质的不同成员。可以使用批次方法来制备一种成员，而可以使用补料-分批或者灌注方法来制备其它成员。
多克隆蛋白质的独特成员具有分开的生产阶段的别的优点在于可以以预先确定的比率混合或组合独特的蛋白质成员，之后进行下游加工。这降低任何偏斜的分布，其可以潜在地由增殖率和/或表达水平的差异引起。
别的优点在于可以进行独特的蛋白质成员的连续制备。这容许在一个或几个生物反应器中制备具有许多独特的蛋白质成员的复杂的多克隆蛋白质。表达后，可以相继地或者每次几种地收获所表达的独特蛋白质成员，并将其贮存，直至所有成员均已经得到表达。然后可以使用一种下游加工方法来纯化多克隆蛋白质。
分开的收获
分开表达独特的蛋白质成员后，可以分开对多克隆蛋白质的一种或多种成员进行后续的收获步骤，或者可以使用常见的方法来收获两种或更多种成员。
可以如下获得所表达的蛋白质产物，即从不同生物反应器收获上清液或细胞，或者在植物或动物中生产的情况中，从所收获的植物或者从例如转基因动物的奶或蛋分离蛋白质。
分开的第一纯化步骤
下游过程(DSP)的第一阶段通常包括一个或多个步骤以从细胞和细胞碎片(细胞壁、膜和片段)分离蛋白质产物。这可以使用用于澄清的方法(包括但不限于离心和过滤)来完成。当分开制备独特的成员时，可以分开地对独特的成员或者共同地对两种或更多种成员实施初始澄清，虽然在分开制备和收获独特蛋白质的情况中，通常还会分开使分开收获的上清液澄清。
澄清后，下一步可以包括亲和层析步骤，诸如以结合和洗脱模式(捕捉模式)进行的蛋白A或蛋白G纯化。所述纯化步骤在除去大多数污染物(宿主细胞蛋白质、DNA、病毒、培养基成分)上通常是非常有效的。因为蛋白酶和其它酶可以构成污染物的一部分，在早期阶段除去这些对于蛋白质产物的稳定性是重要的。
另外，初始亲和层析步骤通常导致体积的显著降低，使得更容易且更便于贮存这种纯化步骤后的部分纯化的蛋白质产物。在连续生产的情况中，收获蛋白质后立即或马上进行体积降低步骤是一项优点。还有，出于蛋白质产物的稳定性的原因，蛋白质收获后尽可能快速地除去污染物的主要部分是一项优点。随后，可以将各包含多克隆蛋白质的一种独特成员的冷冻的等分试样融化、混合、并进行进一步的DSP。
如果例如多克隆蛋白质的独特成员包括具有不能在同一柱上捕获的不同同种型的抗体，或者如果及时分开个体成员的生产，那么还可以对独特成员中至少一种应用分开的初始层析步骤。例如，多克隆蛋白质可以是多克隆抗体，其包含可以在蛋白A柱上纯化的至少一种独特的抗体成员和可以在蛋白G柱上纯化的至少一种其它独特的抗体成员。可以将下游加工的剩余部分作为一个过程实施。
分开的进一步层析步骤
在其它实施方案中，还可以分开对独特的蛋白质成员实施进一步的下游加工。如果对特定的纯化步骤预期非常不同的回收率和/或如果独特的成员在大小、电荷和/或疏水性方面有如此大的差异以至于不能使用一种常见的纯化方法，这可以是有利的。不同的独特蛋白质成员存在非常不同的污染物也可以证明分开层析步骤的用途。
此实施方案容许为每种独特的蛋白质成员优化步骤以对所有蛋白质成员维持高回收率。这可以导致下游加工过程中的较少损失。
药物物质的分开制备
在本发明的又一个实施方案中，分开对独特的蛋白质成员进行直至获得
“药物物质”的所有步骤。在此方案中，可以平行地或连续地制备包含多克隆蛋白质的不同成员的药物物质。这使得有可能以精确的预先确定的比率组合独特的蛋白质成员。如果精确的比率对于功能是重要的，那么这可以是一项优点。完整的上游和下游加工是分开的，并且可以针对每种独特的蛋白质成员进行优化。这可以导致较高的表达水平和回收率。使用本发明的此实施方案，有可能将蛋白质产物的一种或多种成员衍生化，例如以将毒素、聚合物、或另一非蛋白质基团连接到一种或多种但不是所有的独特蛋白质成员。此类衍生化要求在衍生化前已经纯化出蛋白质。另外，衍生化具有如下的结果，即不能容易地与其它独特的非衍生化的蛋白质成员一起纯化衍生化的产物。可以个别地对包含多克隆蛋白质的独特成员的药物物质之每种进行针对多克隆蛋白质的每种独特成员的分开的表征和/或释放测定法。如果将一种或多种独特的成员衍生化，那么能够单独对此独特的成员进行特定的释放或表征测定法可以是一项优点。
最后将所获得的药物物质与所需要的药物赋形剂、载体等一起配制成药物产品。
特定的制备方案
在下文中，逐步描述了用于生产根据本发明的抗体产物的不同制备方案。这些作为非限制性例子提供。
1)生产前部分分开的种子培养和混合
此方案包括下列步骤(参阅图1)：
●集合(in pool)中的转染
●选择
●筛选高生产克隆
●分开生长到某阶段的种子/接种物培养
●混合
●多克隆产物的单批次生产。
方案最初包括提供一套编码独特的多克隆蛋白质成员之每种的表达载体。将表达载体之每种分开转染入合适的宿主细胞的基因组中，使得一种细胞仅表达多克隆蛋白质的一种成员。例如，使用共表达的显性遗传标志诸如药物抗性标志物来进行经转染的克隆的选择。
可以使用用于高通量筛选的方案来选择高生产单细胞克隆。对克隆进一步筛选合适的生物反应器参数，并筛选细胞单位生产率和最大限度效价。
随后，可以使用关于生物反应器参数、生产率和效价的数据根据针对多克隆生产的算法将编码独特的多克隆蛋白质成员之每种的克隆比对入组中。选择最好的生产组(即平衡生产率和成分稳定性)。或者，可以进行实验来测试提供最好的共培养结果的克隆组合。
对于每种独特的多克隆蛋白质成员，生成主细胞库(MCB)。然后在分开的种子培养中使用每种MCB。然后使用分开的种子培养物来接种生物反应器，其根据基于来自表征步骤的数据或者基于实验结果的规定标准。然后在一个生物反应器中在单批次生产中使用接种物，并将所收获的多克隆蛋白质进行单一下游过程。
2)各生产者细胞系中的分开生产、混合、之后纯化。
此方案包括下列步骤(参阅图2)：
●集合中细胞的转染
●转染子的选择
●筛选高生产的细胞系/克隆
●分开的生产、并混合，之后纯化
方案最初包括提供一套编码独特的多克隆蛋白质成员之每种的表达载体。将表达载体之每种分开转染入合适的宿主细胞的基因组中，使得一种细胞仅表达多克隆蛋白质的一种成员。随后，进行共表达的显性遗传标志，诸如药物抗性标志物的选择以选择经转染的克隆。
可以使用用于高通量筛选的方案来选择高生产单细胞克隆。对克隆进一步筛选合适的生物反应器参数，并筛选细胞单位生产率和最大限度效价。
选择编码独特的多克隆蛋白质成员之每种的最好克隆，并为每种独特的多克隆蛋白质成员生成主细胞库，即MCB。然后在传统的上游生产中使用每种MCB。在贮存罐(hold tank)/容器中收集来自每种独特的多克隆蛋白质成员的所有生物反应器运行的上清液，并混合，然后纯化混合的多克隆上清液。任选地，可以进行体积降低步骤，之后在贮存罐中收集。体积降低步骤可以包括超滤或亲和层析，例如蛋白A层析。分开对独特的蛋白质成员进行体积降低步骤。
3)分开的生产和纯化、纯化的蛋白质的混合
此方案包括下列步骤：
●集合中的转染
●选择
●筛选高生产克隆
●分开的生产
●分开的纯化
●纯化的抗体(药物物质)的混合
该方案到上游过程结束为止与方案2相同。然后将多克隆蛋白质的独特成员进行传统的分开的下游加工。将来自每种独特的多克隆蛋白质成员的所有运行的纯化的药物物质收集，并且任选地贮存，并根据规定的标准混合以获得最终的药物产品。
细胞和蛋白质的混合
在制备的上游加工部分过程中无论何时混合不同细胞群体，这会影响作为终产物获得的多克隆蛋白质的组合物。
一种用于混合细胞的办法包括混合或组合至少两种不同细胞群体的相等数目的细胞。然而，如果不同细胞群体具有不同的表达水平或不同的生长率，那么这不可导致独特的蛋白质成员在终产物中的相等分布。为了补偿这点，可以组合至少两种不同细胞群体的不同数目的细胞。如此，可以组合来自不同群体的细胞以获得如下的多克隆细胞群体，其能够表达近似相等量的多克隆蛋白质的独特成员，诸如以预先确定的比率混合它们，所述预先确定的比率可以以实验方法测定。
在其它实施方案中，以如下的比率组合来自至少两种不同细胞群体的细胞，所述比率给予药物物质或药物产品中预先确定比率的独特的蛋白质成员。这可以如下完成，即使用关于不同细胞群体的表达水平和/或生长率的知识和/或关于在至少一个纯化步骤中回收独特成员的知识来计算比率，之后组合细胞。或者，可以基于实验数据凭经验确定适合于获得想要的结果的混合比率。
在上游加工结束时或者下游加工期间进行组合时，这可以仅通过组合来自多克隆蛋白质的独特成员的细胞培养物的等体积来完成。或者，如果已经获得此类信息，那么可以组合等量的多克隆蛋白质的独特成员。
可以以如下的比率组合多克隆蛋白质的至少两种独特的成员，所述比率给予药物物质或药物产品中预先确定比率的独特的蛋白质成员。这可以如下完成，即使用关于在至少一个纯化步骤中回收独特成员的知识来计算比率，之后组合。
多克隆蛋白质
在本发明的大多数实施方案中，多克隆蛋白质与表达蛋白质成员的细胞天然无关，并且表达系统是重组的。
本发明提供了用于一致的制备重组多克隆蛋白质的方法，所述重组多克隆蛋白质优选是分泌的，并且更优选地选自免疫球蛋白超家族、具有免疫球蛋白样结构域的蛋白质家族。免疫球蛋白超家族的大多数成员牵涉细胞表面识别事件。序列分析提示抗体、T细胞受体、MHC分子、一些细胞粘着分子和细胞因子受体是高度同源的。特别地，此家族中含有可变区的成员适合于生成根据本发明的重组多克隆蛋白质。此类成员包括抗体、膜结合抗体(B细胞受体)、Fab片段、Fv片段、单链Fv(scFv)片段、T细胞受体(TcR)、可溶性TcR、TcR可变域片段、由多肽接头连接的TcR可变域片段、和其它抗体或TcR衍生的片段。特别地，涵盖的是，本发明可以用于大规模制备和生产重组治疗性多克隆抗体或抗体片段及TcR和TcR片段。在一个优选的实施方案中，多克隆蛋白质是多克隆抗体或多克隆抗体片段。
本发明的重组多克隆蛋白质指包含不同但同源的蛋白质分子的蛋白质组合物，其中例如差异反映天然存在的多样性。如此，每种蛋白质分子与组合物的其它分子同源，但是还含有一段或多段可变多肽序列，其特征在于多克隆蛋白质的各成员间的氨基酸序列差异。构成可变多肽序列的氨基酸序列的差异可以少到一个氨基酸，但是通常会构成超过一个氨基酸。多克隆抗体或TcR的天然可变性一般位于多肽链中所谓的可变区或V区。
在本发明的一个实施方案中，多克隆蛋白质中的各成员包含长约80和120个氨基酸之间的可变区。可变区可以包含高变区，例如互补决定区(CDR)。在天然存在的TcR中，每个可变区中有四个CDR。在天然存在的抗体中，有重链中的三个CDR和轻链中的三个CDR。
在本发明的别的实施方案中，多克隆蛋白质的各成员的可变区包含长1-26个氨基酸，优选地长4-16个氨基酸的至少一个超变域。这种超变域可以对应于CDR3区。对于抗体，每个可变区优选包括三个超变域。这些可以对应于CDR1、CDR2和CDR3。对于TcR，每个可变区优选构成四个超变域。这些可以对应于CDR1、CDR2、CDR3和CDR4。超变域可以单独构成本发明的重组多克隆蛋白质的可变区内的可变序列。
在本发明的上下文中，多肽序列中的可变性(多克隆性)也可以理解为描述驻留在抗体多肽链的所谓恒定区或C区中的各抗体分子间的差异，例如如在抗体混合物的情况中，所述抗体含有两种或更多种不同抗体同种型，诸如人同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD、和IgE，或者鼠同种型IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、和IgA。如此，重组多克隆抗体可以包含如下的抗体分子，其特征在于可变区(V区)中和/或恒定区(C区)中的各抗体分子间的序列差异。优选地，抗体是相同同种型的，因为这使后续的纯化和表征变得相当容易。组合不同同种型或者优选地不同亚类的抗体也是想得到的。例如，可以组合同种型IgG1、IgG2和IgG4的抗体，因为这些可以使用蛋白A亲和层析均一起纯化。在不同同种型或亚类的抗体的情况中，多克隆性可以存在于恒定部分中和/或可变域中。在一个优选的实施方案中，构成多克隆抗体的所有抗体具有相同的恒定区以进一步便于纯化。更优选地，抗体具有相同的重链恒定区。重链恒定区在独特的抗体间也可以是相同的。在一个实施方案中，如此，至少两个细胞群体是相同的，只是编码独特蛋白质成员的表达载体序列上有差异。例如，至少两个细胞群体可以是相同的，只是编码独特蛋白质成员的可变区的至少一种表达载体序列上有差异。
在本发明的一个优选的实施方案中，重组多克隆蛋白质是重组多克隆抗体或抗体片段。在本发明的另一个优选的实施方案中，重组多克隆蛋白质是重组多克隆TcR或TcR片段。
在所谓的恒定区(特别是抗体重链)中的多克隆性在抗体的治疗应用方面是令人感兴趣的。多种免疫球蛋白同种型具有不同的生物学功能(表1中汇总的)，其在利用抗体进行治疗时可能期望组合，因为不同的免疫球蛋白同种型可牵涉天然免疫应答的不同方面(Canfield和Morrison 1991.J.Exp.Med.173，1483-91；Kumpel等2002.Transfus.Clin.Biol.9，45.-53；Stirnadel等2000.Epidemiol.Infect.124，153-162)。
表1：人免疫球蛋白同种型的生物学功能
如上文所描述的，多克隆性可以驻留于恒定部分中，使得多克隆蛋白质的至少一种独特成员可以包含一个恒定区，而至少一个其它独特成员包含不同的恒定区。所表达的蛋白质上具有不同糖基化样式也可以是优选的，所述表达的蛋白质可以通过对多克隆蛋白质的独特成员使用不同宿主细胞来获得。如此，多克隆蛋白质的至少一种独特成员可以包含一种糖基化样式，而至少一种其它独特成员包含不同糖基化样式。
在其它实施方案中，通过多克隆蛋白质的一种或多种独特成员的衍生化来获得多克隆性。例如，可以使用用于修饰蛋白质的化学方法诸如与毒素偶联来使多克隆蛋白质的至少一种独特成员衍生化，而不使至少一种其它独特成员衍生化。可以对多克隆蛋白质的不同独特成员采用不同类型的化学衍生化。
多克隆蛋白质可以包含至少三种独特的成员，诸如至少4种独特的成员，例如至少5种独特的成员，诸如至少6种独特的成员，例如至少7种独特的成员，诸如8，例如至少9，诸如至少10种独特的成员，例如至少15种独特的成员，诸如至少20种独特的成员，例如至少25种独特的成员。对于大多数目的，多克隆蛋白质中独特成员的数目小于50，诸如小于45，例如小于40，诸如小于35，例如小于30，诸如小于25，例如小于20，诸如小于15，例如小于10，诸如小于5。
在上文所描述的不同制备方案中，要理解的是，可以对独特成员之每种进行制备的不同阶段，例如使得个别地表达所有独特的成员。然而，分开制备仅一种、两种或三种独特成员，而在单批次中或者在数个单批次中制备其它成员也是想得到的。
宿主细胞
可以从任何如下的细胞生成宿主细胞，所述细胞可以将DNA整合入其染色体中或者保留染色体外元件，诸如质粒、微型染色体、YAC(酵母人工染色体)、MAC(小鼠人工染色体)、或HAC(人类人工染色体)。MAC和HAC详细记载于WO 97/40183。
宿主细胞可以是原核的或真核的，并且在一些情况中，可以使用原核细胞来表达一种或多种独特成员，而可以对一种或多种其它独特成员使用真核细胞。
真核细胞可以来自选自下组的真核生物体：植物、酵母、真菌、脊椎动物和无脊椎动物。或者，真核细胞也可以是用于表达抗体的杂交瘤或永生化B细胞。
优选地，使用哺乳动物细胞诸如CHO细胞、COS细胞、BHK细胞、骨髓瘤细胞(例如Sp2/0、YB2/0或NS0细胞)、成纤维细胞诸如NIH 3T3、永生化人细胞诸如HeLa细胞、HEK 293细胞或PER.C6细胞。然而，也可以采用非哺乳动物真核或原核细胞诸如植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、真菌、细菌诸如大肠杆菌(E.coli)等。在一个优选的实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞诸如CHO细胞。
在本发明的一个实施方案中，如下对要作为起始材料使用的细胞系进行亚克隆，即进行限制性稀释将细胞系稀释到单细胞水平，接着将每种单细胞培养成新的细胞群体，之后用感兴趣的载体文库转染。若想要的话，也可在以后在选择正确的细胞系的过程中进行所述亚克隆。用于单细胞克隆的其它方法包括：FACS克隆(Brezinsky等J.2003.Immunol Methods 277，141-155)、LEAPTM技术(来自Cyntellect，San Diego，California，USA)、和ClonePix(来自Genetix，UK)。如此，特定的细胞群体衍生自一种表达多克隆蛋白质的一种独特成员的克隆细胞。
在分离的哺乳动物细胞和细菌中进行传统的重组体制备外，也可以使用其它制备系统。
例如，可以在真菌、酵母和完整的植物中，在转基因禽类(从蛋回收抗体)中和在转基因哺乳动物(从奶回收抗体)中重组表达抗体。
用于在真菌中制备抗体的方法是本领域中已知的，例如如记载于WO2005/070962；Nyyssonen等1993，Nat Biotech 11：591-5；和Ward等2004，Appl.Environ.Microbiol.70：2567-76中的。
用于在酵母中制备单克隆抗体的方法是本领域中已知的，例如如记载于Li等，2006，Nature Biotech.24(2)：219-215中的。
用于在完整的植物中制备单克隆抗体的方法是本领域中已知的，例如如记载于Bouquin等，2002，Transgenic Res.11：115-22；Hood等，2002，Curr.Opin.Biotechnol.13：630-5；和Stoger等，2004，Methods Mol.Biol.248：301-318中的。
用于在禽类中制备单克隆抗体的方法是本领域中已知的，其中在蛋中找到抗体产物，例如如记载于Zhu等，2005，Nature Biotech.23：1159-69中的。
也可以在转基因哺乳动物中重组制备抗体，其中可以在奶中找到重组抗体产物。此类方法的例子记载于下列参考文献中：Behboodi等，2005，Cloning Stem Cells 7：107-18；Hodges等，2003，Reprod.Biol.Endocrinol.1：81；Houdebine LM.2002，Curr Opin.Biotechnol 13：625-9；Jang等，2006，Theriogenology 65：1800-12；Lai等，2003，Reprod.Biol.Endocrinol.1：82；Lonberg N.2005，Nature Biotech.23：1117-25；Santora等，2006，Biomed.Chromatogr.20：843-56；Tang等，2008，Transgenic Res；和Young等，1998，Res Immunol 149：609-10。
供整合用的载体
合适的载体包括合适的选择基因。适合于在哺乳动物细胞表达中使用的选择基因包括但不限于实现营养选择的基因，诸如胸苷激酶基因(TK)、谷氨酰胺合成酶基因(GS)、色氨酸合成酶基因(trpB)或组氨醇脱氢酶基因(hisD)。可以使用的选择标志包括赋予药物抗性的抗代谢物抗性基因，诸如二氢叶酸还原酶基因(dhfr)(其可以用次黄嘌呤和胸苷缺陷培养基进行选择，并用甲氨蝶呤进一步选择)、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(gpt)(其可以用霉酚酸进行选择)、新霉素磷酸转移酶基因(neo)(其可以在真核细胞中用G418和在原核细胞中用新霉素或卡那霉素进行选择)、潮霉素B磷酸转移酶(hyg、hph、hpt)基因(其可以用潮霉素进行选择)、嘌呤霉素N-乙酰转移酶基因(pac)(其可以用嘌呤霉素进行选择)、或杀稻瘟素S脱氨酶基因(Bsd)(其可以用杀稻瘟素进行选择)、和Zeocin抗性基因(Sh ble)(其介导针对Zeocin和博来霉素的抗性)。最后，也可以使用编码使分选能够例如通过流式细胞术进行的蛋白质的基因作为选择标志，诸如绿色荧光蛋白(GFP)、神经生长因子受体(NGFR)或其它膜蛋白、或β-半乳糖苷酶(LacZ)。
优选地，选择标志编码宿主细胞缺陷的基因产物，其避免将例如抗生素添加至培养基。在另一个优选的实施方案中，在有利于表达选择标志的细胞生长的条件下连续培养细胞。这在选择标志是宿主细胞缺陷的基因产物时是特别有用的，因为它容许遍及整个培养期使用选择条件，而不添加例如抗生素。
在表达二聚体或多聚体蛋白质的情况中，一种表达载体可以编码独特多克隆蛋白质成员的所有亚基。或者，表达载体可以包括两个或更多个子集的表达载体，其中第一子集包含编码一个蛋白质亚基的变体核酸序列，而第二子集包含编码另一种蛋白质亚基的变体核酸序列，使得用来自第一子集的成员和第二子集的表达载体的成员进行每次转染。在抗体的情况中，可以通过两个子集的表达载体来构成表达载体，其中第一子集包含编码抗体重链的变体核酸序列，而第二子集包含编码抗体轻链的变体核酸序列，使得用来自第一子集的成员和第二子集的表达载体的成员进行每次转染。
选择标志可以位于分开的表达载体上，从而用编码选择标志的表达载体和编码感兴趣的蛋白质或感兴趣蛋白质的亚基的一种或多种表达载体进行共转染。选择标志也可以位于编码感兴趣的蛋白质的表达载体上。在此后一种情况中，优选地，选择标志位于也编码感兴趣的蛋白质或其亚基之一的转录物上。这可以例如使用IRES构建体来完成。在多聚体蛋白质诸如多聚体抗体的情况中，优选地，选择标志位于编码最大的亚基(例如抗体重链)的转录物上。
用于整合感兴趣的基因的载体进一步包括编码感兴趣的重组多克隆蛋白质的一种成员的DNA，之前有指导蛋白质表达的其自身启动子，例如用于在哺乳动物细胞中表达的哺乳动物启动子。如果感兴趣的重组多克隆蛋白质的成员包含超过一种蛋白质链，例如如果成员是抗体或T细胞受体，那么编码蛋白质的各条链的DNA之前可以有其自身的启动子，其指导链之每条的高水平表达(双向的或单向的)。在双向表达中，可以使用表达载体中的头对头启动子构型，而对于单向表达，可以使用与例如IRES序列组合的一种启动子或两种启动子来进行表达。具有由相同的转录物编码且由IRES序列分开的两种不同亚基的双顺反子表达载体同样是想得到的。
例如，合适的头对头启动子构型是以两种取向的与小鼠金属硫蛋白-1启动子一起的AdMLP启动子、以两种取向的与延长因子-1启动子一起的AdMLP启动子、以两种取向的与MPSV启动子一起的CMV启动子、或以两种取向使用的CMV启动子。
在抗体的情况中，经验已经显示了由细胞表达的重链量不应超过轻链的量。因此，指导轻链表达的启动子优选至少与指导重链表达的启动子一样强。
编码功能前导序列的核酸序列可以包括在表达载体中以将基因产物引导至内质网或细胞内的特定位置诸如细胞器。强的多腺苷酸化信号可以位于编码蛋白质的DNA序列的3’。多腺苷酸化信号确保新生RNA转录物的终止和多腺苷酸化，而且与信息稳定性有关。编码感兴趣的重组多克隆蛋白质成员的DNA可以例如编码抗体或抗体片段的重链和轻链两者，每种基因序列任选地前面有其自身的哺乳动物启动子元件和/或后面有指导两条链之每条的高水平表达的强的多聚A信号。
供整合用的表达载体为了整合位点处的表达升高可以携带别的转录调节元件，诸如增强子、抗阻抑物、或UCOE(遍在染色质开放元件)。增强子是与牵涉转录的核内蛋白特异性相互作用的核酸序列。UCOE开放染色质或者将染色质维持在开放状态，而且促进可操作连接的基因可复制的表达(更为详细地记载于WO 00/05393和Benton等，Cytotechnology 38：43-46，2002)。别的增强子包括基质附着区(MARs)，如记载于例如Girod和Mermod 2003(“Chapter 10：Use of scaffold/matrix-attachment regions for protein production”，第359页-第379页于Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells，SC Makrides(编)，2003，Elsevier Science BV)。抗阻抑物元件包括但不限于STAR元件(Kwaks等，Nat Biotechnol.2003年5月；21(5)：553-8)。当上文中所描述的一种或多种调节元件被整合入宿主细胞的染色体中时，它们被称作异源调节元件。
如果需要提高表达水平，可以使用对DHFR基因或谷氨酰胺合成酶(GS)基因、hprt(次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶)或色氨酸合成酶基因的选择来进行基因扩增。这要求包含此类选择标志的载体的使用。
生产者细胞的培养
培养步骤过程中，如下培养经转化的细胞，即制备和培养接种物(种子培养)、在单个生物反应器或者一系列生物反应器中放大接种物(接种物培养)、并从接种物生产和积累蛋白质(生产阶段)。
在种子培养阶段中，将来自转化步骤的经转化细胞回收到接种培养基中以产生接种物。通过本领域中已知的方法在含有可同化碳源(碳水化合物诸如葡萄糖或乳糖)、氮源(氨基酸、肽、蛋白质或其降解产物诸如胨、铵盐等)、和无机盐(钠、钾、镁和钙的硫酸盐、磷酸盐和/或碳酸盐)的液体培养基中培养经转化的宿主细胞。优选地，接种物培养基包括常规的营养培养基诸如达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)(Sigma)、Ham氏F10(Sigma)、最小必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)或NCTC-135。培养基优选是无血清培养基，并且更优选无动物蛋白质的培养基，诸如EX-CELL
302(SAFC Biosciences)，还更优选无蛋白质的培养基诸如EX-CELL
325(SAFC Biosciences)，并且最优选化学成分确定的培养基诸如OptiCHOTM(Invitrogen)、或ProCHO4TM或PowerCHO2-CDTM(Lonza BioWhittaker)。
这些培养基之任一种在必要时可以补充有氨基酸(谷氨酰胺)、激素或其它生长因子(胰岛素、转铁蛋白、或表皮生长因子)、维生素、盐类(硫酸锌、氯化钠、磷酸盐)、缓冲液、核苷酸、抗体、离子型表面活性剂、和/或葡萄糖或等效能源(equivalent energy source)。培养基可以进一步含有作为生长促进物质的微量元素，诸如离子螯合物(例如螯合物B，Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)和/或锰。种子培养过程中，监测培养条件诸如温度、pH等以确保快速的细胞生长。
接种物培养过程中，在扩大培养基中经由连续培养步骤来扩大接种物。Such steps can be performed in任何合适的容器，包括细胞培养烧瓶、搅拌瓶(stir bottle)、转瓶、旋转性生物反应器(rotary bioreactor)、和旋转器烧瓶(spinner flask)。优选地，在生物反应器中实施接种物培养，从而可以经由密闭的管道系统将细胞转移到生产反应器。扩大培养基还包括常规的营养培养基，而且可以包括由水解产物(例如HySoy
，Quest International，Chicago，IL)供应的氨基酸、激素或其它生长因子、维生素、盐、缓冲液、核苷酸、抗生素、离子型表面活性剂、离子螯合剂、和葡萄糖或等效能源。在生物反应器中的接种物培养过程中，监测接种物的pH、氧饱和和废产物。
生产阶段过程中，将细胞转移到搅动罐或气升式生物反应器或一次性或一次使用生物反应器，并用含有糖、氨基酸、盐、痕量元素和生长因子(它们以这样的量组合以为一致的、强烈的、快速的细胞生长维持生长培养基的pH、重量摩尔渗透压浓度(osmolality)、和其它必要的参数)的复合生长培养基补料。此类商品化进料溶液的例子是Cell Boost 1-6(Hyclone)和EfficientFeedTM A和B(Invitrogen)。或者，可以使用匹配特定生产细胞需要的定制进料溶液。渗透保护剂化合物诸如甜菜碱或脯氨酸的使用例如可以保护细胞免疫渗透应激，而增强抗体生产率。温度、溶解氧、pH、压力、空气流动速率和搅动速率在生产阶段过程中也受到控制。生产阶段过程中，细胞在内部表达蛋白质或者将蛋白质分泌到周围培养基中。可以以化学或机械方式碎裂在其结构内表达蛋白质的那些细胞以收获蛋白质。更多的复杂细胞诸如哺乳动物细胞可以产生糖基化的细胞产物，并将蛋白质分泌到用于分离的细胞培养基中。
收获和纯化
收获步骤过程中，通过本领域中已知的任何手段来从细胞培养物取出蛋白质。例如，当经转化的细胞在细胞内生成蛋白质时，可以使用离心或超滤来除去宿主细胞或溶解的细胞。若蛋白质被分泌到培养基中，则可以通过使用商品化的蛋白质浓缩滤器，例如Amicon
或Millipore Pellicon超滤单元来从向细胞补料的化合物混合物和从细胞自身的副产物取出蛋白质。
纯化步骤过程中，蛋白质进行一个或多个纯化步骤，包括多种层析方法。此类纯化方法的例子包括阴离子交换层析和阳离子交换层析，以及多种过滤方法，诸如使用Pellicon
膜(Millipore，Billerica，MA)的切向流过滤、使用DVSO滤器(Pall Corporation，East Hills，NY)的纳米过滤，例如以降低潜在的病毒污染，和合适大小的死端式过滤(诸如0.45μm和0.2μm滤器)、使用疏水相互作用层析的分级(例如在苯基Sepharose上)、乙醇沉淀、等电聚焦、反向HPLC、硅土上的层析、肝素SepharoseTM上的层析、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、和亲和层析(例如使用蛋白A、蛋白G、抗体、特异性底物、配体或抗原作为捕捉试剂)。
也可以修饰或衍生化本发明的蛋白质。
此类修饰的例子包括翻译后修饰，诸如糖基化(O-连接的和N-连接的)、乙酰化、磷酸化、泛素化、聚合物偶联等。这些中的一些修饰可以在体内使用宿主细胞机器来实施，而其它修饰需要体外方法，接着从宿主细胞分离蛋白质。
应当理解的是，本发明的蛋白质可以与药学可接受载体混合，或者通过载体稀释和/或装入载体内，所述载体可以例如处于胶囊、小袋、纸或其它容器形式。当载体起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料，其充当活性成分的媒介物、赋形剂或介质。合适的药学可接受载体包括例如下列一项或多项：水、盐水、磷酸盐缓冲液盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及其组合。药学可接受载体可以进一步包含少量的辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其延长蛋白质的保存期或效率。如本领域中公知的，可以配制组合物以提供活性成分的快速的、持续的或延迟的释放。
本发明的蛋白质可以处于多种形式。这些包括例如固体、半固体、和液体剂量形式，诸如片剂、丸剂、粉剂、液体溶液、分散体或悬浮液、脂质体、栓剂、可注射和可输注溶液。如此，组合物可以处于片剂、锭剂、小袋、扁囊剂(cachet)、酏剂、悬浮液、气雾剂(作为固体或者在液体培养基中)或者软膏剂(其含有例如多至10％(按重量计)的活性化合物)、软和硬明胶胶囊、栓剂、注射溶液、悬浮液、无菌包装的粉末形式和作为表面贴片(topical patch)。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗应用。对于通过注射或输注的胃肠外施用，表面施用会以溶液或悬浮液形式，这可能基于冻干的产物。
纯化后，通常例如通过离子交换层析或者使用基于质谱术的方法，诸如记载于WO 2006/007853的标志物肽方法来评估多克隆抗体中所有独特成员的存在和/或量或相对分布。用于表征多克隆抗体组合物的方法详细记载于WO 2006/007853。也可以根据需要在上游或下游制备过程中的其它点时进行多克隆蛋白质的每种成员的存在和/或量的测定。在一个实施方案中，如此，本发明的方法包括制备过程中和/或纯化后的至少一个步骤以确认多克隆蛋白质的每种成员的存在和/或量。
多克隆蛋白质的独特成员的进一步优选的特征在于蛋白质同质性，从而可以容易地纯化蛋白质。为了便于表征，优选具有一个独特峰的离子交换层析谱。这适用于多克隆蛋白质的独特成员和最终的药物产品和药物物质组合物两者。也优选的是，当组合独特成员时，可以使用离子交换层析或其它蛋白质表征方法来辨别它们，使得可以在一次运行中表征具有所有独特成员的组合物。如此，优选地选择独特的蛋白质成员以容许鉴定纯化后表征步骤中的独特蛋白质成员。
最终的药物产品包含配制用于施用的多克隆蛋白质(或者可能处于适合于在施用前用例如无菌水重建的冻干形式)、合适的包装、和具有规定信息及提及上市授权的包装插页。
在不同的生物体中表达感兴趣的蛋白质
通过使用此方案，可以将使用依赖于在完整生物体中体内表达的低成本上游加工方法的优点应用到多克隆蛋白质产物的制备。蛋白质产物在植物和动物中的重组表达仍然处于其初期。用于在一种生物体中表达多克隆蛋白质产物的不同成员的方法可以证明为困难的，因为需要在细胞中彼此独立地插入数种基因，随后所述细胞能分裂和分化成完整的生物体。因此，能够在一种生物体中仅表达多克隆蛋白质的一种独特成员可以是优点。
对于动物，已经开发了用于将异源的表达构建体插入干细胞或卵细胞中，并且确保编码的产物随后被表达并分泌到奶(在哺乳动物的情况中)或蛋(在禽类的情况中)的方法。本发明可以延伸到动物，使得一种动物表达多克隆蛋白质的一种成员，之后可以将含有蛋白质产物的奶或蛋组合并进行单一下游加工方法。或者，可以对一种或多种独特蛋白质成员分开进行下游加工的一个或多个步骤。通常会使用相同的动物物种来表达多克隆蛋白质的所有成员以便于下游加工和随后的表征。
对于植物，同样已经开发出用于表达异源蛋白质的方法。一些方法依赖于产物在植物的特定器官中，诸如在马铃薯块茎中、在叶中、在种子中、或在花中的表达。此类器官特异性表达可以便于下游加工，特别如果可以避免植物的富含纤维的部分的话。使用此类方法，可以使用用于栽培植物的低成本方法来以较高量表达重组蛋白产物。如此，单株植物会表达多克隆蛋白质的一种成员，并且可以在下游加工前、过程中或者之后组合不同成员。通常会使用相同的植物物种和品种来表达多克隆蛋白质的所有成员。
根据本发明制备的组合物的治疗用途
可以使用根据本发明制备的药物组合物来治疗、改善或预防哺乳动物中的疾病。可以用当前的药物组合物治疗的疾病包括癌症、传染病、炎性疾病、变态反应、哮喘和其它呼吸道疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病、中枢神经系统疾病、代谢和内分泌疾病、和移植排斥。
另外，可以使用根据本发明生成的多克隆抗体用于诊断目的，例如在诊断试剂盒中，和在供环境使用的试剂盒中，例如用于检测污染物。
实施例
实施例1：分开的细胞扩充、摇瓶中混合的生产
概况
计算六种不同细胞群体，并以相等的细胞比率(1∶1∶1∶1∶1∶1)混合，并用于接种生物反应器，其中每种细胞群体生成不同抗体。将细胞培养7天，之后使用离子交换层析(IEX)来量化六种抗体之每种的量。将实验重复两次，并调查获得的多克隆抗体组合物的批次间重复性。
材料和方法
细胞系
所使用的亲本生产者细胞系是自Lawrence Chasin(哥伦比亚大学)获得的DHFR阴性CHO细胞系DG44的衍生物。用载体pcDNA3.1+(Invitrogen)中腺病毒5型反式激活剂E1A的cDNA转染DG44细胞。用遗传霉素(Invitrogen)以500μg/ml的浓度选择转染子。选择后，通过有限稀释对细胞进行单细胞克隆。通过用抗体质粒的瞬时转染来对克隆测试抗体表达。单克隆显示了与未转染的DG44细胞系相比瞬时测定法中改善3倍的表达水平。在用稳定转染进行的比较中，选定的集合显示了与野生型DG44细胞系相比升高4-5倍的表达水平。将此克隆(称作ECHO)亚克隆两次，并且在抗体表达方面表现为稳定的。
抗体表达质粒
使用在中间有间隔区元件的两个相同的头对头人CMV启动子来构建所使用的IgG1抗体表达质粒，因此表达重链(VH+γ1恒定区)和轻链(κ02-286)的编码区。使用由位于重链编码序列下游的内部核糖体进入位点(IRES)驱动的小鼠二氢叶酸还原酶cDNA(DHFR)盒进行转染子的选择。选择六种不同的抗体，它们针对不同牛痘病毒表面蛋白。表2显示了抗体和表达它们的ECHO克隆。
表2.抗体和ECHO克隆
| 抗体 | ECHO克隆名称 |
| Sym002-037 | 36-8 |
| Sym002-186 | 37-11 |
| Sym002-482 | 39-3 |
| Sym002-303 | 26-9 |
| Sym002-286 | 28-6 |
| Sym002-235 | 38-8 |
ECHO细胞的转染
在T80烧瓶中以0.3x106个细胞/每烧瓶的密度在具有10％胎牛血清(FCS)(Invitrogen)的MEMα培养基(具有核苷)(Invitrogen)中接种ECHO细胞。在接种的一小时内，用Fugene
6(Roche)转染细胞：
●将10μl Fugene6与490μl达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基混合，并容许在室温温育5分钟
●添加5μg表达质粒，并将混合物在室温再温育15分钟
●将混合物添加至细胞培养烧瓶
在第二天，吸出具有转染试剂的培养基，用5ml具有10％渗析的FCS(Invitrogen)(MEMα-)的MEM α培养基(没有核苷)清洗每个烧瓶一次，并与2nM浓度的甲氨蝶呤一起添加10ml相同培养基。一周更换培养基两次。15天后，将细胞进行胰蛋白酶处理，并将所有的细胞转移到新的烧瓶。
为了生成单细胞克隆，用表面结合抗体染色集合中的细胞，并使用FACS-Aria(Becton-Dickinson)分选FACS单细胞。约1周后，通过显微镜对各孔检查单克隆的存在。约2周后，通过IgG ELISA每次在单一稀释中测定来自具有单克隆的各孔的上清液，并且基于各孔的ELISA数值和目视检查。对代表每种抗体的24种克隆选择对无血清悬浮培养的适应。
适应于无血清悬浮培养
对细胞进行胰蛋白酶处理并计数。将5.0x106个细胞离心，并在10mlProCHO4TM无血清培养基(Lonza)+4mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)+1/100MEM NEAA(Invitrogen)中重悬。将细胞转移到50ml细胞培养管(TRP，Switzerland)，并在摇动器上于37℃温育。一周计算细胞密度两次，并且每次将培养物稀释到每ml0.5x106个细胞(对于前2周)或每ml 0.3x106个细胞(对于剩余的期间)。4-5周后，大多数克隆的加倍时间接近30小时，在此时间点，认为它们适应于无血清培养。在适应期间结束时，通过ELISA来测定细胞、将其冷冻，并用于表达实验。
融化和扩充
在加热到37℃的ProCHO4TM培养基中融化六种不同细胞系之每种。以800rpm(160G)离心细胞悬浮液4分钟，除去上清液，并将细胞沉淀物在12mlProCHO4TM培养基中于37℃重悬。然后将细胞悬浮液转移到T75烧瓶，并放置在37℃和5％CO2的培养箱中。在第2天，将培养物调节至摇动器或50ml小瓶/生物反应器中的ProCHO4TM培养基中的5.0x105个细胞/ml。细胞扩充过程中，一周两次或三次将细胞浓度调节至0.5x106个细胞/ml。扩充一周后，用500ml摇动器中60-80ml培养基中的0.5x106个细胞/ml设置六种细胞系之每种。
培养
当接种摇动器时，混合六种细胞系，并将接种物分入两个250ml摇动器中。简言之，混合前，将来自每种细胞系的样品计算三次，并使用平均活细胞计数。采集对应于15.0x106个细胞的每个克隆体积，并彻底混合六个体积，并进行新的细胞计数。基于此细胞计数，设置两个具有0.5x106个/ml的(混合的)细胞浓度的250ml摇动器。将为每个摇动器计算的体积转移到50ml管，并以800rpm(160G)离心4分钟。弃去上清液，并将细胞在50ml ProCHO4TM培养基中重悬，并转移到250ml摇动器。然后将摇动器放置在100rpm和2.6cm振幅的振动台上的37℃和5％CO2的培养箱中。
在两个不同的天数进行实验；具有实验号1A和1B的第1天和具有实验号2A和2B的第2天。将培养运行7天，之后保存上清液，用于IEX序型分析(profiling)。
对IgG组合物的分析
将5-10ml 0.22μm过滤的培养基上清液加载到1ml MabSelect SuReTM柱(GE Healthcare)上。用10ml PBS pH 7.4清洗该柱，并用0.1M甘氨酸pH 2.7洗脱，如制造商所描述的。针对40mM NaCl、50mM醋酸钠pH 5.0透析合并的蛋白质材料两次，并通过测量280nm处的吸光度来测定总IgG浓度。
将60μg IgG混合物加载到来自PolyLC的弱阳离子交换柱PolyCat A(100x4，6mm，3μm，)上。通过在72分钟里以1ml/min的流速应用醋酸钠pH 5.0缓冲液中150至500mM NaCl的梯度来洗脱蛋白质。监测洗脱液的215nm吸光度，并通过合并信号来测定各种IgG的相对量。为了比较不同样品，将抗体的总量设置到100％，并计算六种抗体之每种的比率。
结果
7天后收获来自含有混合群体的摇瓶的上清液，并分析IEX谱。表3和图3中给出了每种抗体的相对面积。
表3.混合群体中培养7天后每种抗体的相对面积。
表显示了
●同时混合的两个不同摇瓶间的六种抗体之每种的量的变化是非常小的。它可能在该方法的标准偏差限度内。
●在不同天数混合的细胞也具有非常小的变化，指明有可能以相等的细胞比率混合六种不同细胞群体，并将它们一起培养，导致培养后六种抗体之每种的相同的相对量。
实施例2：补料分批生物反应器中的分开上游培养、混合、之后纯化
概况
将表达五种不同IgG抗体的五种不同ECHO细胞系在生物反应器中个别地培养13-14天。培养后，在纯化过程中混合含有抗体的级分(2∶1∶1∶1∶1)以获得整装药物物质(bulk drug substance，BDS)中的抗体组合物。
表达质粒、细胞等如实施例1中的，只是仅表达五种抗体(参见表4)。
表4.抗体和ECHO克隆
| 抗体 | ECHO克隆名称 |
| Sym002-186 | 37-11 |
| Sym002-482 | 39-3 |
| Sym002-303 | 26-9 |
| Sym002-286 | 28-6 |
| Sym002-235 | 38-8 |
融化和扩充
在加热到37℃的ProCHO4TM培养基中融化五种不同细胞系之每种。以800rpm(160G)离心细胞悬浮液4分钟，除去上清液，并将细胞沉淀物在12ml37℃ProCHO4TM培养基中重悬。然后将细胞悬浮液转移到T75烧瓶，并放置在37℃和5％CO2的培养箱中。在第2天，将培养物调节至摇动器或50ml管“生物反应器”中的ProCHO4TM培养基中的5.0x105个细胞/ml。细胞扩充过程中，一周两次或三次将细胞浓度调节至0.5x106个细胞/ml。扩充一周后，将五种细胞系之每种转移到无血清生产培养基EX-CELL
302(SAFC)+4mM L-谷氨酰胺。用500ml摇动器中60-80ml培养基中的0.5x106个细胞/ml设置细胞系，并培养2周，直至生物反应器接种。
纯化过程中的培养和混合
在六个500ml工作体积生物反应器(DASGIP AG)中进行培养，其中自动控制pH、溶解氧、温度、进料谱和气体混合。用EX-CELL
302+4mM L-谷氨酰胺中5.0x105个/ml活细胞接种六个生物反应器之每个。生物反应器运行过程中，每天用补充有浓缩的进料溶液、谷氨酰胺和葡萄糖至终体积500ml的EX-CELL
302培养基喂养细胞。13-14天后收获培养物，并在澄清步骤(以1942G离心15分钟)后，将六种上清液之每种无菌过滤流过0.22μm GPExpress Plus膜滤器(Millipore)。
混合等体积的过滤的上清液之每种以获得抗体组合物。通过蛋白A捕捉来纯化抗体组合物，并通过离子交换层析(IEX)来分析。
通过离子交换层析来分析IgG组合物
如下亲和纯化5-10ml 0.22μm过滤的抗体组合物，即将其加载到1mlMabSelect SuReTM柱(GE Healthcare)上。用10ml PBS pH 7.4清洗该柱，并用0.1M甘氨酸pH 2.7洗脱，如制造商所描述的。在表达系统(GE Healthcare)上进行纯化。针对40mM NaCl、50mM醋酸钠pH 5.0透析合并的蛋白质材料两次，并通过测量280nm处的吸光度来测定总IgG浓度。
将80μg IgG混合物加载到来自PolyLC的弱阳离子交换柱(PolyCat A，100x4，6mm，3μm，
)上。通过在72分钟里以1ml/min的流速应用醋酸钠pH 5.0缓冲液中150至500mM NaCl的梯度来洗脱蛋白质。监测洗脱液的215nm吸光度，并通过合并信号来测定各种IgG的相对量。将抗体的总量设置到100％，并计算五种抗体之每种的比率。
通过HPLC来分析IgG组合物
使用RX Daytona分析仪(Randox)和根据制造商指令的免疫比浊法来分析来自生物反应器的上清液样品中的IgG含量。
结果
在六个500ml工作体积生物反应器中进行培养。用5.0x105个/ml活细胞接种六个生物反应器之每个，并在培养13-14天后收获。表5中给出了生物反应器培养设置、收获时的抗体浓度和混合步骤中的体积分数。收获时的抗体浓度由于克隆的不同特性而有所不同。用相同克隆的两次培养CHM020-3和CHM020-4在收获时含有非常相似的抗体浓度，指明过程稳健性。
表5.培养设置、收获时的抗体含量和混合步骤中的体积分数。
澄清和无菌过滤后通过混合等体积的所有六种培养物来混合抗体。然后通过亲和层析来进一步纯化抗体组合物，并使用阳离子交换层析(CIEX)来分析。表6中给出了五种抗体之每种的相对量，如通过CIEX层析所评估的。
表6.混合后每种抗体的相对量，如通过CIEX所量化的。
抗体 混合物(％)中IgG的CIEX量化
Sym002-303 17.4
Sym002-286 23.9
Sym002-186 47.9
Sym002-235 3.8
Sym002-482 7.0
表显示了
●可以使用所描述的方法将数种抗体混合成多克隆抗体组合物并纯化。
●可以通过调节每种含有抗体的级分的量将使用此方法制备的多克隆蛋白质调节至预先确定的组成。
实施例3：分开的种子培养，接着在生物反应器中进行单批次补料分批生产
概况
计算六种不同细胞群体，并以相等的细胞比率(1∶1∶1∶1∶1∶1)混合，并用于接种生物反应器，其中每种细胞群体生成不同抗体。将细胞培养12天，之后使用离子交换层析(IEX)来量化生物反应器中六种抗体之每种的量。将实验重复8次，并调查混合细胞培养间的变化。
材料和方法
细胞系
所使用的细胞系是实施例1中所描述的ECHO细胞系。
抗体表达质粒
使用在中间有间隔区元件的两个相同的头对头人CMV启动子来构建所使用的IgG1抗体表达质粒，因此表达重链(VH+γ1恒定区)和轻链的编码区。使用由位于重链编码序列下游的内部核糖体进入位点(IRES)驱动的小鼠二氢叶酸还原酶cDNA(DHFR)盒进行转染子的选择。对于该实验，选择六种不同的抗体(编号为810、816、824、853、856和894)，它们呼吸道合胞(RS)病毒抗原F和G。
ECHO细胞的转染
转染方法遵循实施例1中所描述的转染方法。
适应于无血清悬浮培养
对细胞进行胰蛋白酶处理并计数。将5.0x106个细胞离心，并在10mlProCHO4TM无血清培养基(Lonza)+4mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)+1/100MEM NEAA(Invitrogen)中重悬。将细胞转移到50ml细胞培养管(TPP，Switzerland)，并在摇动器上于37℃温育。一周计算细胞密度两次，并且每次将培养物稀释到每ml 0.5x106个细胞(对于前2周)或每ml 0.3x106个细胞(对于剩余的期间)。4-5周后，大多数克隆的加倍时间接近30小时，在此时间点，认为它们适应于无血清培养。然后将细胞转移到PowerCHO2TM无血清培养基(Lonza)+4mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)+1/100MEM NEAA(Invitrogen)。2-3周后，当加倍时间在35小时之下时，认为细胞是适应的，之后通过ELISA对它们测定抗体生产率，将其冷冻，并用于表达实验。
融化和扩充
在加热到37℃的ProCHO4TM培养基中融化六种不同克隆之每种。以800rpm(160g)离心细胞悬浮液4分钟，除去上清液，并将细胞沉淀物在12ml37℃ProCHO4TM培养基中重悬。然后将细胞悬浮液转移到T75烧瓶，并放置在37℃和5％CO2的培养箱中。在第2天，将培养物调节至摇动器或50ml细胞培养管中的ProCHO4TM培养基中的5.0x105个/ml。细胞扩充过程中，一周两次或三次将细胞浓度调节至0.5x106个/ml。扩充31天后，在两个不同摇瓶(系列A和B)中设置六种克隆之每种，给出总共12个摇瓶，500ml摇动器中的60-80ml中有0.5x106个/ml。
培养
在总共35天的各抗体生产者细胞系的种子培养扩充后，用六种克隆的混合物接种4个生物反应器之每个。将此实验重复两次，给出总共8个生物反应器，如下文所描述的。简言之，混合前，将每个克隆计算三次，并使用平均活细胞计数。采集对应于25.0x106个细胞的每个克隆体积，并彻底混合“六个克隆的混合物”，并进行新的细胞计数。基于此细胞计数，通过添加PowerCHO2TM培养基+20％(w/w)进料培养基来设置具有0.3x106个/ml的(混合的)细胞浓度的500ml生物反应器。对“六种克隆的混合物”的剩余部分取样，用于IEX谱分析。然后以于30％受控的DO、pH 7.0±0.1、80rpm培养生物反应器。在4、8和12天后，取出样品，用于IEX序型分析
八个生物反应器
为了调查方法的稳健性和批次间一致性，使用来自12个摇瓶的克隆来接种如下的8个生物反应器：
对于生物反应器1，从摇瓶种子培养系列A的六种克隆之每种采集细胞。
对于生物反应器2，以与生物反应器1相同的方式独立地从摇瓶种子培养系列A采集细胞。
对于生物反应器3，从摇瓶种子培养系列B的六种克隆之每种采集细胞。
对于生物反应器4，以与生物反应器1相同的方式独立地从摇瓶种子培养系列B采集细胞。
对于生物反应器5至8，以与生物反应器1至4所描述相同的方式独立地采集细胞。生物反应器1至4后2天接种生物反应器5至8。
抗体纯化和对IgG组合物的CIEX分析
将5-10ml 0.22μm过滤的培养基上清液加载到1ml MabSelect SuReTM柱(GE Healthcare)上。用10ml PBS pH 7.4清洗该柱，并用0.1M甘氨酸pH 2.7洗脱，如制造商所描述的。针对40mM NaCl、50mM醋酸钠pH 5.0透析合并的蛋白质材料两次，并通过测量280nm处的吸光度来测定总IgG浓度。
将60μg IgG混合物加载到来自PolyLC的弱阳离子交换柱PolyCat A(100x4，6mm，3μm，
)上。通过在72分钟里以1ml/min的流速应用醋酸钠pH 5.0缓冲液中150至500mM NaCl的梯度来洗脱蛋白质。监测洗脱液的215nm吸光度，并通过合并信号来测定各种IgG的相对量。为了比较不同样品，将抗体的总量设置到100％，并计算五种抗体之每种的相对量。
结果
12天后收获来自含有混合群体的8个生物反应器的上清液，并在过滤和蛋白A捕捉纯化后分析IEX谱。表7和图4中给出了每种抗体的相对面积。
表7.混合群体中培养12天后每种抗体的相对面积。
| 抗体 | 相对面积(％抗体总量) | 作为％面积的标准偏差 |
| 810 | 16.4 | 6.1％ |
| 816 | 22.4 | 6.9％ |
| 824 | 11.9 | 3.4％ |
| 853 | 16.9 | 2.9％ |
| 856 | 19.2 | 4.0％ |
| 894 | 13.2 | 3.0％ |
表7显示了混合培养中产生的六种抗体之每种的量的变化是非常小的(推测起来在方法的检测限度内)，尽管有如下实情，即在不同的天数用来自不同摇瓶的克隆接种混合培养物，并彼此独立地取出细胞。
图4中的IEX层析谱显示了培养12天后每种抗体的相对量。尽管在设置生物反应器中的故意变化，8个生物反应器中的6种抗体之每种的所得分布是高度相似的，指明该方法是稳健且高度可重复的。另外，此实施例表明，可以在没有任何技术问题的情况中进行8个分开的培养，提示该方法适合于大规模制备多克隆抗体或其它多克隆蛋白质。
实施例4：动物中的分开生产、混合、之后DSP(mixing before DSP)
根据选择的动物，将IgG重链和轻链基因克隆入合适的表达载体中，其中两种基因的表达在将基因表达引导至乳腺的β-酪蛋白启动子的控制下，并使用合适的标志物基因。将表达构建体转染(例如使用LipofectAMINETM等)入合适的供体细胞系(例如胚胎成纤维细胞)中。通过在合适的培养基中进行的随后培养来选择选择标志物抗性细胞。通过PCR和Southern印迹来测定各细胞系以检测两种转基因的存在。通过荧光原位杂交(FISH)对候选细胞系的进一步表征应当确认重链和单链转基因在单一染色体上的共定位。对去核卵母细胞(胞质)使用电融合，在体细胞核移植(SCNT)中使用正确转染的细胞系。然后将SCNT胚泡转移入具有来自受体动物的黄体的子宫中。使接受者返回到牧群以等候随后评估怀孕测定。通过对皮肤活组织检查的PCR分析来对后代分析IgG H和L基因。
将阳性克隆的后代进行激素泌乳，并挤奶来收集样品以测定IgG表达。使用在奶中具有令人满足的IgG水平的克隆动物作为生产牧群的建立者动物。使用此方法生成每种抗体的牧群。通过ELISA(或类似的)对来自此牧群集合的奶分析IgG水平，并于约4℃在贮存罐中贮存。可以基于IgG水平来完成纯化前的奶混合，或者可以分开纯化奶批次。
可以应用类似的方法来在完整的植物中进行制备。
Claims (33)
1.一种用于制备药物产品的方法，所述药物产品包含多克隆蛋白质的至少两种独特的蛋白质成员，所述方法包括下列步骤：
a)提供至少两个细胞群体，其中每个群体编码所述多克隆蛋白质的一种独特成员，并且装入包含培养基和表达所述蛋白质的细胞的物理上分开的容器中，其中所述方法包括上游部分，其包括下列步骤：
i)在分开的容器中在种子培养的一个或多个步骤中扩充所述至少两个细胞群体；
ii)在接种物培养的一个或多个步骤中从所述种子培养物扩增细胞；
iii)在有利于所述蛋白质成员表达的条件下在生产期中从所述接种物培养物培养细胞，从而表达所述至少两种独特的蛋白质成员；
其中至少在所述种子培养期间将所述至少两个细胞群体保持分开；
b)收获所表达的蛋白质；
c)对所收获的蛋白质实施至少一个纯化步骤；
d)获得纯化的药物物质；并
e)将纯化的药物物质配制成多克隆药物产品。
2.权利要求1的方法，其中将所述至少两个细胞群体保持分开，至少直到和包括所述接种物培养。
3.权利要求1的方法，其中将所述至少两个细胞群体保持分开，至少直到和包括所述生产期。
4.权利要求1的方法，其中将由所述至少两个细胞群体所表达的所述至少两种独特蛋白质成员保持分开，至少直到和包括所述蛋白质收获。
5.权利要求1的方法，其中将由所述至少两个细胞群体所表达的所述至少两种独特蛋白质成员保持分开，至少直到和包括至少一个纯化步骤。
6.权利要求1的方法，其中将由所述至少两个细胞群体所表达的所述至少两种独特蛋白质成员保持分开，至少直到和包括获得所述药物物质。
7.权利要求1-3中任一项的方法，其中组合所述至少两个细胞群体的相等数目的细胞。
8.权利要求1-3中任一项的方法，其中组合所述至少两个细胞群体的不同数目的细胞。
9.权利要求8的方法，其中组合来自不同群体的细胞以获得多克隆细胞群体，其能够表达近似相等量的所述多克隆蛋白质的独特成员。
10.权利要求1-3中任一项的方法，其中以预先规定的比率混合来自所述至少两个细胞群体的细胞。
11.权利要求10的方法，其中以如下的比率组合来自所述至少两个细胞群体的细胞，所述比率在所述药物物质或产品中给予预先规定比率的所述独特的蛋白质成员。
12.权利要求1-6中任一项的方法，其中组合来自所述多克隆蛋白质的独特成员的细胞培养物的等体积。
13.权利要求1-6中任一项的方法，其中组合等量的所述多克隆蛋白质的独特成员。
14.权利要求1-6中任一项的方法，其中以如下的比率组合所述多克隆蛋白质的至少两种独特成员，所述比率在所述药物物质或药物产品中给予预先规定比率的所述独特的蛋白质成员。
15.权利要求1-5中任一项的方法，其中在至少一个初始纯化步骤期间将至少一种独特的蛋白质成员与其它一种或多种成员保持分开。
16.前述权利要求中任一项的方法，其中对至少两种独特的细胞群体和/或由所述至少两个细胞群体所表达的至少两种独特的蛋白质成员平行地进行制备方法的不同部分。
17.权利要求1-15中任一项的方法，其中对至少两种独特的细胞群体和/或由所述至少两个细胞群体所表达的至少两种独特的蛋白质成员连续地进行制备方法的不同部分。
18.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤a)期间进行培养所使用的容器选自下组：摇瓶、转瓶、T-烧瓶、和非一次性和一次性生物反应器。
19.前述权利要求中任一项的方法，其中使用对于表达不同蛋白质成员相同的培养基成分和方法参数来进行制备方法的不同部分。
20.前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少两个细胞群体是相同的，只是编码所述独特的蛋白质成员的表达载体序列有差异。
21.权利要求20的方法，其中所述至少两个细胞群体是相同的，只是编码所述独特的蛋白质成员的可变区的至少一种表达载体序列有差异。
22.权利要求20的方法，其中所述多克隆蛋白质的至少一种独特成员包含一个恒定区，而至少一种其它独特成员包含不同的恒定区。
23.前述权利要求中任一项的方法，其中所述多克隆蛋白质的至少一种独特成员包含一种糖基化样式，而至少一种其它独特的成员包含不同的糖基化样式。
24.前述权利要求中任一项的方法，其中所述多克隆蛋白质包含至少三种独特成员。
25.前述权利要求中任一项的方法，其中所述多克隆蛋白质是分泌的。
26.权利要求25的方法，其中所述多克隆蛋白质是多克隆抗体或多克隆抗体片段。
27.前述权利要求中任一项的方法，其中所述多克隆蛋白质是多聚体蛋白质。
28.权利要求1-27中任一项的方法，其中所述细胞是原核的。
29.权利要求1-27中任一项的方法，其中所述细胞是真核的。
30.权利要求29的方法，其中所述真核细胞来自真核生物体，其选自下组：植物、酵母、真菌、脊椎动物和无脊椎动物。
31.权利要求29的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
32.权利要求31的方法，其中所述哺乳动物细胞选自下组：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、BHK细胞、骨髓瘤细胞、NIH 3T3细胞、成纤维细胞、羊膜细胞、永生化人细胞，诸如HeLa细胞、HEK293细胞和PER.C6细胞。
33.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括制备和/或其后纯化期间的至少一个步骤以验证所述多克隆蛋白质的每个成员的存在和/或量。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US4738908P | 2008-04-23 | 2008-04-23 | |
| DKPA200800580 | 2008-04-23 | ||
| US61/047,389 | 2008-04-23 | ||
| DKPA200800580 | 2008-04-23 | ||
| PCT/DK2009/050094 WO2009129814A1 (en) | 2008-04-23 | 2009-04-23 | Methods for manufacturing a polyclonal protein |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102007146A true CN102007146A (zh) | 2011-04-06 |
Family
ID=40091979
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2009801131977A Pending CN102007146A (zh) | 2008-04-23 | 2009-04-23 | 用于制备多克隆蛋白质的方法 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20110117605A1 (zh) |
| EP (1) | EP2280998A1 (zh) |
| JP (1) | JP2011518790A (zh) |
| KR (1) | KR20110016899A (zh) |
| CN (1) | CN102007146A (zh) |
| AU (1) | AU2009240386A1 (zh) |
| BR (1) | BRPI0910454A2 (zh) |
| CA (1) | CA2722348A1 (zh) |
| IL (1) | IL208163A0 (zh) |
| MX (1) | MX2010011293A (zh) |
| NZ (1) | NZ588651A (zh) |
| RU (1) | RU2010147652A (zh) |
| SG (1) | SG189793A1 (zh) |
| WO (1) | WO2009129814A1 (zh) |
| ZA (1) | ZA201006765B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112204127A (zh) * | 2018-06-01 | 2021-01-08 | 龙沙有限公司 | 用于有机生长和分阶段的中等规模模型 |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2009287165A1 (en) * | 2008-08-29 | 2010-03-04 | Symphogen A/S | Method for cloning avian-derived antibodies |
| AU2011324870B2 (en) | 2010-11-01 | 2015-01-29 | Symphogen A/S | pan-HER antibody composition |
| JP6092782B2 (ja) * | 2010-11-16 | 2017-03-08 | エクセリミューン， インコーポレイテッド | 組換えタンパク質の製造方法 |
| BR112014027291A2 (pt) | 2012-05-02 | 2017-08-08 | Symphogen As | composições de anticorpos pan-her humanizados |
| WO2015095809A1 (en) * | 2013-12-20 | 2015-06-25 | Biogen Idec Ma Inc. | Use of perfusion seed cultures to improve biopharmaceutical fed-batch production capacity and product quality |
| EP3194444B1 (en) | 2014-09-16 | 2019-07-10 | Symphogen A/S | Anti-met antibodies and compositions |
| DE102014220306B3 (de) * | 2014-10-07 | 2015-09-03 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Automatisches Verfahren zur Beobachtung von Zellkulturwachstum |
| US11566082B2 (en) | 2014-11-17 | 2023-01-31 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Mutated immunoglobulin-binding polypeptides |
| CN109311948B (zh) | 2016-05-11 | 2022-09-16 | 思拓凡生物工艺研发有限公司 | 清洁和/或消毒分离基质的方法 |
| US10730908B2 (en) | 2016-05-11 | 2020-08-04 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Separation method |
| US10889615B2 (en) | 2016-05-11 | 2021-01-12 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Mutated immunoglobulin-binding polypeptides |
| EP3455243B1 (en) | 2016-05-11 | 2021-03-24 | Cytiva BioProcess R&D AB | Separation matrix |
| US10703774B2 (en) | 2016-09-30 | 2020-07-07 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Separation method |
| US10654887B2 (en) | 2016-05-11 | 2020-05-19 | Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab | Separation matrix |
| CN109311949B (zh) | 2016-05-11 | 2022-09-16 | 思拓凡生物工艺研发有限公司 | 储存分离基质的方法 |
| MA49042A (fr) | 2017-04-05 | 2020-02-12 | Symphogen As | Polythérapies ciblant pd-1, tim-3 et lag-3 |
| EP3714035A4 (en) * | 2017-11-22 | 2021-08-18 | Culture Biosciences, Inc. | FERMENTATION AUTOMATION WORK CELL |
| CA3104390A1 (en) | 2018-06-22 | 2019-12-26 | Genmab A/S | Method for producing a controlled mixture of two or more different antibodies |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PT1231268E (pt) * | 1994-01-31 | 2005-11-30 | Univ Boston | Bancos de anticorpos policlonais |
| AU6206701A (en) * | 2000-05-26 | 2001-12-03 | Symphogen As | Recombinant or purified polyclonal antibodies for treating allergy |
| US6849259B2 (en) * | 2000-06-16 | 2005-02-01 | Symphogen A/S | Polyclonal antibody composition for treating allergy |
| US6610472B1 (en) * | 2000-10-31 | 2003-08-26 | Genetastix Corporation | Assembly and screening of highly complex and fully human antibody repertoire in yeast |
| US20040087014A1 (en) * | 2000-11-28 | 2004-05-06 | Huse William D | Eukaryotic expression libraries and methods of use |
| EP1523496B1 (en) * | 2002-07-18 | 2011-06-29 | Merus B.V. | Recombinant production of mixtures of antibodies |
| DE602004002275T2 (de) * | 2003-01-07 | 2007-09-06 | Symphogen A/S | Verfahren zur herstellung rekombinanterpolyklonaler proteine |
| US20060275766A1 (en) * | 2003-01-07 | 2006-12-07 | Haurum John S | Method for manufacturing recombinant polyclonal proteins |
| AU2004264265C1 (en) * | 2003-08-14 | 2012-06-28 | Thrombogenics Nv | Antibodies against factor VIII with modified glycosylation in the variable region |
| WO2006007850A1 (en) * | 2004-07-20 | 2006-01-26 | Symphogen A/S | Anti-rhesus d recombinant polyclonal antibody and methods of manufacture |
| US8288109B2 (en) * | 2004-07-20 | 2012-10-16 | Symphogen A/S | Procedure for structural characterization of a recombinant polyclonal protein or a polyclonal cell line |
| US7612181B2 (en) * | 2005-08-19 | 2009-11-03 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
| EP2314619A1 (en) * | 2005-12-05 | 2011-04-27 | Symphogen A/S | Anti-orthopoxvirus recombinant polyclonal antibody |
| TW200846362A (en) * | 2007-02-09 | 2008-12-01 | Symphogen As | A polyclonal antibody product |
| PL2152872T3 (pl) * | 2007-05-25 | 2011-03-31 | Symphogen As | Sposób wytwarzania rekombinowanego białka poliklonalnego |
-
2009
- 2009-04-23 MX MX2010011293A patent/MX2010011293A/es active IP Right Grant
- 2009-04-23 AU AU2009240386A patent/AU2009240386A1/en not_active Abandoned
- 2009-04-23 CN CN2009801131977A patent/CN102007146A/zh active Pending
- 2009-04-23 SG SG2013028964A patent/SG189793A1/en unknown
- 2009-04-23 CA CA2722348A patent/CA2722348A1/en not_active Abandoned
- 2009-04-23 WO PCT/DK2009/050094 patent/WO2009129814A1/en active Application Filing
- 2009-04-23 JP JP2011505362A patent/JP2011518790A/ja not_active Withdrawn
- 2009-04-23 US US12/989,340 patent/US20110117605A1/en not_active Abandoned
- 2009-04-23 KR KR1020107026241A patent/KR20110016899A/ko not_active Application Discontinuation
- 2009-04-23 RU RU2010147652/10A patent/RU2010147652A/ru not_active Application Discontinuation
- 2009-04-23 EP EP09734906A patent/EP2280998A1/en not_active Withdrawn
- 2009-04-23 NZ NZ588651A patent/NZ588651A/en not_active IP Right Cessation
- 2009-04-23 BR BRPI0910454A patent/BRPI0910454A2/pt not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-09-15 IL IL208163A patent/IL208163A0/en unknown
- 2010-09-21 ZA ZA2010/06765A patent/ZA201006765B/en unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112204127A (zh) * | 2018-06-01 | 2021-01-08 | 龙沙有限公司 | 用于有机生长和分阶段的中等规模模型 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2722348A1 (en) | 2009-10-29 |
| IL208163A0 (en) | 2010-12-30 |
| RU2010147652A (ru) | 2012-05-27 |
| MX2010011293A (es) | 2010-12-20 |
| US20110117605A1 (en) | 2011-05-19 |
| KR20110016899A (ko) | 2011-02-18 |
| SG189793A1 (en) | 2013-05-31 |
| ZA201006765B (en) | 2012-03-28 |
| BRPI0910454A2 (pt) | 2018-03-27 |
| AU2009240386A1 (en) | 2009-10-29 |
| JP2011518790A (ja) | 2011-06-30 |
| NZ588651A (en) | 2012-04-27 |
| EP2280998A1 (en) | 2011-02-09 |
| WO2009129814A1 (en) | 2009-10-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102007146A (zh) | 用于制备多克隆蛋白质的方法 | |
| AU734800B2 (en) | Production of a multimeric protein by cell fusion method | |
| JP7344949B2 (ja) | グルタミンシンセターゼ遺伝子内相補ベクターを用いた高レベルのヘテロマータンパク質発現細胞の直接選択 | |
| TW200907059A (en) | Recombinant expression vector elements (rEVEs) for enhancing expression of recombinant proteins in host cells | |
| UA115533C2 (uk) | ГУМАНІЗОВАНЕ МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО, СПЕЦИФІЧНЕ ДО КОМПЛЕКСУ αβTCR/СD3 ЛЮДИНИ | |
| BR112021011063A2 (pt) | Transposase piggybac mutada | |
| CN102498212B (zh) | Cho/cert细胞系 | |
| CA2561702A1 (en) | Methods for altering protein production rates | |
| EA011619B1 (ru) | Экспрессионный вектор и способ продуцирования высоких уровней белков | |
| CN114395041B (zh) | 一种制备抗il-12和/或il-23单克隆抗体的方法 | |
| US20110189734A1 (en) | Novel methods and cell lines | |
| JP2024517711A (ja) | 高シアル酸付加細胞 | |
| WO2024068995A1 (en) | Novel transposase system | |
| AU768101B2 (en) | Production of a multimeric protein by cell fusion method | |
| EP4330383A1 (en) | Hypersialylating cells | |
| JP2023538581A (ja) | 細胞培養プロセス | |
| CN111116749A (zh) | 重组的人源化gpc3抗体及其构建和应用 | |
| EA043386B1 (ru) | Прямой отбор клеток, экспрессирующих высокие уровни гетеромерных белков, с использованием глутаминсинтетазных векторов внутригенной комплементации |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110406 |