EA011619B1 - Экспрессионный вектор и способ продуцирования высоких уровней белков - Google Patents

Abstract

Способ высокой экспрессии представляющего интерес белка, с использованием экспрессионного вектора. Способ включает, по меньшей мере, следующие регуляторные элементы: a) промотор CMV или его функциональные варианты, b) интрон, c) TPL или его функциональные варианты, d) VA гены или функциональные варианты и e) последовательность полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота или функциональные варианты.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым экспрессионным векторам для продуцирования высоких уровней белка в клетках млекопитающих и способу продуцирования представляющих интерес белков с использованием указанных векторов. Экспрессионные векторы дают экспрессию рекомбинантного белка ЕРО на 80-100% выше, чем некоторые из лучших векторов, описанных в литературе.

Предшествующий уровень техники

В соответствии с данными ΙΜ8, прогнозируется рост биофармацевтической части общего фармацевтического рынка с 6% в 1999 г. до 14% (90 миллиардов долларов) в 2009 г. Такой повышенный интерес к биопрепаратам в основном происходит благодаря их, как правило, высокоспецифичному направленному действию, которое приводит к значительно уменьшенному и строго определенному риску токсичности по сравнению с лекарственными средствами на основе малых молекул. Более того, при использовании рекомбинантных методик для производства указанных биопрепаратов, в отличие от устаревших методов их очистки от тканевых экстрактов или жидкостей организма, могут быть легко получены продукты очень высокой чистоты и с высокой степенью безопасности и со строго определенными физикохимическими характеристиками. Несмотря на обладание всеми такими благоприятными для пациента качествами, большинство рекомбинантных биопрепаратов остается недоступным для большинства людей в мире, потому что они продолжают оставаться непомерно дорогими. Поэтому спасающие жизнь лекарственные средства, подобные эритропоэтину, лекарственные средства, подобные этанерцепту, которые значительно улучшают качество жизни, и многие противораковые лекарственные средства, подобные ритуксимабу, трастузумабу и всем другим моноклональным антителам, и т.д., являются доступными только для очень небольшого процента людей, в то время как подавляющее большинство больных людей повсюду в мире не может использовать их в достаточном количестве. Поэтому существует крайняя необходимость снизить цену на указанные лекарственные средства. Большая составная часть такой высокой цены связана с их производством. Настоящее изобретение обеспечивает решение данной проблемы посредством предоставления экпрессионных векторов, которые могут дать высокую экспрессию белка в клетках-хозяевах из млекопитающих, трансфицированных ими.

В последние годы технология рекомбинантных ДНК продвинулась к стадии, где вообще возможно получение желаемого гена, кодирующего желаемый белковый продукт, также называемый биологическим, когда белок впоследствии используется как терапевтический. Когда ген получен, может быть использован широкий круг хозяев для их экспрессии, путем первоначального клонирования гена в любой из множества доступных специфичных по отношению к хозяину экспрессионных векторов, с последующим введением ген-несущего вектора в специфического хозяина путем использования различных способов трансформации и трансфекции. Для того чтобы получить белковую продукцию от таких гентрансформированных клеток-хозяев, различные условия инкубации также являются подходящими. Выбор хозяина и последующие взаимозависимые выборы, например, экспрессионных векторов, способов трансформации и трансфекции и инкубационных методик, зависят от многих факторов, таких как особенности белка, который должен быть продуцирован, конечное использование белка, количество требуемого белка, доступные методы очистки, общая стоимость и доступность технологии, и т. д. Например, относительно интересов данного изобретения, когда продуцируемый рекомбинантный белок предназначен для терапевтического применения, первичная, вторичная и третичная структура белка, степень и качество их гликозилирования, чистота конечного продукта, количество продуцируемого белка, цена, по которой лекарственное средство может быть продано, все способствует вышеприведенному процессу выбора экспрессионного хозяина и выполнения других взаимозависимых выборов.

Одно возможное решение, направленное на вышеуказанную проблему высокой стоимости продукции биологических препаратов, состоит в экспрессии их в бактериальных клетках-хозяевах, таких как Е. сой [Матшо, Μ.Η., ВюРйатш, 2:18-33 (1989); Ссогдюи 6., Ргокш спдтссттд: Рг1пс1р1сь апб ртасбсс, \УПсу Ь188, №\ν Уотк, 101-127 (1996); 6о1б, Ь. МсШобб Епгуто1, 185:11-14 (1990); Нобдзоп, 1., Вю/Тссйпо1оду, 11:887-893 (1993); №саиб й а1, 1. Вю1ссйпо1. 3:255-270 (1986); О1ш8, Р.О., апб 8.С. Ьсс., Сигг. Орш. Вю1сс1шо1. 4:520-525 (1993); ^йакшап, А.Р., Сигг. Орш. Вю1сскпо1, 6:491-493 (1995)]. Обычно используемый бактериальный хозяин, ЕбсйспсЫа сой, является важным организмом-хозяином для продуцирования рекомбинантных белков и широко используется в промышленном масштабе. Это представляет много преимуществ, включая легкое культивирование, низкую стоимость и высокий потенциал продуцирования [8йийиа Тап с1 а1, Ртокш схртсббюп апб РипЕсайоп, 25:430-436 (2002); Сотпсйа Яоббтапп с1 а1, Ртокш схртсббюп апб РштПсайоп 7:335-342 (1996)]. Однако бактериальные хозяева, как правило, не идеальны для продуцирования биологических препаратов, потому что они не имеют необходимого механизма гликозилирования белков [О1б Р V. апб Рпттозс 8.В., Рттс1р1с8 о£ 6спс Машри1а1юп8, Ап шбобисйоп 1о дспсйс Епдтссттд, В1аск\\'с11 бсюпсс, ИпПсб Кшдбот. (1994)], и большинство терапевтических белков млекопитающих не являются полностью функциональными без соответствующего гликозилирования. Кроме того, отсутствие секреторного механизма для эффективного высвобождения белка в культуральную среду, ограниченная способность обеспечения образования пространственной дисульфидной связи, неправильный фолдинг, разрушение белка протеазами клеток-хозяев, существенные различия в использовании кодонов, другие модификации, такие как гликации, и т.д., вместе делают бактериальные систе

- 1 011619 мы намного менее привлекательными, нежели системы млекопитающих [Еип, С. е! а1., 1. ΒίοΙ. С1ет, 2 65:3111-3115 (1990); Ыаид е1 а1., Вюсйет. 1., 229:429-439 (1985); 8атт1еп!ок е1 а1., Вю/Тесйио1оду, 7:495501 (1989); 8аууак С. Макпбек, М1стоЫо1од1са1 Веу1етк, 8ер!. 1996. 512-538; N. 1епкшк апб Е. М. СитИпд, Епхуше МютоЬ. Тес1по1, 16:354-364 (1994)]. Поэтому, в большинстве случаев невозможно экспрессировать терапевтические белки в бактериях и большинство биопрепаратов используют эукариотические клетки-хозяева для экспрессии, несмотря на то, что это означает более высокую стоимость производства из-за более низких уровней экспрессии рекомбинантного белка, более жестких условий культивации, более низких скоростей роста и т.д. [(Сотпейа Вокктапп, Рто!ет Ехргеккюп апб Рипйсабоп, 7:335-342 (1996); СеоГГ Т. УатгаШоп, Сштеп! Оршюп ш Вю!есйпо1оду, 1:133-140 (1990)]. Так как системы-хозяева млекопитающих обладают большим преимуществом при продуцировании терапевтических белков, очень важно решить проблему высокой стоимости производства, связанной с ними. Так как стоимость производства может быть снижена посредством увеличения продуктивности, значительные усилия должны быть затрачены на увеличение количества продукта, который может быть продуцирован этими клетками-хозяевами. Факторы, которые обычно влияют на количество продукта, продуцируемого клетками-хозяевами, включают факторы, которые являются внешними по отношению к клетке, такими как условия культивирования, и те, которые являются внутренними для клеток, большинство которых включает факторы, которые регулируют эффективность и качество транскрипции [Еоескшд апб НоГ5(е(1ег, Сепе, 45:101-105 (1986); КаиГтап е1 а1, 1оитпа1 оГ то1еси1аг Вю1оду, 159:601-621 (1985); \Уигт е1 а1, ΡΝΆ8, 1983:5414-5418 (1986); Ве1кег апб Наикег, Итид Векеатсй, 37:482-485 (1987); 2е!!1те1кк1 е1 а1, Вю!ес1по1оду, 5:720-725 (1987)] и трансляции [(В. СтаЬйетг апб К. Вауег, Еооб ТесйпоГ Вю!есЬпо1. 39 (4) 265-269 (2001); Вапба1 1. КаиГтап е1 а1. Мо1еси1аг Вю!есйпо1оду, 16 (2), 151-160, (2000); 1ита] Н1ауа1у е1 а1., У1го1оду 341, 1-11, (2005); СМ. 8!епк!гот е! а1,, Сепе. 273(2), 259-65, (2001); М. 1ЬЬа апб И. 8об, 8οΐепсе, 186, 1893, (1999), и преимущественно обусловлены непосредственно конструкцией экспрессионного вектора. Хотя в литературе сообщается о многих попытках увеличения продуктивности клеток-хозяев посредством улучшения условий культивирования [Ра1егто Ό.Ρ. е! а1., 1оитпа1 оГ Вю!есйпо1оду, 19:35-48 (1991); Висй апб Егоиб, Вю1од1са1к, 22:127-133 (1994); Октап е! а1, Вю!есйпо1оду апб Вюепдтееппд, 77:398-407 (2003); ОехепдоШа е! а1, Вю!есйпо1оду апб Вюепдтееппд, 77:369-380 (2002); 8с1ипе1хег & Мй1ет, Вю!есйпо1оду Ргод, 18:346-353 (2002); ОехепдоШа е! а1., Вю!есйпо1оду апб Вюепдтееппд, 78:741752 (2002); и 8ип е! а1, Вю!есйпо1оду Ргод., 20:576-589 (2004)], улучшение внешних факторов могут увеличить экспрессию только в ограниченной степени и коммерчески неэффективно, до тех пор, пока экспрессионный вектор не будет исходно оптимизирован для достижения идеального базового уровня экспрессии.

О большом числе исследований сообщается в уровне техники, которые направлены на внутренние факторы улучшения экспрессии гена. Внутренние факторы, описанные ниже, также известны как регуляторные элементы, которые регулируют генную экспрессию различными путями. Из уровня техники хорошо известно, что для достижения экспрессии представляющего интерес гена из экспрессионного вектора, он должен находиться под влиянием соответствующей 5' и 3' фланкирующей последовательности, которая даст возможность гену стать транскрибированным в мРНК и затем точно транслированным в белок. Описано много важных 5' и 3' фланкирующих последовательностей, таких как ТАТА-боксы [Вокйай, М. е! а1., Се11, 41:521-530 (1985); Втотшпд, К.8. е! а1. 1. Вю1. С1ет., 263:9630-9634 (1998); Потксй-Нак1ег, К. е! а1., ΡNΑ8, 82:8325-8329 (1985)], промоторов из числа вирусных промоторов, таких как прямой ранний промотор СМУ (цитомегаловирус), ранний или поздний промотор 8У40, основной поздний промотор аденовируса [Ьшд1 В., Сепе, 168:195-198 (1996); Р177отпо, М.С. е! а1., 1. У1го1., 62:11671179 (1988); Окауата апб Вегд, Мо1. Се11 Вю1, 2:161-171 (1982); \\опд е! а1., 8с1епсе, 228:810-815 (1985); Еоескшд апб НоГк!еГГег, Сепе, 45:101-105 (1986)] и промоторы млекопитающих, такие как мышиный металлотиониновый промотор, куриный β-актиновый промотор [№1со1е 1кгае1 е! а1., Сепе, 51:197-204 (1987); Капп, М. апб Вюйатбк, №а!иге, 299:797-802 (1982); М|уахак| е! а1., Ргос. №а!1. Асаб. 8ск И8А, 83:9537-9541 (1986)], энхансеров, таких как прямой ранний энхансер СМУ [Соске!!, М.1. е! а1., №ис1ею Ас1бк Векеатсй, 19:319-325 (1996)], старт- и стоп-кодонов трансляции [Ьейитдет е! а1, Рппс1р1ек оГ Вюсйет1к!ту - 3^гб еб1Иоп, \Уог111 РиЬНкйегк, С1ар!ег 27, р1025], и сайтов полиаденилирования, таких как сайты полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота (ВСН) и 8У40 [Сагкте11, 8. апб А1тше, 1.С, Мо1. Се11. Вю1. 9:4248-4258 (1989)]. Интроны являются другим внутренним фактором, который обычно формирует существенную часть эукариотических генов в качестве промежуточных последовательностей между экзонами и тем, что точно удаляется из первичного транскрипта способом, известным как РНК сплайсинг с образованием зрелой мРНК. РНК сплайсинг был показан как отвечающий за стабильность мРНК [Висйтап е! а1, Мо1. Се11 Вю1. 8:4395-404 (1988); Ре!егкоп е! а1, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, 83:8883-87 (1986)] и регуляцию генной экспрессии [Вппк!ет е! а1, Ргос. №а!1. Асаб. 8с1. И8А, 85:836-40 (1988); Иупап, ν.8. апб Трап, В., №а!иге, 316:774-778 (1985)]. Также были разработаны синтетические химерные интроны, как сообщено Ниапд и др., которые состоят из 5' донорного сайта основного позднего транскрипта аденовируса и 3' сплайсингового сайта мышиного иммуноглобулина [Ниапд е! а1, №ис1ею Ас1бк Век., 18:937-47 (1990)]. Такие химерные интроны поддерживают гетерологичную генную экспрессию лучше, чем обычно используемые интроны. [Ниапд е! а1, №ис1ею Ас1бк Век., 18:937-47 (1990); Теб С1ю1 е! а1, Мо1еси1аг апб

- 2 011619

Се11и1аг Бю1оду, 11 (6) : 3070-3074 (1991)].

Как правило, используемым источником для высокоэффективных внутренних факторов, являются вирусы. Вирусы, как общеизвестно, являются наиболее эффективными паразитами в природе, которые используют свои собственные внутренние факторы для манипулирования хозяевами и экспрессии вирусного гена с целью размножения и выживания. Это также широко изучалось для определения их роли в конструкции экспрессионных векторов с целью усовершенствования белковой продукции. Некоторые из наиболее эффективных промоторов, известных в области молекулярной биологии, произведены из вирусов [Ьшд1 Я., Сепе, 168:195-198 (1996); Ρίζζοτηο, М.С. е! а1., 1. Упо1, 62:1167-1179 (1988); Окауата аий Вегд, Мо1. Се11. Вю1, 2:161-171 (1982); \\опу е! а1., 8с1епсе, 228:810-815 (1985); Еоескт§ апй НоГЧеГГег. Сеие, 45:01-105 (1986)]. Множество вирусов изучалось в значительной степени на генетическом уровне, и были идентифицированы индивидуальные последовательности, которые могут изменять ядерный и цитоплазматический метаболизм мРНК в клетках-хозяевах. Тройной лидерный элемент из аденовируса (ТРЬ) (СТ 209811) [Акиуат С. е! а1, 1 Мо1 Вю1., 134 (1) : 143-58 (1979)] является, как известно, одним из таких элементов для улучшения трансляции даже невирусной РНК в инфицированных вирусом клетках, когда непосредственно прикреплен к ней [Вегкпег К.Ь. е! а1, Нис1е1с Лайк Яек., 13(3):841-57 (1985)].

Все мРНК, кодируемые частью основной поздней транскрипции аденовируса, имеют общую 5' некодирующую область. Этот элемент может уменьшать период полужизни транскриптов [Ниапд е! а1, 1. У1то1., 2(1):225-35 (1998)]. Этот элемент, как известно, усиливает трансляцию мРНК [КаиГтап Я. 1. е! а1, Ргос №111 Асай

8с1 И8А., 82(3):689-93 (1985)]. Другим элементом является вирусные РНК-ассоциированные гены I и II аденовируса (СТ 209811) или их функциональные варианты. УА РНК гены I и II (УА гены), как показано, увеличивают эффективность трансляции гена, содержащего последовательность ТРЬ [КаиГтап Я. 1. е! а1, Ргос №!1 Асай 8ά И8А., 82(3):689-93 (1985)]. УА РНК ген I вовлечен в дефосфорилирование Е1Р2а и, соответственно, увеличивает скорости белкового синтеза [О'Ма11еу е! а1, Се11, 44:391-400 (1986); ТЫштараууа В., е! а1, Се11, 31:543-551 (1982)].

Другим обычно используемым внутренним фактором является количество генных копий, которые являются удобным приемом для увеличения генной экспрессии [КаиГтап апй 8Ьагр, 1оитпа1 оГ то1еси1аг Вю1о§у, 159:601-602 (1982); Репйке С.1. е! а1, Вю!есЬпо1о§у апй Вюепдшееттд, 40:119-129 (1992); 8сЫтке, Я.Т. (Ей.), Сепе Атрййсайоп. Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу,

Со1й 8рпп§ НагЬог, ΝΥ, 1982]. Наиболее общим способом, используемым для увеличения количества генных копий, является выбор клеток для генной амплификации. При таком подходе, например, как описано в ЕР0045809 или И84634665, клетка-хозяин трансформируется парой генов. Первый ген в паре кодирует желаемый белок, и второй ген кодирует маркер селекции, например, дигидрофолатредуктазу (ЭНЕЯ) [А1!, Е.^. е! а1., 1. Вю1. СЬет., 253:1337-1370 (1978)]. Указанные два гена представлены на одном экспрессионном векторе или на двух отдельных экспрессионных векторах. После трансфекции клеток указанной парой генов они культивируются в увеличивающихся концентрациях токсического агента, такого как метотрексат в случае метода, использующего ген ЭНЕЯ в качестве маркера селекции, действие которого нивелируется продуктом гена-маркера селекции. Было обнаружено, что клеточные линии, которые выживают при повышенных концентрациях токсического агента, имеют увеличенное количество копий и гена-маркера селекции, и желаемого генного продукта. Выбранная клетка-хозяин, которая имеет увеличенное количество копий релевантного гена, теперь может произвести больше количества желаемого белка, чем исходная клеточная линия. Подобная стратегия для генной амплификации использовалась с другими маркерами селекции, такими как аденозиндезаминаза (АЭА), орнитиндекрабоксилаза (ОЭС), аспарагинсинтетаза (А8) [СЫапд, Т. апй МсСоп1одие, Мо1. Се11. Вю1. 764-769 (1988); Сатег, М. е! а1., Мо1. Се11. Вю1., 7:1623-1628 (1987); Сегтапп, и.А. е! а1., 1. Вю1. СЬет. 264:7418-7424 (1989); МкеШе Сатег апй СйГГогй Р. 8!аппет8, Сепе, 95:223-230 (1990); \Уоой С.Я. е! а1., 1 ^типок 145:3011-3016 (1990); Ке11етк Я. Е. е! а1., й Сепейск апй Мо1еси1аг Вю1оду оГ !пйи81г1а1 Мютоотдашктк, Атепсап 8оае1у Гог МюгоЬю1о§у, ^а8Ыпд!оп, 215-225 (1989)] и глутаминсинтетаза (С8) [Са!Ьеппе ^-Н. е! а1., 1. Вю1. СЬет., 276:43, 39577-39585 (2001); ВеЬЬшд!оп, е! а1., Вю!есЬпо1о§у, 10:169-175 (1992); ВеЬЬтд!оп, С.Я., Мопос1опа1 апйЬойек: !Ье пех! депегайоп, 2о1а,Н, (ей). Вюк 8с1епййс, ОхГогй, 65-181 (1995); ^йкоп, Я.Н., й Сепе Атрййсайоп т Маттайап Се11к ей Ке11епк, Я.Е., Магсе1 Эеккег йс., Νο\ν Уотк 301-311 (1993)].

Такие вышеописанные регуляторные элементы или внутренние факторы по отдельности являются неспособными давать генную экспрессию и должны использоваться в комбинациях. Несмотря на то, что сами элементы были хорошо поняты, эффективность их комбинаций абсолютно не предсказуема для высокой экспрессии. Некоторые комбинации дают очень низкую экспрессию по сравнению с другими. Для примера, 1апд и др., используя экспрессионный вектор, состоящий из комбинации промотора 8Яа, лидерной последовательности РНК АМУ и ЭНЕЯ, смогли получить экспрессию эритропоэтина (ЕРО)

- 3 011619 только 45 МЕ/мл (эквивалентно 0,346 мкг/мл) [1аид Η Р с1 а1, Вю1есйпо1. Αρρί. Вюсйет, 32:167-172, (2000)], в то время как в и§5955422 сообщается об уровнях ЕРО от 750 до 1470 Ед/миллион клеток/48 часов (или от 375 до 735 Ед/миллион клеток/24 ч), используя экспрессионный вектор, состоящий из другой комбинации элементов, а именно - промотора 8У40 и поли А последовательности и ΌΗΕΚ Однако другой экспрессионный вектор, описанный в и85888774, и состоящий из комбинации промотора ЕЕ1 и элементов ароВ 8ΑΚ, обеспечивает экспрессию от 1500 до 1700 МЕ ЕРО/миллион клеток/24 ч. Для других рекомбинантных белков, таких как ТИЕВ-1дСЕс (ЕиЬте1), был описан экспрессионный вектор, содержащий комбинацию промотора СМУ, ТРЬ, νΑ I и II и ΌΗΕΒ [США 5605690, Сшйу Α 1асоЬ§ аий Сгащ Α 8ιηίΐ1ι|.

Несмотря на все достижения, описанные выше, высокая стоимость производства рекомбинантных биопрепаратов, особенно тех, для которых используют экспрессионные системы млекопитающих, все еще остается главной проблемой. Поэтому, несмотря на то, что уровень техники предоставляет большое количество способов улучшения белковой экспрессии посредством изменения экспрессионного вектора, все же желательно создать новый экспрессионный вектор для дополнительного увеличения продуктивности эукариотических клеток-хозяев. Неожиданно, но, несмотря на большой объем знаний, полученный в данной области более чем за два прошедших десятилетия, даже сегодня специалисты в данной области не могут просто собрать и выбрать комбинацию внутренних факторов или регуляторных элементов для построения экспрессионного вектора, который мог бы дать гарантированно высокую экспрессию. Отдельный элемент, когда он добавлен к комбинации, не может обеспечить какого-либо существенного дополнительного или синергического эффекта к экспрессионному потенциалу вектора. Поэтому способ создания нового экспрессионного вектора, который дал бы высокий уровень белковой экспрессии, все еще требует эмпирического тестирования многих возможностей. Авторы предложили новый экспрессионный вектор, который при стабильной трансфекции в клетки СНО-ΌΗΕΒ дает экспрессию от 11,830 МЕ/мл (91 мкг/мл) при 168 часовом культивировании, что эквивалентно от 2366 до 3549 МЕ/10⁶ клеток/24 ч или от 18,2 до 27,3 мкг/10⁶ клеток/24 ч. Неожиданно такой уровень экспрессии для ЕРО является на 80-100% выше, чем для некоторых из лучших векторов, описанных в литературе. Новый экспрессионный вектор будет существенно снижать стоимость продуцирования ЕРО и других рекомбинантных биопрепаратов.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение решает проблему, описанную ранее в уровне техники, предоставлением нового экспрессионного вектора для значительно улучшенного продуцирования рекомбинантных белков в клетках млекопитающих. Оно также предоставляет способ создания таких векторов и способ применения таких векторов для достижения высокого уровня экспрессии белков.

Таким образом, один из основных объектов данного изобретения обеспечивает усовершенствованный способ достижения высоких экспрессионных уровней представляющих интерес белков путем применения нового вектора, как описано в данном описании.

Следующие последовательности использовали в представленном изобретении.

5Е0. ΙΟ. ΝΟ.1

Тип: ДНК

Длина: 288

Название последовательности: гибридный интрон

Организм-источник: гибрид аденовирусного генного компонента и мышиного генного компонента

ОСААТТААТТ СССТОТСТОС 0А00СССА6С ТОТГООООТО АСГАСТСССТ СТСААА АССО60

СССАТаАСТГ СГОСОСТАА0 АТТОТСАОТТ ТССАААААСО СОАСОАТГТО АТАТТСАССТ120 оссссасаат сатсссттго лааотосссо сотсс атсто сгсаоаааао ас аатсгггтι«ο

ТСТТСТСААО СТТОАССТОТ СОСАООСТТО АОАТСТООСС АТАСАСТТОА ОТОАСААТОА240

САТССАСТТТ СССТТГСТСТ ССАСАООТОТ ССАСТСССАО ОТССААСГ288

8ЕС). ГО. N0.2

Тип: ДНК

Длина: 1470

Название последовательности: ТОТКЯдСЕс

Источник: плацентарная ДНК человека

- 4 011619

АТСбССССССГГССССОТСТОООССОСССТООССОТСООАСТООАаСТСТбООСТОСаОСОСАСОССТТССССССС

САООТООСАТТТАСАСССТАС6ССССООАОСССа(ЗОА<ЗСАСАТ6ССС<ЗСТСЛОАОААТЛСТАТОЛССАСАСАССТ

150

САОАТСТССТССА<ЗСАААТОСТСОССОааССААСАТОСААААОТСТТСТаТАССА.4аАССТССОАСАССОТаТОТ

225

ОАСТССТСТОАОСАСАССАСАТАСАСССАОСТСТСОААСГОаатТСССбАОТССТГСАССТОТСССТСССаСТаТ

300

АаСТСТСАССАСОТбСАААСТСААСССТССАСТСОССААСАОААССаСАТСТаСАССТССАОССССОбСтаОТАС

375 тосасастсАосААССАССАООСОтоссоостатссосссссстссссААОТОССОСССсаастгсоасотсосс

450

АОАССАООААСТСАААСАТСАаАСОТСОТОТбСААОСССТОТОССССИЗООАСаПСТССААСАСОАСТТСАТСС

525

АСаОАТАТТТаСАССССССАСКАОАТСТаТААССТСОТааССАТСССТОСОААТаСААССАТСОАТОСАСЗТСТСС

600

АСОТССАСОТСССССАСССССАОТАТОСССССАССааСАСТАСАСТТАССССАОССАОТСТССАСАСОАТСССАА

675

САСАСОСАбССААСТССАСААСССАаСАСГССТССААССАССТССГГССПЗСТСССААТОСОССССАОССССССА

750

ССТСААСаОАОСАСТаОССАСОАССССАААТСТГОТОАСААААСТСАСАСАТОСССАССОТОСССАССАССТОАА

825

СТССТСЮСаабАСССТСАОТСПССТСТГССССССААААСССААОСАСАСССТСАТОАТСТССС<ЗОАССССТОАС

900

ОТСАСАТССОТ013ТаОТООАСОТОАОССАСОААОАСССТОАбаТСАА<ЭТТСААСТСОТАСОТ6САСООСОТСОАО

975

ОТОСАТААТОССААОАСАААаССОСОаОАООАССАбТАСААСАОСАСОТАССОТатеОТСАОСетССТСАССОТС 1050

8ЕО. ΙΌ. N0.3

Тип: ДНК

Длина: 583

Название последовательности: кДНК эритропоэтина человека Источник: почечная ДНК человека

АТСЮСОСТОСАСОААТОТССТОССТСбСТСТСбСТТСТССТОТСССТССТСТСССТСССТ

СТОСОССТСССАСТССТСООССССССАССАСОССТСАТСТСТСАСАССССАОТССТСаАС

120

АООТАССТСТТООАООССААООАОСССОАСААТАТСАССАСОООСТОТОСТОААСАСТ6С

180 ассттоаатоаоаататсастотсссаоасассаааоттааттгстатосстосааоасю

240

АТСОАСОТССООСАОСАСбСССТАСААСТСТбОСАСООССТООСССТаСТОТСССДАбСТ

300

ОТ<ХТССаС<ЮССАСОСССТОТТООТСААСГСТГСССАасСОТООСАОССССТОСАОСТО

360

САТОТаОАТАААОСССТСАОТООССТТСОСАСССТСАССАСТСТОСГТСОбССТСТОаОА

420

ОСССАОААОСААОССАТСТССССТССАОАТОСОСССТСАОСТаСТССАСТССОААСААТС

480

АСТОСТОАСАСТТТССССАААСТСТГССОАОТСТАСТССААТТТССТССОСаСАААОСТО

540

ААаСТОТАСАСАООООАООССТОСАСОАСАаоСОАСАОАТОА

583

8ЕО. ΙΌ. N0.4

Тип: ДНК

Длина: 373

Название последовательности: ТРЬ

Источник: аденовирус 01:209811

- 5 011619

СТТССаСАТСаСТОТСТССОАСООССАССТОТТааСатаАОТАСТСССТСТСААААОСОО

ОСАТОАСТГСТОСОСТААОАТТСТСАОТТТССАААААСОАОСАСОАТТТОАТАТТСАСТС

120 осссосоотоатоссптсаооотссссссотссатстоотсаоааааоасаатстгттт

180

ОТТОТСААССТТССТТОАТСАТСТСАТАС1ТАТССТОТСССТТТТТТТТССАСАСС1СОС

240 ООТТОАООАСАААСТСТТСССОбТСТТТССАСТАСТСТТООАТССОАААССССТСОСССТ

300

ССОААСООТАСТССОССАССОАОООАССТОАССОАОТССОСАТСОАССООАТСООААААС

360

СТСТСОАСОТАСС

373

8Ер. ГО. N0.5 Тип: ДНК Длина: 417

Название последовательности: УЛ гены I и УЛ гены II

Источник: аденовирус 01:209811

АаСОООСАСТСГГССбТОСТСТОСТСаАТАААТГСССААбООТАТСАТОССООАСОАССО

СаОТТСОААССССООАТССССССОТССООСаТОАТССАТОСОСТТАССОСССаССТОТСа

120 ААСССАСОТОТОСОАСатСАОАСААССбОСОАОСОСТССТТТТОаСТТССТТССАООСОС

180 ООСООСТОСТОСССТЛОСТТТТТГООССАСТООССОСОСОССОСОТААОССгОТТАООСТО

240

ОАААОСОАААССАТТААОТООСТСССТСССТОТАОССООАОООТТАТТТТССААОООТТО

300 АСТСОСАСОАСССССОО'ГГСОАОТСТСССССССОССООАСТССбОСОААСОСОССТТТСС

360 СТССССОТСАТОСААСАССССОСТТОСАААТТССТССООАААСАОСОАСОА6ССССТ

417

Настоящее изобретение использует новую комбинацию из пяти элементов, полученных из вирусов и других различных векторных источников для конструирования нового вектора, который дает синергический эффект таких элементов в виде высокой экспрессии желаемых белков в клетках-хозяевах млекопитающих. Более конкретно, данные экспрессионные векторы состоят из новой комбинации следующих пяти элементов: прямой ранний промотор СМУ, тройной лидерный элемент аденовируса (ТРЬ) (01:209811), гибридный (химерный) интрон (8Е0. ГО. Νο.1), вирусные РНК-ассоциированные гены I и II аденовируса (С!:209811) и последовательность полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота.

Когда такая новая комбинация из пяти элементов используется в соединении с дополнительными элементами в основном векторе, которые необходимы для функционирования его в качестве вектора, новые векторы, полученные таким образом, демонстрируют синергически более высокую экспрессию, чем другие векторы, которые содержат только некоторые из указанных пяти элементов в соединении с основным вектором. При стабильной трансфекции предложенный новый экспрессионный вектор, также содержащий маркер амплификации ΌΗΡΚ, дал на 80-100% выше экспрессию ЕРО, чем некоторые из лучших векторов, описанных в литературе.

Более предпочтительно, новые экспрессионные векторы содержат прямой ранний промотор СМУ, тройной лидерный элемент аденовируса (ТРЬ) (8Е0. ГО. Νο.4), гибридный (химерный) интрон (8Е0. ГО. Νο.1), вирусные РНК-ассоциированные гены I и II аденовируса (8Е0. ГО. Νο.5), сайт клонирования, маркер селекции клеток млекопитающего, маркер селекции прокариотической клетки, маркер амплификации/селекции и сайт полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота, как представлено на соответствующих положениях в указанных векторах.

Белки, которые могут быть продуцированы с использованием таких векторов, включают, но без ограничения, гормоны, например, Ε8Η, антитела, химерные белки, например, этанерцепт, компоненты крови, например, фактор VII, факторы роста, например, эритропоэтин, цитокины, например, интерфероны, ΤΝΡ и тому подобное.

- 6 011619

Описание чертежей

На фиг. 1 представлено схематическое изображение различных ЮТК.-1д6Ес экспрессионных векторов, включая новый экспрессионный вектор ρΖΚ6-ΤΝΕΚ-Ι§6Εο

На фиг. 2 описана экспрессия белка Т№К-1д6Ес из клеток Со§-1, транзиторно трансфицированных различными Т№К-1д6Ес экспрессионными векторами, включая новый экспрессионный вектор ρΖΚ6ЮТКЯдбЕс.

На фиг. 3 представлено схематическое изображение различных ЕРО экспрессионных векторов, включая новый экспрессионный вектор ρΖΚ6-ΕΡΟ.

На фиг. 4 описано сравнение экспрессии ЕРО в клетках Со§-1 транзиторно трансфицированных новым экспрессионным вектором ρΖΚΓ-ΕΡΟ и другим кодирующим ЕРО коммерческим экспрессионным вектором цсОНАЗ.1.

На фиг. 5 представлен эффект нарастания воздействия МТХ на экспрессию ЕРО из выбранных высокопродуцирующих клонов СНО-ЭНЕК клеток, стабильно трансфицированных ρΖΚΓ-ΕΡΟ.

Источник элементов для конструирования нового экспрессионного вектора:

Основной каркас экспрессионного вектора Пять регуляторных элементов промотора СМУ Химерный интрон

ТРЬ (Σηνίϋίοςβη¹) ροϋΝΆ3.1 (1пуИ:годеп) (С1оп1:есЬ²) рсРЙАЗ.1 р1КЕЗЬудЗ рСАУ-ЦОТ-ТЫЕК (АТСС 68088) рСАУ-ΝΟΤ-ΤΝΓΚ (АТСС 68088)

УА гены I и II

Последовательность полиаденилирования ВОН Миниген βΗΓΚ продукт ΙηνίΐΓοςβη Ы£е ТесЬпо1од1ез, США ^Продукт С1оп£есй ЬаЬога£ог1ез 1пс·, США

Используемые сокращения:

ρσϋΝΑ3.1 (ГпугЬгодеп) рСНГК2.9 (АТСС 37165)

СМУ Цитомегаловирус

ТРЬ Тройной лидерный

УА гены или УА гены I и II Вирусные РНК-ассоциированные гены I и II

ВСН Гормон роста крупного рогатого скота

ЕРО	Эритропоэтин
ТЫЕК-ГдеГс	Слитый белок рецептора фактора некроза опухоли и Гс части иммуноглобулина С

Описание изобретения

Настоящее изобретение решает проблему высокой стоимости производства, описанную ранее в уровне техники, посредством предоставления новых экспрессионных векторов для высокой продукции рекомбинантных белков в клетках млекопитающих. Такие новые векторы используют широко известные регуляторные элементы, описанные в уровне техники, но содержат уникальную комбинацию таких элементов, которая неожиданно обеспечивает синергически высокую экспрессию. Настоящее изобретение, кроме того, предоставляет способ продуцирования высоких уровней белка, используя данные новые век торы.

Новая комбинация элементов, используемых в настоящем изобретении, состоит из:

a) прямого раннего промотора СМУ;

b) тройного лидерного элемента аденовируса (ТРЬ) (8ЕЦ. ΙΌ. Νο.4 и 61:209811);

c) гибридного (химерного) интрона (8ЕЦ. ΙΌ. Νο.1);

ά) вирусных РНК-ассоциированных генов I и II аденовируса (8ЕЦ. ΙΌ. Νο.5 и 61:209811) и

е) сайта полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота.

Для того чтобы сконструировать новые векторы, базисные экспрессионные векторы, которые могут быть использованы для присоединения к описанным выше новым комбинациям элементов, включают:

a) сайт клонирования;

b) соответствующий маркер селекции клеток млекопитающих, выбранный из группы, включающей, но, не ограничиваясь ими, устойчивые к лекарственным средствам маркеры, такие как неомицин, гидромицин, пуромицин и тому подобное;

c) соответствующий маркер селекции прокариотической клетки, выбранный из группы, включающей, но, не ограничиваясь ими, устойчивые к антибиотикам маркеры, такие как ампициллин, канамицин и тому подобное;

ά) маркер амплификации/селекции, выбранный из группы, включающей, но, не ограничиваясь ими,

- 7 011619 дигидрофолатредуктазу, аденозиндезаминазу, орнитиндекарбоксилазу, аспарагининсинтетазу, глутаминсинтетазу и тому подобное.

Способ получения желаемого вектора включает выделение различных элементов вектора из других векторных источников или из их биологических источников и включение в другой вектор, который обеспечивает каркас плазмиды. О методиках, используемых для такого конструирования, сообщается в уровне техники, касающейся области конструкции векторов [8атЬгоок 1 е! а1., Мо1еси1аг С1ошид - А 1аЬога!огу Мапиа1, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Рге§8, №\ν Уогк, (1989)] с соответствующими модификациями, в случае необходимости.

Для продуцирования желаемого белка сначала получают соответствующей ген, кодирующий белок. Следующие методики являются обычно используемыми, либо как таковые, либо в комбинации, для получения желаемого гена:

(1) выделение матричной РНК (мРНК) для желаемого гена и использование его в качестве матрицы для получения комплиментарной ДНК (кДНК) путем обратной транскрипции, (2) выделение природного гена из геномных библиотек ДНК, используя комбинацию подходящих ген-специфических гибридизационных зондов и ферментов рестрикции, (3) выделение гена путем специфической амплификации специфического генного фрагмента полимеразной цепной реакцией (ПЦР), использующей одну или более пар ген-специфических праймеров, и (4) химический синтез гена из составляющих его нуклеотидов.

Полученный ген клонируется в сайте клонирования нового вектора способами, хорошо известными в данной области. Образующаяся конструкция трансформируется в подходящую клетку-хозяина млекопитающих. Клетку-хозяина млекопитающих, которая может быть использована для способа, выбирают из группы, включающей, но, не ограничиваясь ими, клеточные линии СНО и СНО ΌΗΡΚ, клеточные линии ВНК1, N80, СО8 и тому подобное. Трансформированные клетки подвергают селекции на основе их способности расти в средах, содержащих соответствующий антибиотик и затем на их способности к экспрессии желаемого белка. Выбранный клон затем выращивают в соответствующих условиях культивирования для роста и продуцирования белка с получением высоких уровней желаемых белков. Количество генных копий и последующая генная экспрессия могут быть увеличены за счет селекции клеток с высоким количеством генных копий при повышенном селективном воздействии специфического цитотоксического лекарственного средства, эффект от которого может быть нивелирован только повышением количества маркера селекции. Так как генная амплификация путем цитотоксического селективного воздействия часто преобразовывает клон в гетерогенную популяцию клеток с вариацией копий представляющего интерес гена, то конечный высокопродуктивный клон выбирают из гетерогенной популяции путем предельного разведения.

Пример 1. Конструирование экспрессионного вектора Т№К.-1дСРс

Экспрессионный вектор млекопитающих рс^NА 3.1 (1пуйгодеп ЬИе Тес1шо1още5) был взят как основной каркасный вектор для конструирования всех векторов по изобретению. Данный вектор состоит из прямого раннего промотора СМУ и сигнальной последовательности полиаденилирования ВОН для контроля транскрипции гена. Два элемента формируют два из пяти элементов новой комбинации. Данный вектор дополнительно состоит из сайта множественного клонирования (МС8), ориджина репликации рИС для бактерий, устойчивого к ампициллину гена для селекции в Е. Сой и устойчивого к неомицину гена для селекции в клетках млекопитающих. Оставшиеся 3 элемента новой комбинации из пяти элементов, а именно - последовательность тройного лидерного элемента аденовируса, гибридный (химерный) интрон, состоящий из 5' донорного сайта основного позднего транскрипта аденовируса и 3' сплайсингового сайта мышиного иммуноглобулина, и вирусные УА РНК гены I и II аденовируса, вставляли в каркас ]:κΌΝΑ 3.1 в различных комбинациях для того, чтобы найти комбинацию элементов, которые вместе работают синергически, чтобы дать очень высокую экспрессию.

кДНК, кодирующие гибридный ген Т№К.-1дСЕс человека (8Ер. ΙΌ. №.2) и ген эритропоэтина человека (8Ер. ΙΌ. №.3) использовали в качестве репортеров для изучения влияния комбинации этих элементов на экспрессию белка. На фиг. 1 описан экспрессионный вектор, полученный для Т№К.-1дСЕс и на фиг. 3 описано то же самое для ЕРО.

Т№К.-1дСЕс представляет собой слитый белок, содержащий 75 кДа Т№К. (1-235 а.к.) и Ес фрагмент 1§С1 (содержащий СН2, СН3 и шарнирную область) [и85605690]. Указанный слитый белок продается как лекарственное средство, называемое ЕпЬге1 (Атдеп), для лечения ревматоидного артрита. Он действует посредством устранения из циркуляции воспалительного цитокина ΊΝΕ-α. Для того, чтобы клонировать кДНК Т№К. I, использовали общую плацентарную ДНК человека (С1ои1есй) в качестве матрицы для основанного на обратнотранскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) клонирования желаемой последовательности. Двухцепочечную кДНК синтезировали из общей плацентарной РНК с использованием обратной транскриптазы ММЬУ (МВI ЕегтеШак, США) ген-специфическим праймингом |МашаЙ5 е! а1., Мо1еси1аг с1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1 (Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Рге§8, Со1б 8рппд НагЬог, Ν.Υ.), (1990)]. Полученную кДНК затем подвергали 40 циклам ПЦР амплификации, используя 1000 пикомолей ген-специфических вырожденных олигонуклеотидных праймеров в объеме 100 мкл, содержащем 50 мМ Трис-С1 (рН 8,3), 2,5 мМ МдС1₂, 200 мкМ каждого из 4 бКТР и 2,5 единицы

- 8 011619 полимеразы РЕи. Каждый цикл ПЦР амплификации состоял из инкубации при 94эээС в течение 30 сек (денатурация), 58эээС в течение 30 сек (отжиг) и 72эээС в течение 1 мин (элонгация). Амплифицированный продукт реакции ПЦР разлагали на 1% агарозном геле. Желаемый фрагмент размером приблизительно 705 пар оснований вырезали из геля и очищали, используя набор для выделения из геля О|адеп. Очищенный фрагмент ДНК лигировали в МС8 ρεΌΝΑ 3.1 после рестрикционного расщепления как вектора, так и очищенного продукта ПЦР с ЕсоШ и РуиП (МВ1 Регтейак, США). Лигированный продукт трансформировали в Е. сой ΌΗ5α и трансформанты отбирали на основании устойчивости к ампициллину. Плазмидную ДНК, выделенную приблизительно из 20 таких колоний, анализировали на наличие кДНК ΤΝΡΡ I рестрикционным расщеплением, используя различные ферменты рестрикции. Одну такую плазмиду секвенировали, используя автоматический ДНК секвенатор (ΑΒΙ), и она была определена, как имеющая правильную интеграцию и последовательность кДНК ΤΝΡΡ I в векторе ρс^NΑ 3.1. Такая плазмидная ДНК была обозначена как ρс^NΑ-ΤNРΚ.

Подобным образом выделяли последовательность 1§С1 Рс, используя плацентарную РНК человека (С1опе1ес11) в качестве матрицы для основанного на ОТ-ПЦР клонирования. ПЦР проводили, используя пару ген-специфических олигонуклеотидных праймеров, соответствующих кодирующей области последовательности 1дО1Рс (699 пар оснований). Каждый цикл ПЦР амплификации состоял из инкубации при 94°С в течение 30 с (денатурация), 56°С в течение 30 с (отжиг) и 72°С в течение 1 мин (элонгация). Амплифицированный продукт реакции ПЦР разлагали на 1% агарозном геле. Желаемый фрагмент размером приблизительно 725 пар оснований вырезали из геля и очищали, используя набор для выделения из геля О|;щеп. Очищенный фрагмент ДНК лигировали в вектор ρΤΖ57Ρ (ΜΒΙ Регтейак) после линеаризации вектора и расщепления очищенного продукта ПЦР, используя ЕсоШ и Νοΐ I (ΜΒΙ Регтейак, США). Цитированный продукт трансформировали в Е. сой ΌΗ5α и трансформанты отбирали на основании устойчивости к ампициллину. Плазмидную ДНК, выделенную приблизительно из 10 таких колоний, анализировали на наличие 1§С1Рс кДНК рестрикционным расщеплением, используя различные ферменты рестрикции. Одну такую плазмиду секвенировали, используя автоматический ДНК секвенатор (ΑΒΙ), и оно была определена, как имеющая правильную интеграцию и последовательность кДНК 1дС1 Рс в векторе ρΤΖ57Ρ. Такая плазмидная ДНК была обозначена как ρΤΖ57Κ-Iд61Рс.

ρεϋΝΑ-ΤΝΡΚ-Ι§ΟΡε

Слияние генных фрагментов ΤΝ1Κ I и ЦС1 Рс выполняли следующим способом. Клонированный фрагмент ΤΝΕΡ I выделяли из ρс^NΑ-ΤNРΚ полным расщеплением с ЕсоШ и РуиП. Фрагмент ЦС1 Рс выделяли из ρΤΖ57Κ-конструкции путем его расщепления с Руи II и №1 I. Фрагменты выделяли из агарозного геля, используя набор для выделения из геля О|адеп. Оба фрагмента ДНК смешивали с линеализированным вектором ρс^NΑ 3.1, предварительно расщепленным с ЕсоШ и №И, в трехкомпонентной лигазной реакции. Лигированный продукт трансформировали в Е. сой ΌΗ5α и трансформанты отобрали на основании устойчивости к ампициллину. Плазмидную ДНК, выделенную приблизительно из 10 таких колоний, анализировали на наличие слитого продукта РТСИ-ЦСРс рестрикционным расщеплением, используя различные ферменты рестрикции. Одну такую плазмиду секвенировали, используя автоматический ДНК секвенатор (АВЦ и она была определена, как имеющая правильную интеграцию и последовательность ΤNРИ-IдСРс слитого продукта. Такая векторная конструкция была обозначена как ρс^NΑΤNРΚ-Iд6Рс (фиг. 1), которая содержала слитый ген, фланкированный промотором СМУ на 5'-конце и последовательностью полиаденилирования ВОН на 3'-конце.

ρεϋΝΑ-ΤΡΕ-ΤΝΡΚ-Ι§ΟΡε-νΑ-ϋΗΡΚ

Для конструирования данного вектора, сначала аденовирусный ΊΡΕ элемент встраивали ниже промотора СМУ и выше гена ΤNРΚ-Iд61Рс в ρс^NΑ-ΤNРΚ-Iд6Рс. Это завершалось расщеплением ρСΑУ/NΟΤ-ΤNРΚ (АТСС 68088) с Кри! и № I при полном расщеплении с извлечением фрагмента в 700 пар оснований, содержащего РРЬ, который затем очищали, используя набор для выделения из геля 01адеп. Фрагмент из 700 пар оснований лигировали в вектор ρс^NΑ-ΤNРΚ-Iд6Рс, расщепленный Крй и Ме I. Лигированный продукт трансформировали в Е. сой ΌΗ5α и трансформанты отбирали на основании устойчивости к ампициллину. Плазмидную ДНК анализировали на наличие и ориентировку РРЬ в результирующей плазмиде рестрикционным расщеплением, используя различные ферменты рестрикции. Одну такую позитивную плазмидную ДНК, обозначенную как р^-РОТК-дО-Г затем использовали для инсерции двух представляющих интерес элементов - одного, в 1000 пар оснований УА РНК гена, выделенного из рСАУ/ΝΟΤ-ΤΝΤΚ двойным расщеплением с ЕсоШ и №1 I, и второго, минигена ΟΗΓΕ. выделенного из плазмиды рБОТК 2.9 (АТСС 37165) [Сгоике ОР е! а1, Мо1. Се11. Вю1., 3:257-266 (1983)] путем полного расщепления с ВатШ и 8крТ Два фрагмента, фрагмент минигена ΟΗΕΡ и фрагмент УА РНК гена, смешивали с ρIй-ΤNРΚ-Iд^-1, предварительно расщепленным с Мий и ВдШ, в трехкомпонентной лигазной реакции. Лигированный продукт трансформировали в Е. сой ΌΗ5α и трансформанты отбирали на основании устойчивости к ампициллину. Плазмидную ДНК анализировали на наличие и ориентировку УА РНК гена и минигена ΟΗΕΡ в результирующей плазмиде путем рестрикционного расщепления, используя различные ферменты рестрикции. Такая векторная конструкция была обозначена как ρс^NΑΤР^-ΤNРΚ-Iд^1Рс-УΑ-^ΗРΚ (фиг. 1).

- 9 011619 ροϋΝΑ-ΤΡΕ-ΠΗτρθΗ-ΤΝΓΚ-Ι§ΟΓο

Экспрессионный вектор ροΌΝΑ-ΤΡΕ-ΗΗτροΗ-ΤΝΡΚ-Ι§ΟΡο получали путем вставки химерного интрона ниже аденовирусного ТРЬ элемента и выше гена ΤΝΡΚ-Ι§ΟΕε в векторе ρΙηΐ-ΤΝΕΚ-Ι§0-1. Это завершалось расщеплением р1КЕ8йуд3 (С1оп1ес11) с ΒδίΧΙ и ЕсоР1 при полном расщеплении с извлечением фрагмента химерного интрона из 350 пар оснований, который дополнительно очищали, используя набор для выделения из геля 01адеп. Фрагмент из 350 пар оснований лигировали в векторную конструкцию ρΙηΐ-ΤΝΡΒ-Ι§0-1, предварительно расщепленную с ΒδίΧΙ и ЕсоКЬ Цитированный продукт трансформировали в Е, со11 ΌΗ5α и трансформанты отбирали на основании устойчивости к ампициллину. Плазмидную ДНК анализировали на наличие и ориентировку ΤΡΕ, интрона и гена ΤNΕΚI-Iд^1Εс в результирующей плазмиде путем рестрикционного расщепления, используя различные ферменты рестрикции. Одну такую плазмиду секвенировали, используя автоматический ДНК секвенатор (ΑΒΙ), и она была определена, как имеющая правильную интеграцию ΤΡΕ, химерного интрона и гена ΤNΕΚI-Iд^1Εс в векторе. Такая векторная конструкция была обозначена как ρс^NΑ-ΤΡ^-Инτροн-ΤNΕΚ.-Iд6Εс (фиг. 1).

ροϋΝΑ-ΤΡΕ-ΠΗτρθΗ-ΤΝΓΚ-Ι§ΟΓο-νΑ-ϋΗΓΚ (ρΖΚΟ-ΤΝΕΚ-Ι^ΟΕο)

Описанную выше плазмидную ДНК, ρс^NΑ-ΤΡ^-Инτροн-ΤNΕΚ-Iд^Εс, использовали для вставки двух элементов, из 1000 пар оснований УА РНК гена, выделенного из ρίΑΥ/ΝΟΤ-ΤΝΕΚ. путем двойного расщепления с ЕсоШ и Νοΐ Ι, и минигена ΌΗΕΚ, выделенного из плазмиды ρΌΗΕΚ 2.9 путем полного расщепления с ВашШ и δκρΙ. Фрагменты для минигена ΌΗΕΚ и УА РНК гена лигировали в векторную конструкцию ρс^NΑ-ΤΡ^-Инτροн-ΤNΕΚ.-Iд6Εс, предварительно расщепленную с ΜυηΙ и Β§1ΙΙ, в трехкомпонентной лигазной реакции. Лигированный продукт трансформировали в Е. со11 ΌΗ5α и трансформанты отбирали на основании устойчивости к ампициллину. Плазмидную ДНК анализировали на наличие и ориентировку УА РНК гена и минигена ΌΗΕΚ в результирующей плазмиде путем рестрикционного расщепления, используя различные ферменты рестрикции. Дополнительно, интеграцию проверяли и подтверждали ДНК секвенированием. Такая векторная конструкция была обозначена как ρс^NΑ-ΤΡ^Инτροн-ΤNΕΚ.-Iд6Εс-УΑ-^ΗΕΒ, также обозначенная как ρΖΚС-ΤNΕΚ.-Iд6Εс (фиг. 1), имеющая номер доступа МТСС 5277.

Пример 2. Сравнение эффективности экспрессии различных ΤNΕΚ-Iд^Εс экспрессионных векторов транзисторной трансфекцией

Для эксперимента по транзиторной трансфекции использовали клетки Сок 1 (АТСС Νο. СРЕ-1650), фибробласто-подобные почечные клетки африканской зеленой мартышки. Клетки постоянно поддерживали в полной ростовой среде (модифицированная по Дульбекко среда Игла с 4 мМ Ь-глутамина и дополненная 1,5 г/л бикарбоната натрия, 4,5 г/л глюкозы, 10% фетальной телячьей сыворотки (ΕΒ8) и антибиотики) при температуре 37°С и в атмосфере 5% диоксида углерода (СО₂). За один день до трансфекции, клетки, растущие в середине логарифмической стадии роста, трипсинизировали и наносили в повторах в 6-луночные планшеты с плотностью в 0,2 миллиона клеток/лунка в 3 мл полной ростовой среды, и инкубировали при 37°С и 5% СО₂. Трансфекцию проводили, используя реагент 01адеп Ро1уГес1 и ранее известные протоколы. В день трансфекции трансфекционную смесь готовили, как описано ниже. Общее количество 1,5 мг ДНК, растворенной в не содержащей эндотоксинов воде, фильтровали, используя 0,2 мкм шприцевой фильтр. Для наибольшей конструкции ρΖΚΠ-ΤΝΕΚ-Ι§ΟΕ^ использовали 1,5 мкг вектора как такового, в то время как для других меньших конструкций эквимолярное количество (в пересчете на ген ΤΝΕΚ-Ι§ΟΕ^ конструкции смешивали с пустым вектором с получением 1,5 мкг общей ДНК. Полученную ДНК сначала растворяли в клеточной ростовой среде, то есть модифицированной по Дульбекко среде Игла с 4 мМ Ь-глутамина, дополненной 1,5 г/л бикарбоната натрия, 4,5 г/л глюкозы, не содержащей сыворотки или антибиотиков, до общего объема 100 мкл. Надлежащее смешивание проводили путем перемешивания при вращении и последующим кратким вращением раствора в течение нескольких секунд для удаления капель с боковых стенок и крышки пробирки. Затем 10 мкл реагента Ро1уЕес1 ΤταηκГесйоп добавляли к полученному раствору ДНК. Надлежащее смешивание трансфекционной смеси проводили путем всасывания и выдавливания из пипетки 5-7 раз. Затем образцы инкубировали при комнатной температуре (20-25эээС) в течение 10 мин, для обеспечения образования комплекса. Пока имело место формирование комплекса, полную ростовую среду осторожно аспирировали из 6-луночного планшета.

Высеянные клетки промывали 3 мл 1Χ стерильного забуференного фосфатом солевого раствора (ΡΒ8). Это сопровождалось добавлением 1,5 мл свежей полной ростовой среды. После 10 мин формирования комплекса добавляли 0,6 мл полной ростовой среды в реакционную пробирку, содержащую трансфекционные комплексы. Планшеты подвергали осторожному вращению для обеспечения надлежащего смешивания и инкубировали при 25°С, 5% СО₂. Использованную среду удаляли из лунок после 40 и 64 ч трансфекции и оценивали экспрессию ΤNΕΚ-Iд^Εс с помощью ЕЫ8А, как описано ниже.

Необходимое число лунок в 96-луночном титрационном микропланшете (Мшс Мах15о1р) покрывали объемом в 100 мкл/лунка козьим антителом против фрагмента ^СЕс человека (Са1Ыосйет, каталожный номер 401439) в концентрации 2 мкг/мл в ΡΒ8 (рН 7,3). Планшеты инкубировали при 4°С в течение ночи во влажных условиях для эффективного покрытия. Спустя 12-18 ч несвязанные покрывающие ан

- 10 011619 титела удаляли, лунки блокировали блокирующим буфером (1% Β8Λ (бычий сывороточный альбумин), 0,05% Твина 20, 5% обезжиренного молока, приготовленного в IX ΡΒ8, рН 7,2) и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После 1 ч блокирования планшеты промывали трижды (250 мкл каждый раз) буфером ΡΒ8Τ (IX ΡΒ8, 0,1% Β8Α, 0,05% Твина 20). Затем по 10 мкл образцов (неизвестных и стандартных, соответственно разведенных в 1Х ΡΒ8, содержащем 1% Β8Α) добавляли в лунки в повторах. Для стандарта ΤΝΡΡ-Ι§ΟΡο. ЕпЬте1 (этанерцепт), использовали пробирку многократного использования, содержащую 25 мг/мл белка ЕпЬге1 (произведенного Iттυηеx Со грога! ίο п, США, поставляемого Атдеп апб \Ууе111 Ρΐιαηηαίχιιΐίοαίδ). Концентрации стандартов, используемых для получения стандартной кривой, составляли 1 нг/мл, 2 нг/мл, 5 нг/мл, 10 нг/мл, 20 нг/мл, 40 нг/мл, и 80 нг/мл. После инкубации в течение 90 мин, что дает возможность связывания антиген-антитело, планшеты промывали трижды (250 мкл каждый раз) буфером ΡΒ8Τ и в лунки добавляли 100 мкл детекционного антитела, козьего антитела против 1§СРеΗΡΡ человека (Г1егсе, каталожный № 31416), разведенного 1:2000 в 1Х ΡΒ8, содержащем 1% Β8Α, и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Планшеты промывали трижды для удаления несвязанного конъюгата антитело-ΗΚΡ. Добавляли 100 мкл субстратного раствора на лунку, содержащего 8 мг порошка ΟΡΌ [дигидрохлорид о-фенилендиамин(1,2-бензолдиамина)] (81дта, каталожный № Р-1526) и 10 мкл пероксида водорода, приготовленного в цитрат-фосфатном буфере (122,8 мг безводной лимонной кислоты и 188 мг Να₂ΗΡΟ₄ в 20 мл дистиллированной воды и рН доведенного до 4,8-5,0) и инкубировали в течение 30 мин в темноте при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1Ν серной кислоты на лунку. Коэффициент поглощения измеряли на считывающем устройстве для ЕЬ18А при 490 нм. Оценку неизвестных образцов производили с помощью программного обеспечения 8ойМах Ρτο (Мо1еси1аг Оеуюез), используя 4-х параметрическую эмпирическую калибровочную кривую, основанную на уравнении ЬеуеЬетдМащиатбЕ

Результаты

На фиг. 2 описаны показательные данные одного такого эксперимента. Самая высокая экспрессия была получена с р2КС-Т№В-1дОРс (72,5±4,3 нг/мл), которая была на 21,97% выше, чем для рс^NΑΤΡΕ-ΤΝΡΚ.-Ι§ΟΡ^νΑ-ΌΗΡΚ. (59,44±1,8 нг/мл), на 36,66% выше, чем для ρс^NΑ-ΤΡ^-Интрон-ΤNΡΒ1дСРс (53,05±2,2 нг/мл) и на 395,55% выше, чем для ρс^NΑ-ΤNΡΒ-Iд6Ρс (14,63±1,4 нг/мл). Синергический эффект пяти элементов дополнительно подтверждается тем фактом, что наибольшая плазмида ρΖΚΕ-ΤΝΡΒ-Ι§ΟΡ^ которая должна показать самую низкую трансфекционную эффективность, все еще давала наивысшую экспрессию. Способность новой комбинации элементов ρΖΚС-ΤNΡΚ.-Iд^Ρс давать высокую экспрессию, дополнительно, подтверждается другими примерами ниже.

Пример 3. Конструирование экспрессионных векторов ЕРО

Были разработаны два экспрессионных вектора ЕРО. Новый экспрессионный вектор ρΖΡί'-ΕΡΟ подобен новому экспрессионному вектору ρΖΡί'-ΤΝΡΡ-Ι§ΟΡ^ предварительно отобранному благодаря его высокой экспрессии посредством экспериментов по транзиторной трансфекции, и кодирует ген ЕРО вместо ΤΝΡΡ-Ι^ΟΡ^

Второй вектор является кодирующим ЕРО коммерческим экспрессионным вектором ]χΌΝΛ3.Ε также несущим ген для ΌΗΡΚ ροϋΝΑ-ΕΡΟ-ϋΗΡΚ

Для того чтобы получить кДНК эритропоэтина человека, общую ДНК, полученную из почки человека (С1оп1есй), использовали в качестве матрицы для ОТ-ПЦР. Двухцепочечную кДНК синтезировали из общей РНК, используя обратную транскриптазу ММЙ-ν (ΜΒΙ Ρе^теηΐа5, США) ген-специфическим праймингом [Машайз е! а1., Мо1еси1аг с1ошпд: А ЬаЬога!оту Мапиа1 (Со1б 8рппд йатЬот ЬаЬота1огу Ρκ88, Со1б 8ртшд ИагЕог, Ν.Υ.), 1990]. Почечную кДНК затем подвергали 35 циклам ПЦР амплификации, используя 100 пикомолей генспецифических олигонуклеотидных праймеров в объеме 100 мкл, содержащих 50 мМ Трис-С1 (рН 8,3), 2,5 мМ МдС1₂, 200 мкМ каждой 6ΝΤΡ и 2,5 единицы полимеразы Ии. Каждый цикл ПЦР амплификации состоял из инкубации при 94°С в течение 30 с (денатурация), 61°С в течение 1 мин (отжиг) и 72°С в течение 1 мин (элонгация). Амплифицированный продукт ПЦР разлагали на 1% агарозном геле. Желаемый фрагмент приблизительно из 590 пар оснований вырезали из геля и очищали, используя набор для выделения из геля 01адеп. Очищенный фрагмент ДНК лигировали в МС8 в рсДНК 3.1 после рестрикционного расщепления как вектора, так и очищенного продукта ПЦР с ЕсоШ и ХЬа1 (ΜΒI Ρе^тепΐаδ, США), образуя, таким образом, липкие концы для направленного клонирования. Лигированный продукт трансформировали в Е. сой ΌΗ5α и трансформанты отбирали на основании устойчивости к ампициллину. Плазмидную ДНК, выделенную приблизительно из 20 таких колоний анализировали на наличие кДНК ЕРО рестрикционным расщеплением, используя различные ферменты рестрикции. Одну такую плазмиду секвенировали, используя ДНК секвенатор (ΑΒΙ), и она была определена, как имеющая правильную интеграцию и последовательность кДНК ЕРО в векторе ρχΌΝΛ 3.1. Данную плазмиду ρχΌΝΛ-ΞΡΟ использовали для вставки минигена ΌΗΡΒ, который выделяли из ρΌΗΡΚ. 2.9 путем полного расщепления с Ηωά III. У минигена ΌΗΡΒ из 2,9 тысяч пар оснований создавали тупые концы, используя полимеразу Кленова (ΜΒI Ρе^тепΐа8, США) и после линеаризации с М1и I (ΜΒI Ρе^тепΐа8, США) лигировали в ρχΌΝΛ-ΞΡΟ с созданием тупых концов, используя полимеразу Кленова (ΜΒI Ρе^- 11 011619 шеШак. США). Лигированный продукт трансформировали в Е. сой ΌΗ5α и трансформанты отбирали на основании устойчивости к ампициллину. Плазмидную ДНК ροΟΝΑ-ΕΡΘ-ΌΗΕΚ (фиг. 3) анализировали на наличие и ориентировку минигена ΌΗ.ΕΚ в результирующей плазмиде рестрикционным расщеплением. используя различные ферменты рестрикции.

ροϋΝΑ-ΤΡΕ-ΠΗτρθΗ-ΕΡΟ-νΑ-ϋΗΓΚ (р/.Ш'-ЕРО)

Данный экспрессионный вектор получали путем вставки аденовирусного ТРЬ ниже промотора СМУ аденовирусного ТРЬ элемента и выше химерного интрона. который был. дополнительно. вставлен выше кДНК ЕРО в конструкции ρс^NΑ-ΕΡΟ. УА РНК ген и миниген ΌΗΕΚ также были вставлены в данный вектор между геном устойчивости к ампициллину и промотором СМУ. Это было достигнуто первичным расщеплением вектора ρс^NΑ-ΤΡ^-Иитрон-ΤNΕΚ-IдСΕс с ЕсоК! и ХЬа1. чтобы удалить фрагмент ΤΝΕΚ-ТдОЕс. Векторный фрагмент из 6 тыс. пар оснований. полученный таким образом. очищали. используя набор для выделения из геля О|;щсп. и лигировали геном ЕРО. имеющим ЕсоК1 и ХЬа1 концы. Лигированный продукт трансформировали в Е. сой ΌΗ5α и трансформанты отбирали на основании устойчивости к ампициллину. Плазмидную ДНК анализировали на наличие и ориентировку ТРЬ. химерного интрона и кДНК ЕРО в результирующей плазмиде рестрикционным расщеплением. используя различные ферменты рестрикции. Одну такую плазмиду секвенировали. используя автоматический ДНК секвенатор (ΑΒΙ). и она была определена. как имеющая правильную интеграцию ТРЬ. химерного интрона и гена ЕРО в векторе. Такую плазмидную ДНК. обозначенную как ρΙηΐ-ΕΡΟ-1. использовали для вставки УА РНК гена из 1000 пар оснований. выделенного из рСАУ^ОТ-Т№К двойным расщеплением с ЕсоК! и №1 I. и минигена ΌΗΕΚ. выделенного из плазмиды ρΌΗΕΚ 2.9 полным расщеплением с ВатЫ1 и 8κρΙ. Два фрагмента лигировали ρΙηΐ-ΕΡΟ-1. предварительно расщепленным с Мип1 и Вд1 II в трехкомпонентной лигазной реакции. Лигированный продукт трансформировали в Е. со11 ΌΗ5α и трансформанты отбирали на основании устойчивости к ампициллину. Плазмидную ДНК анализировали на наличие и ориентировку УА РНК гена и минигена ΌΗΕΚ в результирующей плазмиде рестрикционным расщеплением. используя различные ферменты рестрикции. Дополнительно. интеграцию проверяли и подтверждали секвенированием ДНК. Такая векторная конструкция была обозначена как ρс^NΑ-ΤΡ^-ИнтронЕРО-УА-ΌΗΕΚ. также обозначенная как ρΖΚΤ’-ΕΡΟ (фиг. 3).

Пример 4. Сравнение экспрессионных эффективностей различных экспрессионных векторов ЕРО транзиторной трансфекцией

Для эксперимента по транзиторной трансфекции клетки Сок 1 выращивали и обрабатывали. как описано выше. Все трансфекционные смеси изготавливали так же. как в предыдущем примере. Процедуры трансфекции выполняли так же. как описано в примере выше. и использованную среду удаляли от клеток после 40 и 64 ч трансфекции и подвергали ЕЬ18А для анализа экспрессии ЕРО. как описано ниже.

Сначала 96-луночные титрационные микропланшеты (Νιπκ Мах1ког]э) покрывали объемом в 50 мкл/лунка мышиными моноклональными антителами против рекомбинантного ЕРО человека (Κ&Ό 8ук1ешк Апй-йЕРО Рипйеб Мойке МаЬ. С1опе 9С2Ш11. каталожный номер МАВ287) в концентрации 2 мкг/мл в карбонатном буфере. рН 9.6. Планшеты инкубировали при 4°С в течение ночи во влажных условиях для эффективного покрытия. Спустя 12-18 ч несвязанные покрывающие антитела удаляли и лунки блокировали блокирующим буфером. как описано выше. После 1 ч блокирования планшеты промывали трижды (250 мкл каждый раз) буфером РВ8Т. Затем по 50 мкл образцов. соответственно разведенных в 1Х РВ8. содержащем 1% В8А. добавляли в лунки в повторах. Для стандарта ЕРО использовали Е]эгех 4000 (рекомбинантный ЕРО человека 4000 МЕ/0.4 мл). произведенный Сйад АО 8сйаГГЬаикеп Швейцария. Концентрации стандартов. используемых для получения стандартной кривой. составляли 4 МЕ/мл. 2 МЕ/мл. 1 МЕ/мл. 0.4 МЕ/мл. 0.2 МЕ/мл и 0.1 МЕ/мл. После инкубации в течение 90 мин. что обеспечивало связывание антиген-антитело. планшеты промывали трижды (250 мкл каждый раз) буфером РВ8Т. Это сопровождалось добавлением 50 мкл объема первичных антител (кроличьих антител против ЕРО человека. очищенных 1дС. Κ&Ό 8ук1етк. каталожный номер АВ-286^А) в концентрации 2 мкг/мл в 1Х РВ8. содержащем 1% В8А. с последующей дополнительной инкубацией в течение 1 ч при 37°С. После 1 ч инкубации планшеты промывали трижды (250 мкл каждый раз) буфером РВ8Т и добавляли 50 мкл детекционного антитела/вторичного антитела (козьего антитела против кроличьего 1дСИКР. Вапда1оге Сенек каталожный номер НРО020). разведенного 1:8000 в 1Х РВ8. содержащем 1% В8А. рН 7.2. с последующей дополнительной инкубацией в течение 1 ч при 37°С. Планшеты промывали трижды (250 мкл каждый раз) буфером РВ8Т для удаления несвязанного конъюгата. Это сопровождалось добавлением субстрата. Для этого добавляли 100 мкл субстратного раствора (приготовленного как описано выше) на лунку и инкубировали в течение 30 мин в темноте при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1Ν серной кислоты на лунку. Коэффициент поглощения измеряли на считывающем устройстве для ЕЬ18А при λ490 нм. Оценку неизвестных образцов производили программным обеспечением 8ойМах Рго (Мо1еси1аг Эеу1сек). используя 4-х параметрическую эмпирическую калибровочную кривую. основанную на уравнении ЬеуеЬегд-Магциагй!.

Результаты:

На фиг. 4 описаны показательные данные одного такого эксперимента. Самая высокая экспрессия

- 12 011619 была получена с ρΖΡί’-ΕΡΘ (276,53±3,09 нг/мл), которая была на 984,85% выше, чем для ρεΌΝΆ-ΕΡΘИНЕК (25,49±2,38 нг/мл). Эти данные подтверждают сведения примера 3 о том, что новый экспрессионный вектор, содержащий новую комбинацию пяти элементов, дает очень высокую экспрессию для различных репортерных генов.

Превосходная способность новой комбинации элементов в ρΖΡί'-ΕΡΘ была подтверждена в стабильно трансфицированных клетках, как можно видеть в примере 7 ниже.

Пример 5. Стабильная трансфекция СНО ИНЕК^- клеток с ρΖΚΟ-ΕΡΘ

СНО ИНЕК^- клетки (мутанты клеток яичника китайского хомяка за счет гена, кодирующего дигидрофолатредуктазу) постоянно поддерживали в полной среде (МЕМа среда (8фша), дополненная 10% ΡΒ8 (Нус1опе) и смесью гипоксантина и тимидина). Во время роста клетки для трансфекции в середине логарифмической стадии роста трипсинизировали из флакона Т25 (25 см²), один раз промывали в 5 мл полной среды и ресуспендировали в ΡΒ8. Пятнадцать микрограммов ρΖΚΟ-Ερο, линеаризированного с ферментом рестрикции 8§ρΙ, добавляли к 1х10⁶ клеток и электропорировали (350 Вольт), используя 81га1адепе Εесΐ^ορο^аΐο^ 1000. После короткого восстановительного периода в 48 ч в полной среде, клетки подвергали двойной селекции путем содержания их в селективной среде (10% диализованного ΡΒ8, дополненного средой МЕМа, без добавления смеси гипоксантина и тимидина, плюс 500 мкг/мл С418 (8фша)). Клетки помещали в 5% СО₂, 37°С инкубатор и предоставляли возможность расти в течение двухнедельного периода. Смену среды осуществляли каждые 3 дня. Участки стабильных трансфектантов начинали развиваться, спустя 12 дней после процесса селекции. На 15-й день селекции клетки трипсинизировали. Для выделения единичных клеточных клонов из смешанной популяции стабильных трансфектантов, клетки разводили, используя методику предельного разведения в 96-луночных планшетах. Лунки, содержащие одиночные клетки, обнаруживаемые под микроскопом, метили, и постоянная смена среды приводила к одиночным клеточным клонам. Спустя примерно 12-14 дней, лунки, как было обнаружено, являлись на 70-80% слившимися. Клетки переносили в 24-луночные планшеты и выращивали в течение 48-72 ч перед переносом в 6-луночные планшеты. Одиночные клеточные клоны высевали в 6луночные планшеты с плотностью 0,1 х10⁶ клеток на лунку в селективной среде. Использованную среду удаляли из указанных лунок спустя 48 ч и клетки подсчитывали. Удаленную среду анализировали на экспрессию ЕРО с помощью ΕΕΙ8Ά, как описано выше. Результаты выражали, как общее количество секретированного белка ЕРО/10⁶ клеток/48 ч.

Отбирали десять высокоэкспрессирующих клонов и подвергали процессу генной амплификации на основе метотрексата (МТХ), начиная с добавления 25 нМ МТХ к селективной среде. Свежую среду пополняли каждые 3 дня. Клетки выращивали в одной концентрации МТХ в течение приблизительно 20-25 дней до того, как они становились адаптированными. После каждой стадии увеличения концентрации МТХ, клетки анализировали на уровни экспрессии в 6-луночном планшете, как описано выше. Один из таких отобранных 10 клонов не выжил при 25 нМ МТХ. Все остальные девять клонов были подвергнуты постоянному увеличению концентраций МТХ 100 нМ, 400 нМ и, наконец, 2 мкМ МТХ. На фиг. 5 показана экспрессия гетерогенных популяций, полученных из МТХ-амплифицированных клональных популяций в конце различных стадий МТХ амплификации.

Селекция с помощью с МТХ преобразует клональную популяцию клеток в гетерогенную популяцию. Следовательно, чтобы выделить высокоэкспрессирующие одиночные клеточные клоны из МТХамплифицированных гетерогенных популяций, сначала на стадии при 400 нМ МТХ отбирают одну гетерогенную популяцию 41Н9. Эти клетки были макетом для селекции клонов путем предельного разведения, как описано выше. Спустя приблизительно 14-16 дней, лунки 96-луночного планшета, как было обнаружено, являлись на 70-80% слившимися. Клетки переносили в 24-луночные планшеты и выращивали в течение 48-72 ч перед переносом в 6-луночные планшеты. Одиночные клеточные клоны высевали в 6луночные планшеты с плотностью 0,1х10⁶ клеток на лунку в селективной среде, содержащей 400 нМ МТХ. Использованную среду удаляли из этих лунок спустя 48 ч и клетки подсчитывали. Удаленную среду брали для анализа экспрессии с помощью ΕΕΙ8Ά, как описано выше. Результаты выражали как общее количество секретированного белка ЕРО/10⁶ клеток/48 ч. В табл. 1 показана экспрессия указанных одиночных клеточных клонов, которые были впервые получены из гетерогенной популяции 41Н9. Высокоэкспрессирующие клоны размножали и замораживали в качестве основных клеточных банков для коммерческого производства ЕРО.

- 13 011619

Таблица 1

Клон	Белок, продуцируемый в мкг/миллион клеток/48 часов
41Н9,ЗС10	9,64
41Н9,4С10	13,97
41Н9,4Н9	14,18
41Н9,5С9	12, 61
41Н9,10Н12	11,91
41Н9,1Е8	10,93
41Н9,2Г9	12,32
41Н9,5Е10	12,24
41Н9,8С9	12,68
41Н9,10В10	13,56
41Н9,2С8	6,15
41Н9,4Е9	7,31
41Н9,1С8	14,92
41Н9,7Н9	5,85

Пример 6. Продуцирование ЕРО из стабильно экспрессирующих клонов во флаконах

Две гетерогенные популяции клеток из числа изображенных на фиг. 5, а именно, 56Ό12 и 41Н9, которые подвергали селекции при 100 нМ МТХ и 400 нМ МТХ, соответственно, испытывали на продукцию белка в масштабе флаконов Т75. Флаконы Т75 (75 см²) инокулировали 2,1 миллионами клеток в среде МЕМа, не содержащей гипоксантин и тимидин, дополненной 10% диализованного РВ8 (ЖН Βίο5С1СПСС5) и 600 мкг/мл 0418 наряду с подходящей концентрацией МТХ для соответствующей гетерогенной популяции. Флаконы помещали в СО₂ инкубаторы при 37°С, 5% СО₂ на 72 ч. Клеточный монослой, как было обнаружено, был слившимся на приблизительно 80-85% после 72 ч инкубации. В этот момент, старую использованную среду удаляли и клеточный монослой промывали Дулбекко-РВ8.

К промытым монослоям добавляли 15 мл продуктивной среды [1М0М:Наш Р12 (1:1), дополненной 10 мг/л гй-инсулина, 2 мМ глутамина, аминокислотной смесью, 0,2 мМ Ν-ацетилцистина, 0,25% лактоальбуминна, 2 мг/л Ре8О₄, 25 мг/л декстрансульфата, 0,05% плюроновой кислоты, 5 мг/л гидрокортизона и 1 мМ Να-бутирата]. Клетки инкубировали в СО₂ инкубаторе при 33°С в течение четырехдневного периода. Спустя четыре дня использованную среду асептически удаляли и анализировали с помощью ЕЬ18Л. В табл. 2 показана экспрессия двух клонов в продуктивной среде в масштабе флакона Т75.

Таблица 2

Название гетерогенной популяции	Белок, продуцируемый в мг/л после четырех дней
56ϋ12 (100 нМ МТХ)	21 мг/л
41Н9 (400 нМ МТХ)	43 мг /л

Пример 7. Высокий уровень продукции ЕРО в роллерных флаконах

Одна из представленных гетерогенных популяций 41Н9, описанных выше, которая уже была адаптирована к 2 мкМ МТХ, использовали для исследования роллерного флакона, чтобы проанализировать белковую продукцию в больших масштабах. Клетки 41Н9 размножали, используя культуральные флаконы Т75 и Т175, для того, чтобы получить достаточное количество клеток для посева в роллерные флаконы.

роллерных флаконов инокулировали 30 миллионами клеток каждый в 2 мкМ среду МЕМа, дополненную МТХ, содержащую гипоксантин и тимидин (8щша). дополненную 10% диализованного РВ8 (ЖН Вю5С1епсе5) и 600 мкг/мл 0418. После перемешивания клеток в среде роллерные флаконы помещали в роллер-флаконный инкубатор при 37°С и скоростью вращения приблизительно 0,35 об./мин для роста. Клетки осматривали спустя 24 ч и были определены как хорошо растущие. Флаконы снова помещали в инкубатор для роста и осматривали под микроскопом каждые 24 ч. После 96 ч инокуляции клеточные монослои были слившимися приблизительно на 80-85%. В этот момент старую использованную среду удаляли и в каждый флакон добавляли 210 мл/флакон продуктивной среды [1МОМ:Нат Р12 (1:1), дополненной 10 мг/л гй-инсулина, 2 мМ глутамина, аминокислотной смесью, 0,2 мМ Ν-ацетилцистина, 0,25% лактоальбумина, 2 мг/л Ре8О₄, 25 мг/л декстрансульфата, 0,05% плюроновой кислоты, 5 мг/л гидрокортизона и 1 мМ Να-бутирата]. Клетки инкубировали в роллер-флаконных инкубаторах в течение семидневного периода. По истечении указанного периода использованную среду асептически удаляли из роллерных флаконов, анализировали с помощью ЕЫ8Л, как предварительно описано и отображено в табл. 3.

- 14 011619

Таблица 3

Название гетерогенной Белок, продуцируемый в мг/л популяции после семи дней

41Н9 (2 мкМ МТХ)

91 мг/л

Этот уровень продукции из гетерогенной, стабильно трансфицированной и МТХамплифицированной популяции, из которой индивидуальные клоны еще не были подвергнуты селекции, показывает экспрессионный уровень, который намного лучше, чем описанный в литературе для индивидуальных стабильных клонов. Например, стабильные клоны, полученные путем трансфекции и генной амплификации вплоть до 20 нМ МТХ, использующие вектор, содержащий промотор 8К. α, АМУ РНК 4-х лидерную последовательность, ΌΗΡΚ и резистентность к зеоцину могут дать клон 45 МЕ/мл (эквивалентный 0,346 мкг/мл) [1аид Η Р е1 а1, Вю1есЬпо1. Арр1. Вюейеш, 32:167-172, (2000)].

В патенте США 5955422 показано, что клоны, полученные из клеток СНО, ΌΗΡΚ-, котрансфицированных вектором, содержащим геномную копию гена ЕРО, под контролем промотора 8У40 и поли А-последовательности, и вектором, содержащим ΌΗΡΚ, под МТХ генной амплификацией, давали продуцирование от 750 до 1470 Ед/миллион клеток/48 ч (или от 375 до 735 Ед/миллион клеток/24 ч) в бессывороточной продукционной среде в роллерных флаконах. В другом патенте США 5888774 описан клон ЕРО, полученный из клеток СНО-К1, трансфицированных вектором, содержащим кДНК ЕРО, управляемым промотором ЕБ1 с элементами ароВ 8АК. и устойчивостью к неомицину, который может продуцировать от 1500 до 1700 МЕ ЕРО/миллион клеток/24 ч (культура, проанализированная между днем 3 и 4). В отличие от этого, семидневный показательный образец среды гетерогенной популяции 41Н9 настоящего изобретения, предварительно адаптированной к 2 мкМ МТХ, как обнаружено, содержал 11830 ЕД/мл в роллерном флаконе, как оценено с помощью ЕЫ8А. Основанная на рассчитанных клеточных плотностях от 10⁸ до 1,5х10⁸ клеток на роллерный флакон, скорость продукции ЕРО в 7 дней, 210 мл культуры составляла от 2366 до 3549 МЕ/10⁶ клеток/24 ч, что значительно выше, чем уровни, описанные выше для других описанных векторов, использующих различные другие комбинации регуляторных элементов.

Аналогично, 8ипд Клтап Υοοη и другие |Вю1ес11по1оду апб Вюепдшееппд, 82 (3):289-298, (2003)] сообщают о полностью оптимизированном способе продуцирования ЕРО, использующего клеточную линию, выведенную на клетках СНО ΌΗΡΚ- способом генной амплификации вплоть до 5 мкМ МТХ селективного воздействия, приводящим к выходу приблизительно 50 мкг/мл после культивирования в течение приблизительно 200 ч при 33 °С. ρΖΚΟ-ΕΡΟ настоящего изобретения стабильно трансфектная, гетерогенная популяция 41Н9, которая была адаптирована к сравнительно низкому уровню МТХ (2 мкМ), способна продуцировать 11,830 МЕ/мл (91 мкг/мл) при 168 часовом культивировании, как оценено с помощью ЕЫ8А.

Уровни экспрессии ЕРО с новым экспрессионным вектором ρΖΚΟ-ЕРО на 81-100% выше, чем для описанных лучших векторов в литературе. Способ продуцирования ЕРО, описанный выше для гетерогенной популяции 41Н9, также может быть применен к стабильным клонам, описанным в примере 5, табл. 1.

Новый вектор настоящего изобретения был депонирован в ΙΜΊΈΟΗ, Сйапб1датй, 1пб1а, официально признанным депозитарием по условиям Будапештской конвенции. Номер доступа ожидается.

- 15 011619

Список последовательностей <110> СасИ1а НеаНЬсаге ЫпиЛей

ЗгпдП, Агип К.

Сое1, АзЫзЬ

МепсИга£1:а, δβηοββν К.

<120> ЭКСПРЕССИОННЫЙ ВЕКТОР И СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ВЫСОКИХ УРОВНЕЙ БЕЛКОВ <1зо> гкс-вт-005 <160 5 <170> Ра£еп!1п νβτείοη 3.3 <21-0 1 <211> 236 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Данная последовательность была искусственно получена как гибрид аденовирусного генного компонента и мышиного генного компонента <4 00:· 1

ддаа1:!аа1;(;	сдсбдгсбдс	дадддссадс	ИдИзддддЬд	адбасЬсссб	сбсаааадсд	60
ддсабдасбЪ	сЬдсдсЕаад	аСЬдбсадЫ:	^ссааааасд	ддаддабЬбд	абаИсассб	120
ддсссдсддб	дабдсс-Ьббд	адддЪддссд	сд±ссабс1:д	дбсадаааад	асаабс£1:бб	180
(д((д1:саад	сббдаддЬдЪ	ддсаддсГСд	адабсбддсс	абасасЫда	дЪдасаа<;да	240
сабссасбб!:	дссбббсбсб	ссасаддбд!	ссасбсссад	д£ссаас£		288

<210> 2 <211> 1470 <212> ДНК <213> Плацентарная РНК человека <400> 2

а^ддсдсссд	£сдссд£с6д	ддссдсдсбд	дссдбсддас	Сддадсбсбд	ддсЬдсддсд	60
сасдссСбдс	ссдсссаддб	ддсаЬ^Ьаса	сссГасдссс	сддадсссдд	дадсасаГдс	120
сддс1садад	аа£асДабда	ссадасадсб	садабдЬдс!	дсадсаааЬд	сбсдссдддс	100
саасаЪдсаа	аад-Ьсббсбд	Ьассаадасс	1сддасассд	6д6д!дас!с	сбдбдаддас	240
адсасабаса	сссадсбсбд	даасбдддбб	сссдадбдсЬ	бдадсбдбдд	сбсссдсТд!:	300
адсбсЛдасс	аддбддааас	ЪсаадссЬдс	асбсдддаас	адаассдсаЬ	сСдсассбдс	360
аддсссддсТ	ддбасбдсдс	дсСдадсаад	саддаддддб	дссддсСдЬд	сдсдссдсбд	420
сдсаад£дсс	дсссдддс£Ь	сддсдбддсс	адассаддаа	с£даааса£с	адасдбддбд	480
бдсаадссс!:	дбдссссддд	дасдбЁс£сс	аасасдас1:1:	са£ссасдда	£а£(:£дсадд	540
ссссассада	1;с£д(:аасдб	ддбддссабс	ссбдддаабд	саадсабдда	ЬдсадЬсбдс	600
асдбссасдб	сссссасссд	дадба£ддсс	ссаддддсад	£асасб£асс	ссадссадбд	660
бссасасдаь	сссаасасас	дсадссаасб	ссадаассса	дсасЪдсСсс	аадсассбсс	720

- 16 011619

РРссРдсРсс	саардддссс	садсссссса	дсРдааддда	дсасРддсда	сдадсссааа	780
РсРРдРдаса	ааасРсасас	аРдсссассд	Рдсссадсас	сРдаасРссР	ддддддассд	840
РсадРсРРсс	Рсррсссссс	аааасссаад	дасасссРса	РдаРсРсссд	дассссРдад	900
дрсасардсд	рддрддрдда	сдрдадссас	даадасссРд	аддРсаадРР	саасРддРас	960
дрддасддсд	рддаддрдса	Раардссаад	асааадссдс	дддаддадса	драсаасадс	1020
асдрассдрд	рддрсадсдр	ссРсассдРс	срдсассадд	асРддсРдаа	Рддсааддад	1080
РасаадРдса	аддРсРссаа	сааадсссРс	ссадссссса	Рсдадаааас	саРсРссааа	1140
дссааадддс	адссссдада	ассасаддрд	РасасссРдс	ссссаРсссд	ддаддадаРд	1200
ассаадаасс	аддРсадссР	дассРдссРд	дРсаааддсР	РсРаРсссад	сдасаРсдсс	1260
дрддадрддд	ададсааРдд	дсадссддад	аасаасраса	адассасдсс	РсссдРдсРд	1320
дасРссдасд	дсРссРРсРР	ссРсРаРадс	аадсРсассд	Рддасаадад	саддрддсад	1380
саддддаасд	рсррсрсард	сРссдРдард	сардаддсРс	Рдсасаасса	сРасасдсад	1440
аададссРср	сссрдрсссс	дддРаааРда				1470

<210>3 <211>582 <212> ДНК <213> Почечная РНК человека

<400> 3	асдаардрсс	рдссрддсрд	РддсрРсРсс	РдРсссРдсР	дРсдсРсссР	60
сРдддссРсс	садРссРддд	сдссссасса	сдссРсаРсР	дрдасадссд	адрссрддад	120
аддрассрср	рддаддссаа	ддаддссдад	ааРаРсасда	сдддсрдрдс	РдаасасРдс	180
адсРРдааРд	адаарарсас	РдРсссадас	ассааадрра	аРРРсРаРдс	сРддаададд	240
аРддаддРсд	ддсадсаддс	сдРадаадРс	Рддсадддсс	РддсссРдсР	дРсддаадсР	300
дрсс!дсддд	дссаддсссР	дррддрсаас	ЪсРРсссадс	сдрдддадсс	ссРдсадсРд	360
сардРддаРа	аадссдрсад	РддссРРсдс	адссРсасса	сРсРдсРРсд	ддсРсРддда	420
дсссадаадд	аадссарсРс	сссРссадаР	дсддссРсад	сРдсРссасР	ссдаасааРс	480
асРдсРдаса	сРРРссдсаа	асРсРРссда	дРсРасРсса	аРРРссРссд	дддааадсРд	540
аадсРдРаса	саддддаддс	сРдсаддаса	ддддасадаР	да		582

<210>4 <211>373 <212> ДНК <213> Аденовирус

<400> 4 сРРссдсаРс	дсРдРсРдсд	адддссадсР	дМзддддЪда	дРасРсссрс	Рсаааадсдд	60
дсаРдасРРс	РдсдсРаада	РРдРсадРРР	ссааааасда	ддаддарррд	аРаРРсасРд	120

- 17 011619

дсссдсддЕд	аЕдссЕЕЕда	дддЕддссдс	дЕссаЕсЕдд	Есадаааада	сааЕсЕЕЕЕЕ	180
дЕЕдЕсаадс	ЕЕссЕЕдаЕд	аЕдЕсаЕасЕ	ЕаЕссЕдЕсс	сЕЕЕЕЕЕЕЕс	сасадсЕсдс	240
ддЕЕдаддас	ааасЕсЕЕсд	сддЕсЕЕЕсс	адЕасЕсЕЕд	даЕсддааас	ссдЕсддссЕ	300
ссдаасддЕа	сЕссдссасс	дадддассЕд	адсдадЕссд	саЕсдассдд	аЕсддаааас	360
сЕсЕсдаддЕ	асе					373
<210> 5 <211> 417 <212> ЛНК
<213> Аденовирус
<400> 5 адсдддсасЕ	сЕЕссдЕддЕ	сЕддЕддаЕа	ааЕЕсдсаад	ддЕаЕсаЕдд	сддасдассд	60
дддЕЕсдаас	сссддаЕссд	дссдЕссдсс	дЕдаЕссаЕд	сддЕЕассдс	ссдсдЕдЕсд	120
аасссаддЕд	ЕдсдасдЕса	дасаасдддд	дадсдсЕссЕ	ЕЕЕддсЕЕсс	ЕЕссаддсдс	180
ддсддсЕдсЕ	дсдсЕадсЕЕ	ЕЕЕЕддссас	Еддссдсдсд	сддсдЕаадс	ддЕЕаддсЕд	240
дааадсдааа	дсаЕЕаадЕд	дсЕсдсЕссс	ЕдЕадссдда	дддЕЕаЕЕЕЕ	ссаадддЕЕд	300
адЕсдсадда	сссссддЕЕс	дадЕсЕсддд	ссддссддас	Едсддсдаас	дддддЕЕЕдс	360
сЕссссдЕса	Едсаадассс	сдсЕЕдсааа	ЕЕссЕссдда	аасадддасд	адссссЕ	417

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (20)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ высокой экспрессии представляющих интерес белков с использованием экспрессионного вектора, который включает, по меньшей мере, следующие регуляторные элементы:

   a) промотор СМУ или его функциональные варианты,

   b) интрон,

   c) ТРЬ или его функциональные варианты,

   б) УА гены или функциональные варианты, и

   с) последовательность полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота или функциональные варианты.
2. 2. Способ по п.1, где представляющий интерес белок представляет собой рекомбинантный эритропоэтин.
3. 3. Способ по п.1 для высокой экспрессии гибридного белка ТИРК-1дСЕс.
4. 4. Способ по п.1 для высокой экспрессии ритуксимаба, трастузумаба, бивакузумаба или других моноклональных антител.
5. 5. Способ по п.1 для высокой экспрессии генов, пригодных для экспрессии в клетках млекопитающих.
6. 6. Экспрессионный вектор млекопитающих, определенный в п.1, который включает по меньшей мере следующие пять регуляторных элементов:

   a) промотор СМУ или его функциональные варианты,

   b) интрон,

   c) ТРЬ или его функциональные варианты,

   б) УА гены или функциональные варианты и

   с) последовательность полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота или функциональные варианты.
7. 7. Вектор по пп.1-6, где интрон представляет собой химерный интрон с 8ЕЦ. ΙΌ. Ио.1.
8. 8. Вектор по пп.1-6, где ТРЬ представляет собой регуляторный элемент 8ЕЦ. ΙΌ. Ио.4.
9. 9. Вектор по пп.1-6, где УА гены являются имеющими последовательность 8ЕЦ. ΙΌ. Ио.5.
10. 10. Новый экспрессионный вектор млекопитающих, определенный в любом из предшествующих пп.1-9, который включает по меньшей мере следующие пять регуляторных элементов:

    a) промотор СМУ или его функциональные варианты,

    b) химерный интрон, имеющий последовательность 8ЕЦ. ΙΌ. Ио.1, или его функциональные варианты,

    c) ТРЬ, имеющий последовательность 8ЕЦ. ΙΌ. Ио.4, или его функциональные варианты,

    б) УА гены, имеющие последовательность 8ЕЦ. ΙΌ. Ио.5, или их функциональные варианты и

    - 18 011619

    е) последовательность полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота или функциональные варианты.
11. 11. Вектор, определенный в любом из пп.1-10, дополнительно включающий маркер селективности и амплификации, выбранный из дигидрофолатредуктазы, аденозиндезаминазы, орнитиндекарбоксилазы, аспарагинсинтетазы, глутаминсинтетазы или их функциональные варианты.
12. 12. Вектор, определенный в любом из пп.1-11, дополнительно кодирующий ген для эритропоэтина.
13. 13. Вектор, определенный в любом из пп.1-11, дополнительно кодирующий ген для гибридного белка ΤΝΓΚ-ΙβΟΕο.
14. 14. Вектор, определенный в любом из пп.1-11, дополнительно кодирующий ген для ритуксимаба, трастузумаба, бивакузумаба или других моноклональных антител.
15. 15. Вектор, определенный в любом из пп.1-11, дополнительно кодирующий соответствующий ген(ы), способный экспрессироваться в клетках млекопитающих.
16. 16. Клетка млекопитающих, трансформированная экспрессионным вектором, определенным в любом из пп.1-15.
17. 17. Вектор, определенный в любом из пп.1-16, где клетки млекопитающих для трансфекции выбраны из Со®, СНО, СНО ΌΗΓΚ^-, ΒΗΚ1 и N80.
18. 18. Применение вектора, определенного в любом из предшествующих пунктов, для достижения высокой экспрессии представляющих интерес белков.
19. 19. Применение вектора по п.18, где представляющий интерес белок выбран из рекомбинантного эритропоэтина, рекомбинантного гибридного белка ΤΝΓΚ-ΙβΟΕο и моноклональных антител, выбранных из ритуксимаба, трастузумаба, бивакузумаба.
20. 20. Способ достижения высокой экспрессии представляющего интерес белка посредством кодирования соответствующего гена в векторе, определенном в любом из предшествующих пп.1-11.