KR101184074B1

KR101184074B1 - 단백질을 높은 수준으로 생성하는 발현 벡터 및 방법

Info

Publication number: KR101184074B1
Application number: KR1020077029667A
Authority: KR
Inventors: 아룬 케이 싱; 에시쉬 고엘; 산제에브 케이. 멘디라타
Original assignee: 카딜라 핼쓰캐어 리미티드
Priority date: 2005-06-20
Filing date: 2006-06-19
Publication date: 2012-09-17
Also published as: EA011619B1; AU2006277568A2; US20110212518A1; WO2007017903A3; EA200800098A1; US20130236957A1; ZA200710554B; CA2611946A1; WO2007017903A2; US9163257B2; EP1893757A2; KR20080047319A; UA92913C2; AU2006277568A1; HK1112020A1; AU2006277568B2; JP2008543325A; NZ592891A; US9260721B2; ES2605358T3

Abstract

발현 벡터를 사용하여, 목적 단백질의 발현을 높이는 방법. 상기 방법은 적어도 하기 조절 요소를 포함한다: a) CMV 프로모터, 또는 그의 작용 변이체, b) 인트론, c) TPL 또는 그의 작용 변이체, d) VA 유전자 또는 작용 변이체, 및 e) 소 성장 호르몬 폴리아데닐레이션 서열 또는 작용 변이체.

발현 벡터, 프로모터, 인트론

Description

단백질을 높은 수준으로 생성하는 발현 벡터 및 방법{Expression vector and methods of producing high levels of proteins}

본원 발명은 포유 동물 세포에서 재조합 단백질을 높은 수준으로 생성하는 신규 발현 벡터와, 이를 사용하여 목적 단백질(protein of interest)을 생성하는 방법에 관한 것이다. 상기 발현 벡터는 문헌에서 보고된 최적의 벡터보다 80-100% 높은 재조합 단백질 EPO 발현을 제공한다.

IMS health에 따르면, 전체 약제학적 시장 중 생물 의약의 점유율이 1999년에는 6 퍼센트에서 2009년에는 14 퍼센트(900억 달러)까지 성장할 것으로 예상되고 있다. 이러한 생물제제(biological)에 대한 증가하는 수요는 주로, 소 분자(small molecule)에 기초한 약물과 비교할 때, 상당히 경감되고 뚜렷한 독성 위험을 생성하는 이들의 일반적으로 매우 특정된 작용 표적 때문이다. 또한, 조직 추출물 또는 체액으로부터 생물제제를 정제하는 오래된 방법과는 대조적으로, 생물제제를 생성하기 위해 재조합 방법을 사용함으로써, 매우 높은 순도, 뚜렷한 안전성 및 물리 화학적 특징의 생성물이 쉽게 제조될 수 있다. 모든 환자에게 도움이 되는 이러한 특성에도 불구하고, 대부분의 재조합 생물제제는 세상 대부분 사람들에게 이용될 수는 없는데, 왜냐하면 이들은 엄청난 고가 상태를 계속 유지하고 있기 때문이다. 그러므로, 에리스로포이에틴(erythropoietin)과 같은 생명을 구하는 약물, 삶의 질을 상당히 개선하는 에타네르셉트(etanercept)와 같은 약물, 및 리툭시마브(rituximab), 트라스투주마브(trastuzumab)와 같은 많은 항암성 약물, 및 그 밖의 모든 모노클로날 항체 등은 매우 적은 비율의 사람들에 대해서만 사용되고 있고, 세상에 있는 대다수의 아픈 사람들은 이들을 충분히 사용할 수 없다. 그러므로, 이러한 약물의 비용을 절감하기 위한 시급한 필요성이 있어 왔다. 상기 높은 비용의 상당 부분은 약물을 제조하는 것과 관련된 것이다. 본원 발명은 발현 벡터로 트랜스펙션된(transfected) 포유 동물 숙주 세포에서 단백질 발현을 증가시킬 수 있는, 이러한 발현 벡터를 제공함으로써, 상기 문제에 대한 해결 방법을 제공한다.

최근 연도에, 재조합 DNA 기술은 일반적으로 단백질이 뒤이어 치료제로 사용될 때에는 생물제제라고 불리워지기도 하는 목적 단백질 생성물을 코딩하는(encoding) 목적 유전자를 쉽게 얻는 것이 가능한 단계에까지 발전하고 있다. 일단 그 유전자가 얻어지면, 먼저 상당 수의 입수가능한 숙주-특이적(host-specific) 발현 벡터 중 어느 하나에 상기 유전자를 클로닝하고, 그 다음에 다양한 형질전환 또는 트랜스펙션(transfection) 방법을 사용하여 특이적 숙주에 유전자-전달 벡터(gene-carrying vector)를 도입함으로써, 다양한 숙주가 유전자 발현을 위해 사용될 수 있게 된다. 유전자-형질 전환된 숙주 세포로부터 단백질을 생성하기 위해서, 또한 다양한 조건의 발효(fermentation)가 이용가능하다. 숙주의 선택, 및 발현 벡터, 형질전환 및 트랜스펙션 방법 및 발효 방법의 선택과 같은 후속되는 서로 의존적인 선택은 생성될 단백질의 특성, 단백질의 궁극적인 용도, 필요한 단백질의 양, 이용가능한 정제 방법, 전체적인 비용 및 이용가능한 기술 등과 같은 많은 인자에 따라 달라진다. 예를 들면, 생성되는 재조합 단백질이 치료 용도를 목적으로 하는 본원 발명의 관련 분야와 관련하여서는, 단백질의 1차, 2차 및 3차 구조, 단백질의 글리코실레이션 정도와 특성, 최종 생성물의 순도, 생성된 단백질의 양, 약물이 판매될 수 있는 비용 모든 것들이 발현 숙주를 선택하고 그 밖의 서로 의존적인 선택적 사항을 만드는 상기 방법에 도움이 된다.

생물제제 생성시 고 비용에 관한 상기 기술된 문제를 해결하기 위한 하나의 가능한 해결법은 E. coli와 같은 박테리아 숙주 세포에서 생물제제를 발현하는 것이다[Marino, M. H., BioPharm, 2:18-33 (1989); Georgiou G., Protein engineering: Principles and practice, Wiley Liss, New York, 101-127 (1996); Gold, L. Methods Enzymol, 185:11-14 (1990); Hodgson, J., Bio/Technology, 11:887-893 (1993); Nicaud et al, J. Biotechnol. 3:255-270 (1986); Olins, P. O., and S. C. Lee., Curr. Opin. Biotechnol. 4:520-525 (1993); Shatzman, A. R., Curr. Opin. Biotechnol, 6:491-493 (1995)]. 통상적으로 사용되는 박테리아 숙주인 대장균은 재조합 단백질 생성을 위해 중요한 숙주 유기체이고, 이것은 산업상 생산에서 광범위하게 사용된다. 대장균의 다수 장점으로는 용이한 배양, 저 비용, 및 높은 생성 잠재력(production potential)을 포함한다[Shuhua Tan et al, Protein Expression and Purification, 25:430-436 (2002); Cornelia Rossmann et al, Protein expression and Purification 7:335-342 (1996)]. 그러나, 박테리아 숙주는 일반적으로 생물제제 생성을 위해서는 이상적이지 못한데, 왜냐하면 박테리아 숙주는 단백질을 글리코실화하는데 필요한 기관을 갖고 있지 않고[Old R W, and Primrose S.B., Principles of Gene Manipulations, An introduction to genetic Engineering, Blachvell science, United Kingdom. (1994)], 포유 동물의 치료 단백질 대부분은 적절한 글리코실레이션이 없다면 충분히 작용하지 못하기 때문이다. 또한, 배양 배지로 단백질의 효과적인 방출을 위한 분비 메카니즘의 결여, 대규모 이황화 결합의 형성을 용이하게 하는 제한된 능력, 부적절한 폴딩(folding), 숙주 세포 프로테아제에 의한 단백질의 분해, 코돈 사용(codon usage)에서의 상당한 차이점, 글리케이션(glycation)과 같은 그 밖의 변형 등은 박테리아 시스템을 포유 동물 시스템보다 덜 좋게 만든다[Fuh, G. et al., J. Biol. Chem, 265:3111- 3115 (1990); Liang et al., Biochem. J., 229:429-439 (1985); Sarmientos et al., Bio/Technology, 7:495-501 (1989); Savvas C. Makrides, Microbiological Reviews, Sept. 1996. 512-538; N. Jenkins and E. M. Curling, Enzyme Microb. Technol, 16:354-364 (1994)]. 따라서, 치료제용 단백질을 박테리아에서 발현하는 것이 항상 가능하지는 않으며, 진핵 숙주 세포를 사용한 발현이, 재조합 단백질의 더 낮은 발현 수준, 더 엄격한 배양 요구조건 및 더 늦은 성장 속도 등으로 인하여 더 높은 생성 비용이 들게 하지만 대부분의 생물제제는 발현을 위해서는 진핵 숙주 세포를 사용한다(Cornelia Rossmann, Protein Expression and Purification, 7:335-342 (1996); Geoff T. Yarranton, Current Opinion in Biotechnology, 1:133-140 (1990)].

포유 동물 숙주 시스템이 치료제용 단백질의 생성을 위해서는 매우 좋으므로, 이들과 관련된 높은 생산 비용에 관한 상기 문제점을 해결하는 것은 매우 중요하다. 생산 비용은 생산성을 증가시킴으로써 절감될 수 있으므로, 상기 숙주 세포에 의해 생성될 수 있는 생성물의 양을 증가시키는데 상당한 노력을 들이고 있다. 숙주 세포에 의해 생성되는 생성물의 양을 조절하는 인자는 보통 배양 조건과 같이 세포에 대한 외부 인자와, 전사 효율과 질[Foecking and Hofstetter, Gene, 45:101-105 (1986); Kaufman et al, Journal of molecular Biology, 159:601-621 (1985); Wurm et al, PNAS, 1983:5414-5418 (1986); Reiser and Hauser, Drug Research, 37:482-485 (1987); Zettlmeissl et al, Biotechnology, 5:720-725 (1987)] 및 번역[(R. Grabherr and K. Bayer, Food Technol. Biotechnol. 39 (4) 265-269 (2001); Randal J. Kaufman et al. Molecular Biotechnology, 16 (2), 151-160, (2000) ; Juraj Hlavaty et al., Virology 341, 1 - 11, (2005); C. M. Stenstrom et al,, Gene. 273(2), 259-65, (2001). M. Ibba and D. Soll, Science, 186, 1893, (1999)]을 조절하는 인자를 포함한 대다수의 세포에 대한 내부 인자를 포함하고, 이들은 주로 발현 벡터 그 자체의 설계에 좌우된다. 비록, 문헌상에서 배양 조건 개선에 의해 숙주 세포 생산성을 증가시키기 위한 많은 노력을 보고하고 있지만[Palermo D. P. et al., Journal of Biotechnology, 19:35-48 (1991); Birch and Froud, Biologicals, 22:127-133 (1994); Osman et al, Biotechnology and Bioengineering, 77:398-407 (2003); Dezengotita et al, Biotechnology and Bioengineering, 77:369-380 (2002); Schmelzer & Miller, Biotechnology Prog, 18:346-353 (2002); Dezengotita et al., Biotechnology and Bioengineering, 78:741-752 (2002); 및 Sun et al, Biotechnology Prog., 20:576-589 (2004)], 상기 외부 인자의 개선은 제한된 정도에서만 발현을 증가시킬 수 있고, 발현 벡터가 먼저 발현의 이상적인 근본적인 수준에 도달하도록 최적화되지 않는다면 상업적으로는 쓸모가 없다.

종래 기술 분야에서 유전자 발현을 개선하기 위한 내부 인자를 해결하고자 하는 상당수의 연구가 보고되었다. 하기에서 기술된 내부 인자들은 다양한 방식으로 유전자 발현을 조절하는 조절 요소(regulatory element)로 또한 알려져 있다. 목적 유전자가 발현 벡터로부터 발현되기 위해서, 발현 벡터는 목적 유전자가 mRNA로 전사되고 그런 다음 정확하게 단백질로 번역되도록 적절한 5' 및 3' 플랭킹 서열(flanking sequence)의 조절 하에 위치되어야만 한다는 것은 종래 기술 분야에서 잘 알려져 있다. TATA 박스(TATA box)와 같은 많은 중요한 5' 및 3' 플랭킹 서열[Boshart, M. et al., Cell, 41:521-530 (1985); Browning, K.S. et al. J. Biol. Chem., 263:9630-9634 (1998); Dorsch-Hasler, K. et al., PNAS, 82:8325-8329 (1985)], CMV 즉시 초기 프로모터(immediately early promoter), SV40 초기 프로모터(early promoter) 또는 레이트 프로모터(late promoter), 아데노바이러스 메이저 레이트 프로모터(major late promoter)와 같은 바이러스 프로모터[Luigi R., Gene, 168:195-198 (1996); Pizzorno, M.C. et al., J. Virol., 62:1167-1179 (1988); Okayama and Berg, MoI. Cell. Biol, 2:161-171 (1982); Wong et al., Science, 228:810-815 (1985); Foecking and Hofsteffer, Gene, 45:101-105 (1986)], 및 마우스 메탈로티오닌 프로모터(metallothionin promoter), 치킨 β-액틴 프로모터와 같은 포유 동물 프로모터[Nicole Israel et al., Gene, 51:197-204 (1987); Karin, M. and Richards, Nature, 299:797-802 (1982); Miyazaki et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 83:9537-9541 (1986)]와 같은 프로모터, CMV 즉시 초기 인핸서(immediate early enhancer)와 같은 인핸서[Cockett, M.I. et al., Nucleic Acids Research, 19:319-325 (1996)], 번역 개시 코돈과 종결 코돈[Lehninger et al, Principles of Biochemistry - 제3판, Worth Publishers, Chapter 27, plO25], 및 소 성장 호르몬(bovine growth hormone, BGH) 및 SV40 폴리아데닐레이션(polyazdenylation) 부위와 같은 폴리아데닐레이션 부위[Carswell, S. and Alwine, J.C, Mol. Cell. Biol. 9:4248-4258 (1989)]가 보고되었다. 인트론은 액손 사이에 개재 서열(intervening sequence)로서 진핵 세포 유전자의 필수적인 부분(integral part)을 보통 형성하고, 성숙한 mRNA를 형성하기 위해 RNA 스플라이싱(RNA splicing)이라고 알려진 방법에 의하여 프라이머리 전사체(primary transcript)로부터 정확하게 삭제되는 또 다른 내부 인자이다. RNA 스플라이싱은 mRNA 안정성[Buchman et al, MoI. Cell Biol. 8:4395-404 (1988); Peterson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:8883-87 (1986)], 및 유전자 발현의 조절[Brinster et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:836-40 (1988); Dynan, W.S. and Tjian, R., Nature, 316:774-778 (1985)]을 초래한다고 광범위하게 입증되고 있다. 아데노바이러스 메이저 레이트 전사체의 5' 도너 부위(donor site)와 마우스 면역글로불린의 3' 스플라이스 부위(splice site)로 구성되며 Huang et al[Huang et al, Nucleic Acids Res., 18:937-47 (1990)]에 의해 보고된 것과 같은 합성 키메라 인트론(chimeric intron)이 또한 개발되고 있다. 상기 키메라 인트론은 그 밖의 통상적으로 사용되는 인트론보다 더 향상된 이종 유전자(heterologous gene) 발현을 뒷받침한다[Huang et al, Nucleic Acids Res., 18:937-47 (1990); Ted Choi et al, Molecular and Cellular Biology, 11 (6): 3070-3074 (1991)].

매우 유효한 내부 인자를 위해 통상적으로 사용되는 공급원은 바이러스이다. 바이러스는 그 자신의 내부 인자를 사용하여 자신의 번식과 생존에 좋은 방향으로 숙주와 자신의 유전자 발현을 촉진하는, 자연 상태에 있는 가장 유능한 기생 동물인 것으로 잘 알려져 있다. 또한, 바이러스는 궁극적으로는 단백질 생성을 개선하기 위한 발현 벡터의 설계에서 그 역할에 대해 폭넓게 연구되고 있다. 분자 생물학 분야에서 알려져 있는 가장 효과적인 프로모터 중 일부는 바이러스로부터 유래된다[Luigi R., Gene, 168:195-198 (1996); Pizzorno, M. C. et al., J. Virol, 62:1167-1179 (1988); Okayama and Berg, MoI. Cell. Biol, 2:161-171 (1982); Wong et al., Science, 228:810-815 (1985); Foecking and Hofsteffer, Gene, 45:01-105 (1986)]. 많은 바이러스가 유전자 수준에서 광범위하게 연구되고 있고, 숙주 세포에서 mRNA의 핵 및 세포질 대사를 변경시킬 수 있는 개별적인 서열들이 확인되고 있다. 아데노바이러스 셋으로 나누어진 리더 요소(tripartite leader element, TPL)(GI: 209811) [Akusjarvi G. et al, J MoI Biol, 134(l):143-58 (1979)]는 직접적으로 부착되었을 때 바이러스-감염된 세포에서 심지어 비-바이러스성 RNA의 번역을 증가시키는 것으로 알려진 요소 중 하나이다[Berkner K.L. et al, Nucleic Acids Res., 13(3):841-57 (1985)]. 아데노바이러스 메이저 레이트 전사 단위(transcription unit)에 의해 코딩되는 모든 mRNA는 이러한 공통적인 5' 비-코딩 영역(non-coding region)을 공유한다. 상기 요소는 전사체(transcript)의 핵 반감기를 감소시킬 수 있다[Huang et al, J Virol., 2(1):225-35 (1998)]. 또한, 상기 요소는 mRNA의 번역을 증가시키는 것으로 알려져 있다[Kaufman R. J. et al, Proc Natl Acad Sci U S A., 82(3):689-93 (1985)]. 또 다른 요소는 아데노바이러스성 바이러스 관련된 RNA(Adenoviral Virus Associated RNA) 유전자 I & II(GI:209811) 또는 그의 작용 변이체(functional variant)이다. VA RNA 유전자 I & II (VA 유전자)는 TPL 서열을 포함하는 유전자의 번역 효율(translation efficiency)을 증가시키는 것으로 나타났다[Kaufman R. J. et al, Proc Natl Acad Sci USA., 82(3):689-93 (1985)]. VA RNA I 유전자는 EIF2a의 탈인산화(dephosphorylation)에 관련되고 따라서 단백질 합성 속도를 증가시킨다[O'Malley et al, Cell, 44:391-400 (1986); Thimmapayya B., et al, Cell, 31:543- 551 (1982)].

또 다른 통상적으로 사용되는 내부 인자는 유전자 발현을 증가시키기 위한 좋은 접근 방법인 유전자 복제 수(gene copy number)이다[Kaufman and Sharp, Journal of molecular Biology, 159:601-602 (1982); Pendse G.J. et al, Biotechnology and Bioengineering, 40:119-129 (1992); Schimke, R.T. (Ed.), Gene Amplification. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982]. 유전자 복제 수를 증가시키기 위해 사용되는 가장 통상적인 방법은 유전자 증폭을 위해 세포를 선택하는 것이다. 이러한 접근 방법에서, 예를 들면, EP0045809 또는 US4634665에서 기술된 바와 같이, 숙주 세포는 한 쌍의 유전자로 형질 전환된다. 상기 한 쌍의 유전자에서 첫 번째 유전자는 목적 단백질을 코딩하고, 두 번째 유전자는 선택적 마커(selectable marker) 예를 들면 디히드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase, DHFR)를 코딩한다[Alt, F.W. et al., J. Biol. Chem., 253:1337-1370 (1978)]. 상기 두 개의 유전자는 한 개의 단일한 발현 벡터 상에 또는 두 개의 분리된 발현 벡터 상에 존재한다. 상기 한 쌍의 유전자로 세포를 트랜스펙션시킨 후, 선택적 마커로 DHFR 유전자를 사용하는 방법의 경우에 메토트렉세이트와 같은 독성 제제의 농도 증가 하에서 세포는 배양되고, 그 영향은 선택적 마커 유전자의 생성물에 의해 사라지게 된다. 상기 독성 제제의 보다 높은 농도에서 생존하는 세포주는 선택성 마커 유전자와 목적 생성물 유전자 모두의 증가된 복제 수를 갖는 것으로 확인되었다. 증폭된 관련 유전자 복제의 수를 갖는 선택된 숙주 세포는 목적 단백질의 양을 기원이 되는 세포주보다 더 많이 생성할 수 있다. 유전자 증폭을 위한 유사한 방법이 아데노신 데아미나제(adenosine deaminase, ADA), 오르니틴 데카르복실라제(ornithine decarboxylase, ODC), 아스파라긴 신세타제(asparagine synthetase, AS)[Chiang, T. and McConlogue, MoI. Cell. Biol. 764-769 (1988); Cartier, M. et al., MoI. Cell. Biol, 7:1623-1628 (1987); Germann, U.A. et al., J. Biol. Chem. 264:7418-7424 (1989); Mkeille Cartier and Clifford P. Stanners, Gene, 95:223-230 (1990); Wood CR. et al., J Immunol, 145:3011-3016 (1990); Kellems R. E. et al., In Genetics and Molecular Biology of Industrial Microorganisms, American Society for Microbiology, Washington, 215-225 (1989)], 및 글루타민 신세타제(glutamine synthetase, GS)[Catherine W-H. et al., J. Biol. Chem., 276:43, 39577-39585 (2001); Bebbington, et al., Biotechnology, 10:169-175 (1992); Bebbington, C.R., Monoclonal antibodies: the next generation,Zola,H., (ed). Bios Scientific, Oxford, 65-181 (1995); Wilson, R.H., In "Gene Amplification in Mammalian Cells" ed Kellens, R.E., Marcel Dekker Inc., New York, 301-311 (1993)]와 같은 그 밖의 선택 마커를 사용하여 활용되고 있다.

이러한 상기 기술된 조절 요소 또는 내부 인자는 일반적으로, 독립적으로는 유전자 발현을 제공할 수 없고, 조합하여 사용되어야만 한다. 그러나, 요소 그 자체에 대해서는 잘 이해되고 있는 반면에, 요소들 조합(combination)의 효율은 높은 발현에 대해서는 절대적으로 예측할 수 있는 것이 아니다. 일부 조합은 다른 조합과 비교할 때 매우 좋지 못한 발현을 제공한다. 예를 들면, SR α 프로모터, AMV RNA 리더 서열(leader sequence) 및 DHFR의 조합으로 구성되는 발현 벡터를 사용한 Jang 등은 단지 45 IU/ml(0.346 ㎍/ml와 동등함)의 에리스로포이에틴(EPO) 발현을 얻을 수 있었던 반면에[Jang H P et al, Biotechnol. Appl. Biochem, 32:167-172, (2000)], US5955422는 또 다른 조합, 즉 SV40 프로모터와 폴리 A 서열 및 DHFR로 구성되는 발현 벡터를 사용하여 750 내지 1470 U/ 백만개 세포/48시간(또는 375 내지 735 U/ 백만개 세포 / 24시간)의 EPO의 수준을 보고하였다. US5888774에서 보고되었고, EF1 프로모터와 apoB SAR 요소의 조합으로 구성되는 또 다른 발현 벡터 는 EPO 1500 내지 1700 IU/백만 개 세포/24시간의 발현을 보고하였다. TNFR-IgGFc (Enbrel)과 같은 그 밖의 재조합 단백질을 위해서는, CMV 프로모터, TPL, VA I & II 및 DHFR의 조합을 포함하는 발현 벡터가 보고되었다[US 5605690, Cindy A Jacobs and Craig A Smith].

상기 기술된 모든 발전에도 불구하고, 재조합 생물제제의 제조, 특히 포유 동물 발현 시스템을 사용한 제조의 높은 비용은 여전히 주요 관심사가 되고 있다. 그러므로, 종래 기술이 발현 벡터를 조절함으로써 단백질 발현을 증가시키는 상당수의 방법을 보고하고 있지만, 진핵 숙주 세포의 생산성을 더 증가시키기 위하여 신규 발현 벡터를 개발하는 것은 여전히 바람직한 것일 수 있다. 놀랍게도, 지난 이십년에 걸쳐 이 분야에서 만들어진 방대한 양의 지식에도 불구하고, 심지어 오늘날에도 당해 분야의 당업자는 고 발현을 보장해 줄 수 있는 발현 벡터를 설계하기 위해 내부 인자 또는 조절 요소의 조합을 간단한 방법으로 택일하여 선택할 수 없다. 어떤 조합에 특정 요소가 첨가되었을 때, 이 특정 요소는 벡터의 발현 잠재력에 상당히 부가적인 또는 상승적 효과를 제공할 수 없다. 그러므로, 높은 수준의 단백질 발현을 제공해줄 수 있는 신규 발현 벡터를 개발하는 방법은 여전히 많은 가능성을 실험에 의해 테스트하는 단계를 필요로 하고 있다. 본원 발명자는 CHO-DHFR^- 세포에서 트랜스펙션된 후, 168 시간 배양에서 11,830 IU/ml (91 ㎍/ml)의 발현을 제공하는 신규 발현 벡터를 발명하였고, 이 발현은 2366 내지 3549 IU/10⁶개 세포 / 24시간 또는 18.2 내지 27.3 ㎍/10⁶개 세포 / 24시간과 동등하다. 놀랍게 도, 이러한 EPO 발현 수준은 문헌에서 보고된 최적의 벡터보다 80-100% 더 높다. 상기 신규 발현 벡터는 EPO 생산 비용과 그 밖의 재조합 생물제제의 생산 비용을 상당히 낮출 것이다.

발명의 요약

본원 발명은 포유 동물 세포에서 재조합 단백질의 매우 증대된 생성을 위한 신규 발현 벡터를 제공함으로써, 배경 기술에서 이미 기술되었던 문제를 해결한다. 또한, 본원 발명은 상기 벡터를 제조하는 방법 및 단백질 발현을 높은 수준으로 얻기 위해 상기 벡터를 사용하는 방법을 제공한다.

따라서, 본원 발명의 일차적인 목적 중 하나는 본원 명세서에서 기술된 바와 같이 신규 벡터의 사용에 의해서 목적 단백질의 발현 수준을 증가시키기 위한 개선된 방법을 제공하는 것이다.

본원 발명에서는, 하기 서열이 사용된다:

본원 발명은 바이러스와 다양한 다른 벡터 공급원으로부터 수득된 5개 요소의 신규한 조합을 사용하여, 포유 동물 숙주 세포에서 목적 단백질의 고 발현의 형태로 상기 요소들의 상승적 효과를 제공하는 신규 벡터를 개발한다. 보다 구체적으로, 이러한 발현 벡터는 하기 5개 요소들의 신규한 조합으로 구성된다: CMV 즉시 초기 프로모터(CMV immediate early promoter), 아데노바이러스 셋으로 나누어진 리더 요소(Tripartite Leader element, TPL) (GI:209811), 하이브리드(키메라) 인트론(서열번호 1), 아데노바이러스성 바이러스 관련된 RNA 유전자(Adenoviral Virus Associated RNA gene) I & II (GI:209811), 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐레이션 서열.

상기 5개 요소들의 신규한 조합이 벡터로서의 작용을 위해 필요한 추가적인 요소들과 결합하여 기본 벡터(basic vector)에서 사용될 때, 이렇게 생성된 신규 벡터는 기본 벡터와 결합하여 상기 5개 요소 중 일부만 포함하는 벡터보다 상승적으로 더 높은 발현을 나타내었다. 또한, DHFR 증폭 마커(amplification marker)를 포함하는 본원 발명의 신규 발현 벡터는, 안정한 트랜스펙션 후에, 문헌에서 보고된 최적의 벡터보다 80-100% 더 높은 EPO 발현을 제공하였다.

더 바람직하게는, 신규 발현 벡터는 CMV 즉시 초기 프로모터, 아데노바이러스 셋으로 나누어진 리더 요소(TPL)(서열번호 4), 하이브리드(키메라)인트론(서열번호 1), 아데노바이러스성 바이러스 관련된 RNA 유전자 I & II(서열번호 5), 클로닝 부위, 포유 동물 세포 선택 마커, 원핵세포 선택 마커, 증폭/선택 마커, 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐레이션 부위를 포함하고, 이들 모두는 상기 신규 발현 벡터에서 적절한 위치에 존재한다.

상기 벡터를 사용하여 생성될 수 있는 단백질은 FSH와 같은 호르몬, 항체, 에타네르셉트와 같은 키메라 단백질(chimeric protein), 인자 VII (factor VII)와 같은 혈액 성분, 에리스로포이에틴과 같은 성장 인자, 인터페론과 같은 사이토카인, TNF 및 그 등가물을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

신규 발현 벡터의 작제(construction)를 위한 요소의 공급원:

기본 발현 벡터 백본(backbone) ..........pcDNA3.1(Invitrogen¹)

5개 조절 요소

CMV 프로모터...............pcDNA3.1 (Invitrogen)

키메라 인트론..............pIREShyg3 (Clontech²)

TPL...................... .pCAV-NOT-TNFR (ATCC 68088)

VA I ＆ II 유전자 .........pCAV-NOT-TNFR (ATCC 68088)

BGH 폴리아데닐레이션 서열..pcDNA3.1 (Invitrogen)

DHFR minigene .............pDHFR2.9 (ATCC 37165)

¹Product of Invitrogen Life Technologies, USA

²Product of Clontech Laboratories Inc., USA

사용된 줄임말:

CMV .......사이토메갈로바이러스

TPL .......셋으로 나누어진 리더(Tripartite Leader)

VA 유전자 또는 VA I 및 II 유전자....바이러스 관련된 RNA 유전자 I 및 II

BGH......소 성장 호르몬

EPO......에리스로포이에틴

TNFR-IgGFc....종양 괴사 인사 수용체(tumor necrosis factor receptor)와 면역글로불린 G의 Fc 부분의 융합 단백질(fusion protein)

본원 발명의 상세한 설명

본원 발명은 포유 동물 세포에서 재조합 단백질의 더 많은 제조를 위해 신규 발현 벡터를 제공함으로써, 배경기술에서 이미 기술했던 높은 제조 비용 문제를 해결한다. 상기 신규 벡터는 종래 기술에서 보고된 이미 잘-알려져 있는 조절 요소들을 사용하지만, 놀랍게도 상승적으로 더 높은 발현을 생성하는 요소들의 독특한 조합을 포함한다. 추가로, 본원 발명은 상기 신규 벡터를 사용하여 단백질을 높은 수준으로 생성하는 방법을 제공한다.

본원 발명에서 사용되는 요소들의 신규 조합은 다음으로 구성된다:

a) CMV 즉시 초기 프로모터

b) 아데노바이러스 셋으로 나누어진 리더 요소 (TPL)(서열번호 4와 GI:209811)

c) 하이브리드(키메라) 인트론(서열번호 1)

d) 아데노바이러스성 바이러스 관련된 RNA 유전자 I & II (서열번호 5와 GI:209811), 및

e) 소 성장 호르몬 폴리아데닐레이션 부위

상기 신규 벡터를 개발하기 위하여, 상기 기술된 요소들의 신규한 조합에 추가하여 사용될 수 있는 기본 발현 벡터는 다음을 포함한다:

a) 클로닝 부위,

b) 제한되지는 않지만, 네오마이신, 하이그로마이신(hygromycin), 푸로마이신(puromycin)과 같은 약물 내성 마커(drug resistant marker)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적절한 포유 동물 세포 선택 마커, 및 그 등가물,

c) 제한되지는 않지만, 앰피실린, 카나마이신과 같은 항생제 내성 마커(antibiotic resistance marker)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적절한 원핵 세포 선택 마커, 및 그 등가물,

d) 제한되지는 않지만, 디히드로폴레이트 환원효소, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제, 아스파라긴 신세타제, 글루타민 신세타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 증폭/선택 마커, 및 그 등가물.

목적 벡터를 제조하는 방법은 그 밖의 벡터 공급원으로부터 또는 이들의 생물학적 공급원으로부터 벡터의 다양한 요소를 분리하는 단계와, 플라스미드를 위한 백본을 제공하는 또 다른 벡터에 상기 요소들을 삽입하는 단계를 포함한다. 상기 작제를 위해 사용되는 방법은 종래 기술에서 벡터 작제를 위해 보고된 방법[Sambrook J et al.,, Molecular Cloning - A laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, (1989)]으로부터 유래되고, 필요하다면 이들에 적절한 변형을 가할 수 있다.

목적 단백질의 생성을 위해서는, 먼저 단백질을 코딩하는 상응하는 유전자가 수득된다. 목적 유전자를 얻기 위하여, 하기 방법들은 일반적으로 단독으로 또는 복합적으로 사용된다:

(1) 목적 유전자를 위해 전령 RNA(mRNA)를 분리하고, 이 mRNA를 역전사에 의한 상보적 DNA (cDNA)의 생성을 위한 주형으로 사용한다.

(2) 적절한 유전자-특이적 혼성화(hybridization) 프로브(probe)와 제한 효소의 조합을 사용하여 게놈 DNA 라이브러리(genomic DNA library)로부터 천연 유전자(natural gene)를 분리한다.

(3) 하나 이상의 유전자 특이적 프라이머 쌍을 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의해 특정 유전자 단편을 특이적으로 증폭시켜 유전자를 분리한다. 및

(4) 유전자 구성 뉴클레오티드로부터 유전자를 화학적으로 합성한다.

수득된 유전자는 당해 분야에서 잘 알려져 있는 방법에 의해 신규 벡터의 클로닝 부위에 클로닝된다. 그 결과 생성된 작제물은 적절한 포유 동물 숙주 세포로 형질 전환된다. 본원 발명의 방법을 위해 사용될 수 있는 포유 동물 숙주 세포는 제한되지는 않지만, CHO 및 CHO DHFR^- 세포 주, BHK1, NS0, COS 세포 주 및 그 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 형질전환된 세포는 적절한 항생제를 포함한 배지에서 성장할 수 있는 세포의 능력, 및 목적 단백질의 발현에 대한 세포의 능력에 기초하여 선택된다. 선택된 클론은 성장 및 단백질 생성을 위해 적절한 배양 조건 하에 길러져서, 목적 단백질을 높은 수준으로 제공하게 된다. 유전자 복제 수와 후속되는 유전자 발현은 특정 세포독성 약물의 영향이 선택 마커의 복제 수의 증가에 의해서만 없어질 수 있는 특정 세포독성 약물의 선택 강제(selection pressure) 하에서, 높은 유전자 복제 수를 갖는 세포를 선택함으로써 증가될 수 있다. 가끔, 세포 독성 선택 강제에 의한 유전자 증폭은 목적 유전자의 복제를 변화시키면서 클론을 이종 세포 군(heterologous population of cell)으로 변화시키므로, 최종의 생산성이 높은 클론은 제한 희석에 의해서 이종 군으로부터 선택된다.

도면에 대한 설명:

도 1은 신규 발현 벡터 pZRC-TNFR-IgGFc를 포함하는 다양한 TNFR-IgGFc 발현 벡터의 개요도이다.

도 2는 신규 발현 벡터 pZRC-TNFR-IgGFc를 포함하는 다양한 TNFR-IgGFc 발현 벡터로 일시적 트랜스펙션된 Cos-1 세포로부터의 TNFR-IgGFc 단백질의 발현을 나타낸다.

도 3은 신규 발현 벡터 pZRC-EPO를 포함하는 다양한 EPO 발현 벡터의 개요도이다.

도 4는 신규 발현 벡터 pZRC-EPO로 일시적 트랜스펙션된 Cos-1 세포와, 또 다른 EPO 코딩하는 상업적 발현 벡터 pcDNA3.1로 일시적 트랜스펙션된 Cos-1 세포에서 EPO 발현 비교를 나타낸다.

도 5는 pZRC-EPO로 안정하게 트랜스펙션된 CHO-DHFR^- 세포의 선택된 높은 생성 클론에서 EPO 발현에 대한 MTX의 증가하는 강제(pressure)의 영향을 나타낸다.

실시예 1: TNFR - IgGFc 발현 벡터의 작제

포유 동물 발현 벡터 pcDNA 3.1 (Invitrogen Life Technologies)을 본원 발명의 모든 벡터를 작제하기 위한 기본 백본 벡터로 택하였다. 이 벡터는 CMV 즉시 초기 프로모터와, 유전자 전사 조절을 위한 BGH 폴리아데닐레이션 시그날 서열로 구성된다. 상기 2개의 요소가 본원 발명 신규 조합의 5개 요소 중 2개를 형성한다. 이 벡터는 다클로닝 부위(multiple cloning site, MCS), 박테리아를 위한 복제의 pUC 복제시작점(pUC origin), 대장균에서 선택을 위한 앰피실린 내성 유전자, 및 포유 동물 세포에서 선택을 위한 네오마이신 내성 유전자로 더 구성된다. 5개 요소 중 신규 조합에서 남아있는 3개 요소, 즉 아데노바이러스성 셋으로 나누어진 리더 서열, 아데노바이러스 메이저 레이트 전사체의 5' 도너 부위와 마우스 면역글로불린의 3' 스플라이스 부위로 구성되는 하이브리드(키메라) 인트론, 및 아데노바이러스성 VA RNA I & II 유전자를 다양한 조합으로 상기 pcDNA 3.1 백본에 삽입하여, 매우 높은 발현을 제공할 수 있도록 하는 서로 상승적으로 작용하는 요소들의 조합을 발견하고자 하였다.

인간 TNFR-IgGFc 융합 유전자(서열번호 2)와 인간 에리스로포이에틴 유전자(서열번호 3)를 코딩하는 cDNA를 리포터 유전자(reporter)로 사용하여, 단백질 발현에 대한 상기 요소들의 조합의 영향을 연구하였다. 도 1은 TNFR-IgGFc를 위해 개발된 발현 벡터를 나타내고, 도 3은 EPO를 위해 개발된 발현 벡터를 나타낸다.

TNFR-IgGFc는 75 kDa TNFR(1-235 a.a.)과 IgG1의 Fc 단편(CH2, CH3 및 힌지 영역(hinge region)을 포함함)을 포함하는 융합 단백질이다[US5605690]. 상기 융합 단백질은 류마티즘성 관절염을 위해 Enbrel(Amgen)로 칭해지는 약물로 판매된다. 이것은 순환기로부터 염증성 사이토카인인 TNF-α를 제거함으로써 작용한다. TNFR I cDNA을 클로닝하기 위하여, Human placental total RNA(Clontech)를 목적 서열의 역 전사효소-폴리머라제 연쇄 반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)에 기초한 클로닝을 위한 주형으로 사용하였다. 유전자 특이적 프라이밍(gene specific priming)에 의해, MMLV 역 전사 효소(MBI Fermentas, USA)를 사용하여 Human placental total RNA로부터 이중 가닥 cDNA를 합성하였다[Maniatis et al., Molecular cloning; A Laboratory Manual (Cold Spring harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), (1990)]. 그런 다음, 50 mM Tris-Cl (pH 8.3), 2.5 mM MgCl₂, 4 dNTP 각각 200 μM 및 Pfu 폴리머라제 2.5 유닛을 포함하는 100 ㎕ 부피에서, 유전자 특이적 축퇴(degenerate) 올리고뉴클레오티드 프라이머 100 피코몰을 사용하여, 상기 cDNA를 PCR 증폭 40 사이클을 시켰다. 각각의 PCR 증폭 사이클은 94℃에서 30초(변성), 58℃에서 30초(어닐링), 및 72℃에서 1분(확장) 동안의 배양으로 구성되었다. PCR 반응의 증폭된 생성물을 1% 아가로스 겔에서 분리시켰다. 약 705 염기 쌍 크기의 목적 단편을 겔에서 절개해 내었고, Qiagen Gel 추출 키트(extraction kit)를 사용하여 정제하였다. 벡터와 정제된 PCR 생성물 모두를 EcoRI과 PvuII (MBI Fermentas, USA)로 제한효소 절단(restriction digestion)한 후에, 정제된 DNA 단편을 pcDNA 3.1의 MCS에 연결(ligation)시켰다. 얻은 라이게이션 생성물(ligation product)을 대장균 DH5α에서 형질 전환시켰고, 앰피실린 내성에 기초하여 형질전환체를 평가하였다. 약 20개의 이러한 콜로니(colony)로부터 분리된 플라스미드 DNA에 대해, 다양한 제한 효소를 사용하는 제한효소 절단으로 TNFR I cDNA의 실재를 분석하였다. 이러한 플라스미드를 자동화된 DNA 시퀀서(automated DNA sequencer, ABI)를 사용하여 서열을 확인하였고, pcDNA 3.1 벡터에 TNFR I cDNA의 정확한 결합과 서열이 있음을 확인하였다. 이러한 플라스미드 DNA를 pcDNA-TNFR로 명명하였다.

유사한 방법으로, RT-PCR 기초한 클로닝을 위한 주형으로서 human placental total RNA (Clonetech)를 사용하여, IgG1Fc 서열 분리를 수행하였다. IgG1Fc 서열(699 bp)의 코딩 영역(coding region)에 상응하는, 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다. 각각의 PCR 증폭 사이클은 94℃에서 30초(변성), 56℃에서 30초(어닐링), 및 72℃에서 1분(확장) 배양으로 구성되었다. PCR 반응의 증폭된 생성물을 1% 아가로스 겔에서 분리하였다. 약 725 염기 쌍 크기의 목적 단편을 겔에서 절개해 내었고, Qiagen Gel 추출 키트를 사용하여 정제하였다. 벡터의 선형화(linearization) 및 EcoRI과 Not I(MBI Fermentas, USA)를 사용한 정제된 PCR 생성물의 절단 이후에, 상기 정제된 DNA 단편을 pTZ57R (MBI Fermentas) 벡터에 연결시켰다. 얻은 라이게이션 생성물을 대장균 DH5α에서 형질 전환시켰고, 앰피실린 내성에 기초하여 형질 전환체를 평가하였다. 약 10개의 이러한 콜로니로부터 분리된 플라스미드 DNA에 대해, 다양한 제한 효소를 사용하는 제한효소 절단에 의해서, IgG1Fc cDNA의 실재를 분석하였다. 이러한 플라스미드 하나를 자동화된 DNA 시퀀서(ABI)를 사용하여 서열 확인하였고, pTZ57R 벡터에 IgG1 Fc cDNA의 정확한 결합과 서열을 갖고 있는 것을 확인하였다. 이러한 플라스미드 DNA를 pTZ57R-IgG1Fc로 명명하였다.

pcDNA - TNFR - IgGFc

TNFR I과 IgG1Fc 유전자 단편의 융합을 하기 방법에 의해 수행하였다. 클로닝된 TNFR I 단편을 EcoRI과 PvuII에 의한 완전한 절단(complete digestion)에 의하여 pcDNA-TNFR로부터 분리하였다. pTZ57R-IgG1Fc 작제물을 Pvu II과 Not I으로 절단함으로써, pTZ57R-IgGlFc 작제물로부터 IgG1Fc 단편을 분리하였다. Qiagen gel 추출 키트를 사용하여, 상기 단편들을 아가로스 겔로부터 분리하였다. EcoRI과 NotI으로 미리-절단한 선형화된 벡터 pcDNA3.1과 상기 DNA 단편 모두를 스리피스(three piece) 라이게이션 반응에서 혼합하였다. 얻은 라이게이션 생성물을 대장균 DH5α에서 형질 전환시켰고, 형질 전환체를 앰피실린 내성에 기초하여 평가하였다. 이러한 약 10개 콜로니로부터 분리한 플라스미드 DNA에 대해, 다양한 제한 효소를 사용한 제한효소 절단에 의해서 TNFR-IgGFc 융합 생성물의 실재를 분석하였다. 이러한 플라스미드 하나를 자동화된 DNA 시퀀서(ABI)를 사용하여 서열 확인하였고, TNFR-IgGFc 융합 생성물의 정확한 결합과 서열을 갖고 있는 것을 확인하였다. 상기 벡터 작제물을 pcDNA-TNFR-IgGFc로 명명하였고(도 1), 이것은 5' 말단에 CMV 프로모터와 3' 말단에 BGH 폴리아데닐레이션 서열에 의해 플랭킹된(flanked) 융합 유전자를 포함하고 있다.

pcDNA - TPL - TNFR - IgGFc - VA - DHFR

상기 벡터를 개발하기 위해서, 먼저 pcDNA-TNFR-IgGFc에서 CMV 프로모터의 하향(downstream) 및 TNFR-IgG1Fc 유전자의 상향(upstream)으로 아데노바이러스 TPL 요소를 삽입하였다. 이것은 KpnI과 Nde I으로 pCAV/NOT-TNFR (ATCC 68088)를완전한 절단으로 절단하여, TPL을 포함하는 700 bp 단편을 꺼냄으로써 수행되었고, 상기 단편을 Qiagen Gel 추출 키트를 사용하여 추가로 정제하였다. KpnI과 Nde I으로 절단된 pcDNA-TNFR-IgGFc 벡터에 상기 700 bp 단편을 연결시켰다. 얻은 라이게이션 생성물을 대장균 DH5α에서 형질 전환시켰고, 형질 전환체를 앰피실린 내성 에 기초하여 평가하였다. 그 결과 생성된 플라스미드에서 TPL의 실재와 배향(orientation)을 위하여, 다양한 제한 효소를 사용한 제한효소 절단에 의하여 플라스미드 DNA를 분석하였다. pInt-TNFR-IgG-1로 명명되는 상기 양성(positive) 플라스미드 DNA 하나를 2개 요소를 삽입하는데 사용하였다 - 2개 요소 중 하나는 EcoRI과 Not I 이중 절단(double digestion)에 의해 pCAV/NOT-TNFR로부터 분리된 1000 bp VA RNA 유전자이고, 두 번째 요소는 BamHI & SspI로 완전한 절단에 의해 플라스미드 pDHFR 2.9 (ATCC 37165)[Crouse GF et al, MoI. Cell. Biol, 3:257-266 (1983)]로부터 분리된 DHFR minigene이다. MunI & BglII로 이미 절단한 pInt-TNFR-IgG-1과 상기 두 개의 단편인 DHFR minigene 단편과 VA RNA 유전자 단편을 스리피스 라이게이션 반응에서 혼합하였다. 얻은 라이게이션 생성물을 대장균 DH5 α에서 형질 전환하였고, 형질 전환체를 앰피실린 내성에 기초하여 평가하였다. 그 결과 생성된 플라스미드에서 VA RNA 유전자와 DHFR minigene의 실재와 배향을 위하여, 다양한 제한 효소를 사용하는 제한효소 절단에 의하여 플라스미드 DNA를 분석하였다. 상기 벡터 작제물을 pcDNA-TPL-TNFR-IgGlFc-VA-DHFR로 명명하였다(도 1).

pcDNA - TPL - Intron - TNFR - IgGFc

pInt-TNFR-IgG-l 벡터에서 아데노바이러스 TPL 요소의 하향 및 TNFR-IgGFc 유전자의 상향에 키메라 인트론을 삽입함으로써, 발현 벡터 pcDNA-TPL-Intron-TNFR-IgGFc를 제조하였다. pIREShyg3 (Clontech)을 BstXI과 EcoRI으로 완전한 절단으로 절단하여 350 bp 키메라 인트론 단편을 꺼내었고, Qiagen Gel 추출 키트를 사용하여 추가로 정제함으로써, 상기 제조를 수행하였다. BstXI과 EcoRI으로 이미 절단한 pInt-TNFR-IgG-l 벡터 작제물에, 상기 350 bp 단편을 연결시켰다. 얻은 라이게이션 생성물을 대장균 DH5α에서 형질 전환시켰고 형질 전환체를 앰피실린 내성에 기초하여 평가하였다. 그 결과 생성된 플라스미드에서 TPL, 인트론 및 TNFRI-IgGlFc 유전자의 실재와 배향을 위하여, 다양한 제한 효소를 사용한 제한효소 절단에 의하여 플라스미드 DNA를 분석하였다. 상기 플라스미드 하나를 자동화된 DNA 시퀀서(ABI)를 사용하여 서열 확인하였고, 벡터에서 TPL, 키메라 인트론 및 TNFRI-IgGlFc의 정확한 결합을 갖는 것을 확인하였다. 상기 벡터 작제물을 pCDNA-TPL-Intron-TNFR-IgGFc로 명명하였다(도 1).

pcDNA - TPL - Intron - TNFR - IgGFc - VA - DHFR ( pZRC - TNFR - IgGFc )

EcoRI과 Not I으로 이중 절단에 의해 pCAV/NOT-TNFR로부터 분리된 1000 bp VA RNA 유전자와, BamHI과 SspI으로 완전한 절단에 의해 플라스미드 pDHFR 2.9로부터 분리된 DHFR minigene인 2개 요소를 삽입하기 위하여, 상기 기술된 플라스미드 DNA, pcDNA-TPL-Intron-TNFR-IgGFc를 사용하였다. MunI & BglII으로 이미 절단한 pcDNA-TPL-Intron-TNFR-IgGFc에, DHFR minigene과 VA RNA 유전자 단편들을 스리피스 라이게이션 반응에서 연결하였다. 얻은 라이게이션 생성물을 대장균 DH5α에서 형질 전환시켰고, 형질 전환체를 앰피실린 내성에 기초하여 평가하였다. 그 결과 생성된 플라스미드에서 VA RNA 유전자와 DHFR minigene의 실재와 배향을 위해, 다양한 제한 효소를 사용한 제한효소 절단에 의하여 플라스미드 DNA를 분석하였다. 추가로, DNA 시퀀싱에 의하여 결합을 체크하였고 확인하였다. 상기 벡터 작제물을 pZRC-TNFR-IgGFc로 칭해지는 pcDNA-TPL-Intron-TNFR-IgGFc-VA-DHFR로 명명하였다(도 1).

실시예 2: 일시적 트랜스펙션(transient transfection)에 의한, 다양한 TNFR-IgGFc 발현 벡터의 발현 효율 비교

일시적 트랜스펙션 실험을 위하여, African green monkey kidney 섬유아세포-유사 세포인 Cos 1 세포(ATCC No. CRL-1650)를 사용하였다. 상기 세포들을 완전 성장 배지(complete growth medium)(4 mM L-글루타민을 포함하고 1.5 g/L 소듐 바이카보네이트, 4.5 g/L 글루코스, 10% 우태아혈청(FBS) 및 항생제를 포함하도록 조정된 Dulbecco's modified Eagle's 배지)에서 37℃ 온도에서 5% 이산화탄소 (CO₂) 분위기에서 적절하게 유지하였다. 트랜스펙션 하루 전에, 미드-로그 상태(mid-log phase)로 성장한 세포를 트립신 처리하였고, 3 ml 완전 성장 배지에서 2 십만 개 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에서 이중으로(duplicate) 플레이트하였고, 37℃에서 5% CO₂에서 배양하였다. 이미 공지된 프로토콜을 사용하고 Qiagen Polyfect 반응시약을 사용하여 트랜스펙션을 수행하였다. 트랜스펙션하는 날, 하기와 같이 트랜스펙션 혼합(transfection mix)을 제조하였다. 내독소가 없는 물에 용해시킨 DNA 1.5 ㎍ 전체를 0.2 μM 시린지 필터를 사용하여 여과하였다. 가장 큰 작제물인 pZRC-TNFR-IgGFc에 대해서는 1.5 ㎍ 벡터를 그 자체로 사용한 반면에, 그 밖의 더 작은 작제물에 대해서는 그 작제물의 동일몰 함량(TNFR-IgGFc 유전자에 의함)을 빈 벡터(empty vector)와 혼합하여 전체 1.5 ㎍ DNA가 되도록 보충하였다. 상기 DNA를 세포 성장 배지 즉, 1.5 g/L 소듐 바이카보네이트와 4.5 g/L 글루코스를 포함하도록 조절되고 혈청 또는 항생제를 포함하지 않으며 전체 부피가 100 ㎕가 되고 4 mM L-글루타민을 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's 배지에서 먼저 용해시켰다. 볼텍싱에 의하여 적절한 혼합을 수행하였고, 그런 다음 얻은 용액에 간헐적인 짧은 스핀을 몇 초 동안 제공하여 튜브의 측 벽과 상부로부터 방울(drop)을 제거하였다. 그런 다음, 얻은 DNA 용액에 PolyFect Transfection 반응 시약 10㎕를 첨가하였다. 트랜스펙션 혼합을 위 아래로 5회 내지 7회 피펫팅함으로써 적절한 혼합을 수행하였다. 그런 다음, 실온(20-25℃)에서 10분 동안 배양시켜 복합체(complex)가 형성되도록 하였다. 복합체 형성이 일어나는 동안, 6 웰 플레이트로부터 완전 성장 배지를 천천히 흡인기로 빨아내었다. 시딩된(seeding) 세포를 1X 멸균된 포스페이트 완충시킨 식염수(phosphate buffered saline, PBS)(1X PBS) 3 ml로 1회 수세하였다. 그런 다음 새로운 완전 성장 배지 1.5 ml를 첨가하였다. 복합체 형성하고 10분 후에, 트랜스펙션 복합체를 포함하는 반응 튜브에 완전 성장 배지 0.6 ml를 첨가하였다. 그런 다음, 플레이트를 천천히 흔들어 적절한 혼합이 되도록 하였고 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 트랜스펙션하고 40시간 및 64시간 후에, 사용한 배지를 웰로부터 제거하였고, 하기에서 기술한 바와 같이 ELISA에 의하여 TNFR-IgGFc 발현을 분석하였다.

96 웰 마이크로 티터 플레이트(Nunc Maxisorp)에서 필요한 개수의 웰을, PBS (pH 7.3)에서 2 ㎍/ml의 농도에서 Goat anti-Human IgGFc Fragment 항 체(Calbiochem, Cat no 401439) 100㎕/웰의 부피로 코팅하였다. 효과적인 코팅을 위하여, 습한 조건에서 플레이트를 4℃에서 밤새 배양하였다. 12-18시간 후에, 결합되지 않은 코팅 항체를 제거하였고, 블록킹 완충용액(blocking buffer)(1% BSA, 0.05% Tween 20, 1X PBS에서 제조된 5% 엷은 막이 덮힌 우유, pH-7.2)으로 웰을 블록킹하였으며, 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 블록킹하고 1 시간 후에, 플레이트를 PBST 완충용액(1X PBS, 0.1% BSA, 0.05% Tween 20)으로 세 번 수세하였다(매회 250 ㎕). 그런 다음, 100 ㎕ 시료(1% BSA를 포함하는 1X PBS에서 적절하게 희석시킨 알 수 없는 물질(unknown)과 표준액(standard))를 웰에 중복 첨가하였다. TNFR-IgGFc 표준액을 위해서는 25 mg/ml Enbrel 단백질을 포함하는 Enbrel(에타네르셉트) 다중 사용 바이알(multiple use vial)(Immunex Corporation, US에 의해 제조됨, Amgen and Wyeth Pharmaceuticals에 의해 판매됨)을 사용하였다. 검정 곡선을 만들기 위해 사용한 표준액의 농도는 1 ng/ml, 2 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml, 및 80 ng/ml이었다. 항원-항체 결합이 일어나도록 90 분 동안 배양한 후에, 플레이트를 PBST 완충용액으로 세 번 수세하였고(매회 250 ㎕), 1% BSA를 포함하는 1X PBS에서 1:20,000으로 희석한 검출 항체 Goat anti-Human IgGFc-HRP (Pierce, Cat No. 31416) 100 ㎕를 웰에 첨가하였고, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 세 번 수세하여, 결합되지 않은 항체-HRP 칸쥬게이트(conjugate)를 제거하였다. OPD[O-페닐렌디아민 (1,2-벤젠디아민) 디히드로클로라이드] 분말(Sigma Cat No P-1526) 8 mg을 포함하는 기질 용액 100 ㎕와 시트레이 트-포스페이트 완충용액(20 ml 증류수에 넣은 시트르산 122.8 mg과 무수 Na₂HPO₄ 188 mg 및 pH 4.8 내지 5.00으로 맞춤)에서 제조한 과산화수소 10 ㎕를 웰마다 첨가하였고, 30분 동안 암 조건에서 37℃에서 배양하였다. 웰마다 1N 황산 50 ㎕를 첨가하여 반응을 중지시켰다. ELISA 리더(ELISA reader)에서 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. Leveberg-Marquardt 방법의 방정식에 기초한 4 파라미터 맞춤 검정 곡선(4 Parameter fit standard curve)을 사용하는 SoftMax Pro (Molecular Devices) 소프트웨어에 의해, 알려지지 않은 시료를 위한 값을 도출하였다.

결과:

도 2는 상기 실험으로부터 도출된 대표적인 데이타를 나타낸다. 가장 높은 발현을 pZRC-TNFR-IgGFc (72.5±4.3 ng/ml)으로 얻었고, 이것은 pcDNA-TPL-TNFR-IgGFc-VA-DHFR (59.44±1.8 ng/ml)보다 21.97% 더 높았고, pcDNA-TPL-Intron-TNFR-IgGFc (53.05±2.2 ng/ml)보다 36.66% 더 높았고, pcDNA-TNFR-IgGFc (14.63±1.4 ng/ml)보다 395.55% 더 높았다. 5개 요소들의 상승 효과는, 가장 좋지 못한 트랜스펙션 효율을 보여주어야만 하는 가장 크기가 큰 플라스미드인 pZRC-TNFR-IgGFc가 여전히 가장 높은 발현을 제공하였다는 사실에 의해 추가로 뒷받침되고 있다. pZRC-TNFR-IgGFc 요소들의 신규 조합이 높은 발현을 제공하는 능력은 하기 그 밖의 실시예에 의하여 추가로 뒷받침된다.

실시예 3

EPO 발현 벡터의 작제

2개의 EPO 발현 벡터를 개발하였다. 신규 발현 벡터인 pZRC-EPO는 일시적 트랜스펙션 실험을 통하여 증가된 발현을 위해 이미 선택된 신규 발현 벡터인 pZRC-TNFR-IgGFc와 유사하고, 이것은 TNFR-IgGFc 대신에 EPO 유전자를 코딩한다. 두 번째 벡터는 DHFR을 위한 유전자를 전달하는, EPO를 코딩하는 상업적 발현 벡터 pcDNA3.1이다.

pcDNA - EPO - DHFR

인간 에리스로포이에틴 cDNA를 얻기 위하여, 인간 신장으로부터 유래된 전체 RNA(Clontech)를 RT-PCR을 위한 주형으로 사용하였다. 유전자 특이적 프라이밍[Maniatis et al., Molecular cloning; A Laboratory Manual (Cold Spring harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.), 1990]에 의하여 MMLV 역전사 효소(MBI Fermentas, USA)를 사용하여 전체 RNA로부터 이중 가닥 cDNA를 합성하였다. 그런 다음, 상기 신장 cDNA를 50 mM Tris-Cl (pH 8.3), 2.5 mM MgCl₂, 각각의 dNTP 200 μM 및 Pfu 폴리머라제 2.5 유닛을 포함하는 100 ㎕ 부피에서 유전자 특이적 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이머 100 피코몰을 사용하는 PCR 증폭을 35 사이클 거쳤다. 각각의 PCR 증폭 사이클은 94℃에서 30초(변성), 61℃에서 1분(어닐링), 및 72℃에서 1분(확장)동안 배양으로 구성되었다. PCR 반응의 증폭된 생성물을 1% 아가로스 겔에서 분리하였다. 약 590 염기쌍의 목적 단편을 겔에서 절개해 내었고, Qiagen Gel 추출 키트를 사용하여 정제하였다. EcoRI과 XbaI(MBI Fermentas, USA)을 가지고 벡터와 상기 정제된 PCR 생성물 모두를 제한효소 절단한 후, 상기 정제된 DNA 단편을 pcDNA 3.1의 MCS에 연결시켜, 방향성 클로닝(directional cloning)을 위한 점착성 말단(sticky end)을 생성하였다. 얻은 라이게이션 생성물을 대장균 DH5α에서 형질 전환시켰고, 형질 전환체를 앰피실린 내성에 기초하여 평가하였다. 약 20개의 콜로니로부터 분리한 플라스미드 DNA에 대해, 다양한 제한 효소를 사용하는 제한효소 절단에 의해서 EPO cDNA 실재를 분석하였다. 상기 플라스미드 하나를 자동화된 DNA 시퀀서(ABI)를 사용하여 서열 확인하였고, pcDNA 3.1 벡터에 EPO cDNA의 정확한 결합 및 서열을 갖는 것을 확인하였다. Hind III으로 완전한 절단에 의해 pDHFR 2.9로부터 분리된 DHFR minigene을 삽입하기 위하여, 상기 플라스미드 pcDNA-EPO를 사용하였다. 2.9 Kb DHFR minigene을 Klenow Polymerase (MBI Fermentas, USA)를 사용하여 블런트 말단(blunt end)으로 만들었고, pcDNA-EPO를 Mlu I (MBI Fermentas, USA)으로 선형화하고 Klenow Polymerase (MBI Fermentas, USA)를 사용하여 블런트 말단으로 만든 후에 pcDNA-EPO에 연결시켰다. 얻은 라이게이션 생성물을 대장균 DH5α에서 형질 전환시켰고, 형질 전환체를 앰피실린 내성에 기초하여 평가하였다. 그 결과 생성된 플라스미드에서 DHFR minigene의 실재와 배향을 위하여, 다양한 제한 효소를 사용하는 제한 효소 절단에 의하여 플라스미드 DNA, pcDNA-EPO-DHFR(도 3)을 분석하였다.

pcDNA - TPL - Intron - EPO - VA - DHFR ( pZRC - EPO )

pCDNA-EPO 작제물에서 CMV 프로모터의 하향 및 키메라 인트론의 상향에 아데노바이러스 TPL을 삽입하였고, EPO cDNA의 상향에 추가로 삽입하여, 상기 발현 벡터를 생성하였다. 또한, 상기 벡터에서 앰피실린 내성 유전자와 CMV 프로모터 사이에 VA RNA 유전자와 DHFR minigene을 삽입하였다. 이것은 먼저 EcoRI과 XbaI로 pcDNA-TPL-Intron-TNFR-IgGFc 벡터를 절단하여 TNFR-IgGFc 단편을 제거함으로써 수행되었다. 이렇게 생성된 6 kb 벡터 단편을 Qiagen Gel 추출 키트를 사용하여 정제하였고, EcoRI과 XbaI 말단(end)을 갖는 EPO 유전자와 연결시켰다. 얻은 라이게이션 생성물을 대장균 DH5α에서 형질 전환하였고, 형질 전환체를 앰피실린 내성에 기초하여 평가하였다. 그 결과 생성된 플라스미드에서 TPL, 키메라 인트론 및 EPO cDNA의 실재와 배향을 위하여, 다양한 제한 효소를 사용하는 제한효소 절단에 의하여 플라스미드 DNA를 분석하였다. 상기 플라스미드 하나를 자동화된 DNA 시퀀서(ABI)를 사용하여 서열 확인하였고, 상기 벡터에서 TPL, 키메라 인트론, 및 EPO 유전자의 정확한 결합을 갖는 것을 확인하였다. EcoRI과 Not I으로 이중 절단에 의하여 pCAV/NOT-TNFR으로부터 분리된 1000 bp VA RNA 유전자, 및 BamHI & SspI으로 완전한 절단에 의해 플라스미드 pDHFR 2.9로부터 분리된 DHFR minigene을 삽입하기 위하여, pInt-EPO-1로 명명되는 상기 플라스미드 DNA를 사용하였다. MunI & Bgl II으로 이미 절단된 pInt-EPO-1과 상기 2개의 단편을, 스리피스 라이게이션에서 연결시켰다. 얻은 라이게이션 생성물을 대장균 DH5α에서 형질 전환하였고, 형질 전환체를 앰피실린 내성에 기초하여 평가하였다. 그 결과 생성된 플라스미드에서 VA RNA 유전자와 DHFR minigene의 실재 및 배향을 위하여, 다양한 제한 효소를 사용하는 제한효소 절단에 의하여 플라스미드 DNA를 분석하였다. 추가로, DNA 시퀀싱에 의하여 결합을 체크하였고 확인하였다. 얻은 벡터 작제물을 pCDNA-TPL-Intron-EPO-VA-DHFR으로 명명하였고, 이것을 또한 pZRC-EPO으로 불렀다(도 3).

실시예 4

일시적 트랜스펙션에 의한, 다양한 EPO 발현 벡터의 발현 효율 비교

일시적 트랜스펙션을 위하여, 상기에서 기술한 바와 같이 Cos 1 세포를 길렀고 처리하였다. 모든 트랜스펙션 혼합물을 상기 실시예에서 기술한 바와 같이 만들었다. 또한, 트랜스펙션 절차를 상기 실시예에서 기술한 바에 따라 수행하였고, 트랜스펙션하고 40시간 및 60시간 후에, 사용한 배지를 세포로부터 제거하였고, 상기에서 기술한 바와 같이 EPO 발현 분석을 위해 ELISA하였다.

먼저, 96 웰 마이크로 티터 플레이트(Nunc Maxisorp)를 pH-9.6의 카보네이트 완충 용액에서 2 ㎍/ml의 농도로 재조합 인간 EPO에 대항하는 마우스 모노클로날 항체 50 ㎕/웰 부피(R&D Systems Anti-hEPO Purified Mouse Mab, Clone 9C21D11, Cat# MAB287)로 코팅하였다. 효과적인 코팅을 위하여, 상기 플레이트를 습한 조건에서 4℃에서 밤새 배양하였다. 12-18 시간 후에, 코팅 항체를 제거하였고, 상기에서 기술한 바와 같이 블록킹 완충용액으로 웰을 블록킹하였다. 블록킹하고 1 시간 후에, 플레이트를 PBST 완충용액으로 세 번 수세하였다(매회 250 ㎕). 그런 다음, 1% BSA를 포함하는 1X PBS에서 적절하게 희석시킨 50 ㎕ 시료를 중복으로 웰에 첨가하였다. EPO 표준액을 위해, Cilag AG Schaffhausen Switzerland에 의해 제조된 Eprex 4000 (재조합 인간 EPO 4000IU/0.4ml)을 사용하였다. 표준 곡선을 만들기 위해 사용한 표준액의 농도는 4 IU/ml, 2 IU/ml, 1 IU/ml, 0.4 IU/ml, 0.2 IU/ml, 및 0.1 IU/ml 이었다. 항원-항체 결합하도록 90분 배양한 후에, 플레이트를 PBST 완충용액으로 세 번 수세하였다(매회 250 ㎕). 1% BSA를 포함하는 1X PBS 에서 2 ㎍/ml의 농도에서 일차 항체(primary antibody)(rabbit anti-human EPO, 정제된 IgG, R&D Systems, Cat # AB-286-NA) 50 ㎕ 부피 첨가하였고, 1 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 1시간 배양한 후에, 플레이트를 PBST 완충용액으로 세 번 수세하였고(매회 250 ㎕), 1% BSA를 포함하는 pH-7.2의 1X PBS에서 1:8000으로 희석된 검출 항체/이차 항체(goat anti-rabbit IgG-HRP, Bangalore Genei, Cat # HPO020) 50 ㎕를 첨가하였고, 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 플레이트를 PBST 완충용액으로 세 번 수세하여(매회 250 ㎕), 결합되지 않은 칸쥬게이트를 제거하였다. 다음에 기질을 첨가하였다. 이를 위하여, 웰 마다 기질 용액(상기에서 기술한 바에 따라 제조함) 100 ㎕를 첨가하였고, 30분 동안 암 조건에서 37℃에서 배양하였다. 웰 마다 1N 황산 50 ㎕를 첨가하여 반응을 중지시켰다. ELISA 리더(ELISA reader)에서 λ 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. Leveberg-Marquardt 방법의 방정식에 기초한 4 파라미터 맞춤 검정 곡선(4 Parameter fit standard curve)을 사용하는 SoftMax Pro (Molecular Devices) 소프트웨어에 의해서, 알려지지 않은 시료를 위한 값을 도출하였다.

결과:

도 4는 상기 하나의 실험으로부터 도출한 대표적인 데이타를 나타낸다. 가장 높은 발현을 pZRC-EPO (276.53±3.09 ng/ml)로 얻었고, 이것은 pcDNA-EPO-DHFR (25.49±2.38 ng/ml) 보다 984.85% 더 높았다. 상기 데이타는 5개 요소의 신규 조합을 포함하는 신규 발현 벡터가 다양한 리포터 유전자를 위해 매우 증가된 발현을 제공하였다는 실시예 3의 결과를 뒷받침한다.

pZRC-EPO에서 요소들의 신규 조합의 뛰어난 능력은 하기 실시예 7에서 볼 수 있는 바와 같이 안정하게 트랜스펙션된 세포에서 확인되었다.

실시예 5

pZRC - EPO 로 CHO DHFR ^- 세포의 안정한 트랜스펙션

CHO DHFR^- 세포(디히드로폴레이트 환원효소의 유전자 코딩을 위한 chinese hamster ovary 세포 돌연변이체)를 완전 배지(complete emdium)(10% FBS (Hyclone), 및 하이포크산틴과 티미딘의 혼합물이 보충된 MEMα 배지(Sigma))에서 적절하게 유지하였다. 트랜스펙션 시점에, 미드 로그 상태에서 성장하는 세포를 T25 cm² 플라스크로부터 트립신 처리하였고, 5 ml 완전 배지로 1회 수세하였고, PBS에서 재현탁하였다. SspI 제한 효소로 선형화한 pZRC-Epo 15 마이크로그램을 1 X 10⁶개 세포에 첨가하였고, Stratagene Eectroporator 1000을 사용하여 전기 천공(electroporation)하였다(350 V). 완전 배지에서 48시간의 짧은 회수 기간 후에, 세포를 선택 배지(selection medium)(하이포크산틴과 티미딘의 혼합물의 첨가가 없고, 500 ㎍/ml G418 (Sigma)을 추가한, 10% 투석된 FBS 보충된 MEMα 배지)에서 유지함으로써 이중 선택을 거치도록 하였다. 세포를 5 % CO₂, 37℃ 배양기에 다시 넣었고, 2주 기간 동안 자라도록 하였다. 배지 교환을 3일마다 하였다. 안정한 트랜스펙턴트(transfectant)의 단편(patch)은 선택 과정을 거쳐 12일 후에 나타나기 시작하였다. 선택 15일째 되는 날에, 세포를 트립신으로 처리하였다. 안정 한 트랜스펙턴트의 혼합된 군(population)으로부터 단세포(single cell) 클론을 분리하기 위하여, 96 웰 플레이트에서 제한 희석 방법(limiting dilution technique)을 사용하여 세포를 희석하였다. 현미경 하에서 단세포를 포함하는 것으로 확인된 웰을 표시하였고, 이 단세포 클론에 정기적으로 배지 교환을 제공하였다. 약 12-14일 후에, 상기 웰은 70-80 % 합류 상태인(confluent) 것으로 확인되었다. 세포를 24 웰 플레이트로 옮겼고, 6 웰 플레이트로 옮기기 전에 48-72시간 동안 길렀다. 상기 단세포 클론을 선택 배지에서 웰 당 0.1 X 10⁶개 세포의 밀도로 6 웰 플레이트에 시딩(seeding)하였다. 48시간 후에, 사용한 배지를 웰로부터 제거하였고, 세포를 카운트하였다. 상기 사용한 배지를 상기에서 기술한 바와 같이 ELISA에 의해 EPO 발현을 분석하였다. 그 결과를 분비된 EPO 단백질 총량/10⁶ 세포/48시간으로 표시하였다.

높은 발현을 하는 클론 10개를 선택하였고, 이들을 선택 배지에 25 nM MTX를 첨가함으로써 개시하는 메토트렉세이트(MTX)-기초, 유전자 증폭 과정을 거치게 하였다. 신선한 배지를 후에 3일마다 보충하였다. 세포들이 적응할 때까지, 세포들이 약 20-25일 동안 MTX 하나의 농도에서 자라게 하였다. MTX 농도를 증가시키는 모든 단계 이후에, 이미 기술한 바와 같이 6 웰 플레이트 수준에서 세포들의 발현 수준을 분석하였다. 상기 선택된 10개 클론 중 하나는 25 nM MTX에서 생존하지 못하였다. 남아있는 모든 9개 클론에 대해서는, MTX 농도를 100 nM, 400 nM 및 최종적으로는 2 μM MTX로 연속적으로 증가시켰다. 도 5는 MTX 증폭의 다양한 단계 마 지막에 클론 군(clonal population)의 MTX 증폭으로부터 유래된 이종 군(heterogenous population)의 발현을 보여준다.

MTX에 의한 선택은 세포의 클론 군을 이종 군으로 변환시킨다. 따라서, 이러한 MTX-증폭된 이종 군으로부터 높은 발현을 하는 단세포 클론을 분리하기 위하여, 먼저 하나의 이종 군인 41H9를 400 nM MTX 단계에서 선택하였다. 상기에서 기술한 바와 같이 제한 희석에 의해서 클론 선택을 위해 이 세포들을 고정하였다. 약 14-16일 지난 후에, 96 웰 플레이트의 웰은 70-80% 합류 상태인 것으로 확인되었다. 세포들을 24 웰 플레이트로 옮겼고, 6 웰 플레이트로 옮기기 전에 48-72시간 동안 길렀다. 이러한 단세포 클론을 400 nM MTX을 포함하는 선택 배지에서 웰 당 0.1 X 10⁶개 세포의 밀도에서 6 웰 플레이트에 시딩하였다. 48시간 후에, 사용한 배지를 웰로부터 제거하였고, 세포를 카운트하였다. 사용한 배지를 상기에서 기술한 바와 같이 ELISA에 의해 발현 분석을 위해 취하였다. 그 결과를 분비된 EPO 단백질의 총량/10⁶ 세포/48시간으로 표시하였다. 표 1은 41H9 이종 군으로부터 최초에 유래되었던 이 단세포 클론의 발현을 보여준다. 높은 발현을 하는 클론을 불렸고, EPO의 상업적 생산을 위한 마스터 셀 뱅크(master cell banks)로서 동결시켰다.

표 1

클론	단백질 수득률 ㎍/백만개 세포/48시간
41H9.3G10	9.64
41H9.4G10	13.97
41H9.4H9	14.18
41H9.5G9	12.61
41H9.10H12	11.91
41H9.1E8	10.93
41H9.2F9	12.32
41H9.5E10	12.24
41H9.8C9	12.68
41H9.10B10	13.56
41H9.2G8	6.15
41H9.4F9	7.31
41H9.1C8	14.92
41H9.7H9	5.85

실시예 6

플라스크에서 안정한 발현 클론으로부터 EPO 의 생산

도 5에서 나타낸 것들로부터의 2개의 이종 세포군, 즉 56D12와 41H9(이들은 각각 100 nM MTX와 400 nM MTX에서 선택되었음)를 T75 플라스크 수준에서 단백질 생성을 위해 테스트하였다. 각각의 이종 군을 위해, 적절한 MTX의 농도와 함께, 하이포크산틴이 없고 티미딘이 없으며 10% 투석된 FBS(JRH Bioscience)와 600 ㎍/ml G418을 보충한 MEMα 배지에서 210만 개 세포로 T75 cm² 플라스크에 접종하였다. 플라스크를 37℃, 5% CO₂에서 72시간 동안 CO₂ 배양기에 다시 넣었다. 72시간 배양 후에, 세포 단일층은 약 80-85% 합류 상태인 것으로 확인되었다. 이 시점에서, 사용한 오래된 배지를 제거하였고, 세포 단일 층을 Dulbecco's PBS로 수세하였다. 수세된 단일 층에, 생산 배지(production medium)[10 mg/L rh-인슐린(rh-insulin), 2mM 글루타민, 아미노산 혼합물, 0.2 mM N-아세틸 시스틴, 0.25% 락트알부민, 2 mg/L FeSO₄, 25 mg/L 덱스트란 술페이트, 0.05% 플루오로닉산(pluoronic acid), 5 mg/L 하이드로코르티손, 및 1 mM Na-부티레이트 보충된 IMDM : Ham's F12 (1:1)] 15 ml를 첨가하였다. 세포를 CO₂ 배양기에서 33℃에서 4일 기간 동안 배양하였다. 4일 후에, 사용한 배지를 무균 상태로(aseptically) 제거하였고, ELISA에 의해 분석하였다. 표 2는 T75 플라스크 수준에서 생산 배지에서 두 클론의 발현을 보여준다.

표 2

이종 군의 명칭	4일 후 단백질 수득률 mg/l
56D12(100 nM MTX)	21 mg/l
41H9(400 nM MTX)	43 mg/l

실시예 7

롤러 바틀(roller bottle)에서 높은 수준의 EPO 생성

상기에서 기술한 대표적인 이종 군 중의 하나인 41H9를 2 μM MTX에 미리 적응시켰고 이를 롤러 바틀 연구에 사용하여, 더 큰 규모에서의 단백질 생성을 분석하였다. 41H9 세포를 T75 및 T175 배양 플라스크에서 불려, 롤러 바틀에 시딩하기 위한 충분한 개수의 세포를 얻었다.

2 μM MTX-보충되고 하이포크산틴 및 티미딘이 없고, 10% 투석된 FBS(JRH Biosciences)와 600 ㎍/ml G418을 포함하는 MEMα 배지(Sigma)에서, 5개의 롤러 바틀 각각에 3천만 개의 세포를 접종하였다. 배지에서 세포들을 혼합한 후에, 롤러 바틀을 세포 성장을 위해 37℃ 및 약 0.35 rpm 롤러 속도의 롤러 바틀 배양기에 다시 넣었다. 24시간 후에 세포가 관찰되었고, 이들은 잘 자라고 있는 것으로 나타났다. 세포 성장을 위해 롤러 바틀을 다시 배양기에 넣었고, 24시간 마다 현미경 으로 관찰하였다. 접종하고 96시간 후에, 세포 단일층은 약 80-85% 합류 상태가 되었다. 이 시점에서, 오래된 사용한 배지를 제거하였고, 생산 배지[10 mg/L rh-인슐린, 2 mM 글루타민, 아미노산 혼합물, 0.2 mM N-아세틸 시스틴, 0.25% 락트알부민, 2 mg/L FeSO₄, 25 mg/L 덱스트란 술페이트, 0.05% 플루오로닉산, 5 mg/L 하이드로코르티손, 및 1 mM Na-부티레이트가 보충된 IMDM : Ham's F12 (1:1)] 210 ml/바틀을 각각의 바틀에 첨가하였다. 롤러 바틀 배양기에서 7일 동안 세포를 배양하였다. 이 기간 후에, 사용한 배지를 롤러 바틀에서 무균 상태로 제거하였고, 상기에서 기술한 바와 같이 ELISA에 의해 분석하였으며, 표 3에 나타내었다.

표 3

이종 군의 명칭	7일 후 단백질 수득률 mg/l
41H9(2 μM MTX)	91 mg/l

개별적인(individual) 클론들이 아직 선택되지 않은, 이종의 안정하게 트랜스펙션되었으며 MTX-증폭된 군으로부터 생산성의 이러한 수준은 개별적인 안정한 클론을 위해 문헌에서 보고된 발현 수준보다 훨씬 더 좋은 발현 수준을 나타내었다. 예를 들면, SR α 프로모터, AMV RNA 4 리더 서열, DHFR 및 지오신(Zeocin) 내성을 포함하는 벡터를 사용하여 트랜스펙션과 20 nM MTX 이하의 유전자 증폭으로 생성된 안정한 클론은 45 IU/ml(0.346 ㎍/ml과 동등함)의 클론을 제공할 수 있었다[Jang H P et al, Biotechnol Appl. Biochem, 32:167-172, (2000)].

미국특허 제5,955,422호는 SV40 프로모터와 폴리 A 서열의 조절 하에 EPO 유전자의 게놈 카피를 포함하는 벡터와, DHFR을 포함하는 벡터로 코-트랜스펙션된(co-transfected) CHO DHFR-세포로부터 생성된 클론은 MTX 유전자 증폭 이후에 무 혈청 생산 배지에서 롤러 바틀에서 750 내지 1470 U / 백만 개 세포 / 48 시간(또는 375 내지 735 U/ 백만 개 세포 / 24 시간)의 수득률을 제공하였다고 보고하고 있다. 또 다른 특허 US5888774는 apoB SAR 요소와 네오마이신 내성을 갖는 EFl 프로모터에 의해 도래된 EPO cDNA를 포함하는 벡터로 트랜스펙션된 CHO-K1 세포로부터 생성된 EPO 클론은 EPO 1500 내지 1700 IU / 백만 개 세포/ 24 시간(3일 내지 4일의 배양으로 분석되었음)을 생성할 수 있었다고 보고하고 있다. 대조적으로, 2 μM MTX로 이미 적응시켜 놓은 본원 발명의 이종 군인 41H9의 7일간의 대표적인 배지 샘플은 ELISA로 평가하였을 때 롤러 바틀에서 11830 IU/ml을 포함하고 있는 것으로 확인되었다. 7일간 EPO 생성 속도인 롤러 바틀 당 10⁸ 내지 1.5 X 10⁸의 평가된 세포 밀도에 기초할 때, 210 ml 배지는 2366 내지 3549 IU/10⁶ 세포 / 24 시간이 되었고, 이것은 조절 요소들의 그 밖의 다양한 조합을 사용한 다른 보고된 벡터를 위해 상기에서 기술된 수준보다 유의성 있게 더 높았다.

유사하게는, Sung Kwan Yoon et al [Biotechnology and Bioengineering, 82(3):289-298, (2003)]은 5 μM MTX 이하의 선택 압력으로 유전자 증폭 공정에 의해 CHO DHFR-세포에서 개발된 세포주를 사용하는 EPO 생성을 위한 완전히 최적화된 공정은 33℃에서 약 200 시간의 배양 기간 이후에 약 50 ㎍/ml의 수득률을 제공하였다고 보고하고 있다. 비교적 낮은 MTX(2 μM)에 적응시킨 본원 발명의 pZRC-EPO 안정하게 트랜스펙션된 이종 군인 41H9는 ELISA에 의해 평가하였을 때 168시간 배양 후 11,830 IU/ml (91 ㎍/ml)를 생성할 수 있었다.

신규 발현 벡터인 pZRC-EPO를 가지고 EPO의 발현의 이러한 수준은 문헌에서 최적의 벡터를 위해 보고된 수준보다 81-100% 더 높았다. 이종 군인 41H9를 위해 상기에서 기술된 EPO 생성 방법은 실시예 5, 표 1에서 보고된 안정한 클론에 또한 적용될 수 있다.

본원 발명의 신규 벡터는 부다페스트 조약에 의해 IMTECH, Chandigarh, 인도 등록된 기탁 기간에 기탁되었다. 수탁 번호를 기다리고 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Cadila Healthcare Limited Singh, Arun K. Goel, Ashish Mendiratta, Sanjeev K. <120> EXPRESSION VECTOR AND METHODS OF PRODUCING HIGH LEVELS OF PROTEINS <130> ZRC-BT-005 <160> 5 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 288 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> This sequence was artificially generated as a hybrid of an adenovirus gene component and a mouse gene component <400> 1 ggaattaatt cgctgtctgc gagggccagc tgttggggtg agtactccct ctcaaaagcg 60 ggcatgactt ctgcgctaag attgtcagtt tccaaaaacg ggaggatttg atattcacct 120 ggcccgcggt gatgcctttg agggtggccg cgtccatctg gtcagaaaag acaatctttt 180 tgttgtcaag cttgaggtgt ggcaggcttg agatctggcc atacacttga gtgacaatga 240 catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag gtccaact 288 <210> 2 <211> 1470 <212> DNA <213> Human Placental RNA <400> 2 atggcgcccg tcgccgtctg ggccgcgctg gccgtcggac tggagctctg ggctgcggcg 60 cacgccttgc ccgcccaggt ggcatttaca ccctacgccc cggagcccgg gagcacatgc 120 cggctcagag aatactatga ccagacagct cagatgtgct gcagcaaatg ctcgccgggc 180 caacatgcaa aagtcttctg taccaagacc tcggacaccg tgtgtgactc ctgtgaggac 240 agcacataca cccagctctg gaactgggtt cccgagtgct tgagctgtgg ctcccgctgt 300 agctctgacc aggtggaaac tcaagcctgc actcgggaac agaaccgcat ctgcacctgc 360 aggcccggct ggtactgcgc gctgagcaag caggaggggt gccggctgtg cgcgccgctg 420 cgcaagtgcc gcccgggctt cggcgtggcc agaccaggaa ctgaaacatc agacgtggtg 480 tgcaagccct gtgccccggg gacgttctcc aacacgactt catccacgga tatttgcagg 540 ccccaccaga tctgtaacgt ggtggccatc cctgggaatg caagcatgga tgcagtctgc 600 acgtccacgt cccccacccg gagtatggcc ccaggggcag tacacttacc ccagccagtg 660 tccacacgat cccaacacac gcagccaact ccagaaccca gcactgctcc aagcacctcc 720 ttcctgctcc caatgggccc cagcccccca gctgaaggga gcactggcga cgagcccaaa 780 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 840 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 900 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 960 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1020 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1080 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1140 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1200 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1260 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1320 gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1380 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1440 aagagcctct ccctgtcccc gggtaaatga 1470 <210> 3 <211> 582 <212> DNA <213> Human Kidney RNA <400> 3 atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60 ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120 aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180 agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg 240 atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct 300 gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg 360 catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctggga 420 gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc 480 actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg 540 aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacagat ga 582 <210> 4 <211> 373 <212> DNA <213> Adenovirus <400> 4 cttccgcatc gctgtctgcg agggccagct gttggggtga gtactccctc tcaaaagcgg 60 gcatgacttc tgcgctaaga ttgtcagttt ccaaaaacga ggaggatttg atattcactg 120 gcccgcggtg atgcctttga gggtggccgc gtccatctgg tcagaaaaga caatcttttt 180 gttgtcaagc ttccttgatg atgtcatact tatcctgtcc cttttttttc cacagctcgc 240 ggttgaggac aaactcttcg cggtctttcc agtactcttg gatcggaaac ccgtcggcct 300 ccgaacggta ctccgccacc gagggacctg agcgagtccg catcgaccgg atcggaaaac 360 ctctcgaggt acc 373 <210> 5 <211> 417 <212> DNA <213> Adenovirus <400> 5 agcgggcact cttccgtggt ctggtggata aattcgcaag ggtatcatgg cggacgaccg 60 gggttcgaac cccggatccg gccgtccgcc gtgatccatg cggttaccgc ccgcgtgtcg 120 aacccaggtg tgcgacgtca gacaacgggg gagcgctcct tttggcttcc ttccaggcgc 180 ggcggctgct gcgctagctt ttttggccac tggccgcgcg cggcgtaagc ggttaggctg 240 gaaagcgaaa gcattaagtg gctcgctccc tgtagccgga gggttatttt ccaagggttg 300 agtcgcagga cccccggttc gagtctcggg ccggccggac tgcggcgaac gggggtttgc 360 ctccccgtca tgcaagaccc cgcttgcaaa ttcctccgga aacagggacg agcccct 417

Claims

하기를 포함하는, 발현 벡터를 사용하여 목적 단백질(protein of interest)의 발현을 증가시키는 방법:

(i) 적어도 하기 조절 요소를 포함하는 발현 벡터를 준비하는 단계:

a) CMV(Cytomegalovivus) 프로모터, 또는 그의 작용 변이체(functional variant),

b) 키메라 인트론(chimeric intron),

c) TPL(Tripartite Leader) 또는 그의 작용 변이체,

d) VA(Virus associated) 유전자 또는 그의 작용 변이체, 및

e) 소 성장 호르몬 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 서열 또는 그의 작용 변이체.

(ii) 상기 발현 벡터에 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 클로닝하는 단계,

(iii) 상기 발현 벡터로 포유동물 숙주 세포를 트랜스펙션시키는 단계, 및

(iv) 상기 포유동물 숙주 세포가 상기 목적 단백질을 발현하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 목적 단백질이 재조합 에리스로포이에틴인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 목적 단백질이 융합 단백질 TNFR-IgGFc 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 목적 단백질은 재조합 에리스로포이에틴, 융합 단백질 TNFR-IgGFc, 및 모노클로날 항체로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
삭제
적어도 하기 5개의 조절 요소를 포함하는 포유 동물 발현 벡터:

a) CMV 프로모터, 또는 그의 작용 변이체,

b) 키메라 인트론,

c) TPL 또는 그의 작용 변이체,

d) VA 유전자 또는 그의 작용 변이체, 및

e) 소 성장 호르몬 폴리아데닐레이션 서열 또는 그의 작용 변이체.
제6항에 있어서, 상기 키메라 인트론은 서열번호 1의 서열을 갖는 것인 벡터.
제6항에 있어서, 상기 TPL이 서열번호 4의 조절 요소인 것인 벡터.
제6항에 있어서, 상기 VA 유전자가 서열번호 5의 서열을 갖는 것인 벡터.
삭제
제6항에 있어서, 디히드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase), 아데노신 데아미나제(adenosine deaminase), 오르니틴 데카르복실라제(ornithine decarboxylase), 아스파라긴 신세타제(asparagine synthetase), 글루타민 신세타제(glutamine synthetase), 또는 그의 작용 변이체로부터 선택되는 선택 및 증폭 마커를 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것인 벡터.
제6항에 있어서, 에리스로포이에틴을 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것인 벡터.
제6항에 있어서, 융합 단백질 TNFR-IgGFc를 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것인 벡터.
제6항에 있어서, 리툭시마브, 트라스투주마브, 및 베바쿠주마브로부터 선택된 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것인 벡터.
제6항에 있어서, 하나 이상의 목적 유전자를 더 포함하는 것인 벡터.
삭제
제1항에 있어서, 상기 포유동물 숙주 세포는 Cos, CHO, CHO DHFR^-, BHK1, 및 NS0 세포주로부터 선택되는 것인 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 목적 단백질이 재조합 에리스로포이에틴, 재조합 융합 단백질 TNFR-IgGFc, 리툭시마브, 트라스투주마브, 및 베바쿠주마브로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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제1항에 있어서, 상기 목적 단백질의 발현을 증가시키기 위해, 상기 포유동물 숙주 세포는 메토트렉세이트(MTX)로 더 처리되는 것인 방법.