CN116323679A - 用于癌症治疗的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

提供了用于治疗癌症的组合物，该组合物包括与化疗药物联合使用的免疫偶联物。还提供用于治疗癌症的方法，该方法包括使用该组合物。

Description

用于癌症治疗的方法和组合物
背景技术
尽管可以检测到针对肿瘤抗原的免疫反应(Disis等人(1997)《临床肿瘤学杂志(J.Clin.Oncol.)》15:3363-3367)，但是造成疾病的恶性细胞往往不能引发导致排斥的免疫反应。研究表明，通过将免疫调节分子例如细胞因子和共刺激分子引入肿瘤细胞中来增强肿瘤细胞的免疫原性是有可能的；然而，根除残余癌细胞可能需要靶向无法引导基因转移的广泛分散的微转移肿瘤沉积物。另外，所引入的免疫调节分子的表达和稳定性往往远不能令人满意。免疫系统的细胞所产生的免疫调节剂例如细胞因子可以直接或间接激活适应性免疫反应的细胞，并且可以在引发保护性抗肿瘤免疫中发挥重要作用。先天免疫系统可以由导致促炎性细胞因子例如白细胞介素释放的细菌产物或“危险”信号触发。
多项研究表明，免疫调节剂可用于在动物模型和癌症患者中发挥抗肿瘤作用。然而，与应用免疫调节剂有关的短半衰期和全身毒性很大程度上限制了其使用。
除了免疫疗法，也已经使用了手术、化学疗法、激素疗法和放射疗法来治疗癌症(参见例如Stockdale,1998,《癌症患者管理原则(Principles of Cancer PatientManagement)》,在《科学美国人：医学(Scientific American:Medicine)》,第3卷,Rubenstein和Federman编,第12章,第IV章节)中。然而，由于患者健康状况或疾病晚期，手术可能是不可能的或不可接受的，并且常常在手术后无法完全去除患者的癌细胞。激素疗法很少作为单一药剂给予，并且尽管可能有效，但是常常在其它治疗去除大部分癌细胞之后用于预防或延缓癌症复发。此外，患者可能很快对化学疗法药剂产生耐药性。
因此，仍然十分期望用于癌症治疗的新颖且有效的疗法。
发明内容
本公开提供了用于治疗癌症的组合物和方法，所述组合物和方法包括联合使用免疫偶联物与化疗药物，本公开的发明在癌症治疗中显示了显著的协同作用。
在一个方面，本公开提供了包括免疫偶联物和化疗药物的组合物，其中：所述免疫偶联物包括1)一种或多种白细胞介素，和2)由第一Fc亚单元和第二Fc亚单元组成的Fc结构域，所述第一Fc亚单元与所述第二Fc亚单元缔合以形成二聚体；所述一种或多种白细胞介素与所述Fc结构域融合；并且其中所述化疗药物包括氟尿嘧啶和/或奥沙利铂(Oxaliplatin)。
在一些实施方案中，所述一种或多种白细胞介素中的至少一种与所述Fc结构域的氨基末端氨基酸融合。
在一些实施方案中，所述免疫偶联物包括两种或更多种白细胞介素。
在一些实施方案中，所述两种或更多种白细胞介素中的至少两种与所述Fc结构域的氨基末端氨基酸融合。
在一些实施方案中，所述白细胞介素中的一种或多种通过肽接头和/或免疫球蛋白铰链区与所述Fc结构域融合。
在一些实施方案中，所述两种或更多种白细胞介素中的至少两种通过肽接头彼此融合以形成白细胞介素二聚体。
在一些实施方案中，至少一种所述白细胞介素二聚体与所述Fc结构域的氨基末端氨基酸融合。举例来说，至少一种所述白细胞介素二聚体可以通过肽接头或免疫球蛋白铰链区与所述Fc结构域的氨基末端氨基酸融合。
在一些实施方案中，所述两种或更多种白细胞介素是同一白细胞介素的两个或更多个拷贝。
在一些实施方案中，所述两种或更多种白细胞介素是IL10的两个或更多个拷贝。
在一些实施方案中，所述一种或多种白细胞介素包括一种或多种IL10。
在一些实施方案中，所述免疫偶联物进一步包括与所述Fc结构域融合的靶向部分，其中所述靶向部分对肿瘤抗原展现出结合特异性。
在一些实施方案中，所述靶向部分与所述Fc结构域的氨基末端氨基酸融合。
在一些实施方案中，所述靶向部分通过肽接头或免疫球蛋白铰链区与所述Fc结构域融合。
在一些实施方案中，所述靶向部分包括抗体的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，所述抗体的抗原结合结构域是Fab部分。
在一些实施方案中，所述肿瘤抗原是EGFR。
在一些实施方案中，所述靶向部分包括抗EGFR抗体的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，所述抗EGFR抗体是西妥昔单抗(Cetuximab)。
在一些实施方案中，靶向部分包括西妥昔单抗的重链CDR1-3，HCDR1包括如SEQ IDNO:52所示的氨基酸序列，西妥昔单抗的HCDR2包括如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，并且HCDR3包括如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述靶向部分包括西妥昔单抗的轻链CDR1-3，LCDR1包括如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，LCDR2包括如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，并且LCDR3包括如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述靶向部分包括西妥昔单抗的重链可变区，并且所述重链可变区包括如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述靶向部分包括西妥昔单抗的轻链可变区，并且所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述Fc结构域是IgG Fc结构域。
在一些实施方案中，所述IgG是IgG1。
在一些实施方案中，所述IgG是人类IgG1。
在一些实施方案中，所述免疫偶联物是不对称的免疫偶联物，所述不对称的免疫偶联物包括第一成员和与所述第一成员不同的第二成员，其中所述第一成员包括所述第一Fc亚单元，并且所述第二成员包括与所述第二Fc亚单元融合的所述一种或多种白细胞介素，并且所述第一Fc亚单元与所述第二Fc亚单元缔合以形成所述Fc结构域的所述二聚体。
在一些实施方案中，在所述第二成员中，所述一种或多种白细胞介素中的至少一种与所述第二Fc亚单元的氨基末端氨基酸融合。
在一些实施方案中，在所述第二成员中，所述一种或多种白细胞介素中的至少两种彼此融合以形成白细胞介素二聚体，并且所述白细胞介素二聚体进一步与所述第二Fc亚单元的所述氨基末端氨基酸融合。
在一些实施方案中，所述第一成员进一步包括与所述第一Fc亚单元融合的所述靶向部分。
在一些实施方案中，在所述第一成员中，所述靶向部分与所述第一Fc亚单元的氨基末端氨基酸融合。
在一些实施方案中，所述第一Fc亚单元与所述第二Fc亚单元不同，并且所述Fc结构域包括促进所述第一Fc亚单元与所述第二Fc亚单元之间的异二聚体化的修饰。
在一些实施方案中，所述第一Fc亚单元包括第一修饰，并且所述第二Fc亚单元包括第二修饰。
在一些实施方案中，所述第一修饰包括在T366位置的氨基酸取代和在选自由以下组成的组的一个或多个位置的氨基酸取代：Y349、F405、K409、D399、K360、Q347、K392和S354，其中所述氨基酸的所述位置是根据KABAT编号的EU指数来确定的。
在一些实施方案中，所述第一修饰所包括的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：
Y349C、Y349D、D399S、F405K、K360E、K409A、K409E、Q347E、Q347R、S354D、K392D和T366W，其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
在一些实施方案中，所述第一修饰包括2-5个氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述第一修饰包括在选自以下组中的任一者的一组位置的氨基酸取代：1)Y349和T366；2)Y349、T366和F405；3)Y349、T366和K409；4)Y349、T366、F405、K360和Q347；5)Y349、T366、F405和Q347；6)Y349、T366、K409、K360和Q347；7)Y349、T366、K409和Q347；8)T366、K409和K392；9)T366和K409；10)T366、K409、Y349和S354；11)T366和F405；12)T366、F405和D399；和13)T366、F405、Y349和S354；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
在一些实施方案中，所述第一修饰包括选自以下组中的任一者的一组氨基酸取代：1)Y349C和T366W；2)Y349C、T366W和F405K；3)Y349C、T366W和K409E；4)Y349C、T366W和K409A；5)Y349C、T366W、F405K、K360E和Q347E；6)Y349C、T366W、F405K和Q347R；7)Y349C、T366W、K409A、K360E和Q347E；8)Y349C、T366W、K409A和Q347R；9)T366W、K409A和K392D；10)T366W和K409A；11)T366W、K409A和Y349D；12)T366W、K409A、Y349D和S354D；13)T366W和F405K；14)T366W、F405K和D399S；15)T366W、F405K和Y349D；和16)T366W、F405K、Y349D和S354D；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
在一些实施方案中，所述第二修饰包括在T366、L368和Y407位置的氨基酸取代以及在一个或多个选自由D356、D399、E357、F405、K360、K392、K409和Q347组成的组的位置的氨基酸取代，其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
在一些实施方案中，所述第二修饰所包括的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：
D356C、D399S、E357A、F405K、K360E、K392D、K409A、L368A、L368G、Q347E、Q347R、T366S、Y407A和Y407V，其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
在一些实施方案中，所述第二修饰包括4-6个氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述第二修饰包括在选自以下组中的任一者的一组位置的氨基酸取代：1)D356、T366、L368、Y407和F405；2)D356、T366、L368和Y407；3)D356、T366、L368、Y407和Q347；4)D356、T366、L368、Y407、K360和Q347；5)D356、T366、L368、Y407、F405和Q347；6)D356、T366、L368、Y407、F405、K360和Q347；7)T366、L368、Y407、D399和F405；8)T366、L368、Y407和F405；9)T366、L368、Y407、F405和E357；10)T366、L368、Y407和K409；11)T366、L368、Y407、K409和K392；和12)T366、L368、Y407、K409和E357；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
在一些实施方案中，所述第二修饰包括选自以下组中的任一者的一组氨基酸取代：1)D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；2)D356C、T366S、L368A和Y407V；3)D356C、T366S、L368A、Y407V和Q347R；4)D356C、T366S、L368A、Y407V、K360E和Q347E；5)D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K和Q347R；6)D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K、K360E和Q347E；7)T366S、L368A、Y407V、D399S和F405K；8)T366S、L368G、Y407A和F405K；9)T366S、L368A、Y407V、F405K和E357A；10)T366S、L368A、Y407V和K409A；11)T366S、L368A、Y407V、K409A和K392D；12)T366S、L368G、Y407A和K409A；13)T366S、L368A、Y407V、K409A和E357A；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
在一些实施方案中，所述第一Fc亚单元包括所述第一修饰，所述第二Fc亚单元包括所述第二修饰，并且所述第一修饰和所述第二修饰包括在选自所述以下组中的任一者的一组位置的氨基酸取代：1)所述第一修饰：Y349和T366；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407和F405；2)所述第一修饰：Y349、T366和F405；和所述第二修饰：D356、T366、L368和Y407；3)所述第一修饰：Y349、T366和K409；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407和F405；4)所述第一修饰：Y349、T366、F405、K360和Q347；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407和Q347；5)所述第一修饰：Y349、T366、F405和Q347；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407、K360和Q347；6)所述第一修饰：Y349、T366、K409、K360和Q347；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407、F405和Q347；7)所述第一修饰：Y349、T366、K409和Q347；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407、F405、K360和Q347；8)所述第一修饰：T366、K409和K392；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、D399和F405；9)所述第一修饰：T366和K409；和所述第二修饰：T366、L368、Y407和F405；10)所述第一修饰：T366、K409和Y349；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、F405和E357；11)所述第一修饰：T366、K409、Y349和S354；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、F405和E357；12)所述第一修饰：T366和F405；和所述第二修饰：T366、L368、Y407和K409；13)所述第一修饰：T366、F405和D399；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、K409和K392；14)所述第一修饰：T366、F405和Y349；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、K409和E357；15)所述第一修饰：T366、F405、Y349和S354；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、K409和E357；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
在一些实施方案中，所述第一Fc亚单元包括所述第一修饰，所述第二Fc亚单元包括所述第二修饰，其中所述第一修饰和所述第二修饰包括选自所述以下组中的任一者的一组氨基酸取代：1)所述第一修饰：Y349C和T366W；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；2)所述第一修饰：Y349C、T366W和F405K；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A和Y407V；3)所述第一修饰：Y349C、T366W和K409E；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；4)所述第一修饰：Y349C、T366W和K409A；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；5)所述第一修饰：Y349C、T366W、F405K、K360E和Q347E；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和Q347R；6)所述第一修饰：Y349C、T366W、F405K和Q347R；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V、K360E和Q347E；7)所述第一修饰：Y349C、T366W、K409A、K360E和Q347E；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K和Q347R；8)所述第一修饰：Y349C、T366W、K409A和Q347R；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K、K360E和Q347E；9)所述第一修饰：T366W、K409A和K392D；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、D399S和F405K；10)所述第一修饰：T366W和K409A；和所述第二修饰：T366S、L368G、Y407A和F405K；11)所述第一修饰：T366W、K409A和Y349D；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、F405K和E357A；12)所述第一修饰：T366W、K409A、Y349D和S354D；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、F405K和E357A；13)所述第一修饰：T366W和F405K；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V和K409A；14)所述第一修饰：T366W、F405K和D399S；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、K409A和K392D；15)所述第一修饰：T366W和F405K；和所述第二修饰：T366S、L368G、Y407A和K409A；16)所述第一修饰：T366W、F405K和Y349D；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、K409A和E357A；17)所述第一修饰：T366W、F405K、Y349D和S354D；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、K409A和E357A；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
在一些实施方案中，所述第一Fc亚单元包括所述第一修饰，所述第二Fc亚单元包括所述第二修饰，所述第一修饰包括所述氨基酸取代T366W和K409A，并且所述第二修饰包括所述氨基酸取代T366S、L368G、Y407A和F405K，其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
在一些实施方案中，其中所述第一成员不包括任何白细胞介素。
在一些实施方案中，所述第一Fc亚单元包括SEQ ID NO:17中的任一个中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第二Fc亚单元包括SEQ ID NO:18中的任一个中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述白细胞介素是人类白细胞介素。
在一些实施方案中，所述白细胞介素包括SEQ ID NO:56中的任一个中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述免疫偶联物包括第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链，所述第一多肽链包括如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，所述第二多肽链包括如SEQ IDNO:39所示的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包括如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一成员包括第一多肽链和第二多肽链，所述第二成员包括第三多肽链，所述第一多肽链包括如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，所述第二多肽链包括如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包括如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一成员包括第一多肽链，并且所述第二成员包括第二多肽链，所述第一多肽链包括SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列，并且所述第二多肽链包括SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述氟尿嘧啶包括5-Fu。
在一些实施方案中，所述化疗药物进一步包括亚叶酸。
在一些实施方案中，所述化疗药物包括四氢叶酸和/或甲酰四氢叶酸钙。
在一些实施方案中，所述化疗药物包括FOLFOX方案。
在一些实施方案中，所述氟尿嘧啶和所述奥沙利铂在所述组合物中彼此不混合。
在其它方面，本公开提供了与化疗药物联合用于治疗癌症的免疫偶联物，其中所述免疫偶联物如本公开中所定义，并且所述化疗药物如本公开中所定义。
在一些实施方案中，所述癌症选自胰腺癌和结直肠癌。
在一些实施方案中，所述胰腺癌是转移性胰腺癌。
在一些实施方案中，所述结直肠癌是转移性结直肠癌。
在一些实施方案中，所述癌症或其细胞具有增加的EGFR表达。
在其它方面，本公开提供了免疫偶联物与化疗药物联合用于制备用以治疗有需要的受试者的癌症的药剂的用途，其中所述免疫偶联物如本公开中所定义，并且所述化疗药物如本公开中所定义。
在一些实施方案中，所述癌症选自胰腺癌和结直肠癌。
在一些实施方案中，所述胰腺癌是转移性胰腺癌。
在一些实施方案中，所述结直肠癌是转移性结直肠癌。
在一些实施方案中，所述癌症或其细胞具有增加的EGFR表达。
在其它方面，本公开提供了用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用(a)有效量的如本公开中所定义的免疫偶联物和(b)有效量的如本公开中所定义的化疗药物。
在一些实施方案中，所述免疫偶联物是在施用所述化疗药物之后施用于所述受试者。
在一些实施方案中，所述免疫偶联物是在施用所述化疗药物之后不超过10天施用于所述受试者。
在一些实施方案中，所述免疫偶联物是在施用所述化疗药物之后不超过3天施用于所述受试者。
在一些实施方案中，向所述受试者施用所述免疫偶联物两次或更多次。
在一些实施方案中，所述癌症选自胰腺癌、黑色素瘤和结直肠癌。
在一些实施方案中，所述胰腺癌是转移性胰腺癌。
在一些实施方案中，所述结直肠癌是转移性结直肠癌。
在一些实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。
在一些实施方案中，所述癌症或其细胞具有增加的EGFR表达。
本公开的额外方面和优点将变得对于本领域技术人员来说根据以下实施方式显而易见，其中仅显示和描述了本公开的说明性实施方案。正如将认识到的那样，本公开能够有其它且不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有所述修改都不脱离本公开。因此，附图和实施方式应被视为在本质上是说明性的，而不被视为是限制性的。
通过引用并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文中，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地指示为通过引用并入一样。
附图说明
本发明的新颖特点在所附权利要求书中被特定地阐述。通过参考以下实施方式以及附图(在本文中也称为“图(figure/FIG.)”)获得对本发明的特点和优点的更好理解，所述实施方式阐述了说明性实施方案，其中采用了本发明的原则，在所述附图中：
图1A-1E绘示了本公开的免疫偶联物的纯化结果，如SDS-PAGE分析和SEC-HPLC分析所示。
图2A-2D绘示了各种化学疗法与本公开的免疫偶联物联合使用的作用。
图3A-3C绘示了本公开的免疫偶联物的实施例。
图4A-4B绘示了Erb-(IL10)2、FOLFOX以及Erb-(IL10)2与FOLFOX的组合抑制了肿瘤生长。
图4C绘示了Erb-(IL10)2、FOLFOX以及Erb-(IL10)2与FOLFOX的组合延长了小鼠存活率。
图5A-5B绘示了Erb-(IL10)2、FOLFOX以及Erb-(IL10)2与FOLFOX的组合抑制了肿瘤生长。
具体实施方式
在描述本公开的实施方案之前，应理解所述实施方案仅以举例的方式提供，并且在实践本公开中可以采用本文所描述的本公开的实施方案的各种替代方案。对于本领域技术人员来说，在不脱离本公开的情况下，现在会出现许多变化、改变和取代。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语均具有与本公开本领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管在本公开的实践或测试中可以使用与本文所描述的方法和材料类似或同等的方法和材料，但是下文描述了合适的方法和材料。在有冲突的情况下，以专利说明书(包含定义)为准。另外，材料、方法和实施例仅为说明性的而不打算为限制性的。对于本领域技术人员来说，在不脱离本公开的情况下，现在会出现许多变化、改变和取代。
除非上下文另外清楚地规定，否则本文所使用的单数形式“一个(a/an)”和“所述(the)”一般包含复数个提及物。
本文所使用的术语“免疫偶联物”一般指通过使一种或多种抗体或其片段与一种或多种第二分子偶联而形成的蛋白质分子。第二分子可以相同或不同，并且可以包含例如效应蛋白。
本文所使用的术语“蛋白质”一般指属于、涉及、类似或为多肽或蛋白质的材料或分子。举例来说，本公开的免疫偶联物可以是异二聚体蛋白或包括两种或更多种多肽的异二聚体。
本文所使用的术语“异二聚体”一般指由两个不同的成员构成的分子(例如蛋白质分子)。异二聚体的两个成员可能在结构、功能、活性和/或组成上有所不同。举例来说，所述两个不同的成员可以包括多肽，所述多肽在形成这些多肽的氨基酸残基的顺序、数量或种类上有所不同。异二聚体的两个不同的成员中的每一个都可以独立地包括一个、两个或更多个单元、多肽链或部分。
本文所使用的术语“靶向部分”一般指特异性、选择性或优先结合到靶分子、细胞、颗粒、组织或聚集体的分子、复合物或聚集体。举例来说，靶向部分可以是抗体、抗原结合抗体片段、双特异性抗体或其它基于抗体的分子或化合物。靶向部分的其它实施例可以包含但不限于适配体、高亲合性多聚体(avimer)、受体结合配体、核酸、生物素-抗生物素蛋白结合对、结合肽或蛋白质等。术语“靶向部分”和“结合部分”在本文中可互换使用。
本文所使用的术语“肿瘤抗原”一般指在肿瘤细胞中产生或由肿瘤细胞产生的抗原物质，所述抗原物质能够触发宿主的免疫反应。举例来说，肿瘤抗原可以是构成肿瘤细胞的一部分并且能够诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的蛋白质、多肽、肽或其片段。肿瘤抗原肽可以是由于肿瘤抗原在肿瘤细胞中降解而产生并且在通过与HLA分子结合而在细胞表面上表达时可以诱导或激活肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的肽。在一些实施方案中，术语“肿瘤抗原”也可以指在癌细胞上排他地或优先或有差异地表达且/或被发现与癌细胞有关并因此提供偏好癌症或对癌症具有特异性的标靶的生物分子(例如蛋白质、碳水化合物、糖蛋白等)。举例来说，优先表达可以是相较于生物体内任何其它细胞来说的优先表达或生物体的特定区域内(例如，特定器官或组织内)的优先表达。
本文所使用的术语“异二聚体化”一般指在两个不同的成员(例如，两个非相同的多肽)之间形成异二聚体，例如通过复合、缔合或聚集，在两个不同的成员之间形成或不形成共价键的过程。
本文所使用的术语“共价键”一般指在原子之间通过共享电子而形成的化学键。举例来说，共价键可以是极性的或非极性的。在一些实施方案中，共价键是二硫键。
本文所使用的术语“非共价配对亲和力”一般指二聚合序列或异二聚体化序列能够通过非共价相互作用，例如通过离子对、氢键、偶极子-偶极子相互作用、电荷转移相互作用、π-π相互作用、阳离子-π-电子相互作用、范德瓦尔(van der Waals)相互作用和分散相互作用、疏水性(亲脂性)相互作用、复合物形成(例如，过渡金属阳离子的复合物形成)或这些相互作用的组合而彼此结合。
本文所使用的术语“接头”一般指使两个多肽序列连接或相连，例如使两个多肽结构域相连的合成氨基酸序列。接头可以通过肽键使两个氨基酸序列连接。在一些实施方案中，本公开的接头在线性序列中使生物活性部分与第二部分连接。
术语“多肽、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换用于指任何长度的氨基酸的聚合物。所述聚合物可以是线性的或支链的，其可以包括经修饰的氨基酸，并且其可以被非-氨基酸中断。所述术语还涵盖经修饰，例如通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作例如与标记组分偶联而经修饰的氨基酸聚合物。所述术语可以适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，也可以适用于天然存在的氨基酸聚合物。所述术语还可以包含连接构成多肽的氨基酸的传统肽键的变体。举例来说，“肽”、“多肽”和“蛋白质”可以是氨基酸链，其α碳通过肽键而相连。因此，链的一端(氨基末端)处的末端氨基酸可以有一个游离氨基，而链的另一端(羧基末端)处的末端氨基酸可以有一个游离羧基。本文所使用的术语“氨基末端”(缩写为N末端)一般指肽的氨基末端处的氨基酸上的游离α-氨基，或肽内任何其它位置处的氨基酸的α-氨基(参与肽键时的氨基)。类似地，术语“羧基末端”一般指肽的羧基末端上的游离羧基或肽内任何其它位置处的氨基酸的羧基。肽也可以包含基本上任何聚氨基酸，包含但不限于肽模拟物，例如由醚而不是酰胺键连接的氨基酸。
本文所使用的术语“氨基酸”一般指天然和/或非天然或合成氨基酸，包含但不限于D或L光学异构体或两者，氨基酸类似物和肽模拟物。使用标准单字母或三字母代码来指定氨基酸。
术语“变体”当用于蛋白质分子(例如多肽或蛋白质)的情形下时一般指与天然生物活性蛋白具有序列同源性的蛋白质分子，其至少保留了所述生物活性蛋白的治疗活性和/或生物活性的一部分。举例来说，与参考生物活性蛋白相比，变异蛋白可以共享至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，“变体”可以包含经故意地修饰，例如通过位点定向诱变、编码基因合成、插入或通过突变意外地修饰的蛋白质。
术语“偶联”、“相连”、“融合(fused)”和“融合(fusion)”在本文中可互换使用，并且一般指例如通过包含化学偶联或重组手段的手段使两个或更多个化学元件、序列或组分连接在一起。举例来说，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么其与所述序列可操作地相连。一般来说，“可操作地相连”意味着所相连的DNA序列是相接的，并且在阅读相中或在框内。“框内融合”是指以维持原始开放阅读框(ORF)的正确阅读框的方式使两个或更多个ORF连接以形成相接的较长的ORF。因此，所产生的“融合多肽”是含有对应于原始ORF所编码的多肽的两个或更多个片段(所述区段在自然界中通常不会如此连接)的单一蛋白质。“融合位点”是指两个或更多个片段连接在一起的序列。在一些情况下，融合位点可以是与所连接的两个或更多个片段中的序列相同的序列。在一些情况下，融合位点可以进一步包含与所连接的两个或更多个片段中的序列中的任一个不相同的空隙区段。
在多肽的情形下，“线性序列”或“序列”是指多肽中在氨基末端到羧基末端方向上的一系列氨基酸，在序列中彼此相邻的残基在多肽的一级结构中是相接的。“部分序列”是形成多肽的一部分的线性序列，已知其在一个或两个方向上包括额外的残基。
术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用，并且其一般指任何长度的核苷酸的聚合形式，是脱氧核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实施例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析定义的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，可以在聚合物装配之前或之后对核苷酸结构赋予修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸在聚合后可以例如通过与标记组分偶联而进行进一步修饰。
术语“基因”和“基因片段”在本文中可互换使用，并且一般指在转录和转译后能够编码特定蛋白质的含有至少一个开放阅读框的多核苷酸。基因或基因片段可以是基因组的或cDNA，只要多核苷酸含有至少一个可以覆盖整个编码区或其区段的开放阅读框。“融合基因”是由相连在一起的至少两个异源多核苷酸构成的基因。
本文所使用的术语“抗体”一般指包括一个或多个大体上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽的蛋白质。免疫球蛋白基因可以包含κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及麦利亚德(myriad)免疫球蛋白可变区基因。本文所使用的轻链可以分为κ或λ。重链可以分为γ、μ、α、δ或ε，其又分别定义了免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。本公开中使用的抗体可以具有包括四聚体的结构单元。每个四聚体可以由两对相同的多肽链构成，每对具有一条“轻”链(约25KD)和一条“重”链(约50-70KD)。每条链的N末端可以定义主要负责抗原识别的约100到110个或更多个氨基酸的可变区。本文所使用的术语“轻链可变区”(VL)和“重链可变区”(VH)一般分别指这些具有轻链和重链的区域。抗体可以以完整免疫球蛋白形式存在，或以通过各种肽酶消化产生或从新表达的许多良好表征的片段形式存在。因此，举例来说，胃蛋白酶可以消化铰链区中的二硫键下方的抗体以产生F(ab)'2(Fab的二聚体，其本身是通过二硫键连接到VH-CH1的轻链)。F(ab)'2可以在温和的条件下被还原以使铰链区中的二硫键断裂，从而将(Fab')2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体基本上是具有铰链区的一部分的Fab(参见《免疫学基本原理(Fundamental Immunology)》,W.E.Paul编,Raven Press,N.Y.(1993)获取其它抗体片段的更详细的描述)。虽然各种抗体片段是关于完整抗体的消化来定义的，但是本领域普通技术人员应了解，所述Fab'片段可以以化学方式或通过利用重组DNA方法重新合成。因此，本文所使用的术语抗体也可以包含通过修饰整个抗体产生或使用重组DNA方法重新合成的抗体片段，包含但不限于Fab'2、IgG、IgM、IgA、IgE、scFv、dAb、纳米抗体、单功能抗体和双功能抗体。在一些实施方案中，抗体包含但不限于Fab'2、IgG、IgM、IgA、IgE和单链抗体例如单链Fv(scFv)抗体，其中可变重链和可变轻链连接在一起(直接或通过肽接头)以形成连续多肽。
本文所使用的术语“抗原结合位点”或“结合部分”一般指抗体中参与抗原结合的部分。抗原结合位点可以由重(“H”)链和/或轻(“L”)链的N末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区内的三个高度不同的区段被称为“高变区”，其被插入称为“框架区”或“FR”的更保守的侧接区段之间。因此，本文所使用的术语“FR”一般指天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间并与其相邻的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中彼此相对安置以形成抗原结合“表面”。这个表面可以介导对靶抗原的识别和结合。每条重链和轻链的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”，并且其例如由Kabat等人《具有免疫学意义的蛋白质的序列(Sequences of proteins ofimmunological interest)》,第4版，美国卫生和人类服务部，公共卫生局(U.S.Dept.Health and Human Services,Public Health Services),Bethesda,Md.(1987)表征。
本文所使用的术语“同源性”、“同源”或“序列同一性”一般指两个或更多个多核苷酸序列之间或两个或更多个多肽序列之间的序列类似性或互换性。当使用程序(例如Emboss Needle或BestFit)来测定两个不同的氨基酸序列之间的序列同一性、类似性或同源性时，可以使用默认设置，或可以选择适当的评分矩阵例如blosum45或blosum80以优化同一性、类似性或同源性分数。在一些实施方案中，同源多核苷酸是在严格条件下杂合并且与那些序列相比具有至少60％、至少65％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％序列同一性的多核苷酸。当对相当长度的序列进行最优比对时，同源多肽具有至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少98％序列同一性，或具有至少99％序列同一性。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现预期应用，包含但不限于疾病治疗的组合物的量。治疗有效量可以取决于本领域普通技术人员可以容易地确定的预期应用(例如体外或体内)、或所治疗的受试者和疾病状况例如受试者的体重和年龄、疾病状况的严重性、施用方式等而变化。所述术语也可以适用于在靶细胞中诱导特定反应例如靶基因诱导、增殖和/或细胞凋亡的剂量。具体剂量将取决于所选择的特定化合物、要遵循的给药方案、其是否与其它化合物联合施用、施用时间、施用其的组织以及运载其的物理递送系统而变化。
术语“治疗(treatment/treating)”或“缓解”或“改善”在本文中可互换使用，并且是指获得有益或期望结果(包含但不限于治疗益处和/或预防益处)的方法。本文所使用的治疗益处一般指根除所治疗的基础病症或降低其严重性。此外，在与基础病症相关的一种或多种生理症状根除、严重性降低或发生率减少的情况下实现治疗益处以使得在受试者中观察到改善，尽管受试者可能仍然受到基础病症的折磨。为了获得预防益处，可以将所述组合物施用于处于罹患特定疾病的风险下的受试者，或施用于报告了一种疾病的一种或多种生理症状的受试者，即使可能尚未对这种疾病做出诊断。
本文所使用的术语“治疗效果”一般涵盖上述治疗益处和/或预防益处。预防效果包含延缓疾病或病况的出现或消除所述疾病或病况、延缓疾病或病况的症状的发作或消除所述疾病或病况的症状、减缓、阻止或逆转疾病或病况的发展、或其任何组合。
本文所使用的术语“共同施用”、“联合施用”、“联合使用”和其语法同等物一般涵盖将两种或更多种药剂或疗法施用于受试者以使得两种药剂和/或其代谢物或两种疗法都存在于受试者体内和/或在受试者体内起作用。共同施用包含以独立的组合物或形式同时施用、以独立的组合物或形式在不同时间点施用或以其中存在两种药剂的组合物施用。
本文所使用的术语“药剂”一般指生物、药物或化学化合物或其它部分。非限制性实施例包含简单或复杂的有机或无机分子、肽、蛋白质、寡核苷酸、抗体、抗体衍生物、抗体片段、维生素衍生物、碳水化合物、毒素、化疗化合物或能够产生/发射放射线的药剂。
本文所使用的术语“白细胞介素”一般指能够促进T淋巴细胞和/或B淋巴细胞和/或造血细胞的发育和分化的分泌蛋白或信号传导分子。白细胞介素可以通过辅助CD4 T淋巴细胞以及通过单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞合成。本文所使用的白细胞介素(IL)可以包含IL10。本文所使用的术语“白细胞介素”可以包含全长白细胞介素或其片段(例如截短形式)或变体，其大体上维持对应的野生型白细胞介素的生物活性(例如，具有对应的野生型白细胞介素的生物活性的至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或甚至至少100％的生物活性)。本文所使用的白细胞介素可以来自任何哺乳动物物种。在一些实施方案中，白细胞介素来自选自由人类、马、牛、鼠、猪、兔、猫、狗、大鼠、山羊、绵羊和非人类灵长类动物组成的组的物种。在一些实施方案中，白细胞介素可以呈例如对其受体具有增加或减少的亲和力的突变形式。
本文所使用的术语“受试者”一般指人类或非人类动物，包含但不限于猫、狗、马、猪、母牛、羊、山羊、兔、鼠、大鼠或猴子。
本文所使用的术语“EGFR家族成员”一般指表皮生长因子受体家族的成员。举例来说，其可以是ErbB-1(也被命名为表皮生长因子受体(EGFR))。
本文所使用的术语“成员”一般指作为免疫偶联物的一种组分的多肽、亚单元或部分。
本文所使用的术语“Fc结构域”一般指抗体重链的Fc部分或Fc片段。举例来说，其可以指免疫球蛋白重链恒定区的羧基末端部分或其能够结合Fc受体的类似物或部分。众所周知，每个免疫球蛋白重链恒定区包括四个或五个结构域。所述结构域依序命名如下：CH1-铰链-CH2-CH3(-CH4)。CH4存在于不具有铰链区的IgM中。可用于本公开中的免疫球蛋白重链恒定区可以包括免疫球蛋白铰链区，并且也可以包含CH3结构域。举例来说，免疫球蛋白重链恒定区可以包括免疫球蛋白铰链区、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，本公开的Fc结构域由铰链-CH2-CH3结构域组成。
本文所使用的术语“Fc亚单元”一般指Fc结构域的组分。举例来说，Fc结构域可以由两个或更多个成员形成，并且每个成员可以被认为是一个Fc亚单元。
本文所使用的术语“与……复合”一般指分子(例如抗体)的一个成员/亚单元与另一个成员/亚单元缔合(例如结合)。举例来说，轻链可以与重链复合以形成靶向部分。
本文所使用的术语“结合特异性”一般指特异性结合既定标靶(例如，与其发生免疫反应)的能力(同时不结合或大体上不结合非标靶)。本公开的靶向部分可以是单特异性的并且含有一个或多个特异性结合标靶的结合位点，或可以是多特异性的(例如双特异性或三特异性)并且含有两个或更多个特异性结合相同或不同标靶的结合位点。
本文所使用的术语“与……缔合(associates with/associated with)”一般指一个实体与另一个实体物理缔合或接触。举例来说，免疫偶联物的第一成员可以与第二成员共价或非共价“缔合”。在一些实施方案中，免疫偶联物的第一成员通过界面与第二成员缔合，并且所述界面分别由第一成员和第二成员的氨基酸残基(即界面残基)形成。
本文所使用的术语“修饰”一般指对多肽骨架(例如氨基酸序列)的任何操作或对多肽的任何转译后修饰(例如糖基化)。举例来说，修饰与对应的野生型多肽的序列形成对比。修饰可以是一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)的取代、添加和/或缺失。
本文所使用的术语“融合蛋白”一般指包括多肽的氨基酸序列或者由多肽的氨基酸序列组成的多肽，所述多肽的所述氨基酸序列直接或间接(例如通过接头)与异源多肽(即与前一个多肽或其结构域无关的多肽)的氨基酸序列融合。
本文所使用的术语“C末端”一般指多肽的羧基末端。
本文所使用的术语“N末端”一般指多肽的氨基末端。
本文所使用的术语“免疫球蛋白”一般指由一个或多个大体上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包含κ、λ、α、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因以及麦利亚德免疫球蛋白可变区基因。一种形式的免疫球蛋白构成了抗体的基本结构单元。这种形式是四聚体并且由两对相同的免疫球蛋白链组成，每对具有一条轻链和一条重链。在每对中，轻链和重链可变区共同负责与抗原的结合，而恒定区负责抗体效应功能。除了抗体之外，免疫球蛋白还可以以多种多样的其它形式，包含例如Fv、Fab、Fab′和(Fab′)2存在。
本文所使用的术语“框内融合”一般指以维持原始开放阅读框(ORF)的正确阅读框的方式使两个或更多个ORF连接以形成相接的较长的ORF。
本文所使用的术语“氨基酸取代”一般指多肽的特定位置处的一个氨基酸被另一个氨基酸替换。
本文所使用的术语“KABAT编号的EU指数”一般指根据Kabat等人(1971)《纽约科学院年鉴(Ann.NY Acad,Sci.)》190:382-391以及Kabat,E.A.等人(1991)《具有免疫学意义的蛋白质的序列》,第五版,美国卫生和人类服务部,NIH公开第91-3242号的对应于氨基酸序列的EU编号的指数。
术语“分离的多核苷酸”和“分离的核酸”在此处可互换使用，并且一般指任何长度的核苷酸的聚合形式，是脱氧核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物，从其天然环境中分离出，或人工合成的。
本文所使用的术语“药学上可接受的赋形剂”一般指与药物施用相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂等。
术语“免疫原性细胞死亡”和“免疫原性细胞凋亡”在本文中可互换使用，并且一般指通过激活例如树突状细胞(DC)和随后激活特异性T细胞反应来诱导有效的抗肿瘤免疫反应的一种形式的细胞死亡。免疫原性细胞死亡的特征可以在于分泌损伤相关分子模式(DAMP)。DAMP可以包含钙网蛋白(CRT)、热休克蛋白(HSP)、分泌型神经轴突生长因子(HMGB1)、ATP等。CRT通常在内质网(ER)的腔内，并且可以在诱导免疫原性细胞凋亡之后易位到垂死细胞的表面，在那里其充当用于专业吞噬细胞的“吃我”信号。HSP包括在应力条件下也可以易位到质膜的HSP70和HSP90。HMGB1被认为是晚期细胞凋亡标志物，并且其释放到细胞外空间似乎是肿瘤抗原向树突状细胞的最优释放和呈递所必需的。ATP在分泌时可以充当用于单核细胞的“找我”信号并诱导其被吸引到细胞凋亡位点。
本文所使用的术语“FOLFOX方案”一般指包含甲酰四氢叶酸钙(亚叶酸钙、亚叶酸、甲酰四氢叶酸)、氟尿嘧啶(5-FU)和奥沙利铂并且可以用于治疗晚期和转移性结直肠癌的化学疗法方案。FOLFOX方案的不同之处在于药剂剂量和施用排程，并且包含FOLFOX 4、FOLFOX 6、改良的FOLFOX 6(mFOLFOX 6)和FOLFOX 7。
本文所使用的术语“氟尿嘧啶”、“5-氟尿嘧啶”或“5-FU”一般指用作抗癌化学疗法药物的核苷嘧啶的抗代谢物氟嘧啶类似物。
本文所使用的术语“奥沙利铂”或“伊洛沙汀(Eloxatin)”一般指可用于各种类型的易感癌症和肿瘤的治疗性治疗中的抑制细胞生长的抗肿瘤药。
本文所使用的术语“亚叶酸”、“四氢叶酸”、“甲酰四氢叶酸”、“甲酰四氢叶酸钙(leucovorin calcium/calcium leucovorin)”一般指与其它化学疗法药物联合使用的化学保护药。
本文所使用的术语“增加的表达”一般指在一些条件下比在正常情况下更高的生产表达。举例来说，EGFR在转移性胰腺癌(例如，胰腺导管腺癌PDAC)和转移性结直肠癌细胞，包括野生型或正常细胞中具有增加的表达。
包括免疫偶联物和化疗药物的组合物
在一个方面，本公开提供包括免疫偶联物和化疗药物的组合物。所述免疫偶联物可以包括：1)一种或多种白细胞介素，和2)由第一Fc亚单元和第二Fc亚单元组成的Fc结构域，并且所述第一Fc亚单元与所述第二Fc亚单元缔合以形成二聚体。一种或多种白细胞介素可以与Fc结构域融合。化疗药物可以包括氟尿嘧啶和奥沙利铂。
对于本公开的免疫偶联物，一种或多种白细胞介素(例如IL10)中的至少一种可以与Fc结构域的氨基末端氨基酸融合(例如框内)。免疫偶联物可以包括两种或更多种白细胞介素。在一些实施方案中，两种或更多种白细胞介素中的至少两种与Fc结构域的氨基末端氨基酸融合。在一些实施方案中，所述白细胞介素中的一种或多种通过肽接头和/或免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合(例如框内)。在一些实施方案中，两种或更多种白细胞介素中的至少两种通过肽接头彼此融合(例如框内)以形成白细胞介素二聚体。至少一种所述白细胞介素二聚体可以与Fc结构域的氨基末端氨基酸融合。在一些实施方案中，两种或更多种白细胞介素是同一白细胞介素的两个或更多个拷贝。举例来说，两种或更多种白细胞介素是IL10的两个或更多个拷贝。因此，在一些实施方案中，两种IL10彼此框内融合(例如通过肽接头)以形成IL10二聚体，随后，IL10二聚体的羧基末端可以与Fc结构域的氨基末端氨基酸融合(例如框内，例如通过肽接头)。
接头可以是包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个氨基酸的肽。举例来说，接头可以包括1-10个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸)、1-15个氨基酸(例如，1-11、12、13、14、15个氨基酸)、1-20个氨基酸、1-30个氨基酸或更多个氨基酸。在一些实施方案中，接头包括如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。
免疫偶联物可以进一步包括与Fc结构域融合的靶向部分，其中所述靶向部分可以对肿瘤抗原展现出结合特异性。肿瘤抗原可以是在肿瘤环境中或在肿瘤细胞的表面上特异性表达或存在的任何免疫原性实体或其一部分。在一些实施方案中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：EGFR家族成员(例如EGFR)。
靶向部分可以与Fc结构域的氨基末端氨基酸融合。在一些实施方案中，靶向部分通过肽接头或免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合。
靶向部分可以包括抗体的抗原结合结构域，例如，所述抗体的抗原结合结构域可以是Fab部分、结构域抗体或ScFv部分。在一些实施方案中，所述抗体的抗原结合结构域是Fab部分。所述抗体可以选自由抗EGFR抗体组成的组。
在一些实施方案中，所述抗体是抗EGFR抗体。举例来说，抗EGFR抗体可以是西妥昔单抗。在一些实施方案中，靶向部分包括西妥昔单抗的重链CDR1-3、西妥昔单抗的轻链CDR1-3、西妥昔单抗的重链可变区、西妥昔单抗的轻链可变区和/或西妥昔单抗的轻链。举例来说，靶向部分可以是包括西妥昔单抗的重链可变区和轻链可变区两者的Fab部分。
举例来说，靶向部分可以包括重链CDR，所述重链CDR具有与对应的西妥昔单抗的重链CDR1-3中所包括的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。或者或另外，靶向部分可以包括轻链CDR，所述轻链CDR具有与对应的西妥昔单抗的轻链CDR1-3中所包括的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。举例来说，靶向部分可以包括重链可变区，所述重链可变区具有与对应的西妥昔单抗的重链可变区中所包括的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。举例来说，靶向部分可以包括轻链可变区，所述轻链可变区具有与对应的西妥昔单抗的轻链可变区中所包括的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。举例来说，靶向部分可以包括轻链，所述轻链具有与对应的西妥昔单抗的轻链中所包括的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
西妥昔单抗的重链CDR 1-3分别如SEQ ID NO:52(CDR1)、SEQ ID NO:53(CDR2)和SEQ ID NO:54(CDR3)所示。西妥昔单抗的轻链CDR 1-3分别如SEQ ID NO:48(CDR1)、SEQ IDNO:49(CDR2)和SEQ ID NO:50(CDR3)所示。西妥昔单抗的重链可变区如SEQ ID NO:55所示。西妥昔单抗的轻链可变区如SEQ ID NO:51所示。
对于本公开的免疫偶联物，Fc结构域可以是IgG Fc结构域。IgG可以选自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4组成的组。在一些实施方案中，IgG是人类IgG1，并且Fc结构域是人类IgG1Fc结构域(野生型或经修饰)。
在一些实施方案中，免疫偶联物是由两个相同的成员组成的蛋白质同二聚体。两个相同的成员中的每一个都可以包括与Fc结构域的亚单元融合(例如框内，例如通过肽接头)的一种或多种白细胞介素(例如IL10)。举例来说，一种或多种白细胞介素的羧基末端可以与Fc亚单元的氨基末端氨基酸融合。在一些实施方案中，一种白细胞介素(例如IL10)的羧基末端与所述两个Fc亚单元中的一个的氨基末端氨基酸框内融合以形成同二聚体的一个成员，并且两个相同的所述成员通过两个Fc亚单元之间的相互作用彼此缔合以形成同二聚体(例如，图3A中所绘示)。在一些实施方案中，两种白细胞介素(例如，两种IL10)彼此框内融合(例如，通过肽接头)以形成白细胞介素二聚体，并且然后，所述白细胞介素二聚体的羧基末端与所述两个Fc亚单元中的一个的氨基末端氨基酸框内融合以形成同二聚体的一个成员，并且两个相同的所述成员通过两个Fc亚单元之间的相互作用彼此缔合以形成同二聚体。
在一些实施方案中，免疫偶联物是蛋白质异二聚体，所述蛋白质异二聚体包括第一成员和与所述第一成员不同的第二成员，其中所述第一成员包括第一Fc亚单元，并且所述第二成员包括与第二Fc亚单元融合的一种或多种白细胞介素，并且所述第一Fc亚单元与所述第二Fc亚单元缔合以形成所述异二聚体。
在一些实施方案中，在所述第二成员中，所述一种或多种白细胞介素中的至少一种与所述第二Fc亚单元的氨基末端氨基酸融合。
在一些实施方案中，在所述第二成员中，所述一种或多种白细胞介素中的至少两种彼此融合以形成白细胞介素二聚体，并且所述白细胞介素二聚体进一步与所述第二Fc亚单元的所述氨基末端氨基酸融合。举例来说，两种IL10可以彼此框内融合(例如，通过肽接头，以形成IL10二聚体)，并且然后与第二Fc亚单元框内融合以形成蛋白质异二聚体的第二成员。举例来说，IL10二聚体的羧基末端可以与第二Fc亚单元的氨基末端氨基酸融合(例如，图3B和3C中所绘示)。
举例来说，免疫偶联物的第二成员可以是融合蛋白，其中第二Fc亚单元可以与白细胞介素框内融合。在一些实施方案中，(多种)白细胞介素的羧基末端直接或间接与第二Fc亚单元的氨基末端融合以形成融合蛋白。在一些实施方案中，第二Fc亚单元通过肽接头或免疫球蛋白铰链区与(多种)白细胞介素框内融合。
本公开的肽接头可以是例如通过肽键使两个多肽序列连接或相连的合成氨基酸序列。在一些实施方案中，接头是包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个氨基酸的肽。举例来说，接头可以包括1-10个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸)、1-15个氨基酸(例如，1-11、12、13、14、15个氨基酸)、1-20个氨基酸、1-30个氨基酸或更多个氨基酸。在一些实施方案中，接头包括SEQID NO:41所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头抗蛋白水解或大体上抗蛋白水解。铰链区可以包括SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一成员进一步包括与所述第一Fc亚单元融合的所述靶向部分。举例来说，所述靶向部分可以与第一Fc亚单元的氨基末端氨基酸融合。举例来说，所述第一成员可以包括抗体的Fab部分，其羧基末端(例如重链部分例如CH1结构域或铰链区的羧基末端)与第一Fc亚单元的氨基末端氨基酸融合(例如，图3C中所绘示)。
在一些实施方案中，蛋白质异二聚体不包括任何靶向部分。举例来说，第一成员可以仅包括第一Fc亚单元(例如，图3B中所绘示)。
在一些实施方案中，第一Fc亚单元与第二Fc亚单元相同(例如，野生型人类IgG1Fc结构域的亚单元)。
在一些实施方案中，第一Fc亚单元与第二Fc亚单元不同，并且Fc结构域包括促进第一Fc亚单元与第二Fc亚单元之间的异二聚体化的修饰。举例来说，第一Fc亚单元可以包括第一修饰，并且第二Fc亚单元可以包括第二修饰。举例来说，第一修饰可以在第一Fc亚单元的CH3结构域中，而第二修饰可以在第二Fc亚单元的CH3结构域中。举例来说，第一修饰和/或第二修饰分别与其对应的野生型Fc结构域的序列相当。
举例来说，第一修饰可以包括在T366位置的氨基酸取代和在选自由以下组成的组的一个或多个位置的氨基酸取代：Y349、F405、K409、D399、K360、Q347、K392和S354，其中所述氨基酸的所述位置是根据KABAT编号的EU指数来确定的。
在一些实施方案中，第一修饰包括在T366位置的氨基酸取代和在选自由以下组成的组的一个或多个位置的氨基酸取代：Y349、F405、K409、D399、K360、Q347、K392和S354，其中所述氨基酸的所述位置是根据KABAT编号的EU指数来确定的。
举例来说，第一修饰所包括的所述氨基酸取代可以选自由以下组成的组：Y349C、Y349D、D399S、F405K、K360E、K409A、K409E、Q347E、Q347R、S354D、K392D和T366W。
在一些实施方案中，所述第一修饰包括2-5个氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述第一修饰包括在选自以下组中的任一者的一组位置的氨基酸取代：1)Y349和T366；2)Y349、T366和F405；3)Y349、T366和K409；4)Y349、T366、F405、K360和Q347；5)Y349、T366、F405和Q347；6)Y349、T366、K409、K360和Q347；7)Y349、T366、K409和Q347；8)T366、K409和K392；9)T366和K409；10)T366、K409、Y349和S354；11)T366和F405；12)T366、F405和D399；和13)T366、F405、Y349和S354；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
在一些实施方案中，所述第一修饰包括选自以下组中的任一者的一组氨基酸取代：1)Y349C和T366W；2)Y349C、T366W和F405K；3)Y349C、T366W和K409E；4)Y349C、T366W和K409A；5)Y349C、T366W、F405K、K360E和Q347E；6)Y349C、T366W、F405K和Q347R；7)Y349C、T366W、K409A、K360E和Q347E；8)Y349C、T366W、K409A和Q347R；9)T366W、K409A和K392D；10)T366W和K409A；11)T366W、K409A和Y349D；12)T366W、K409A、Y349D和S354D；13)T366W和F405K；14)T366W、F405K和D399S；15)T366W、F405K和Y349D；和16)T366W、F405K、Y349D和S354D；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
在一些实施方案中，所述第二修饰包括在T366、L368和Y407位置的氨基酸取代以及在一个或多个选自由D356、D399、E357、F405、K360、K392、K409和Q347组成的组的位置的氨基酸取代，其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
在一些实施方案中，所述第二修饰所包括的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：D356C、D399S、E357A、F405K、K360E、K392D、K409A、L368A、L368G、Q347E、Q347R、T366S、Y407A和Y407V。
在一些实施方案中，所述第二修饰包括在4-6个位置的氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述第二修饰包括在选自以下组中的任一者的一组位置的氨基酸取代：1)D356、T366、L368、Y407和F405；2)D356、T366、L368和Y407；3)D356、T366、L368、Y407和Q347；4)D356、T366、L368、Y407、K360和Q347；5)D356、T366、L368、Y407、F405和Q347；6)D356、T366、L368、Y407、F405、K360和Q347；7)T366、L368、Y407、D399和F405；8)T366、L368、Y407和F405；9)T366、L368、Y407、F405和E357；10)T366、L368、Y407和K409；11)T366、L368、Y407、K409和K392；和12)T366、L368、Y407、K409和E357；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
在一些实施方案中，所述第二修饰包括选自以下组中的任一者的一组氨基酸取代：1)D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；2)D356C、T366S、L368A和Y407V；3)D356C、T366S、L368A、Y407V和Q347R；4)D356C、T366S、L368A、Y407V、K360E和Q347E；5)D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K和Q347R；6)D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K、K360E和Q347E；7)T366S、L368A、Y407V、D399S和F405K；8)T366S、L368G、Y407A和F405K；9)T366S、L368A、Y407V、F405K和E357A；10)T366S、L368A、Y407V和K409A；11)T366S、L368A、Y407V、K409A和K392D；12)T366S、L368G、Y407A和K409A；13)T366S、L368A、Y407V、K409A和E357A；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
在一些实施方案中，所述第一Fc亚单元包括所述第一修饰，所述第二Fc亚单元包括所述第二修饰，并且所述第一修饰和所述第二修饰包括在选自以下组中的任一者的一组位置的氨基酸取代：1)所述第一修饰：Y349和T366；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407和F405；2)所述第一修饰：Y349、T366和F405；和所述第二修饰：D356、T366、L368和Y407；3)所述第一修饰：Y349、T366和K409；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407和F405；4)所述第一修饰：Y349、T366、F405、K360和Q347；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407和Q347；5)所述第一修饰：Y349、T366、F405和Q347；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407、K360和Q347；6)所述第一修饰：Y349、T366、K409、K360和Q347；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407、F405和Q347；7)所述第一修饰：Y349、T366、K409和Q347；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407、F405、K360和Q347；8)所述第一修饰：T366、K409和K392；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、D399和F405；9)所述第一修饰：T366和K409；和所述第二修饰：T366、L368、Y407和F405；10)所述第一修饰：T366、K409和Y349；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、F405和E357；11)所述第一修饰：T366、K409、Y349和S354；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、F405和E357；12)所述第一修饰：T366和F405；和所述第二修饰：T366、L368、Y407和K409；13)所述第一修饰：T366、F405和D399；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、K409和K392；14)所述第一修饰：T366、F405和Y349；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、K409和E357；15)所述第一修饰：T366、F405、Y349和S354；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、K409和E357；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
在一些实施方案中，所述第一Fc亚单元包括所述第一修饰，所述第二Fc亚单元包括所述第二修饰，其中所述第一修饰和所述第二修饰包括选自以下组中的任一者的一组氨基酸取代：1)所述第一修饰：Y349C和T366W；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；2)所述第一修饰：Y349C、T366W和F405K；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A和Y407V；3)所述第一修饰：Y349C、T366W和K409E；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；4)所述第一修饰：Y349C、T366W和K409A；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；5)所述第一修饰：Y349C、T366W、F405K、K360E和Q347E；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和Q347R；6)所述第一修饰：Y349C、T366W、F405K和Q347R；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V、K360E和Q347E；7)所述第一修饰：Y349C、T366W、K409A、K360E和Q347E；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K和Q347R；8)所述第一修饰：Y349C、T366W、K409A和Q347R；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K、K360E和Q347E；9)所述第一修饰：T366W、K409A和K392D；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、D399S和F405K；10)所述第一修饰：T366W和K409A；和所述第二修饰：T366S、L368G、Y407A和F405K；11)所述第一修饰：T366W、K409A和Y349D；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、F405K和E357A；12)所述第一修饰：T366W、K409A、Y349D和S354D；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、F405K和E357A；13)所述第一修饰：T366W和F405K；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V和K409A；14)所述第一修饰：T366W、F405K和D399S；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、K409A和K392D；15)所述第一修饰：T366W和F405K；和所述第二修饰：T366S、L368G、Y407A和K409A；16)所述第一修饰：T366W、F405K和Y349D；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、K409A和E357A；17)所述第一修饰：T366W、F405K、Y349D和S354D；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、K409A和E357A；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
在一些实施方案中，所述第一Fc亚单元包括所述第一修饰，所述第二Fc亚单元包括所述第二修饰，所述第一修饰包括所述氨基酸取代T366W和K409A，并且所述第二修饰包括所述氨基酸取代T366S、L368G、Y407A和F405K，其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
举例来说，所述第一Fc亚单元的氨基酸序列可以选自SEQ ID NO:17。白细胞介素的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:56所示。所述第二Fc亚单元的氨基酸序列可以选自SEQ IDNO:18。
在一些实施方案中，本公开的免疫偶联物是蛋白质异二聚体，并且第二成员的氨基酸序列可以选自SEQ ID NO:42。
在一些实施方案中，免疫偶联物可以包括第一成员和第二成员。第一成员可以包括第一多肽链和第二多肽链。第二成员可以包括第三多肽链。第一多肽链可以包括西妥昔单抗的轻链可变区。第二多肽链可以包括西妥昔单抗的第一Fc亚单元和重链可变区。第三多肽链可以包括第二Fc亚单元和一种或多种白细胞介素。目标部分可以包括西妥昔单抗的重链可变区和西妥昔单抗的轻链可变区。
在一些实施方案中，免疫偶联物可以包括第一成员，所述第一成员包括第一多肽链，并且所述第二成员包括第二多肽链，所述第一多肽链可以包括SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，并且所述第二多肽链可以包括SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
所述组合物的不同组分可以独立包装(例如，在施用前彼此不混合)或预先混合并包装在同一包装单元中。
本公开的组合物可以是药物组合物并可以进一步包括药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂的实施例包含但不限于惰性固体稀释剂和填充剂、稀释剂、无菌水溶液和各种有机溶剂、渗透增强剂、增溶剂和佐剂。
在一些实施方案中，药物组合物被配制用于口服施用、静脉内施用、肌肉内施用、在肿瘤部位的原位施用、吸入、经直肠施用、经阴道施用、透皮施用或通过皮下储存器的施用。
本公开的组合物可以包括治疗有效量的活性剂(例如，免疫偶联物和化疗药物)。治疗有效量是能够(至少部分)预防和/或治愈患有病况或病症(例如癌症)或具有罹患所述病况或病症的风险的受试者的所述病况或病症和/或其任何并发症的本发明组合物的量。所包括的活性剂的具体量/浓度可以根据施用方法和患者需要而变化，并可以基于例如患者的体积、粘度和/或体重等来确定。
用于治疗癌症的方法和用途
在另一方面，本公开提供了与化疗药物联合用于治疗癌症的免疫偶联物。所述免疫偶联物可以包括：1)一种或多种白细胞介素，和2)由第一Fc亚单元和第二Fc亚单元组成的Fc结构域，并且所述第一Fc亚单元与所述第二Fc亚单元缔合以形成二聚体。一种或多种白细胞介素可以与Fc结构域融合。
在另一方面，本公开提供了免疫偶联物与化疗药物联合用于制备用以治疗有需要的受试者的癌症的药剂的用途。所述免疫偶联物可以包括：1)一种或多种白细胞介素，和2)由第一Fc亚单元和第二Fc亚单元组成的Fc结构域，并且所述第一Fc亚单元与所述第二Fc亚单元缔合以形成二聚体。一种或多种白细胞介素可以与Fc结构域融合。
在另一方面，本公开提供了用于治疗有需要的受试者的癌症的方法。所述方法包括向所述受试者施用(a)有效量的本公开的其它部分中的免疫偶联物和(b)有效量的本公开的其它部分中的化疗药物。所述免疫偶联物可以包括：1)一种或多种白细胞介素，和2)由第一Fc亚单元和第二Fc亚单元组成的Fc结构域，并且所述第一Fc亚单元与所述第二Fc亚单元缔合以形成二聚体。一种或多种白细胞介素可以与Fc结构域融合。
免疫偶联物如本公开的其它部分中所定义。举例来说，免疫偶联物可以是包括于本公开的组合物中的免疫偶联物。
可以在施用化疗药物之后向受试者施用免疫偶联物。在一些实施方案中，向受试者施用超过一次剂量的化疗药物，并且在施用最后一次(或最终一次)剂量的化疗药物之后向受试者施用免疫偶联物。
举例来说，可以向受试者施用2-15次剂量(例如，2-14次剂量、2-13次剂量、2-12次剂量、2-11次剂量、2-10次剂量、2-9次剂量、2-8次剂量、3-10次剂量、4-10次剂量或4-12次剂量)的化疗药物，并且可以在施用最后一次(或最终一次)剂量的化疗药物之后向受试者施用免疫偶联物。
可以在施用化疗药物之后(例如，在施用最后一次剂量的化疗药物之后)不超过10天(例如，不超过9天、不超过8天、不超过7天、不超过6天、不超过5天、不超过4天、不超过3天、不超过2天、不超过1天或立即)向受试者施用免疫偶联物。在一些实施方案中，在施用化疗药物之后0-7天(例如，0-6天、0-5天、0-4天、0-3天、0-2天或0-1天)向受试者施用免疫偶联物。
可以向受试者施用免疫偶联物两次或更多次(例如，至少2次、至少3次、至少4次或更多次)。
癌症可以包括实体肿瘤。举例来说，癌症可以选自由结直肠癌、胰腺癌和黑色素瘤组成的组。
在一些实施方案中，癌症在受试者体内，例如，癌症或癌细胞在人体内或在非人类动物(例如，哺乳动物)体内。在一些实施方案中，哺乳动物是人类。在一些实施方案中，哺乳动物是小鼠、大鼠、猫、狗、兔、猪、绵羊、马、牛、山羊、沙鼠、仓鼠、豚鼠、猴子或任何其它哺乳动物。许多所述哺乳动物可以是本领域已知为某些疾病或病症，包含实体肿瘤和/或其它癌症的临床前模型的受试者(例如Talmadge等人,2007《美国病理学杂志(Am.J.Pathol.)》170:793；Kerbel,2003《癌症生物学与治疗(Canc.Biol.Therap.)》2(4增刊1):S134；Man等人,2007《癌症与转移评论(Canc.Met.Rev.)》26:737；Cespedes等人,2006《临床与转化肿瘤学(Clin.TransL Oncol.)》8:318)。
本公开还包含以下实施方案：
1.一种组合物，所述组合物包括免疫偶联物和化疗药物，其中：所述免疫偶联物包括1)一种或多种白细胞介素，和2)由第一Fc亚单元和第二Fc亚单元组成的Fc结构域，所述第一Fc亚单元与所述第二Fc亚单元缔合以形成二聚体；所述一种或多种白细胞介素与所述Fc结构域融合；并且其中所述化疗药物包括氟尿嘧啶和/或奥沙利铂。
2.根据实施方案1所述的组合物，其中所述一种或多种白细胞介素中的至少一种与所述Fc结构域的氨基末端氨基酸融合。
3.根据实施方案1至2中任一项所述的组合物，其中所述免疫偶联物包括两种或更多种白细胞介素。
4.根据实施方案3所述的组合物，其中所述两种或更多种白细胞介素中的至少两种与所述Fc结构域的氨基末端氨基酸融合。
5.根据实施方案1至4中任一项所述的组合物，其中所述白细胞介素中的一种或多种通过肽接头和/或免疫球蛋白铰链区与所述Fc结构域融合。
6.根据实施方案3至5中任一项所述的组合物，其中所述两种或更多种白细胞介素中的至少两种通过肽接头彼此融合以形成白细胞介素二聚体。
7.根据实施方案6所述的组合物，其中至少一种所述白细胞介素二聚体与所述Fc结构域的氨基末端氨基酸融合。
8.根据实施方案3至7中任一项所述的组合物，其中所述两种或更多种白细胞介素是同一白细胞介素的两个或更多个拷贝。
9.根据实施方案8所述的组合物，其中所述两种或更多种白细胞介素是IL10的两个或更多个拷贝。
10.根据实施方案1至9所述的组合物，其中所述一种或多种白细胞介素包括一种或多种IL10。
11.根据实施方案1至10中任一项所述的组合物，其中所述免疫偶联物进一步包括与所述Fc结构域融合的靶向部分，其中所述靶向部分对肿瘤抗原展现出结合特异性。
12.根据实施方案11所述的组合物，其中所述靶向部分与所述Fc结构域的氨基末端氨基酸融合。
13.根据实施方案11至12中任一项所述的组合物，其中所述靶向部分通过肽接头或免疫球蛋白铰链区与所述Fc结构域融合。
14.根据实施方案11至13中任一项所述的组合物，其中所述靶向部分包括抗体的抗原结合结构域。
15.根据实施方案14所述的组合物，其中所述抗体的抗原结合结构域是Fab部分。
16.根据实施方案11至15中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤抗原是EGFR。
17.根据实施方案11至16中任一项所述的组合物，其中所述靶向部分包括抗EGFR抗体的抗原结合结构域。
18.根据实施方案17所述的组合物，其中所述抗EGFR抗体是西妥昔单抗。
19.根据实施方案18所述的组合物，其中所述靶向部分包括西妥昔单抗的重链CDR1-3，HCDR1包括如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，HCDR2包括如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，并且HCDR3包括如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
20.根据实施方案18至19中任一项所述的组合物，其中所述靶向部分包括西妥昔单抗的轻链CDR1-3，LCDR1包括如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，LCDR2包括如SEQ IDNO:49所示的氨基酸序列，并且LCDR3包括如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
21.根据实施方案18至20中任一项所述的组合物，其中所述靶向部分包括西妥昔单抗的重链可变区，并且所述重链可变区包括如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
22.根据实施方案18至21中任一项所述的组合物，其中所述靶向部分包括西妥昔单抗的轻链可变区，并且所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列。
23.根据实施方案1至22中任一项所述的组合物，其中所述Fc结构域是IgG Fc结构域。
24.根据实施方案23所述的组合物，其中所述IgG是IgG1。
25.根据实施方案24所述的组合物，其中所述IgG是人类IgG1。
26.根据实施方案1至25中任一项所述的组合物，其中所述免疫偶联物是不对称的免疫偶联物，所述不对称的免疫偶联物包括第一成员和与所述第一成员不同的第二成员，其中所述第一成员包括所述第一Fc亚单元，并且所述第二成员包括与所述第二Fc亚单元融合的所述一种或多种白细胞介素，并且所述第一Fc亚单元与所述第二Fc亚单元缔合以形成所述Fc结构域的所述二聚体。
27.根据实施方案26所述的组合物，其中在所述第二成员中，所述一种或多种白细胞介素中的至少一种与所述第二Fc亚单元的氨基末端氨基酸融合。
28.根据实施方案26至27所述的组合物，其中在所述第二成员中，所述一种或多种白细胞介素中的至少两种彼此融合以形成白细胞介素二聚体，并且所述白细胞介素二聚体进一步与所述第二Fc亚单元的所述氨基末端氨基酸融合。
29.根据实施方案26至28中任一项所述的组合物，其中所述第一成员进一步包括与所述第一Fc亚单元融合的所述靶向部分。
30.根据实施方案29所述的组合物，其中在所述第一成员中，所述靶向部分与所述第一Fc亚单元的氨基末端氨基酸融合。
31.根据实施方案1至30中任一项所述的组合物，其中所述第一Fc亚单元与所述第二Fc亚单元不同，并且所述Fc结构域包括促进所述第一Fc亚单元与所述第二Fc亚单元之间的异二聚体化的修饰。
32.根据实施方案31所述的组合物，其中所述第一Fc亚单元包括第一修饰，并且所述第二Fc亚单元包括第二修饰。
33.根据实施方案32所述的组合物，其中所述第一修饰包括在T366位置的氨基酸取代和在选自由以下组成的组的一个或多个位置的氨基酸取代：Y349、F405、K409、D399、K360、Q347、K392和S354，其中所述氨基酸的所述位置是根据KABAT编号的EU指数来确定的。
34.根据实施方案33所述的组合物，其中所述第一修饰所包括的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：Y349C、Y349D、D399S、F405K、K360E、K409A、K409E、Q347E、Q347R、S354D、K392D和T366W，其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
35.根据实施方案32至34中任一项所述的组合物，其中所述第一修饰包括2-5个氨基酸取代。
36.根据实施方案32至35中任一项所述的组合物，其中所述第一修饰包括在选自以下组中的任一者的一组位置的氨基酸取代：1)Y349和T366；2)Y349、T366和F405；3)Y349、T366和K409；4)Y349、T366、F405、K360和Q347；5)Y349、T366、F405和Q347；6)Y349、T366、K409、K360和Q347；7)Y349、T366、K409和Q347；8)T366、K409和K392；9)T366和K409；10)T366、K409、Y349和S354；11)T366和F405；12)T366、F405和D399；和13)T366、F405、Y349和S354；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
37.根据实施方案32至36中任一项所述的组合物，其中所述第一修饰包括选自以下组中的任一者的一组氨基酸取代：1)Y349C和T366W；2)Y349C、T366W和F405K；3)Y349C、T366W和K409E；4)Y349C、T366W和K409A；5)Y349C、T366W、F405K、K360E和Q347E；6)Y349C、T366W、F405K和Q347R；7)Y349C、T366W、K409A、K360E和Q347E；8)Y349C、T366W、K409A和Q347R；9)T366W、K409A和K392D；10)T366W和K409A；11)T366W、K409A和Y349D；12)T366W、K409A、Y349D和S354D；13)T366W和F405K；14)T366W、F405K和D399S；15)T366W、F405K和Y349D；和16)T366W、F405K、Y349D和S354D；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
38.根据实施方案32至37中任一项所述的组合物，其中所述第二修饰包括在T366、L368和Y407位置的氨基酸取代以及在一个或多个选自由D356、D399、E357、F405、K360、K392、K409和Q347组成的组的位置的氨基酸取代，其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
39.根据实施方案39所述的组合物，其中所述第二修饰所包括的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：D356C、D399S、E357A、F405K、K360E、K392D、K409A、L368A、L368G、Q347E、Q347R、T366S、Y407A和Y407V，其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
40.根据实施方案32至39中任一项所述的组合物，其中所述第二修饰包括4-6个氨基酸取代。
41.根据实施方案32至40中任一项所述的组合物，其中所述第二修饰包括在选自以下组中的任一者的一组位置的氨基酸取代：1)D356、T366、L368、Y407和F405；2)D356、T366、L368和Y407；3)D356、T366、L368、Y407和Q347；4)D356、T366、L368、Y407、K360和Q347；5)D356、T366、L368、Y407、F405和Q347；6)D356、T366、L368、Y407、F405、K360和Q347；7)T366、L368、Y407、D399和F405；8)T366、L368、Y407和F405；9)T366、L368、Y407、F405和E357；10)T366、L368、Y407和K409；11)T366、L368、Y407、K409和K392；和12)T366、L368、Y407、K409和E357；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
42.根据实施方案32至41中任一项所述的组合物，其中所述第二修饰包括选自以下组中的任一者的一组氨基酸取代：1)D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；2)D356C、T366S、L368A和Y407V；3)D356C、T366S、L368A、Y407V和Q347R；4)D356C、T366S、L368A、Y407V、K360E和Q347E；5)D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K和Q347R；6)D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K、K360E和Q347E；7)T366S、L368A、Y407V、D399S和F405K；8)T366S、L368G、Y407A和F405K；9)T366S、L368A、Y407V、F405K和E357A；10)T366S、L368A、Y407V和K409A；11)T366S、L368A、Y407V、K409A和K392D；12)T366S、L368G、Y407A和K409A；13)T366S、L368A、Y407V、K409A和E357A；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
43.根据实施方案32至42中任一项所述的组合物，其中所述第一Fc亚单元包括所述第一修饰，所述第二Fc亚单元包括所述第二修饰，并且所述第一修饰和所述第二修饰包括在选自所述以下组中的任一者的一组位置的氨基酸取代：1)所述第一修饰：Y349和T366；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407和F405；2)所述第一修饰：Y349、T366和F405；和所述第二修饰：D356、T366、L368和Y407；3)所述第一修饰：Y349、T366和K409；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407和F405；4)所述第一修饰：Y349、T366、F405、K360和Q347；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407和Q347；5)所述第一修饰：Y349、T366、F405和Q347；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407、K360和Q347；6)所述第一修饰：Y349、T366、K409、K360和Q347；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407、F405和Q347；7)所述第一修饰：Y349、T366、K409和Q347；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407、F405、K360和Q347；8)所述第一修饰：T366、K409和K392；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、D399和F405；9)所述第一修饰：T366和K409；和所述第二修饰：T366、L368、Y407和F405；10)所述第一修饰：T366、K409和Y349；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、F405和E357；11)所述第一修饰：T366、K409、Y349和S354；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、F405和E357；12)所述第一修饰：T366和F405；和所述第二修饰：T366、L368、Y407和K409；13)所述第一修饰：T366、F405和D399；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、K409和K392；14)所述第一修饰：T366、F405和Y349；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、K409和E357；15)所述第一修饰：T366、F405、Y349和S354；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、K409和E357；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
44.根据实施方案32至43中任一项所述的组合物，其中所述第一Fc亚单元包括所述第一修饰，所述第二Fc亚单元包括所述第二修饰，其中所述第一修饰和所述第二修饰包括选自所述以下组中的任一者的一组氨基酸取代：1)所述第一修饰：Y349C和T366W；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；2)所述第一修饰：Y349C、T366W和F405K；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A和Y407V；3)所述第一修饰：Y349C、T366W和K409E；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；4)所述第一修饰：Y349C、T366W和K409A；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；5)所述第一修饰：Y349C、T366W、F405K、K360E和Q347E；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和Q347R；6)所述第一修饰：Y349C、T366W、F405K和Q347R；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V、K360E和Q347E；7)所述第一修饰：Y349C、T366W、K409A、K360E和Q347E；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K和Q347R；8)所述第一修饰：Y349C、T366W、K409A和Q347R；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K、K360E和Q347E；9)所述第一修饰：T366W、K409A和K392D；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、D399S和F405K；10)所述第一修饰：T366W和K409A；和所述第二修饰：T366S、L368G、Y407A和F405K；11)所述第一修饰：T366W、K409A和Y349D；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、F405K和E357A；12)所述第一修饰：T366W、K409A、Y349D和S354D；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、F405K和E357A；13)所述第一修饰：T366W和F405K；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V和K409A；14)所述第一修饰：T366W、F405K和D399S；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、K409A和K392D；15)所述第一修饰：T366W和F405K；和所述第二修饰：T366S、L368G、Y407A和K409A；16)所述第一修饰：T366W、F405K和Y349D；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、K409A和E357A；17)所述第一修饰：T366W、F405K、Y349D和S354D；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、K409A和E357A；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
45.根据实施方案44所述的组合物，其中所述第一Fc亚单元包括所述第一修饰，所述第二Fc亚单元包括所述第二修饰，所述第一修饰包括所述氨基酸取代T366W和K409A，并且所述第二修饰包括所述氨基酸取代T366S、L368G、Y407A和F405K，其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
46.根据实施方案26至45中任一项所述的组合物，其中所述第一成员不包括任何白细胞介素。
47.根据实施方案1至46中任一项所述的组合物，其中所述第一Fc亚单元包括如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
48.根据实施方案1至47中任一项所述的组合物，其中所述第二Fc亚单元包括如SEQ ID NO:18中的任一个所示的氨基酸序列。
49.根据实施方案1至48中任一项所述的组合物，其中所述白细胞介素是人类白细胞介素。
50.根据实施方案1至49中任一项所述的组合物，其中所述白细胞介素包括如SEQIDNO:56中的任一个所示的氨基酸序列。
51.根据实施方案1至50中任一项所述的组合物，其中所述免疫偶联物包括第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链，所述第一多肽链包括如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，所述第二多肽链包括如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包括如SEQID NO:42所示的氨基酸序列。
52.根据实施方案26至50中任一项所述的组合物，其中所述第一成员包括第一多肽链和第二多肽链，所述第二成员包括第三多肽链，所述第一多肽链包括如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，所述第二多肽链包括如SEQ ID NO:39的任一个中所示的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包括如SEQ ID NO:42的任一个中所示的氨基酸序列。
53.根据权利要求26至50中任一项所述的组合物，其中所述第一成员包括第一多肽链，并且所述第二成员包括第二多肽链，所述第一多肽链包括如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，并且所述第二多肽链包括如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
54.根据实施方案1至53中任一项所述的组合物，其中所述氟尿嘧啶包括5-Fu。
55.根据实施方案1至54中任一项所述的组合物，其中所述化疗药物进一步包括亚叶酸。
56.根据实施方案1至55中任一项所述的组合物，其中所述化疗药物包括四氢叶酸和/或甲酰四氢叶酸钙。
57.根据实施方案1至56中任一项所述的组合物，其中所述化疗药物包括FOLFOX方案。
58.根据实施方案1至57中任一项所述的组合物，其中所述氟尿嘧啶和所述奥沙利铂在所述组合物中彼此不混合。
59.一种免疫偶联物，所述免疫偶联物与化疗药物联合用于治疗癌症，其中所述免疫偶联物如实施方案1至57中任一项中所定义，并且所述化疗药物如实施方案1至58中任一项中所定义。
60.根据实施方案59所述的免疫偶联物，其中所述癌症选自胰腺癌和结直肠癌。
61.根据实施方案59所述的免疫偶联物，其中所述胰腺癌是转移性胰腺癌。
62.根据实施方案59所述的免疫偶联物，其中所述结直肠癌是转移性结直肠癌。
63.根据实施方案59至62中任一项所述的免疫偶联物，其中所述癌症或其细胞具有增加的EGFR表达。
64.一种免疫偶联物与化疗药物联合用于制备用以治疗有需要的受试者的癌症的药剂的用途，其中所述免疫偶联物如实施方案1至58中任一项中所定义，并且所述化疗药物如实施方案1至58中任一项中所定义。
65.根据实施方案64所述的用途，其中所述癌症选自胰腺癌和结直肠癌。
66.根据实施方案65所述的用途，其中所述胰腺癌是转移性胰腺癌。
67.根据实施方案65所述的用途，其中所述结直肠癌是转移性结直肠癌。
68.根据实施方案64至67中任一项所述的用途，其中所述癌症或其细胞具有增加的EGFR表达。
69.一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用(a)有效量的根据实施方案1至58中任一项所述的免疫偶联物和(b)有效量的根据实施方案1至57中任一项所述的化疗药物。
70.根据实施方案69所述的方法，其中所述免疫偶联物是在施用所述化疗药物之后施用于所述受试者。
71.根据实施方案70所述的方法，其中所述免疫偶联物是在施用所述化疗药物之后不超过10天施用于所述受试者。
72.根据实施方案70至71中任一项所述的方法，其中所述免疫偶联物是在施用所述化疗药物之后不超过3天施用于所述受试者。
73.根据实施方案69至72中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用所述免疫偶联物两次或更多次。
74.根据实施方案69至73中任一项所述的方法，其中所述癌症选自胰腺癌和结直肠癌。
75.根据实施方案74所述的方法，其中所述胰腺癌是转移性胰腺癌。
76.根据实施方案74所述的方法，其中所述结直肠癌是转移性结直肠癌。
77.根据实施方案69至76中任一项所述的方法，其中所述癌症或其细胞具有增加的EGFR表达。
虽然本发明的各种实施方案已经在本文中显示和描述，但对于本领域技术人员显而易见的是，所述实施方案仅以举例的方式提供。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的情况下，可能会出现许多变化、改变和取代。应该理解，可以采用本文所描述的本发明实施方案的各种替代方案。
实施例
示出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制造和使用本发明的完整揭露和描述，而不意欲限制本发明人视为其发明的范围，也不意欲表示以下实验是所有或唯一的所执行的实验。已经努力确保关于所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但应该考虑到一些实验误差和偏差。除非另有指示，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，并且压力是大气压或接近大气压。可以使用标准缩写，例如：bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；nt，核苷酸；i.m.，肌肉内；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下；等等。
实施例1修饰和制备核酸
1.1Fc修饰
在本公开中，对人类IgG1 Fc结构域的界面残基进行氨基酸修饰(例如，氨基酸取代)，得到以下几组修饰(如下表1中所示)，链A也被称为Fc9或第一Fc亚单元，而链B也被称为Fc6或第二Fc亚单元：
Figure BDA0004018487780000351
/>
Figure BDA0004018487780000361
表1.氨基酸修饰组
随后，使用ScFv-Fc/Fc系统检验了包括上表1中所列的修饰组的异二聚体蛋白的形成，下文将详细说明。
首先，从数据库Uniprot(P01857)获得人类免疫球蛋白γ1(IgG1)恒定区氨基酸序列，得到野生型人类IgG1-Fc区氨基酸序列(SEQ ID NO:30)。通过RT-PCR从人类PBMC总RNA获得编码野生型人类IgG1-Fc的多核苷酸片段(SEQ ID NO:31，命名为Fc基因片段)。通过重叠PCR将编码小鼠κIII信号肽的多核苷酸片段(SEQ ID NO:32)添加到Fc基因的5'端，并且然后亚克隆到载体pcDNA4(Invitrogen，目录V86220)，得到用于在哺乳动物细胞中表达人类IgG1-Fc的重组表达载体。
合成了编码ScFv-Fc融合蛋白的核酸分子(SEQ ID NO:33)，其中ScFv是指抗HER2单链抗体，ScFv-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示。然后，将ScFv-Fc基因片段亚克隆到载体pcDNA4(Invitrogen，目录V86220)，得到用于在哺乳动物细胞中表达ScFv-Fc融合蛋白的重组表达载体。
在一些情况下，使编码骆驼单结构域抗体可变区(VhH)的多肽与Fc基因片段的N末端融合，得到编码融合蛋白VhH-Fc(如SEQ ID NO:36所示)的融合基因片段(如SEQ ID NO:35所示)。然后，将其亚克隆到载体pcDNA4(Invitrogen，目录V86220)，得到用于在哺乳动物细胞中表达融合蛋白VhH-Fc的重组表达载体。
然后，通过重叠PCR将上表1中所列的氨基酸修饰分别引入ScFv-Fc(1-17组)、VhH-Fc(9-12、14、15和17组)和Fc基因片段(1-8组)中，其中A链是指ScFv-Fc中的Fc亚单元，而B链是指独立的Fc亚单元或VhH-Fc中的Fc亚单元。将具有氨基酸修饰的基因片段分别亚克隆到载体pcDNA4(Invitrogen，目录V86220)，得到用于在哺乳动物细胞中表达经修饰的ScFv-Fc融合蛋白、经修饰的Fc蛋白和经修饰的VhH-Fc融合蛋白的重组表达载体。
然后，用所构建的表达载体和PEI转染悬浮培养的HEK293细胞(ATCC CRL-1573TM)。对于每一组，以1:1的比例对表达A链(ScFv-Fc融合蛋白)的表达载体和表达B链(Fc蛋白或VhH-Fc融合蛋白)的表达载体进行共转染。培养5-6天后，收集瞬时表达产物的上清液，并且使用ProteinA亲和色谱法初步纯化包括对应的蛋白质异二聚体的表达产物。每种初步纯化的表达产物都包括同二聚体蛋白ScFv-Fc/ScFv-Fc、同二聚体蛋白Fc/Fc(或同二聚体蛋白VhH-Fc/VhH-Fc)和异二聚体蛋白ScFv-Fc/Fc(或异二聚体蛋白ScFv-Fc/VhH-Fc)，以上蛋白质分别以不同百分比存在。由于这些蛋白质(即，同二聚体和异二聚体)的分子量不同，因此它们对应的百分比可以根据非还原SDS-PAGE凝胶上反映的对应的条带强度来确定。对所述强度进行量化并且结果总结在下表2-5中。
群组 ScFv-Fc同二聚体(％) ScFv-Fc/Fc异二聚体(％) Fc同二聚体(％)
1 24 58 18
2 10 70 20
3 25 57 18
4 10 77 13
表2表达产物中的同二聚体蛋白和异二聚体蛋白的百分比
Figure BDA0004018487780000371
Figure BDA0004018487780000381
表3表达产物中的同二聚体蛋白和异二聚体蛋白的百分比
Figure BDA0004018487780000382
表4表达产物中的同二聚体蛋白和异二聚体蛋白的百分比
Figure BDA0004018487780000383
表5表达产物中的同二聚体蛋白和异二聚体蛋白的百分比
从上表2-5中可以看出，所有的修饰组都能非常有效地促进异二聚体形成。出于说明目的，群组10中的修饰(链A中的修饰：T366W+K409A；链B中的修饰：T366S+L368G+Y407A+F405K)在以下实施例中用于生成本公开的免疫偶联物或蛋白质混合物。
1.2制备抗EGFR(西妥昔单抗)
获得了西妥昔单抗(也被称为爱必妥(Erbitux)或Erb，是针对表皮生长因子受体EGFR的抗体)的重链和轻链的全长氨基酸序列，并使用在线工具DNAworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)获得了对应的编码这些氨基酸序列的DNA序列。然后，合成了编码西妥昔单抗的轻链(Erb-LC)的核酸分子。Erb-LC的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，而对应的编码其的多核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示。然后，将点突变(T366W和K409A)引入编码西妥昔单抗重链基因的Fc区的多核苷酸序列中，并且合成了编码经修饰的西妥昔单抗重链的核酸分子(在本文中称为erb-Fc9)，对应的编码其的多肽被命名为Erb-Fc9。Erb-Fc9的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，而编码其的多核苷酸序列如SEQ ID NO:40所示。
1.3制备(IL10)2-Fc6
首先，从美国国家生物技术信息中心(NCBI)获得人类白细胞介素10(IL10)(P22301)的序列信息，并获得编码其的全长多核苷酸序列。然后，获得符合蛋白质数据库Uniprot中人类免疫球蛋白γ1(IgG1)恒定区(P01857)的氨基酸序列的人类IgG1-Fc的氨基酸序列(即，P01857的残基104到残基330)。之后，将点突变(T366S、L368G、Y407A和F405K)引入IgG1-Fc片段中，并且由此获得的多肽被称为Fc6。然后，将接头序列“(GGGGS)3”(SEQ IDNO:41)和铰链区序列(SEQ ID NO:60)添加到Fc6的N端，得到接头-铰链-Fc6。然后，使用在线工具DNAworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码其的DNA序列。然后，将接头序列“(GGGGS)3”(SEQ ID NO:41)添加到IL10的两个拷贝之间，得到(IL10)2。然后，将编码(IL10)2的多核苷酸序列添加到编码接头-铰链-Fc6的多核苷酸序列的5'端，从而得到并合成编码融合蛋白(IL10)2-Fc6的多核苷酸序列。(IL10)2-Fc6的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示，而编码其的多核苷酸序列如SEQ ID NO:43所示。
1.4制备IL10-Fc
首先，从美国国家生物技术信息中心(NCBI)获得人类白细胞介素10(IL10)(P22301)的序列信息，并获得编码其的全长多核苷酸序列。然后，获得符合蛋白质数据库Uniprot中人类免疫球蛋白γ1(IgG1)恒定区(P01857)的氨基酸序列的人类IgG1-Fc的氨基酸序列(即，P01857的残基104到残基330)。然后，将接头序列“(GGGGS)3”(SEQ ID NO:41)和铰链区序列(SEQ ID NO:60)添加到IgG1-Fc的N端，得到接头-铰链-Fc。然后，使用在线工具DNAworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码其的DNA序列。将编码IL10的多核苷酸序列添加到编码接头-铰链-Fc的多核苷酸序列的5'端，从而得到并合成编码融合蛋白IL10-Fc的多核苷酸序列。IL10-Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示，而编码其的多核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示。
1.5制备Fc9
获得符合蛋白质数据库Uniprot中人类免疫球蛋白γ1(IgG1)恒定区(P01857)的氨基酸序列的人类IgG1-Fc的氨基酸序列(即，P01857的残基104到残基330)。之后，将点突变(T366W和K409A)引入IgG1Fc片段中，并且由此获得的多肽被称为Fc9。Fc9的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，而编码其的多核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示。
实施例2构建重组质粒
用HindIII和EcoRI(Takara)消化根据实施例1得到的核酸分子(编码Erb-Fc9、Fc9、Erb-LC(西妥昔单抗轻链)、(IL10)2-Fc6和IL10-Fc)，并且然后分别亚克隆到载体pcDNA4/myc-HisA(Invitrogen，V863-20)。通过测序对所获得的质粒进行验证，并且正确的重组质粒分别被命名为：pcDNA4-Erb-Fc9、pcDNA4-Fc9、pcDNA4-Erb-LC、pcDNA4-(IL10)2-Fc6和pcDNA4-IL10-Fc。
实施例3表达和纯化免疫偶联物
在转染之前两天，制备12×600mL悬浮培育的HEK293(ATCC，CRL-1573TM)细胞以进行瞬时转染，以0.8×106个细胞/毫升的密度接种细胞。两天后，将细胞悬浮液的三份等分试样离心，并且然后重新悬浮在600mL Freestyle293培养基中。
将从实施例2得到的重组表达载体分为以下几组：
群组1：pcDNA4-Erb-Fc9(200μg)+pcDNA4-Erb-LC(200μg)+pcDNA4-(IL10)2-Fc6(200μg)
群组2：pcDNA4-Fc9(200μg)+pcDNA4-(IL10)2-Fc6(200μg)
群组3：pcDNA4-IL10-Fc(200μg)
所有蛋白质都是在瞬时转染的293F细胞中制造的。简单地说，使FreeStyle 293F细胞(Invitrogen)在293F培养基(Invitrogen)中生长，用非线性化质粒DNA和293Fectin试剂(Invitrogen)转染，并在37℃、5％ CO2下以80-1002下以80-100mL/烧瓶的体积分批在摇瓶中生长6天。所有蛋白质都是通过一步protein A色谱法纯化的。每种蛋白质的质量都是通过SDS-PAGE和SEC-HPLC来确定的。类似地，本申请的其它免疫偶联物的表达和纯化结果得到了验证并用SDS-PAGE确认。
这样得到的免疫偶联物被命名为(从群组1到群组3，分别地)：Erb-(IL10)2、Fc9-(IL10)2和(IL10-Fc)2。
图1A-1E显示Erb-(IL10)2、(IL10-Fc)2和Fc9-(IL10)2的免疫偶联物得到成功表达和纯化。
在图1A中，泳道1装载Erb-(IL10)2(还原)；泳道2装载标志物；泳道3装载Erb-(IL10)2(非还原)。
在图1B中，泳道1装载(IL10-Fc)2(原始样品)；泳道2装载(IL10-Fc)2(流通)；泳道3装载(IL10-Fc)2(洗脱)；泳道4装载标志物；泳道5装载标准阳性对照BSA；泳道6装载空白缓冲液；泳道7是空白；以及泳道8装载(IL10-Fc)2(洗脱；非还原)。
在图1C中，泳道1装载Fc9-(IL10)2(原始样品)；泳道2装载Fc9-(IL10)2(流通)；泳道3装载Fc9-(IL10)2(洗脱)；泳道4装载标志物；泳道5装载标准阳性对照BSA；泳道6装载空白缓冲液；泳道7是空白；泳道8装载Fc9-(IL10)2(洗脱；非还原)。
图1D显示SEC-HPLC结果，可以看出(IL10-Fc)2的表达产物中非所期望的寡聚物百分比是约27％。
图1E显示SEC-HPLC结果，可以看出Fc9-(IL10)2的表达产物中非所期望的寡聚物百分比是约3.3％。
从这些结果可以看出，本公开的免疫偶联物已经成功生产。有趣的是，Fc9-(IL10)2的表达产物含有与(IL10-Fc)2的表达产物相比少得多的非所期望的寡聚物。
实施例4化学疗法与本公开的免疫偶联物联合使用的作用
4.1本公开的免疫偶联物与奥沙利铂联合使用的作用
雌性C57BL/6小鼠是从中国科学院实验动物中心(中国上海)获得，6至8周龄，并在特定的无病原体条件下饲养。所有动物的使用都符合当地伦理委员会的要求。本研究经《医学实验动物护理与使用指南(Guide for the Care and Use of Medical LaboratoryAnimals)》(中华人民共和国卫生部，1998)中的建议批准。表达人类EGFR和Kb结合肽抗原SIYRYYGL(SIY，SEQ ID NO:47)的B16-EGFR-SIY黑色素瘤细胞系是在内部产生的，并在补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100单位/毫升的青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基(Gibco Invitrogen)中生长。
将B16-EGFR-SIY黑色素瘤细胞(5×105)皮下(s.c)接种到小鼠胁腹并使其生长约10天。肿瘤体积记录为两个垂直直径(长和宽)并计算为V＝ab2/2，其中a和b分别是最长直径和最短直径。根据肿瘤大小将小鼠随机分配到各组。
将携带肿瘤的小鼠分为若干组，其中每组5只小鼠：同型对照组，其中用0.5mg/kg人类IgG1(10μg/小鼠)治疗小鼠；Erb-(IL10)2组，其中用0.5mg/kg(10μg/小鼠)Erb-(IL10)2治疗小鼠；奥沙利铂组，其中用15mg/kg(300μg/小鼠)奥沙利铂治疗小鼠；Erb-(IL10)2+奥沙利铂组，其中用0.5mg/kg Erb-(IL10)2和15mg/kg奥沙利铂治疗小鼠。使C57BL/6小鼠在第0天s.c.接种B16-EGFR-SIY细胞，在第7、10、14天分别i.p.注射Erb-(IL10)2；以及在第7天通过尾静脉注射奥沙利铂。
结果示于图2A中。由于奥沙利铂的毒性高，因此奥沙利铂组的所有小鼠在14天后都死亡(参看图2A)。可以看出，观察到Erb-(IL10)2与奥沙利铂的组合在抑制肿瘤生长方面有协同作用(参看图2A)。
图2D显示Erb-(IL10)2、奥沙利铂以及Erb-(IL10)2与奥沙利铂的组合对存活率的影响。
类似地，将携带肿瘤的小鼠分为若干组，其中每组5只小鼠：同型对照组，其中用0.5mg/kg人类IgG1(10μg/小鼠)治疗小鼠；Fc9-(IL10)2组，其中用0.5mg/kg(10μg/小鼠)Fc9-(IL10)2治疗小鼠；奥沙利铂组，其中用15mg/kg(300μg/小鼠)奥沙利铂治疗小鼠；Fc9-(IL10)2+奥沙利铂组，其中用0.5mg/kg Fc9-(IL10)2和15mg/kg(300μg/小鼠)奥沙利铂治疗小鼠。使C57BL/6小鼠在第0天s.c.接种B16-EGFR-SIY细胞，在第7、10、14天分别i.p.注射Fc9-(IL10)2；以及在第7天通过尾静脉注射奥沙利铂。
结果示于图2B中。由于奥沙利铂的毒性高，因此奥沙利铂组以及Fc9-(IL10)2和奥沙利铂组的所有小鼠在14天后都死亡(参看图2C)。因此，无法比较各组之间的协同作用。
图2C显示Fc9-(IL10)2、奥沙利铂以及Fc9-(IL10)2与奥沙利铂的组合对存活率的影响。
实施例5FOLFOX与本公开的免疫偶联物联合使用的作用
5.1在胰腺肿瘤模型中本公开的免疫偶联物与FOLFOX联合使用的作用
使C57BL/6小鼠在第0天s.c.接种胰腺肿瘤细胞，得到胰腺肿瘤模型。将携带肿瘤的小鼠分为若干组：同型对照组，其中用人类IgG1治疗小鼠；Erb-(IL10)2组，其中用Erb-(IL10)2治疗小鼠；FOLFOX组，其中用FOLFOX治疗小鼠；Erb-(IL10)2+FOLFOX组，其中用Erb-(IL10)2和FOLFOX治疗小鼠。i.p.注射Erb-(IL10)2并且通过尾静脉注射FOLFOX。
可以看出，观察到Erb-(IL10)2与FOLFOX的组合在抑制肿瘤生长方面有协同作用。这表明，Erb-(IL10)2与FOLFOX的组合在治疗转移性胰腺癌方面有协同作用。
5.2在结直肠肿瘤模型中本公开的免疫偶联物与FOLFOX联合使用的作用
使70只C57BL/6小鼠在第0天s.c.接种结直肠肿瘤MC38-EGFR-5细胞，得到结直肠肿瘤模型。将携带肿瘤的小鼠分为若干组：同型对照组，其中用人类IgG1治疗小鼠；Erb-(IL10)2组，其中用Erb-(IL10)2治疗小鼠；FOLFOX组，其中用FOLFOX治疗小鼠；Erb-(IL10)2+FOLFOX组，其中用Erb-(IL10)2和FOLFOX治疗小鼠。使C57BL/6小鼠在第0天s.c.接种MC38-EGFR-5细胞；以及在第7天i.v.注射奥沙利铂，8小时后注射Erb-(IL10)2。
在第8天i.p.注射甲酰四氢叶酸钙和5-FU。施用剂量、途径和排程列于表6中。
Figure BDA0004018487780000421
/>
Figure BDA0004018487780000431
表6施用排程
图4A和图4B显示Erb-(IL10)2和FOLFOX的组合可以抑制肿瘤生长。图4C显示Erb-(IL10)2和FOLFOX的组合可以延长存活率。
可以看出，观察到Erb-(IL10)2与FOLFOX的组合在抑制肿瘤生长方面有协同作用。这表明，Erb-(IL10)2与FOLFOX的组合在治疗转移性结直肠癌方面有协同作用。
实施例6氟尿嘧啶与本公开的免疫偶联物联合使用的作用
6.1在胰腺肿瘤模型中本公开的免疫偶联物与氟尿嘧啶联合使用的作用
使C57BL/6小鼠在第0天s.c.接种胰腺肿瘤细胞，得到胰腺肿瘤模型。将携带肿瘤的小鼠分为若干组：同型对照组，其中用人类IgG1治疗小鼠；Erb-(IL10)2组，其中用Erb-(IL10)2治疗小鼠；5-FU组，其中用5-FU治疗小鼠；Erb-(IL10)2+5-FU组，其中用Erb-(IL10)2和5-FU治疗小鼠。i.p.注射Erb-(IL10)2并且通过尾静脉注射5-FU。
可以看出，观察到Erb-(IL10)2与5-FU的组合在抑制肿瘤生长方面有协同作用。这表明，Erb-(IL10)2与氟尿嘧啶的组合在治疗转移性胰腺癌方面有协同作用。
6.2在结直肠肿瘤模型中本公开的免疫偶联物与氟尿嘧啶联合使用的作用
使C57BL/6小鼠在第0天s.c.接种结直肠肿瘤MC38-EGFR细胞，得到结直肠肿瘤模型。将携带肿瘤的小鼠分为若干组：同型对照组，其中用人类IgG1治疗小鼠；Erb-(IL10)2组，其中用Erb-(IL10)2治疗小鼠；5-FU组，其中用5-FU治疗小鼠；Erb-(IL10)2+5-FU组，其中用Erb-(IL10)2和5-FU治疗小鼠。i.p.注射Erb-(IL10)2并且通过尾静脉注射5-FU。
可以看出，观察到Erb-(IL10)2与5-FU的组合在抑制肿瘤生长方面有协同作用。这表明，Erb-(IL10)2与氟尿嘧啶的组合在治疗转移性结直肠癌方面有协同作用。
实施例7奥沙利铂与本公开的免疫偶联物联合使用的作用
7.1在胰腺肿瘤模型中本公开的免疫偶联物与奥沙利铂联合使用的作用
使C57BL/6小鼠在第0天s.c.接种胰腺肿瘤细胞，得到胰腺肿瘤模型。将携带肿瘤的小鼠分为若干组：同型对照组，其中用人类IgG1治疗小鼠；Erb-(IL10)2组，其中用Erb-(IL10)2治疗小鼠；奥沙利铂组，其中用奥沙利铂治疗小鼠；Erb-(IL10)2+奥沙利铂组，其中用Erb-(IL10)2和奥沙利铂治疗小鼠。i.p.注射Erb-(IL10)2并且通过尾静脉注射奥沙利铂。
可以看出，观察到Erb-(IL10)2与奥沙利铂的组合在抑制肿瘤生长方面有协同作用。这表明，Erb-(IL10)2与奥沙利铂的组合在治疗转移性胰腺癌方面有协同作用。
7.2在结直肠肿瘤模型中本公开的免疫偶联物与奥沙利铂联合使用的作用
使C57BL/6小鼠在第0天s.c.接种结直肠肿瘤MC38-EGFR细胞，得到结直肠肿瘤模型。将携带肿瘤的小鼠分为若干组：同型对照组，其中用人类IgG1治疗小鼠；Erb-(IL10)2组，其中用Erb-(IL10)2治疗小鼠；奥沙利铂组，其中用奥沙利铂治疗小鼠；Erb-(IL10)2+奥沙利铂组，其中用Erb-(IL10)2和奥沙利铂治疗小鼠。i.p.注射Erb-(IL10)2并且通过尾静脉注射奥沙利铂。
可以看出，观察到Erb-(IL10)2与奥沙利铂的组合在抑制肿瘤生长方面有协同作用。这表明，Erb-(IL10)2与奥沙利铂的组合在治疗转移性结直肠癌方面有协同作用。
实施例8在黑色素瘤模型中本公开的免疫偶联物与FOLFOX联合使用的作用
使60只C57BL/6小鼠在第0天s.c.接种黑色素瘤B16-EGFR-5细胞(5×105个细胞/小鼠)，得到黑色素瘤模型。将携带肿瘤的小鼠分为若干组：同型对照组，其中用人类IgG1治疗小鼠；Erb-(IL10)2组，其中用Erb-(IL10)2治疗小鼠；FOLFOX组，其中用FOLFOX治疗小鼠；Erb-(IL10)2+FOLFOX组，其中用Erb-(IL10)2和FOLFOX治疗小鼠。施用剂量、途径和排程列于表7中。使C57BL/6小鼠在第0天s.c.接种B16-EGFR-5细胞；以及在第7天i.v.注射奥沙利铂，8小时后注射Erb-(IL10)2。在第8天i.p.注射甲酰四氢叶酸钙和5-FU。
Figure BDA0004018487780000441
表7施用排程
图5A和图5B显示Erb-(IL10)2和FOLFOX的组合可以抑制肿瘤生长。
可以看出，观察到Erb-(IL10)2与FOLFOX的组合在抑制肿瘤生长方面有协同作用。这表明，Erb-(IL10)2与FOLFOX的组合在治疗黑色素瘤方面有协同作用。
虽然本发明的优选实施方案已经在本文中显示和描述，但对于本领域技术人员显而易见的是，所述实施方案仅以举例的方式提供。本发明并不打算被本说明书内提供的具体实施例所限制。虽然本发明已经参照上述说明书进行了描述，但是对本文实施方案的描述和说明并不打算在限制性意义上进行解释。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的情况下，现在会出现许多变化、改变和取代。此外，应该理解，本发明的所有方面并不限于本文所示的具体描述、配置或相对比例，以上取决于各种条件和变量。应该理解，可以在实践本发明中采用本文所描述的本发明实施方案的各种替代方案。因此，预期本发明也应该涵盖任何所述替代方案、修改、变化或同等方案。以下实施方案旨在界定本发明的范围，并且在这些实施方案以及其等效物的范围内的方法和结构也由此被涵盖。
序列表
<110> 苏州丁孚靶点生物技术有限公司
<120> 用于癌症治疗的方法和组合物
<130> 0027-PA-038CN
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Y349C+T366W
<400> 1
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
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35 40 45
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
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195 200 205
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Pro Gly Lys
225
<210> 2
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D356C+T366S+L368A+Y407V+F405K
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<213> 人工序列
<220>
<223> Y349C+T366W+K409E
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<213> 人工序列
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Asp Thr Leu Pro Pro Asp Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Ala Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 22
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T366W+F405K
<400> 22
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asn Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 23
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T366S+L368A+Y407V+K409A
<400> 23
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Ala Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 24
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T366W+F405K+D399S
<400> 24
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asn Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Ser Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 25
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T366S+L368A+Y407V+K409A+K392D
<400> 25
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Ala Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 26
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T366S+L368G+Y407A+K409A
<400> 26
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Gly Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Ala Ser Ala Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 27
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T366W +F405K +Y349D
<400> 27
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asn Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Asp Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 28
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T366S+L368A+Y407V +K409A +E357A
<400> 28
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Ala Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Ala Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 29
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T366W+F405K+Y349D+S354D
<400> 29
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asn Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Asp Thr Leu Pro Pro Asp Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 30
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型人 IgG1-Fc 域氨基酸
<400> 30
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 31
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc基因片段
<400> 31
gacaagaccc acacctgccc cccctgcccc gcccccgagc tgctgggcgg ccccagcgtg 60
ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatca gccgcacccc cgaggtgacc 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgagaac cccgaggtga agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag ccccgcgagg agcagtacaa cagcacctac 240
cgcgtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtga gcaacaaggc cctgcccgcc cccatcgaga agaccatcag caaggccaag 360
ggccagcccc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcccccca gccgcgacga gctgaccaag 420
aaccaggtga gcctgacctg cctggtgaag ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccccgt gctggacagc 540
gacggcagct tcttcctgta cagcaagctg accgtggaca agagccgctg gcagcagggc 600
aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagagc 660
ctgagcctga gccccggcaa g 681
<210> 32
<211> 741
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码小鼠 kappaIII 信号肽的多核苷酸片段
<400> 32
atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg cagcaccggc 60
gacaagaccc acacctgccc cccctgcccc gcccccgagc tgctgggcgg ccccagcgtg 120
ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatca gccgcacccc cgaggtgacc 180
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgagaac cccgaggtga agttcaactg gtacgtggac 240
ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag ccccgcgagg agcagtacaa cagcacctac 300
cgcgtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 360
tgcaaggtga gcaacaaggc cctgcccgcc cccatcgaga agaccatcag caaggccaag 420
ggccagcccc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcccccca gccgcgacga gctgaccaag 480
aaccaggtga gcctgacctg cctggtgaag ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 540
tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccccgt gctggacagc 600
gacggcagct tcttcctgta cagcaagctg accgtggaca agagccgctg gcagcagggc 660
aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagagc 720
ctgagcctga gccccggcaa g 741
<210> 33
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ScFv-Fc融合蛋白基因
<400> 33
atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg cagcaccggc 60
gaggtgcagc tgctggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggccgcag cctgcgcctg 120
agctgcatcg ccagcggctt caccttcagc agctacccca tgacctgggt gcgccaggcc 180
cccggcaagg gcctggagtg ggtggccagc atcagctacg acggcagcta caagtacaag 240
gccgacagca tgaagggccg cctgaccatc agccgcgaca acagcaagaa caccctgtac 300
ctggagatga acagcctgac cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgcaccgcc 360
ttcttcaacg cctacgactt ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagcgccagc 420
accaagggcc ccagcgtggg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcga gatcgtgatg 480
acccagagcc ccgccaccct gagcgtgagc cccggcgagc gcgccaccct gagctgccgc 540
gccagccaga gcgtgcgcag caacctggcc tggtaccagc agaagcccgg ccaggccccc 600
cgcctgctga tctacgccgc cagcacccgc gccaccggca tccccgcccg cttcagcggc 660
agcggcagcg gcaccgagtt caccctgacc atcagcagcc tgcagagcga ggacttcgcc 720
gtgtactact gccagcagta caacgagtgg ttccgcacca gcggccaggg caccaaggtg 780
gagatcaagc gcgacaagac ccacacctgc cccccctgcc ccgcccccga gctgctgggc 840
ggccccagcg tgttcctgtt cccccccaag cccaaggaca ccctgatgat cagccgcacc 900
cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg agccacgaga accccgaggt gaagttcaac 960
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac gccaagacca agccccgcga ggagcagtac 1020
aacagcacct accgcgtggt gagcgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 1080
aaggagtaca agtgcaaggt gagcaacaag gccctgcccg cccccatcga gaagaccatc 1140
agcaaggcca agggccagcc ccgcgagccc caggtgtaca ccctgccccc cagccgcgac 1200
gagctgacca agaaccaggt gagcctgacc tgcctggtga agggcttcta ccccagcgac 1260
atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac cacccccccc 1320
gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagagccgc 1380
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1440
acccagaaga gcctgagcct gagccccggc aag 1473
<210> 34
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ScFv-Fc融合蛋白
<400> 34
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Pro Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Lys Ala Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Ala Phe Phe Asn Ala Tyr Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg
145 150 155 160
Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Arg Ala Thr
180 185 190
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Tyr Asn Glu Trp Phe Arg Thr Ser Gly Gln Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Glu Ile Lys Arg Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asn Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305 310 315 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
340 345 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 35
<211> 1121
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码融合蛋白VhH-Fc的融合基因片段
<400> 35
atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg cagcaccggc 60
caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 120
tcctgtgcag cctctgaata catctacagt agctactgca tggcctggtt ccgccaggct 180
ccagggaagg agcgcgaggg ggtcgcagtt attgggagtg atggtagcac aagctacgca 240
gactccgtga aaggccgatt caccatctcc aaagacaacg ccaagaacac tctgtatctg 300
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacact gccatgtact actgtgcggc catcggtggt 360
tactgctacc aaccacccta tgagtaccag tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 420
tcccagaacc gaaaagcagc gacaagaccc acacctgccc cccctgcccc gcccccgagc 480
tgctgggcgg ccccagcgtg ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatca 540
gccgcacccc cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgagaac cccgaggtga 600
agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag ccccgcgagg 660
agcagtacaa cagcacctac cgcgtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc 720
tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtga gcaacaaggc cctgcccgcc cccatcgaga 780
agaccatcag caaggccaag ggccagcccc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcccccca 840
gccgcgacga gctgaccaag aaccaggtga gcctgacctg cctggtgaag ggcttctacc 900
ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca 960
ccccccccgt gctggacagc gacggcagct tcttcctgta cagcaagctg accgtggaca 1020
agagccgctg gcagcagggc aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca 1080
accactacac ccagaagagc ctgagcctga gccccggcaa g 1121
<210> 36
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白 VhH-Fc
<400> 36
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Tyr Ser Ser Tyr
20 25 30
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Val Ile Gly Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ile Gly Gly Tyr Cys Tyr Gln Pro Pro Tyr Glu Tyr Gln Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp
115 120 125
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
145 150 155 160
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
165 170 175
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
180 185 190
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
195 200 205
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
210 215 220
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
225 230 235 240
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
245 250 255
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
260 265 270
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
275 280 285
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
290 295 300
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
305 310 315 320
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
325 330 335
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
340 345 350
Gly Lys
<210> 37
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Erb-LC氨基酸序列
<400> 37
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 38
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Erb-LC基因
<400> 38
gacatcctgc tgacccagag ccccgtgatc ctgagcgtga gccccggcga gcgcgtgagc 60
ttcagctgcc gcgccagcca gagcatcggc accaacatcc actggtacca gcagcgcacc 120
aacggcagcc cccgcctgct gatcaagtac gccagcgaga gcatcagcgg catccccagc 180
cgcttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga gcatcaacag cgtggagagc 240
gaggacatcg ccgactacta ctgccagcag aacaacaact ggcccaccac cttcggcgcc 300
ggcaccaagc tggagctgaa gcgcaccgtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360
agcgacgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600
ctgagcagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cgcggcgagt gc 642
<210> 39
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Erb-Fc9氨基酸序列
<400> 39
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Ala Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 40
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Erb-Fc9基因
<400> 40
caggtgcagc tgaagcagag cggccccggc ctggtgcagc ccagccagag cctgagcatc 60
acctgcaccg tgagcggctt cagcctgacc aactacggcg tgcactgggt gcgccagagc 120
cccggcaagg gcctggagtg gctgggcgtg atctggagcg gcggcaacac cgactacaac 180
acccccttca ccagccgcct gagcatcaac aaggacaaca gcaagagcca ggtgttcttc 240
aagatgaaca gcctgcagag caacgacacc gccatctact actgcgcccg cgccctgacc 300
tactacgact acgagttcgc ctactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcgccgcc 360
agcactaagg ggccctctgt gtttccactc gccccttcta gcaaaagcac ttccggagga 420
actgccgctc tgggctgtct ggtgaaagat tacttccccg aaccagtcac tgtgtcatgg 480
aactctggag cactgacatc tggagttcac acctttcctg ctgtgctgca gagttctgga 540
ctgtactccc tgtcatctgt ggtcaccgtg ccatcttcat ctctggggac ccagacctac 600
atctgtaacg tgaaccacaa accctccaac acaaaagtgg acaaacgagt cgaaccaaaa 660
tcttgtgaca aaacccacac atgcccaccg tgcccagctc cggaactcct gggcggaccg 720
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccaagtcg ggatgagctg 1080
accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgttg 1200
gactccgacg gctccttctt cctctacagc gcgctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子1
<400> 41
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 42
<211> 582
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (IL10)2-Fc6氨基酸序列
<400> 42
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser
165 170 175
Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly
180 185 190
Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val
195 200 205
Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys
210 215 220
Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu
225 230 235 240
Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu
245 250 255
Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn
260 265 270
Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro
275 280 285
Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn
290 295 300
Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile
305 310 315 320
Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn Gly
325 330 335
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro
340 345 350
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
355 360 365
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
370 375 380
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
385 390 395 400
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
405 410 415
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
420 425 430
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
435 440 445
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
450 455 460
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
465 470 475 480
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
485 490 495
Gln Val Ser Leu Ser Cys Gly Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
500 505 510
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
515 520 525
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Ala Ser Lys
530 535 540
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
545 550 555 560
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
565 570 575
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
580
<210> 43
<211> 1746
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> (IL10)2-Fc6基因
<400> 43
agccccggcc agggcacaca gtccgagaac agctgcaccc actttcccgg caacctgcct 60
aacatgctga gggacctgag ggacgccttc agcagggtga agaccttctt ccagatgaag 120
gaccagctgg ataacctgct gctgaaggag agcctgctgg aggacttcaa gggctacctg 180
ggctgccagg ccctgagcga gatgatccag ttctacctgg aggaggtgat gccccaggcc 240
gagaaccagg accccgacat caaggcccac gtgaacagcc tgggcgagaa cctgaagacc 300
ctgaggctga ggctgaggag gtgccacagg ttcctgccct gtgagaacaa atccaaggcc 360
gtggagcagg tgaagaacgc cttcaacaag ctgcaggaaa agggcatcta caaggccatg 420
agcgagttcg acatctttat caactatatc gaggcctaca tgacaatgaa gatcaggaac 480
ggcggcggcg gcagcggggg cggcggcagc ggaggaggcg gcagcagccc cggccagggc 540
acacagtccg agaacagctg cacccacttt cccggcaacc tgcctaacat gctgagggac 600
ctgagggacg ccttcagcag ggtgaagacc ttcttccaga tgaaggacca gctggataac 660
ctgctgctga aggagagcct gctggaggac ttcaagggct acctgggctg ccaggccctg 720
agcgagatga tccagttcta cctggaggag gtgatgcccc aggccgagaa ccaggacccc 780
gacatcaagg cccacgtgaa cagcctgggc gagaacctga agaccctgag gctgaggctg 840
aggaggtgcc acaggttcct gccctgtgag aacaaatcca aggccgtgga gcaggtgaag 900
aacgccttca acaagctgca ggaaaagggc atctacaagg ccatgagcga gttcgacatc 960
tttatcaact atatcgaggc ctacatgaca atgaagatca ggaacggcgg cggcggcagc 1020
gggggcggcg gcagcggagg aggcggcagc gagcctaagt ccagcgacaa gacccacacc 1080
tgcccccctt gccccgctcc ggaactcctg ggcggaccgt cagtcttcct cttcccccca 1140
aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 1200
gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 1260
aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1320
ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1380
aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1440
ccacaggtgt ataccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1500
agttgcgggg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1560
cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgttgg actccgacgg ctccttcaag 1620
ctcgccagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1680
tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1740
ggtaaa 1746
<210> 44
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL10-Fc氨基酸序列
<400> 44
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
165 170 175
Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
180 185 190
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
195 200 205
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
210 215 220
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
225 230 235 240
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
245 250 255
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
260 265 270
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
275 280 285
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
290 295 300
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
305 310 315 320
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
325 330 335
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
340 345 350
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
355 360 365
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
370 375 380
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
385 390 395 400
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405
<210> 45
<211> 1221
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL10-Fc基因
<400> 45
agccccggcc agggcacaca gtccgagaac agctgcaccc actttcccgg caacctgcct 60
aacatgctga gggacctgag ggacgccttc agcagggtga agaccttctt ccagatgaag 120
gaccagctgg ataacctgct gctgaaggag agcctgctgg aggacttcaa gggctacctg 180
ggctgccagg ccctgagcga gatgatccag ttctacctgg aggaggtgat gccccaggcc 240
gagaaccagg accccgacat caaggcccac gtgaacagcc tgggcgagaa cctgaagacc 300
ctgaggctga ggctgaggag gtgccacagg ttcctgccct gtgagaacaa atccaaggcc 360
gtggagcagg tgaagaacgc cttcaacaag ctgcaggaaa agggcatcta caaggccatg 420
agcgagttcg acatctttat caactatatc gaggcctaca tgacaatgaa gatcaggaac 480
ggcggcggcg gcagcggggg cggcggcagc ggaggaggcg gcagcgagcc taagtccagc 540
gacaagaccc acacctgccc cccttgcccc gctccggaac tcctgggcgg accgtcagtc 600
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 660
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 720
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 780
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 840
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 900
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 960
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1020
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gttggactcc 1080
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1140
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1200
ctctccctgt ctccgggtaa a 1221
<210> 46
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc9基因
<400> 46
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gctccggaac tcctgggcgg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccaa gtcgggatga gctgaccaag 420
aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gttggactcc 540
gacggctcct tcttcctcta cagcgcgctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660
ctctccctgt ctccgggtaa a 681
<210> 47
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Kb结合肽抗原
<400> 47
Ser Ile Tyr Arg Tyr Tyr Gly Leu
1 5
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗轻链 CDR1
<400> 48
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His
1 5 10
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗轻链 CDR2
<400> 49
Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗轻链 CDR3
<400> 50
Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr
1 5
<210> 51
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗轻链可变区
<400> 51
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗重链 CDR1
<400> 52
Asn Tyr Gly Val His
1 5
<210> 53
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗重链 CDR2
<400> 53
Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser
1 5 10 15
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗重链 CDR3
<400> 54
Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 55
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗重链可变区
<400> 55
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 56
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL10
<400> 56
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 57
<211> 480
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL10基因
<400> 57
agccccggcc agggcacaca gtccgagaac agctgcaccc actttcccgg caacctgcct 60
aacatgctga gggacctgag ggacgccttc agcagggtga agaccttctt ccagatgaag 120
gaccagctgg ataacctgct gctgaaggag agcctgctgg aggacttcaa gggctacctg 180
ggctgccagg ccctgagcga gatgatccag ttctacctgg aggaggtgat gccccaggcc 240
gagaaccagg accccgacat caaggcccac gtgaacagcc tgggcgagaa cctgaagacc 300
ctgaggctga ggctgaggag gtgccacagg ttcctgccct gtgagaacaa atccaaggcc 360
gtggagcagg tgaagaacgc cttcaacaag ctgcaggaaa agggcatcta caaggccatg 420
agcgagttcg acatctttat caactatatc gaggcctaca tgacaatgaa gatcaggaac 480
<210> 58
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (IL10)2
<400> 58
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser
165 170 175
Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly
180 185 190
Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val
195 200 205
Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys
210 215 220
Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu
225 230 235 240
Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu
245 250 255
Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn
260 265 270
Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro
275 280 285
Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn
290 295 300
Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile
305 310 315 320
Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
325 330 335
<210> 59
<211> 1005
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> (IL10)2基因
<400> 59
agccccggcc agggcacaca gtccgagaac agctgcaccc actttcccgg caacctgcct 60
aacatgctga gggacctgag ggacgccttc agcagggtga agaccttctt ccagatgaag 120
gaccagctgg ataacctgct gctgaaggag agcctgctgg aggacttcaa gggctacctg 180
ggctgccagg ccctgagcga gatgatccag ttctacctgg aggaggtgat gccccaggcc 240
gagaaccagg accccgacat caaggcccac gtgaacagcc tgggcgagaa cctgaagacc 300
ctgaggctga ggctgaggag gtgccacagg ttcctgccct gtgagaacaa atccaaggcc 360
gtggagcagg tgaagaacgc cttcaacaag ctgcaggaaa agggcatcta caaggccatg 420
agcgagttcg acatctttat caactatatc gaggcctaca tgacaatgaa gatcaggaac 480
ggcggcggcg gcagcggggg cggcggcagc ggaggaggcg gcagcagccc cggccagggc 540
acacagtccg agaacagctg cacccacttt cccggcaacc tgcctaacat gctgagggac 600
ctgagggacg ccttcagcag ggtgaagacc ttcttccaga tgaaggacca gctggataac 660
ctgctgctga aggagagcct gctggaggac ttcaagggct acctgggctg ccaggccctg 720
agcgagatga tccagttcta cctggaggag gtgatgcccc aggccgagaa ccaggacccc 780
gacatcaagg cccacgtgaa cagcctgggc gagaacctga agaccctgag gctgaggctg 840
aggaggtgcc acaggttcct gccctgtgag aacaaatcca aggccgtgga gcaggtgaag 900
aacgccttca acaagctgca ggaaaagggc atctacaagg ccatgagcga gttcgacatc 960
tttatcaact atatcgaggc ctacatgaca atgaagatca ggaac 1005
<210> 60
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区
<400> 60
Glu Pro Lys Ser Ser
1 5

Claims (78)

1.一种组合物，所述组合物包括免疫偶联物和化疗药物，其中：
所述免疫偶联物包括：1)一种或多种白细胞介素，和2)由第一Fc亚单元和第二Fc亚单元组成的Fc结构域，所述第一Fc亚单元与所述第二Fc亚单元缔合以形成二聚体；所述一种或多种白细胞介素与所述Fc结构域融合；并且
其中所述化疗药物包括氟尿嘧啶和/或奥沙利铂(Oxaliplatin)。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种白细胞介素中的至少一种与所述Fc结构域的氨基末端氨基酸融合。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的组合物，其中所述免疫偶联物包括两种或更多种白细胞介素。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述两种或更多种白细胞介素中的至少两种与所述Fc结构域的氨基末端氨基酸融合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述白细胞介素中的一种或多种通过肽接头和/或免疫球蛋白铰链区与所述Fc结构域融合。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的组合物，其中所述两种或更多种白细胞介素中的至少两种通过肽接头彼此融合以形成白细胞介素二聚体。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中至少一种所述白细胞介素二聚体与所述Fc结构域的氨基末端氨基酸融合。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的组合物，其中所述两种或更多种白细胞介素是同一白细胞介素的两个或更多个拷贝。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述两种或更多种白细胞介素是IL10的两个或更多个拷贝。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种白细胞介素包括一种或多种IL10。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述免疫偶联物进一步包括与所述Fc结构域融合的靶向部分，其中所述靶向部分对肿瘤抗原展现出结合特异性。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述靶向部分与所述Fc结构域的氨基末端氨基酸融合。
13.根据权利要求11至12中任一项所述的组合物，其中所述靶向部分通过肽接头或免疫球蛋白铰链区与所述Fc结构域融合。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的组合物，其中所述靶向部分包括抗体的抗原结合结构域。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述抗体的抗原结合结构域是Fab部分。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤抗原是EGFR。
17.根据权利要求11至16中任一项所述的组合物，其中所述靶向部分包括抗EGFR抗体的抗原结合结构域。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述抗EGFR抗体是西妥昔单抗(Cetuximab)。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述靶向部分包括西妥昔单抗的重链CDR1-3，HCDR1包括如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，HCDR2包括如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，并且HCDR3包括如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
20.根据权利要求18至19中任一项所述的组合物，其中所述靶向部分包括西妥昔单抗的轻链CDR1-3，LCDR1包括如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，LCDR2包括如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，并且LCDR3包括如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的组合物，其中所述靶向部分包括西妥昔单抗的重链可变区，并且所述重链可变区包括如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的组合物，其中所述靶向部分包括西妥昔单抗的轻链可变区，并且所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:51+-所示的氨基酸序列。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的组合物，其中所述Fc结构域是IgG Fc结构域。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述IgG是IgG1。
25.根据权利要求23所述的组合物，其中所述IgG是人类IgG1。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的组合物，其中所述免疫偶联物是不对称的免疫偶联物，所述不对称的免疫偶联物包括第一成员和与所述第一成员不同的第二成员，其中所述第一成员包括所述第一Fc亚单元，并且所述第二成员包括与所述第二Fc亚单元融合的所述一种或多种白细胞介素，并且所述第一Fc亚单元与所述第二Fc亚单元缔合以形成所述Fc结构域的所述二聚体。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中在所述第二成员中，所述一种或多种白细胞介素中的至少一种与所述第二Fc亚单元的氨基末端氨基酸融合。
28.根据权利要求26至27中任一项所述的组合物，其中在所述第二成员中，所述一种或多种白细胞介素中的至少两种彼此融合以形成白细胞介素二聚体，并且所述白细胞介素二聚体进一步与所述第二Fc亚单元的所述氨基末端氨基酸融合。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的组合物，其中所述第一成员进一步包括与所述第一Fc亚单元融合的所述靶向部分。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中在所述第一成员中，所述靶向部分与所述第一Fc亚单元的氨基末端氨基酸融合。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的组合物，其中所述第一Fc亚单元与所述第二Fc亚单元不同，并且所述Fc结构域包括促进所述第一Fc亚单元与所述第二Fc亚单元之间的异二聚体化的修饰。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述第一Fc亚单元包括第一修饰，并且所述第二Fc亚单元包括第二修饰。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述第一修饰包括在T366位置的氨基酸取代和在选自由以下组成的组的一个或多个位置的氨基酸取代：Y349、F405、K409、D399、K360、Q347、K392和S354，其中所述氨基酸的所述位置是根据KABAT编号的EU指数来确定的。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述第一修饰所包括的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：Y349C、Y349D、D399S、F405K、K360E、K409A、K409E、Q347E、Q347R、S354D、K392D和T366W，其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的组合物，其中所述第一修饰包括2-5个氨基酸取代。
36.根据权利要求32至35中任一项所述的组合物，其中所述第一修饰包括在选自以下组中的任一者的一组位置的氨基酸取代：1)Y349和T366；2)Y349、T366和F405；3)Y349、T366和K409；4)Y349、T366、F405、K360和Q347；5)Y349、T366、F405和Q347；6)Y349、T366、K409、K360和Q347；7)Y349、T366、K409和Q347；8)T366、K409和K392；9)T366和K409；10)T366、K409、Y349和S354；11)T366和F405；12)T366、F405和D399；和13)T366、F405、Y349和S354；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
37.根据权利要求32至36中任一项所述的组合物，其中所述第一修饰包括选自以下组中的任一者的一组氨基酸取代：1)Y349C和T366W；2)Y349C、T366W和F405K；3)Y349C、T366W和K409E；4)Y349C、T366W和K409A；5)Y349C、T366W、F405K、K360E和Q347E；6)Y349C、T366W、F405K和Q347R；7)Y349C、T366W、K409A、K360E和Q347E；8)Y349C、T366W、K409A和Q347R；9)T366W、K409A和K392D；10)T366W和K409A；11)T366W、K409A和Y349D；12)T366W、K409A、Y349D和S354D；13)T366W和F405K；14)T366W、F405K和D399S；15)T366W、F405K和Y349D；和16)T366W、F405K、Y349D和S354D；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
38.根据权利要求32至37中任一项所述的组合物，其中所述第二修饰包括在T366、L368和Y407位置的氨基酸取代以及在一个或多个选自由D356、D399、E357、F405、K360、K392、K409和Q347组成的组的位置的氨基酸取代，其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述第二修饰所包括的所述氨基酸取代选自由以下组成的组：D356C、D399S、E357A、F405K、K360E、K392D、K409A、L368A、L368G、Q347E、Q347R、T366S、Y407A和Y407V，其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
40.根据权利要求32至39中任一项所述的组合物，其中所述第二修饰包括4-6个氨基酸取代。
41.根据权利要求32至40中任一项所述的组合物，其中所述第二修饰包括在选自以下组中的任一者的一组位置的氨基酸取代：1)D356、T366、L368、Y407和F405；2)D356、T366、L368和Y407；3)D356、T366、L368、Y407和Q347；4)D356、T366、L368、Y407、K360和Q347；5)D356、T366、L368、Y407、F405和Q347；6)D356、T366、L368、Y407、F405、K360和Q347；7)T366、L368、Y407、D399和F405；8)T366、L368、Y407和F405；9)T366、L368、Y407、F405和E357；10)T366、L368、Y407和K409；11)T366、L368、Y407、K409和K392；和12)T366、L368、Y407、K409和E357；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
42.根据权利要求32至41中任一项所述的组合物，其中所述第二修饰包括选自以下组中的任一者的一组氨基酸取代：1)D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；2)D356C、T366S、L368A和Y407V；3)D356C、T366S、L368A、Y407V和Q347R；4)D356C、T366S、L368A、Y407V、K360E和Q347E；5)D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K和Q347R；6)D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K、K360E和Q347E；7)T366S、L368A、Y407V、D399S和F405K；8)T366S、L368G、Y407A和F405K；9)T366S、L368A、Y407V、F405K和E357A；10)T366S、L368A、Y407V和K409A；11)T366S、L368A、Y407V、K409A和K392D；12)T366S、L368G、Y407A和K409A；13)T366S、L368A、Y407V、K409A和E357A；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
43.根据权利要求32至42中任一项所述的组合物，其中所述第一Fc亚单元包括所述第一修饰，所述第二Fc亚单元包括所述第二修饰，并且所述第一修饰和所述第二修饰包括在选自所述以下组中的任一者的一组位置的氨基酸取代：1)所述第一修饰：Y349和T366；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407和F405；2)所述第一修饰：Y349、T366和F405；和所述第二修饰：D356、T366、L368和Y407；3)所述第一修饰：Y349、T366和K409；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407和F405；4)所述第一修饰：Y349、T366、F405、K360和Q347；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407和Q347；5)所述第一修饰：Y349、T366、F405和Q347；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407、K360和Q347；6)所述第一修饰：Y349、T366、K409、K360和Q347；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407、F405和Q347；7)所述第一修饰：Y349、T366、K409和Q347；和所述第二修饰：D356、T366、L368、Y407、F405、K360和Q347；8)所述第一修饰：T366、K409和K392；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、D399和F405；9)所述第一修饰：T366和K409；和所述第二修饰：T366、L368、Y407和F405；10)所述第一修饰：T366、K409和Y349；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、F405和E357；11)所述第一修饰：T366、K409、Y349和S354；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、F405和E357；12)所述第一修饰：T366和F405；和所述第二修饰：T366、L368、Y407和K409；13)所述第一修饰：T366、F405和D399；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、K409和K392；14)所述第一修饰：T366、F405和Y349；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、K409和E357；15)所述第一修饰：T366、F405、Y349和S354；和所述第二修饰：T366、L368、Y407、K409和E357；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
44.根据权利要求32至43中任一项所述的组合物，其中所述第一Fc亚单元包括所述第一修饰，所述第二Fc亚单元包括所述第二修饰，其中所述第一修饰和所述第二修饰包括选自所述以下组中的任一者的一组氨基酸取代：1)所述第一修饰：Y349C和T366W；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；2)所述第一修饰：Y349C、T366W和F405K；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A和Y407V；3)所述第一修饰：Y349C、T366W和K409E；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；4)所述第一修饰：Y349C、T366W和K409A；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；5)所述第一修饰：Y349C、T366W、F405K、K360E和Q347E；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和Q347R；6)所述第一修饰：Y349C、T366W、F405K和Q347R；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V、K360E和Q347E；7)所述第一修饰：Y349C、T366W、K409A、K360E和Q347E；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K和Q347R；8)所述第一修饰：Y349C、T366W、K409A和Q347R；和所述第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K、K360E和Q347E；9)所述第一修饰：T366W、K409A和K392D；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、D399S和F405K；10)所述第一修饰：T366W和K409A；和所述第二修饰：T366S、L368G、Y407A和F405K；11)所述第一修饰：T366W、K409A和Y349D；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、F405K和E357A；12)所述第一修饰：T366W、K409A、Y349D和S354D；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、F405K和E357A；13)所述第一修饰：T366W和F405K；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V和K409A；14)所述第一修饰：T366W、F405K和D399S；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、K409A和K392D；15)所述第一修饰：T366W和F405K；和所述第二修饰：T366S、L368G、Y407A和K409A；16)所述第一修饰：T366W、F405K和Y349D；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、K409A和E357A；17)所述第一修饰：T366W、F405K、Y349D和S354D；和所述第二修饰：T366S、L368A、Y407V、K409A和E357A；其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述第一Fc亚单元包括所述第一修饰，所述第二Fc亚单元包括所述第二修饰，所述第一修饰包括所述氨基酸取代T366W和K409A，并且所述第二修饰包括所述氨基酸取代T366S、L368G、Y407A和F405K，其中所述氨基酸的所述位置是根据所述KABAT编号的所述EU指数来确定的。
46.根据权利要求26至45中任一项所述的组合物，其中所述第一成员不包括任何白细胞介素。
47.根据权利要求1至46中任一项所述的组合物，其中所述第一Fc亚单元包括SEQ IDNO:17中的任一个中所示的氨基酸序列。
48.根据权利要求1至47中任一项所述的组合物，其中所述第二Fc亚单元包括SEQ IDNO:18中的任一个中所示的氨基酸序列。
49.根据权利要求1至48中任一项所述的组合物，其中所述白细胞介素是人类白细胞介素。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的组合物，其中所述白细胞介素包括SEQ ID NO:56中的任一个中所示的氨基酸序列。
51.根据权利要求1至50中任一项所述的组合物，其中所述免疫偶联物包括第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链，所述第一多肽链包括SEQ ID NO:37中的任一个中所示的氨基酸序列，所述第二多肽链包括SEQ ID NO:39中的任一个中所示的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包括SEQ ID NO:42中的任一个中所示的氨基酸序列。
52.根据权利要求26至50中任一项所述的组合物，其中所述第一成员包括第一多肽链和第二多肽链，所述第二成员包括第三多肽链，所述第一多肽链包括如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，所述第二多肽链包括如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包括如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
53.根据权利要求26至50中任一项所述的组合物，其中所述第一成员包括第一多肽链，并且所述第二成员包括第二多肽链，所述第一多肽链包括如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，并且所述第二多肽链包括如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的组合物，其中所述氟尿嘧啶包括5-Fu。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的组合物，其中所述化疗药物进一步包括亚叶酸。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的组合物，其中所述化疗药物包括四氢叶酸和/或甲酰四氢叶酸钙。
57.根据权利要求1至56中任一项所述的组合物，其中所述化疗药物包括FOLFOX方案。
58.根据权利要求1至57中任一项所述的组合物，其中所述氟尿嘧啶和所述奥沙利铂在所述组合物中彼此不混合。
59.一种免疫偶联物，所述免疫偶联物与化疗药物联合用于治疗癌症，其中所述免疫偶联物如权利要求1至53中任一项中所定义，并且所述化疗药物如权利要求1至58中任一项中所定义。
60.根据权利要求59所述的免疫偶联物，其中所述癌症选自胰腺癌和结直肠癌。
61.根据权利要求60所述的免疫偶联物，其中所述胰腺癌是转移性胰腺癌。
62.根据权利要求60所述的免疫偶联物，其中所述结直肠癌是转移性结直肠癌。
63.根据权利要求59至62中任一项所述的免疫偶联物，其中所述癌症或其细胞具有增加的EGFR表达。
64.一种免疫偶联物与化疗药物联合用于制备用以治疗有需要的受试者的癌症的药剂的用途，其中所述免疫偶联物如权利要求1至53中任一项中所定义，并且所述化疗药物如权利要求1至58中任一项中所定义。
65.根据权利要求64所述的用途，其中所述癌症选自胰腺癌、黑色素瘤和结直肠癌。
66.根据权利要求65所述的用途，其中所述胰腺癌是转移性胰腺癌。
67.根据权利要求65所述的用途，其中所述结直肠癌是转移性结直肠癌。
68.根据权利要求65所述的用途，其中所述结直肠癌是黑色素瘤。
69.根据权利要求64至68中任一项所述的用途，其中所述癌症或其细胞具有增加的EGFR表达。
70.一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用(a)有效量的根据权利要求1至53中任一项所述的免疫偶联物和(b)有效量的根据权利要求1至58中任一项所述的化疗药物。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述免疫偶联物是在施用所述化疗药物之后施用于所述受试者。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述免疫偶联物是在施用所述化疗药物之后不超过10天施用于所述受试者。
73.根据权利要求71至72中任一项所述的方法，其中所述免疫偶联物是在施用所述化疗药物之后不超过3天施用于所述受试者。
74.根据权利要求71至73中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用所述免疫偶联物两次或更多次。
75.根据权利要求71至74中任一项所述的方法，其中所述癌症选自胰腺癌和结直肠癌。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述胰腺癌是转移性胰腺癌。
77.根据权利要求75所述的方法，其中所述结直肠癌是转移性结直肠癌。
78.根据权利要求70至77中任一项所述的方法，其中所述癌症或其细胞具有增加的EGFR表达。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5011277B2 (ja) * 2005-04-06 2012-08-29 アイビーシー・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド ホモダイマー、ホモテトラマーまたはダイマーのダイマーのからなる安定に連結された複合体を発生させるための方法および使用
KR101380729B1 (ko) * 2007-05-30 2014-04-10 포항공과대학교 산학협력단 면역글로불린 융합 단백질
UA117901C2 (uk) * 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
AU2014357292B2 (en) * 2013-11-27 2020-06-25 Zymeworks Bc Inc. Bispecific antigen-binding constructs targeting HER2
US10206980B2 (en) * 2014-01-08 2019-02-19 Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. IL-15 heterodimeric protein and uses thereof
CN104403004B (zh) * 2014-11-24 2017-10-13 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 抗体‑干扰素异二聚体的制备和用途
CN110719920B (zh) * 2017-06-14 2024-01-30 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 蛋白质异二聚体及其用途
CN111132998B (zh) * 2017-09-25 2024-01-30 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 用于癌症治疗的方法和组合物

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