CN109971720B - 靶向ErbB受体家族的嵌合抗原受体修饰T细胞及其用途 - Google Patents

靶向ErbB受体家族的嵌合抗原受体修饰T细胞及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种靶向ErbB受体家族的嵌合抗原受体修饰T细胞及其用途。具体而言，本发明提供的嵌合抗原受体从N端到C端依次含有膜蛋白信号肽、通过接头连接的T1E肽段和Herin肽段、长50个氨基酸残基以上的铰链区、跨膜区、共刺激信号分子胞内结构域和免疫受体酪氨酸活化基序。本发明还包括表达本文所述嵌合抗原受体的T细胞，该T细胞可以特异性杀伤至少一个EGFR家族成员蛋白高表达的肿瘤细胞。

Description

靶向ErbB受体家族的嵌合抗原受体修饰T细胞及其用途
技术领域
本发明属于基因工程学和免疫学，涉及靶向ErbB受体家族的嵌合抗原受体修饰 T细胞及其用途
背景技术
癌症现在已成为人类健康的头号杀手，快速的生活节奏、巨大的工作压力、不健康的饮食习惯、糟糕的环境都是癌症发生的帮凶，使得癌症的高发率和年轻化趋势也越来越明显。目前常用的治疗手段效果十分有限，仍需探索一个更加有效的治疗方法，来提高癌症患者的生存率和生存质量。
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法作为肿瘤免疫治疗的重要分支之一，在恶性血液肿瘤中已经取得了非常好的疗效，对复发难治性B细胞白血病的完全缓解率超过90％。嵌合抗原受体是一种人工合成受体，它通常包含胞外抗原结合域、跨膜铰链区和胞内信号转导区。通过将识别肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA)的抗体单链可变区(single-chain fragment variable，scFv)和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM)”在体外进行基因重组。再通过病毒或其它载体系统将其导入T细胞中，这样经过基因改造的T细胞称之为CAR-T细胞。CAR-T细胞在体外经大规模扩增后，回输到患者体内，能够以非 MHC限制性的模式表现强效的抗癌作用。
但是，将这种疗法复制到实体瘤时却遇到了很多障碍。一是实体瘤缺乏肿瘤特异性抗原，无法找到完美的治疗靶点。二是实体瘤具有更强的肿瘤免疫抑制微环境。此外，肿瘤本身具有很强的异质性。这些因素导致肿瘤免疫治疗后容易复发。因此，制备多靶点、功能更强的CART细胞，是提高肿瘤治疗效果的关键。例如，采用CART19 治疗B细胞急性淋巴细胞白血病，约有30％的病人治疗后会产生CD19抗原阴性复发，研究表明同时以CD19和IL3受体α链CD123作为靶点，构建的CART19/123 双靶点的CART细胞，具有更好的体内治疗效果，可降低复发率(J Clin Invest.2016 Oct 3；126(10))。然而，这些CAR的抗原识别区大多是人工构建的单链抗体，具有较强的免疫原性，体内治疗容易被识别并清除，导致治疗效果不佳。因此，采用天然的肽段构建出多靶点的抗原识别区，具有免疫原性弱，靶向范围更好的优点。
ErbB受体家族包含四个成员，分别是表皮生长因子受体ErbB1(EGFR/Her2)、ErbB2(Her2)、ErbB3(Her3)和ErbB4(Her4)。配体激活ErbB受体酪氨酸激酶后，可引起受体间的二聚化，酪氨酸的自身磷酸化，进而激活下游的信号通路。在正常成年人体内，这四种受体的表达量都处于较低水平。然而，许多恶性肿瘤的发生都与ErbB1和/或ErbB2的过表达有关，包括头颈癌、乳腺癌、肺癌、胃肠道癌、前列腺癌和胰腺癌等。因此，临床研究的许多抗肿瘤药物是靶向ErbB不同受体胞外区的单克隆抗体和小分子酪氨酸激酶抑制剂，如HER2人源化抗体赫赛汀(Herceptin)已被FDA批准用于乳腺癌的临床治疗。
然而，ErbB受体通常是以紧密结合的二聚体的形式发挥作用的。Her2单个受体缺乏高亲和力的配体，但它却是最佳的二聚化伙伴，尤其是与EGFR或Her3二聚化时能增强酪氨酸激酶信号活化。Her3具有配体结合能力但缺乏酪氨酸激酶活性，与 Her2形成的异源二聚体是最强有力的信号复合体，在乳腺癌中最具有代表性的异源二聚体是Her2/Her3。单独靶向某一受体的抗肿瘤药物，由于不能靶向其他的ErbB 受体二聚体，容易引起肿瘤的复发。
T1E是一种嵌合的多肽，它由人转录生长因子α(TGFα)N端的七个氨基酸和表皮生长因子(EGF)C端的48个氨基酸组成，它和基于ErbB1的同源二聚体和异源二聚体都有很高的亲和力，此外，T1E还能有效结合ErbB2/3异源二聚体。有研究表明，以T1E作为scFv的CAR转染T细胞，可有效治疗人头颈癌的小鼠肿瘤异种移植模型。但是，T1E不能结合单独的ErbB2或者ErbB3，在靶向ErbB受体家族的范围上还存在缺陷。
Herstatin是Her2被选择性地剪切而产生的Her2截短的版本,其序列包括Her2 第Ⅰ及Ⅱ胞外区结构域的340个氨基酸和第八内含子编码的79个氨基酸,是一种可溶的Her2自身抑制因子。Herstatin能与单独的EGFR或Her2高亲和力结合，其中起主要作用的是第八内含子编码的79个氨基酸(命名为Herin)。本发明，将天然的 T1E和Herin融合表达作为CAR的抗原识别区，二者可以互补识别ErbB受体家族，扩大靶向范围。
发明内容
本发明提供一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次包括任选的膜蛋白信号肽、通过接头连接的T1E肽段和Herin肽段、长50个氨基酸残基以上的铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域。
在一个或多个实施方案中，所述信号肽选自CD8信号肽、CD28信号肽和CD4 信号肽；优选地，所述信号肽是CD8信号肽，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:15 第1-22位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述T1E的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第23-77位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述Herin的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第93-171 位氨基酸序列所示。
在一个或多个实施方案中，所述接头选自柔性接头和刚性接头；优选地，所述柔性接头为含有G和S的接头，所述刚性接头为含有EAAAK重复序列的接头；优选地，所述接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第78-92位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述长50个氨基酸残基以上的铰链区选自CD8α铰链区、IgD铰链区、IgG1Fc CH2CH3铰链区和IgG4Fc CH2CH3铰链区；优选地，所述铰链区是CD8α铰链区或IgG4Fc CH2CH3铰链区；优选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述IgG4FcCH2CH3铰链区的氨基酸序列如 SEQ ID NO:15第172-399位氨基酸序列所示。
在一个或多个实施方案中，所述跨膜区选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种或多种；优选地，所述跨膜区为CD8跨膜区或CD28跨膜区；优选地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，所述CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第400-427位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述胞内共刺激信号域为共刺激信号分子的胞内结构域，选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、LCK、ICOS和DAP10胞内结构域中的一种或多种；优选地，所述共刺激信号分子的胞内结构域是CD137胞内结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，或所述共刺激信号分子的胞内结构域是CD28 胞内结构域，其氨基酸序列可如SEQID NO:15第428-468位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述胞内信号域是免疫受体酪氨酸活化基序，选自CD3ζ和FcεRIγ的酪氨酸活化基序；优选地，所述免疫受体酪氨酸活化基序为CD3ζ酪氨酸活化基序，优选地，其氨基酸序列如SEQ ID NO:15第469-580位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有任选的CD8 信号肽、T1E、EAAAK重复序列、Herin、IgG4Fc CH2CH3铰链区、CD28跨膜区、 CD28胞内结构域和CD3ζ酪氨酸活化基序。
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有任选的CD8 信号肽、Herin、EAAAK重复序列、T1E、IgG4Fc CH2CH3铰链区、CD28跨膜区、 CD28胞内结构域和CD3ζ酪氨酸活化基序。
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:15或16所示。
本发明还提供一种多核苷酸序列，选自：
(1)编码本文所述嵌合抗原受体的多核苷酸序列；和
(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列；
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体的编码序列具有特征中的一项或多项：
所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述T1E的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述Herin的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
所述铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO:5或6所示；
所述跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO:7或8所示；
所述共刺激信号分子胞内结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:9或10所示；和
所述免疫受体酪氨酸活化基序为的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列选自SEQ ID NO:13或14所示的多核苷酸序列或其互补序列。
本发明还提供一种核酸构建物，其含有本文所述的多核苷酸序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是表达载体。
在一个或多个实施方案中，所述表达载体是真核表达载体，优选含有选自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5和Ty的转座元件。
本发明还提供一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞含有本文所述的核酸构建物，或表达本文所述的嵌合抗原受体。
在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞；更优选地，所述宿主细胞为T细胞；更优选地，所述宿主细胞为原代培养T细胞。
本发明还提供本文所述的嵌合抗原受体和/或其编码序列和/或的核酸构建物在制备用于治疗或预防癌症的重组宿主细胞中的应用；以及本文所述的重组宿主细胞在制备治疗或预防癌症用的药物中的应用。
在一个或多个实施方案中，所述癌症为其癌细胞表面异常表达至少一个EGFR家族成员蛋白的癌症；优选地，所述癌症选自：头颈癌、肝癌、腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、胰腺癌或前列腺癌。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的重组宿主细胞和药学上可接受的载体。
本发明还提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，或为SEQ ID NO:3所示序列的互补序列。
本发明还提供一种融合蛋白，其由T1E与Herin通过接头序列连接形成；其中，所述T1E由人转录生长因子αN端的七个氨基酸和表皮生长因子C端的48个氨基酸组成；所述Herin是Herstatin第八内含子编码的79个氨基酸；所述接头选自柔性接头、刚性接头和体内裂解接头；优选为含有G和S的柔性接头，或含有EAAAK重复序列的刚性接头。
在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:15或16 的第23-171位氨基酸序列所示。
本发明还提供所述融合蛋白的编码序列或其互补序列；优选地，所述序列如SEQID NO:13或14第67-513位碱基序列所示。
附图说明
图1：为各种靶向ErbB受体家族的嵌合抗原受体基因结构模式图。
图2：RT-PCR检测eCAR T细胞和HerinCAR T细胞中CAR基因表达的copy 数结果。
图3：eCAR T细胞和HerinCAR T细胞的杀伤对比，包括人非小细胞肺癌 H23-LUC和人肺癌细胞H292-LUC。
图4：eCAR T细胞、EHCAR-GS T细胞、HECAR-GS T细胞、EHCAR-EK T细胞和HECAR-EKT细胞中CAR基因表达的拷贝数结果。
图5：eCAR T细胞、EHCAR-GS T细胞、HECAR-GS T细胞、EHCAR-EK T细胞和HECAR-EKT细胞的杀伤对比，包括人卵巢癌细胞SKOV3-LUC和人肝癌细胞 HCCLM3-LUC。
图6：每组柱从左到右分别显示Mock T细胞、、HECAR-GS T细胞、EHCAR-GS T细胞、HECAR-EK T细胞、EHCAR-EK T细胞和eCAR T细胞在EGFR抗原刺激下 IL-2，IL-4，IL-6,IL-10，TNF-α和IFN-γ细胞因子分泌的变化。
图7：eCAR T细胞、EHCAR-EK-28TIZ T细胞和HECAR-EK-28TIZ T细胞中 CAR基因表达的拷贝数结果。
图8：eCAR T细胞、EHCAR-EK-28TIZ T细胞和HECAR-EK-28TIZ T细胞的杀伤对比，包括人卵巢癌细胞SKOV3-LUC、人肝癌细胞HCCLM3-LUC和人非小细胞肺癌H23-LUC。
图9：每组柱从左到右分别显示Mock T细胞、eCAR T细胞、EHCAR-EK-28TIZ T细胞和HECAR-EK-28TIZ T细胞在EGFR抗原刺激下IL-2，IL-4，IL-6,IL-10，TNF-α和IFN-γ细胞因子分泌的变化。
图10：eCAR T细胞、EHCAR-EK-28TIZ T细胞和HECAR-EK-28TIZ T细胞、 Mock-T细胞和PBS空白对照，分别治疗小鼠后，不同天数的肿瘤细胞荧光值变化。
具体实施方式
下面对本发明涉及的部分术语进行解释。
在本发明中，术语“表达框”是指表达一个基因所需的完整元件，包括启动子和基因编码序列。
术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物(例如CAR，单链抗体，铰链区和跨膜区)的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
术语“Fc”即抗体的可结晶段(fragment crystallizable,Fc)，是指位于抗体分子"Y" 结构的柄部末端，包含抗体重链恒定区CH2和CH3结构域的肽段,是抗体与效应分子或者细胞相互作用的部位。
术语“共刺激分子”是指存在于抗原提呈细胞表面，能与Th细胞上的共刺激分子受体结合，产生协同刺激信号的分子。淋巴细胞的增殖不仅需要抗原的结合，还需要接受共刺激分子的信号。共刺激信号传递给T细胞主要是通过表达在抗原呈递细胞表面的共刺激分子CD80，CD86与T细胞表面的CD28分子结合。B细胞接受共刺激信号可以通过一般的病原体成分例如LPS，或者通过补体成分，或者通过激活了的抗原特异性的Th细胞表面的CD40L。
术语“接头”或铰链是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。示例性的接头包括含有G和/或S的接头，以及例如Furin 2A肽。
术语“特异性结合”是指抗体或者抗原结合片段与其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。“特异性识别”具有类似的含义。
术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。
术语“受试者”或者“患者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
术语“嵌合抗原受体”(CAR)是人工改造受体，能够将识别肿瘤细胞表面抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。CAR通常依次包含任选的信号肽、结合肿瘤细胞膜抗原的多肽如单链抗体、铰链区、跨膜区和胞内信号区。通常，结合肿瘤细胞膜抗原的多肽能够以中等亲和力结合肿瘤细胞广泛表达的膜抗原。结合肿瘤细胞膜抗原的多肽可以是天然多肽或人工合成多肽；优选地，人工合成多肽为单链抗体或Fab片段。
术语“单链抗体”(scFv)是指由抗体轻链可变区(VL区)氨基酸序列和重链可变区(VH区)氨基酸序列经铰链连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。在某些实施方案中，感兴趣单链抗体(scFv)来自感兴趣的抗体。感兴趣的抗体可以是人抗体，包括人鼠嵌合抗体和人源化抗体。抗体可以是分泌型或膜锚定型；优选地为膜锚定型。
本发明设计了一种新型靶向ErbB受体家族的CAR-T细胞，该CAR的抗原识别部位包括完整的T1E和Herin两种结构，二者通过接头连接。由于ErbB受体通常是以紧密结合的二聚体的形式发挥作用，机制较复杂，在实验初期，为了获得功能最好的靶向ErbB受体家族的CAR-T细胞，本发明人进行了各种条件的摸索，设计了一系列的CAR结构，包括分别单独表达T1E和Herin的CAR、同时表达T1E和Herin的 CAR且调换这两种片段的位置顺序进行比较、不同接头、不同跨膜铰链区和胞内共刺激区的比较，最终得到体外效果最好的两种CAR，一种从N端到C端依次含有CD8 信号肽、T1E、EAAAK接头、Herin、IgG4FcCH2CH3铰链区、CD28跨膜区、CD28 胞内结构域和CD3ζ酪氨酸活化基序，命名为EHCAR-EK-28TIZ；另一种从N端到C 端依次含有CD8信号肽、Herin、EAAAK接头、T1E、IgG4FcCH2CH3铰链区、CD28 跨膜区、CD28胞内结构域和CD3ζ酪氨酸活化基序，命名为HECAR-EK-28TIZ。体外实验表明，与其它结构的CAR-T细胞相比，EHCAR-EK-28TIZ和HECAR-EK-28TIZ 能具有识别抗原和细胞杀伤作用。
本文包括具有如下结构特征的嵌合抗原受体(CAR)：从N端到C端，依次含有任选的膜蛋白信号肽、通过接头连接的T1E肽段和Herin肽段(两种肽段的位置可调换)、长50个氨基酸残基以上的铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域。
信号肽是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链(长度5-30个氨基酸)，常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移(定位)的N-末端的氨基酸序列(有时不一定在N端)，它负责把蛋白质引导到细胞含不同膜结构的亚细胞器内。本文的信号肽为膜蛋白信号肽，可选自CD8信号肽、CD28信号肽和CD4信号肽。在优选的实施方案中，本发明使用CD8信号肽。示范性的CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第1-22位氨基酸残基所示；示范性的CD8信号肽的核苷酸序列可如SEQ ID NO：1所示。
T1E是一种嵌合的多肽，它由人转录生长因子α(TGFα)N端的七个氨基酸和表皮生长因子(EGF)C端的48个氨基酸组成，它和基于ErbB1的同源二聚体和异源二聚体都有很高的亲和力。此外，T1E还能有效结合ErbB2/3异源二聚体。本发明的T1E的氨基酸序列如SEQID NO:15第23-77位氨基酸残基所示；示例性的核苷酸序列可如SEQ ID NO：2所示。
Herstatin是Her2被选择性地剪切而产生的Her2截短的版本,其序列包括Her2 第Ⅰ及Ⅱ胞外区结构域的340个氨基酸和第八内含子编码的79个氨基酸,是一种可溶的Her2自身抑制因子。本发明的Herin是Herstatin第八内含子编码的79个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:15第93-171位氨基酸残基所示。在本发明的某些实施方案中，本发明将编码其氨基酸的密码子优化，获得SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
接头用于将不同的氨基酸序列连接起来，可起到稳定蛋白的空间结构、提高其生物学活性的作用。适用于本文的接头包括柔性接头、刚性接头和体内裂解接头。在某些实施方案中，本文使用的柔性接头为GS接头，即主要含有G和S的接头。示例性的GS接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：12；在某些实施方案中，本文使用刚性接头，如含有EAAAK重复序列的接头，本文也称为EAAAK接头。示例性的EAAAK接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第78-92位氨基酸残基，示例性的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
铰链区指免疫球蛋白重链CH1和CH2功能区之间的区域，该区富含脯氨酸，不形成α螺旋，易发生伸展及一定程度扭曲，有利于抗体的抗原结合部位与抗原表位间的互补性结合。适用于本文的铰链区可选自CD8的胞外铰链区、IgG1Fc CH2CH3铰链区、IgD铰链区、CD28的胞外铰链区、IgG4Fc CH2CH3铰链区和CD4的胞外铰链区的任意一种或多种，优选是长50个氨基酸残基以上、更优选长80个氨基酸残基以上的铰链区。在某些实施方案中，本文使用CD8α铰链区和IgG4Fc CH2CH3铰链区。示例性的CD8α铰链区的氨基酸序列可如SEQ ID NO:17所示，示例性的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。示例性的IgG4FcCH2CH3铰链区的氨基酸序列可如SEQ ID NO:15第172-399位氨基酸序列所示，其示例性的核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示。
跨膜区可选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137 跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种或多种。在某些实施方案中，本文使用的嵌合抗原受体的跨膜区为CD8跨膜区和CD28跨膜区。示例性的CD8跨膜区的氨基酸序列可如SEQ ID NO:18所示，示例性的核苷酸序列可如SEQ ID NO:7所示。示例性的CD28跨膜区的氨基酸序列可如SEQ ID NO:15第400-427位氨基酸残基所示，其示例性的核苷酸序列可如SEQ ID NO:8所示。
胞内共刺激信号域包括共刺激信号分子的胞内结构域，可选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、LCK、ICOS和DAP10的胞内结构域中的一种或多种。在某些实施方案中，使用CD28的胞内结构域或CD137的胞内结构域。示例性的 CD137胞内结构域的氨基酸序列可如SEQ ID NO:19所示，示例性的核苷酸序列可如 SEQ ID NO:9所示；示例性的CD28胞内结构域的氨基酸序列可如SEQ ID NO:15第 428-468位氨基酸残基所示，示例性的核苷酸序列可如SEQ ID NO:10所示。
胞内信号域可以是免疫受体酪氨酸活化基序，可选自CD3ζ和/或FcεRIγ的酪氨酸活化基序。示例性的CD3ζ酪氨酸活化基序的氨基酸序列可如SEQ ID NO:15第 469-580位氨基酸残基所示，示例性的核苷酸序列可如SEQ ID NO:11所示。
形成本文嵌合抗原受体的上述各部分，如CD8信号肽、T1E片段、Herin片段、通过接头连接的T1E片段和Herin片段、铰链区、跨膜区、共刺激信号分子胞内结构域以及免疫受体酪氨酸活化基序等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。
应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本文的CAR的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG， HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B， gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。
在某些实施方案中，本文的嵌合抗原受体从N端到C端依次含有任选的CD8信号肽、T1E、CD8铰链区、CD8跨膜区、CD137胞内结构域和CD3ζ酪氨酸活化基序。
在某些实施方案中，本文的嵌合抗原受体从N端到C端依次含有任选的CD8信号肽、Herin、IgG4FcCH2CH3铰链区、CD8跨膜区、CD137胞内结构域和CD3ζ酪氨酸活化基序。
在某些实施方案中，本文的嵌合抗原受体从N端到C端依次含有任选的CD8信号肽、Herin、GS接头、T1E、CD8铰链区、CD8跨膜区、CD137胞内结构域和CD3ζ酪氨酸活化基序。
在某些实施方案中，本文的嵌合抗原受体从N端到C端依次含有任选的CD8信号肽、T1E、GS接头、Herin、CD8铰链区、CD8跨膜区、CD137胞内结构域和CD3ζ酪氨酸活化基序。
在某些实施方案中，本文的嵌合抗原受体从N端到C端依次含有任选的CD8信号肽、Herin、EAAAK接头、T1E、CD8铰链区、CD8跨膜区、CD137胞内结构域和CD3ζ酪氨酸活化基序。
在某些实施方案中，本文的嵌合抗原受体从N端到C端依次含有任选的CD8信号肽、T1E、EAAAK接头、Herin、CD8铰链区、CD8跨膜区、CD137胞内结构域和CD3ζ酪氨酸活化基序。
在某些实施方案中，本文的嵌合抗原受体从N端到C端依次含有任选的CD8信号肽、Herin、EAAAK接头、T1E、IgG4FcCH2CH3铰链区、CD28跨膜区、CD28 胞内结构域和CD3ζ酪氨酸活化基序。
在某些实施方案中，本文的嵌合抗原受体从N端到C端依次含有任选的CD8信号肽、T1E、EAAAK接头、Herin、IgG4FcCH2CH3铰链区、CD28跨膜区、CD28 胞内结构域和CD3ζ酪氨酸活化基序。
优选地，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有任选的CD8信号肽、T1E、 EAAAK接头、Herin、IgG4FcCH2CH3铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域和 CD3ζ酪氨酸活化基序。示例性的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示第23-580位氨基酸残基所示，或者如SEQ ID NO:15所示；优选地，其核苷酸序列可核苷酸序列可如SEQ ID NO:13第67-1740位碱基序列所示，或者如SEQ ID NO:13 所示。
优选地，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有任选的CD8信号肽、Herin、 EAAAK接头、T1E、IgG4FcCH2CH3铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域和 CD3ζ酪氨酸活化基序。这类嵌合抗原受体的示例性氨基酸序列可SEQ ID NO:16所示第23-580位氨基酸残基所示，或者如SEQ ID NO:16所示；优选地，其核苷酸序列可如SEQ ID NO:14第67-1740位碱基序列所示，或者如SEQ ID NO:14所示。
本文还包括编码所述嵌合抗原受体的多核苷酸序列。本文的多核苷酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。
本文所述的多核苷酸序列通常可以用PCR扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
本文还包括核酸构建物，其含有本文所述的编码所述嵌合抗原受体的多核苷酸序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。在某些实施方案中，本发明的核酸构建物是表达框。
调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本文。
在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体。具体而言，可将本文CAR的编码序列克隆入许多类型的载体，例如这些类型的载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。载体可以是表达载体。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。
通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如，在某些实施方案中，本发明使用逆转录病毒载体，该逆转录病毒载体含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，本文所述 CAR的编码序列，以及任选的可选择的标记。
合适的启动子包括但不限于即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。在某些实施方案中，可使用 CN201510021408.1所公布的各种启动子序列，包括但不限于该申请SEQ ID NO:1所示的含mCMV增强子、hCMV增强子和EF1α启动子的CCEF启动子；SEQ ID NO:2所示的含CD3e增强子和EF1α启动子的TEF启动子；SEQ ID NO:3所示的含CD3e 增强子、mCMV增强子、hCMV增强子和EF1α启动子的TCEF启动子；SEQ ID NO:4 所示的含mCMV增强子、hCMV增强子和含内含子的EF1α启动子的CCEFI启动子； SEQ ID NO:5所示的含CD3e增强子和含内含子的EF1α启动子的TEFI启动子；以及 SEQ ID NO:5所示的含CD3e增强子、mCMV增强子、hCMV增强子和含内含子的 EF1α启动子的TCEFI启动子。本文将该申请的全部内容以引用的方式纳入本文。
可选择的标记包括可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从被病毒载体感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。有用的可选择标记基因包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因。
在某些实施方案中，本文的表达载体是整合载体，用于将本发明的CAR的编码序列整合入宿主细胞中。在某些实施方案中，本文的表达载体是真核表达载体，具体是转座子载体。在某些实施方案中，该转座子载体是含有选自piggybac、sleeping beauty、frogprince、Tn5或Ty的转座元件的真核表达载体。这类转座子载体含有相应转座子的5’反向末端重复序列(5’LTR)和相应转座子的3’反向末端重复序列(3’LTR)。在5’LTR和3’LTR之间是本发明的CAR的表达框，包括相应的启动子序列、CAR 的编码序列以及如polyA加尾信号序列。
例如，在某些实施方案中，本文的核酸构建物或表达载体从5’到3’依次含有转座子5’反向末端重复序列(5’LTR)、启动子、CD8信号肽编码序列、通过EAAAK-linker 连接的T1E片段和Herin片段编码序列、CD8铰链区编码序列或IgG4Fc CH2CH3铰链区编码序列、CD8跨膜区编码序列、CD28胞内结构域编码序列、CD3ζ酪氨酸活化基序编码序列、polyA加尾信号序列以及转座子3’反向末端重复序列(3’LTR)。所述转座子载体还可含有转座酶编码序列和控制转座酶编码序列表达的启动子。在某些实施方案中，所述真核表达载体是pNB328载体。
可采用常规的方法将本文的载体导入宿主细胞中，这些方法包括显微注射法、基因枪法、电穿孔法、病毒介导的转化法、电子轰击法、磷酸钙沉淀法等。在某些实施方案中，本文采用电穿孔法将本文的核酸构建物导入宿主细胞中。具体地，将重组的质粒经电转仪高压电的作用转到感兴趣的宿主细胞中。
适用于本文的宿主细胞可以是本领域周知的哺乳动物细胞，优选是T细胞，包括各种来源的各种类型的T细胞。例如，T细胞可来源于B细胞恶性肿瘤患者的PBMC。在某些实施方案中，T细胞为原代培养T细胞。
因此，本文也包括一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞含有本文所述嵌合抗原受体的编码序列或本文所述的核酸构建物；和/或所述重组宿主细胞表达本文所述的嵌合抗原受体。该重组宿主细胞可以是前文所述的转入了本文所述载体的宿主细胞。
用于本文嵌合抗原受体中的Herin片段及其优化的密码子序列也包括在本文的范围之内。更具体而言，本文包括其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的Herin片段。
用于本文嵌合抗原受体中的IgG4Fc CH2CH3铰链区及其编码序列也包括在本文的范围之内。更具体而言，本文包括其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的IgG4 Fc CH2CH3铰链区及其编码序列(包括简并序列)。
本文还包括前文提及的各种氨基酸序列、核酸序列、重组宿主细胞等的用途。具体而言，本文包括所述IgG4 Fc CH2CH3铰链区和/或其编码序列在制备本文所述嵌合抗原受体和/或其编码序列中的用途；所述嵌合抗原受体的编码序列在制备重组表达载体中的用途；所述核酸构建物在制备重组宿主细胞中的用途；以及所述重组宿主细胞在制备治疗或预防癌症用的药物中的用途。在某些实施方案中，本文包括所述IgG4 Fc CH2CH3铰链区和/或其编码序列、所述嵌合抗原受体和/或其编码序列以及所述核酸构建物在制备用于治疗或预防癌症的重组宿主细胞中的应用。
适用于本文所述CAR或其表达细胞进行治疗或预防的癌症优选至少一个EGFR 家族蛋白阳性的癌症，具体包括癌细胞表面异常表达ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4 的癌症。具体而言，这类癌症可选自：头颈癌、肝癌、腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、胰腺癌或前列腺癌。
在某些实施方案中，本文的嵌合抗原受体对同时表达ErbB1和ErbB2的肿瘤细胞如卵巢癌和肺癌，以及单独表达ErbB1的肿瘤细胞如肝癌，均具有优异的杀伤效果，因此，本文的这类CAR或其表达细胞可特别用于治疗至少一个EGFR家族成员阳性的癌症。
本文还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有本文所述的重组表达载体。试剂盒还可含有适用于将所述重组表达载体转入细胞中的试剂，以及任选的指导本领域技术人员将所述重组表达载体转入细胞的说明书。
本文还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的重组宿主细胞和药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可以是本领域周知的适用于细胞给药的载体，包括但不限于pNB328载体。
治疗或预防癌症的方法也包括在本文的范围之内，所述方法包括将本文所述的重组宿主细胞或药物组合物给予有需要的个体的步骤。给予的方法可以是细胞治疗中常用的方法。给予的剂量可根据病患性别、年龄、所患疾病、身体状况等因素加以考虑。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
实施例1：重组质粒pNB328-eCAR、pNB328-HerinCAR、pNB328-EHCAR-GS、 pNB328-HECAR-GS、pNB328-EHCAR-EK、pNB328-HECAR-EK、 pNB328-EHCAR-EK-28TIZ和pNB328-HECAR-EK-28TIZ的构建
委托上海捷瑞生物公司合成eCAR基因、HerinCAR基因、EHCAR-GS基因、 HECAR-GS基因、EHCAR-EK基因、HECAR-EK基因、EHCAR-EK-28TIZ基因和 HECAR-EK-28TIZ基因，结构模式如图1所示。将各基因装入用EcoR1+SalI双酶切的pNB328载体中(pNB328载体见CN201510812654.9，含EF1α启动子)，构建质粒，分别命名为pNB328-eCAR、pNB328-HerinCAR、pNB328-EHCAR-GS、 pNB328-HECAR-GS、pNB328-EHCAR-EK、pNB328-HECAR-EK、 pNB328-EHCAR-EK-28TIZ和pNB328-HECAR-EK-28TIZ。
结构模式图中的CD8信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；T1E的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；Herin的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；EAAAK接头 (EK-linker)的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；GS接头(GS-linker)的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；CD8α铰链跨膜区(CD8EC)核苷酸序列如SEQ ID NO:5 所示；突变型IgG4Fc CH2CH3铰链跨膜区核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；CD8跨膜区(CD8TM)的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；CD28跨膜区(CD28TM)的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；CD137胞内共刺激信号结构区域(CD137IC)核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；CD28胞内共刺激信号结构区域(CD28IC)核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；CD3ζ胞内信号域核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。各结构模式图中未示出启动子序列和polyA加尾信号序列，其分别位于5’LTR和信号肽序列之间以及3’LTR之前。
实施例2：靶向ErbB受体家族的嵌合抗原受体修饰T细胞构建
外周血单核细胞(PBMCs)由上海细胞治疗生产中心分离获得。将PBMC贴壁培养2-4h，其中未贴壁的悬浮细胞即为初始T细胞，将悬浮细胞收集到15ml离心管中， 1200rmp离心3min，弃上清，加入生理盐水，1200rmp离心3min，弃生理盐水，并重复此步骤；取9个1.5ml离心管，每管加入5×106个细胞，编号a、b、c、d、e、f、 g、h和i，1200rmp离心3min，弃上清，取电转试剂盒(来自Lonza公司)，各管按比例加入电转试剂共100ul，a、b、c、d、e、f、g和h管分别加入6ug构建好的重组质粒pNB328-eCAR、pNB328-HerinCAR、pNB328-EHCAR-GS、pNB328-HECAR-GS、 pNB328-EHCAR-EK、pNB328-HECAR-EK、pNB328-EHCAR-EK-28TIZ和 pNB328-HECAR-EK-28TIZ，重悬混匀细胞，i管加入6ug对照质粒(即pNB328空质粒，构建Mock T细胞)；将混合液转移至电转杯中，放入电转仪，选取所需程序，进行电击；使用试剂盒中的微量吸管将电转好的细胞悬液转移到加好培液的六孔板中 (含2％FBS的AIM-Ⅴ培液)，混匀，置于37℃，5％CO2培养箱培养，六小时后加入刺激因子IL-2和anti-CD3/anti-CD28，37℃，5％CO2培养3～4天，观察T细胞的生长情况，获得表达eCAR基因、HerinCAR基因、EHCAR-GS基因、HECAR-GS 基因、EHCAR-EK基因、HECAR-EK基因、EHCAR-EK-28TIZ基因和 HECAR-EK-28TIZ基因的T细胞。
实施例3：RT-PCR检测eCAR和HerinCAR表达的copy数比较
将实施例2中电转后第10天的Mock T细胞、eCAR T细胞和HerinCAR T细胞，按照1×106细胞数目收集细胞沉淀，PBS清洗细胞沉淀1遍，使用gDNA提取试剂盒 (9765,Takara)抽提细胞基因组DNA(gDNA)。实验步骤参照试剂盒内附带的说明书，使用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测基因组DNA中CAR基因(检测CD137) 插入的拷贝数。反应程序为：50℃，2min→95℃,10min→95℃,15s→60℃,1min，40 个循环。得到的eCAR和HerinCAR基因组的CT值及Actin的CT值根据相应的公式计算出绝对拷贝数含量。结果如图2所示。
实施例4：eCAR和HerinCAR的杀伤功能对比
选取MHC class I分型匹配的效应细胞与靶细胞，应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测实施例2获得的eCAR-T和HerinCAR-T的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μl DMEM或1640培养液，放入仪器中，选择步骤1，调零；
(2)靶细胞铺板：人非小细胞肺癌H23-LUC和人肺癌细胞H292-LUC(购买于美国菌种保藏中心ATCC)按每孔104个细胞/50μl铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始步骤2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养24h后，暂停步骤2，加入效应细胞，每孔50μl，效靶比分别设置为4:1，以转入pNB328空载体的Mock T细胞作为对照，开始步骤3，继续共培养24h后，观察细胞增殖曲线；
结果如图3所示。单独表达T1E片段的CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用明显强于单独表达Herin的CAR-T细胞以及对照T细胞。
实施例5：RT-PCR检测eCAR、EHCAR-GS、HECAR-GS、EHCAR-EK和 HECAR-EK表达的拷贝数比较
将实施例2中电转后第10天的Mock T细胞、eCAR T、EHCAR-GS、HECAR-GS、 EHCAR-EK和HECAR-EK细胞，按照1×106细胞数目收集细胞沉淀，PBS清洗细胞沉淀1遍，按照实施例3的方法，检测检测基因组DNA中CAR基因(检测CD137) 插入的拷贝数。结果如图4所示。
实施例6：eCAR、EHCAR-GS、HECAR-GS、EHCAR-EK和HECAR-EK的杀伤功能对比
按照实施例4的方法，测试实施例2获得的eCAR T细胞、EHCAR-GS T细胞、 HECAR-GS T细胞、EHCAR-EK T细胞和HECAR-EK T细胞体外杀伤活性的测试，所用的靶细胞分别为人卵巢癌细胞SKOV3-LUC和人肝癌细胞HCCLM3-LUC。
结果如图5所示。在使用相同的CD8α铰链跨膜区、CD8跨膜区和CD137胞内共刺激信号结构区域的情况下，单独表达T1E片段的eCAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用明显强于同时表达T1E片段和Herin片段的HECAR-GS和HECAR-EK细胞(Herin片段在前，T1E片段在后)以及EHCAR-GS和EHCAR-EK细胞(T1E片段在前，Herin片段在后)以及对照T细胞；此外，使用EAAAK接头的HECAR-EK 和EHCAR-EK细胞的杀伤作用明显强于使用GS接头的HECAR-GS和EHCAR-GS 细胞，说明用EAAAK接头连接T1E和Herin，能更好的提高融合蛋白的生物活性，增强其功能。
实施例7：eCAR T细胞、EHCAR-GS T细胞、HECAR-GS T细胞、EHCAR-EK T细胞和HECAR-EK T细胞在EGFR抗原的特异性刺激下细胞因子释放对比
用5ug/ml的EGFR抗原包被96孔板，4℃包被过夜，PBS清洗3遍，加入1×105 (100ul体积)的实施例2制备得到的eCAR T细胞、EHCAR-GS T细胞、HECAR-GS T细胞、EHCAR-EK T细胞和HECAR-EK T细胞以及对照的Mock T细胞(转入 pNB328空载体)，培养24h后收集细胞上清。用BDTMCBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II检测这四种T细胞受EGFR抗原刺激后细胞因子的分泌情况，具体步骤如下：
(1)混合人的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF、IFN-γ捕获磁珠，涡旋振荡混匀捕获磁珠，每管加入50ul混匀后的捕获磁珠；
(2)加入50ul人的Th1/Th2细胞因子标准品(倍比稀释5000pg/ml、2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、312.5pg/ml、156pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、20pg/ml、0pg/ml) 和50ul的待测样品(经稀释液2倍稀释)。
(3)每管加入50ul的人的Th1/Th2-II-PE的检测抗体；
(4)室温避光孵育3h；
(5)每管加入1ml的洗涤缓冲液，200离心5min，弃上清；
(6)每管加入300ul的洗涤缓冲液重悬细胞，并转移至流式管中，用流式细胞仪检测荧光值。
结果如图6所示，eCAR-T细胞的IL-2和IFN-γ分泌量显著高于EHCAR-GS T 细胞、HECAR-GS T细胞、EHCAR-EK T细胞和HECAR-EK T细胞；EHCAR-EK T 细胞和HECAR-EK T细胞的IL-2和IFN-γ分泌量显著高于EHCAR-GS T细胞和 HECAR-GS T细胞。
实施例8：RT-PCR检测eCAR T细胞、EHCAR-EK-28TIZ T细胞和HECAR- EK-28TIZ T细胞表达的拷贝数比较
将实施例2中电转后第11天的Mock T细胞、eCAR-T细胞、EHCAR-EK-28TIZT 细胞和HECAR-EK-28TIZ T细胞，按照1×106细胞数目收集细胞沉淀，PBS清洗细胞沉淀1遍，按照实施例3的方法检测检测基因组DNA中CAR基因插入的拷贝数， eCAR-T细胞检测CD137，EHCAR-EK-28TIZ细胞和HECAR-EK-28TIZ细胞检测 CD28。结果如图7所示。
实施例9：eCAR T细胞、EHCAR-EK-28TIZ T细胞和HECAR-EK-28TIZ T 细胞的杀伤功能对比
按照实施例4的方法，进行eCAR T细胞、EHCAR-EK-28TIZ T细胞和HECAR- EK-28TIZ T细胞体外杀伤活性的测试，所用的靶细胞分别为人卵巢癌细胞 SKOV3-LUC、人肝癌细胞HCCLM3-LUC和人非小细胞肺癌细胞。
结果如图8所示，将EHCAR-EK和HECAR-EK的CD8α铰链跨膜区替换为突变型IgG4FcCH2CH3，CD8跨膜区替换为CD28，CD137胞内共刺激信号结构区域替换为CD28胞内共刺激信号结构区域后，即改造成为EHCAR-EK-28TIZ和HECAR- EK-28TIZ，它们的杀伤能力明显高于单独表达T1E片段的eCAR-T细胞。
实施例10：eCAR T细胞、EHCAR-EK-28TIZ T细胞和HECAR-EK-28TIZ T 细胞在EGFR抗原的特异性刺激下细胞因子释放对比
用5ug/ml的EGFR抗原包被96孔板，4℃包被过夜，PBS清洗3遍，加入1×105 (100ul体积)的实施例2制备得到的eCAR T细胞、EHCAR-EK-28TIZ T细胞和 HECAR-EK-28TIZ T细胞以及对照的Mock T细胞(转入pNB328空载体)，培养24h 后收集细胞上清。按照实施例7的方法，检测这四种T细胞受EGFR抗原刺激后细胞因子的分泌情况。
结果如图9所示，eCAR T细胞、EHCAR-EK-28TIZ T细胞和HECAR-EK-28TIZT 细胞的IL-2和IFN-γ分泌量相较于Mock T细胞，都有明显提高，但EHCAR-EK-28TIZ T细胞和HECAR-EK-28TIZ T细胞显著高于eCAR T细胞。
实施例11：eCAR T细胞、EHCAR-EK-28TIZ T细胞和HECAR-EK-28TIZ T 细胞体内抗肿瘤作用。
购买4～6周龄NSG小鼠20只，平均分为5组，每组4只，接种肝癌细胞株 HCCLM3-LUC，每只1×107，成瘤10天后，尾静脉分别注射PBS(100ul)和实施例2获得的Mock-T、eCART细胞、EHCAR-EK-28TIZ T细胞和HECAR-EK-28TIZ T细胞(1×107个细胞/只)，观察记录小鼠体内肿瘤荧光变化。
结果如图10所示，PBS和Mock-T细胞对肿瘤模型没有治疗效果，eCAR T细胞、EHCAR-EK-28TIZ T细胞和HECAR-EK-28TIZ T细胞都有很好的抗肿瘤效果，且 EHCAR-EK-28TIZ T细胞和HECAR-EK-28TIZ T细胞效果更好。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述。本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 上海细胞治疗研究院
上海细胞治疗工程技术研究中心集团有限公司
<120> 靶向ErbB受体家族的嵌合抗原受体修饰T细胞及其用途
<130> 17A012
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgagc 66
<210> 2
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtggtgtccc attttaatga ctgtcccctg tcccacgatg ggtactgcct ccatgatggt 60
gtgtgcatgt atattgaagc attggacaag tatgcatgca actgtgttgt tggctacatc 120
ggggagcgat gtcagtaccg agacctgaag tggtgggaac tgcgc 165
<210> 3
<211> 237
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcacccaca gcctgccccc ccgccccgcc gccgtgcccg tgcccctgcg catgcagccc 60
ggccccgccc accccgtgct gagcttcctg cgccccagct gggacctggt gagcgccttc 120
tacagcctgc ccctggcccc cctgagcccc accagcgtgc ccatcagccc cgtgagcgtg 180
ggccgcggcc ccgaccccga cgcccacgtg gccgtggacc tgagccgcta cgagggc 237
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaagctgccg ctaaggaggc cgcagccaaa gaggccgctg caaag 45
<210> 5
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttcgtgccgg tcttcctgcc agcgaagccc accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 60
ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 120
gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgat 165
<210> 6
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcacctcccg tggccggacc atcagtcttc ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc 60
atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc 120
gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 180
cgggaggagc agttccagag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 240
gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc 300
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag agccacaggt gtacaccctg 360
cccccatccc aggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 420
ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 480
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caggctaacc 540
gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 600
ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc tccctgtctc tgggtaaa 648
<210> 7
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atctacatct gggcgcccct ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gcaaccac 78
<210> 8
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cccttttggg tgctggtggt ggttggtgga gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca 60
gtggccttta ttattttctg ggtg 84
<210> 9
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaacggggca gaaagaagct cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 10
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 11
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggcagc ggcggtggcg ggtcg 45
<210> 13
<211> 1740
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgagcgtgg tgtcccattt taatgactgt cccctgtccc acgatgggta ctgcctccat 120
gatggtgtgt gcatgtatat tgaagcattg gacaagtatg catgcaactg tgttgttggc 180
tacatcgggg agcgatgtca gtaccgagac ctgaagtggt gggaactgcg cgaagctgcc 240
gctaaggagg ccgcagccaa agaggccgct gcaaagggca cccacagcct gcccccccgc 300
cccgccgccg tgcccgtgcc cctgcgcatg cagcccggcc ccgcccaccc cgtgctgagc 360
ttcctgcgcc ccagctggga cctggtgagc gccttctaca gcctgcccct ggcccccctg 420
agccccacca gcgtgcccat cagccccgtg agcgtgggcc gcggccccga ccccgacgcc 480
cacgtggccg tggacctgag ccgctacgag ggcgagtcca aatatggtcc cccatgccca 540
ccatgcccag cacctcccgt ggccggacca tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag 600
gacactctca tgatctcccg gacccctgag gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag 660
gaagaccccg aggtccagtt caactggtac gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag 720
acaaagccgc gggaggagca gttccagagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 780
ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc 840
ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg 900
tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 960
gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1020
aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 1080
aggctaaccg tggacaagag caggtggcag gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg 1140
catgaggctc tgcacaacca ctacacacag aagagcctct ccctgtctct gggtaaaccc 1200
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 1260
gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 1320
aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 1380
cgcgacttcg cagcctatcg ctccagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 1440
taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 1500
gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag 1560
aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 1620
gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 1680
ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1740
<210> 14
<211> 1740
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgagcggca cccacagcct gcccccccgc cccgccgccg tgcccgtgcc cctgcgcatg 120
cagcccggcc ccgcccaccc cgtgctgagc ttcctgcgcc ccagctggga cctggtgagc 180
gccttctaca gcctgcccct ggcccccctg agccccacca gcgtgcccat cagccccgtg 240
agcgtgggcc gcggccccga ccccgacgcc cacgtggccg tggacctgag ccgctacgag 300
ggcgaagctg ccgctaagga ggccgcagcc aaagaggccg ctgcaaaggt ggtgtcccat 360
tttaatgact gtcccctgtc ccacgatggg tactgcctcc atgatggtgt gtgcatgtat 420
attgaagcat tggacaagta tgcatgcaac tgtgttgttg gctacatcgg ggagcgatgt 480
cagtaccgag acctgaagtg gtgggaactg cgcgagtcca aatatggtcc cccatgccca 540
ccatgcccag cacctcccgt ggccggacca tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag 600
gacactctca tgatctcccg gacccctgag gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag 660
gaagaccccg aggtccagtt caactggtac gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag 720
acaaagccgc gggaggagca gttccagagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 780
ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc 840
ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg 900
tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 960
gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1020
aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 1080
aggctaaccg tggacaagag caggtggcag gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg 1140
catgaggctc tgcacaacca ctacacacag aagagcctct ccctgtctct gggtaaaccc 1200
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 1260
gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 1320
aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 1380
cgcgacttcg cagcctatcg ctccagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 1440
taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 1500
gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag 1560
aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 1620
gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 1680
ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1740
<210> 15
<211> 580
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Val Val Ser His Phe Asn Asp Cys Pro Leu
20 25 30
Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu
35 40 45
Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu
50 55 60
Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg Glu Ala Ala
65 70 75 80
Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Gly Thr His Ser
85 90 95
Leu Pro Pro Arg Pro Ala Ala Val Pro Val Pro Leu Arg Met Gln Pro
100 105 110
Gly Pro Ala His Pro Val Leu Ser Phe Leu Arg Pro Ser Trp Asp Leu
115 120 125
Val Ser Ala Phe Tyr Ser Leu Pro Leu Ala Pro Leu Ser Pro Thr Ser
130 135 140
Val Pro Ile Ser Pro Val Ser Val Gly Arg Gly Pro Asp Pro Asp Ala
145 150 155 160
His Val Ala Val Asp Leu Ser Arg Tyr Glu Gly Glu Ser Lys Tyr Gly
165 170 175
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
180 185 190
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
195 200 205
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
210 215 220
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
225 230 235 240
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
245 250 255
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
260 265 270
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
275 280 285
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
290 295 300
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
305 310 315 320
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
325 330 335
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
340 345 350
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
355 360 365
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
370 375 380
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Pro
385 390 395 400
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
405 410 415
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
420 425 430
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
435 440 445
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
450 455 460
Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
465 470 475 480
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
485 490 495
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
500 505 510
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
515 520 525
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
530 535 540
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
545 550 555 560
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
565 570 575
Leu Pro Pro Arg
580
<210> 16
<211> 580
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Gly Thr His Ser Leu Pro Pro Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Val Pro Val Pro Leu Arg Met Gln Pro Gly Pro Ala His Pro Val
35 40 45
Leu Ser Phe Leu Arg Pro Ser Trp Asp Leu Val Ser Ala Phe Tyr Ser
50 55 60
Leu Pro Leu Ala Pro Leu Ser Pro Thr Ser Val Pro Ile Ser Pro Val
65 70 75 80
Ser Val Gly Arg Gly Pro Asp Pro Asp Ala His Val Ala Val Asp Leu
85 90 95
Ser Arg Tyr Glu Gly Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
100 105 110
Ala Ala Ala Lys Val Val Ser His Phe Asn Asp Cys Pro Leu Ser His
115 120 125
Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu
130 135 140
Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys
145 150 155 160
Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg Glu Ser Lys Tyr Gly
165 170 175
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
180 185 190
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
195 200 205
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
210 215 220
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
225 230 235 240
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
245 250 255
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
260 265 270
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
275 280 285
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
290 295 300
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
305 310 315 320
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
325 330 335
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
340 345 350
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
355 360 365
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
370 375 380
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Pro
385 390 395 400
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
405 410 415
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
420 425 430
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
435 440 445
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
450 455 460
Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
465 470 475 480
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
485 490 495
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
500 505 510
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
515 520 525
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
530 535 540
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
545 550 555 560
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
565 570 575
Leu Pro Pro Arg
580
<210> 17
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
35 40 45
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
50 55
<210> 18
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 19
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40

Claims (22)

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，从N端到C端，依次包括通过接头连接的T1E和Herin、长50个氨基酸残基以上的铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域，其中，
所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有T1E、EAAAK重复序列、Herin、IgG4 Fc CH2CH3铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域和CD3ζ酪氨酸活化基序，或者
所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有Herin、EAAAK重复序列、T1E、IgG4 Fc CH2CH3铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域和CD3ζ酪氨酸活化基序，
所述T1E的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第23-77位氨基酸残基所示；
所述Herin的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第93-171位氨基酸序列所示；
所述IgG4 FcCH2CH3铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第172-399位氨基酸序列所示。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，
所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有CD8信号肽、T1E、EAAAK重复序列、Herin、IgG4Fc CH2CH3铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域和CD3ζ酪氨酸活化基序，或者
所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有CD8信号肽、Herin、EAAAK重复序列、T1E、IgG4Fc CH2CH3铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域和CD3ζ酪氨酸活化基序。
3.如权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体具有以下一个或多个特征：
所述CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第1-22位氨基酸残基所示；
所述EAAAK重复序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第78-92位氨基酸残基所示；
所述CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第400-427位氨基酸残基所示；
所述CD28胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第428-468位氨基酸残基所示；和
所述CD3ζ酪氨酸活化基序的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第469-580位氨基酸残基所示。
4.如权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:15或16所示。
5.一种多核苷酸，具有：
（1）编码权利要求1－4中任一项所述嵌合抗原受体的多核苷酸序列；和
（2）（1）所述多核苷酸序列的互补序列。
6.如权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，所述嵌合抗原受体的编码序列具有特征中的一项或多项：
所述T1E的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述Herin的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
所述铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO: 6所示；
所述跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO: 8所示；
所述CD28胞内结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示；和
所述CD3ζ酪氨酸活化基序的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
7.如权利要求5或6所述的多核苷酸，其特征在于，所述嵌合抗原受体还具有信号肽，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
8.如权利要求5或6所述的多核苷酸，其特征在于，所述编码嵌合抗原受体的多核苷酸序列如SEQ ID NO:13或14所示。
9.一种核酸构建物，其含有权利要求5-8中任一项所述的多核苷酸。
10.如权利要求9所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物是表达载体。
11.如权利要求10所述的核酸构建物，其特征在于，所述表达载体是真核表达载体。
12.如权利要求11所述的核酸构建物，其特征在于，所述表达载体含有选自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5和Ty的转座元件。
13.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞含有权利要求9-12中任一项所述的核酸构建物，或表达权利要求1－4中任一项所述的嵌合抗原受体。
14.如权利要求13所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞为哺乳动物细胞。
15.如权利要求14所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞为T细胞。
16.如权利要求15所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞为原代培养T细胞。
17.权利要求1－4中任一项所述的嵌合抗原受体和/或其编码序列和/或权利要求9-12中任一项所述的核酸构建物在制备用于治疗或预防癌症的重组宿主细胞中的应用。
18.权利要求13-16中任一项所述的重组宿主细胞在制备治疗或预防癌症用的药物中的应用。
19.如权利要求17或18所述的应用，其特征在于，所述癌症为其癌细胞表面异常表达至少一个EGFR家族成员蛋白的癌症。
20.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述癌症选自：头颈癌、肝癌、腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌或食管癌。
21.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述癌症选自：乳腺癌、胰腺癌或前列腺癌。
22.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求13-16中任一项所述的重组宿主细胞和药学上可接受的载体。
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