CN106117366A - 一种cd19特异性嵌合抗原受体及其编码基因、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种CD19特异性嵌合抗原受体，由人抗CD19的单链抗体、人抗体IgG4的CH2CH3、CD28的跨膜区和胞内信号结构、CD137的胞内信号结构、及CD3ζ的胞内信号结构串联构成。本发明还公开了上述嵌合抗原受体的氨基酸序列和核酸序列。本发明还公开了上述嵌合抗原受体在制备治疗CD19相关肿瘤药物中的应用，即修饰T淋巴细胞，修饰后的淋巴细胞可用于CD19相关肿瘤的治疗。

Description

一种CD19特异性嵌合抗原受体及其编码基因、应用
技术领域
本发明涉及细胞免疫技术领域，尤其涉及一种CD19特异性嵌合抗原受体及其编码基因、应用。
背景技术
B淋巴细胞肿瘤是起源于B细胞的恶性血液系统疾病，主要包括B细胞源行的急性淋巴系统白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)及大部分的慢性淋巴系统白血病(CLL)。其中ALL的发病率最高，并且有逐年增高的趋势。目前的治疗主要通过全身化疗和造血干细胞的移植。大剂量的放化疗，毒副作用强，患者耐受性差，免疫力大大降低，虽然可以缓解，但是复发率高。而且造血干细胞的来源稀缺，配型成功率低。
嵌合抗原受体修饰的T细胞(chimeric antigen receptor；CAR-T)治疗是利用基因工程技术，借助逆转录病毒或者逆转病毒载体或者mRNA转导，使得T细胞获得可以识别肿瘤表面抗原，杀伤肿瘤的嵌合抗原受体。CAR-T治疗相比于传统的治疗方法展现出巨大的优势，具体体现在杀伤肿瘤精准性高，CAR-T细胞治疗采用抗原抗体特异性结合的技术，只有肿瘤表面抗原表达的肿瘤细胞被杀伤，对正常细胞的伤害小；杀伤肿瘤范围广泛，只要表达肿瘤相关抗原，CAR-T细胞就能清除，对于转移性肿瘤、复发性肿瘤均有效；对于患者而言避免了放化疗的痛苦，恢复健康迅速。
CD19属于Ig超家族成员，分子量为95kDa，是一种穿膜糖蛋白，分布于B细胞表面。CD19的相应的生理性配体尚不清楚。研究表明，CD19与B细胞活化和信号的转导有关：(1)CD19单克隆抗体可诱导胞浆内多种底物迅速发生磷酸化；(2)CD19胞浆区可被一种丝氨酸激酶催化而发生磷酸化；(3)CD19胞浆区与src激酶家族Lyn稳定的结合。最近提出一个B细胞最佳信号放大的双重抗原结合模型，这个模式认为是BCR/Ig&alpha；Ig&beta与抗原结合后，使CD19与CD21相互接近形成复合物，外来抗原及包裹抗原的C3dg分别被BCR和CD21所结合，后者激活CD19/CD21复合物中与CD19紧密结合的src家族Lyn，而使CD19分子胞浆内酪氨酸发生磷酸化。CD19广泛表达在多种B细胞恶性肿瘤细胞表面，在正常B细胞，滤泡性树突状细胞表面也有表达，而在其他组织和血液细胞没有表达，血液中也未曾检测到CD19可溶性蛋白的存在。因此它被认为是CAR-T治疗B细胞肿瘤的理想靶点。临床试验结果显示，CD19CAR-T对急性B-淋巴细胞白血病(B-ALL)的治愈率已经达到了90％。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种CD19特异性嵌合抗原受体。
本发明的目的还在于提供编码上述嵌合抗原受体的基因。
本发明的目的还在于提供上述嵌合抗原受体的应用。
为了实现上述目的，本发明提出的一种CD19特异性嵌合抗原受体，包括胞外抗原结合区、铰链区和胞内信号转导区，所述铰链区为人抗体IgG4的CH2CH3。
优选地，所述人抗体IgG4的CH2CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述胞外抗原结合区为人抗CD19的单链抗体。
优选地，所述人抗CD19的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；优选地，所述人抗CD19的单链抗体的重链和轻链分子之间有个连接肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述嵌合抗原受体由人抗CD19的单链抗体、人抗体IgG4的CH2CH3、CD28的跨膜区和胞内信号结构、CD137的胞内信号结构、及CD3ζ的胞内信号结构串联构成。
优选地，所述嵌合抗原受体的氨基末端含有一个信号肽，其氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
优选地，所述嵌合抗原受体以CD28的跨膜区和胞内信号结构、CD137胞内信号结构、CD3ζ的胞内信号结构串联构成的结构域为T细胞共刺激信号传导结构；优选地，所述T细胞共刺激信号传导结构的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO.5所示。
优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明提出的编码上述CD19特异性嵌合抗原受体的基因，其核酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明提出的上述CD19特异性嵌合抗原受体在制备治疗CD19相关肿瘤药物中的应用。
本发明根据1991年发表的鼠源抗人CD19抗体克隆FMC63的重链和轻链的可变区序列(Zola,Immunol cell boil.1991,Dec 69)，经过密码子优化，基因合成抗CD19的ScFv序列，并将合成ScFv克隆到pSFG-CH2CH3-CD28-CD137-CD3ζ中，即构建成本发明的CD19-scFv-CH2CH3-CD28-CD137-CD3ζ嵌合抗原受体。
美国宾州大学Carl June在2010年申请了CD19-CAR专利(WO2012079000)，同样利用了抗CD19抗体FMC63的抗体序列，但其CAR结构与本发明中序列不同，WO2012079000中CAR(1)使用了慢病毒系统来组建CAR，本发明中使用了逆转病毒；(2)WO2012079000包含了CD19scFv序列，CD8a序列作为链接序列和跨膜序列，CD137胞内信号序列和CD3ζ胞内序列。本发明中使用了人的IgG4的CH2CH3作为链接序列，以及CD28跨膜序列和CD28胞内序列。利用CH2CH3作为链接区的优势在于CH2CH3有利于形成二聚体，可以提高CD19scFv对CD19分子的亲和力。
同时其他发表文章中已经构建了利用人IgG1的CH2CH3的CD19-CAR分子，IgG1的CH2CH3可以引起潜在的ADCC作用，会造成细胞因子风暴，产生副作用，而本发明利用了IgG4的CH2CH3，通常不会造成细胞因子风暴。此外，本发明中的CAR包含了CD28的胞内刺激信号，因此本发明中的CAR提供了两个共刺激信号CD28和CD137，大大提高了CAR的杀肿瘤作用。
本发明利用嵌合抗原受体与逆转病毒包装质粒PeqPam3及RD114env在293T细胞包装成逆转病毒，利用该病毒感染T淋巴细胞。利用Elisa检测CAR-T细胞在抗原刺激下IFN-γ的分泌及通过流式检测对CD19阳性的肿瘤细胞的杀伤作用。
本发明公布CD19特异性的嵌合抗原受体的结构，和体外感染T淋巴细胞的技术。修饰后的T淋巴细胞释放IFN-γ等杀伤肿瘤细胞。CD19特异性的嵌合抗原受体可以用于CD19相关肿瘤的靶向治疗。
附图说明
图1为本发明提出的CD19特异性嵌合抗原受体的结构示意图。
图2为本发明所得CD19-scFv的PCR产物的电泳图。
图3为本发明所得CD19特异性嵌合抗原受体的电泳图。
图4为流式检测CD19特异性CAR-T细胞中CAR分子的表达的结果图。
图5为流式细胞分析肿瘤细胞和T细胞的比例结果图。
图6为本发明所得嵌合抗原受体CD19特异性CAR-T细胞与淋巴瘤细胞的MTT检测结果图。
图7为ELISA检测本发明所得CAR-T细胞在受到CD19刺激后IFN-γ和IL2的表达结果图。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1：CD19特异性嵌合抗原受体逆转病毒载体的构建
本发明提出的一种CD19特异性嵌合抗原受体，由人抗CD19的单链抗体、人抗体IgG4的CH2CH3、CD28的跨膜区和胞内信号结构、CD137的胞内信号结构、及CD3ζ的胞内信号结构串联构成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
1、利用1991年发表的FMC62鼠源抗人CD19单克隆抗体序列，选出VH和VL的序列，用于设计CAR载体中的scFv序列，采用金斯瑞生物技术公司OptimumGeneTM基因设计软件对密码子进行进一步优化，在优化的序列两端分别加上NcoI，BAMHI酶切位点，优化后的序列由南京金斯瑞生物技术公司完成基因合成，合成后的序列克隆在pCDNA3载体，质粒命名为CD19-scFv-pCDNA3。
其中插入的CD19-scFv序列部分可以经由PCR进行扩增得到，接着进行检测，如图2所示，其中条带1为CD19-scFv的PCR产物，700bp左右；条带2为100bp的条带参照。
2、CD19-scFv-pCDNA3质粒用限制性内切酶NcoI和BAMHI酶切，酶切体系如下：2μgCD19-scFv-pCDNA3、1μL NcoI、1μL BamHI、2μL 10×酶切缓冲液，用水补到20μL，37℃水浴中过夜，酶切产物用1％的琼脂糖凝胶电泳，在紫外下切取目的条带，采用DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)回收目的片段；用同样的方法NcoI和BAMHI酶切pSFG-CH2CH3-CD28-CD137-CD3ζ载体，用琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。将回收后的CD19-ScFv与酶切载体通过T4DNA连接酶连接，反应体系如下：2μL CD19-ScFv、2μL载体酶切产物、1μL 10×连接缓冲液，1μL连接酶，用水补到10μL，16度水浴中过夜。取连接产物加入到DH5α感受态中[参考《分子克隆》第三版中大肠杆菌感受态制备(CaCl2法)]，放置37度细菌培养箱中过夜培养。挑取单个菌落，扩大培养，提取阳性克隆的质粒，经酶切和测序，将正确的载体命名为CD19-scFv-CH2CH3-CD28-CD137-CD3ζ，即本发明提出的CD19特异性嵌合抗原受体。
将所得CD19特异性嵌合抗原受体进行检测，其结果如图3所示，其中条带1为100bp的对照条带，条带2为所得CD19特异性嵌合抗原受体。
实施例2：CD19特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞的制备
1、含CD19特异性嵌合抗原受体逆转病毒的包装
用无内毒素质粒大提试剂盒内(天根生物)的操作说明书提取逆转录病毒包装载体pRD114和CD19-scFv-CH2CH3-CD28-CD137-CD3ζ逆转录病毒载体共转染到293T细胞中，转染后48h收集细胞上清，4000rpm离心10min，去除上清中的细胞及细胞碎片。用0.45μm的滤膜过滤，分装冻存，备用。
2、T淋巴细胞的制备
采取20mL健康志愿者的新鲜抗凝血，用淋巴分离液(GE公司)分立外周血单核细胞(PBMC)。分离后的细胞用CD3和CD28平板刺激48h，用T淋巴细胞培养基GT-T551(TAKARA公司)加3％自身血浆进行诱导，得到T淋巴细胞。
3、CAR-T细胞的制备
用50μg/mL的RetroNectin(TAKARA公司)包被非组织培养板24孔板，每孔加入500μL，4℃过夜。每孔再加入500μL病毒上清，37℃孵育30min。去除病毒上清，再加入500μL病毒上清，37℃孵育30min，除病毒上清，每孔加入1.5mL病毒上清，再加入0.5mL稀释后的T淋巴细胞，从而获得CD19-scFv-CH2CH3-CD28-CD137-CD3ζ细胞，即CD19特异性CAR-T细胞。
4、流式检测CD19特异性CAR-T细胞中CAR分子的表达
将CAR-T细胞加入5μL FITC标记的抗Fc抗体(Jackson公司)，37℃孵育1h后，进行流式检测，检测结果如图4所示：其中虚线所形成的峰为对照的T淋巴细胞，而实线的峰表示感染嵌合抗原受体的逆转录病毒的T淋巴细胞。由图4可知：本方法所得CAR-T细胞的效率大于90％。
实施例3：嵌合抗原受体CD19特异性CAR-T细胞对CD19相关肿瘤的杀伤作用
1、CAR-T细胞对肿瘤的杀伤力检测
将淋巴瘤细胞用培养基调整到5×106/mL，每孔50μL，按效应细胞和靶细胞比为1:4，加入CD19阳性的淋巴瘤细胞2.5×105个，待细胞完全贴壁后，收集T细胞和CAR-T细胞，调整细胞浓度为1.25×106/mL，每孔50μL，然后分别进行流式细胞(培养24h)和MTT检测(培养12h)。
首先，收集细胞进行CD3和CD19的染色，进行流式细胞分析肿瘤细胞(CD19+)和T细胞(CD3+)的比例，其结果如图5所示。由图5可知：本发明所得嵌合抗原受体CD19特异性CAR-T细胞能有效杀伤淋巴瘤细胞。
其次，同样的实验弃上清加入100μL稀释的CCK8，孵育4-6小时，酶标仪检测OD450的吸光值。其检测结果如图6所示，CAR-T细胞对CD19表达的肿瘤的杀伤率高于CD19不表达的肿瘤细胞；CAR-T细胞对相关肿瘤杀伤作用高于T细胞，高于单纯培养基。
2、ELISA检测CAR-T细胞在受到CD19刺激后IFN-γ和IL2的表达
将淋巴瘤细胞用培养基调整到5×106/mL，每孔50μL，加入淋巴瘤细胞2.5×105个，待细胞完全贴壁后，收集T和CAR-T细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，每孔50μL，培养24h。收集上清液，利用ELISA试剂盒检测IFN-γ和IL2的表达。
其结果如图7所示，CD19特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞在收到CD19阳性的淋巴瘤细胞刺激后表达和分泌IFN-γ和IL2。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种CD19特异性嵌合抗原受体，包括胞外抗原结合区、铰链区和胞内信号转导区，其特征在于，所述铰链区为人抗体IgG4的CH2CH3。
2.根据权利要求1所述CD19特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述人抗体IgG4的CH2CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1或2所述CD19特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外抗原结合区为人抗CD19的单链抗体。
4.根据权利要求1-3所述CD19特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述人抗CD19的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；优选地，所述人抗CD19的单链抗体的重链和轻链分子之间有个连接肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求1-4所述CD19特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由人抗CD19的单链抗体、人抗体IgG4的CH2CH3、CD28的跨膜区和胞内信号结构、CD137的胞内信号结构、及CD3ζ的胞内信号结构串联构成。
6.根据权利要求1-5所述CD19特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基末端含有一个信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
7.根据权利要求1-6所述CD19特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体以CD28的跨膜区和胞内信号结构、CD137胞内信号结构、CD3ζ的胞内信号结构串联构成的结构域为T细胞共刺激信号传导结构；优选地，所述T细胞共刺激信号传导结构的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO.5所示。
8.根据权利要求1-7所述CD19特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
9.编码如权利要求1-8任一项所述CD19特异性嵌合抗原受体的基因，其特征在于，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
10.如权利要求1-8任一项所述CD19特异性嵌合抗原受体在制备治疗CD19相关肿瘤药物中的应用。
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