JP7433656B2 - 第3シグナル受容体を含むキメラ抗原受容体およびその使用 - Google Patents
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Description
ここで、Xは、腫瘍標的抗体または腫瘍に特異的に結合可能なリガンド若しくは受容体を含み、Yは、ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、SLAM、CD2、CD226から選ばれる共刺激受容体の細胞内領域であり、Mは、IL2Ra、IL2Rb、IL4Ra、IL7Ra、IL9Ra、IL15Ra、IL21Raから選ばれるgamma chainファミリーサイトカイン受容体の細胞内領域であり、Nは、IL2Rg細胞内領域である第3シグナル受容体を含むキメラ抗原受容体を提供する。
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR;
SEQ ID No. 2:
KKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ;
SEQ ID No.3
NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV;
SEQ ID No.4:
KIKKEWWDQIPNPARSRLVAIIIQDAQGSQWEKRSRGQEPAKCPHWKNCLTKLLPCFLEHNMKRDEDPHKAAKEMPFQGSGKSAWCPVEISKTVLWPESISVVRCVELFEAPVECEEEEEVEEEKGSFCASPESSRDDFQEGREGIVARLTESLFLDLLGEENGGFCQQDMGESCLLPPSGSTSAHMPWDEFPSAGPKEAPPWGKEQPLHLEPSPPASPTQSPDNLTCTETPLVIAGNPAYRSFSNSLSQSPCPRELGPDPLLARHLEEVEPEMPCVPQLSEPTTVPQPEPETWEQILRRNVLQHGAAAAPVSAPTSGYQEFVHAVEQGGTQASAVVGLGPPGEAGYKAFSSLLASSAVSPEKCGFGASSGEEGYKPFQDLIPGCPGDPAPVPVPLFTFGLDREPPRSPQSSHLPSSSPEHLGLEPGEKVEDMPKPPLPQEQATDPLVDSLGSGIVYSALTCHLCGHLKQCHGQEDGGQTPVMASPCCGCCCGDRSSPPTTPLRAPDPSPGGVPLEASLCPASLAPSGISEKSKSSSSFHPAPGNAQSSSQTPKIVNFVSVGPTYMRVS;
SEQ ID No. 5:
KLSPRVKRIFYQNVPSPAMFFQPLYSVHNGNFQTWMGAHGAGVLLSQDCAGTPQGALEPCVQEATALLTCGPARPWKSVALEEEQEGPGTRLPGNLSSEDVLPAGCTEWRVQTLAYLPQEDWAPTSLTRPAPPDSEGSRSSSSSSSSNNNNYCALGCYGGWHLSALPGNTQSSGPIPALACGLSCDHQGLETQQGVAWVLAGHCQRPGLHEDLQGMLLPSVLSKARSWTF;
SEQ ID No. 6:
SLKTHPLWRLWKKIWAVPSPERFFMPLYKGCSGDFKKWVGAPFTGSSLELGPWSPEVPSTLEVYSCHPPRSPAKRLQLTELQEPAELVESDGVPKPSFWPTAQNSGGSAYSEERDRPYGLVSIDTVTVLDAEGPCTWPCSCEDDGYPALDLDAGLEPSPGLEDPLLDAGTTVLSCGCVSAGSPGLGGPLGSLLDRLKPPLADGEDWAGGLPWGGRSPGGVSESEAGSPLAGLDMDTFDSGFVGSDCSSPVECDFTSPGDEGPPRSYLRQWVVIPPPLSSPGPQAS;
SEQ ID No. 7:
ERTMPRIPTLKNLEDLVTEYHGNFSAWSGVSKGLAESLQPDYSERLCLVSEIPPKGGALGEGPGASPCNQHSPYWAPPCYTLKPET。
scFv(X)-(Y)CD3zeta、M及びNの融合タンパク質を形成すると共に、両端にレンチウイルスベクターを付加して、レンチウイルスパッケージングプラスミドと同時形質移入して、scFv(X)-(Y)CD3zeta-MNウイルスが得られ、
ステップ2:scFv(X)-(Y)CD3zeta-MN CAR-T細胞調製
分離精製されたヒトPBMCを培養後、ステップ1で得られるscFv(X)-(Y)CD3zeta-MNウイルスを感染させ、適切な条件で細胞を増幅させることで、scFv(X)-(Y)CD3zeta-MN CAR-T細胞を調製し、
ここで、Xは、腫瘍標的抗体または他のタンパク質であり、Yは、ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、SLAM、CD2、CD226から選ばれる共刺激受容体の細胞内領域であり、Mは、IL2Ra、IL2Rb、IL4Ra、IL7Ra、IL9Ra、IL15Ra、IL21Raから選ばれるgamma chainファミリーサイトカイン受容体の細胞内領域であり、Nは、IL2Rg細胞内領域であることを含む。
本実施例に記載の20BBZIL2RbIL2Rg CAR-T細胞の調製は、以下のステップを含む。
scFv-antihCD20-20BBZ(SEQ ID No.1)、IL2Rb細胞内領域(SEQ ID No.3)およびIL2Rg細胞内領域(SEQ ID No.7)は、overlap PCRにより融合タンパク質を形成すると共に、両端にEcoRIとBamHI制限酵素サイトを付加してpCDH-MSCVEFベクターにクローンした。正しくシークエンシングされたクローンされたエンドトキシンフリーの大量抽出物を、レンチウイルスパッケージングプラスミド(VSV-g、pMD Gag/Pol、RSV-REV)と293Xで同時形質移入後48と72時間に、上清を採取して、0.45μMでろ過後、ベックマン超遠心機およびSW28スウィングロータを用いて、25000RPMの遠心でウイルスを2時間濃縮することによって、pCDH-MSCVEF-20BBZIL2RbIL2Rgウイルス(20BBZIL2RbIL2Rgウイルスと単に称される)が得られ、次のCAR-T細胞産生に用いられる。同時に、対照pCDH-MSCVEF-20BBZウイルス(20BBZウイルスと単に称される)が産生され、得られた20BBZIL2RbIL2Rgウイルスにより293細胞を感染させ、ウイルス力価を、図2に示すように測定した。
ヒトPBMCを、Stemcell T細胞分離キットで精製後、anti-hCD3およびanti-hCD28により被覆された96ウエル培養プレートに播種後2日に、MOI=10-20で20BBZウイルスおよび20BBZIL2RbIL2Rgウイルスを感染後1日に、液を交換して細胞培養を続け、6日ごとに人工抗原提示細胞またはanti-hCD3/28で刺激するように2ラウンド刺激後、20BBZCAR-T細胞と20BBZIL2RbIL2RgCAR-T細胞が得られ、次の実験および表現型分析に用いられる。図7に示されるように、得られた細胞は、CAR陽性である。
本実施例に記載の20BBZIL4RaIL2Rg CAR-T細胞の調製は、以下のステップを含む。
scFv-antihCD20-20BBZ(SEQ ID No.1)、IL4Ra細胞内領域(SEQ ID No.4)およびIL2Rg細胞内領域(SEQ ID No.7)は、overlap PCRを通って融合タンパク質を形成すると共に、両端にEcoRIとBamHI制限酵素サイトを付加してpCDH-MSCVEFベクターにクローンした。正しくシークエンシングされたクローンされたエンドトキシンフリーの大量抽出物を、レンチウイルスパッケージングプラスミド(VSV-g、pMD Gag/Pol、RSV-REV)と293Xで同時形質移入後48と72時間に、上清を採取して、0.45μMでろ過後、ベックマン超遠心機およびSW28スウィングロータを用いて、25000RPMの遠心でウイルスを2時間濃縮することによって、pCDH-MSCVEF-20BBZIL4RaIL2Rgウイルス(20BBZIL4RaIL2Rgウイルスと単に称される)が得られ、次のCAR-T細胞産生に用いられる。同時に、対照pCDH-MSCVEF-20BBZウイルス(20BBZウイルスと単に称される)が産生され、得られた20BBZIL4RaIL2Rgウイルスにより293細胞を感染させ、ウイルス力価を、図3に示すように測定した。
ヒトPBMCを、Stemcell T細胞分離キットで精製後、anti-hCD3およびanti-hCD28により被覆された96ウエル培養プレートに播種後2日に、MOI=10-20で20BBZウイルスおよび20BBZIL4RaIL2Rgウイルスを感染後1日に、液を交換して細胞培養を続け、6日ごとに人工抗原提示細胞またはanti-hCD3/28で刺激するように2ラウンド刺激後、20BBZCAR-T細胞と20BBZIL4RaIL2RgCAR-T細胞が得られ、次の実験および表現型分析に用いられる。図8に示されるように、得られた細胞は、CAR陽性である。
本実施例に記載の20BBZIL7RaIL2Rg CAR-T細胞の調製は、以下のステップを含む。
scFv-antihCD20-20BBZ(SEQ ID No.1)、IL7Ra細胞内領域(SEQ ID No.2)およびIL2Rg細胞内領域(SEQ ID No.7)は、overlap PCRにより融合タンパク質を形成すると共に、両端にEcoRIとBamHI制限酵素サイトを付加してpCDH-MSCVEFベクターにクローンした。正しくシークエンシングされたクローンされたエンドトキシンフリーの大量抽出物を、レンチウイルスパッケージングプラスミド(VSV-g、pMD Gag/Pol、RSV-REV)と293Xで同時形質移入後48と72時間に、上清を採取して、0.45μMでろ過後、ベックマン超遠心機およびSW28スウィングロータを用いて、25000RPMの遠心でウイルスを2時間濃縮することによって、pCDH-MSCVEF-20BBZIL7RaIL2Rgウイルス(20BBZIL7RaIL2Rgウイルスと単に称される)が得られ、次のCAR-T細胞産生に用いられる。同時に、対照pCDH-MSCVEF-20BBZウイルス(20BBZウイルスと単に称される)が産生され、得られた20BBZIL7RaIL2Rgウイルスにより293細胞を感染させ、ウイルス力価を、図4に示すように測定した。
ヒトPBMCを、Stemcell T細胞分離キットで精製後、anti-hCD3およびanti-hCD28により被覆された96ウエル培養プレートに播種後2日に、MOI=10-20で20BBZウイルスおよび20BBZIL7RaIL2Rgウイルスを感染後1日に、液を交換して細胞培養を続け、6日ごとに人工抗原提示細胞またはanti-hCD3/28で刺激するように2ラウンド刺激後、20BBZCAR-T細胞と20BBZIL7RaIL2RgCAR-T細胞が得られ、次の実験および表現型分析に用いられる。図9に示されるように、得られた細胞は、CAR陽性である。
本実施例に記載の20BBZIL9RaIL2Rg CAR-T細胞の調製は、以下のステップを含む。
scFv-antihCD20-20BBZ(SEQ ID No.1)、IL9Ra細胞内領域(SEQ ID No.5)およびIL2Rg細胞内領域(SEQ ID No.7)は、overlap PCRにより融合タンパク質を形成すると共に、両端にEcoRIとBamHI制限酵素サイトを付加してpCDH-MSCVEFベクターにクローンした。正しくシークエンシングされたクローンされたエンドトキシンフリーの大量抽出物を、レンチウイルスパッケージングプラスミド(VSV-g、pMD Gag/Pol、RSV-REV)と293Xで同時形質移入後48と72時間に、上清を採取して、0.45μMでろ過後、ベックマン超遠心機およびSW28スウィングロータを用いて、25000RPMの遠心でウイルスを2時間濃縮することによって、pCDH-MSCVEF-20BBZIL9RaIL2Rgウイルス(20BBZIL9RaIL2Rgウイルスと単に称される)が得られ、次のCAR-T細胞産生に用いられる。同時に、対照pCDH-MSCVEF-20BBZウイルス(20BBZウイルスと単に称される)が産生され、得られた20BBZIL9RaIL2Rgウイルスにより293細胞を感染させ、ウイルス力価を、図5に示すように測定した。
ヒトPBMCを、Stemcell T細胞分離キットで精製後、anti-hCD3およびanti-hCD28により被覆された96ウエル培養プレートに播種後2日に、MOI=10-20で20BBZウイルスおよび20BBZIL9RaIL2Rgウイルスを感染後1日に、液を交換して細胞培養を続け、6日ごとに人工抗原提示細胞またはanti-hCD3/28で刺激するように2ラウンド刺激後、20BBZCAR-T細胞と20BBZIL9RaIL2RgCAR-T細胞が得られ、次の実験および表現型分析に用いられる。図10に示されるように、得られた細胞は、CAR陽性である。
本実施例に記載の20BBZIL21RaIL2Rg CAR-T細胞の調製は、以下のステップを含む。
scFv-antihCD20-20BBZ(SEQ ID No.1)、IL21Ra細胞内領域(SEQ ID No.6)およびIL2Rg細胞内領域(SEQ ID No.7)は、overlap PCRにより融合タンパク質を形成すると共に、両端にEcoRIとBamHI制限酵素サイトを付加してpCDH-MSCVEFベクターにクローンした。正しくシークエンシングされたクローンされたエンドトキシンフリーの大量抽出物を、レンチウイルスパッケージングプラスミド(VSV-g、pMD Gag/Pol、RSV-REV)と293Xで同時形質移入後48と72時間に、上清を採取して、0.45μMでろ過後、ベックマン超遠心機およびSW28スウィングロータを用いて、25000RPMの遠心でウイルスを2時間濃縮することによって、pCDH-MSCVEF-20BBZIL21RaIL2Rgウイルス(20BBZIL21RaIL2Rgウイルスと単に称される)が得られ、次のCAR-T細胞産生に用いられる。同時に、対照pCDH-MSCVEF-20BBZウイルス(20BBZウイルスと単に称される)が産生され、得られた20BBZIL21RaIL2Rgウイルスにより293細胞を感染させ、ウイルス力価を、図6に示すように測定した。
ヒトPBMCを、Stemcell T細胞分離キットで精製後、anti-hCD3およびanti-hCD28により被覆された96ウエル培養プレートに播種後2日に、MOI=10-20で20BBZウイルスおよび20BBZIL21RaIL2Rgウイルスを感染後1日に、液を交換して細胞培養を続け、6日ごとに人工抗原提示細胞またはanti-hCD3/28で刺激するように2ラウンド刺激後、20BBZCAR-T細胞と20BBZIL21RaIL2RgCAR-T細胞が得られ、次の実験および表現型分析に用いられる。図11に示されるように、得られた細胞は、CAR陽性である。
実施例3におけるステップ2で調製された20BBZ CAR-T細胞と20BBZIL7RaIL2Rg CAR-T細胞を、14日連続的に培養し、6日おきに1回、人工抗原提示細胞で刺激し、細胞をカウントした結果が図12に示される。図面のように、20BBZIL7RaIL2Rg CAR-T細胞は、20BBZCAR-T細胞よりも強い増殖能力を有する。
実施例3におけるステップ2で調製された20BBZ CAR-T細胞と20BBZIL7RaIL2Rg CAR-T細胞を、96ウエルプレートに播種して、CAR-T:腫瘍細胞が1:1、1:2、1:4の割合でRaji腫瘍細胞を加えた後24、48時間に、腫瘍細胞の生存割合を比較したところ、その結果が図13に示される。図面のように、20BBZIL7RaIL2Rg CAR-T細胞は、20BBZ CAR-T細胞と類似の腫瘍殺傷能を有する。
106 Nalm-6腫瘍細胞を、B-NDGマウスに静脈内に播種後6日に、107 20BBZ CAR-T細胞と20BBZIL7RaIL2Rg CAR-T細胞治療を施しながら、マウスの生存率を観察すると、一部のマウスは、7日目にその骨髄における腫瘍細胞とCAR-T細胞の含有量が測定され、その結果がそれぞれ図14および図15に示される。図面のように、20BBZIL7RaIL2Rg CAR-T細胞は、マウスの生存が20BBZ CAR-T細胞よりも有意に延長すると共に、インビボで多く増幅されている。
Claims (10)
- 構造が、scFv(X)-(Y)CD3zeta-MNであり、
ここで、Xは、腫瘍標的抗体を含み、
Yは、ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、SLAM、CD2、CD226から選ばれる共刺激受容体の細胞内領域であり、
Mは、IL2Ra、IL2Rb、IL4Ra、IL7Ra、IL9Ra、IL15Ra、IL21Raから選ばれるgamma chainファミリーサイトカイン受容体の細胞内領域であり、
Nは、IL2Rg細胞内領域である
ことを特徴とする、第3シグナル受容体を含むキメラ抗原受容体。 - 前記Xは、anti-CD19抗体、anti-CD20抗体、anti-EGFR抗体、anti-HER2抗体、anti-EGFRVIII抗体、anti-PSMA抗体、anti-BCMA抗体、anti-CD22抗体、又はanti-CD30抗体から選ばれることを特徴とする、請求項1に記載の第3シグナル受容体を含むキメラ抗原受容体。
- 前記Xは、anti-CD20抗体であり、前記Yは、4-1BB細胞内領域であり、前記Mは、IL2Rb細胞内領域、IL4Ra細胞内領域、IL7Ra細胞内領域、IL9Ra細胞内領域、IL21Ra細胞内領域の1つから選ばれることを特徴とする、請求項1に記載の第3シグナル受容体を含むキメラ抗原受容体。
- 前記scFv(X)-(Y)CD3zetaは、配列がSEQ ID No.1で表されるscFv-antihCD20-20BBZであり、前記IL7Ra細胞内領域の配列は、SEQ ID No.2で表され、前記IL2Rb細胞内領域の配列は、SEQ ID No.3で表され、前記IL4Ra細胞内領域の配列は、SEQ ID No.4で表され、前記IL9Ra細胞内領域の配列は、SEQ ID No.5で表され、前記 IL21Ra細胞内領域の配列は、SEQID No.6で表され、前記IL2Rg細胞内領域の配列は、SEQ ID No.7で表されることを特徴とする、請求項3に記載の第3シグナル受容体を含むキメラ抗原受容体。
- 請求項1~4のいずれか1項に記載のキメラ抗原受容体の組換え発現ベクターにより作製されるCAR-T細胞。
- ステップ1:レンチウイルスベクター作製およびウイルス産生
scFv(X)-(Y)CD3zeta、M及びNの融合タンパク質を形成すると共に、両端にレンチウイルスベクターを付加し、レンチウイルスパッケージングプラスミドと同時形質移入して、scFv(X)-(Y)CD3zeta-MNウイルスが得られ、
ステップ2:scFv(X)-(Y)CD3zeta-MN CAR-T細胞調製
分離精製されたヒトPBMCを培養後、ステップ1で得られるscFv(X)-(Y)CD3zeta-MNウイルスを感染させ、適切な条件で細胞を増幅させることで、scFv(X)-(Y)CD3zeta-MN CAR-T細胞を調製することを含む
ことを特徴とする、請求項5に記載のCAR-T細胞の調製方法。 - 前記レンチウイルスベクター作製およびウイルス産生におけるステップは
scFv(X)-(Y)CD3zeta、M及びNがoverlap PCRにより融合タンパク質を形成すると共に、両端に制限酵素サイトを付加してレンチウイルスベクターにクローンし、正しくシークエンシングされたクローンされたエンドトキシンフリーの大量抽出物を、レンチウイルスパッケージングプラスミドと同時形質移入後予定時間に、上清を採取してろ過し、遠心によってウイルスを濃縮することによって、scFv(X)-(Y)CD3zeta-MNウイルスを得ることを含む
ことを特徴とする、請求項6に記載のCAR-T細胞の調製方法。 - 前記scFv(X)-(Y)CD3zeta-MN CAR-T細胞調製のステップは、ヒトPBMCを分離精製後、適切な刺激条件を持つ培養プレートに播種して予定時間培養後、ステップ1で産生したscFv(X)-(Y)CD3zeta-MNウイルスを感染させ、適切な刺激条件で細胞を増幅させるように2ラウンド刺激増幅後、scFv(X)-(Y)CD3zeta-MN CAR-T細胞が得られることを含む
ことを特徴とする、請求項6に記載のCAR-T細胞の調製方法。 - 請求項5に記載のCAR-T細胞を含む製剤。
- 腫瘍を治療または予防するために使用される請求項1~4のいずれか1項に記載のキメラ抗原受容体または請求項5に記載のCAR-T細胞。
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