CN116082503A - 一种靶向人igsf9的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向人IGSF9的单克隆抗体及其应用，属于单克隆抗体技术领域。本发明提供的靶向人IGSF9的单克隆抗体，所述靶向人IGSF9的单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本发明的靶向人IGSF9的单克隆抗体，通过识别介导T细胞增殖抑制的IGSF9蛋白，阻断IGSF9蛋白对T细胞的抑制作用，恢复T细胞活性，从而抑制肿瘤细胞的生长；与其他免疫抑制分子药物联用后，协同效应明显，为肿瘤的治疗提供了新的方向。

Description

一种靶向人IGSF9的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及单克隆抗体技术领域，尤其涉及一种靶向人IGSF9的单克隆抗体及其应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。目前，肿瘤免疫治疗是最有可能治愈肿瘤的方法。例如，PD-1/PD-L1单克隆抗体在肿瘤治疗中取得巨大成功，其根本原因是PD-L1的表达是可诱导型；肿瘤微环境中的IFNr诱导PD-L1的表达，因此，应用PD-1/PD-L1单克隆抗体具有较强的抑瘤效果；但是临床数据显示，只有20％的肿瘤患者能够从中受益，表明大多数肿瘤患者有自己独特的免疫逃避机制；因此，发现新的可被诱导的肿瘤特异免疫检查点分子，研发相应治疗型抗体，能够为肿瘤患者带来新的疗法。有研究证实，免疫抑制受体IGSF9在肿瘤细胞、肿瘤浸润T、B以及巨噬细胞高表达，而在正常组织及外周免疫细胞不表达；IGSF9依赖其细胞外结构域与T细胞表面未知蛋白相结合，抑制T细胞增殖，促进肿瘤免疫逃避，为肿瘤免疫治疗带来困扰。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向人IGSF9的单克隆抗体及其应用。本发明提供的靶向人IGSF9的单克隆抗体，通过识别介导T细胞增殖抑制的IGSF9蛋白，阻断IGSF9蛋白对T细胞的抑制作用，恢复T细胞活性，从而抑制肿瘤细胞的生长，为肿瘤的治疗提供了新的方向。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种靶向人IGSF9的单克隆抗体，所述靶向人IGSF9的单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种上述靶向人IGSF9的单克隆抗体在制备抑制肿瘤生长的药物中的应用。
优选的，所述药物包括所述靶向人IGSF9的单克隆抗体和免疫抑制分子。
优选的，所述免疫抑制分子包括PD-1，PD-L1、CTLA-4，TIM-3，LAG-3，CD160，BTLA。
优选的，所述肿瘤包括非小细胞肺癌、结肠癌和急性髓系白血病。
本发明提供了一种靶向人IGSF9的单克隆抗体及其应用。本发明证实了IGSF9蛋白是受肿瘤细胞诱导产生的，通过与T细胞表面蛋白结合，抑制T细胞增殖，促进肿瘤细胞免疫逃逸，而在缺失T细胞后，IGSF9则不再促进肿瘤生长。本发明根据IGSF9蛋白的胞外结构域，制备得到一种靶向人IGSF9的单克隆抗体，可特异性识别IGSF9蛋白，阻断IGSF9和T细胞表面蛋白结合，进而恢复T细胞增殖抑制。同时，该单克隆抗体可显著增加TNF-α和IFN-γ水平，与其他免疫抑制分子药物联用后，协同效应明显，显著抑制肿瘤生长。
附图说明
图1为实施例1中非小细胞肺癌和毗邻正常组织中IGSF9蛋白的表达水平。
图2为实施例1中IGSF9蛋白在健康供体和NSCLC患者的外周血以及NSCLC患者的肿瘤组织中各种免疫细胞上的表达水平。
图3为实施例1中IGSF9蛋白在正常C57BL/6小鼠的外周血以及荷瘤小鼠的外周血和肿瘤组织中的B细胞、CD3+/CD4+T细胞上的表达水平，其中*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001，ns代表无统计学差异。
图4为实施例2中IGSF9-ECD-His蛋白或IGSF9-ECD-Fc蛋白对活化的CD3+T细胞的影响。
图5为实施例2中将MC38-control、MC38-migsf9和MC38-migsf9-ECD细胞接种到C57BL/6-igsf9+/+和C57BL/6-igsf9-/-小鼠皮下，肿瘤大小、重量和肿瘤浸润CD3+T细胞水平的检测结果。
图6为实施例2中不同浓度的IGSF9-ECD-His蛋白加入CD3+T细胞培养体系后的培养结果。
图7为实施例2中IGSF9-ECD-His、IGSF9-ECD-Fc和human IgG与CD3+T细胞结合情况；其中，图7a为IGSF9-ECD-His与CD3+T细胞的结合情况；图7b为IGSF9-ECD-Fc与CD3+T细胞的结合情况；图7c为IGSF9-ECD蛋白与CD3+T细胞膜上的未知蛋白的IP结果。
图8为实施例2中将MC38-control和MC38-migsf9细胞接种到C57BL/6-rag2-/-小鼠皮下后的肿瘤大小和肿瘤重量变化情况。
图9为实施例3中靶向人IGSF9的单克隆抗体的制备流程图。
图10为实施例3中小鼠血清与IGSF9的结合情况。
图11为实施例3中小鼠血清与CD3+T细胞共培养结果。
图12为实施例3中筛选出的7株阳性融合细胞，分别为2H11、5C3、2H5、2A3、8D9、6C12、6G10。
图13为实施例3中筛选出的7株融合细胞分别与CD3+T细胞、IGSF9-ECD共培养的培养结果。
图14为实施例3中5C3亚克隆的6株单克隆细胞分别与CD3+T细胞、IGSF9-ECD共培养的培养结果。
图15为实施例3中5C3亚克隆的6株单克隆细胞分别与CD3+T细胞、IGSF9-ECD共培养后的CD3+T细胞增殖结果。
图16为实施例4中靶向人IGSF9的单克隆抗体或IgG与CD3+T细胞和THP-1细胞共培养的培养结果；其中，图16a为靶向人IGSF9的单克隆抗体或IgG与CD3+T细胞和THP-1细胞共培养的培养结果；图16b为细胞上清中的TNF-α水平；图16c为细胞上清中的IFN-γ水平。
图17为实施例5中靶向人IGSF9的单克隆抗体对肿瘤的抑制效果；其中，图17a为各组小鼠肿瘤大小，图17b为小鼠肿瘤生长曲线，图17b中*代表p<0.05，**代表p<0.01。
具体实施方式
本发明提供了一种靶向人IGSF9的单克隆抗体，所述靶向人IGSF9的单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明中，SEQ ID NO.1的氨基酸序列为：
EVQLLETGGGLVQPGGSRGLSCEGSGFSFSGFWMSWVRQTPGKTLEWIGNIKSDGSAINYAPSIKDRFTIFRDNDKSTLYLQMSNVRSEDTATYFCMRSNYGHWYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSLGK。
在本发明中，SEQ ID NO.2的氨基酸序列为：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNFLNWYQQKPNGTVKLLIYYTSSLYSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKFPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC。
本发明还提供了一种上述靶向人IGSF9的单克隆抗体在制备抑制肿瘤生长的药物中的应用。
在本发明中，所述药物优选包括所述靶向人IGSF9的单克隆抗体和免疫抑制分子。
优选的，所述免疫抑制分子优选包括PD-1，PD-L1、CTLA-4，TIM-3，LAG-3，CD160，BTLA；进一步优选为PD-1。
优选的，所述肿瘤优选包括非小细胞肺癌、结肠癌和急性髓系白血病；进一步优选为结肠癌和急性髓系白血病。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例通过流式检测分析IGSF9蛋白在肿瘤细胞、肿瘤浸润免疫细胞中的高表达。
将非小细胞肺癌及其毗邻正常组织制备成单细胞悬液，采用流式细胞仪检测IGSF9在非小细胞肺癌和毗邻正常组织的表达，如图1所示，结果表明：IGSF9在非小细胞肺癌组织中的表达水平显著高于正常组织。
流式细胞仪检测IGSF9在各免疫细胞中的表达水平，如图2所示，结果表明：在正常健康人外周血各免疫细胞中没有检测到IGSF9的表达，但是非小细胞肺癌患者外周血中髓系细胞、Treg细胞、B细胞以及CD3+/CD4+T细胞中IGSF9的表达水平显著高于正常健康人；在肿瘤浸润的髓系细胞、Treg细胞、B细胞以及CD3+/CD4+T细胞中IGSF9的表达水平显著高于非小细胞肺癌患者外周血的表达水平。
将MC38细胞接种到C57BL/6小鼠体内，检测IGSF9蛋白在正常C57BL/6小鼠的外周血以及荷瘤小鼠的外周血和肿瘤组织中的B细胞、CD3+/CD4+T细胞上的表达水平，如图3所示，结果表明：肿瘤浸润B细胞中IGSF9的水平显著高于外周血和接种前的外周血。
上述结果表明IGSF9是可以被诱导的，肿瘤微环境中存在诱导IGSF9表达的因素。
实施例2
本实施例验证IGSF9蛋白对T细胞增殖抑制和促进肿瘤免疫逃逸的机制。
制备带有His或者Fc标签的人IGSF9胞外区蛋白(IGSF9-ECD-His或者IGSF9-ECD-Fc)。向T细胞培养体系中分别加入1μg IGSF9-ECD-His或1μg IGSF9-ECD-Fc蛋白，如图4所示，结果表明：1μg IGSF9-ECD-His或者IGSF9-ECD-Fc蛋白能够显著抑制CD3+T细胞增殖。
其中，人IGSF9胞外区蛋白的制备过程如下：在人IGSF9基因细胞外结构域(氨基酸序列如SEQ ID No.3所示)的编码序列末端连接His或者Fc标签后克隆到表达载体pcDNA3.1(-)上，将该表达载体转染至HEK293F细胞(ThermoFisher,A14635)中，扩大培养。收集细胞上清，进行蛋白亲和层析纯化，得到IGSF9-ECD-His或者IGSF9-ECD-Fc蛋白。
其中，T细胞培养体系为将活化的CD3+T细胞在含有10％FBS、100U/mL IL-2和CD3/CD28 coatedbeads的1640培养基中培养的体系。
分别将MC38-control、MC38-migsf9和MC38-migsf9-ECD细胞接种到C57BL/6-igsf9+/+小鼠(将购自上海南方模式生物科技股份有限公司的igsf9基因敲除鼠自交后获得)和C57BL/6-igsf9-/-小鼠(将购自上海南方模式生物科技股份有限公司的igsf9基因敲除鼠自交后获得)皮下，肿瘤大小、重量和肿瘤浸润CD3+T细胞水平检测结果如图5所示，结果表明：MC38-migsf9和MC38-migsf9-ECD都显著促进肿瘤的生长，而且肿瘤组织浸润T细胞的水平显著降低。
其中，MC38-control、MC38-migsf9和MC38-migsf9-ECD细胞的制备过程如下：
将空载体、含有migsf9的载体、含有migsf9-ECD的载体分别与逆转录病毒包装载体Plo整合后转染GP2-293细胞，收集病毒。将收集得到的病毒感染MC38细胞。对于感染空载体的MC38细胞，用流式分选细胞仪将GFP阳性细胞进行分选，获得MC38-control细胞。对于感染migsf9或migsf9-ECD的MC38细胞，分析GFP和migsf9双阳性的细胞进行分选，获得MC38-migsf9和MC38-migsf9-ECD细胞。
向T细胞培养体系中加入不同浓度的IGSF9-ECD-His蛋白，如图6所示，结果发现IGSF9-ECD-His对T细胞的增殖抑制呈剂量依赖型，当剂量大于0.5μg时，开始出现明显的T细胞增殖抑制，表明IGSF9-ECD-His是剂量依赖式抑制T细胞。
将8μg IGSF9-ECD-His、IGSF9-ECD-Fc和human IgG蛋白(购自北京义翘神州科技有限公司，Cat#：13504)与激活的CD3+T共孵育30min，用流式抗体anti-His-APC和anti-Fc-APC检测结合情况，如图7a和图7b所示，结果表明IGSF9-ECD能够和T细胞相结合。如图7c所示的IP结果显示IGSF9-ECD蛋白与T细胞膜上的未知蛋白相结合，其中条带2为单纯IGSF9-ECD蛋白组，条带3为IGSF9-ECD蛋白与T细胞结合组，条带4为human IgG蛋白与T细胞结合组，同时IP结果也显示IGSF9-ECD-Fc能够从T细胞膜蛋白中拉下明显的条带。
将MC38-control和MC38-migsf9细胞接种到C57BL/6-rag2-/-小鼠(购自上海南方模式生物科技股份有限公司)皮下，检测肿瘤大小和肿瘤重量，如图8所示，结果表明：缺失T细胞后，IGSF9不再促进肿瘤生长，进一步表明IGSF9抑制T细胞增殖，促进肿瘤细胞免疫逃避。
以上结果表明IGSF9依赖其胞外结构域与T细胞结合抑制T细胞增殖。
实施例3
本实施例制备靶向人IGSF9的单克隆抗体。
按照图9所示流程制备单克隆抗体，具体制备过程如下：
(1)采用IGSF9-ECD-His蛋白分别免疫5只BALB/c小鼠，每只免疫4次后，采集5只小鼠血清，分别为serum1、serum2、serum3、serum4、serum5。采用ELISA检测血清效价，结果如表1所示；用THP-1-igsf9-WT细胞和THP-1-igsf9-KO细胞通过流式检测小鼠血清与IGSF9的结合能力，结果如图10所示，发现5只小鼠血清都能结合THP-1-igsf9-WT细胞，而不结合THP-1-igsf9-KO细胞。
其中，THP-1-igsf9-KO细胞的构建过程为：根据sgRNA设计原则，应用https://zlab.bio/guide-design-resources设计了靶向IGSF9的3条特异sgRNA序列(序列如SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6)。3条sgRNA序列如下：
SEQ ID NO.4：sgRNA1：CACGTAATCAGGGTCAATTC；
SEQ ID NO.5：sgRNA2：GAAGCCTGAGGTGGTATCGG；
SEQ ID NO.6：sgRNA3：GCTGGGGAGAGTGTGGTGCT；
将上述序列克隆到pslq1651-sgRNA-GFP质粒中。将MD2G、psPAPX2和含有sgRNA的pslq1651-sgRNA-GFP质粒转染293T细胞，收集病毒。将收集得到的病毒感染THP1-Cas9细胞，采用1ug/ml的Dox诱导7天后，流式分选细胞仪分选GFP+/IGSF9-的细胞，命名为THP1-igsf9-KO细胞。
其中，THP-1-igsf9-WT细胞的构建过程为：按照THP-1-igsf9-KO细胞的构建过程，将不含sgRNA的空载体也包装成病毒，同时感染THP-1-cas9细胞作为对照，将该细胞命名为THP-1-igsf9-WT细胞。
其中，T细胞共培养过程如下：
1)常规培养THP1细胞，离心，计数，用含有100U/ml IL2和10％FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，按照2.5×104细胞/孔计数(2.5×104细胞/孔)；
2)将计数的THP-1细胞用28Gy剂量的X-ray进行辐照；
3)将正常人外周血CD3+T细胞进行CFSE染色(1×106细胞加1μl CFSE)，室温静置3min，离心，用含有100U/ml IL2和10％FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，按照5×104细胞/孔计数；
4)在U型96孔板中，分别设置阳性对照组、对照组和实验组1、2、3、4、5。其中，阳性对照组为按照1×106CD3+T细胞加入25μl CD3/CD28 beads；对照组为按照1×106CD3+T细胞加入0.5×106THP-1细胞和25μl CD3/CD28 beads；实验组1、2、3、4、5分别按照1×106CD3+T细胞加入0.5×106THP-1细胞、25μl CD3/CD28 beads和5μl小鼠血清。
5)培养5天后拍照、离心收集细胞，应用anti-human CD3-APC和anti-human CD8-PE的流式抗体染色，以CFSE的稀释倍数代表CD3+T细胞增殖。
T细胞共培养结果如图11所示，可以看出：与阳性对照组相比，对照组中的CD3+T细胞生长明显受到抑制，无明显的CD3+T细胞聚团生长，而在加入小鼠血清之后，血清能够显著阻断THP-1对CD3+T细胞的增殖，CD3+T细胞聚团、生长较明显。
结合检测结果以及小鼠状态，最终选择2号小鼠。
表1 ELISA血清效价检测结果
Figure BDA0003807248270000081
Figure BDA0003807248270000091
(2)分离2号小鼠脾脏细胞，与多发性骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，从67株ELISA检测阳性的融合细胞中，鉴定出7株可以用流式细胞仪检测的融合细胞，结果如图12所示，分别为2H11、5C3、2H5、2A3、8D9、6C12、6G10。将这7株融合细胞分别与CD3+T细胞、IGSF9-ECD共培养，培养结果如图13所示，可以看出，这7株融合细胞的上清都能阻断IGSF9-ECD对T细胞的增殖抑制。
选择5C3细胞进行亚克隆，得到6株单克隆细胞，分别为5C3-1A4、5C3-1B2、5C3-1C12、5C3-2B2、5C3-2B8、5C3-2D12。将这6株单克隆细胞分别与CD3+T细胞、IGSF9-ECD共培养，培养结果如图14所示，可以看出，5C3-1A4对阻断IGSF9-ECD对T细胞的增殖抑制的效果最好。用5-(6)-羧基荧光素二乙酸酯(CFSE)对CD3+T细胞进行染色，CFSE的稀释倍数代表细胞增殖，结果如图15所示，可以看出，5C3-1A4组的CD3+T细胞增殖效果最好。
综上所述，5C3-1A4是阻断型效果最好的单克隆细胞，对该细胞进行测序，获得靶向IGSF9的抗体序列，该抗体序列如下：
重链的全长氨基酸序列(SEQ ID NO.1)：
EVQLLETGGGLVQPGGSRGLSCEGSGFSFSGFWMSWVRQTPGKTLEWIGNIKSDGSAINYAPSIKDRFTIFRDNDKSTLYLQMSNVRSEDTATYFCMRSNYGHWYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSLGK
轻链的全长氨基酸序列(SEQ ID NO.2)：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNFLNWYQQKPNGTVKLLIYYTSSLYSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKFPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
实施例4
本实施例验证实施例3制备得到的靶向人IGSF9的单克隆抗体对IGSF9介导的T细胞增殖抑制作用。
将实施例3制备得到的靶向人IGSF9的单克隆抗体或IgG加入CD3+T细胞和THP-1细胞共培养中，如图16a所示，结果表明：靶向人IGSF9的单克隆抗体显著恢复了T细胞增殖抑制。
通过ELISA检测细胞上清中TNF-α和IFN-γ水平，如图16b和图16c所示，结果表明：靶向人IGSF9的单克隆抗体显著增加了TNF-α和IFN-γ水平。
以上结果表明：实施例3制备得到的靶向人IGSF9的单克隆抗体能够阻断IGSF9和T细胞表面未知蛋白结合进而恢复T细胞活性。
实施例5
本实施例验证靶向人IGSF9的单克隆抗体对肿瘤的抑制效果，具体过程如下：
取生长状态相同的40只C57BL/6小鼠，平均随机分为4组，分别为对照抗体组(mIgG)、IGSF9抗体组(实施例3制备的靶向人IGSF9的单克隆抗体)、PD-1抗体组(anti-PD-1)以及IGSF9抗体和PD-1抗体联用组。
从NCBI调取人IGSF9基因的CDS序列(NM_001135050.2)，设计引物将该序列克隆到pSLenti-EF1a-EGFP-CMV-MCS慢病毒载体上，载体信息为pSLenti-EF1a-EGFP-CMV-IGSF9(1-20aa)-HA-IGSF9(21-1179aa)，测序验证其正确性。应用293T细胞包装病毒颗粒、感染小鼠MC38细胞。通过流式细胞仪进行筛选GFP+/IGSF9+的MC38细胞，命名为MC38-higsf9。将MC38-higsf9细胞接种到C57BL/6小鼠皮下，5天后分别注射mIgG、实施例3制备的靶向人IGSF9的单克隆抗体、anti-PD-1以及实施例3制备的靶向人IGSF9的单克隆抗体和anti-PD-1联用，其中IGSF9抗体和PD-1抗体联用组的注射方式为：注射anti-PD-1 1天后再注射实施例3制备的靶向人IGSF9的单克隆抗体，实施例3制备的靶向人IGSF9的单克隆抗体和anti-PD-1的比例为1：1。每只小鼠注射量为200μg，每3天注射一次，注射5次后，改为每7天注射一次，再注射2次。注射开始时量取肿瘤大小，之后每3天量取一次肿瘤大小。32天后，对照抗体组处理的小鼠皮下肿瘤体积大于2cm3，麻醉状态下处死4组小鼠，取出肿瘤，比较肿瘤大小，如图17a所示；根据试验期间的肿瘤大小绘制肿瘤生长曲线，如图17b所示。
从图17a可以看出，IGSF9抗体组、PD-1抗体组和IGSF9抗体和PD-1抗体联用组的小鼠肿瘤大小较对照抗体组小鼠肿瘤明显减小，其中IGSF9抗体和PD-1抗体联用组的小鼠肿瘤最小，且所有小鼠的肿瘤都受到了明显的抑制，个体间肿瘤大小无显著差异。从图17b可以看出，IGSF9抗体组、PD-1抗体组以及IGSF9抗体和PD-1抗体联用组的小鼠肿瘤生长明显受到抑制，其中将IGSF9抗体和PD-1抗体联用，肿瘤生长速度最慢，表明IGSF9抗体和PD-1抗体协同效应明显，能够显著抑制肿瘤的生长速度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种靶向人IGSF9的单克隆抗体，其特征在于，所述靶向人IGSF9的单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种权利要求1所述的靶向人IGSF9的单克隆抗体在制备抑制肿瘤生长的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物包括所述靶向人IGSF9的单克隆抗体和免疫抑制分子。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述免疫抑制分子包括PD-1，PD-L1、CTLA-4，TIM-3，LAG-3，CD160，BTLA。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括非小细胞肺癌、结肠癌和急性髓系白血病。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040258616A1 (en) * 2003-01-27 2004-12-23 Idec Pharmaceuticals Corporation Compositions and methods for treating cancer using IGSF9 and LIV-1
CN110563845A (zh) * 2019-09-12 2019-12-13 滨州医学院 抗igsf9抗体、药物组合物及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040258616A1 (en) * 2003-01-27 2004-12-23 Idec Pharmaceuticals Corporation Compositions and methods for treating cancer using IGSF9 and LIV-1
CN110563845A (zh) * 2019-09-12 2019-12-13 滨州医学院 抗igsf9抗体、药物组合物及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARCHANA MISHRA等: "Genetic Evidence for the Adhesion Protein IgSF9/Dasm1 to Regulate Inhibitory Synapse Development Independent of its Intracellular Domain", THE JOURNAL OF NEUROSCIENCE, vol. 34, no. 12, pages 4187 - 4199 *
刘祎璠等: "免疫抑制受体 IGSF9 单克隆抗体的制备以及功能验证", 滨州医学院学报, vol. 45, no. 4, pages 241 - 247 *

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