CN115724978A - 一种抗psma单链抗体及与其相关的嵌合抗原受体和应用 - Google Patents
一种抗psma单链抗体及与其相关的嵌合抗原受体和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗PSMA单链抗体及与其相关的嵌合抗原受体和应用。所述抗PSMA单链抗体的重链的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列，轻链的氨基酸序列包括SEQ IDNO.2所示的序列。本发明的抗PSMA单链抗体为人源化的PSMA的scFv抗体，在人体内功能更强，相合度更好，且不易被免疫系统排斥，本发明的嵌合抗原受体专一性地与PSMA结合后有更好的反应效果，使得CAR‑T细胞对肿瘤产生更强的免疫反应，相比于其他PSMA嵌合抗原受体也具有更好的长效性。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，涉及一种抗PSMA单链抗体及与其相关的嵌合抗原受体和应用。
背景技术
随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimericantigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。一般情况下，嵌合抗原受体CAR由一个肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区域以及胞内信号转导区组成。通常，CAR包含抗体的单链片段可变(Single chain fragmentvariable，scFv)区或对肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)具有特异性的结合结构域，其通过铰链和跨膜区与T细胞信号传导分子的胞质结构域偶联。最常见的淋巴细胞活化部分包括与T细胞效应物功能触发(例如CD3ζ)部分串联的T细胞共刺激结构域。
CAR介导的过继性免疫疗法允许CAR移植的T细胞以非HLA限制性的方式直接识别靶肿瘤细胞上的TAA。目前，CAR-T的治疗在血液肿瘤上取得了一定的效果，二代CD19CAR-T在复发难治的B系急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴白血病以及淋巴瘤上都被证实有抗肿瘤的功效，整体反应率根据肿瘤的不同约在50％～90％之间。
PSMA(prostate specific membrane antigen，前列腺特异膜抗原)广泛地表现在前列腺癌、肾癌、膀胱癌、胶质母细胞、脑瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤等肿瘤与肿瘤微环境微血管中，在正常组织中低量且局限性地表达，是一种免疫治疗理想的肿瘤相关抗原。目前此癌症抗原多应用于前列腺癌的治疗当中，此为发生在前列腺的上皮恶性肿瘤，是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤。但是不仅在前列腺肿瘤，PSMA也在大多肿瘤的基质组织微血管中高表达。
目前在胶质母细胞瘤、脑瘤的免疫治疗中，发展较为成熟的有针对PSMA的抗体治疗，这一方式在临床上取得了初步的成功。抗体施打后存在于外周血中，较难精准地进入肿瘤组织或肿瘤微小残留的部位，且无法长期存在体内。因此，制备一种嵌合抗原受体PSMACAR-T细胞，除了具有抗体治疗的优点，且由于T细胞本身的特性，可精准地进入肿瘤组织，并长期记忆性的存在于体内，能为复发难治的前列腺癌患者提供一个更有效的治疗选择。目前通过PSMA CAR-T治疗胶质母细胞瘤的临床报导皆初步显示了CAR-T的有效性，但仍缺乏长期观察的数据。
目前，CAR-T技术治疗实体肿瘤的效果并不十分理想，许多CAR-T的scFv区域多从鼠源的抗体衍生而来，鼠源scFv容易遭到人类免疫系统的排斥，造成CAR-T于体内无法长期存在，从而使治疗效果受限。有报导指出，这也是许多急性淋巴细胞白血病的病人，在使用CD19CAR-T完全缓解后又复发的原因之一，且也造成了再治疗的困难性。
因此，如何提供治疗效果好、持续时间长的人源化的PSMA CAR-T，已成为肿瘤免疫治疗技术领域亟待解决的问题之一。
发明内容
为达上述目的，本发明提供一种抗PSMA单链抗体及与其相关的嵌合抗原受体和应用，所述抗PSMA单链抗体具备高特异性和亲和力，能够高效结合PSMA，利用其PSMA嵌合抗原受体以及相应的CAR-T，可以清除PSMA阳性的实体肿瘤，有效靶向肿瘤微环境清除微小残留，且不会发生严重不良反应，提高了CAR-T的安全性、有效性、记忆性以及长期维持性。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明中，所述抗PSMA单链抗体为人源化的PSMA的scFv抗体，针对肿瘤表面抗原PSMA进行了人源化密码与人源化抗体结构(framework)的特异性改造，改造后的scFv抗体在人体内功能更强，相合度更好，且不易被免疫系统排斥。
本发明中，所述抗PSMA单链抗体的重链的氨基酸序列包括与SEQ ID NO.1具有80％以上的同一性的序列，所述抗PSMA单链抗体的轻链的氨基酸序列包括与SEQ ID NO.2具有80％以上的同一性的序列。
SEQ ID NO.1：
EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKISGYTFTEYTIHWVKQASGKGLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAGWNFDYWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSSEGSTKG。
SEQ ID NO.2：
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTIICKASQDVGTAVDWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYFCQQYNSYPLTFGGGTKLEIK。
第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子包括编码第一方面所述的抗PSMA单链抗体的核酸序列。
优选地，所述核酸分子的核苷酸序列与SEQ ID NO.3具有80％以上的同一性。
SEQ ID NO.3：
gaggtccaactggtgcagtctggtgctgaagtgaagaagcctggtgccagcgtgaagattagctgcaagattagcggctacaccttcaccgagtataccattcactgggtcaaacaagcctctggaaaagggctggaatggataggcaatatcaaccccaacaatggcggaacaacctacaaccaaaagtttgaggatcgtgccactctgacggttgacaagtccacgagcacagcctacatggagctgtcaagtctgaggtccgaggatactgcggtctactattgtgctgctgggtggaacttcgactattggggacagggtacgacagttactgtgtcctcaggctcaacatccggctctggaaagcctgggtccagtgaagggagcacaaaaggggacatcgtgatgacccagtctccaagcagccttagcgctagtgtaggggatcgagtgaccatcatctgcaaagcatctcaggacgtaggcactgcagtggattggtatcagcagaaaccaggaaaagcgccgaaactgttgatctactgggcaagtacacgccacactggagtcccagatcggtttaccgggtccggctcaggcactgacttcactctgaccatttcctctcttcagcccgaagattttgccgactacttctgtcagcagtacaatagctatcccctgacatttggcggtggaacaaagctcgagataaag。
第三方面，本发明提供一种PSMA嵌合抗原受体，所述PSMA嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，所述抗原结合结构域包括第一方面所述抗PSMA单链抗体。
本发明的PSMA嵌合抗原受体通过对针对肿瘤表面抗原PSMA人源化嵌合抗原受体的共刺激信号传导区进行特定的基因改造，结构示意图如图1所示，改造后的嵌合抗原受体在专一性地与PSMA结合后有更好的反应效果，能够使得CAR-T细胞对肿瘤产生更强的免疫反应，相比于其他PSMA嵌合抗原受体也具有更好的长效性。
优选地，所述跨膜结构域包括CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域。
优选地，所述共刺激信号传导区包括CD28和CD27信号结构传导区或CD28和IL-15Ra信号结构传导区。
优选地，所述CD28和CD27信号结构传导区的氨基酸序列与SEQ ID NO.4具有90％以上的同一性。
优选地，所述CD28和IL-15Ra信号结构传导区的氨基酸序列与SEQ ID NO.5具有90％以上的同一性。
优选地，所述PSMA嵌合抗原受体还包括诱导自杀融合结构域。
优选地，所述诱导自杀融合结构域包括胱天蛋白酶9结构域。
优选地，所述胱天蛋白酶9结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO.6具有90％以上的同一性。
优选地，所述PSMA嵌合抗原受体还包括信号肽和/或2A序列。
优选地，所述信号肽包括Secretory信号肽。
优选地，所述Secretory信号肽为CD8α基因的信号肽，所述Secretory信号肽的氨基酸序列为：MALPVTALLLPLALLLHAARP；或，所述Secretory信号肽可以为GM-CSFR基因的信号肽，所述Secretory信号肽的氨基酸序列为：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP；本领域技术人员可以根据实际情况对Secretory信号肽进行选择，在此不做特殊限定，Secretory信号肽的存在不会对本发明的嵌合抗原受体的性能产生影响。
SEQ ID NO.4：
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSASGGGGSGGGGSQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP。
SEQ ID NO.5：
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSASGGGGSGGGGSKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL。
SEQ ID NO.6：
MGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGGGGSGAMVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSAS。
根据本发明，所述PSMA嵌合抗原受体中信号肽为能够指导嵌合抗原受体跨膜转移的信号肽，本领域技术人员可以根据需要选择本领域常规的分泌蛋白基因信号肽。
根据本发明，所述诱导自杀融合结构域通过2A序列与CD3ζ信号传导结构域串联，所述2A序列可以使所述诱导自杀融合结构域表达的蛋白与所述PSMA嵌合抗原受体蛋白断裂开，从而使所述嵌合抗原受体发挥作用；通过注入激活剂，从而使诱导自杀融合结构域激活，从而导致嵌合抗原受体失去作用。
本发明中，所述嵌合抗原受体还包括铰链区，氨基酸序列为GSTSGSGKPGSSEGSTKG，或是多个GGGGS的重复组合，例如可以是：GGGGSGGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS。本领域技术人员可以根据实际情况对铰链区进行选择，在此不做特殊限定，铰链区的存在不会对本发明的嵌合抗原受体的性能产生影响。
优选地，所述PSMA嵌合抗原受体包括Secretory信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和诱导自杀融合结构域。
作为优选的技术方案，所述PSMA嵌合抗原受体为Secretory信号肽(Secretorysignal)、抗PSMA单链抗体(PSMscFv)、CD8α和/或CD28跨膜结构域、CD28和CD27信号结构传导区、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和胱天蛋白酶9结构域(FKBP.Casp9)串联而成，具体排列如下：Secretorysignal-PSMscFv-CD28-CD27-CD3ζ-2A-FKBP.Casp9，其中的CD28代表CD28胞外信号结构和跨膜结构域及其胞内信号结构传导区；或所述嵌合抗原受体为Secretory信号肽、抗PSMA单链抗体(PSMscFv)、CD8α和/或CD28跨膜结构域、CD28和IL-15Ra信号结构传导区、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和胱天蛋白酶9结构域(FKBP.Casp9)串联而成，具体排列如下：Secretorysignal-PSMAscFv-CD28-IL-15Ra-CD3ζ-2A-FKBP.Casp9，其中的CD28代表CD28跨膜结构域及其胞内信号结构传导区。
优选地，所述CD3ζ信号传导结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO.7所示的序列。
优选地，所述2A序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO.8所示的序列。
SEQ ID NO.7：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
SEQ ID NO.8：
TSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP。
本发明中，所述嵌合抗原受体还包括启动子，所述启动子为EF1α或任何一种高表达启动子。
第四方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第三方面所述的PSMA嵌合抗原受体。
第五方面，本发明提供一种病毒载体，所述病毒载体含有编码第三方面所述的PSMA嵌合抗原受体的核酸分子。
所述病毒载体含有至少一个拷贝的第四方面所述的核酸分子。
优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体或逆转录病毒载体，优选为慢病毒载体。
本发明中，所述病毒载体可有效修饰免疫细胞，从而制备靶向细胞。
第六方面，本发明提供一种重组病毒，所述重组病毒由第五方面所述的病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳动物细胞包装得到。
优选地，所述包装辅助质粒包括pNHP和pHEF-VSVG；
优选地，所述哺乳动物细胞包括293细胞、293T细胞或TE671细胞中的任意一种。
第七方面，本发明提供一种嵌合抗原受体细胞，所述嵌合抗原受体细胞表达第三方面所述的PSMA嵌合抗原受体。
本发明中，嵌合抗原受体细胞作用机理的示意图如图1，所述嵌合抗原受体细胞具有良好靶向杀伤作用，同时释放低剂量免疫因子，具备低毒性高免疫杀伤的反应性质。
优选地，所述嵌合抗原受体细胞由将编码第三方面所述的PSMA嵌合抗原受体的核酸分子转染到免疫细胞中制备得到。
优选地，所述转染的方式包括通过病毒载体转染、通过真核表达质粒转染或通过mRNA转染中的任意一种，优选为通过病毒载体转染。
优选地，所述免疫细胞包括T细胞。
第八方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包括第一方面所述的抗PSMA的单链抗体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的PSMA嵌合抗原受体、第五方面所述的病毒载体、第六方面所述的重组病毒或第七方面所述的嵌合抗原受体细胞中的任意一种或至少两种的组合。
第九方面，本发明提供第一方面所述的抗PSMA的单链抗体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的PSMA嵌合抗原受体、第五方面所述的病毒载体、第六方面所述的重组病毒、第七方面所述的嵌合抗原受体细胞或第八方面所述的组合物中的任意一种或至少两种的组合在制备肿瘤治疗药物中的应用。
优选地，所述肿瘤包括表达PSMA特异抗原的肿瘤。
优选地，所述肿瘤包括前列腺癌、淋巴瘤、肾癌、膀胱癌、结肠癌、神经母细胞瘤或脑瘤。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的抗PSMA单链抗体为人源化的PSMA的scFv抗体，针对肿瘤表面抗原PSMA进行了人源化密码与人源化抗体结构(framework)的特异性改造，改造后的scFv抗体在人体内功能更强，相合度更好，且不易被免疫系统排斥；
(2)本发明的嵌合抗原受体通过对针对肿瘤表面抗原PSMA人源化嵌合抗原受体的共刺激信号传导区进行特定的基因改造，改造后的嵌合抗原受体在专一性地与PSMA结合后有更好的反应效果，使得CAR-T细胞对肿瘤产生更强的免疫反应，相比于其他PSMA嵌合抗原受体也具有更好的长效性；
(3)本发明的嵌合抗原受体T细胞相较于其他的PSMA嵌合抗原受体T细胞具有更高的安全性与持久性，即使发生了过强的免疫反应引起病人的免疫因子风暴，由于具有诱导凋亡机制，也能通过诱导CAR-T细胞凋亡的药物将其撤除；本发明的嵌合抗原受体T细胞在进行CAR-T细胞回输后，可在体内长期监测到CAR-T的存在，证明其具有长效性，能使病人达到长期缓解的作用；
(4)本申请中的人源化抗体相关制剂可针对所有PSMA阳性疾病发挥作用，其中，已实际应用于表达肿瘤特异靶点PSMA的瘤病人中，有更小的临床副作用与更高的安全性，可有效清除对化疗不敏感的微小残留，此外，PSMA CAR-T也联合其他靶点CAR-T应用于脑瘤患者当中，并于病人体内长期监测到PSMA CAR-T的存在，有利于维持长期缓解。
附图说明
图1为嵌合抗原受体的结构和嵌合抗原受体T细胞的作用机理的示意图；
图2为PSMA CAR-T细胞对PSMA阳性肿瘤细胞株的体外杀伤图；
图3A为PSMA CAR-T治疗脑胶质瘤的流程示意图；
图3B为一位脑胶质瘤患者的肿瘤切片免疫组化染色结果图片(放大倍数为20×)；
图4为实施例8中PSMA CAR-T回输后体内CAR拷贝数检测的曲线图；
图5为PSMA CART输注前后患者脑部肿瘤病灶变化MRI图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种人源化的PSMA的scFv抗体，所述人源化的PSMA的scFv抗体具有结合PSMA抗原的活性；
所述人源化的PSMA的scFv抗体的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例2
本实施例提供一种嵌合抗原受体，其中嵌合抗原受体为Secretory信号肽(MALPVTALLLPLALLLHAARP)、抗PSMA单链抗体(SEQ ID NO.3)、CD28跨膜结构域、CD28和CD27信号结构传导区(SEQ ID NO.4)、CD3ζ信号传导结构域(SEQ ID NO.7)、2A序列(SEQ IDNO.8)和胱天蛋白酶9结构域(SEQ ID NO.6)串联而成，具体排列为：Secretory signal-PSMA scFv-CD28-CD27-CD3ζ-2A-FKBP.Casp9，其中的CD28代表CD28跨膜结构域及其胞内信号结构传导区，命名为嵌合抗原受体12313。
实施例3
本实施例提供一种慢病毒载体，所述慢病毒载体编码实施例2中的嵌合抗原受体。
其中，所述慢病毒载体的骨架载体为pTYF，具体可参见：Chang,L.-J.andZaiss,A.-K.(2001)Methods for the preparation and use of lentivirus vectors.Methodsin Molecular Medicine,Gene Therapy Protocols,2nd Ed.,pp 303-318,Ed.JeffreyMorgan,Humana Press,Inc.；Cui,Y.and Chang,L.-J.(2003)Detection and selectionof lentiviral vector transduced cells.“Methods in Molecular Biology Vol.229:Lentivirus Gene Engineering Protocols”pp 69-85,Ed.Maurizio Federico,HumanaPress,Inc；Oka,M.Chang,L.-J.,Costantini,F.,and Terada,N.(2005)Lentivirusmediated gene transfer in embryonic stem cells.Series:“Methods in MolecularBiology”Embryonic Stem Cells2.。
实施例4
本实施例提供一种重组慢病毒，所述重组慢病毒为实施例3中的慢病毒载体以及一个与靶细胞不相关的对照病毒蛋白(EBV LMP 2)抗体CAR慢病毒载体，与包装辅助质粒共转染哺乳动物细胞包装得到，步骤如下：
(1)培养293T细胞18h；
(2)加入新鲜的DMEM(Thermo Fisher)；
(3)在无菌离心管中加入以下试剂：每孔加入DMEM、包装辅助质粒(pNHP和pHEF-VSV-G)以及pTYF CAR DNA载体(具体操作可参见Chang,L.-J.and Zaiss,A.-K.(2001)Methods for the preparation and use of lentivirus vectors.Methods inMolecular Medicine,Gene Therapy Protocols,2nd Ed.,pp 303-318,Ed.JeffreyMorgan,Humana Press,Inc.)，漩涡振荡；
(4)将Superfect(Qiagene)加至离心管中，25℃静置8min；
(5)将离心管中的DNA-Superfect混合液逐滴加入培养细胞中，漩涡；
(6)37℃、CO2培养箱里培养5h；
(7)吸除培养液，用AIM-V(BRL)冲洗培养基，并加入新的AIM-V继续培养；
(8)将细胞放回CO2培养箱中培养过夜，第二天观察转染效率。
实施例5
本实施例进行慢病毒的纯化和浓缩。
1.病毒纯化
通过离心(1000×g)去除细胞碎片，得到病毒上清液，用低蛋白结合过滤器将病毒上清液过滤，分装，于-80℃储存。
2.用离心过滤器浓缩慢病毒
(1)在生物安全柜中，取浓缩离心管，消毒无菌清洗2次；
(2)每个离心过滤管中加入病毒上清液，离心直到病毒体积减小30倍；
(3)振荡过滤管，离心收集浓缩病毒到收集杯中，将所有管中的病毒集中到一个离心管中。
实施例6
本实施例提供2种嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞表达实施例2中的12312靶向PSMA的嵌合抗原受体，以及实施例4中的对照靶向LMP2嵌合抗原受体，制备方法如下：
将活化后的T细胞悬浮于培养液中并且添加10μg/mL的polybrene(Sigma)，培养液为含有细胞培养因子IL-2、IL-7与IL-15(购自Peprotech)的AIM-V，分别加入浓缩后的实施例5中的慢病毒，100×g、25℃离心100min后，置于37℃培养24h，加入培养液，培养4天后，将细胞收获并计数，培养2天后经过安全检测，输至病人体内。
实施例7
本实施例进行靶细胞相关(12313)与不相关(LMP2)的CAR-T体外杀伤试验。
(1)向PSMA阳性的两个细胞株：前列腺肿瘤细胞株LNCap2,与多发性骨髓瘤细胞株Molp2，通过慢病毒载体转入绿色荧光蛋白使其稳定表达；
(2)将LMP2CAR-T细胞作为阴性对照组，实施例6中的12313靶向PSMA的CAR-T作为实验组。将上述两种CAR-T细胞与步骤(1)的两种肿瘤置于37℃、5％CO2培养箱共培养1～8天，期间通过荧光显微镜每天观察记录肿瘤细胞的杀伤情形，结果如图2所示，可以看出PSMA CAR-T(12313)组的杀伤效果明显优于对照组(LMP2)。
实施例8
本实施例利用PSMA CAR-T细胞(12313CAR-T)治疗脑胶质瘤。
(1)征集1位难治脑胶质瘤患者作为对象，整体治疗流程如图3A所示。
(2)病人的肿瘤白片通过免疫组化染色确认PSMA的阳性表达，如图3B所示。
(3)采集病人白血球浓厚液，通过Ficoll密度梯度离心法分离白血球浓厚液中的外周血单个核淋巴细胞，并使用CD3磁珠筛选出T细胞并加入抗CD28的抗体(BDBiosciences)进行T细胞活化，以2×106CAR-T细胞数/千克体重进行后续的PSMA CAR-T制备。
(4)回输前病人以小剂量化疗进行预处理，预处理方案为250mg/m2的环磷酰胺处理3天，25mg/m2的氟达拉滨处理3天，预处理与CAR-T输入间隔24h，总共4天。
(5)以静脉注射的方式输注CAR-T细胞。
(6)输注后由临床医生对病人进行监测与毒性反应评估，临床毒性反应即免疫因子风暴(Cytokine release syndrome，CRS)，结果显示病人没有观察到CRS反应。
(7)输注前后通过MRI对患者肿瘤病灶进行评估，患者评估为病情稳定。
(8)输注后定期抽取病人的少量外周血，分离外周血单个核淋巴细胞后抽取细胞染色体DNA(gDNA)，使用专一性引物以qPCR方式(具体操作可参见Chang,L.-J.and Zaiss,A.-K.(2001)Methods for the preparation and use of lentivirus vectors.Methodsin Molecular Medicine,Gene Therapy Protocols,2nd Ed.,pp303-318,Ed.JeffreyMorgan,Humana Press,Inc.)定量外周血中CAR拷贝数，图4为胶质母细胞瘤患者输CAR-T细胞后定时抽血检测CAR拷贝数，病人体内PSMA CAR拷贝变化曲线图。图5为临床输注PSMA嵌合抗原受体T细胞治疗脑胶质瘤患者，CAR-T细胞输注前后患者脑部MRI图，结果显示，输细胞前5(-5)天肿瘤影像明显，输细胞后12天肿瘤假进展因CAR-T细胞浸润后变大，以及输CAR-T后55天肿瘤缩小。
综上所述，本发明所述的PSMA嵌合抗原受体具有更好的反应效果及长效性。应用于表达肿瘤特异靶点PSMA的胶质母细胞瘤病人中，具有更小的临床副作用与更高的安全性，可有效清除对化疗不敏感的微小残留。此外，PSMA CAR-T也可以联合其他靶点CAR-T应用于脑胶质瘤患者的治疗中，并且可以在病人体内长期监测到PSMA CAR-T的存在，对维持长期缓解有所助益。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种抗PSMA单链抗体，其特征在于，所述抗PSMA单链抗体的重链的氨基酸序列包括与SEQ ID NO.1具有80％以上的同一性的序列，所述抗PSMA单链抗体的轻链的氨基酸序列包括与SEQ ID NO.2具有80％以上的同一性的序列。
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码权利要求1所述的抗PSMA单链抗体的核酸序列。
3.一种PSMA嵌合抗原受体，其特征在于，所述PSMA嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域；
所述抗原结合结构域包括权利要求1所述抗PSMA单链抗体。
4.根据权利要求3所述的PSMA嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域包括CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域；
优选地，所述共刺激信号传导区包括CD28和CD27信号结构传导区或CD28和IL-15Ra信号结构传导区；
优选地，所述CD28和CD27信号结构传导区的氨基酸序列与SEQ ID NO.3具有90％以上的同一性；
优选地，所述CD28和IL-15Ra信号结构传导区的氨基酸序列与SEQ ID NO.4具有90％以上的同一性；
优选地，所述PSMA嵌合抗原受体还包括诱导自杀融合结构域；
优选地，所述诱导自杀融合结构域包括胱天蛋白酶9结构域；
优选地，所述胱天蛋白酶9结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO.5具有90％以上的同一性；
优选地，所述PSMA嵌合抗原受体还包括信号肽和/或2A序列；
优选地，所述信号肽包括Secretory信号肽；
优选地，所述PSMA嵌合抗原受体包括Secretory信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和诱导自杀融合结构域。
5.一种病毒载体，其特征在于，所述病毒载体含有编码权利要求3所述的PSMA嵌合抗原受体的核酸分子；
优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体或逆转录病毒载体，优选为慢病毒载体。
6.一种重组病毒，其特征在于，所述重组病毒由权利要求5所述的病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳动物细胞包装得到；
优选地，所述包装辅助质粒包括pNHP和pHEF-VSVG；
优选地，所述哺乳动物细胞包括293细胞、293T细胞或TE671细胞中的任意一种。
7.一种嵌合抗原受体细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体细胞表达权利要求3所述的PSMA嵌合抗原受体；
优选地，所述嵌合抗原受体细胞由将编码权利要求3所述的PSMA嵌合抗原受体的核酸分子转染到免疫细胞中制备得到；
优选地，所述转染的方式包括通过病毒载体转染、通过真核表达质粒转染或通过mRNA转染中的任意一种，优选为通过病毒载体转染；
优选地，所述免疫细胞包括T细胞。
8.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1所述的抗PSMA的单链抗体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的PSMA嵌合抗原受体、权利要求5所述的病毒载体、权利要求6所述的重组病毒或权利要求7所述的嵌合抗原受体细胞中的任意一种或至少两种的组合。
9.权利要求1所述的抗PSMA的单链抗体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的PSMA嵌合抗原受体、权利要求5所述的病毒载体、权利要求6所述的重组病毒或权利要求7所述的嵌合抗原受体细胞或权利要求8所述的组合物中的任意一种或至少两种的组合在制备肿瘤治疗药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括表达PSMA特异抗原的肿瘤；
优选地，所述肿瘤包括表达PSMA特异抗原的血液肿瘤和实体瘤；
优选地，所述肿瘤包括前列腺癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、膀胱癌、结肠癌、神经母细胞瘤或脑瘤。
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