JP2022512450A - Ｇｐｃ３を標的とする免疫エフェクター細胞およびその応用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＧＰＣ３を標的とするキメラ抗原受容体および外因性ＩＬ１２を発現する免疫応答細胞に関する。本発明は、前記免疫応答細胞を含む医薬組成物、および前記免疫応答細胞または医薬組成物を使用して腫瘍、特にＧＰＣ３陽性腫瘍を治療するための方法をさらに提供する。本発明の免疫応答細胞は、インビトロで固形腫瘍細胞に対して有効であるだけでなく、インビボで固形腫瘍細胞に対しても優れた殺傷効果を有する。

Description

本発明は、細胞免疫治療法の分野に属し、具体的なには、ＧＰＣ３を標的とする遺伝子修飾された免疫エフェクター細胞に関する。

キメラ抗原受容体操作Ｔリンパ球（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＣＡＲ－Ｔ）技術は、近年台頭した腫瘍生物療法に用いられる新しい策略である。キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ）は、腫瘍関連抗原を識別する一本鎖抗体と免疫細胞の活性化モチーフを結合したものであり、インビトロで、遺伝子工学の方法を介してＴリンパ球がキメラ抗原受容体を発現するようにして、Ｔ細胞の特異的な識別と腫瘍細胞を殺傷する能力を与える。現在、ＣＡＲ－Ｔは、血液系悪性腫瘍の治療応用において良好な治療効果を達成し、例えば、ＣＤ１９陽性のＢリンパ球性白血病患者の治療応用において大きな成功を得た。しかし、ＣＡＲ－Ｔは、依然として固形腫瘍の治療応用において非常に大きな挑戦に直面している。

インターロイキン－１２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２、ＩＬ１２）は、ヘルパーＴ細胞の増殖を促進し、ＮＫ細胞およびＴ細胞を誘導してγインターフェロンを生成させることができる、重要な免疫刺激サイトカインである。しかしながら、臨床実験において、ＩＬ１２の全身投与中に、肝臓機能異常、高熱、重度の血行力学的不安定性等の重度の副作用が複数の臓器で発生し、重度の患者は死亡につながり、ＩＬ１２の応用を制限することが判明された。

さらに、腫瘍、特に固形腫瘍の特殊性により、各腫瘍の微小環境も完全に異なり、ＩＬ１２を共発現する免疫エフェクター細胞が抗腫瘍効果、特に抗腫瘍効果を有意に増強するかどうかは不明であり、実験マウスの体重減少などの一定の副作用を引き起こす。さらに、ＣＡＲ Ｔ細胞と他のサイトカインとの併用も、大きな副作用や不十分なインビボ効果等の欠点が存在する。従って、具体的なキメラ抗原受容体免疫応答細胞と具体的なサイトカインとの併用によってどのような効果を発生するかは、合理的に予測されることはできない。

従って、当技術分野において、有意な抗腫瘍効果を有することができるが、副作用が低い免疫応答細胞が緊急に必要とされる。

本発明の目的は、有意な抗腫瘍効果を有するが、副作用が低い免疫応答細胞を提供することである。

第１の態様において、本発明は、免疫応答細胞を提供し、当該細胞は、ＧＰＣ３に特異的に結合する受容体および外因性ＩＬ１２を発現する。

具体的な実施形態において、前記受容体は、前記ＩＬ１２に操作可能に連結される。

具体的な実施形態において、前記免疫応答細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、細胞毒性Ｔリンパ球、ナチュラルキラーＴ細胞、ＤＮＴ細胞、および／または制御性Ｔ細胞を含む。

具体的な実施形態において、前記外因性ＩＬ１２は、構成的発現または誘導型発現であり、好ましくは、前記ＩＬ１２を発現するために使用されるプロモーターは、免疫細胞誘導型プロモーターを含み、好ましくは、前記免疫細胞誘導型プロモーターは、ＮＦＡＴ６プロモーターである。

具体的な実施形態において、前記受容体は、ＧＰＣ３に特異的に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナルドメインを有する。

具体的な実施形態において、前記受容体は、キメラ抗原受容体であり、ここで、前記細胞内ドメインは、細胞刺激シグナル分子、または細胞刺激シグナル分子と細胞活性化共刺激分子との組み合わせを含み、

好ましくは、前記細胞刺激シグナル分子は、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＦｃεＲＩγ、ＦｃＲβ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｆｃ γＲＩＩａ、ＤＡＰ１０、またはＤＡＰ１２タンパク質機能的シグナル伝達ドメインから選択され、より好ましくは、ＣＤ３ζであり、または

好ましくは、前記細胞活性化共刺激分子は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２Ｄのようなタンパク質機能的シグナル伝達ドメインから選択され、より好ましくは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、およびＩＣＯＳである。

具体的な実施形態において、前記受容体の細胞外ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。

具体的な実施形態において、前記受容体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、２２、２３、または２４に示されるアミノ酸配列を含むか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、２２、２３、または２４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。

具体的な実施形態において、前記受容体および前記外因性ＩＬ１２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、２８、または２９と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。

具体的な実施形態において、前記免疫応答細胞は、外因性共刺激リガンドを含まない。

具体的な実施形態において、前記受容体および／または前記ＩＬ１２は、免疫応答細胞の表面に構成的または誘導的に発現される。

具体的な実施形態において、前記免疫応答細胞は、発現構築物を含み、当該発現構築物は、前記抗原結合受容体の発現カセット、および前記ＩＬ１２の発現カセットを含む。

具体的な実施形態において、前記受容体および／またはＩＬ１２は、ウイルスベクターを使用して発現し、好ましくは、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、逆転写ウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターを含む。

具体的な実施形態において、前記免疫応答細胞が個体に投与された後、前記個体の末梢血中のＣＡＲ－Ｔ細胞の数は、前記外因性ＩＬ１２が存在しない状況に比較して少なくとも５０％増加する。

具体的な実施形態において、前記免疫応答細胞が個体に投与されてから約７日後、前記個体の末梢血中のＣＡＲ－Ｔ細胞の数の合計は、６０００個／μＬを超え、前記免疫応答細胞が投与されてから約１０日後、前記個体の末梢血中のＣＡＲ－Ｔ細胞の数の合計は、６０００個／μＬを超える。

好ましい実施形態において、本発明の免疫応答細胞は、例えば、１＊１０^７細胞／Ｌ未満の低い用量の本発明とは異なる免疫応答細胞（即ち、ＧＰＣ３に特異的に結合する受容体および外因性ＩＬ１２を同時に発現しない免疫エフェクター細胞）によって制御できない腫瘍、または体積が大きすぎる腫瘍（例えば、マウス腫瘍モデルにおいて体積が３００ｍｍ^３を超える腫瘍、さらに６００ｍｍ^３を超える腫瘍）に対して優れた殺傷効果を有する。

第２の態様において、本発明は、発現構築物を提供し、当該発現構築物は、順次に連結された受容体の発現カセットおよびＩＬ１２の発現カセットを含み、ここで、前記抗原結合受容体およびＩＬ１２は、本発明の第１の態様に記載されたとおりである。

第３の態様において、本発明は、必要とする個体の腫瘍を治療するための医薬組成物の調製における本発明第１の態様に記載の免疫応答細胞の用途を提供する。

具体的な実施形態において、前記腫瘍は、肝臓臓がん、胃がん、肺がん、乳がん、頭頚部がん、膀胱がん、卵巣がん、子宮頸がん、腎臓がん、膵臓がん、子宮頸がん、脂肪肉腫、黒色腫、副腎がん、神経鞘腫、悪性線維性組織球腫、および食道がんを含み、好ましくは、前記腫瘍は、肝臓臓がん、胃がん、肺がん、または乳がんである。

具体的な実施形態において、前記免疫エフェクター細胞は、腫瘍を少なくとも５０％減少させる。

具体的な実施形態において、前記免疫エフェクター細胞は、腫瘍を少なくとも７０％減少させ、より好ましくは、前記免疫エフェクター細胞は、腫瘍を少なくとも８０％減少させる。

第４の態様において、本発明は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、
本発明の第１の態様に記載の免疫応答細胞、および
薬学的に許容されるベクターまたは賦形剤を含む。
第５の態様において、本発明は、
本発明第１の態様に記載の免疫応答細胞、および
前記免疫応答細胞を個体に投与する方法を指導する取扱説明書を含むキットを提供する。

本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。

図１Ａは、ＣＡＲ－Ｔ細胞によって調製されたプラスミド構造の模式図である。図１Ｂは、ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ／ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ細胞の表面でのＣＡＲ発現状況のＦＡＣＳ検出を示す。 インビトロでのＣＡＲ細胞－Ｔの毒性実験の結果を示す。 図３Ａは、ＣＡＲ－Ｔを腫瘍細胞と共に２４時間インキュベートされた場合のＩＬ－１２の分泌状況を示す。図３Ｂは、ＣＡＲ－Ｔを腫瘍細胞と共に２４時間インキュベートされた場合のＩＬ－２／ＴＮＦ－α／ＩＦＮ－γの分泌状況を示す。 図４Ａは、異なる実験グループにおけるＨｕｈ－７皮下移植腫瘍の成長状況を示す。図４Ｂは、異なる実験グループにおけるＨｕｈ－７皮下移植腫瘍マウスの体重変化を示す。 ７日目および１０日目の異なるＣＡＲ－Ｔの末梢血の生存細胞の数を示す。 ＣＡＲ－Ｔ注射後１０日目の血清サンプルのＩＦＮ－γの量を示す。 腫瘍組織における浸潤性Ｔ細胞およびＫｉ６７に対して免疫組織化学的検出を行われた結果を示す。 実験終了時のマウス皮下腫瘍の成長状況を示す。 ｍＣＡＲ－Ｔ／ｍＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔ細胞の表面でのＣＡＲ発現状況のＦＡＣＳ検出を示す。

インビトロでのｍＣＡＲ－Ｔの毒性実験の結果グラフである。 図１１Ａは、ＵＴＤ、ｍＧＰＣ３－ＣＡＲ、ｍＧＰＣ３－ｍ２８Ｚ－ｍＮＦＡＴ６－ｍＩＬ１２を腫瘍細胞と共に２４時間インキュベートされた場合のｍＩＬ－１２の分泌状況を示す。図１１Ｂは、ＵＴＤ／ｍＧＰＣ３－ｍ２８Ｚ／ｍＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔを腫瘍細胞と共に２４時間インキュベートされた場合のサイトカインｍＩＬ－２、ｍＴＮＦ－α、ｍＩＦＮ－γ放出状況を示す。 Ｅ０７７１－ＧＰＣ３皮下移植腫瘍の治療効果を示す。 図１３Ａは、ｍＩＬ１２－ＧＰＣ３－Ｔ ５Ｘ１０^６／匹グループおよびｍＩＬ１２－ＧＰＣ３－Ｔ ２Ｘ１０^６／匹グループの尾静脈注射の実験結果を示す。図１３Ｂは、ｍＩＬ１２－ＧＰＣ３－Ｔの投与後、ｍＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔグループおよびブランク対照グループのマウスの体重を示す。

発明者らは、広範囲にわたる詳細な研究の後、免疫応答細胞においてＧＰＣ３に特異的に結合する受容体および外因性ＩＬ１２が有意な抗腫瘍効果を有することができるが、副作用が低いことを予期せずに発見した。これに基づいて本発明を完了した。

以下、具体的な説明は、本明細書に開示される実施形態を詳細に示す。本明細書は、本明細書に開示された具体的な実施形態に限定されることを意図するものではなく、変更されえることを理解されたい。当業者は、本明細書に開示される内容が様々な変更または変化を有することができ、これはすべて開示された範囲および原理によってカバーされることを理解するであろう。特に明記しない限り、各実施形態は、すべて他の任意の実施形態と任意に組み合わせることができる。

本明細書に開示される特定の実施形態は、数値範囲を含み、本発明の特定の態様は、範囲の形態で説明することができる。特に明記しない限り、数値範囲または範囲で説明する形態は、簡潔さおよび便宜のためだけのものであり、本発明の範囲対する厳密な制限と見なされるべきではないことを理解されたい。従って、範囲形態を使用する説明は、これらの範囲と数値ポイントが本明細書で明確に記述されているように、すべての可能なサブ範囲および当該範囲内のすべての可能な具体的な数値ポイントを具体的に開示することを見なされるべきである。例えば、１～６の範囲の説明は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６および３～６等のサブ範囲、ならびに１、２、３、４、５および６の範囲内の具体的な数値ポイントを具体的に開示することを見なされるべきである。前記数値の幅に関係なく、前記原則は、すべて等しく適用される。範囲で説明する場合、当該範囲は、範囲の端点を含む。

用語
本明細書で使用される「活性化」および「アクティブ化」という用語は、交換可能に使用され、それたおよび他の文法形態は、細胞が休止状態から活性状態に変化する過程を指すことができる。当該過程は、抗原、遊走および／または機能的活性状態の表現型または遺伝的変化に対応する応答を含む。例えば、「活性化」という用語は、Ｔ細胞の段階的な活性化過程を指すことができる。例えば、Ｔ細胞は、完全に活性化するために少なくとも二つのシグナルを必要とする可能性がある。第１のシグナルは、ＴＣＲが抗原－ＭＨＣ複合体によって結合された後に発生る可能性があり、第２のシグナルは、共刺激分子（表３にリストされた共刺激分子を参照）の結合によって発生する可能性がある。インビトロにおいて、抗ＣＤ３は、前記第１のシグナルをシミュレートすることができ、抗ＣＤ２８は、前記第２のシグナルをシミュレートすることができる。例えば、操作されたＴ細胞は、発現されたＣＡＲによって活性化されることができる。本明細書で使用されるＴ細胞活性化またはＴ細胞トリガーは、検出可能な細胞増殖、サイトカイン生成および／または検出可能なエフェクター機能を誘導するために十分に刺激されたＴ細胞の状態を指すことができる。

本明細書で使用される「受容体」という用語は、細胞膜または細胞内に存在し、細胞外の特定のシグナル分子に結合して細胞内の一連の生化学反応を活性化して、細胞が外部刺激に対して対応するエフェクターを生み出す特定のタンパク質である。受容体に結合する生物学的活性物質は、まとめてリガンド（ｌｉｇａｎｄ）と呼ばれる。受容体とリガンドとの結合は、分子コンフォメーション変化をもたらすことにより、細胞間シグナル形質転換の媒介、細胞間接着、エンドサイトーシス等の過程の細胞反応を引き起こす。

本明細書で使用される「共刺激リガンド」という用語は、Ｔ細胞上の相同性共刺激分子に特異的に結合し、それによってシグナルを提供し、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドをロードしたＭＨＣ分子の結合によって提供される第１のシグナルと共に、増殖、活性化および分化等を含むがこれらに限定されないＴ細胞応答を媒介する、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞およびＢ細胞等）上の分子を含む。共刺激リガンドは、ＣＤ７、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＰＤ－Ｌ、ＰＤ－Ｌ２、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導型共刺激リガンド（ＩＣＯＳ－Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ－Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体およびＢ７－Ｈ３に特異的に結合するリガンドを含むが、これらに限定されない。共刺激リガンドは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンド等を含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体をさらに特別に含む。

本明細書で使用される「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドに特異的に結合し、それによって増殖等であるがこれらに限定されないＴ細胞の共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の相同性結合パートナーを指す。共刺激分子は、ＭＨＣ Ｉ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体を含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「共刺激シグナル」とは、ＴＣＲ／ＣＤ３等の細胞刺激シグナル分子に結合し、組み合わせによってＴ細胞増殖および／または重要分子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションをもたらすシグナルを指す。

本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、Ｔ細胞を含むがこれらに限定されない免疫細胞によって発現されることができる操作された分子を指す。ＣＡＲは、Ｔ細胞で発現されかつＴ細胞をリダイレクトして、人工受容体によって決定される標的細胞の特異的死滅を誘導することができる。ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、マウス、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体に由来されることができる。

本明細書で使用される「操作された」および文法上の他の形態という用語は、生物のゲノム内の核酸等の核酸における一つまたは複数の変化を指すことができる。「操作された」という用語は、遺伝子の変更、追加および／または欠失を指すことができる。操作された細胞は、遺伝子が追加、欠失および／または変更された細胞を指すこともできる。

本明細書で使用される「細胞」または「操作された細胞」および文法上の他の形態という用語は、ヒトまたは非ヒト動物起源の細胞を指すことができる。操作された細胞は、ＣＡＲを発現する細胞を指すこともできる。

本明細書で使用される「トランスフェクション」という用語は、真核細胞への外因性核酸の導入を指す。トランスフェクションは、リン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染およびバイオリステック技術（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）を含む、当該技術分野で知られている様々な手段によって達成することができる。

「安定トランスフェクション」または「安定したトランスフェクション」という用語は、導入およびトランスフェクトされた細胞のゲノムへの外因性核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡの導入および統合を指す。「安定トランスフェクション体」（ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）という用語は、外来ＤＮＡをゲノムＤＮＡに安定して統合する細胞を指す。

本明細書で使用される「核酸分子コード」、「ＤＮＡ配列をコードする」および「ＤＮＡをコードする」という用語は、デオキシリボ核酸鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または順序を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。従って、核酸配列は、アミノ酸配列をコードする。

本明細書で使用される「個体」という用語は、哺乳動物または有袋類等の任意の動物を指す。本発明の個体は、ヒト、ヒト以外の霊長類動物（例えば、アカゲザルまたは他の種類のマカク等）、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラットおよび任意の種類の家畜を含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「末梢血リンパ球」（ＰＢＬ）という用語および文法上の他の形態は、血液（例えば、末梢血）中を循環するリンパ球を指すことができる。末梢血リンパ球は、臓器に限定されないリンパ球を指すことができる。末梢血リンパ球は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞または他の任意の組み合わせを含むことができる。

本明細書で使用される「免疫応答細胞」または「免疫反応性細胞」という用語は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＤＮＴ細胞等、ならびにそれぞれの前駆体細胞およびその子孫を含むがこれらに限定されない、免疫応答を誘発することができる細胞を指すことができる。免疫応答細胞は、リンパ系または骨髄系の細胞を指すことができる。

本明細書で使用される「Ｔ細胞」という用語および文法上の他の形態は、任意の起源のＴ細胞を指すことができる。例えば、Ｔ細胞は、自己Ｔ細胞等の一次Ｔ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヒトまたは非人のものでもあり得る。

本明細書で使用される「Ｔ細胞活性化」または「Ｔ細胞活性化」という用語および文法上の他の形態は、検出可能な細胞増殖、サイトカインの生成、および／または検出可能なエフェクター機能状態を誘導するために十分に刺激されるＴ細胞の状態を指す。いくつかの状況において、「完全なＴ細胞活性化」は、Ｔ細胞の細胞毒性のトリガーに類似することができる。当技術分野で知られている様々なアッセイを使用して、Ｔ細胞の活性化を測定することができる。前記アッセイは、サイトカイン分泌を測定するためのＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、細胞内サイトカイン発現を測定するためのフローサイトメトリーアッセイ（ＣＤ１０７）、増殖を測定するためのフローサイトメトリーアッセイ、および標的細胞の除去を決定するための細胞毒性アッセイ（５１Ｃｒ放出アッセイ）であり得る。前記アッセイは、一般に対照（非操作細胞）を使用して操作細胞（ＣＡＲ Ｔ）と比較して、対照と比較した操作細胞の相対的活性化を決定する。さらに、前記アッセイは、標的抗原を発現しない標的細胞とインキュベートまたは接触させた操作細胞と比較することができる。例えば、前記比較は、ＧＰＣ３を発現しない標的細胞とインキュベートされたＧＰＣ３－ＣＡＲＴ細胞との比較であり得る。

ヌクレオチド配列を指すために使用される場合、本明細書で使用される「配列」という用語および文法上の他の形態は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得、一本鎖または二本鎖であり得る。核酸配列は、突然変異させることができる。核酸配列は、任意の長さを有することができる。

本明細書で使用される「有効量」という用語は、治療的または予防的利益を提供する量を指す。

本明細書で使用される「発現ベクター」という用語は、発現されるヌクレオチド配列に効果的に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含む、ベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用要素（ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞またはインビトロ発現システムによって提供されることができる。発現ベクターは、コスミド、プラスミド（例えば、露出またはリポソームに含まれる）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）等の当技術分野で知られているすべてのものを含む。

本明細書で使用される「レンチウイルス」という用語は、レトロウイルス科の属を指す。レトロウイルスは、非分裂細胞に感染する能力においてレトロウイルスで独特であり、それらは、宿主細胞のＤＮＡに大量の遺伝情報を送達することができるため、遺伝子送達ベクターの最も効果的な方法の一つである。ＨＩＶ、ＳＩＶおよびＦＩＶは、すべてレンチウイルスの実例である。レンチウイルスに由来するベクターは、インビボで有意なレベルの遺伝子導入を達成する手段を提供する。

本明細書で使用される「操作可能に連結される」という用語は、調節配列と他の核酸配列との間の機能を連結を指し、例えば、当該連結は、後者の発現をもたらす。例えば、第１の核酸配列と第２の核酸配列とが機能的な関係になる場合、第１の核酸配列と第２の核酸配列とは、操作可能に連結される。

本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するために必要とされる細胞の合成メカニズムまたは導入された合成メカニズムによって識別されるＤＮＡ配列として定義される。

本明細書で使用される「ベクター」という用語は、単離された核酸を含みかつ単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用される組成物である。当技術分野で知られている多くのベクターは、線状ポリヌクレオチド、イオンまたは両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含むが、これらに限定されない。従って、「ベクター」という用語は、自律的に複製したプラスミドまたはウイルスを含む。当該用語は、ポリリジン化合物、リポソーム等の核酸の細胞への移動を容易にする非プラスミドおよび非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの実例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用される配列「相同性」という用語は、比較ウインドウ（例えば、少なくとも２０個の位置）にわたって二つの最も一致する配列を比較することによって相同性のパーセンテージを決定し、ここで、比較ウインドウのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、追加または欠失（即ち、ギャップ）を含み得、例えば、ベストマッチの二つの配列と参照配列（追加または欠失を含まない）の間には、２０％またはより少ないギャップ（例えば、５～１５％、または１０～１２％）がある。通常、二つの配列で同じ核酸塩基またはアミノ酸残基が発生する位置の数を決定することによりパーセンテージを計算して、正しく一致する位置の数を生成すようにし、正しく一致した位置の数を参照配列内の位置の総数（即ち、ウインドウの大きさ）で割り、結果に１００をかけて、配列相同性のパーセンテージを生成する。

本明細書で使用される「ＩＬ１２」、「インターロイキン－１２」および「インターロイキン－１２」という用語は、交換可能に使用することができる。同じ意味を有する。本明細書で使用される「ＩＬ１２」という用語は、様々な生物学的活性を有する免疫調節因子であり、例えば、「ＩＬ１２」という用語は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６で定義されるヒトＩＬ１２またはその活性フラグメントを指すことができ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に定義されるマウスＩＬ１２またはその活性フラグメントを指すこともでき、他の種でもあり得る。

いくつかの実施形態において、前記ＧＰＣ３に特異的に結合する受容体を構築する要素または前記ＩＬ１２は、天然に存在することができ、例えば、哺乳動物から単離または精製されることができ、人工的に調製することができ、例えば、組換え要素またはＩＬ１２は、従来の遺伝子工学組替え技術に従って製造することができる。好ましくは、本発明は、組換え要素またはＩＬ１２を使用することができる。

前記各要素またはＩＬ１２ポリペプチド配列の基礎において、一つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失または追加によって形成されるアミノ酸配列も本発明に含まれる。アミノ酸の適切な置換は、当技術分野で周知の技術であり、前記技術は、容易に実施することができかつ得られた分子の生物学的活性芽変化しないことを保証する。これらの技術により、当業者は、一般にポリペプチドの非必要領域の単一のアミノ酸基を変更しても、生物学的活性は、実質的に変更されないことを認識されたい。

前記各要素またはＩＬ１２のポリペプチドの生物学的活性フラグメントは、すべて本発明に適用されることができる。ここで、前記生物学的活性フラグメントは、完全長ポリペプチドの一部であっても完全長ポリペプチドの全部または一部の機能を保持するポリペプチドであることを意味する。通常な状況において、前記生物学的活性フラグメントは、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも５０％を保持する。より好ましい条件において、前記活性フラグメントは、完全長ポリペプチドの活性の６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％を保持することができる。

前記各要素またはＩＬ１２ポリペプチド配列の基礎において、修飾または改良されたポリペプチドも本発明に適用されることができ、例えば、その半減期、有効性、代謝、および／またはポリペプチドの効力を促進するために修飾または改良されたポリペプチドを使用することができる。つまり、ポリペプチドの生物学的活性に影響を及ぼさない任意の変化形態は、本発明に使用することができる。

本明細書で使用される「腫瘍」という用語は、細胞または組織の病理学的増殖を特徴とする疾患、およびその後の他の組織または器官の遊走または浸潤を指す。腫瘍の成長は、通常制御されたおらず進行性であり、正常な細胞増殖を誘導または阻害しない。腫瘍は、膀胱、乳房、食道、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、子宮器官、または組織あるいは対応する細胞を含むがこれらに限定されない、様々な細胞、組織または器官に影響を与えることができる。本発明に記載の腫瘍は、肝臓がん、胃がん、肺がん、乳がん、頭頚部がん、膀胱がん、卵巣がん、子宮頚がん、腎臓がん、膵臓がん、子宮頚がん、脂肪肉腫、黒色腫、副腎がん、神経鞘腫、悪性線維性組織球腫、食道がんを含むことができるが、これらに限定されない。好ましくは、前記「腫瘍」は、肝臓がん、胃がん、肺がん、乳がんを含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「免疫応答細胞機能の増強」という用語は、例えば、Ｔ細胞機能の増強を含む。Ｔ細胞を例として、Ｔ細胞機能の増強は、Ｔ細胞が持続または増強された生物学的機能を有するか、または枯渇（ｅｘｈａｕｓｔｅｄ）または不活性なＴ細胞を更新または再活性化するようにＴ細胞を誘導、誘発または刺激することを指す。Ｔ細胞機能の増強の実例としては、介入前のレベルと比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞による分泌するインターフェロンの増加、増殖の増加、抗原反応性（例えば、ウイルスまたは病原体のクリアランス率）の増加を含む。一実施形態において、増強レベルは、少なくとも５０％、または６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％である。このような増強を測定する方法は、当業者に知られている。

本明細書で使用される「外因性」という用語は、細胞内で内因性発現を有さないか、または発現レベルが過剰発現された場合に有する機能を達成するのに不十分である一つの核酸分子またはポリペプチドを指す。従って、「外因性」は、外因性、異種および過剰発現された核酸分子およびポリペプチド等の、細胞内で発現される組換え核酸分子またはポリペプチドを含む。

本明細書で使用される「受容体」という用語は、細胞膜上で一つまたは複数のリガンドに選択的に結合するポリペプチド、またはその一部を指す。

いくつかの実施形態において、本発明の抗原結合受容体は、キメラ抗原受容体である。本明細書で使用される「キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ）」という用語は、Ｔ細胞を活性化することができる、細胞内シグナル形質転換ドメインに融合された腫瘍抗原結合ドメインを指す。一般に、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、マウスまたはヒト化またはヒトのモノクローナル抗体に由来する。

キメラ抗原受容体は、通常細胞外抗原結合領域を含む。いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合領域は、完全に人であり得る。他の状況において、細胞外抗原結合領域を完全にヒト化することができる。他の状況において、細胞外抗原結合領域は、マウス起源であり得るか、または前記細胞外抗原結合領域のキメラが少なくとも二つの異なる動物からのアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態において、前記細胞外抗原結合領域は、非ヒトであり得る。

様々な抗原結合領域を設計することができる。非限定的な実例としては、抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ライブラリーから選択されるフラグメント抗原結合領域（Ｆａｂ）、単一ドメインフラグメントまたはその同族受容体に結合する天然リガンドを含む。いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合領域は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂまたは天然リガンド、およびそれらの任意の誘導体を含むことができる。細胞外抗原結合領域は、完全な抗体の一部を含みかつ完全な抗体に結合される抗原に結合する完全な抗体以外の分子を指すことができる。抗体フラグメントの実例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、二機能性抗体、線状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、および抗体フラグメントから形成された多重特異的抗体を含むが、これらに限定されない。

ｓｃＦｖ、Ｆａｂまたは天然リガンド等の細胞外抗原結合領域は、抗原特異性を決定するＣＡＲの一部であることができる。細胞外抗原結合領域は、任意の相補的標的に結合することができる。細胞外抗原結合領域は、既知の可変領域配列を有する抗体に由来することができる。細胞外抗原結合領域は、得られることができるマウスハイブリドーマから得られた抗体配列から得ることができる。あるいは、腫瘍細胞または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）等の一次細胞の全細胞外切断配列から細胞外抗原結合領域を得ることができる。

いくつかの状況において、細胞外抗原結合領域の結合特異性は、相補性決定領域または軽鎖ＣＤＲまたは重鎖ＣＤＲ等のＣＤＲによって決定されることができる。多くの状況において、結合特異性は、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲによって決定されることができる。他の参照抗原と比較して、所与の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲの組み合わせは、抗原（例えば、ＧＰＣ３）により大きな親和性および／または特異性を与えることができる、所与の結合ポケットを提供することができる。例えば、グリピカン３に特異的なＣＤＲは、ＣＡＲの細胞外結合領域で発現することができ、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲが、ＧＰＣ３を発現する腫瘍細胞に、免疫応答細胞を標的化することができる。

本明細書に開示される実施形態のいずれかの特定の態様において、ｓｃＦｖ等の細胞外抗原結合領域は、抗原に特異的な軽鎖ＣＤＲを含むことができる。軽鎖ＣＤＲは、ＣＡＲ等の抗原結合ユニットのｓｃＦｖ軽鎖の相補性決定領域であることができる。軽鎖ＣＤＲは、連続するアミノ酸残基の配列、または非相補性決定領域（例えば、フレームワーク領域）によって間隔された二つ以上の連続するアミノ酸残基の配列を含むことができる。いくつかの状況において、軽鎖ＣＤＲは、軽鎖ＣＤＲ－１、ＣＤＲ－２等と呼ばれることができる、二つ以上の軽鎖ＣＤＲを含むことができる。いくつかの状況において、軽鎖ＣＤＲは、それぞれ軽鎖ＣＤＲ－１、軽鎖ＣＤＲ－２および軽鎖ＣＤＲ－３と呼ばれることができる、三つの軽鎖ＣＤＲを含むことができる。いくつかの実例において、通常の軽鎖上に存在する一組のＣＤＲは、まとめて軽鎖ＣＤＲと呼ばれることができる。

本明細書に開示される実施形態のいずれかの特定の態様において、ｓｃＦｖ等の細胞外抗原結合領域は、抗原に特異的な重鎖ＣＤＲを含むことができる。重鎖ＣＤＲは、ｓｃＦｖ等の抗原結合ユニットの重鎖相補性決定領域であることができる。重鎖ＣＤＲは、アミノ酸残基の連続配列、または非相補性決定領域（例えば、フレームワーク領域）によって間隔された二つ以上のアミノ酸残基の連続配列を含むことができる。いくつかの状況において、重鎖ＣＤＲは、重鎖ＣＤＲ－１、ＣＤＲ－２等と呼ばれることができる、二つ以上の重鎖ＣＤＲを含むことができる。いくつかの状況において、重鎖ＣＤＲは、それぞれ重鎖ＣＤＲ－１、重鎖ＣＤＲ－２および重鎖ＣＤＲ－３と呼ばれることができる、三つの重鎖ＣＤＲを含むことができる。いくつかの状況において、共通の重鎖上に存在する一組のＣＤＲは、まとめて重鎖ＣＤＲと呼ばれることができる。

遺伝子工学を使用することにより、様々な方法で細胞外抗原結合領域を修飾することができる。いくつかの状況において、細胞外抗原結合領域を突然変異させることにより、標的により高い親和性を有するように細胞外抗原結合領域を選択することができる。いくつかの状況において、その標的に対応する細胞外抗原結合領域に親和性は、正常組織上で低レベルで発現されることができる標的対して最適化されることができる。潜在的な毒性を最小限に抑えるために、最適化を行うことができる。他の状況において、標的の膜結合形態に対してより高い親和性を有する細胞外抗原結合領域のクーロンは、その可溶性形態の対応物よりも優れることができる。異なるレベルの可溶性形態の標的を検出することができ、それらの標的が望ましくない毒性を引き起こすことができるため、このような修飾を行うことができる。

いくつかの状況において、細胞外抗原結合領域は、ヒンジまたは間隔領域を含む。ヒンジおよび間隔領域という用語は、交換可能に使用されることができる。ヒンジは、細胞外抗原結合領域に柔軟性を提供するために使用されるＣＡＲの一部と見なすことができる。いくつかの状況において、ヒンジは、細胞の細胞表面のＣＡＲを検出するために使用されることができ、特に、検出細胞外抗原結合領域を検出する抗体が効果ないか、または利用できない場合に使用される。例えば、免疫グロブリンに由来するヒンジの長さは、細胞外抗原結合領域によって標的とされる標的のエピトープの位置に応じて、最適化される必要があるかもしれない。

いくつかの状況において、ヒンジは、免疫グロブリンに属していない可能性があり、ＣＤ８α分子の天然ヒンジ等の別の分子に属する。ＣＤ８αヒンジは、ＣＤ８補助受容体とＭＨＣ分子との相互作用に役割を果たすことが知られているシステインおよびプロリン残基を含むことができる。前記システインおよびプロリン残基は、前記ＣＡＲの性能に影響を与えることができる。

ＣＡＲヒンジのサイズは、調節することができる。免疫応答細胞と標的細胞との間の免疫シナプスのこのような形態は、細胞表面の標的分子上の膜遠端エピトープのために、ＣＡＲによって機能的に橋渡しすることができない距離を限定し、即ち、短いヒンジＣＡＲを使用しても、シナプス距離がシグナルを伝達することができる近似値に達することはできない。同様に、膜近端ＣＡＲ標的抗原エピトープは、長いヒンジＣＡＲのコンテキストでのみシグナル出力が観察される。使用される細胞外抗原結合領域に応じて、ヒンジを調節することができる。ヒンジの長さは、任意であり得る。

膜貫通ドメインは、ＣＡＲを細胞の原形質膜に固定することができる。ＣＤ２８の天然膜貫通部分は、ＣＡＲに使用されることができる。他の状況において、ＣＡＲにＣＤ８αの天然膜貫通部分を使用することができる。「ＣＤ８」は、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００１７５９またはその刺激活性を有するフラグメントと少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の相同性を有するタンパク質であり得る。「ＣＤ８核酸分子」は、ＣＤ８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得、いくつかの状況において、膜貫通領域は、ＣＤ２８の天然膜貫通部分であり得、「ＣＤ２８」は、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００６１３０またはその刺激活性を有するフラグメントと少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の相同性を有するタンパク質を指すことができる。「ＣＤ２８核酸分子」は、ＣＤ２８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。いくつかの状況において、膜貫通部分は、ＣＤ８α領域を含むことができる。

ＣＡＲの細胞内シグナルドメインは、ＣＡＲが配置されている免疫応答細胞のエフェクター機能の少なくとも一つを活性化することに関与することができる。ＣＡＲは、Ｔ細胞のエフェクター機能を誘導することができ、例えば、前記エフェクター機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含む補助活性である。従って、「細胞内シグナルドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを形質転換しかつ細胞が特異的機能を実行するように誘導するタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達領域全体を使用することができるが、多くの状況において、シグナルドメインのチェーン全体を使用する必要はない。いくつかの状況において、細胞内シグナル伝達領域の短縮部分を使用する。いくつかの状況において、細胞内シグナルドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを形質転換するのに十分な細胞内シグナル伝達領域の任意の短縮部分を含むことを意図する。

ＣＡＲで使用されるシグナルドメインの好ましい例としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質配列および標的－受容体結合後にシグナル形質転換を開始するために相乗的に作用する補助受容体（ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ならびにそれらの任意の誘導体または変異体配列およびこれらの配列の同じ機能を有する任意の合成配列を含むことができる。

いくつかの状況において、前記細胞内シグナルドメインは、既知の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のシグナルモチーフを含むことができる。細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄのＤＡＰ１０、またはＤＡＰ１２に由来するタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。しかしながら、好ましい実施形態において、細胞内シグナルドメインは、ＣＤ３ζ鎖に由来する。

一つまたは複数のＩＴＡＭモチーフを含むＴ細胞シグナルドメインの実例は、Ｔ細胞受容体Ｔ３ζ鎖またはＣＤ２４７としても呼ばれるＣＤ３ζドメインである。当該ドメインは、Ｔ細胞受容体－ＣＤ３複合体の一部であり、いくつかの細胞内シグナル形質転換経路の抗原識別とＴ細胞の主な効果の活性化とを組み合わせる上で重要な役割を果たす。本明細書で使用されるＣＤ３ζは、主に、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリーＰ２０９６３からしれれているように、基本的に同じ配列を有するタンパク質を含む、ヒトＣＤ３ζおよびそのアイソフォームを指す。キメラ抗原受容体の一部として、もう一度説明するが、Ｔ細胞受容体Ｔ３ζ鎖全体は必要ではなく、そのＴ細胞受容体Ｔ３ζ鎖のシグナルドメインを含む任意の誘導体は、その任意の機能的同等物を含むのも適切である。

細胞内シグナル伝達ドメインは、表１のドメインのいずれかから選択されることができる。いくつかの状況において、参照ドメインとの相同性が約５０％～約１００％になるように、ドメインを修飾することができる。修飾形態が約５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または最大約１００％の相同性を含むように、表１のドメインのいずれか一つを修飾することができる。

ＣＡＲの細胞内シグナル伝達領域は、一つまたは複数の共刺激ドメインをさらに含むことができる。細胞内シグナル伝達領域は、ζ鎖（第１世代のＣＡＲ）またはそのＣＤ２８または４－１ＢＢ（第２世代のＣＡＲ）等の、単一の共刺激ドメインを含むことができる。別の例において、細胞内シグナル伝達領域は、ＣＤ２８／ＯＸ４０またはＣＤ２８／４－１ＢＢ（第３世代）等の二つの共刺激ドメインを含むことができる。

ＣＤ８等の細胞内シグナルドメインと共に、これらの共刺激ドメインは、キナーゼ経路を生成するダウンストリーム活性化を引き起こすことにより、遺伝子転写および機能的細胞反応をサポートする。ＣＡＲの共刺激ドメインは、ＣＤ２８（ホスファチジルイノシトール－４、５－ビスホスフェート３－キナーゼ）または４－１ＢＢ／ＯＸ４０（ＴＮＦ－受容体関連因子アダプタータンパク質）経路、ならびにＭＡＰＫおよびＡｋｔの活性化に関連する近端シグナルタンパク質を活性化することができる。

いくつかの状況において、ＣＡＲによって生成されたシグナルは、補助または共刺激シグナルと組み合わせることができる。共刺激シグナルドメインに対して、キメラ抗原受容体様複合体は、いくつかの可能な共刺激シグナルドメインを含むように設計することができる。当技術分野で知れているように、ナイーブＴ細胞において、Ｔ細胞受容体の単独結合は、Ｔ細胞の細胞毒性Ｔ細胞への完全な活性化を誘導するのに十分ではない。完全なプロデューサーＴ細胞の活性化は、２番目の共刺激シグナルが必要される。ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４－１ＢＢＬ、ＭｙＤ８８および４－１ＢＢを含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞活性化の共刺激を提供するいくつかの受容体が報告されている。これらの共刺激分子によって使用されるシグナル伝達経路は、すべて主なＴ細胞受容体活性化シグナルと相乗的に作用することができる。これらの共刺激シグナル伝達領域によって提供されるシグナルは、一つまたは複数のＩＴＡＭモチーフ（例えば、ＣＤ３ｚｅｔａシグナル形質転換ドメイン）に由来する主な効果活性化シグナルと相乗的に作用することができ、Ｔ細胞活性化の要件を満たすことができる。

いくつかの状況において、キメラ抗原受容体様複合体に共刺激ドメインを追加すると、操作された細胞の有効性および耐久性を増強することができる。別の実施形態において、Ｔ細胞シグナルドメインと共刺激ドメインとは、互いに融合してシグナル伝達領域を形成する。

本明細書で使用される「調節」という用語は、正または負の変更を指す。調節の例としては、１％、２％、１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％の変化を含む。

本明細書で使用される「治療」という用語は、個体を変更する用途する過程または細胞によって引き起こされる疾患に対処する過程における臨床的介入、即ち、臨床病理学的過程における予防および介入に使用できることを指す。治療効果は、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、任意の疾患の直接的または間接的な病理学的結果の低減、転移の防止、疾患の進行速度の遅延、病状の改善または緩和、予後の緩和または改善等を含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「免疫力低下」という用語は、被験者が免疫不全を有し、容易に感染されることを指す。日和見感染を引き起こす有機体は、通常、健康な免疫系で病気を引き起こすことはないが、免疫系が弱まっているか、または抑制されている人に感染する可能性がある。

本明細書で使用される「構成的発現」という用語は、すべての生理学的条件下での発言を指す。

本明細書で使用される「誘導発現」という用語は、Ｔ細胞が抗原に結合する場合等の特定の像県下での発言を指す。当業者は、従来の「誘導発現」をどのように実行するか。

免疫応答細胞
いくつかの実施形態において、本発明は、免疫応答細胞を提供し、当該細胞は、ＧＰＣ３に特異的に結合する受容体および外因性ＩＬ１２を発現する。

いくつかの実施形態において、前記外因性ＩＬ１２は、構成的発現または誘導型発現であり、好ましくは、誘導型プロモーターを使用する誘導型発現であり、好ましくは、ＮＦＡＴ６プロモーターである。

いくつかの実施形態において、前記抗原結合受容体の膜貫通領域は、ＣＤ８またはＣＤ２８等のタンパク質の膜貫通領域から選択されることができる。ヒトＣＤ８タンパク質は、αβまたはγδの二つの鎖で構成される、ヘテロダイマーである。いくつかの実施形態において、膜貫通領域は、ＣＤ８αまたはＣＤ２８の膜貫通領域から選択される。さらに、ＣＤ８αヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ）は、柔軟な領域であるため、ＣＤ８またはＣＤ２８と膜貫通領域とにヒンジ領域を加えて、抗原結合受容体ＣＡＲ標的識別ドメインｓｃＦｖと細胞内シグナル領域との連結に使用される。

本発明の細胞内シグナルドメインは、ＣＤ３ζ、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ２８共刺激シグナルドメイン、ＣＤ１３７共刺激シグナルドメイン、およびそれらの組み合わせから選択されることができる。ＣＤ３分子は、五つのサブユニットで構成され、ここで、ＣＤ３ζサブユニット（ＣＤ３ゼータ（ｚｅｔａ）とも呼ばれ、Ｚと略す）は、三つのＩＴＡＭモチーフを含み、当該モチーフは、ＴＣＲ－ＣＤ３複合体の重要なシグナル形質転換領域である。さらに、前述のように、ＣＤ２８およびＣＤ１３７は、それぞれのリガンドに結合した後、その細胞内シグナルセグメントによって生成される共刺激効果が免疫応答細胞（主にＴリンパ球である）の継続的な増殖を引き起こし、免疫応答細胞から分泌されるＩＬ－２およびＩＦＮ－γ等のサイトカインのレベルを向上させることができ、インビボでのＣＡＲ免疫応答細胞の生存サイクルおよび抗腫瘍効果を向上させる、共刺激シグナル分子である。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル形質転換ドメインは、ＣＤ３ζシグナルドメインまたはＣＤ３ζシグナルドメインとＣＤ２８等の他の共刺激シグナルの組み合わせである。

いくつかの実施形態において、本発明の免疫応答細胞は、発現構築物を含むことができ、当該発現構築物は、抗体、ＣＤ２８共刺激シグナルドメイン、ＣＤ３ζ、および前記要素に逆に連結されるＮＦＡＴ６、ＩＬ１２発現ユニットのように、順番に連結される要素が存在する。好ましくは、前記抗体とＣＤ２８共刺激シグナルドメインとの間は、ＣＤ８α膜貫通領域およびＣＤ８αヒンジ領域を介して連結される。

いくつかの実施形態において、活性化されたＴ細胞核因子ＮＦＡＴ（Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ）は、Ｔ細胞の活性化過程でサイトカインの転写および発現に重要な役割を果たす。この考慮に基づいて、本発明者らは、ＩＬ１２コード配列をＮＦＡＴ６プロモーターの制御に置き、そうすることにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞が抗原と接触してＴ細胞活性化を誘発する場合にのみ、ＩＬ１２を高レベルで発現させることができる。

ＮＦＡＴ６プロモーターは、六つのＮＦＡＴ結合部位を使用して、ＩＬ２の最小プロモーター（ｍｉｎｉｍａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）と連結して構成されるプロモーター（Ｈｏｏｉｊｂｅｒｇ Ｅ、Ｂａｋｋｅｒ ＡＱ、Ｒｕｉｚｅｎｄａａｌ ＪＪ、Ｓｐｉｔｓ Ｈ．ＮＦＡＴ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧＦＰ ｐｅｒｍｉｔｓ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ Ｔｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ．２０００ Ｊｕｌ １５；９６（２）：４５９－６６）であり、ＴＣＲ－Ｔ等のＴリンパ球におけるＩＬ１２等のサイトカインの発現を調節するために使用されることができる（Ｚｈａｎｇ Ｌ、Ｋｅｒｋａｒ ＳＰ、Ｙｕ Ｚ、Ｚｈｅｎｇ Ｚ、Ｙａｎｇ Ｓ、ＲｅｓｔｉｆｏＮＰ、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ、Ｍｏｒｇａｎ ＲＡ.Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ＩＬ－１２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１ Ａｐｒ；１９（４）：７５１－９ ）。

本発明の一態様によると、本発明は、前記抗原結合受容体をコードする核酸をさらに含む。本発明は、本発明と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはポリペプチドのフラグメント、類似体および誘導体を個度する前記ポリヌクレオチドの変異体にさらに関する。

本発明は、免疫応答細胞の表面に発現される抗原結合受容体タンパク質をコードする核酸ベクターをさらに提供する。具体的な実施形態において、本発明で使用されるベクターは、レンチウイルスプラスミドベクターｐＲＲＬＳＩＮ－ｃＰＰＴ．ＰＧＫ－ＧＦＰ．ＷＰＲＥである。他のタイプのウイルスベクターおよび非ウイルスベクターも、応用可能であることを理解されたい。

本発明は、前記ベクターを含むウイルスをさらに含む。本発明のウイルスは、感染力を有するパッケージ化されたウイルスを含み、感染力を有するウイルスとしてパッケージするために必要な成分を含むパッケージ化されるウイルスも含む。外来遺伝子を免疫応答細胞に形質転換するために使用されることができる当技術分野で知られている他のウイルスおよび対応するそのプラスミドベクターも本発明に使用されることができる。

本発明の免疫応答細胞は、抗原結合受容体および外因性ＩＬ１２発現することができる構築物で形質転換されるか、またはベクターを発現するか、または当該プラスミドのウイルスを含む。非ウイルスおよびウイルスの形質転換法を含む当技術分野における従来の核酸形質転換法は、本発明に使用されることができる。

本発明に記載の免疫応答細胞は、前記抗原結合受容体に加えて別の抗原結合受容体を発現することができる。

本発明に記載の免疫応答細胞は、安全スイッチを発現することができ、好ましくは、前記安全スイッチは、ｉＣａｓｐａｓｅ－９、Ｔｒｕａｎｃａｔｅｄ ＥＧＦＲまたはＲＱＲ８を含む。

核酸
標的結合抗原受容体またはＣＡＲをコードする導入遺伝子を細胞に組み込むことができる。例えば、導入遺伝子を、Ｔ細胞等の免疫応答細胞に組み込むことができる。細胞に挿入されると、導入遺伝子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のコピーである相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）フラグメント、またはそのゲノムＤＮＡの元の領域にある遺伝子自体（イントロンの有無にかからわず）であり得る。

ＤＮＡ等の導入遺伝子配列をコードする核酸は、細胞の染色体にランダムに挿入することができる。ランダムな統合は、核酸（例えば、ＤＮＡ）を細胞に導入する任意の方法によって生成することができる。例えば、当該方法は、エレクトロポレーション、超音波、遺伝子銃の使用、リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、デンドリマーの使用、マイクロインジェクションおよびアデノウイルスと、ＡＡＶとレトロウイルスベクターとを含むウイルスベクターの使用、および／またはＩＩ型リボザイムを含むが、これらに限定されない。

導入遺伝子をコードするＤＮＡは、レポーター遺伝子を含むように設計することもできるため、導入遺伝子または発現産物の存在がレポーター遺伝子の活性化によって検出することができる。前記のような任意のレポーター遺伝子を使用することができる。レポーター遺伝子が活性化されている細胞培養物中の細胞を選択することにより、導入遺伝子を含む細胞を選択することができる。

ＣＡＲの発現は、ｑＰＣＲ等の発現アッセイ法、またはＲＮＡレベルの測定によって確認することができる。発現レベルは、コピー数を示すこともできる。例えば、発現レベルが非常に高い場合、これは、ＣＡＲのコピーがゲノムに組み込まれることを示すことができる。あるいは、高発現は、導入遺伝子が高度に発現されたプロモーターの付近等の、硬度に転写された領域に組み込まれることを示すことができる。タンパク質レベルを測定することにより、例えば、ウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロッティングによっても確認することができる。

いくつかの実施形態において、本発明の免疫応答細胞は、一つまたは複数の導入遺伝子を含むことができる。前記一つまたは複数の導入遺伝子は、ＣＡＲタンパク質を発現することができ、当該ＣＡＲタンパク質は、抗原上の少なくとも一つのエピトープを識別および結合するか、または抗原上の突然変異エピトープに結合する。ＣＡＲは、機能的ＣＡＲであり得る。いくつかの実施形態において、本発明の免疫応答細胞は、一つまたは複数のＣＡＲを含み得るか、または単一のＣＡＲおよび二次操作された受容体を含むことができる。

上記のように、導入遺伝子は、ランダムまたは部位特異的な方法で免疫反応性細胞のゲノムに挿入することができる。例えば、導入遺伝子を免疫細胞のゲノムのランダムな部位に挿入することができる。これらの導入遺伝子は、機能的であり得、例えば、ゲノムのどこかに挿入された場合に完全に機能的であり得る。例えば、導入遺伝子は、それ自体のプロモーターをコードすることができるか、またはその内部プロモーターによって制御される位置に挿入されることができる。あるいは、導入遺伝子を、遺伝子のイントロンまたは遺伝子のエキソン、プロモーターまたは非コード領域等の遺伝子に挿入することができる。内因性免疫チェックポイント等の破壊的な遺伝子を挿入するように導入遺伝子に挿入することができる。

いくつかの状況において、導入遺伝子の一つ以上のコピーをゲノム内の複数のランダムの部位に挿入することができる。例えば、複数のコピーをゲノム内のランダムの部位に挿入することができる。導入遺伝子をランダムに１回挿入した場合と比較して、これは、全体的な発現が増加する可能性がある。あるいは、導入遺伝子のコピーを遺伝子に挿入することができる、導入遺伝子の別のコピーを別の遺伝子に挿入することができる。免疫反応性細胞のゲノムの特定の部位に挿入することができるように、導入遺伝子を標的化することができる。

いくつかの状況において、抗原結合受容体をコードする配列を含むは、プラスミドベクターの形態をとることができる。プラスミドベクターは、プロモーターを含み得る。いくつかの状況において、プロモーターは、構成的であり得る。いくつかの状況において、プロモーターは、誘導可能である。プロモーターは、ＣＭＶ、Ｕ６、ＭＮＤまたはＥＦ１ａであり得るか、またはＣＭＶ、Ｕ６、ＭＮＤまたはＥＦ１ａから由来することができる。いくつかの状況において、プロモーターは、ＣＡＲ配列に隣接することができる。いくつかの状況において、プラスミドベクターは、スプライス受容体をさらに含む。いくつかの状況において、スプライス受容体は、ＣＡＲ配列に隣接することができる。プロモーター配列は、ＰＫＧまたはＭＮＤプロモーターであり得る。ＭＮＤプロモーターは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーで修飾されたＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲのＵ３領域を含む合成プロモーターであり得る。

いくつかの状況において、標的受容体をコードするポリ核酸は、非ウイルス技術を介して細胞に伝達されるように設計することができる。いくつかの状況において、ポリ核酸は、適正製造基準（ＧＭＰ）と交換性のある試薬であり得る。

標的結合抗原受容体またはＣＡＲをコードするポリ核酸の発現は、一つまたは複数のプロモーターによって制御されることができる。プロモーターは、遍在的、構成的（関連遺伝子の継続的な転写を可能にする無制限のプロモーター）、組織特異的プロモーターまたは誘導型プロモーターであり得る。プロモーターに隣接または接近して挿入された導入遺伝子の発現を調節することができる。例えば、導入遺伝子は、遍在的に存在するプロモーター付近または横に挿入することができる。いくつかの遍在的に存在するプロモーターは、ＣＡＧＧＳプロモーター、ｈＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはＲＯＳＡ２６プロモーターであり得る。

プロモーターは、内因性または外因性であり得る。例えば、一つまたは複数の導入遺伝子を内因性または外因性ＲＯＳＡ２６プロモーターの隣接または近くに挿入することができる。さらに、プロモーターは、免疫反応性細胞の特異的であり得る。例えば、一つまたは複数の導入遺伝子は、ブタのＲＯＳＡ２６プロモーターの隣接または近くに挿入することができる。

組織特異的プロモーターまたは細胞特異的プロモーターは、発現の位置を制御することに使用されることができる。例えば、一つまたは複数の導入遺伝子を組織特異的プロモーターの隣接または地区に挿入することができる。組織特異的プロモーターは、ＦＡＢＰプロモーター、Ｌｃｋプロモーター、ＣａｍＫＩＩプロモーター、ＣＤ１９プロモーター、ケラチンプロモーター、アルブミンプロモーター、ａＰ２プロモーター、インスリンプロモーター、ＭＣＫプロモーター、ＭｙＨＣプロモーター、ＷＡＰプロモーター、またはＣｏｌ２Ａプロモーターであり得る。

誘導型プロモーターを使用することもできる。必要に応じて、誘導剤を追加または削除することによってこれらの誘導型プロモーターをオンおよびオフすることができる。予期性誘導型プロモーターは、Ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ａｒａＢＡＤ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ－１、ｔｅｔＡ、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ＰＬ、ｃｓｐＡ、Ｔ７、ＶＨＢ、Ｍｘおよび／またはＴｒｅｘであり得るが、これらに限定されない。

免疫細胞誘導型プロモーター
本明細書で使用される「誘導型プロモーター」という用語は、制御されたプロモーターであり、期待される条件が達成される前に操作可能に連結された遺伝子を発現または低発現し、期待される条件が満たされると、その操作可能に連結される遺伝子を発現または高発現することを指す。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の誘導型プロモーターは、細胞内の正常または高酸素含有量の条件下で作動可能に連結された遺伝子を発現または低発現しなく、細胞内の酸素含有量の減少に応答して、低酸素条件下または高酸素含有量化でそれに動作可能に連結された遺伝子を発現または高発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で使用される誘導型プロモーターは、低酸素誘導性転写因子－１α（Ｈｙｐｏｘｉａ－Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－１α、ＨＩＦ－１α）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で使用される「誘導型プロモーター」という用語は、免疫応答細胞が抗原に接触する前、または免疫応答細胞が活性化されない場合、操作可能に連結される遺伝子を発現または低発現し、免疫応答細胞が抗原に接触するか、または免疫応答細胞が活性化される場合にのみ、それらに操作可能に連結される遺伝子と高レベル発現するか、または低酸素条件下での発現を促進する「免疫細胞誘導型プロモーター」を指す。いくつかの実施形態において、前記「免疫細胞誘導型プロモーター」は、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞核因子）型プロモーターを含む。

本明細書で使用される「ＮＦＡＴ型プロモーター」とは、ＮＦＡＴ結合活性に基づいて操作可能に連結される遺伝子の発現を調節するタイプのプロモーターを指す。

ＮＦＡＴは、免疫反応において重要な役割を果たす転写因子ファミリーの総称である。ＮＦＡＴファミリーの一つまたは複数のメンバーは、免疫系のほとんどの細胞で発現する。ＮＦＡＴも、心臓、骨格筋および神経系の発達に関与する。

ＮＦＡＴ転写因子ファミリーは、ＮＦＡＴｃ１、ＮＦＡＴｃ２、ＮＦＡＴｃ３、ＮＦＡＴｃ４およびＮＦＡＴ５の五つのメンバーで構成される。ＮＦＡＴｃ１～ＮＦＡＴｃ４は、カルシウムシグナルによって調節される。カルモジュリン（ＣａＭ）はセリン／スレオニンホスファターゼカルシニューリン（ＣＮ）を活性化するため、カルシウムシグナルがＮＦＡＴの活性化に対して非常に重要する。活性化されたＣＮは、ＮＦＡＴタンパク質のアミノ末端でセリンリッチ領域（ＳＲＲ）およびＳＰリピート配列を急速に脱リン酸化し、コンフォメーション変化を引き起こし、核局在化シグナルを露出させ、ＮＦＡＴの核へのインポートをもたらす。

Ｔ細胞活性化の過程におけるサイトカインの転写発現におけるＮＦＡＴの役割に基づいて、本明細書に記載の免疫細胞誘導型プロモーターを調節するために使用することができるため、免疫応答細胞が抗原との接触によって活性化される場合、操作可能に連結される遺伝子が発現または高レベルで発現される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の「ＮＦＡＴ型プロモーター」は、二つ以上のＮＦＡＴ結合部位を含むことができる。例えば、前記「ＮＦＡＴ型プロモーター」は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のＮＦＡＴ結合部位を含むことができる。いくつかの実施形態において、前記「ＮＦＡＴ型プロモーター」は、複数の前記ＮＦＡＴ結合部位と、連結されるＩＬ２最小プロモーター等のプロモーターから構成されるプロモーターであり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＮＦＡＴ型プロモーターは、（ＮＦＡＴ）６として指定される六つのＮＦＡＴ結合部位を含む。便宜上、前記（ＮＦＡＴ）６は、ＮＦＡＴ６とも呼ばれる。いくつかの実施形態において、前記ＮＦＡＴ６は、前記ＮＦＡＴ型プロモーターにおける六つの繰り返されるＮＦＡＴ結合部位を表す。

さらに、発現に必要ではないが、導入遺伝子配列は、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、内部リボソーム侵入部位、２Ａペプチドおよび／またはポリアデニル化シグナルをコードする配列等の転写または翻訳制御配列を含む。

いくつかの状況において、レトロウイルスベクター（γ－レトロウイルスまたはレンチウイルスベクター）を使用して、導入遺伝子を免疫反応性細胞に導入することができる。例えば、ＣＡＲをコードする導入遺伝子または抗原に結合する任意の受容体またはその変異体またはフラグメントは、レトロウイルスベクターにクーロンされ、内因性プロモーター、レトロウイルス長い末端リピート配列、または標的細胞タイプの特異的プロモーターによって駆動されることができる。非ウイルスベクターも使用することができる。非ウイルスベクター送達システムは、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸およびリポソームまたは泊洛沙姆等の送達ビヒクルと複合体を形成した核酸を含む。

哺乳類細胞への遺伝子導入のために、多くのウイルスベースのシステムが開発された。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムに便利なプラットフォームを提供する。当技術分野で知られている技術を使用して、選択された遺伝子をベクターに挿入しかつレトロウイルス粒子にパッケージングされることができる。レンチウイルス等のレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期的な安定した統合およびその娘細胞でのその増殖を可能にするため、長期的な遺伝子導入を達成するための適切な手段である。レンチウイルスベクターは、非増殖細胞を形質転換できるため、マウス白血病ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターに比較して追加の利点を有する。それらは、免疫原性が低いという追加の利点を有する。アデノウイルスベクターの利点は、それらが標的細胞のゲノムに融合せず、負の統合関連イベントを回避することができる。
前記抗原結合受容体をコードする導入遺伝子で細胞をトランスフェクトすることができる。導入遺伝子の濃度は、約１００ピコグラム～約５０マイクログラムであり得る。いくつかの状況において、細胞に導入された核酸（例えば、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡまたはＲＮＡ）の量を変更して、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化することができる。例えば、エレクトロポレーションのために１マイクログラムのｄｓＤＮＡを各細胞サンプルに加えることができる。いくつかの状況において、最適なトランスフェクション効率および／または細胞生存率に必要な核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ）の量は、細胞の種類によって異なる。いくつかの状況において、各サンプルに使用される核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）の量は、トランスフェクション効率および／または細胞生存率に直接対応されることができる。例えば、一連のトランスフェクション濃度。ベクターによってコードされる導入遺伝子は、細胞ゲノムに統合されることができる。いくつかの状況において、ベクターによってコードされる導入遺伝子は、前方に統合される。他の状況において、ベクターによってコードされる導入遺伝子は、逆方向で統合される。

いくつかの状況において、免疫反応性細胞は、ＣＤ４５ＲＯ（－）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ－セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋および／またはＩＬ－７Ｒα＋で構成される幹記憶ＴＳＣＭ細胞であり得、前記幹記憶細胞は、ＣＤ９５、ＩＬ－２Ｒβ、ＣＸＣＲ３および／またはＬＦＡ－１を発現することができ、前記幹記憶細胞とは異なる多くの機能特性を示す。あるいは、免疫反応性細胞は、Ｌ－セレクチンとＣＣＲ７とを含む中央記憶ＴＣＭ細胞であり得、ここで、中央記憶細胞は、例えば、ＩＬ－２等を分泌することができるが、ＩＦＮγまたはＩＬ－４は分泌しない。免疫反応性細胞は、Ｌ－セレクチンまたはＣＣＲ７を含むエフェクター記憶ＴＥＭ細胞であり得、例えば、ＩＦＮγおよびＩＬ－４等のエフェクターサイトカインを生成する。

以下に記載されるように、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または頭蓋内注入）または局所適用を介して、個々の患者への投与によってベクターを送達する。あるいは、ベクターは、個々の患者（例えば、リンパ球、Ｔ細胞、骨髄穿刺物、組織生検）から取り出された細胞等の体外での細胞に送達されることができ、次に、一般に、当該ベクターを組み込んだ細胞を選択した後、細胞を患者にの体内に再移植する。選択の前または後に、細胞を増殖することができる。

抗原結合受容体を発現するための適切な免疫反応性細胞は、必要とする個体に対して自己由来または非自己由来の細胞であり得る。

個体から適切な免疫応答細胞の供給源を得ることができる。いくつかの状況において、Ｔ細胞を得ることができる。前記Ｔ細胞は、ＰＢＭＣ、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍の組織等を含む、多くの供給源から得ることができる。いくつかの状況において、ＦｉｃｏｌｌＴＭ単離等の当業者に知られている任意の技術を使用して、前記個体から収集された血液からＴ細胞を得ることができる。一実施形態において、アフェレーシスによって個体の循環血液からの細胞を得ることができる。アフェレーシス製品は、一般に、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球および血小板を含む、リンパ球を含む。一実施形態において、アフェレーシス収集によって収集された細胞を洗浄して血漿画分を除去し、その後の処理段階のために適切な緩衝液または培地に細胞を入れることができる。

または、細胞は、健康なドナー、癌と診断された患者、または感染症と診断された患者に由来することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、異なる表現型の特徴を有する混合細胞集団の一部であり得る。前記方法に従って、形質転換されたＴ細胞から細胞株を得ることもできる。細胞治療バンクから細胞を得ることもできる。本明細書に記載の方法のいずれかによって、免疫阻害療法に耐性のある修飾細胞を得ることができる。修飾前に適切な細胞集団を選択することもできる。修飾後に操作された細胞集団を選択することもできる。操作された細胞は、自家移植に使用されることができる。あるいは、細胞は、同種異系移植に使用されることができる。いくつかの状況において、癌関連標的配列の同定に使用されるサンプルの同じ患者に細胞を投与する。他の状況において、細胞を癌関連標的配列の同定に使用される患者以外の異なるサンプルの患者に投与する。

いくつかの状況において、適切な初代細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、およびＴ細胞、天然殺傷細胞、単球、天然殺傷剤Ｔ細胞、単球前駆体細胞、造血幹細胞または非多能性幹細胞等であるがこれらに限定されない、他の血液細胞亜集団を含む。いくつかの状況において、細胞は、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞または任意の他のタイプのＴ細胞等の腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）等の、任意のＴ細胞を含む、任意の免疫細胞であり得る。Ｔ細胞は、記憶Ｔ細胞、記憶幹Ｔ細胞またはエフェクターＴ細胞をさらに含むことができる。全血等の大集団からＴ細胞を選択することができる。Ｔ細胞は、大集団から増殖することもできる。Ｔ細胞は、特定の集団および表現型に傾く可能性がある。例えば、Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ（－）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ２８（＋）および／またはＩＬ－７Ｒα（＋）を含む表現型に傾く可能性がある。適切な細胞は、ＣＤ４５ＲＯ（－）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ２８（＋）および／またはＩＬ－７Ｒα（＋）等の表の一つまたは複数のマーカーから選択される。適切な細胞は、例えば、胚性幹細胞、誘導された多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞および間葉系幹細胞等の干細胞をさらに含む。適切な細胞は、ヒト細胞、非ヒト細胞および／またはマウス細胞等の任意の数の細胞を含むことができる。適切な細胞は、前駆体細胞であり得る。適切な細胞は、治療される被験者（例えば、患者）に由来することができる。

患者に必要な治療上有効な細胞の量は、細胞の生存率および細胞が遺伝子修飾された効率に応じて変化することができる（例えば、導入遺伝子が一つまたは複数の細胞に統合される効率、または導入遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベル）。いくつかの状況において、遺伝子修飾後の細胞生存率の産物（例えば、倍に増殖）および導入遺伝子統合の効率は、被験者の投与に利用可能な細胞の治療量に対して対応することができる。いくつかの状況において、遺伝子修飾後の細胞生存率の増加は、治療を受ける患者に有効な必要な細胞の量の減少に対応している可能性がある。いくつかの状況において、導入遺伝子を一つまたは複数の細胞に統合する効率の増加は、患者に治療的に有効なものを与えるために必要な細胞の数の減少に対応することができる。いくつかの状況において、必要な治療上有効な細胞の量を決定することは、経時的な細胞の変化に関連する機能を決定することを含むことができる。いくつかの状況において、必要な治療上有効な細胞の量を決定することは、時間関連変数に基づいて、導入遺伝子を一つまたは複数の細胞に統合する効率変化に対応する機能（例えば、細胞培養時間、エレクトロポレーション時間、細胞刺激時間）を決定することを含むことができる。いくつかの状況において、治療上有効な細胞は、細胞表面上の抗原結合受容体の発現の約３０％～約１００％を含む、細胞集団であり得る。いくつかの状況において、フローサイトメトリーの測定を介して、治療上有効な細胞は、細胞表面上の前記抗原結合受容体の約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％または約９９．９％以上を発現することができる。

いくつかの状況において、前記抗原結合受容体が細胞の原形質膜に存在する場合、かつ標的に結合することによって活性化される場合、その細胞表面に前記結合抗原を発現する受容体結合することができる標的を有する細胞に毒性をもたらす可能性がある。例えば、いくつかの状況において、細胞が細胞の原形質膜に存在する場合、細胞は、細胞毒性細胞（例えば、ＮＫ細胞または細胞毒性Ｔリンパ球）であり得、その標的に結合することによって活性化される場合、本明細書に記載の抗原結合受容体は、標的細胞に対する細胞毒性細胞の細胞毒性活性を増加させることができる。例えば、いくつかの状況において、標的の結合によって活性化される場合、本明細書に記載の抗原結合受容体は、結合標的のない細胞に対する細胞毒性と比較して、細胞毒性を少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍または１０倍以上を増加させることができる。

医薬組成物
本発明の免疫応答細胞は、医薬組成物の調製に適用することができる。有効量の免疫応答細胞を含むことに加えて、前記医薬組成物は、薬学的に許容されるベクターをさらに含むことができる。「薬学的に許容される」という用語は、分子実体および組成物が動物またはヒトに適切に投与された場合、それらが有害、アレルギーまたは他の副作用を引き起こさないことを指す。

薬学的に許容されるベクターまたはその成分として使用されることができるいくつかの物質の具体的な例としては、抗酸化剤、防腐剤、パイロジェンフリー水、等張塩溶液、およびリン酸塩緩衝液等等である。

本発明の組成物は、必要に応じて様々な剤形に調製することができ、医者が患者のタイプ、連例、体重および大体な疾患病状、投与方法等の要因に従って患者にとって有益な投与量を決定して投与することができる。投与方法は、非経口投与（例えば、注射）または他の治療方法を使用することができる。

免疫原性組成物の「非経口」投与は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）または胸骨内注射または注入技術等を含む。

個体に投与される免疫反応性細胞集団を含む製剤は、特定の適応症または疾患を効果的に治療または予防する複数の免疫反応性細胞を含む。従って、個体に免疫反応性細胞の治療上有効な集団を投与することができる。一般に、約１×１０^４～約１×１０^１０の免疫反応性細胞を含む製剤を投与する。ほとんどの状況において、製剤は、約１×１０^５～約１×１０^９の免疫反応性細胞、約５×１０^５～約５×１０^８の免疫反応性細胞、または約１×１０^６～約１×１０^７の免疫反応性細胞を含む。しかしながら、癌の位置、発生源、身分、程度および重症度、治療を受ける個体の年齢および体調等に応じて、個体に投与されるＣＡＲ免疫反応性細胞の数は、広範囲で変化する。医者は、使用される適切な投与量を最終的に決定する。

いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体を使用して、免疫細胞を仲介した免疫応答を刺激する。例えば、Ｔ細胞を仲介した免疫応答は、Ｔ細胞の活性化に関する免疫応答である。活性化された抗原特異的細胞毒性Ｔ細胞は、腫瘍抗原を表示する癌細胞等、表面上に外来抗原エピトープを表示する標的細胞にアポトーシスを誘導することができる。別の実施形態において、哺乳動物において、キメラ抗原受容体を使用して、抗腫瘍免疫を提供する。Ｔ細胞を仲介した免疫応答により、被験者は、抗腫瘍免疫を生成する。

いくつかの状況において、癌を患っている被験者を治療する方法は、治療を必要とする被験者に本発明に記載の一つまたは複数の免疫応答細胞を超する段階を含むことができる。前記免疫応答細胞は、腫瘍標的分子に結合して癌細胞の死を誘発する可能性がある。上記のように、本発明は、前記個体に治療有効量の本発明の免疫応答細胞を投与する段階を含む、個体の病原体感染を治療する方法をさらに提供する。

本発明の免疫反応性細胞の投与頻度は、治療される疾患の要因、特定の免疫反応性細胞の要素および投与方法を含むことに基づく。本明細書に記載のように、本発明の免疫応答細胞が改善された生存率を有するため、外因性ＩＬ１２を発現しない類似な免疫応答細胞よりも低い治療有効量で投与することができるだけでなく、より低い頻度で投与することができて、少なくとも類似で、より有意な好ましい治療効果を得る。

抗腫瘍薬との組み合わせ
いくつかの実施形態において、本発明の免疫応答細胞は、別の治療剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、前記別の治療剤は、化学療法薬である。本発明の免疫応答細胞と組み合わせて応用されることができる化学療法薬は、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン和ノビビン（ＴＭ）（ビノレルビン、５’－硫化脱水素）を含む有糸分裂阻害剤（ビンブラスチンアルカロイド）、ＣａｍｐｔｏｓａｒＴＭ（イリノテカンＨＣＬ）、ＨｙｃａｍｔｉｎＴＭ（トポテカンＨＣＬ）およびカンプトテシンとその類似体に由来する他の化合物を含むカンプトテシン化合物等のトポイソメラーゼＩ阻害剤、エトポシド、テニポシドおよびミドキシゾズ等のポドフィロトキシン誘導体、シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ブリキアジン、ウラシルマスタード、クロプロフェンおよびダカルバジン等のアルキル化剤、シタラビン、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリンおよびプロカルバジンを含む代謝拮抗剤、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、マイシノマイシン、マイトマイシン、サルコマイシンＣおよびダウノルビシン等を含むがこれらに限定されない、抗生物質、ならびに抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサカム、メルファラン、イホスファミドおよびミトキサントロン等を含むがこれらに限定されない、他の化学療法薬を含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、本発明の免疫応答細胞と組み合わせて応用されることができる化学療法薬は、抗ＶＥＧＦ抗体（ヒト化およびキメラ抗体、抗ＶＥＧＦアプタマーおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む）ならびにアンギオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、レチノイン酸、メタロプロテイナーゼ－１と－２との組織阻害剤等の他の血管新生阻害剤を含む、抗血管新生剤を含むがこれらに限定されない。

キット
本発明は、本発明の免疫応答細胞を含むキットをさらに提供する。前記キットは、癌、病原体感染、免疫障害または同種異系移植を治療または予防するために使用されることができる。一実施形態において、キットは、一つまたは複数の単位剤形を含む有効量の免疫応答細胞を含む治療的または予防的組成物を含むことができる。

いくつかの実施形態において、キットは、治療的または予防的組成物を含む滅菌容器を含むことができる。

いくつかの状況において、キットは、約１×１０^４の細胞～約１×１０^６の細胞を含むことができる。いくつかの状況において、キットは、少なくとも約１×１０^５の細胞、少なくとも約１×１０^６の細胞、少なくとも約１×１０^７の細胞、少なくとも約４×１０^７の細胞、少なくとも約５×１０^７の細胞、少なくとも約６×１０^７の細胞、少なくとも約６×１０^７の細胞、８×１０^７の細胞、少なくとも約９×１０^７の細胞、少なくとも約１×１０^８の細胞、少なくとも約２×１０^８の細胞、少なくとも約３×１０^８の細胞、少なくとも約４×１０^８の細胞、少なくとも約５×１０^８の細胞、少なくとも約６×１０^８の細胞、少なくとも約６×１０^８細胞、少なくとも約８×１０^８の細胞、少なくとも約９×１０^８細胞、少なくとも約１×１０^９の細胞、少なくとも約２×１０^９の細胞、少なくとも約３×１０^９の細胞、少なくとも約４×１０^９の細胞、少なくとも約５×１０^９の細胞、少なくとも約６×１０^９の細胞、少なくとも約８×１０^９の細胞、少なくとも約９×１０^９の細胞、少なくとも約１×１０^１０の細胞、少なくとも約２×１０^１０の細胞、少なくとも約３×１０^１０の細胞、少なくとも約４×１０^１０の細胞、少なくとも約５×１０^１０の細胞、少なくとも約６×１０^１０の細胞、少なくとも約９×１０^１０の細胞、少なくとも約９×１０^１０の細胞、少なくとも約１×１０^１１の細胞、少なくとも約２×１０^１１の細胞、少なくとも約３×１０^１１の細胞、少なくとも約４×１０^１１の細胞、少なくとも約５×１０^１１の細胞、少なくとも約８×１０^１１の細胞、少なくとも約９×１０^１１の細胞、または少なくとも約１×１０^１２の細胞を含むことができる。例えば、キットは、約５×１０^１０の細胞を含むことができる。

いくつかの状況において、キットは、同種異系細胞を含むことができる。いくつかの状況において、キットは、ゲノム修飾を含むことができる細胞を含むことができる。いくつかの状況において、キットは、「既成の」細胞を含むことができる。いくつかの状況において、キットは、臨床使用のために増殖することができる細胞を含むことができる。いくつかの状況において、キットは、研究目的に使用される内容物を含むことができる。

自己リンパ球注入は、治療に使用されることができる。治療を必要とする患者から自己末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集することができ、本明細書に記載された方法および当技術分野で知られている方法を使用して、Ｔ細胞を活性化および装飾した後、患者体内に注射することができる。他の状況において、同種異系細胞は、患者の治療に使用されることができる。

本明細書に開示されるほうほうは、移植を含むことができる。移植は、細胞産物の養子移植を指すことができる。移植は、自家移植、同種異系移植、異種移植または任意の他の移植であり得る。例えば、移植は、異種移植であり得る。移植は、同種異系移植もあり得る。

実施例１．ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ細胞／ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔ細胞の調製
１．プラスミドの構築
本実施例で使用されるキメラ抗原受容体は、第２世代のキメラ抗原受容体であり、使用されるＧＰＣ３受容体の細胞外ドメインを標的とするｓｃＦｖのヌクレオチドコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示され、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、ＣＤ２８の細胞内ドメイン、およびＣＤ３ζをさらに有する。図１Ａに示されるように、ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔ細胞のプラスミドを構築し、具体的には、次のとおりである。

ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ配列は、ＣＤ８αシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ＧＰＣ３を標的とするｓｃＦｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ＣＤ８のヒンジ（ｈｉｎｇｅ）領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＣＤ２８膜貫通領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）およびＣＤ３の細胞内セグメントＣＤ３ζ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）で構成される。

ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲのプラスミドは、ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔプラスミドに基づいてＮＦＡＴ６－ＩＬ１２配列を挿入し、ＧＰＣ３発現する第２世代のキメラ抗原受容体およびＩＬ１２のレンチウイルスプラスミドを構築する。ＮＦＡＴ６－ＩＬ１２配列は、６＊ＮＦＡＴ結合モチーフ（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、ＩＬ２最小プロモーター（ｍｉｎｉｍａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、ＩＬ１２シグナルペプチド、ＩＬ１２ ｐ４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、ＩＬ１２ ｐ３５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）およびＰＡ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）で構成される。

２．レンチウイルスのパッケージング、ウイルスの濃縮および力価のアッセイ
ａ．レンチウイルスのパッケージング
１）６～１０継代まで培養した２９３Ｔ細胞をペトリ皿に５×１０^６の密度で接種し、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩培養し、培地は、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｉｃｏ）を含むＤＭＥＭであり、
２）５．４μｇの標的遺伝子プラスミドＧＰＣ３－ＣＡＲ－ＴおよびＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔと６．２μｇのパッケージングプラスミドｐＲｓｖ－ＲＥＶ、６．２μｇのＲＲＥ－ＰＭＤＬｇ、２．４μｇのＶｓｖｇとを８００μＬのブランクＤＭＥＭ培養液に溶解し、混合して、プラスミド混合液を得、
３）６０μｇのＰＥＩ（１μｇ／μｌ）を８００μｌの無血清ＤＭＥＭ培養液に溶解し、室温下で５分間インキュベートして、ＰＥＩ混合液を得、
４）プラスミド混合液をＰＥＩ混合液に加えて均等に混合し、室温下で２０分間インキュベートして、トランスフェクション複合体を形成し、
５）１１ｍｌのＤＭＥＭ培地を含む１０ｃｍのペトリ皿に１．６ｍｌのトランスフェクション複合体を滴下し、４～５時間後、トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を１０％ＦＢＳのＤＭＥＭ培基と交換し、３７℃で７２時間インキュベートし、ウイルス溶液の上清を収集する。

ｂ．レンチウイルス濃縮
１）５ＸＰＥＧ８０００ＮａＣｌの調製：８．７６６ｇのＮａＣｌと５０ｇのＰＥＧ８０００とを秤量して２００ｍｌのＭｉｌｌｉ－Ｑ純水に溶解し、１２１℃で３０分間湿熱滅菌し、４℃で保存し、
２）０．４５μｍのフィルターを使用してウイルス上清溶液をろ過し、３０ｍｌごとにろ過した後のウイルス初期溶液に、７．５ｍｌの５Ｘ ＰＥＧ－８０００ＮａＣｌ母液を加え、２０～３０分ごとに１回、合計３～５回混合し、４℃で一晩置き、遠心分離した後上清を吸引して捨て、静止して残留液体を除去し、適切な量のレンチウイルス溶解液を加えてレンチウイルスペレットを溶解し、濃縮したウイルス懸濁液を－８０℃で保存する。

フローサイトメトリーによって検出されたレンチウイルスの力価は、陽性率が５～２０％の細胞の数であり、力価（Ｕ／ｍＬ）＝細胞の数×陽性率／ウイルス体積を計算し、濃縮した後のウイルスの力価は、それぞれ、
ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ：２．４×１０^８Ｕ／ｍｌ
ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔ：１×１０^８Ｕ／ｍｌである。
３.ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔ細胞の調製

１）抗ＣＤ３とＣＤ２８抗体との磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＴリンパ球を活性化し、
２）感染の前日、レトロネクチン（ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）で２４ウェルプレートをコーティングし、各ウェルに３８０μｌの５μｇ／ｍｌのレトロネクチン溶液（ＰＢＳ）を加え、４℃で一晩インキュベートし、
３）２４ウェルプレートのレトロネクチン溶液（ＰＢＳ）を捨て、１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、レトロネクチンでコーティングした２４ウェルプレートに活性化されたＴ細胞を接種し、各ウェルの細胞の数は、５×１０^５であり、培養液の体積は、５００μｌであり、ＭＯＩ＝１５に従って、濃縮した後のレンチウイルスをＰＢＭＣ細胞に加え、３２℃、１８００ｒｐｍで４０分間遠心分離した後、細胞インキュベーターに移し、
４）増殖培養：感染された細胞を５×１０^５／ｍＬの密度で１日おきに継代し、同時に、リンパ球培養液に最終濃度が５００Ｕ／ｍＬである組換えヒトＩＬ－２を補充する。

当技術分野における一般的なフローサイトメトリーを使用してＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ細胞／ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔの陽性率（純度）アッセイ（アッセイ方法は、Ｋｏｗｏｌｉｋ ｅｔ ａｌ．、２００６によって記事された方法等の、当技術分野における従来の方法出る）を測定し、結果は、図１Ｂに示され、ＵＴＤは、ＣＡＲでトランスフェクトされていないＴ細胞であり、ＧＰＣ３－ＣＡＲは、ｐＲＲＬＳＩＮ．ｃＰＰＴ．ＥＦ－１α－９Ｆ２－２８ＺでトランスフェクトされたＴ細胞であり、ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲは、ｐＲＲＬＳＩＮ．ｃＰＰＴ．ＥＦ－１α－９Ｆ２－２８Ｚ－ＮＦＡＴ６－ＩＬ１２でトランスフェクトされたＴ細胞であり、結果は、９Ｆ２－２８Ｚ／９Ｆ２－２８Ｚ－ＮＦＡＴ６－ＩＬ１２表面がすべてより高いレベルのＣＡＲ発現を有することを示す。

実施例２．ＧＰＣ３ ＣＡＲ－Ｔ／ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔ細胞を標的とする細胞毒性アッセイ
ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞毒性検出キット（プロメガ会社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用して細胞毒性を検出し、具体的には、ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞毒性検出キットの取扱説明書を参照する。
１）標的細胞：Ｈｕｈ－７、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＳＫ－ＨＥＰ－１細胞を標的細胞として選択し、ここで、Ｈｕｈ－７細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞は、ＧＰＣ３陽性であり、ＳＫ－ＨＥＰ－１細胞は、ＧＰＣ３陰性であり、
２）エフェクター細胞：３：１、１：１または１：３のエフェクター：ターゲット比に従って、ＵＴＤ、ＧＰＣ３－ＣＡＲ－ＴおよびＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔ細胞を加え、
実験結果は、図２に示され、ＵＴＤグループと比較して、ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ／ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔは、インビトロ毒性実験において、すべてより強い細胞毒性作用を示し、両者の間に有意差はない。ＧＰＣ３陰性の肝臓がん細胞に対して、ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ／ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔは、殺傷効果の増強はない。

実施例３．ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ／ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔサイトカインの分泌状況
ＵＴＤ／ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ／ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔを肝臓がん細胞株Ｈｕｈ－７、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＳＫ－ＨＥＰ－１細胞と１：１で２４時間インキュベートした後上清を収集し、ＥＬＩＳＡで上清中のサイトカインの分泌レベルを検出する。

ここで、ＴＮＦ－α、ＩＬ１２を検出するためのサンプルは、希釈する必要はなく、ＩＬ２とＩＦＮ－γとを検出するためのサンプルは、それぞれ２０倍と２５倍とに希釈される。ＥＬＩＳＡキットは、二重抗体サンドイッチ酵素結合免疫吸着検出技術を使用する。結果は、図３Ａおよび３Ｂに示される。図３Ａは、ＧＰＣ３＋腫瘍細胞Ｈｕｈ－７とＰＬＣ／ＰＲＦ／５とを共培養した場合、ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔがより高いレベルのＩＬ１２分泌を有することを示し、ＧＰＣ３－の腫瘍細胞ＳＫ－ＨＥＰ－１と共培養する場合、ＩＬ１２はほとんど検出されず、当該ＣＡＲ－Ｔ細胞がＧＰＣ３を識別する場合にのみＩＬ１２を分泌することを示す。図３Ｂは、ＵＴＤ／ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ／ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔと腫瘍細胞とを２４時間共培養した場合、サイトカインＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γの放出状況を検出し、ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔが有意に多くのＩＦＮ－γを分泌することを示す。

実施例４．中程度に高いＧＰＣ３発現を伴う内因性Ｈｕｈ－７皮下移植腫瘍に対するＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ／ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔの治療効果
１．ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＨｕｈ－７皮下移植腫を接種
Ｈｕｈ－７細胞を２×１０^６／匹で皮下接種し、腫瘍の体積は、約１０日後に３００ｍｍ^３に達し、ランダムグループ化することにより、各グループは、６匹のマウスであり、
２．ＵＴＤ／ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ／ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔ細胞を調製および増殖し、

３．Ｈｕｈ－７移植腫瘍に対するＵＴＤ／ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ／ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔ細胞養子免疫治療
１）皮下移植された腫瘍には、１０日以内に腹腔内シクロホスファミド（１００ｍｇ／ｋｇ）が注射され、
２）１０日目に、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの移植腫瘍体積を測定しかつランダムにグループ化する。皮下移植された腫瘍マウスは、それぞれのグループには６匹のマウスがいる、ＵＴＤグループ、ＧＰＣ３－ＣＡＲ－ＴグループおよびＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔグループを含む三つのグループにグループに分けられ、
３）１２日目に、グループ化された後のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス細胞に養子免疫治療を行う。１ｘ１０^７細胞／匹のマウスの投与量で尾静脈注射により低投与量のＣＡＲ－Ｔを投与し、
４）３～４日ごとにＨｕｈ－７皮下移植腫瘍の体積の大きさを測定し、マウスの各グループの腫瘍体積の変化を記録し、経時的な腫瘍体積の成長曲線を描く。結果は、図４Ａおよび図４Ｂに示される。

図４Ａは、Ｈｕｈ－７皮下移植腫瘍の成長状況を示し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与の２日後、ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔは、有意な腫瘍阻害および殺傷効果を示し、ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔグループにおいて、腫瘍は、１４日目から増加しており、ブランク対照グループと大差はない。ＧＰＣ３－ＣＡＲで制御できない腫瘍に対して、ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔは、依然として優れた殺傷活性を示すことを説明する。

図４Ｂは、ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔを投与した後、ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔグループとブランク対照グループとのマウスの体重に有意差はないことを示し、ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔは、有意な抗腫瘍効果を示したものの、体重減少の治療関連の副作用を引き起こさなかったことを示す。さらに、実験グループのマウスに対する観察は、ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔを投与した後のマウスも明らかな毒性副作用はなかったことを示す。

ＣＡＲ－Ｔ注射後７日目と１０日目にそれぞれ尾静脈から採血し、フローサイトメトリーによってＣＡＲ－Ｔ細胞の生存状況を検出し、結果は、図５に示され、７日目にＧＰＣ３－ＣＡＲ－ＴグループのＣＡＲ－Ｔ細胞の生存数は、６０００個／μＬ未満であり、ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ ＴグループのＣＡＲ－Ｔ細胞の生存数は、８０００個／μＬ近くに達し、１０日目にＧＰＣ３－ＣＡＲ－ＴグループのＣＡＲ－Ｔ細胞は、２０００個／μＬ未満に大幅に減少し、ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔは、依然としてより高い細胞生存率を維持し、７日目のＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔのデータと比較して、差が小さく、ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔグループと比較して、ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔグループは、末梢血中のＣＡＲ－Ｔ細胞の数が少なくとも７５％（計算方法：ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔグループ－ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔグループ／ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔグループ）多いことを示し、インビボでのＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔの細胞生存率は、ＩＬ１２を含まないＣＡＲ－Ｔ製品よりもはるかに優れていることを示す。

１０日目に、マウスの末梢血を採取し、血清サンプルをＥＬＩＳＡによってＩＦＮ－γを検出し、検出方法は、実施例３と同じであり、結果は、図６に示され、ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔグループのマウスの血液中のＩＦＮ－γは、ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔグループよりもはるかに高いことを示す。

実験終了時に、その皮下腫瘍を採取し、腫瘍組織中の浸潤性Ｔ細胞およびＫｉ６７に対して免疫組織化学で検出し、結果は、図７に示され、ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ ＴグループのＣＡＲ－Ｔ浸潤は、ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔグループよりも優位に多く、ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔグループの核増殖マーカー（Ｍａｒｋｅｒ）Ｋｉ６７は、他の二つのグループよりも優位に低く、Ｋｉ６７の減少は、腫瘍内の増殖細胞の減少を示し、即ち、ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔは、ＧＰＣ３＋の腫瘍細胞を効果的に排除し、腫瘍細胞の増殖を阻害することができることを示す。

実験終了時に、マウスを安楽死させかつその皮下腫瘍を秤量し、結果は、図８Ａおよび図８Ｂに示され、ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔグループは、実験終了時の腫瘍体積と腫瘍重量との点で第２世代のＣＡＲ－Ｔグループよりも有意に低く、有意な統計的な差を有する。

実施例５．マウスＣＡＲ－Ｔ（ｍＧＰＣ３－ＣＡＲ）およびｍ－ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔ（マウスＣＡＲ－ＩＬ１２）細胞の調製
免疫健全なマウスにおける自然免疫の動員におけるＩＬ１２の役割をさらに検証するために、マウス由来のＣＡＲ－Ｔを調製した。

１．プラスミドの構築
マウスＣＤ８αシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、マウスＣＤ８αヒンジ領域および膜貫通領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、マウスＣＤ２８細胞内ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、マウスＣＤ３ζ細胞内ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）の遺伝子配列を順次に連結し、インビトロ遺伝子合成法によってＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ遺伝子フラグメントを得、レトロウイルスベクターＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰのＩＲＥＳ－ＧＦＰフラグメントをＭｌｕ IとＳａｌ Iとの二重酵素制限部位に置き換えて、組換えベクターＭＳＣＶ－ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔを得る。マウスＣＡＲ－ＩＬ１２（ｍ－ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔ）は、ＭＳＣＶ－ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔプラスミドに基づいてｍＮＦＡＴ６－ｍＩＬ１２配列を挿入し、ＧＰＣ３発現する第２世代のキメラ抗原受容体およびｍＩＬ１２のプラスミドＭＳＣＶ－ＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔを構築する。ｍＮＦＡＴ６－ｍＩＬ１２配列は、６＊ｍＮＦＡＴ結合モチーフ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、ｍＩＬ２最小プロモーター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、ｍＩＬ１２シグナルペプチドおよびｍＩＬ１２ ｐ４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、（ＳＧ４）３リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、ｍＩＬ１２ ｐ３５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、ＰＡ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）で構成される。

２．レトロウイルスのパッケージング
１）６～１０継代まで培養した２９３Ｔ細胞を１０ｃｍペトリ皿に５×１０^６の密度で接種し、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩培養し、培地は、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｉｃｏ）を含むＤＭＥＭであり、
２）９μｇのＭＳＣＶ－ＧＰＣ３－ＣＡＲ－ＴまたはＭＳＣＶ－ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ－ｍＮＦＡＴ６－ｍＩＬ１２と９μｇのパッケージングプラスミドｐＣＬ－Ｅｃｏとを８００μＬの無血清ＤＭＥＭ培養液に溶解し、均等に混合して、プラスミド混合液を得、５４μｇのＰＥＩ（１μｇ／μｌ）を８００μｌの無血清ＤＭＥＭ培養液に溶解し、均等に混合し、室温下で５分間インキュベートして、ＰＥＩ混合液を得、
３）プラスミド混合液をＰＥＩ混合液に加えて均等に混合し、室温下で２０分間インキュベートして、トランスフェクション複合体を形成し、
４）１１ｍｌのＤＭＥＭ培地を含む１０ｃｍのペトリ皿に１．６ｍｌのトランスフェクション複合体を滴下し、４～５時間後、トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を１０％ＦＢＳのＤＭＥＭ培基と交換し、３７℃で７２時間インキュベートし、ウイルス溶液上清を収集して、ｍＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ／ｍＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ－ｍＮＦＡＴ６－ｍＩＬ１２を保有するレトロウイルスを収集する。

４．マウスＣＡＲ－Ｔリンパ球の調製
健康なＢａｌｂ／ｃマウスを取り、細胞分離キット（Ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ）（幹細胞技術（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用して、取扱説明書の記載に従って、分離してマウスの脾臓Ｔリンパ球を得る。

精製したマウスＣＤ３＋Ｔリンパ球をＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｏｕｓｅ Ｔ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（ＰＢＳで１回洗浄する）に１：１の比率で加え、インキュベーターに入れて培養し、培地は、活性化用のＲＰＭＩ１６４０完全培地である。

レトロネクチンでコーティングされた４８ウェルプレートに２４時間活性化されたマウス脾臓Ｔリンパ球を接種し、ウェルあたりの細胞の数は、１×１０^６であり、１ｍｌのｍＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ／ｍＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ－ｍＮＦＡＴ６－ｍＩＬ１２のレトロウイルスを加え、培地を２ｍＬまでに補充し、２０００ｇ、３２℃で、９０分間遠心分離した後、細胞インキュベーターに移して培養を続け、翌日、新鮮な培地を好感し、細胞密度を５×１０^５／ｍＬに調整し、２～３ごとに継代を行う。

ｍＣＡＲ－Ｔ細胞キメラ抗原受容体発現アッセイ：
１×１０^６のｍＣＡＲ－Ｔ／ｍＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔ細胞を取り、２ｍｌの遠心分離管内に均等に二つに分け、４℃、４００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨て、ＰＢＳで２回洗浄する。対照グループの細胞に５０μｌのＰＥ－ＳＡ（１：２００で希釈する）抗体を加えて氷上で４５分間インキュベートし、ＰＢＳ（２％ＮＢＳ）で２回洗浄し、再懸濁した後対照とし、検出グループの細胞に１：５０で希釈した５０μｌのビオチン－ヤギ抗ヒト（ｂｉｏｔｉｎ－Ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ）ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２抗体を加え、氷上で４５分間インキュベートし、ＰＢＳ（２％ＮＢＳ）で２回洗浄し、５０μｌのＰＥ－ＳＡ（１：２００で希釈する）抗体を加えて氷上で４５分間インキュベートする。

２ｍｌのＰＢＳ（２％ＮＢＳ）を加えて細胞を再懸濁し、４℃、４００ｇで５分間遠心分離して上清を捨て、２回繰り返し、５００μｌのＰＢＳ（２％ＮＢＳ）を加え、ＦＡＣＳによって検出し、結果は、図９に示され、結果は、ｍ９Ｆ２－ｍ２８Ｚ／ｍ９Ｆ２－ｍ２８Ｚ－ｍＮＦＡＴ６－ｍＩＬ１２の表面は、すべてより高いレベルのＣＡＲ発現を有し、ＵＴＤは、ＣＡＲでトランスフェクトされていないｍＴ細胞であることを示す。

実施例６．ＧＰＣ３ ｍＣＡＲ－Ｔ／ｍＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔ細胞を標的とする細胞毒性アッセイ
ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞毒性検出キット（プロメガ会社）を使用し、具体的には、ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞毒性検出キットの取扱説明書を参照する。

１）標的細胞：９６ウェルプレートにそれぞれ５０μＬの２×１０^５／ｍＬのＥ０７７１－Ｐａｒｅｎｔａｌ、Ｅ０７７１－Ｐａｒｅｎｔａｌ－ＧＰＣ３、Ｅ０７７１－Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ（Ｅ０７７１をマウスの腫瘍形成に接種した後、腫瘍組織を分離することによって得られた細胞株）、Ｅ０７７１－Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ－ＧＰＣ３細胞を接種し、
２）エフェクター細胞：３：１、１：１または１：３のエフェクター：ターゲット比に従って、ＵＴＤ、ｍＧＰＣ３－ｍ２８ＺおよびｍＧＰＣ３－ｍ２８Ｚ－ｍＮＦＡＴ６－ｍＩＬ１２細胞を加え、
実験結果は、図１０に示され、ＵＴＤグループと比較して、ｍＧＰＣ３－ＣＡＲおよびｍＧＰＣ３－ｍ２８Ｚ－ｍＮＦＡＴ６－ｍＩＬ１２（ｍＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔ）は、インビトロ毒性実験において、すべてより強い細胞毒性作用を示し、両者の間に有意差はない。ＧＰＣ３陰性の腫瘍細胞に対して、ｍＧＰＣ３－ＣＡＲおよびｍＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔは、殺傷効果の増強はない。

実施例７．ｍＣＡＲ－Ｔ／ｍＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔサイトカインの分泌状況
ＵＴＤ／ｍＧＰＣ３－ＣＡＲ／ｍＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ ＴをＥ０７７１－Ｐａｒｅｎｔａｌ、Ｅ０７７１－Ｐａｒｅｎｔａｌ－ＧＰＣ３、Ｅ０７７１－Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ、Ｅ０７７１－Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ－ＧＰＣ３細胞と１：１で２４時間インキュベートした後上清を収集し、ＥＬＩＳＡで上清中のサイトカインの分泌レベルを検出する。ここで、ｍＴＮＦ－α、ｍＩＬ１２、ｍＩＬ２を検出するためのサンプルは、希釈する必要はなく、ｍＩＦＮ－γを検出するためのサンプルは、５０倍に希釈される。ＥＬＩＳＡキットは、二重抗体サンドイッチ酵素結合免疫吸着検出技術を使用する。特異的抗マウスＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２モノクローナル抗体は、それぞれ高親和性ＥＬＩＳＡプレートにプレコーティングされる。ＥＬＩＳＡプレートのウェルに標準の試験サンプルおよびビオチン化の検出抗体を加え、インキュベートした後、サンプルに存在するｍＩＬ－２、ｍＴＮＦ－α、ｍＩＦＮ－γ、ｍＩＬ－１２は、それぞれ固相抗体および検出抗体に結合する。未結合物質を洗浄および除去した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ）を加える。洗浄した後ＴＭＢで発色する。色反応の強度は、サンプル中の上記サイトカインの濃度に正比例する。反応を停止するために停止溶液を加え、４５０ｎｍの波長（参照波長５７０～６３０ｎｍ）での吸光度値を測定する。

結果は、図１１Ａおよび１１Ｂに示され、図１１Ａは、ＵＴＤ、ｍＧＰＣ３－ＣＡＲ、ｍＧＰＣ３－ｍ２８Ｚ－ｍＮＦＡＴ６－ｍＩＬ１２と腫瘍細胞とを２４時間共培養した場合のｍＩＬ－１２の分泌状況を検出し、ＧＰＣ３＋の腫瘍細胞と共培養した場合、ｍＧＰＣ３－ｍ２８Ｚ－ｍＮＦＡＴ６－ｍＩＬ１２（ｍＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔ）は、より高いレベルのＩＬ１２分泌を有することを示し、マウスＩＬ１２分泌も誘導可能であることを示す。図１１Ｂは、ＵＴＤ／ｍＧＰＣ３－ｍ２８Ｚ／ｍＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔと腫瘍細胞とを２４時間インキュベートした場合のサイトカインｍＩＬ－２、ｍＴＮＦ－α、ｍＩＦＮ－γの放出状況を検出し、ｍＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ Ｔが有意に多くのＩＦＮ－γを分泌することを示す。

実施例８． Ｅ０７７１－ＧＰＣ３皮下移植腫瘍に対するｍＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ／ｍＩＬ１２－ＧＰＣ３－Ｔの治療効果
１．Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＥ０７７１－ＧＰＣ３皮下移植腫瘍を接種
Ｅ０７７１－ＧＰＣ３細胞を１×１０^６／匹で皮下接種し、腫瘍の体積は、約１０日後に３００ｍｍ^３に達し、ランダムグループ化することにより、各グループは、６匹のマウスであり、
２．ｍＵＴＤ／ｍＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ／ｍＩＬ１２－ＧＰＣ３－Ｔ細胞を調製および増殖し、
３．Ｅ０７７１－ＧＰＣ３移植腫瘍に対するｍＵＴＤ／ｍＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ／ｍＩＬ１２－ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ細胞養子免疫治療
１）１０日目に、Ｅ０７７１－ＧＰＣ３マウスの移植腫瘍体積を測定しかつランダムにグループ化する。皮下移植腫瘍マウスは、それぞれのグループには６匹のマウスがイル、ＵＴＤグループ、ｍＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ５×１０^６グループ、ｍＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ２×１０^６グループ、ｍＩＬ１２－ＧＰＣ３－Ｔ５×１０^６グループ、ｍＩＬ１２－ＧＰＣ３－Ｔ２×１０^６グループを含む五つのグループに分けられ、
２）３～４日ごとにＥ０７７１－ＧＰＣ３皮下移植腫瘍の体積の大きさを測定し、マウスの各グループの腫瘍体積の変化を記録し、経時的な腫瘍体積の成長曲線を描く。結果は、図１２Ａおよび図１２Ｂに示される。

図１２Ａは、ｍＩＬ１２－ＧＰＣ３－Ｔ５×１０^６／匹グループとｍＩＬ１２－ＧＰＣ３－Ｔ２×１０^６／匹グループとの尾静脈注射が実験終了時に同様の腫瘍阻害効果を示し、両方ともより優れた腫瘍阻害効果を示し、腫瘍阻害率は、すべて９０％を超え、ＩＬ１２の補助下で、低投与量のＣＡＲ－Ｔ注入が、大きな腫瘍負荷に直面しても望ましい効果を達成できることを示し、一方、ｍＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ５×１０^６／匹グループは、ｍＵＴＤグループに比べて、体積が小さかったものの、統計的差はなく、ＣＡＲ－Ｔ注射時の腫瘍体積が大きい（３００ｍｍ^３）ためと考えられる。

図１２Ｂは、ｍＩＬ１２－ＧＰＣ３－Ｔの投与後、ｍＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔグループとブランク対照グループとのマウスの体重に有意差はないことを示し、ＩＬ１２－ＧＰＣ３－Ｔは、有意な抗腫瘍効果を示したものの、体重減少の治療関連の副作用を引き起こさなかったことを示す。

実験終了時に、マウスを安楽死させかつその皮下腫瘍を秤量し、結果は、図１３Ａおよび図１３Ｂに示され、ｍＩＬ１２－ＧＰＣ３－Ｔグループは、実験終了時の腫瘍体積と腫瘍重量との点で第２世代のＣＡＲ－Ｔグループよりも有意に低く、有意な統計的な差を有する。

本発明に関与される配列は、以下の表に要約される。

本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。

Claims (22)

1. 免疫応答細胞であって、
   当該細胞は、ＧＰＣ３に特異的に結合する受容体および外因性ＩＬ１２を発現することを特徴とする、前記免疫応答細胞。
2. 前記受容体は、前記ＩＬ１２に操作可能に連結されることを特徴とする
   請求項１に記載の免疫応答細胞。
3. 前記免疫応答細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、細胞毒性Ｔリンパ球、ナチュラルキラーＴ細胞、ＤＮＴ細胞、および／または制御性Ｔ細胞を含むことを特徴とする
   請求項１に記載の免疫応答細胞。
4. 前記外因性ＩＬ１２は、構成的発現または誘導型発現であり、
   好ましくは、前記ＩＬ１２を発現するために使用されるプロモーターは、免疫細胞誘導型プロモーターを含み、
   好ましくは、前記免疫細胞誘導型プロモーターは、ＮＦＡＴ６プロモーターであることを特徴とする
   請求項１に記載の免疫応答細胞。
5. 前記受容体は、ＧＰＣ３に特異的に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナルドメインを有することを特徴とする
   前記請求項のいずれか１項に記載の免疫応答細胞。
6. 前記受容体は、キメラ抗原受容体であり、ここで、前記細胞内ドメインは、細胞刺激シグナル分子、または細胞刺激シグナル分子と細胞活性化共刺激分子との組み合わせを含み、
   好ましくは、前記細胞刺激シグナル分子は、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＦｃεＲＩγ、ＦｃＲβ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｆｃ γＲＩＩａ、ＤＡＰ１０、またはＤＡＰ１２タンパク質の機能的シグナル伝達ドメインから選択され、より好ましくは、ＣＤ３ζであり、または
   好ましくは、前記細胞活性化共刺激分子は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２Ｄのようなタンパク質機能的シグナル伝達ドメインから選択され、より好ましくは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、およびＩＣＯＳであることを特徴とする
   請求項５に記載の免疫応答細胞。
7. 前記受容体の細胞外ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする
   請求項５または６に記載の免疫応答細胞。
8. 前記受容体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、２２、２３、または２４に示されるアミノ酸配列を含むか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、２２、２３、または２４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする
   前記請求項のいずれか１項に記載の免疫応答細胞。
9. 前記受容体および前記外因性ＩＬ１２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされ、
   好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、２９、３０、または３１と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされ、
   より好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、２９、３０、または３１に示されるヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする
   請求項８に記載の免疫応答細胞。
10. 前記免疫応答細胞は、外因性共刺激リガンドを含まないことを特徴とする
    前記請求項のいずれか１項に記載の免疫応答細胞。
11. 前記受容体および／または前記ＩＬ１２は、免疫応答細胞の表面に構成的または誘導的に発現されることを特徴とする
    前記請求項のいずれか１項に記載の免疫応答細胞。
12. 前記免疫応答細胞は、発現構築物を含み、当該発現構築物は、前記抗原結合受容体の発現カセット、および前記ＩＬ１２の発現カセットを含むことを特徴とする
    前記請求項のいずれか１項に記載の免疫応答細胞。
13. 前記受容体および／またはＩＬ１２は、ウイルスベクターを使用して発現し、好ましくは、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、逆転写ウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターを含むことを特徴とする
    前記請求項のいずれか１項に記載の免疫応答細胞。
14. 前記免疫応答細胞が個体に投与された後、前記個体の末梢血中のＣＡＲ－Ｔ細胞の数は、前記外因性ＩＬ１２が存在しない状況に比較して少なくとも５０％増加することを特徴とする
    請求項１～１３のいずれか１項に記載の免疫応答細胞。
15. 前記免疫応答細胞が個体に投与されてから約７日後、前記個体の末梢血中のＣＡＲ－Ｔ細胞の数の合計は、６０００個／μＬを超え、前記免疫応答細胞が投与されてから約１０日後、前記個体の末梢血中のＣＡＲ－Ｔ細胞の数の合計は、６０００個／μＬを超えることを特徴とする
    請求項１～１３のいずれか１項に記載の免疫応答細胞。
16. 発現構築物であって、
    当該発現構築物は、順次に連結された受容体の発現カセットおよびＩＬ１２の発現カセットを含み、ここで、前記抗原結合受容体およびＩＬ１２は、前記請求項のいずれか１項に定義されたとおりであることを特徴とする、前記発現構築物。
17. 必要とする個体の腫瘍を治療するための医薬組成物の調製における請求項１～１３のいずれか１項に記載の免疫応答細胞の用途。
18. 前記腫瘍は、肝臓臓がん、胃がん、肺がん、乳がん、頭頚部がん、膀胱がん、卵巣がん、子宮頸がん、腎臓がん、膵臓がん、子宮頸がん、脂肪肉腫、黒色腫、副腎がん、神経鞘腫、悪性線維性組織球腫、および食道がんを含み、好ましくは、前記腫瘍は、肝臓臓がん、胃がん、肺がん、または乳がんであることを特徴とする
    請求項１７に記載の用途。
19. 前記免疫エフェクター細胞は、腫瘍を少なくとも５０％減少させることを特徴とする
    請求項１７または１８に記載の用途。
20. 前記免疫エフェクター細胞は、腫瘍を少なくとも７０％減少させ、より好ましくは、前記免疫エフェクター細胞は、腫瘍を少なくとも８０％減少させることを特徴とする
    請求項１９に記載の用途。
21. 医薬組成物であって、
    前記医薬組成物は、
    請求項１～１３のいずれか１項に記載の免疫応答細胞、および
    薬学的に許容されるベクターまたは賦形剤を含むことを特徴とする、前記医薬組成物。
22. キットであって、
    請求項１～１３のいずれか１項に記載の免疫応答細胞、および
    前記免疫応答細胞を個体に投与する方法を指導する取扱説明書を含むことを特徴とする、前記キット。
    

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