JP2024509917A - 腫瘍溶解性ウイルスによる直交性ｉｌ－２の送達を用いた、固形腫瘍におけるｔ細胞の選択的刺激方法 - Google Patents

腫瘍溶解性ウイルスによる直交性ｉｌ－２の送達を用いた、固形腫瘍におけるｔ細胞の選択的刺激方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、直交性キメラサイトカイン受容体（例えばoIL2R-IL9Rキメラ受容体）とキメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（TCR）とを含む改変免疫細胞またはその前駆体（例えば改変T細胞）のための、直交性キメラサイトカイン受容体/直交性サイトカインのペアおよび組成物ならびに方法を提供する。本開示は、直交性サイトカイン（例えばoIL2）をコードする核酸配列を含む腫瘍溶解性アデノウイルスベクター、ならびに、その必要のある対象においてがんを処置するために前記改変細胞および前記ベクターを使用する方法を、さらに提供する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、2021年3月9日に出願された米国仮特許出願第63/158,671号に対して米国特許法第119条（e）に基づく優先権を主張し、この米国仮出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
連邦政府による資金提供を受けた研究または開発に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所によって交付された契約U54CA244711の下に、米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
発明の背景
現在の免疫治療の進歩は、急性リンパ芽球性白血病およびびまん性大細胞型B細胞リンパ腫の処置に対するCD19標的CAR-T細胞のFDA承認によって明らかなように、血液悪性疾患の処置にとって画期的なことであった。しかし、がん処置に関して、まだ対処されていない最大の重荷は、固形腫瘍である。CAR-T細胞は、腫瘍特異抗原の欠如、治療抵抗性の壁を克服すること、腫瘍不均一性、不十分な拡大および持続性、ならびに密な免疫抑制性の腫瘍微小環境（TME）がもたらす外因性機能障害およびT細胞浸潤に対する物理的障壁を含むいくつかの難題ゆえに、固形腫瘍に対する戦いでは効力を欠いてきた。大きな制約の一つは、養子移入されたT細胞の不十分なインビボでの拡大と持続性であり、そのためにリンパ枯渇コンディショニング化学療法を余儀なくされるが、これは患者の適格性を制限する毒性レジメンである。拡大し持続するT細胞でさえ、最終分化して機能障害を起こすことになる。幹細胞様表現型を持つT細胞であれば、これらの制約を克服し、マウスモデルおよびヒトにおいて優れた抗腫瘍活性を呈することができるが、幹細胞様T細胞を選択しまたは拡大するための治療的操作は細胞製造段階に限られ、インビボでは行うことができない。これらの壁および難題を克服する新規な細胞ベースの治療法が、当技術分野では必要とされている。本発明はこの必要性に対処する。
いくつかの局面において、本発明は、細胞における受容体の選択的活性化のためのシステムであって、
（a）以下：
（i）直交性キメラサイトカイン受容体、および
（ii）少なくとも1つのキメラ抗原受容体（CAR）
を含む、改変免疫細胞と、
（b）直交性IL2サイトカインをコードする核酸配列を含む、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターと
を含み、
該直交性キメラサイトカイン受容体が、直交性IL2受容体（oIL2R）の細胞外ドメインと、IL2Rではないサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、システムを提供する。
いくつかの態様において、oIL2Rの前記細胞外ドメインは、直交性IL2受容体ベータ（oIL2Rb）の細胞外ドメインである。
いくつかの態様において、前記直交性キメラサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、IL9R細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの態様において、前記IL9R細胞内シグナル伝達ドメインは、IL9R-アルファ（IL9Ra）細胞内シグナル伝達ドメインである。
いくつかの態様において、前記CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。
いくつかの態様において、前記抗原結合ドメインは、完全長抗体またはその抗原結合フラグメント、Fab、一本鎖可変フラグメント（scFv）、または単一ドメイン抗体からなる群より選択される。
いくつかの態様において、前記抗原結合ドメインは、腫瘍抗原を標的とする。
いくつかの態様において、前記腫瘍抗原は、CD19、CD20、HER2、NY-ESO-1、MUC1、CD123、FLT3、B7-H3、CD33、IL1RAP、CLL1（CLEC12A）PSA、CEA、VEGF、VEGF-R2、CD22、ROR1、メソテリン、c-Met、糖脂質F77、FAP、EGFRvIII、MAGE A3、5T4、WT1、KG2Dリガンド、葉酸受容体（FRa）、およびWnt1抗原からなる群より選択される。
いくつかの態様において、前記抗原結合ドメインは、scFvである。
いくつかの態様において、前記抗原結合ドメインは、抗メソテリンscFvである。
いくつかの態様において、前記CARの細胞内ドメインは、TNFRスーパーファミリーのタンパク質、CD28、4-1BB（CD137）、OX40（CD134）、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C、およびB7-H3（CD276）、もしくはそれらの変異体からなる群より選択されるタンパク質の共刺激ドメイン、またはキラー免疫グロブリン様受容体（KIR）由来の細胞内ドメインを含む。
いくつかの態様において、前記CARの細胞内ドメインは、ヒトCD3ゼータ鎖（CD3ζ）、FcγRIII、FcsRI、Fc受容体の細胞質テール、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を保持する細胞質受容体、TCRゼータ、FcRガンマ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66d、またはそれらの変異体からなる群より選択されるタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの態様において、（a）前記直交性キメラサイトカイン受容体は、oIL2Rbの細胞外ドメインと、IL9Raの細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、（b）前記CARは、抗メソテリン抗原結合ドメインを含む。
いくつかの局面において、本発明は、対象におけるがんを処置する方法であって、
（a）該対象に、
（i）直交性キメラサイトカイン受容体、および
（ii）少なくとも1つのCAR
を含む、有効量の改変免疫細胞またはその前駆体（改変免疫細胞の集団）を投与する工程、および
（b）該対象に、直交性IL2サイトカインをコードする核酸配列を含む、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを投与する工程
を含み、
該直交性キメラサイトカイン受容体が、直交性IL2受容体（oIL2R）の細胞外ドメインと、IL2Rではないサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、方法を提供する。
いくつかの態様において、oIL2Rの前記細胞外ドメインは、直交性IL2受容体ベータ（oIL2Rb）の細胞外ドメインである。
いくつかの態様において、前記直交性キメラサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、IL9R細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの態様において、前記IL9R細胞内シグナル伝達ドメインは、IL9R-アルファ（IL9Ra）細胞内シグナル伝達ドメインである。
いくつかの態様において、前記CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。
いくつかの態様において、前記抗原結合ドメインは、完全長抗体またはその抗原結合フラグメント、Fab、一本鎖可変フラグメント（scFv）、または単一ドメイン抗体からなる群より選択される。
いくつかの態様において、前記抗原結合ドメインは、腫瘍抗原を標的とする。
いくつかの態様において、前記腫瘍抗原は、CD19、CD20、HER2、NY-ESO-1、MUC1、CD123、FLT3、B7-H3、CD33、IL1RAP、CLL1（CLEC12A）PSA、CEA、VEGF、VEGF-R2、CD22、ROR1、メソテリン、c-Met、糖脂質F77、FAP、EGFRvIII、MAGE A3、5T4、WT1、KG2Dリガンド、葉酸受容体（FRa）、およびWnt1抗原からなる群より選択される。
いくつかの態様において、前記抗原結合ドメインは、scFvである。
いくつかの態様において、前記抗原結合ドメインは、抗メソテリンscFvである。
いくつかの態様において、前記CARの細胞内ドメインは、TNFRスーパーファミリー、CD28、4-1BB（CD137）、OX40（CD134）、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C、およびB7-H3（CD276）、もしくはそれらの変異体からなる群より選択されるタンパク質の共刺激ドメイン、またはキラー免疫グロブリン様受容体（KIR）由来の細胞内ドメインを含む。
いくつかの態様において、前記CARの細胞内ドメインは、ヒトCD3ゼータ鎖（CD3ζ）、FcγRIII、FcsRI、Fc受容体の細胞質テール、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を保持する細胞質受容体、TCRゼータ、FcRガンマ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66d、またはそれらの変異体からなる群より選択されるタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの態様において、（a）前記直交性キメラサイトカイン受容体は、oIL2Rbの細胞外ドメインと、IL9Raの細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、（b）前記CARは、抗メソテリン抗原結合ドメインを含む。
いくつかの態様において、前記改変免疫細胞の集団は、改良された輸送およびエフェクター機能を持つ幹細胞メモリー（Tscm）特徴を呈し、それによってがんを処置する。
いくつかの態様において、ベクターを投与する前記工程は、腫瘍内注射を含む。
いくつかの態様において、前記がんは、膵がんおよび黒色腫からなる群より選択される。
いくつかの態様において、前記膵がんは、膵管腺癌である。
いくつかの局面において、本発明は、細胞における受容体の選択的活性化のためのシステムであって、
（a）以下：
（i）直交性キメラサイトカイン受容体、および
（ii）少なくとも1つのT細胞受容体（TCR）
を発現するように操作された、改変免疫細胞と、
（b）直交性IL2サイトカインをコードする核酸配列を含む、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターと
を含み、
該直交性キメラサイトカイン受容体が、直交性IL2受容体（oIL2R）の細胞外ドメインと、IL2Rではないサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、システムを提供する。
いくつかの態様において、oIL2Rの前記細胞外ドメインは、直交性IL2受容体ベータ（oIL2Rb）の細胞外ドメインである。
いくつかの態様において、前記直交性キメラサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、IL9R細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの態様において、前記IL9R細胞内シグナル伝達ドメインは、IL9R-アルファ（IL9Ra）細胞内シグナル伝達ドメインである。
いくつかの態様において、前記TCRは、腫瘍抗原を標的とする。
いくつかの態様において、前記TCRは、gp100黒色腫抗原またはNYESO1を標的とする。
いくつかの態様において、前記TCRは、pmel-1 TCRまたはNYESO1特異的TCRである。
いくつかの態様において、（a）前記直交性キメラサイトカイン受容体は、oIL2Rbの細胞外ドメインと、IL9Raの細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、（b）前記TCRは、pmel-1 TCRまたはNYESO1特異的TCRである。
いくつかの局面において、本発明は、対象におけるがんを処置する方法であって、
（a）該対象に、
（i）直交性キメラサイトカイン受容体、および
（ii）少なくとも1つのT細胞受容体（TCR）
を発現するように改変された、有効量の改変免疫細胞またはその前駆体（改変免疫細胞の集団）を投与する工程、および
（b）該対象に、直交性IL2サイトカインをコードする核酸配列を含む、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを投与する工程
を含み、
該直交性キメラサイトカイン受容体が、直交性IL2受容体（oIL2R）の細胞外ドメインと、IL2Rではないサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、方法を提供する。
いくつかの態様において、oIL2Rの前記細胞外ドメインは、直交性IL2受容体ベータ（oIL2Rb）の細胞外ドメインである。
いくつかの態様において、前記直交性キメラサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、IL9R細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの態様において、前記IL9R細胞内シグナル伝達ドメインは、IL9R-アルファ（IL9Ra）細胞内シグナル伝達ドメインである。
いくつかの態様において、前記TCRは、腫瘍抗原を標的とする。
いくつかの態様において、前記TCRは、gp100黒色腫抗原またはNYESO1を標的とする。
いくつかの態様において、前記TCRは、pmel-1 TCRまたはNYESO1特異的TCRである。
いくつかの態様において、（a）前記直交性キメラサイトカイン受容体は、oIL2Rbの細胞外ドメインと、IL9Raの細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、（b）前記TCRは、pmel-1 TCRまたはNYESO1特異的TCRである。
いくつかの態様において、前記改変免疫細胞の集団は、改良された輸送およびエフェクター機能を持つ幹細胞メモリー（Tscm）特徴を呈し、それによってがんを処置する。
いくつかの態様において、ベクターを投与する前記工程は、腫瘍内注射を含む。
いくつかの態様において、前記がんは、膵がんおよび黒色腫からなる群より選択される。
いくつかの態様において、前記膵がんは、膵管腺癌である。
本発明の前記その他の特徴および利点は、添付の図面と併せて以下の例示的態様の詳細な説明から、よりよく理解されるだろう。
図1A～図1Gは、キメラ直交性IL-2受容体がT細胞においてIL-9Rシグナル伝達の性質をあらわにするという知見を図解している。（図1A）野生型IL2Rβ受容体複合体、直交性IL2β受容体複合体、またはγcファミリー直交性IL2Rβキメラ受容体複合体の概略図。直交性受容体および直交性キメラ受容体を含有するベクターはすべて、IRES-YFP要素も含有する。（図1B）MSA-IL2（100nM）（中空の色）またはMSA-oIL2（5μM）（中実の色）で20分間刺激された、オルソキメラ受容体（ortho chimeric receptor）を発現する（YFP＋）T細胞または非形質導入（UTD）T細胞における、pSTATシグナル伝達の代表的なヒストグラムおよび定量。データは平均蛍光±SEMとして表されている。n＝3。（図1C）MSA-oIL2、MSA-IL2、またはIL9で20分間刺激された、o2R形質導入T細胞（赤色）またはo9R形質導入T細胞（青色）における、pSTATシグナル伝達の用量応答曲線。データは平均蛍光±SEMとして表されている。YFP＋ゲート。n＝3。（図1D）MSA-IL2（100nM）またはMSA-oIL2（5μM）と共に2日間培養されたキメラ受容体発現T細胞のCD62Lの表面マーカーレベル。（図1E）MSA-IL2（100nM）またはMSA-oIL2（5μM）と共に2日間培養されたキメラ受容体発現T細胞のFasの表面マーカーレベル。（図1F）MSA-IL2（100nM）またはMSA-oIL2（5μM）と共に2日間培養されたキメラ受容体発現T細胞のSca1の表面マーカーレベル。図1D～図1Fではデータは平均蛍光±SEMとして表されている。n＝3。ns、有意差なし;＊＊＊、p＜0.001;＊＊＊＊、p＜0.0001（ANOVA）。（図1G）MSA-oIL2存在下またはMSA-IL2存在下で4日間の培養後、少なくとも1回の分裂を起こしたo2R細胞またはo9R細胞の、用量応答曲線。データは、Flowjoで算出された、分裂した細胞のパーセンテージとして表されている;YFP＋ゲート;n＝3生物学的レプリケート。 図1-1の説明を参照。 図1-1の説明を参照。 図1-1の説明を参照。 MSA-orthoIL2で20分間刺激された、orthoIL2Rβ ICDキメラ受容体発現T細胞のpSTATシグナル伝達の用量応答曲線を図解している。データは平均蛍光±SEMとして表されている。n＝3。 図3A～図3DはmIL9Rの発現とpSTATシグナル伝達に関するデータである。（図3A）C57BL6トランスジェニックマウス由来のモック形質導入T細胞またはmIL9R形質導入T細胞におけるIL9Rの発現。（図3B）pmel1 TCRトランスジェニックマウス由来のモック形質導入T細胞またはmIL9R形質導入T細胞におけるIL9Rの発現。（図3C）MSA-IL2（100nM）（中空の色）またはIL9（1μM）（中実の色）で20分間刺激された、mIL9R発現（YFP＋）C57BL6 T細胞におけるpSTATシグナル伝達の代表的ヒストグラム（上）および定量（下）。データは平均蛍光±SEMとして表されている。n＝3。（図3D）MSA-IL2またはIL9で刺激された、IL9R形質導入pmel T細胞またはモック形質導入pmel T細胞におけるpSTATシグナル伝達の用量応答曲線。 図3-1の説明を参照。 図4A～図4Cは、MSA-oIL2［5μM］の非存在下（中空）または存在下（中実）、MSA-IL2の10倍用量タイトレーション（100nMから出発）で20分間処理された、o9R発現C57BL/6 T細胞におけるpSTATシグナル伝達に関するデータである。データは平均蛍光±SEMとして表されている。n＝3。YFP（＋）ゲート。（図4A）pSTAT5シグナル伝達に関するデータである。（図4B）pSTAT3シグナル伝達に関するデータである。（図4C）pSTAT1シグナル伝達に関するデータである。 図5A～図5Bはインビトロ増殖データである。（図5A）MSA-IL2（中空の記号）またはMSA-orthoIL2（中実の記号）の存在下で4日間培養されたorthoIL2Rb ICDキメラ受容体発現T細胞の用量タイトレーションインビトロ増殖曲線。データは、MSA-IL2の存在下で培養された、さまざまなキメラ受容体発現細胞のそれぞれの最大成長に対して正規化された、生CD8＋YFP（＋）細胞総数を表す。n＝2±SEM。（図5B）MSA-oIL2（中実の曲線）またはMSA-IL2（中空の曲線）の存在下で4日間培養された、o2R（赤色）またはo9R（青色）が形質導入されたCTV標識T細胞のインビトロ増殖。YFP（＋）ゲート;3つの代表的プロットのうちの1つが示されている。 図5Ａの説明を参照。 図6A～図6Bは、o2R pmel T細胞およびo9R pmel T細胞のシグナル伝達と増殖を図解している。（図6A）MSA-oIL2（5μM）による30分間の刺激後の、o2R pmel T細胞とo9R pmel T細胞における、STAT1、STAT3およびSTAT5リン酸化。YFP＋細胞にゲートをかけた生物学的デュプリケートのMFIおよび範囲が示されている。＊、調整済みp＜0.05;＊＊、調整済みp＜0.005（対応のないt検定、ホルム-シダック（Holm-Sidak）法を使った多重比較補正）。（図6B）MSA-oIL2と共に培養した48時間でのo2R pmel T細胞またはo9R pmel T細胞のインビトロ増殖（成長倍率で測定）を測定する7つのレプリケート実験が示されている（各データポイントは平均±SDを表す。n＝3）。＊、p＜0.05（比対応t検定（ratio-paired t-test））。 図7A～図7Jは、oIL9Rシグナル伝達がpmel T細胞の表現型と機能を変化させて、リンパ球枯渇がなくてもそれらに抗腫瘍効力を賦与するという知見を図解している。（図7A）実験の概略図。B16-F10黒色腫が埋植されたC57BL/6マウスに、リンパ球を枯渇させてから（またはリンパ球を枯渇させずに）、5×106個のpmelまたは対照C57BL/6 T細胞によるACTを行い、次にMSA-IL2またはMSA-oIL2（2.5×104U/日、腹腔内）で5日間処置した。（図7B）ACTの7日後の、養子移入されたT細胞の末梢血定量（平均±SD、n＝マウス5～6匹/群）。＊＊、p＜0.01（対応のないt検定）。（図7C）o2R pmel ACTとMSA-IL2またはMSA-oIL2とによる処置を受けたマウスにおける腫瘍成長（平均±SEM、n＝マウス5～6匹/群）。＊＊、p＜0.01（ANOVA）。3回の独立した実験を代表するデータ。（図7D）o9R pmel ACTとMSA-IL2またはMSA-oIL2とによる処置を受けたマウスにおける腫瘍成長（平均±SEM、n＝マウス5～6匹/群）。＊＊、p＜0.01（ANOVA）。3回の独立した実験を代表するデータ。（図7E）MSA-oIL2で処置されたマウスにおける、ACTの5日後の、腫瘍浸潤o2Rまたはo9R pmel T細胞の定量（CD8＋Thy1.1＋T細胞/グラム）。＊＊、p＜0.01（対応のないt検定）。（図7F）MSA-IL2（50nM）またはMSA-oIL2（5μM）で前処理したo2Rまたはo9R pmel T細胞と共培養（2:1のエフェクター:標的比）されたnRFP＋B16-F10腫瘍細胞の、Incucyte生細胞イメージングシステムで測定したインビトロ成長（平均±SD、n＝3）。＊、p＜0.05;＊＊、p＜0.01（ANOVA）。（図7G）MSA-oIL2（5μM）で48時間インビトロ処理されたo2Rおよびo9R pmel T細胞（n＝3/群）のopt-SNEクラスタリング（左）と、存在量が異なるクラスターだけを図解した各群についての個別プロット（中）、および際だった特徴でアノテーションされた、存在量が異なるクラスターのボルカノプロット（右）。（図7H）MSA-oIL2（5μM）で処理されたo2R pmel T細胞とo9R pmel T細胞の間で発現が変動した遺伝子のヒートマップ。MSA-IL2（50nM）で処理された群も示されている。（図7I）T細胞の幹細胞性および機能障害（左）ならびにT細胞の活性化およびエフェクター機能（右）に関連し、MSA-oIL2（5μM）で処理されたo9R pmel T細胞とo2R pmel T細胞の間で発現が変動した、マニュアルキュレートされた遺伝子のヒートマップ。（図7J）MSA-oIL2で処理されたo9R pmel T細胞とo2R pmel T細胞とを比較した、転写因子遺伝子セットの正規化エンリッチメントプロット（normalized enrichment plot）（左図）。統計的に有意なエンリッチメント（調整済みp値＜0.05）が赤色で示されている。MSA-oIL2で処理されたo9R pmel T細胞およびo2R pmel T細胞におけるJun対Fosの発現比（右図）。＊＊、p＜0.01（対応のないt検定）。 図7-1の説明を参照。 図7-1の説明を参照。 図7-1の説明を参照。 図7-1の説明を参照。 図8A～図8Cは、リンパ球枯渇状況下およびリンパ球数正常状況下におけるo2R pmel T細胞およびo9R pmel T細胞の抗腫瘍効力を図解している。（図8A）o2R pmel T細胞とmIL-2またはoIL-2とで処置されたB16-F10腫瘍保持マウスの生存率。（図8B）o9R pmel T細胞とmIL-2またはoIL-2とで処置されたB16-F10腫瘍保持マウスの生存率。図8A～図8Bでは、mIL-2で処置されたBL/6 T細胞をオフターゲットT細胞対照として使用した。リンパ球を枯渇させたまたはリンパ球を枯渇させていない腫瘍保持マウスにおける非形質導入pmel T細胞＋mIL-2を、対照とした。（図8C）リンパ球を枯渇させた宿主におけるo9R pmel T細胞の効果。o9R pmel T細胞とmIL-2、oIL-2、またはIL2なしとで処置された、リンパ球枯渇C57BL/6マウスにおけるB16-F10腫瘍の腫瘍成長（平均±SEM、左図）。 図9A～図9Dは、o9R pmel T細胞の輸送、表現型および機能を図解している。（図9A）o2R pmel T細胞（左）およびo9R pmel T細胞（中）を養子移入した7日後のCD45＋腫瘍浸潤白血球のopt-SNEクラスタリング（n＝マウス4匹/群）。o9R pmel T細胞で処置したマウスとo2R pmel T細胞で処置したマウスからの腫瘍における、存在量が異なるクラスターのボルカノプロット（右図）。（図9B）oIL-2で処置された非リンパ球枯渇宿主における腫瘍浸潤o9Rおよびo2R pmel T細胞のサブセットのopt-SNEクラスタリング（n＝マウス4匹/群、左図）と、存在量が異なるクラスターだけを図解した各処置群についての個別プロット（中図）、および際だった特徴でアノテーションされた、存在量が異なるクラスターのボルカノプロット（右図）。（図9C）o2RとoIL-2（左図）またはo9R pmel T細胞とoIL-2（右図）のどちらか一方で処置された非リンパ球枯渇宿主における、マルチプレックスIHC（赤色＝CD3、橙色＝CD8、黄色＝PD1、緑色＝CD4、暗青緑色＝FOXP3）による、CD3＋CD8＋T細胞およびCD8＋PD1＋T細胞の腫瘍浸潤。定量が下に示されている。（図9D）インビトロで24時間にわたってB16-F10黒色腫と共培養されたoIL2R pmel T細胞およびoIL9R pmel T細胞によるIFNγ分泌。共培養に先立って、T細胞をインビトロで48時間にわたってoIL-2（5μM）で前処理した。＊、p＜0.05、対応のないt検定。 図9Aの説明を参照。 図9Aの説明を参照。 図9Aの説明を参照。 o9Rシグナル伝達および野生型IL-9Rシグナル伝達がTscm表現型を推進するという知見を図解している。野生型IL-9R（pmel-IL9R）が形質導入され、インビトロで48時間にわたってmIL-2（0.05μM）、oIL-2（5μM）またはIL-9（0.05μM）で処理された、CD8＋Thy1.1＋選別o9R pmel T細胞、o2R pmel T細胞、またはpmel T細胞のパーセンテージとしてのCD62L、CD95（Fas）およびCD44の表面発現。ns、有意差なし;＊＊＊＊、p＜0.0001、対応のないt検定。 インビトロでoIL-2またはmIL-2に曝露した48後の、選別されたpmel-o2R（n＝3）およびpmel-o9R（n＝3）T細胞の教師なしトランスクリプトーム解析（RNA-seq）を図解している。主成分分析によれば、試料は処置群ごとに分かれている（PC1対PC2、左図）。ヒートマップにおいて試料間距離で整列した場合、試料は処置群ごとにクラスターを形成し（右図）、oIL-2で処理されたo9R pmel T細胞が、4つの群の中で最も特徴的だった。 MSA-oIL2で処置したマウスの腫瘍流入領域リンパ節（DLN）、脾臓または腫瘍からのCD62L＋o2Rまたはo9R pmel T細胞（Thy1.1＋YFP＋）の頻度を図解している。養子移入の1日後または5日後に組織を収集した。各データポイントは1匹のマウス個体を表す。n＝1群あたりマウス3～5匹。＊＊、p＜0.01;＊＊＊、p＜0.001;＊＊＊＊、＜0.0001;対応のないt検定。 図13A～図13Mは、o2R受容体およびo9R受容体を共発現するCAR T細胞の直交性ターゲティングを図解している。（図13A）恒常性サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター下にoIL-2をコードする複製欠損性血清型5アデノウイルスベクターAd-oIL2の概略図（上図）。細胞培養上清におけるAd-oIL2によるインビトロoIL-2発現（左下図;平均±SEM、n＝3）。1×109個のAd-oIL2ウイルス粒子を腫瘍内（IT）注射するかまたは25,000単位のMSA-oIL2を毎日腹腔内（IP）注射した72時間後の、腫瘍ホモジネートおよび血清におけるoIL-2発現の定量（右下図;平均±SEM、n＝マウス5匹/群）。LITR、左末端逆位反復配列;RITR、右末端逆位反復配列。（図13B）MSA-IL2（100nM）またはMSA-oIL2（5μM）による刺激の30分後の、非形質導入（UTD）T細胞、CAR-o2R T細胞またはCAR-o9R T細胞におけるpSTAT1/pSTAT3/pSTAT5発現の代表的ウェスタンブロット解析。（図13C）Xcelligence生細胞イメージングシステムで測定された、48時間にわたってMSA-oIL2（5μM）と共にプレインキュベートしたCAR-o2R T細胞およびCAR-o9R T細胞（2:1のエフェクター:標的比）による、メソテリン陽性PDA7940b腫瘍細胞のインビトロ細胞キリング（正規化細胞インデックスの平均、n＝4）。（図13D）MSA-IL2（100nM）またはMSA-oIL2（5μM）による刺激の4日後の、CAR-o2R/CAR-o9R T細胞における代表的なCD44およびCD62L表面共発現。（図13E）MSA-IL2（100nM）またはMSA-oIL2（5μM）による刺激の4日後の、CAR-o2R/CAR-o9R T細胞における代表的なFas発現。（図13F）MSA-IL2（100nM）またはMSA-oIL2（5μM）による4日間の刺激後の、CAR-o2RおよびCAR-o9R T細胞培養上清中の分泌サイトカインのLuminex解析（平均±SEM、n＝3/群）。＊＊＊＊P＜0.0001（ANOVA）。（図13G）MSA-oIL2で処理されたo2R CAR T細胞とo9R CAR T細胞の間で発現が変動した遺伝子のヒートマップ（左図）。MSA-IL2で処理された群も示されている。T細胞の幹細胞性および機能障害ならびにT細胞の活性化およびエフェクター機能に関連し、MSA-oIL2で処置されたマウスにおけるo9R CAR T細胞とo2R CAR T細胞の間で発現が変動した、マニュアルキュレートされた遺伝子のヒートマップ（中図および右図）。（図13H）KPC由来PDA7940b腫瘍を利用する同系養子CAR T細胞治療マウスモデルの概略図。Ad-oIL2の用量、1×109VP。CAR T細胞の用量、5×106細胞。CTXの用量、120mg/kg。SC、皮下;CTX、シクロホスファミド;IP、腹腔内;IT、腫瘍内;IV、静脈内。（図13I）表示した処置群ごとのPDA7940b腫瘍の個別の成長曲線。（図13J）表示した処置群ごとのPDA7940b腫瘍の個別の成長曲線。（図13K）シクロホスファミドプレコンディショニングなし（「CTXなし」）での表示した処置群ごとのPDA7940b腫瘍の個別の成長曲線。図13I～図13Kにおいて、黒い線は、免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群（ICANS）による死亡を示す。n＝1群あたりマウス6～12匹。CR、完全奏効。Tox、神経毒性による死亡数。効力実験は2回繰り返した。（図13L）PDA7940bを再負荷した（図13Jからの）治癒マウスの、同齢のナイーブマウス（n＝10）と比較した、腫瘍体積（左図）。再負荷マウスの末梢血中のCD45.1＋リンパ球の定量（右図）。＊P＜0.05、＊＊P＜0.01（ANOVA）。ns、有意差なし。（図13M）9日目（ACTの8日後）における腫瘍浸潤CAR T細胞の定量（左図）。9日目におけるIFNγ陽性腫瘍浸潤CAR T細胞の頻度（右図）。＊P＜0.05、＊＊＊＊P＜0.0001（ANOVA）。 図13-1の説明を参照。 図13-1の説明を参照。 図13-1の説明を参照。 図13-1の説明を参照。 図13-1の説明を参照。 図13-1の説明を参照。 図13-1の説明を参照。 図14A～図14Bは、マウスT細胞におけるCARとorthoIL-2Rβの共発現を図解している。（図14A）抗メソテリンCARとo2R（CAR-o2R）またはo9R（CAR-o9R）とを発現する初代マウスCD3＋T細胞の概略図。（図14B）フローサイトメトリーによって決定された、非形質導入（UTD）T細胞における、またはレトロウイルス形質導入されたCAR-o2R T細胞およびCAR-o9R T細胞における、代表的なメソテリンCAR発現（上図）、IL-2Rβ発現（中図）およびCAR/IL-2Rβ共発現（下図）。中図の挿入情報は、非形質導入T細胞および形質導入T細胞におけるIL-2Rβの平均蛍光強度（MFI）である。 図14Ａの説明を参照。 図14Ａの説明を参照。 図14Ａの説明を参照。 図14Ａの説明を参照。 図14Ａの説明を参照。 図14Ａの説明を参照。 図15A～図15Bは、o2R CAR T細胞およびo9R CAR T細胞の拡大および表現型を図解している。（図15A）インビトロCAR T細胞の拡大。CAR-o2R細胞およびCAR-o9R細胞をMSA-IL2（100nM）またはMSA-oIL2（5μM）の存在下でインキュベートした。毎日、細胞のアリコートをプレートから取り出し、カルセインAM生存性色素（viability dye）で染色し、Celigoイメージサイトメーターで計数した。平均±SEM、n＝3レプリケートウェル/群。（図15B）CAR T細胞におけるCD44およびCD62L共発現。図13Dに示す代表的フロープロットの完全データ。CAR-o2R細胞およびCAR-o9R細胞をMSA-IL2（100nM）またはMSA-oIL2（5μM）の存在下で4日間インキュベートした。CD44とCD62Lの表面共発現を生CAR＋細胞に対するフローサイトメトリーによって決定した。平均±SEM、n＝3/群。ns、有意差なし。＊＊＊＊P＜0.0001（ANOVA）。 図15Ａの説明を参照。 図16A～図16Eは、11日目におけるRNA ISHおよび傷害性の血清マーカーを図解している。（図16A）Ad-oIL2＋CAR-o2Rの画像。（図16B）Ad-oIL2＋CAR-o9Rの画像。図16A～図16Bは、マウスCAR（赤色、Cy3）、マウスメソテリン（緑色、FITC）に特異的な蛍光プローブで染色され、DAPI（青色）で対比染色された、脳および髄膜切片の代表的画像である。CAR陽性細胞（白い矢印）およびメソテリン陽性髄膜細胞（紫色の矢印）が髄膜の軟膜くも膜層に示されている。（図16C）脳切片中の染色されたCAR T細胞の半定量。平均±SEM、2切片/マウス、マウス3匹/群。＊P＜0.05（ウェルチ（Welch）の補正によるt検定）。（図16D）処置11日目におけるカルシウム、リン、カリウムおよび尿酸の血清中レベル。平均±SEM、n＝マウス3匹/群。（図16E）処置11日目におけるCRS関連サイトカインの血清中レベル。平均±SEM、n＝マウス3匹/群。 図16-1の説明を参照。 図16-1の説明を参照。 図17A～図17Cは、マウスにおける生存率および抗腫瘍効力に関するデータである。（図17A）コンディショニング化学療法ありまたはコンディショニング化学療法なしで、CAR-o2R＋Ad-oIL2で処置したマウスと、CAR-o9R T細胞＋Ad-oIL2で処置したマウスの間の生存率の差。図13I～13Kにおける処置群のカプラン-マイヤー生存曲線。＊＊P＜0.01、＊＊＊＊P＜0.0001（ログランク・マンテル・コックス（Mantel-Cox）検定）。（図17B）Ad-oIL2とCAR T細胞（直交性サイトカイン受容体を含まないもの）とで処置されたマウスにおける抗腫瘍効力。定着した皮下PDA7940b腫瘍を、0日目および4日目のAd-oIL2（1×109VP/腫瘍）と、0日目のCAR T細胞（5×106個）とで処置した。平均±SEM、n＝マウス5匹/群。ns、有意差なし。（図17C）Ad-Null（導入遺伝子なし）とCAR-o2R T細胞とで処置されたマウスにおける抗腫瘍効力。定着した皮下PDA7940b腫瘍を、0日目および4日目のAd-Null（1×109VP/腫瘍）と、0日目のCAR-o2R T細胞（5×106個）とで処置した。平均±SEM、n＝マウス5匹/群。ns、有意差なし。 図18A～図18Gは、ヒトキメラ直交性IL-2Rβ/IL-9Rが、TCR操作T細胞における幹細胞性および多機能性を推進するという知見を図解している。（図18A）MSA-hoIL2またはMSA-hIL2で20分間刺激された、ho2Rまたはho9Rのどちらか一方とNY-ESO-1 TCRとを共発現するヒトT細胞におけるpSTATシグナル伝達。データは平均蛍光±SEMとして表されている。n＝3。（図18B）6日間にわたってMSA-hoIL2（1μM）またはMSA-hIL2（0.1μM）で処理されたho2R/NYESO1-TCR操作ヒトT細胞およびho9R/NYESO1-TCR操作ヒトT細胞の拡大倍率。（図18C）MSA-hoIL2（1μM）との6日間の培養後の、ho2R/NYESO1-TCR操作ヒトT細胞およびho9R/NYESO1-TCR操作ヒトT細胞の免疫表現型。YFP＋T細胞にゲートをかけたCD45RA発現およびCD27発現の代表的なプロット（上列）、ならびにCD45RA＋CD27＋集団にゲートをかけた（矢印と点線で示す）CD95発現およびCCR7発現。YFP＋集団のパーセンテージとしてのCD45RA＋CD27＋CD95＋CCR7＋TSCM細胞の定量が右側の棒グラフに示されている。＊＊＊＊、p＜0.0001（対応のないt検定、n＝3/群）。（図18D）それぞれMSA-hoIL2（1μM）またはMSA-hIL2（0.1μM）と共にインビトロ培養されたTSCM細胞およびTCM細胞の、2日目に対する拡大倍率。＊、p＜0.05;＊＊、p＜0.01（対応のないt検定、n＝3/群）。（図18E）MSA-hoIL2（1μM）と共に48時間プレインキュベートした、ho2Rまたはho9Rのどちらか一方とNY-ESO-1 TCRとを共発現するT細胞を、MSA-hoIL2の存在下、nRFP（nRFP-M407）を発現するHLA＊0201＋NY-ESO-1＋黒色腫腫瘍細胞株と、1:1のE:T比で共培養した。MSA-hIL2（1nM）存在下の非形質導入T細胞を陰性対照として使用した。72時間ごとに腫瘍細胞（105個）を共培養に再導入し（淡青色の矢印）、各腫瘍負荷の24時間前にMSA-hoIL2（1μM）を培養に加えた。生細胞画像を2時間ごとにキャプチャし、パーセント腫瘍コンフルエンス（percent tumor confluence）を、RFP発現に基づいて測定した。4回目の腫瘍負荷後に、表現型解析（図18F参照）ならびに再刺激および細胞内サイトカイン染色（ICS）（図18G参照）のために、T細胞を収集した。（図18F）YFP＋T細胞のパーセンテージとしてのCD45RA＋CD27＋細胞およびTSCM細胞の定量、ならびにCD62LおよびCXCR3のMFI（YFP＋ゲート）。＊、p＜0.05;＊＊、p＜0.01;＊＊＊、p＜0.001（対応のないt検定、n＝2/群）。（図18G）図18Eでの4回目の腫瘍負荷後のT細胞を、αCD3/αCD28活性化抗体、黒色腫細胞株M407（HLA＊0201＋NY-ESO-1＋）またはM263（HLA＊0201-NY-ESO-1-）のいずれかで、4時間再刺激した。CD8＋YFP＋T細胞間で、IFNγ、TNFαおよびIL-2を、ICSによって定量した。ドーナツグラフは、3種のサイトカインのうちの0、1、2または3種を発現する各群内のCD8＋YFP＋T細胞の比率を示している。ns、有意差なし;＊＊＊＊、p＜0.0001（二元配置ANOVA、n＝3/群）。 図18Aの説明を参照。 図18Aの説明を参照。 図18Aの説明を参照。 図18Aの説明を参照。 図18Aの説明を参照。 図18Aの説明を参照。 図18Aの説明を参照。 図19A～図19Dは、ヒトキメラ直交性IL-2Rβ/IL-9Rが、抗原特異的腫瘍の繰り返し負荷後でさえ、幹細胞様表現型を持つ多機能T細胞を推進するという知見を図解している。（図19A）NYESO1-TCRクローン1G4のβ鎖を認識する抗ヒトVβ13.1抗体およびYFP（o2Rベクターまたはo9Rベクターの内部マーカー）によって検出される、ho2RとNYESO1-TCR（左）またはho9RとNYESO1-TCR（右）のどちらか一方とが共形質導入された正常健常ドナーT細胞のフロープロット。共形質導入効率が示されている。（図19B）図18Cに示すho2R/NYESO1-TCR T細胞およびho9R/NYESO1-TCR T細胞のYFP＋集団の免疫表現型検査のためのゲーティング戦略。（図19C）MSA-hoIL2（1μM）と共に2日間培養した後の、ho2R/NYESO1 TCR操作ヒトT細胞およびho9R/NYESO1 TCR操作ヒトT細胞の免疫表現型。YFP＋集団のパーセンテージとしてのTSCM細胞の棒グラフ定量が示されている。＊＊、p＜0.01（対応のないt検定、n＝3/群）。（図19D）図13EからのT細胞を収集し、αCD3/αCD28 dynabeads、黒色腫細胞株M407（HLA＊0201＋NY-ESO-1＋）またはM263（HLA＊0201＋NY-ESO-1-）のいずれか一つで4時間、再刺激した。YFP＋CD4 T細胞（CD8-）間で、IFNγ、TNFαおよびIL-2を、ICSによって定量した。 図19Aの説明を参照。 図19Aの説明を参照。 図19Aの説明を参照。 図19Aの説明を参照。 図20は本明細書記載の実験において使用された試薬類の表である。 図20-1の説明を参照。 図21はメソテリンノックアウト細胞株の作成を図解している。メソテリン陽性PDA7940b腫瘍細胞をCRISPR/Cas9によって編集することで、メソテリンをノックアウトし、FACSによる選別で純粋にした。リアルタイム細胞キリングアッセイ（RTCA）において、抗メソテリンCAR T細胞は野生型細胞（PDA7940bMSLN＋）を殺したが、KO細胞（PDA7940bMSLN-）は殺さなかった。 図21-1の説明を参照。 図21-1の説明を参照。 図21-1の説明を参照。 腫瘍抗原拡散を図解している。併用処置によって以前に治癒したマウスにメソテリン陽性（PDA7940bMSLN＋）腫瘍細胞およびメソテリン陰性（PDA7940bMSLN-）腫瘍細胞を再負荷した。腫瘍を24日間成長させてから腫瘍サイズを測定した。同齢のナイーブマウスを腫瘍成長に関する対照とした。 図23A～図23BはヒトorthoIL-2に関するデータである。図23Aは、Ad5/3-D24-hoIL2によるヒトorthoIL-2のインビトロ発現を図解するグラフである。A549細胞を、Ad5/3-D24-hoIL2または同質遺伝子対照（isogenic control）ウイルスAd5/3-D24に感染させるか、またはモック感染させた。感染の96時間後に、50ulの細胞培養上清を収集し、ヒトIL-2 ELISAによって分析した。図23Bは、ヒトorthoIL-2をコードするファイバーキメラ（fiber-chimeric）腫瘍溶解性アデノウイルスAd5/3-D24-hoIL2の、塩化セシウム（CsCl）勾配による精製を図解する写真である。赤色の矢印は、無傷のウイルス粒子を含有するバンドを示しており、チューブの側面を突き刺すことにより、針とシリンジで、それが収集される。CsClは2ラウンドの緩衝液交換によって除去された。 24A～図24Bは、ヒトT細胞におけるヒトオルソ受容体（ortho-receptor）とPSMAリターゲット（PSMA-retargeted）CARの共発現を図解するデータである。図24Aは、感染48時間後のPSMA28z CARと完全長ヒトorthoIL2Rb受容体の共発現を図解するフローサイトメトリーデータである。図24Bは、感染48時間後のPSMA28z CARとキメラorthoIL2Rb/IL9Raスイッチ受容体の共発現を図解するフローサイトメトリーデータである。 図24A-1の説明を参照。 図24A-1の説明を参照。 図24A-1の説明を参照。 図24A-1の説明を参照。 図24A-1の説明を参照。
詳細な説明
一局面において、本発明は、直交性キメラサイトカイン受容体（例えばoIL2R-IL9Rキメラ受容体）と少なくとも1つのキメラ抗原受容体（CAR）とを含む改変免疫細胞またはその前駆体（例えば改変T細胞）のための組成物および方法を提供する。本開示は、直交性サイトカイン（例えばoIL2）をコードする核酸配列を含む腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを、さらに提供する。がんを処置するために前記改変細胞およびベクターを使用する方法も提供される。一局面において、本発明は、がんを処置する方法であって、がんを有する対象に、（a）直交性キメラサイトカイン受容体と少なくとも1つのCARとを含む改変細胞、および（b）直交性サイトカインをコードする核酸配列を含む腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを投与する工程を含み、該改変T細胞は該対象において改良された輸送およびエフェクター機能を持つ幹細胞メモリー（Tscm）特徴を呈し、それによって該がんを処置する方法を提供する。
別の一局面において、本発明は、直交性キメラサイトカイン受容体（例えばoIL2R-IL9Rキメラ受容体）と少なくとも1つのT細胞受容体（TCR）とを含む改変免疫細胞またはその前駆体（例えば改変T細胞）のための組成物および方法を提供する。本開示は、直交性サイトカイン（例えばoIL2）をコードする核酸配列を含む腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを、さらに提供する。がんを処置するために前記改変細胞およびベクターを使用する方法も提供される。一局面において、本発明は、がんを処置する方法であって、がんを有する対象に、（a）直交性キメラサイトカイン受容体と少なくとも1つのTCRとを含む改変細胞、および（b）直交性サイトカインをコードする核酸配列を含む腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを投与する工程を含み、該改変T細胞は該対象において改良された輸送およびエフェクター機能を持つ幹細胞メモリー（Tscm）特徴を呈し、それによって該がんを処置する方法を提供する。
この開示に記載される方法は本明細書に開示される特定の方法および実験条件に限定されないことを理解すべきである。そのような方法および条件はさまざまでありうるからである。本明細書において使用する術語には、特定の態様を説明する目的しかなく、限定を意図していないことも、理解すべきである。
さらにまた、本明細書記載の実験では、別段の表示がある場合を除き、当技術分野の技能の範囲内にある通常の分子生物学的および細胞生物学的ならびに免疫学的技法が使用される。そのような技法は当業者には周知であり、文献に詳しく説明されている。例えばAusubelら編「Current Protocols in Molecular Biology」John Wiley＆Sons,Inc.,ニューヨーク州ニューヨーク（1987～2008）（すべての補遺を含む）、MR GreenおよびJ.Sambrookによる「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」（第4版）、ならびにHarlowら「Antibodies:A Laboratory Manual」Chapter 14,Cold Spring Harbor Laboratory,コールドスプリングハーバー（2013,第2版）を参照されたい。
A. 定義
別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用される科学用語および技術用語は、当業者が一般に理解している意味を有する。曖昧さが潜んでいる場合には、本明細書において提供される定義が、いかなる辞書または外部の定義よりも優先される。文脈上別段の必要がある場合を除き、単数形は複数を包含するものとし、複数形は単数を包含するものとする。「または」の使用は、別段の言明がある場合を除き、「および/または」を意味する。「including」（を含む）ならびに他の形態、例えば「includes」および「included」という用語の使用は、限定ではない。
一般に、本明細書に記載する細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質化学および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションとの関連で使われる学術用語は当技術分野において周知であり、よく使用されている。本明細書に掲載される方法および技法は、別段の表示がある場合を除き、一般に、当技術分野において周知の従来法に従って、本明細書の全体を通して引用し議論するさまざまな一般文献およびより具体的な文献に記載されているように行われる。酵素反応および精製技法は、製造者の仕様書に従って、当技術分野においてよく行われているとおりに、または本明細書に記載するとおりに行われる。本明細書に記載する分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および製薬化学の実験手順および実験技法との関連で使われる学術用語は当技術分野において周知であり、よく使用されている。化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤、および送達、および患者の処置には、標準的な技法が使用される。
本開示の理解がより容易になりうるように、選ばれた用語を以下に定義する。
冠詞「1つの（a）」および「1つの（an）」は、本明細書では、1つのまたは1つより多い（すなわち少なくとも1つの）その冠詞の文法上の対象を指すために使用される。一例として「ある要素（an element）」とは、1つの要素または1つより多い要素を意味する。
本明細書にいう「約」は、測定可能な値、例えば量、持続時間などを指す場合には、明示された値からの±20％または±10％、より好ましくは±5％、さらに好ましくは±1％、より一層好ましくは±0.1％の変動を包含することを意味する。そのような変動は開示される方法を実施するのに適当だからである。
本明細書にいう「活性化」は、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分な刺激を受けたT細胞の状態を指す。活性化には、誘導されたサイトカイン産生および検出可能なエフェクター機能も付随しうる。「活性化T細胞」という用語は、なかんずく、細胞分裂を起こしているT細胞を指す。
本明細書にいう、疾患を「緩和する」とは、その疾患の1つまたは複数の症状の重症度を低減することを意味する。
本明細書において使用する「抗原」という用語は、免疫応答を惹起する分子と定義される。この免疫応答は抗体の産生もしくは特異的免疫適格細胞の活性化のどちらか一方、またはその両方を伴いうる。事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が、抗原として機能しうることは、当業者には理解されるであろう。
さらにまた、抗原は、組換えDNAまたはゲノムDNAに由来することもできる。したがって、免疫応答を引き出すタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のDNAが、本明細書において使用する用語としての「抗原」をコードすることは、当業者には理解されるであろう。さらにまた、抗原が必ずしも遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってコードされる必要はないことも、当業者には理解されるであろう。本発明が、限定するわけではないが、複数の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を包含すること、およびこれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を引き出すためにさまざまな組合せで配置されることは明白である。さらにまた、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要も全くないことは、当業者には理解されるであろう。抗原を合成的に生成させうること、または抗原が生物学的試料に由来しうることは、明白である。そのような生物学的試料としては、組織試料、腫瘍試料、細胞または生体液を挙げることができるが、それらに限定されるわけではない。
本明細書において使用する「自家」という用語は、後でその材料を再導入することになる個体と同じ個体に由来する任意の材料を指すものとする。
「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、限定するわけではないが増殖などといった、T細胞による共刺激応答を媒介する、T細胞上のコグネイト結合パートナーを指す。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLAおよびTollリガンド受容体などがあるが、それらに限定されるわけではない。
本明細書にいう「共刺激シグナル」は、TCR/CD3ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わされて、T細胞の増殖および/またはキー分子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションにつながるシグナルを指す。
「疾患」とは、動物がホメオスタシスを維持できず、その疾患が改善されなければ、その動物の健康が悪化し続けるという、動物の健康状態である。これに対し、動物における「障害」とは、動物はホメオスタシスを維持することはできるが、その動物の健康状態は、その障害がない場合よりも好ましくないという、健康状態である。無処置のまま放置しても、障害は、その動物の健康状態のさらなる低下を、必ずしも引き起こさない。
本明細書において使用する「ダウンレギュレーション」という用語は、1つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現の減少または排除を指す。
「有効量」または「治療有効量」は本明細書では相互可換的に使用され、特定の生物学的結果を達成しまたは治療上もしくは予防上の利益を与えるのに有効な、本明細書記載の化合物、製剤、材料または組成物の量を指す。そのような結果には、哺乳動物に投与された場合に、本発明の組成物の非存在下で検出される免疫応答と比較して、検出可能なレベルの免疫抑制または免疫寛容を引き起こす量が含まれうるが、それらに限定されるわけではない。免疫応答は、当技術分野において認識されている無数の方法によって、容易に評価することができる。本発明において投与される組成物の量はさまざまであり、処置される疾患または状態、処置される哺乳動物の年齢ならびに健康状態および身体状態、疾患の重症度、投与される具体的化合物などといったいくつかの因子に基づいて、容易に決定できることは、当業者には理解されるだろう。
「コードする」とは、生物学的プロセスにおいて、所定のヌクレオチド配列（すなわちrRNA、tRNAおよびmRNA）または所定のアミノ酸配列のどちらか一方とそれがもたらす生物学的性質とを有する他のポリマーおよび高分子を合成するためのテンプレートとして役立つという、遺伝子、cDNAまたはmRNAなどといったポリヌクレオチド中の特定ヌクレオチド配列の固有の性質を指す。したがって、ある遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳が細胞または他の生物学的なシステムにおいてタンパク質を産生するのであれば、その遺伝子はタンパク質をコードする。コード鎖、すなわちmRNA配列と同一であって通常は配列表に掲載されているヌクレオチド配列と、遺伝子またはcDNAの転写にテンプレートとして使用される非コード鎖は、どちらも、タンパク質またはその遺伝子もしくはcDNAの他の産物をコードしているということができる。
本明細書にいう「内在性」とは、ある生物、細胞、組織もしくはシステムの内部に由来するか、またはある生物、細胞、組織もしくはシステムの内部で産生される、任意の物質を指す。
本明細書において使用する「エピトープ」という用語は、免疫応答を引き出してB細胞応答および/またはT細胞応答を誘導することができる抗原上の小さな化学分子と定義される。抗原は、1つまたは複数のエピトープを有することができる。大半の抗原は多くのエピトープを有する。すなわちそれらは多価である。一般にエピトープのサイズはおよそ10個程度のアミノ酸および/または糖である。好ましくは、エピトープは約4～18アミノ酸、より好ましくは約5～16アミノ酸、さらに最も好ましくは6～14アミノ酸、より好ましくは約7～12、最も好ましくは約8～10アミノ酸である。一般に、分子の特定一次配列よりもむしろ、全体的な三次元構造が抗原特異性の主たる基準であるので、それが、あるエピトープを別のエピトープと区別する目安になることは、当業者には理解される。本開示によれば、本発明において使用されるペプチドはエピトープであることができる。
本明細書において使用する「外因性」という用語は、ある生物、細胞、組織もしくはシステムの外部から導入されるか、ある生物、細胞、組織もしくはシステムの外部で産生される任意の材料を指す。
本明細書において使用する「拡大する」という用語は、T細胞の数が増加する場合のように、数が増加することを指す。一態様において、エクスビボで拡大されるT細胞は、当初培養中に存在していた数と比較して、数が増加する。別の一態様において、エクスビボで拡大されるT細胞は、培養中の他の細胞タイプと比較して、数が増加する。本明細書において使用する「エクスビボ」という用語は、生きている生物（例えばヒト）から取り出し、その生物の外で（例えば培養ディッシュ、試験管またはバイオリアクター中で）増殖させた細胞を指す。
本明細書において使用する「発現」という用語は、特定のヌクレオチド配列の、そのプロモーターによって駆動される、転写および/または翻訳と定義される。
「発現ベクター」とは、発現させようとするヌクレオチド配列に機能的に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは発現にとって十分なシス作用性要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞によって供給されるか、またはインビトロ発現システム中に供給されうる。発現ベクターには、例えば組換えポリヌクレオチドを組み込んだコスミド、プラスミド（例えば裸のプラスミドまたはリポソームに含まれているプラスミド）およびウイルス（例えばセンダイウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）など、当技術分野において公知のものはすべて包含される。
本明細書にいう「同一性」とは、2つのポリマー分子間の、特に2つのアミノ酸分子間、例えば2つのポリペプチド分子間の、サブユニット配列同一性を指す。2つのアミノ酸配列が同じ位置に同じ残基を有する場合、例えば2つのポリペプチド分子のそれぞれにおけるある位置がアルギニンで占められているなら、それらはその位置において同一である。同一性、または2つのアミノ酸配列がアラインメントにおいて同じ位置に同じ残基を有する程度は、パーセンテージとして表されることが多い。2つのアミノ酸配列間の同一性は、一致位置または同一位置の数の直接的関数である。例えば2つの配列中の位置の半分（例えば長さ10アミノ酸のポリマー中の5つの位置）が同一であるなら、それら2つの配列は50％同一であり、位置の90％（例えば10中の9）が一致するかまたは同一なら、それら2つのアミノ酸配列は90％同一である。
本明細書において使用する「免疫応答」という用語は、リンパ球が抗原分子を外来と特定した時に起こって、その抗原を除去するために抗体の形成を誘導しおよび/またはリンパ球を活性化する、細胞応答と定義される。
「免疫抑制性」という用語は、本明細書では、免疫応答全体を低減することを指すために使用される。
「単離された」とは、自然状態から変更されまたは取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物中に自然に存在する核酸またはペプチドは「単離され」ていないが、その自然状態の共存物質から部分的にまたは完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離され」ている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在するか、または例えば宿主細胞などの非ネイティブ環境に存在することができる。
本明細書にいう「レンチウイルス」はレトロウイルス科（Retroviridae）の一属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染することができる点で、レトロウイルスの中ではユニークであり、レンチウイルスはかなりの量の遺伝情報を宿主細胞のDNA中に送達することができるので、遺伝子送達ベクターの最も効率のよい方法の一つである。HIV、SIVおよびFIVはいずれもレンチウイルスの例である。レンチウイルス由来のベクターは、インビボでかなりのレベルの遺伝子導入を達成するための手段になる。
本明細書において使用する「改変された」という用語は、本発明の分子または細胞の、変化した状態または構造を意味する。分子は、さまざまな方法で、例えば化学的、構造的および機能的に改変されうる。細胞は核酸の導入によって改変されうる。
本明細書において使用する「調整する」という用語は、ある処置または化合物の非存在下での対照における応答のレベルと比較した、および/または無処置である点を除けば同一である対象における応答のレベルと比較した、対照における応答のレベルの検出可能な増加または減少を媒介することを意味する。この用語は、ネイティブのシグナルまたは応答に摂動を加えおよび/または影響を及ぼし、それによって、対象、好ましくはヒトにおける有益な治療応答を媒介することを包含する。
本発明では、よく見られる核酸塩基について、以下の略号を使用する。「A」はアデノシンを指し、「C」はシトシンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」はチミジンを指し、「U」はウリジンを指す。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的には、短いポリヌクレオチドを指す。ヌクレオチド配列がDNA配列（すなわちA、T、C、G）で表された場合、これには、「U」が「T」に取って代ったRNA配列（すなわちA、U、C、G）も含まれることは、理解されるであろう。
別段の明示がある場合を除き、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重物であって同じアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列をすべて包含する。タンパク質またはRNAをコードするヌクレオチド配列という語句は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が一部のバージョンではイントロンを含有しうるという限りにおいて、イントロンも包含しうる。
免疫原性組成物の「非経口」投与には、例えば皮下（s.c.）、静脈内（i.v.）、筋肉内（i.m.）もしくは胸骨内注射、または注入技法が含まれる。
本明細書において使用する「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖と定義される。さらにまた、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書にいう核酸およびポリヌクレオチドは相互可換である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであって、それを単量体型「ヌクレオチド」に加水分解することができるという一般知識を有している。単量体型ヌクレオチドはヌクレオシドに加水分解することができる。本明細書にいうポリヌクレオチドとしては、当技術分野において利用可能な任意の手段によって、例えば限定するわけではないが、組換え手段、すなわち通常のクローニング技術およびPCRなどを使った組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングによって得られる、および合成手段によって得られる、すべての核酸配列が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
本明細書において使用する「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は相互可換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合的に連結されたアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは少なくとも2つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質の配列またはペプチドの配列を構成することができるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに接合された2つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を包含する。本明細書において使用する場合、この用語は、当技術分野においてペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーなどともよく呼ばれる短い鎖と、当技術分野において一般にタンパク質と呼ばれて多くのタイプが存在する長い鎖を、どちらも包含する。「ポリペプチド」は、例えば、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、改変されたポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質などを包含する。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組合せを包含する。
抗体に関して本明細書において使用する「特異的に結合する」という用語は、特異的抗原を認識するが、試料中の他の分子は実質的に認識も結合もしない抗体を意味する。例えば、ある種からの抗原に特異的に結合する抗体は、1つまたは複数の種からのその抗原にも結合しうる。しかし、そのような異種間反応性、それ自体によって、特異的であるという抗体の分類が変更されることはない。もう一つの例において、ある抗原に特異的に結合する抗体は、その抗原の異なるアレル型にも結合しうる。しかし、そのような交差反応性、それ自体によって、特異的であるという抗体の分類が変更されることはない。場合によっては、抗体、タンパク質またはペプチドと第2の化学種との相互作用に関して、その相互作用が化学種上の特定構造（例えば抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味するために、「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語を使用することができる。例えば抗体は、タンパク質一般ではなく、特異的なタンパク質構造を認識し、それに結合する。抗体がエピトープ「A」に特異的であるとすると、標識された「A」を含む反応において、エピトープAを含有する分子（または遊離の非標識A）の存在は、抗体に結合される標識されたAの量を低減するだろう。
「刺激」という用語は、刺激分子（例えばTCR/CD3複合体）とそのコグネイトリガンドとが結合し、それによりシグナル伝達事象、例えば限定するわけではないがTCR/CD3複合体によるシグナル伝達を媒介することによって誘導される一次応答を意味する。刺激は、一定の分子の発現の変化、例えばTGF-ベータのダウンレギュレーション、および/または細胞骨格構造の再編成などを媒介することができる。
「刺激分子」とは、この用語を本明細書において使用する場合には、抗原提示細胞上に存在するコグネイト刺激リガンドと特異的に結合するT細胞上の分子を意味する。
本明細書にいう「刺激リガンド」とは、抗原提示細胞（例えばaAPC、樹状細胞、B細胞など）上に存在する場合に、T細胞上のコグネイト結合パートナー（本明細書では「刺激分子」という）と特異的に結合することで、T細胞による一次刺激応答、例えば限定するわけではないが、活性化、免疫応答の開始、増殖などを媒介するリガンドを意味する。刺激リガンドは当技術分野において周知であり、なかんずく、ペプチドが負荷されたMHCクラスI分子、抗CD3抗体、スーパーアゴニスト抗CD28抗体、およびスーパーアゴニスト抗CD2抗体が、これに包含される。
「対象」という用語は、生きている生物であって、その体内での免疫応答を引き出すことができるもの（例えば哺乳動物）を包含するものとする。本明細書にいう「対象」または「患者」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物でありうる。非ヒト哺乳動物としては、例えば家畜およびペット、例えばヒツジ類、ウシ類、ブタ類、イヌ類、ネコ類およびネズミ類の哺乳動物、ならびにサル類および非ヒト霊長類の哺乳動物が挙げられる。好ましくは、対象はヒトである。
「標的部位」または「標的配列」とは、核酸のうち、結合が起こるのに十分な条件下で結合分子が特異的に結合しうる部分を画定する核酸配列をいう。いくつかの態様において、標的配列とは、核酸のうち、結合が起こるのに十分な条件下で結合分子が特異的に結合しうる部分を画定するゲノム核酸配列をいう。
本明細書において使用する「T細胞受容体」または「TCR」という用語は、抗原の提示に応答して起こるT細胞の活性化に関与する膜タンパク質の複合体を指す。TCRは、主要組織適合遺伝子複合体分子に結合している抗原の認識を担っている。TCRは、アルファ（α）鎖とベータ（β）鎖のヘテロ二量体で構成されるが、一部の細胞では、TCRはガンマおよびデルタ（γ/δ）鎖からなる。TCRはアルファ/ベータ型およびガンマ/デルタ型で存在しうる。これらは構造的には類似しているが、明確に異なる解剖学的場所および機能を有する。各鎖は、2つの細胞外ドメイン、すなわち可変ドメインおよび定常ドメインで構成されている。いくつかの態様において、TCRは、例えばヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、メモリーT細胞、制御性T細胞、ナチュラルキラーT細胞およびガンマ・デルタT細胞など、TCRを含む任意の細胞上で改変されうる。
本明細書において使用する「治療」という用語は、処置および/または予防を意味する。治療効果は、疾患状態の抑制、寛解または根絶によって得られる。
本明細書において使用する「トランスフェクト」または「形質転換」または「形質導入」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクト」細胞または「形質転換」細胞または「形質導入」細胞とは、外因性核酸によるトランスフェクションまたは形質転換または形質導入を受けた細胞である。細胞には初代対象細胞およびその子孫が含まれる。
疾患を「処置する」とは、この用語を本明細書において使用する場合には、対象が経験する疾患または障害の少なくとも1つの徴候または症状の頻度または重症度を低減することを意味する。
「ベクター」は、単離された核酸を含み、その単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる組成物である。限定するわけではないが、例えば線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスなど、当技術分野では数多くのベクターが公知である。したがって「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを包含する。この用語は、例えばポリリジン化合物、リポソームなど、細胞への核酸の移入を容易にする非プラスミドおよび非ウイルス化合物を包含するとも解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
「オルソログ」（ortholog）または「直交性（orthogonal）サイトカイン/受容体ペア」とは、（a）ネイティブサイトカインまたはコグネイト受容体に対して著しく低減したアフィニティーを呈し、かつ（b）対応する操作された（直交性）サイトカインまたは受容体に特異的に結合するようにアミノ酸変化によって改変された、遺伝子操作されたタンパク質ペアを指す。直交性サイトカインが結合すると、直交性サイトカイン受容体は、ネイティブ細胞要素を介して伝達されて当該ネイティブ応答を模倣する生物学的活性を与えるシグナル伝達を活性化するが、このシグナル伝達は、直交性受容体を発現する操作された細胞に特異的である。操作された直交性サイトカイン/受容体ペアは例えばWO 2017/044464およびWO 2019/173773に記載されており、これらの文献は参照により本明細書に組み入れられる。直交性サイトカイン/受容体ペアは、プロミスキャス（promiscuous）なサイトカインの活性を関心対象のT細胞サブセットに向かわせることで、遺伝子工学によってT細胞機能を精密にコントロールすることを可能にするために使用される。
「直交性キメラサイトカイン受容体」とは、直交性サイトカイン受容体の細胞外ドメインと、該直交性サイトカイン受容体が由来するサイトカイン受容体とは異なるサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、サイトカイン受容体をいう。直交性サイトカインが結合すると、直交性サイトカインキメラ受容体は、ネイティブ細胞要素を介して伝達されて、該細胞内シグナル伝達ドメインが由来する受容体のネイティブ応答を模倣する生物学的活性を与えるシグナル伝達を活性化するが、このシグナル伝達は、直交性キメラサイトカイン受容体を発現する操作された細胞に特異的である。
範囲:本開示の全体を通して、本発明のさまざまな局面は、範囲形式で表される場合がある。範囲形式での説明は、単に便宜上および簡潔な表現のためであって、本発明の範囲に対する確固たる限定であると解釈してはならないと、理解すべきである。したがって、ある範囲の記載は、その範囲内の考えうる部分的範囲および個々の数値を具体的に開示しているとみなすべきである。例えば、1～6などの範囲の説明は、1～3、1～4、1～5、2～4、2～6、3～6などの部分的範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば1、2、2.7、3、4、5、5.3および6などを、具体的に開示しているとみなすべきである。これは範囲の幅とは無関係に適用される。
B. 直交性キメラサイトカイン受容体/サイトカインペア
一局面において、本発明は直交性キメラサイトカイン受容体/サイトカインペアおよびその使用方法を提供する。いくつかの態様において、直交性キメラサイトカイン受容体は、直交性IL-2受容体（oIL2R）の細胞外ドメインと、IL-9受容体（IL9R）の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。いくつかの態様において、直交性キメラサイトカイン受容体は、直交性IL-2受容体ベータ（oIL2Rb）の細胞外ドメインと、IL-9受容体アルファ（IL9Ra）の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。直交性キメラサイトカイン受容体細胞外ドメイン（すなわちoIL2Rb）は、対応する操作された直交性サイトカイン（すなわちoIL2）に特異的に結合する。
oIL2R細胞外ドメインによって直交性IL2サイトカイン（oIL2）に結合すると、直交性キメラサイトカイン受容体は、ネイティブ細胞要素を介して伝達されて、該細胞内シグナル伝達ドメインが由来する受容体のネイティブ応答を模倣する生物学的活性を与える細胞内シグナル伝達ドメイン（例えばIL9R細胞内シグナル伝達ドメイン）のシグナル伝達を活性化するが、このシグナル伝達は、直交性キメラサイトカイン受容体を発現する操作された細胞に特異的である。直交性キメラサイトカイン受容体は、直交性サイトカインのネイティブ対応物（例えばIL-2）を含めて、対応する内在性サイトカインには結合せず、一方、直交性サイトカイン（例えばoIL2）は、直交性細胞外ドメインが由来する直交性受容体のネイティブ対応物（例えばIL-2R）を含めて、いかなる内在性受容体にも結合しない。いくつかの態様において、直交性キメラサイトカイン受容体に対する直交性サイトカインのアフィニティーは、直交性細胞外ドメインが由来するネイティブ受容体に対するネイティブサイトカインのアフィニティーと同等である。
例示的な本発明の直交性サイトカインおよび直交性キメラサイトカイン受容体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を以下に掲載する。
ヒトortho-IL2 cDNA（SEQ ID NO:1）
Figure 2024509917000001
ヒトortho-IL2タンパク質（SEQ ID NO:2）
Figure 2024509917000002
ヒトorthoIL2Rb cDNA（SEQ ID NO:3）
Figure 2024509917000003
ヒトorthoIL2Rbタンパク質（SEQ ID NO:4）
Figure 2024509917000004
ヒトorthoIL2Rb/IL9Ra cDNA（SEQ ID NO:5）
Figure 2024509917000005
ヒトorthoIL2Rb/IL9Raタンパク質（SEQ ID NO:6）
Figure 2024509917000006
マウスortho-IL2（クローン3A10）cDNA（SEQ ID NO:7）
Figure 2024509917000007
マウスortho-IL2（クローン3A10）タンパク質（SEQ ID NO:8）
Figure 2024509917000008
マウスorthoIL2Rb（別名o2R）cDNA（SEQ ID NO:9）
Figure 2024509917000009
マウスorthoIL2Rb（別名o2R）タンパク質（SEQ ID NO:10）
Figure 2024509917000010
マウスorthoIL2Rb（別名o2R）細胞外ドメイン（SEQ ID NO:11）
Figure 2024509917000011
マウスorthoIL2Rb（別名o2R）膜貫通領域（SEQ ID NO:12）
Figure 2024509917000012
マウスorthoIL2Rb（別名o2R）細胞内ドメイン（SEQ ID NO:13）
Figure 2024509917000013
マウスorthoIL2Rb/IL9Ra（別名o9R）cDNA（SEQ ID NO:14）
Figure 2024509917000014
マウスorthoIL2Rb/IL9Ra（別名o9R）タンパク質（SEQ ID NO:15）
Figure 2024509917000015
マウスorthoIL2Rb/IL9Ra（別名o9R）-orthoIL2Rb細胞外ドメイン（SEQ ID NO:16）
Figure 2024509917000016
マウスorthoIL2Rb/IL9Ra（別名o9R）-膜貫通領域（SEQ ID NO:17）
Figure 2024509917000017
マウスorthoIL2Rb/IL9Ra（別名o9R）-膜貫通領域を伴うIL9Ra細胞内ドメイン（SEQ ID NO:18）
Figure 2024509917000018
マウスorthoIL2Rb/IL4R（別名o4R）タンパク質（SEQ ID NO:19）
Figure 2024509917000019
マウスorthoIL2Rb/IL7R（別名o7R）タンパク質（SEQ ID NO:20）
Figure 2024509917000020
マウスorthoIL2Rb/IL21R（別名o21R）タンパク質（SEQ ID NO:21）
Figure 2024509917000021
C. キメラ抗原受容体（CAR）
本発明のいくつかの態様において、直交性キメラサイトカイン受容体を発現する改変免疫細胞（例えばT細胞）は、少なくとも1つのキメラ抗原受容体を共発現するように改変されたT細胞（「CAR-T」細胞）である。
抗原結合ドメイン
CARの抗原結合ドメインは、タンパク質、炭水化物および糖脂質を含む特異的標的抗原に結合するためのCARの細胞外領域である。抗原結合ドメインは、1つまたは複数の抗原に結合する任意のドメインを含むことができ、限定するわけではないが、これには、モノクローナル抗体（mAb）、ポリクローナル抗体、合成抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、非ヒト抗体、単一ドメイン抗体、完全長抗体またはその任意の抗原結合フラグメント、Fabおよび一本鎖可変フラグメント（scFv）が含まれうる。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、グリコシル化された抗体またはそのフラグメントまたはそのscFvを含む。
いくつかの態様において、抗原結合によって認識される標的抗原は、腫瘍抗原を含む。CARの抗原結合ドメインの標的になりうる腫瘍抗原の例としては、限定するわけではないがCD19、CD20、HER2、NY-ESO-1、MUC1、CD123、FLT3、B7-H3、CD33、IL1RAP、CLL1（CLEC12A）PSA、CEA、VEGF、VEGF-R2、CD22、ROR1、メソテリン、c-Met、糖脂質F77、FAP、EGFRvIII、MAGE A3、5T4、WT1、KG2Dリガンド、葉酸受容体（FRa）、およびWnt1抗原などを含む群から選択される1つまたは複数の抗原が挙げられる。
本明細書において使用する「一本鎖可変フラグメント」または「scFv」という用語は、共有結合で連結されてVH::VLヘテロ二量体を形成している、免疫グロブリン（例えばマウスまたはヒト）の重鎖可変（VH）領域と軽鎖可変（VL）領域の融合タンパク質である。可変重（VH）鎖と可変軽（VL）鎖は直接つながれるか、またはVHのN末をVLのC末と結びつけるかもしくはVHのC末をVLのN末と結びつけるペプチドリンカーによってつながれる。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、N末からC末に向かってVH-リンカー-VLの配置を有するscFvを含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、N末からC末に向かってVL-リンカー-VHの配置を有するscFvを含む。当業者は本発明において使用するための適当な配置を選択することができるだろう。
リンカーは、通常は、フレキシビリティのためにグリシンに富むと共に、溶解性のためにセリンまたはスレオニンに富む。リンカーは、細胞外抗原結合ドメインの重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを連結することができる。リンカーの限定でない例は、Shen et al.,Anal.Chem.80（6）:1910-1917（2008）およびWO 2014/087010に開示されており、それらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。当技術分野ではさまざまなリンカー配列が公知であり、例えば（GS）n、（SG）n、（GSGGS）n、（GGGS）nおよび（GGGGS）nなどのグリシンセリン（GS）リンカー（ここで、nは少なくとも1の整数を表す）があるが、それに限定されるわけではない。例示的なリンカー配列は、例えば限定するわけではないが
Figure 2024509917000022
などのアミノ酸配列を含むことができる。当業者は、本発明において使用するための適当なリンカー配列を選択することができるだろう。一態様において、本発明の抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（VH）と軽鎖可変領域（VL）とを含み、VHとVLはリンカー配列によって隔てられている。
定常状態が除かれリンカーが導入されているにも関わらず、scFvタンパク質は元の免疫グロブリンの特異性を保っている。一本鎖Fvポリペプチド抗体は、Hustonらが記載したように（Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883,1988）、VHコード配列とVLコード配列とを含む核酸から発現させることができる。米国特許第5,091,513号、同第5,132,405号および同第4,956,778号ならびに米国特許公開第20050196754号および同第20050196754号も参照されたい。阻害活性を有するアンタゴニストscFvが記載されている（例えばZhao et al.,Hybridoma（Larchmt）2008 27（6）:455-51、Peter et al.,J Cachexia Sarcopenia Muscle 2012 August 12、Shieh et al.,J Imunol 2009 183（4）:2277-85、Giomarelli et al.,Thromb Haemost 2007 97（6）:955-63、Fife eta.,J Clin Invst 2006 116（8）:2252-61、Brocks et al.,Immunotechnology 1997 3（3）:173-84、Moosmayer et al.,Ther Immunol 1995 2（10:31-40を参照されたい）。刺激活性を有するアゴニストscFvが記載されている（例えばPeter et al.,J Bioi Chem 2003 25278（38）:36740-7、Xie et al.,Nat Biotech 1997 15（8）:768-71、Ledbetter et al.,Crit Rev Immunol 1997 17（5-6）:427-55、Ho et al.,BioChim Biophys Acta 2003 1638（3）:257-66を参照されたい）。
本明細書にいう「Fab」は、抗原に結合するが、一価であり、Fc部分を有しない抗体構造のフラグメントを指す。例えば酵素パパインで消化された抗体は、2つのFabフラグメントとFcフラグメント（例えば重（H）鎖定常領域;抗原に結合しないFc領域）とを与える。
本明細書にいう「F（ab'）2」は、全IgG抗体のペプシン消化によって生成する抗体フラグメントを指し、このフラグメントは2つの抗原結合（ab'）（二価）領域を有し、各（ab'）領域は、抗原に結合するために、S-S結合によって連結された2つの別個のアミノ酸鎖、H鎖の一部と軽（L）鎖とを含み、残りのH鎖部分は一つに連結されている。「F（ab'）2」フラグメントは2つの独立したFab'フラグメントに分割することができる。
いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、そのCARが最終的に使用されることになる種と同じ種に由来しうる。例えば、ヒトにおいて使用される場合、CARの抗原結合ドメインはヒト抗体またはそのフラグメントを含みうる。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、そのCARが最終的に使用されることになる種とは異なる種に由来しうる。例えば、ヒトにおいて使用される場合、CARの抗原結合ドメインは、マウス抗体もしくはそのフラグメントまたはヒト化マウス抗体もしくはそのフラグメントを含みうる。
ある一定の態様において、抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR1、HCDR2およびHCDR3）を含む重鎖可変領域と、3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR1、LCDR2およびLCDR3）を含む軽鎖可変領域とを含む。
膜貫通ドメイン
本発明のCARは、CARの抗原結合ドメインをCARの細胞内ドメインに結びつける膜貫通ドメインを含みうる。CARの膜貫通ドメインは、細胞（例えば免疫細胞またはその前駆体）の形質膜をまたぐことができる領域である。膜貫通ドメインは、細胞膜、例えば真核細胞膜への挿入のためにある。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、CARの抗原結合ドメインと細胞内ドメインの間に介在する。
いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、CAR中のドメインのうちの1つまたは複数に天然に付随している。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、同じ表面膜タンパク質または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合が回避されるように選択するか、または1つもしくは複数のアミノ酸置換によってそのように改変することができる。
膜貫通ドメインは天然源または合成源のいずれかに由来しうる。供給源が天然である場合、このドメインは、任意の膜結合型または膜貫通型タンパク質、例えばI型膜貫通タンパク質に由来しうる。供給源が合成である場合、膜貫通ドメインは、細胞膜へのCARの挿入を容易にする任意の人工配列、例えば人工疎水性配列でありうる。本発明において特に有用な膜貫通ドメインの例としては、T細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134（OX-40）、CD137（4-1BB）、CD154（CD40L）、ICOS、CD278、Toll様受容体1（TLR1）、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9に由来する（すなわち少なくともその膜貫通領域を含む）膜貫通ドメイン、またはキラー免疫グロブリン様受容体（KIR）由来の膜貫通ドメインが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
ある一定の態様において、膜貫通ドメインはCD8の膜貫通ドメインを含む。ある一定の態様において、CD8の膜貫通ドメインはCD8αの膜貫通ドメインである。
いくつかの態様において、膜貫通ドメインは合成物であってよく、その場合、それは主としてロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含むだろう。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各端に見いだされるだろう。
本明細書記載の膜貫通ドメインは、本明細書記載の抗原結合ドメインのいずれとも、本明細書記載の細胞内ドメインのいずれとも、またはCARに含まれうる本明細書記載の他のドメインのいずれとも、組み合わせることができる。
いくつかの態様において、膜貫通ドメインはヒンジ領域をさらに含む。本発明のCARはヒンジ領域も含みうる。CARのヒンジ領域は、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間に位置する親水性領域である。いくつかの態様において、このドメインはCARの適正なタンパク質フォールディングを容易にする。ヒンジ領域はCARにとって随意の構成要素である。ヒンジ領域は、抗体のFcフラグメント、抗体のヒンジ領域、抗体のCH2領域、抗体のCH3領域、人工ヒンジ配列またはそれらの組合せから選択されるドメインを含みうる。ヒンジ領域の例としては、CD8aヒンジ、わずか3つのグリシン（Gly）であってもよいポリペプチドでできた人工ヒンジ、ならびにIgG（例えばヒトIgG4）のCH1およびCH3ドメインが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
いくつかの態様において、CARは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと結びつけるヒンジ領域を含み、その膜貫通ドメインは次に細胞内ドメインにつながる。ヒンジ領域は、好ましくは、抗原結合ドメインが標的細胞上の標的抗原を認識しそれに結合するのを支援することができる（例えばHudecek et al.,Cancer Immunol.Res.（2015）3（2）:125-135を参照されたい）。いくつかの態様において、ヒンジ領域はフレキシブルなドメインであり、よって、抗原結合ドメインが、腫瘍細胞などの細胞上の標的抗原の特異的構造および密度を最適に認識するための構造を有することを可能にする（Hudecek et al.,前掲）。ヒンジ領域のフレキシビリティは、ヒンジ領域が多くの異なるコンフォメーションをとることを可能にする。
いくつかの態様において、ヒンジ領域は免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域である。いくつかの態様において、ヒンジ領域は、受容体由来のヒンジ領域ポリペプチド（例えばCD8由来ヒンジ領域）である。ある一定の態様において、ヒンジ領域はCD8αヒンジである。
ヒンジ領域は、約4アミノ酸～約50アミノ酸、例えば約4aa～約10aa、約10aa～約15aa、約15aa～約20aa、約20aa～約25aa、約25aa～約30aa、約30aa～約40aa、または約40aa～約50aaの長さを有することができる。いくつかの態様において、ヒンジ領域は、5aa超、10aa超、15aa超、20aa超、25aa超、30aa超、35aa超、40aa超、45aa超、50aa超、55aa超、またはそれ以上の長さを有することができる。
適切なヒンジ領域は容易に選択することができ、例えば1アミノ酸（例えばGly）～20アミノ酸、2アミノ酸～15アミノ酸、3アミノ酸～12アミノ酸、例えば4アミノ酸～10アミノ酸、5アミノ酸～9アミノ酸、6アミノ酸～8アミノ酸、または7アミノ酸～8アミノ酸など、いくつもある適切な長さのいずれであってもよく、1、2、3、4、5、6または7アミノ酸であることができる。適切なヒンジ領域は20アミノ酸超（例えば30、40、50、60またはそれ以上のアミノ酸）の長さを有することができる。
例えばヒンジ領域には、グリシンポリマー（G）n、グリシン-セリンポリマー（例えば（GS）n、（GSGGS）nおよび（GGGS）nを含み、ここでnは少なくとも1の整数である）、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、および当技術分野において公知の他のフレキシブルリンカーが含まれる。グリシンポリマーおよびグリシン-セリンポリマーを使用することができ、GlyとSerはどちらも構造が比較的定まっていないので、構成要素間の中立的繋留索として役立ちうる。グリシンポリマーを使用することができる。グリシンはアラニンと比べてもかなり多くのファイ-プサイ空間（phi-psi space）にアクセスし、より長い側鎖を持つ残基よりもはるかに束縛が少ない（例えばScheraga,Rev.Computational.Chem.（1992）2:73-142を参照されたい）。例示的なヒンジ領域は、限定するわけではないが
Figure 2024509917000023
などといったアミノ酸配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ヒンジ領域は免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域である。免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列は当技術分野において公知である。例えばTan et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1990）87（1）:162-166およびHuck et al.,Nucleic Acids Res.（1986）14（4）:1779-1789を参照されたい。限定でない例として、免疫グロブリンヒンジ領域は、以下のアミノ酸配列のうちの1つを含むことができる:
Figure 2024509917000024
（例えばGlaser et al.,J.Biol.Chem.（2005）280:41494-41503参照）;
Figure 2024509917000025
など。
ヒンジ領域は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4ヒンジ領域のアミノ酸配列を含むことができる。一態様において、ヒンジ領域は、野生型（天然に存在する）ヒンジ領域と比べて1つまたは複数のアミノ酸の置換および/または挿入および/または欠失を含むことができる。例えばヒトIgG1ヒンジのHis229は、ヒンジ領域が配列EPKSCDKTYTCPPCPを含むことになるように、Tyrで置換することができる。例えばYan et al.,J.Biol.Chem.（2012）287:5891-5897を参照されたい。一態様において、ヒンジ領域は、ヒトCD8由来のアミノ酸配列、またはその変異体を含むことができる。
細胞内シグナリングドメイン
本発明のCARは細胞内シグナル伝達ドメインも含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」および「細胞内ドメイン」という用語は本明細書では相互可換的に使用される。CARの細胞内シグナル伝達ドメインは、そのCARが発現する細胞（例えば免疫細胞）のエフェクター機能のうちの少なくとも1つの活性化を担う。細胞内シグナル伝達ドメインはエフェクター機能シグナルを伝達し、細胞（例えば免疫細胞）に、その専門機能を果たすように、例えば標的細胞を傷つけおよび/または破壊するように指示する。
本発明において使用するための細胞内ドメインの例としては、表面受容体、共刺激分子およびT細胞におけるシグナル伝達を開始するために共同して作用する任意の分子の細胞質部分、ならびにこれらの要素の任意の誘導体または変異体、および同じ機能的能力を有する任意の合成配列が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、T細胞受容体複合体のζ鎖またはそのホモログのうちのいずれか、例えばη鎖、FcsRIγおよびβ鎖、MB1（Iga）鎖、B29（Ig）鎖など、ヒトCD3ゼータ鎖、CD3ポリペプチド（Δ、δおよびε）、sykファミリーチロシンキナーゼ（Syk、ZAP70など）、srcファミリーチロシンキナーゼ（Lck、Fyn、Lynなど）、ならびにT細胞形質導入に関与する他の分子、例えばCD2、CD5およびCD28が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトCD3ゼータ鎖、FcyRIII、FcsRI、Fc受容体の細胞質テール、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を保持する細胞質受容体、およびそれらの組合せでありうる。
一態様において、CARの細胞内シグナル伝達ドメインは、1つまたは複数の共刺激分子の任意の部分、例えばCD2、CD3、CD8、CD27、CD28、ICOS、4-1BB、PD-1由来の少なくとも1つのシグナル伝達ドメイン、それらの任意の誘導体または変異体、同じ機能的能力を有するそれらの任意の合成配列、およびそれらの任意の組合せを含む。
細胞内ドメインの他の例には、限定するわけではないがTCR、CD3ゼータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD86、共通FcRガンマ（common FcR gamma）、FcRベータ（FcイプシロンRIb）、CD79a、CD79b、FcガンマRIIa、DAP10、DAP12、T細胞受容体（TCR）、CD8、CD27、CD28、4-1BB（CD137）、OX9、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、KIRファミリータンパク質、リンパ球機能関連抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンド、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM（LIGHTR）、SLAMF7、NKp80（KLRF1）、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8アルファ、CD8ベータ、IL2Rベータ、IL2Rガンマ、IL7Rアルファ、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CDlib、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1（CD226）、SLAMF4（CD244、2B4）、CD84、CD96（Tactile）、CEACAM1、CRT AM、Ly9（CD229）、CD160（BY55）、PSGL1、CD100（SEMA4D）、CD69、SLAMF6（NTB-A、Ly108）、SLAM（SLAMF1、CD150、IPO-3）、BLAME（SLAMF8）、SELPLG（CD162）、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、Toll様受容体1（TLR1）、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、本明細書記載の他の共刺激分子、それらの任意の誘導体、変異体またはフラグメント、同じ機能的能力を有する共刺激分子の任意の合成配列、およびそれらの任意の組合せを含む、1つまたは複数の分子または受容体に由来するフラグメントまたはドメインがある。
細胞内ドメインのさらなる例としては、限定するわけではないが、CD3、B7ファミリー共刺激および腫瘍壊死因子受容体（TNFR）スーパーファミリー受容体を含む第1世代、第2世代および第3世代のT細胞シグナル伝達タンパク質などといった、さまざまな他の免疫シグナル伝達受容体のいくつかのタイプの細胞内シグナル伝達ドメインが挙げられるが、限定はされない（例えばPark and Brentjens,J.Clin.Oncol.（2015）33（6）:651-653を参照されたい）。さらに、細胞内シグナル伝達ドメインは、NK細胞およびNKT細胞によって使用されるシグナル伝達ドメイン（例えばHermanson and Kaufman,Front.Immunol.（2015）6:195参照）、例えばNKp30（B7-H6）（例えばZhang et al.,J.Immunol.（2012）189（5）:2290-2299参照）およびDAP12（例えばTopfer et al.,J.Immunol.（2015）194（7）:3201-3212参照）、NKG2D、NKp44、NKp46、DAP10およびCD3zのシグナル伝達ドメインを含みうる。
本発明のCARにおける使用に適した細胞内シグナル伝達ドメインには、CARの活性化に応答して（すなわち抗原および二量体化作用物質によって活性化されて）特徴的で検出可能なシグナル（例えば細胞による1種または複数種のサイトカイン産生の増加;標的遺伝子の転写の変化;タンパク質の活性の変化;細胞挙動の変化、例えば細胞死;細胞の増殖;細胞の分化;細胞の生残;細胞シグナル伝達応答の調整など）を与える任意の所望のシグナル伝達ドメインが含まれる。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、少なくとも1つの（例えば1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つなどの）、後述のITAMモチーフを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、DAP10/CD28型シグナル伝達鎖を含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、膜結合型CARに共有結合しているのではなく、細胞質内に拡散している。
本発明のCARにおける使用に適した細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）含有細胞内シグナル伝達ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、ITAMモチーフは細胞内シグナル伝達ドメイン中で2回繰り返され、1つ目のITAMモチーフと2つ目のITAMモチーフは6～8個のアミノ酸によって互いに隔てられている。一態様において、CARの細胞内シグナル伝達ドメインは3つのITAMモチーフを含む。
いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば限定するわけではないがFcガンマRI、FcガンマRIIA、FcガンマRIIC、FcガンマRIIIA、FcRL5などの、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を含有するヒト免疫グロブリン受容体のシグナル伝達ドメインを含む（例えばGillis et al.,Front.Immunol.（2014）5:254参照）。
適切な細胞内シグナル伝達ドメインは、ITAMモチーフを含有するポリペプチドに由来するITAMモチーフ含有部分であることができる。例えば適切な細胞内シグナル伝達ドメインは、任意のITAMモチーフ含有タンパク質からのITAMモチーフ含有ドメインであることができる。したがって適切な細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来するタンパク質全体の全配列を含有する必要はない。適切なITAMモチーフ含有ポリペプチドの例としては、DAP12、FCER1G（Fcイプシロン受容体Iガンマ鎖）、CD3D（CD3デルタ）、CD3E（CD3イプシロン）、CD3G（CD3ガンマ）、CD3Z（CD3ゼータ）およびCD79A（抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、DAP12（TYROBP;TYROタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質;KARAP;PLOSL;DNAX活性化タンパク質12;KAR関連タンパク質;TYROタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質;キラー活性化受容体関連タンパク質;キラー活性化受容体関連タンパク質などとしても公知である）に由来する。一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、FCER1G（FCRG;Fcイプシロン受容体Iガンマ鎖;Fc受容体ガンマ鎖;fc-イプシロンRI-ガンマ;fcRガンマ;fceR1ガンマ;高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ;免疫グロブリンE受容体,高親和性,ガンマ鎖などとしても公知である）に由来する。一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、T細胞表面糖タンパク質CD3デルタ鎖（CD3D;CD3-デルタ;T3D;CD3抗原,デルタサブユニット;CD3デルタ;CD3d抗原,デルタポリペプチド（TiT3複合体）;OKT3,デルタ鎖;T細胞受容体T3デルタ鎖;T細胞表面糖タンパク質CD3デルタ鎖などとしても公知である）に由来する。一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、T細胞表面糖タンパク質CD3イプシロン鎖（CD3e、T細胞表面抗原T3/Leu-4イプシロン鎖、T細胞表面糖タンパク質CD3イプシロン鎖、AI504783、CD3、CD3イプシロン、T3eなどとしても公知である）に由来する。一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、T細胞表面糖タンパク質CD3ガンマ鎖（CD3G、T細胞受容体T3ガンマ鎖、CD3-ガンマ、T3G、ガンマポリペプチド（TiT3複合体）などとしても公知である）に由来する。一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、T細胞表面糖タンパク質CD3ゼータ鎖（CD3Z、T細胞受容体T3ゼータ鎖、CD247、CD3-ゼータ、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZなどとしても公知である）に由来する。一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD79A（B細胞抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖;CD79a抗原（免疫グロブリン関連アルファ）;MB-1膜糖タンパク質;ig-アルファ;膜結合型免疫グロブリン関連タンパク質;表面IgM関連タンパク質などとしても公知である）に由来する。一態様において、本開示のCARにおける使用に適した細胞内シグナル伝達ドメインはDAP10/CD28型シグナル伝達鎖を含む。一態様において、本開示のCARにおける使用に適した細胞内シグナル伝達ドメインはZAP70ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79bまたはCD66dの細胞質シグナル伝達ドメインを含む。一態様において、CAR中の細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトCD3ゼータの細胞質シグナル伝達ドメインを含む。
通常は細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切り取られた一部分を使用する場合、その切り取られた部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、無傷の鎖に代えて使用しうる。細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインのうちの、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、任意の切り取られた一部分を含む。
本明細書記載の細胞内ドメインは、本明細書記載の抗原結合ドメインのいずれとも、本明細書記載の膜貫通ドメインのいずれとも、またはCARに含まれうる本明細書記載の他のドメインのいずれとも、組み合わせることができる。
ある一定の態様において、細胞内ドメインは4-1BBの共刺激ドメインを含む。ある一定の態様において、細胞内ドメインは、CD3ζまたはその変異体の細胞内ドメインを含む。ある一定の態様において、細胞内ドメインは4-1BBドメインおよびCD3ζドメインを含む。
D. T細胞受容体
本発明のいくつかの態様において、直交性キメラサイトカイン受容体を発現する改変免疫細胞（例えばT細胞）は、少なくとも1つのT細胞受容体（TCR）を共発現するように改変された免疫細胞（例えばT細胞）である。
いくつかの態様において、TCRは抗原、例えば腫瘍抗原を標的とする（すなわち抗原、例えば腫瘍抗原に対する抗原特異性を有する）。本明細書において使用する「抗原特異性を有する」などの語句は、TCRが、抗原またはそのエピトープに特異的に結合し、それを認識できることを意味する。
天然TCRは一般にヘテロ二量体である。ヒトでは、T細胞の95％において、TCRはアルファ（α）鎖とベータ（β）鎖（それぞれTRAおよびTRBによってコードされる）を含むが、T細胞の5％では、TCRがγおよびδ（γ/δ）鎖（それぞれTRGおよびTRDによってコードされる）を含む。天然TCR複合体は、4つの二量体モジュール、すなわち可変リガンド結合性TCRαβモジュール（大半のT細胞において）（またはTCRγ/δモジュール）と、3つの不変シグナル伝達モジュールCD3δε、CD3γεおよびCD3ζ二量体とに配置された、I型1回貫通型膜タンパク質の八量体型集合体である。TCRαβモジュールはAPCまたは標的細胞表面上のpMHCリガンドに結合するが、これらのタンパク質は固有のシグナル伝達能を欠くので、シグナル伝達モジュールに頼り、それらの細胞質免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）によって情報を伝達する。例えば、参照により本明細書に組み入れられるChandler et al.Int J Mol Sci（2020）21:7424を参照されたい。天然TCRは、当技術分野において公知の標準的な分子生物学技法および遺伝子操作技法を使ってクローニングし、改変することができる。
操作されたTCR形態も、例えばTCR模倣抗体（TCR mimic antibody）（Chang et al.,Expert Opin Biol Ther.（2016）16（8）:979-87）、TCR様CARおよびTCR-CAR（Walseng et al.,Sci Rep.（2017）7:1-10、Akatsuka et al.,Front Immunol.（2020）11:257、Poorebrahim et al.,Cancer Gene Ther.（2021）28（6）:581-589など、当技術分野では種々公知である。CARとは異なり、TCRは細胞表面抗原に制限されることなく、MHC分子によって提示されるペプチド（pMHC）を検出し、それに結合することができる。この特徴により、TCRの潜在的標的は、腫瘍特異的ネオエピトープなど、広範囲にわたることになる。注目すべきことに、TCRベースのCARの、高度に腫瘍特異的なネオエピトープへのリダイレクション（redirection）は、CAR治療に一般に付随する「オフ腫瘍」毒性を防止することができる。
いくつかの態様において、TCRは天然TCRである。いくつかの態様において、TCRは改変TCRである。いくつかの態様において、TCRは、操作されたTCR、例えばTCR模倣構造もしくは抗体様構造、CAR様TCR、またはCAR-TCRである。いくつかの態様において、TCRはマウスTCRである。いくつかの態様において、TCRはヒトTCRである。いくつかの態様において、TCRは、ヒトTCRの1つまたは複数の部分（例えば定常部分または可変部分）と、マウスTCRの1つまたは複数の部分（例えば定常部分または可変部分）とを有するハイブリッドTCRである。あるいは、前記部分は、ほとんどマウスであるTCRが「ヒト化」されるように、ヒトTCRの数アミノ酸であることもできる。そのようなハイブリッドTCRを作製する方法は当技術分野において公知である（例えばCohen et al.,Cancer Res.,（2006）66:8878-8886参照）。
いくつかの態様において、TCRはgp100黒色腫抗原、例えばヒトgp100を標的とする（すなわちgp100黒色腫抗原、例えばヒトgp100に対する抗原特異性を有する）。いくつかの態様において、腫瘍抗原はgp100である。gp100は、当技術分野ではSILV、SI、SIL、ME20、PMEL17またはD12S53Eとしても公知である。gp100は、哺乳動物の色素沈着の制御において重要な役割を果たすことが公知のタンパク質であり（Hoashi et al.,J.Biol.Chem.（2005）280:14006-14016）、黒色腫および結腸直腸腫瘍を含むヒト腫瘍によって発現されるがん抗原として公知である（Tartaglia et al.,Vaccine（2001）19（17-19）:2571-5）。ヒトgp100のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のGenBankデータベースにおいて、GenBankアクセッション番号NP＿008859（アミノ酸配列）およびGenBankアクセッション番号NM＿006928.3（ヌクレオチド配列）として公開されている。
gp100に対する抗原特異性を有するTCR（すなわち抗gp100 TCR）は、例えばUS20140219978A1に記載のTCRなど、当技術分野において公知である。いくつかの態様において、TCRはpmel-1 TCRである。pmel-1マウスモデルは、養子細胞療法（ACT）を使った悪性黒色腫の処置をモデル化するためのシステムとして開発された（Overwijk,et al.,J Exp Med.（2003）,198（4）:569-80）。標的抗原pmel-17は、ヒト黒色腫において過剰発現することが多いメラノサイト分化抗原gp100のオルソログである。
いくつかの態様において、TCRはNY-ESO-1抗原を標的とする（すなわちNY-ESO-1抗原に対する抗原特異性を有する）。NY-ESO-1は、滑膜肉腫、粘液性脂肪肉腫、黒色腫その他の腫瘍において過剰発現するがん精巣抗原である。いくつかの態様において、TCRはNYESO1-TCRクローン1G4（Robbins,et al.,J Immunol,2008,180:6116-6131）である。いくつかの態様において、TCRは、MAGE-A3/A6、MAGE-A10、AFP、PRAME、MART-1およびHPV E6から選択される抗原を標的とする。
E. 核酸および発現ベクター
本開示は、（i）直交性キメラサイトカイン受容体をコードする核酸、（ii）直交性サイトカインをコードする核酸、および（iii）CARおよび/またはTCRをコードする核酸を提供する。本開示の核酸は、本明細書に開示する直交性キメラサイトカイン受容体、直交性サイトカイン、CARおよび/またはTCRのうちのいずれか1つをコードする核酸配列（すなわちポリヌクレオチド配列）を含みうる。
ある一定の態様において、本開示の核酸は、第1ポリヌクレオチド配列と第2ポリヌクレオチド配列とを含む。第1および第2ポリヌクレオチド配列はリンカーによって分離されていてもよい。本開示において使用するためのリンカーは、複数のタンパク質が同じ核酸配列（例えばマルチシストロン性または二シストロン性配列）によってコードされることを可能にし、この核酸配列はポリプロテインとして翻訳されて、それが別々のタンパク質構成要素に解離される。ある一定の態様において、核酸は、5'から3'に向かって、第1ポリヌクレオチド配列、リンカー、および第2ポリヌクレオチド配列を含む。ある一定の態様において、核酸は、5'から3'に向かって、第2ポリヌクレオチド配列、リンカー、および第1ポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様において、リンカーは、配列内リボソーム進入部位（IRES）をコードする核酸配列を含む。本明細書にいう「配列内リボソーム進入部位」または「IRES」とは、タンパク質コード領域の開始コドン、例えばATGへの、直接的な配列内リボソーム進入を促進し、よって遺伝子のキャップ非依存的翻訳をもたらす要素を指す。例えば限定するわけではないが、ウイルスmRNA源または細胞mRNA源から得ることができるIRES、例えば免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（BiP）;血管内皮増殖因子（VEGF）;線維芽細胞増殖因子2;インスリン様成長因子;翻訳開始因子eIF4G;酵母転写因子TFIIDおよびHAP4、ならびに例えばカルジオウイルス、ライノウイルス、アフトウイルス、HCV、フレンドマウス白血病ウイルス（FrMLV）およびモロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）にから得ることができるIRESなど、さまざまな配列内リボソーム進入部位が当業者に公知である。当業者は本発明において使用するための適当なIRESを選択することができるだろう。
いくつかの態様において、リンカーは、自己切断ペプチドをコードする核酸配列を含む。本明細書にいう「自己切断ペプチド」または「2Aペプチド」は、複数のタンパク質がポリプロテインとしてコードされ、それが翻訳後に構成要素タンパク質へと解離することを可能にするオリゴペプチドを指す。「自己切断」という用語の使用は、タンパク質分解的切断反応を含意しようとするものではない。限定するわけではないが、例えばウイルス科ピコルナウイルス科（Picornaviridae）のメンバー、例えば口蹄疫ウイルス（FMDV）、ウマ鼻炎Aウイルス（ERAV0、トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス（TaV）およびブタテッショウウイルス-1（PTV-1）、ならびにカリオウイルス（cariovirus）、例えばタイロウイルスおよび脳心筋炎ウイルスに見いだされるものなど、さまざまな自己切断ペプチドまたは2Aペプチドが、当業者に公知である。FMDV、ERAV、PTV-1およびTaV由来の2Aペプチドを、本明細書では、それぞれ「F2A」、「E2A」、「P2A」および「T2A」という。当業者は、本発明において使用するための適当な自己切断ペプチドを選択することができるだろう。
いくつかの態様において、リンカーは、フューリン切断部位をコードする核酸配列を、さらに含む。フューリンは、トランスゴルジ中に存在してタンパク質前駆体をその分泌前にプロセシングする、遍在的に発現されるプロテアーゼである。フューリンはそのコンセンサス認識配列のCOOH末を切断する。限定するわけではないが、例えばArg-X1-Lys-ArgまたはArg-X1-Arg-Arg、X2-Arg-X1-X3-ArgおよびArg-X1-X1-Arg、例えばArg-Gln-Lys-Argなど（ここで、X1は天然に存在するアミノ酸であり、X2はLysまたはArgであり、X3はLysまたはArgである）、さまざまなフューリンコンセンサス認識配列（または「フューリン切断部位」）が、当業者に公知である。当業者は、本発明において使用するための適当なフューリン切断部位を選択することができるだろう。
いくつかの態様において、リンカーは、フューリン切断部位と2Aペプチドの組合せをコードする核酸配列を含む。例としては、フューリン切断部位およびF2Aをコードする核酸配列を含むリンカー、フューリン切断部位およびE2Aをコードする核酸配列を含むリンカー、フューリン切断部位およびP2Aをコードする核酸配列を含むリンカー、フューリン切断部位およびT2Aをコードする核酸配列を含むリンカーが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。当業者は本発明において使用するための適当な組合せを選択することができるだろう。そのような態様において、リンカーは、フューリン切断部位と2Aペプチドの間にスペーサー配列を、さらに含みうる。いくつかの態様において、リンカーは、2Aペプチドの5'側にフューリン切断部位を含む。いくつかの態様において、リンカーは、フューリン切断部位の5'側に2Aペプチドを含む。限定するわけではないが、例えばグリシンセリン（GS）スペーサー（GSリンカーとしても公知である）、例えば（GS）n、（SG）n、（GSGGS）nおよび（GGGS）n（ここで、nは少なくとも1の整数を表す）など、さまざまなスペーサー配列が当技術分野では公知である。例示的なスペーサー配列は、例えば限定するわけではないが
Figure 2024509917000026
などのアミノ酸配列を含むことができる。当業者は、本発明において使用するための適当なスペーサー配列を選択することができるだろう。
いくつかの態様において、本開示の核酸は、転写制御要素、例えばプロモーターおよびエンハンサーなどに機能的に連結されうる。適切なプロモーター要素およびエンハンサー要素は当業者に公知である。
細菌細胞における発現の場合、適切なプロモーターには、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダPおよびtrcなどがあるが、それらに限定されるわけではない。真核細胞における発現の場合、適切なプロモーターには、軽鎖および/または重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーターおよびエンハンサー要素;サイトメガロウイルス前初期プロモーター;単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター;初期および後期SV40プロモーター;レトロウイルスの長末端反復中に存在するプロモーター;マウスメタロチオネイン-Iプロモーター;および当技術分野において公知のさまざまな組織特異的プロモーターなどがあるが、それらに限定されるわけではない。適切な可逆的プロモーターは、可逆的誘導性プロモーターを含めて、当技術分野では公知である。そのような可逆的プロモーターは、多くの生物、例えば真核生物および原核生物から単離することができ、またはそれらに由来しうる。例えば第1の原核生物と第2の真核生物、第1の真核生物と第2の原核生物など、第2の生物において使用するための、第1の生物に由来する可逆的プロモーターの改変は、当技術分野において周知である。そのような可逆的プロモーター、およびそのような可逆的プロモーターに基づくが追加の制御タンパク質も含むシステムには、例えばアルコール制御性プロモーター（例えばアルコールデヒドロゲナーゼI（alcA）遺伝子プロモーター、アルコールトランス活性化因子タンパク質応答性プロモーター（AlcR）など）、テトラサイクリン制御性プロモーター（例えばTetActivator、TetON、TetOFFなどを含むプロモーターシステム）、ステロイド制御性プロモーター（例えばラットグルココルチコイド受容体プロモーターシステム、ヒトエストロゲン受容体プロモーターシステム、レチノイドプロモーターシステム、甲状腺プロモーターシステム、エクジソンプロモーターシステム、ミフェプリストンプロモーターシステムなど）、金属制御性プロモーター（例えばメタロチオネインプロモーターシステムなど）、病原関連制御性プロモーター（例えばサリチル酸制御性プロモーター、エチレン制御性プロモーター、ベンゾチアジアゾール制御性プロモーターなど）、温度制御性プロモーター（例えば熱ショック誘導性プロモーター（例えばHSP-70、HSP-90、ダイズ熱ショックプロモーターなど）、光制御性プロモーター、合成誘導性プロモーターなどがあるが、それらに限定されるわけではない。
いくつかの態様において、プロモーターは、CD8細胞特異的プロモーター、CD4細胞特異的プロモーター、好中球特異的プロモーター、またはNK特異的プロモーターである。例えばCD4遺伝子プロモーターを使用することができる。例えばSalmon et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1993）90:7739およびMarodon et al.（2003）Blood 101:3416を参照されたい。別の一例として、CD8遺伝子プロモーターを使用することができる。NK細胞特異的発現は、NcrI（p46）プロモーターを使用することで達成できる。例えばEckelhart et al.Blood（2011）117:1565を参照されたい。
酵母細胞における発現の場合、適切なプロモーターは、ADH1プロモーター、PGK1プロモーター、ENOプロモーター、PYK1プロモーターなどの恒常的プロモーター、またはGAL1プロモーター、GAL10プロモーター、ADH2プロモーター、PHOSプロモーター、CUP1プロモーター、GALTプロモーター、MET25プロモーター、MET3プロモーター、CYC1プロモーター、HIS3プロモーター、ADH1プロモーター、PGKプロモーター、GAPDHプロモーター、ADC1プロモーター、TRP1プロモーター、URA3プロモーター、LEU2プロモーター、ENOプロモーター、TP1プロモーター、およびAOX1（例えばピキア属（Pichia）において使用する場合）などの制御可能なプロモーターである。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に、当技術分野における通常の技術水準内にある。原核宿主細胞において使用するための適切なプロモーターには、例えばバクテリオファージT7 RNAポリメラーゼプロモーター;trpプロモーター;lacオペロンプロモーター;ハイブリッドプロモーター、例えばlac/tacハイブリッドプロモーター、tac/trcハイブリッドプロモーター、trp/lacプロモーター、T7/lacプロモーター;trcプロモーター;tacプロモーターなど;araBADプロモーター;インビボ制御性プロモーター、例えばssaGプロモーターまたは関連プロモーター（例えば米国特許出願公開第20040131637号参照）、pagCプロモーター（Pulkkinen and Miller,J.Bacteriol.（1991）173（1）:86-93、Alpuche-Aranda et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1992）89（21）:10079-83）、nirBプロモーター（Harborne et al.Mol.Micro.（1992）6:2805-2813）など（例えばDunstan et al.,Infect.Immun.（1999）67:5133-5141、McKelvie et al.,Vaccine（2004）22:3243-3255、およびChatfield et al.,Biotechnol.（1992）10:888-892参照）;シグマ70プロモーター、例えばコンセンサスシグマ70プロモーター（例えばGenBankアクセッション番号AX798980、AX798961およびAX798183参照）;定常期プロモーター、例えばdpsプロモーター、spvプロモーターなど;病原性遺伝子島SPI-2由来のプロモーター（例えばWO96/17951参照）;actAプロモーター（例えばShetron-Rama et al.,Infect.Immun.（2002）70:1087-1096）;rpsMプロモーター（例えばValdivia and Falkow Mol.Microbiol.（1996）.22:367参照）;tetプロモーター（例えばHillen,W.and Wissmann,A.（1989）、Saenger,W.and Heinemann,U.編「Topics in Molecular and Structural Biology,Protein--Nucleic Acid Interaction」（Macmillan,英国ロンドン）Vol.10の143～162頁）;SP6プロモーター（例えばMelton et al.,Nucl.Acids Res.（1984）12:7035参照）などがあるが、それらに限定されるわけではない。大腸菌（Escherichia coli）などの原核細胞において使用するための適切な強いプロモーターには、Trc、Tac、T5、T7およびPラムダなどがあるが、それらに限定されるわけではない。細菌宿主細胞における使用のためのオペレーターの限定でない例には、ラクトースプロモーターオペレーター（LacIリプレッサータンパク質はラクトースと接触するとコンフォメーションが変化し、それによってLadリプレッサータンパク質がオペレーターに結合するのを妨げる）、トリプトファンプロモーターオペレーター（トリプトファンと複合体を形成している場合、TrpRリプレッサータンパク質は、オペレーターに結合するコンフォメーションを有し、トリプトファンの非存在下では、TrpRリプレッサータンパク質はオペレーターに結合しないコンフォメーションを有する）、およびtacプロモーターオペレーター（例えばdeBoer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.（1983）80:21-25参照）がある。
適切なプロモーターの他の例には、前初期サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター配列がある。このプロモーター配列は、それに機能的に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルな発現を駆動することができる強い恒常的プロモーター配列である。他の恒常的プロモーター配列、例えば限定するわけではないが、シミアンウイルス40（SV40）初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（MMTV）またはヒト免疫不全ウイルス（HIV）長末端反復（LTR）プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バー・ウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、EF-1アルファプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えば限定するわけではないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよびクレアチンキナーゼプロモーターなども使用しうる。さらに本発明は、恒常的プロモーターの使用に限定されるべきでない。誘導性プロモーターも本発明の一部とみなされる。誘導性プロモーターの使用は、それが機能的に連結されているポリヌクレオチド配列の発現を、そのような発現が望ましい時にオンにするか、または発現が望ましくない時にオフにすることができる、分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例には、メタロチオニン（metallothionine）プロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターなどがあるが、それらに限定されるわけではない。
いくつかの態様において、適切なプロモーターを含有する遺伝子座または構築物または導入遺伝子は、誘導システムの誘導によって、不可逆的に切り替えられる。不可逆的切り替えを誘導するための適切なシステムは、当技術分野において周知であり、例えば不可逆的切り替えの誘導には、Cre-lox媒介組換えを利用しうる（例えばFuhrmann-Benzakein,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（2000）28:e99を参照されたい。この文献の開示は、参照により本明細書に組み入れられる）。不可逆的に切り替え可能なプロモーターの作成には、当技術分野に公知のリコンビナーゼ、エンドヌクレアーゼ、リガーゼの任意の適切な組合せを使用しうる。本明細書の他の項に記載する部位特異的組換えを実施するための方法、機序および要件は、不可逆的に切り替え可能なプロモーターの作成に役立ち、当技術分野において周知である。例えばGrindley et al.Annual Review of Biochemistry（2006）567-605および「Tropp,Molecular Biology」（2012）（Jones＆Bartlett Publishers,マサチューセッツ州サドベリー）を参照されたい。これらの文献の開示は参照により本明細書に組み入れられる。
いくつかの態様において、本開示の核酸は、CAR誘導性発現カセットをコードする核酸配列を、さらに含む。一態様において、CAR誘導性発現カセットは、CARシグナル伝達時に放出されるトランスジェニックポリペプチド産物を産生するためのものである。例えばChmielewski and Abken,Expert Opin.Biol.Ther.（2015）15（8）:1145-1154およびAbken,Immunotherapy（2015）7（5）:535-544を参照されたい。いくつかの態様において、本開示の核酸は、T細胞活性化応答性プロモーターに機能的に連結されたサイトカインをコードする核酸配列を、さらに含む。いくつかの態様において、T細胞活性化応答性プロモーターに機能的に連結されたサイトカインは、別個の核酸配列上に存在する。一態様において、サイトカインはIL-12である。
本開示の核酸は、発現ベクターおよび/またはクローニングベクター内に存在しうる。発現ベクターは、選択可能マーカー、複製起点、ならびにそのベクターの複製および/または維持に備えた他の特徴を含むことができる。適切な発現ベクターには、例えばプラスミド、ウイルスベクターなどが含まれる。適切なベクターおよびプロモーターは当業者には数多く公知であり、本組換え構築物を作成するために多くの市販品を利用することができる。以下にベクターを例示するが、決してこれらを限定と解釈してはならない。細菌用:pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a（Stratagene、米国カリフォルニア州ラホーヤ）、pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540およびpRIT5（Pharmacia、スウェーデン・ウプサラ）。真核生物用:pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG（Stratagene）pSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVL（Pharmacia）。
発現ベクターは、外因性タンパク質をコードする核酸配列の挿入に備えて、プロモーター配列の近くに位置する好都合な制限部位を、一般に有する。発現宿主内で機能する選択可能マーカーが存在しうる。適切な発現ベクターには、例えばウイルスベクター（例えばワクシニアウイルス;ポリオウイルス;アデノウイルス（例えばLi et al.,Invest.Opthalmol.Vis.Sci.（1994）35:2543-2549、Borras et al.,Gene Ther.（1999）6:515-524、Li and Davidson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1995）92:7700-7704、Sakamoto et al.,H.Gene Ther.（1999）5:1088-1097、WO 94/12649、WO 93/03769、WO 93/19191、WO 94/28938、WO 95/11984およびWO 95/00655参照）;アデノ随伴ウイルス（例えばAli et al.,Hum.Gene Ther.（1998）9:81-86、Flannery et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1997）94:6916-6921、Bennett et al.,Invest.Opthalmol.Vis.Sci.（1997）38:2857-2863、Jomary et al.,Gene Ther.（1997）4:683 690、Rolling et al.,Hum.Gene Ther.（1999）10:641-648、Ali et al.,Hum.Mol.Genet.（1996）5:591-594、SrivastavaのWO 93/09239、Samulski et al.,J.Vir.（1989）63:3822-3828、Mendelson et al.,Virol.（1988）166:154-165およびFlotte et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1993）90:10613-10617参照）;SV40;単純ヘルペスウイルス;ヒト免疫不全ウイルス（例えばMiyoshi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1997）94:10319-23、Takahashi et al.,J.Virol.（1999）73:7812-7816参照）に基づくウイルスベクター;レトロウイルスベクター（例えばマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳房腫瘍ウイルスなどのレトロウイルス由来のベクター）などがあるが、それらに限定されるわけではない。
使用に適した発現ベクターには他にも、例えばレンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、フォーミーウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、操作されたハイブリッドウイルスベクター、トランスポゾン媒介ベクターがあるが、それらに限定されるわけではない。ウイルスベクター技術は当技術分野では周知であり、例えばSambrook et al.,2012,「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」1～4巻,Cold Spring Harbor Press,NY）ならびにウイルス学および分子生物学の他のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスなどがあるが、それらに限定されるわけではない。
一般に、適切なベクターは、少なくとも1種の生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、および1つまたは複数の選択可能マーカーを含有する（例えばWO 01/96584、WO 01/29058および米国特許第6,326,193号）。
いくつかの態様において、発現ベクター（例えばレンチウイルスベクター）は、免疫細胞またはその前駆体（例えばT細胞）にCARまたはTCRを導入するために使用しうる。したがって、本発明の発現ベクター（例えばレンチウイルスベクター）は、CARまたはTCRをコードする核酸を含みうる。いくつかの態様において、発現ベクター（例えばレンチウイルスベクター）は、そこにコードされているCARまたはTCRの機能的発現を助ける追加の要素を含むだろう。いくつかの態様において、CARまたはTCRをコードする核酸を含む発現ベクターは、哺乳類プロモーターをさらに含む。一態様において、ベクターは伸長因子1アルファプロモーター（EF-1αプロモーター）をさらに含む。EF-1αプロモーターの使用は、下流の導入遺伝子（例えばCARまたはTCRをコードする核酸配列）の発現効率を増加させうる。生理学的プロモーター（例えばEF-1αプロモーター）は組込みによる遺伝毒性を誘導する可能性が低く、幹細胞を形質転換するレトロウイルスベクターの能力を無効にしうる。ベクター（例えばレンチウイルスベクター）における使用に適した生理学的プロモーターは他にも当業者に公知であり、それらを本発明のベクターに組み入れることができる。いくつかの態様において、ベクター（例えばレンチウイルスベクター）は、力価と遺伝子発現を改良しうる必須でないシス作用配列を、さらに含む。必須でないシス作用配列の限定でない一例は、効率のよい逆転写および核内移行にとって重要なセントラルポリプリントラクト（central polypurine tract）およびセントラルターミネーション配列（central termination sequence）（cPPT/CTS）である。必須でないシス作用配列は他にも当業者に公知であり、それらを本発明のベクター（例えばレンチウイルスベクター）に組み入れることができる。いくつかの態様において、ベクターは転写後制御要素をさらに含む。転写後制御要素は、RNAの翻訳を改良し、導入遺伝子発現を改良し、RNA転写産物を安定化しうる。転写後制御要素の一例はマーモット肝炎ウイルス転写後制御要素（WPRE）である。したがっていくつかの態様において、本発明のベクターはWPRE配列をさらに含む。さまざまな転写後制御要素が当業者に公知であり、それらを本発明のベクター（例えばレンチウイルスベクター）に組み入れることができる。本発明のベクターは、RNA輸送のためのrev応答要素（RRE）、パッケージング配列、ならびに5'および3'長末端反復（LTR）などといった追加の要素を、さらに含みうる。「長末端反復」または「LTR」という用語は、レトロウイルスDNAの端部に位置する塩基対のドメインを指し、U3領域、R領域およびU5領域を含む。LTRは、一般に、レトロウイルス遺伝子の発現（例えば促進（promotion）、開始（initiation）および遺伝子転写産物のポリアデニル化）およびウイルス複製に必要な機能を提供する。一態様において、本発明のベクター（例えばレンチウイルスベクター）は3'U3欠失LTRを含む。したがって本発明のベクター（例えばレンチウイルスベクター）は、導入遺伝子の機能的発現の効率を強化するために、本明細書記載の要素の任意の組合せを含みうる。例えば本発明のベクター（例えばレンチウイルスベクター）は、CARまたはTCRをコードする核酸に加えて、WPRE配列、cPPT配列、RRE配列、5'LTR、3'U3欠失LTR'を含みうる。
本発明のベクターは自己不活化ベクターでありうる。本明細書において使用する「自己不活化ベクター」という用語は、3'LTRエンハンサープロモーター領域（U3領域）が（例えば欠失または置換によって）改変されているベクターを指す。自己不活化ベクターは、1巡目のウイルス複製以降のウイルス転写を防止しうる。結果として、自己不活化ベクターは、1回だけ感染し宿主ゲノム（例えば哺乳動物ゲノム）に組み込まれることができ、それ以上は継代することができない。したがって自己不活化ベクターは、複製可能なウイルスを作り出すリスクを、著しく低減しうる。
いくつかの態様において、本発明の核酸は、RNA、例えばインビトロ合成されたRNAでありうる。RNAをインビトロ合成するための方法は当業者に公知であり、公知の方法はいずれも、本開示の直交性キメラサイトカイン受容体もしくはそれに対応する直交性サイトカイン、および/またはCARもしくはTCRをコードする配列を含むRNAを合成するために、使用することができる。RNAを宿主細胞中に導入するための方法は当技術分野において公知である。例えばZhao et al.Cancer Res.（2010）15:9053参照。本開示のCARまたはTCRをコードするヌクレオチド配列を含むRNAの、宿主細胞への導入は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで実行することができる。例えば宿主細胞（例えばNK細胞、細胞傷害性Tリンパ球など）には、インビトロまたはエクスビボで、本開示の直交性キメラサイトカイン受容体もしくはそれに対応する直交性サイトカインおよび/またはCARもしくはTCRをコードするヌクレオチド配列を含むRNAを、エレクトロポレーションすることができる。
ポリペプチドまたはその一部分の発現を評価するために、細胞中に導入される発現ベクターには、ウイルスベクターによるトランスフェクションまたは感染を試みた細胞の集団から発現細胞を同定および選択することが容易になるように、選択可能マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子またはその両方も含有させうる。いくつかの態様において、選択可能マーカーは、別個のDNA片上に担持されていて、共トランスフェクション法で使用されうる。宿主細胞における発現が可能になるように、選択可能マーカーとレポーター遺伝子の両方に、適当な制御配列を隣接させうる。有用な選択可能マーカーには、抗生物質耐性遺伝子があるが、それに限定されるわけではない。
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性がある細胞を同定するため、および制御配列の機能性を評価するために使用される。一般にレポーター遺伝子は、レシピエントである生物または組織において存在も発現もしない遺伝子であって、それがコードするポリペプチドの発現が、何らかの容易に検出できる性質、例えば酵素活性によって明らかになる遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、DNAがレシピエント細胞中に導入された後、適切な時点で評価される。適切なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を挙げることができるが、それらに限定されるわけではない（例えばUi-Tei et al.,2000 FEBS Letters 479:79-82）。
いくつかの態様において、本開示の核酸は、本明細書記載の（i）直交性キメラサイトカイン受容体、（ii）直交性サイトカイン、および/または（iii）CARもしくはTCRの、例えば哺乳動物における、産生のために提供される。いくつかの態様において、本開示の核酸は、その核酸の増幅に対応する。
腫瘍溶解性アデノウイルスベクター
腫瘍溶解性ウイルスは、固形腫瘍の処置にとって極めて有望な作用物質であり、GM-CSFを発現する腫瘍溶解性ヘルペスウイルスは、臨床試験で証明された治療上の利益に基づき、進行黒色腫の治療薬として米国FDAによって承認された（Andtbacka RH,et al.「Talimogene laherparepvec improves durable response rate in patients with advanced Melanoma」J Clin Oncol.2015;33（25）:2780-2788）。腫瘍溶解性アデノウイルス（OAd）は、正常細胞を温存しつつ、がん細胞を特異的に標的とし、がん細胞中で複製し、がん細胞を殺すようにプログラムすることができる。ウイルス子孫の放出は、ウイルス接種物の指数的増加をもたらし、それが直接的な腫瘍縮小を引き起こしうると共に、免疫系を覚醒させるのに必要な危険信号を与える（Lichty BD,Breitbach CJ,Stojdl DF,Bell JC.「Going viral with cancer immunotherapy」Nat Rev Cancer.2014;14（8）:559-567）。重要なことに、OAdは、選択的にTME内で治療用導入遺伝子を発現するように遺伝子改変することができる（Siurala M,et al.「Adenoviral delivery of tumor necrosis factor-α and interleukin-2 enables successful adoptive cell therapy of immunosuppressive melanoma」Mol Ther.2016;24（8）:1435-1443、Nishio N,et al.「Armed oncolytic virus enhances immune functions of chimeric antigen receptor-modified T cells in solid tumors」Cancer Res.2014;74（18）:5195-5205、Tanoue K,et al.「Armed oncolytic adenovirus-expressing PD-L1 mini-body enhances antitumor effects of chimeric antigen receptor T cells in solid tumors」Cancer Res.2017;77（8）:2040-2051、Rosewell Shaw A,et al.「Adenovirotherapy delivering cytokine and checkpoint inhibitor augments CAR T cells against metastatic head and neck cancer」Mol Ther.2017;25（11）:2440-2451）。ヒト患者におけるOAdの実行可能性および安全性は臨床試験で証明されている（Kim KH,et al.「A phase I clinical trial of Ad5/3-Δ24,novel serotype-chimeric,infectivity-enhanced,conditionally-replicative adenovirus（CRAd）,in patients with recurrent ovarian cancer」Gynecol Oncol.2013;130（3）:518-524、Ranki T,et al.「Phase I study with ONCOS-102 for the treatment of solid tumors-an evaluation of clinical response and exploratory analyses of immune markers」J Immunother Cancer.2016;4:17）。治療用導入遺伝子を局所的に発現させつつ腫瘍免疫抑制を復旧させるそれらの能力は、養子T細胞移入との併用のための合理的戦略を与える。
いくつかの態様において、本開示の直交性サイトカイン、例えば直交性IL-2は、制限増殖型（conditionally replicating）腫瘍溶解性アデノウイルスベクターなどの腫瘍溶解性アデノウイルスベクター内に含まれる核酸配列によってコードされる。制限増殖型腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの一例として、初期遺伝子E1AおよびE3がそれぞれがん細胞特異的複製および導入遺伝子発現が可能になるように改変されている血清型5アデノウイルスベクター（Ad5）が挙げられる。E1Aは、p16-Rbパスウェイ変異を保持するがん細胞において選択的に複製することができるウイルスを得るために、CR2領域のDNAのうち24塩基対を欠失させることによって改変される（別名D24変異体）。直交性サイトカイン（例えばoIL2）導入遺伝子はE3領域中に置くことができる。さらにまた、ウイルスキャプシドは、腫瘍細胞の形質導入効率の改良を可能にするキメラ5/3ファイバーを含むように改変される。この構築物Ad5/3-D24-orthoIL2と、その同質遺伝子対照は、レンチウイルスを使って形質導入されたorthoCAR T細胞および/またはorthoTCR T細胞を選択的に誘引し刺激して改良された抗腫瘍効力を与える直交性サイトカインペアの能力を評価するために、インビトロ研究およびインビボ研究で使用される。
F. 改変免疫細胞
本発明は、（i）直交性キメラサイトカイン受容体と（ii）少なくとも1つのCARとを含む改変免疫細胞またはその前駆体（例えばT細胞）を提供する。（i）直交性キメラサイトカイン受容体と（ii）少なくとも1つのCARとをコードする1つまたは複数の核酸を含む改変免疫細胞またはその前駆細胞も提供される。したがってそのような改変細胞は、そこで発現するCARによって方向づけられる特異性を有する。例えば、CARを含む本開示の改変細胞は、標的細胞上の1つまたは複数の抗原（例えばがん細胞上の1つまたは複数の腫瘍抗原）に対する特異性を有する。一局面において、本発明は、がんを処置する方法であって、がんを有する対象に、（i）直交性キメラサイトカイン受容体と少なくとも1つのCARとを含む改変細胞および（ii）直交性サイトカインをコードする核酸を含む腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを投与する工程を含み、それによってがんを処置する方法を提供する。
本発明は、（i）直交性キメラサイトカイン受容体と（ii）少なくとも1つのT細胞受容体（TCR）とを発現するように改変された改変免疫細胞またはその前駆体（例えばT細胞）を、さらに提供する。（i）直交性キメラサイトカイン受容体と（ii）少なくとも1つのTCRとをコードする1つまたは複数の核酸を含む改変免疫細胞またはその前駆細胞も提供される。したがってそのような改変細胞は、そこで発現するTCRによって方向づけられる特異性を有する。例えば、TCRを含む本開示の改変細胞は、標的細胞上の1つまたは複数の抗原（例えばがん細胞上の1つまたは複数の腫瘍抗原）に対する特異性を有する。一局面において、本発明は、がんを処置する方法であって、がんを有する対象に、（i）直交性キメラサイトカイン受容体と少なくとも1つのTCRとを発現するように改変された改変細胞および（ii）直交性サイトカインをコードする核酸を含む腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを投与する工程を含み、それによってがんを処置する方法を提供する。
ある一定の態様において、改変細胞は改変免疫細胞である。ある一定の態様において、改変細胞は自家細胞である。ある一定の態様において、改変細胞はヒト対象から得られた自家細胞である。ある一定の態様において、改変細胞はT細胞である。
G. 処置の方法
本明細書記載の改変細胞（例えばT細胞）は、免疫治療用の組成物に含めることができる。組成物は、薬学的組成物であってよく、薬学的に許容される担体をさらに含みうる。改変T細胞を含む治療有効量の薬学的組成物を投与しうる。
一局面において、本発明は、養子細胞移入 治療のための方法であって、それを必要とする対象に本発明の改変T細胞を投与する工程を含む方法を包含する。別の一局面において、本発明は、対象における疾患または状態を処置する方法であって、それを必要とする対象に改変T細胞の集団を投与する工程を含む方法を包含する。一局面において、本発明は、がんを処置する方法であって、がんを有する対象に、（a）（i）直交性キメラサイトカイン受容体と（ii）少なくとも1つのCARとを含む改変細胞、および（b）直交性サイトカインをコードする核酸配列を含む腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを投与する工程を含み、該改変細胞は改良された輸送およびエフェクター機能を持つ幹細胞メモリー（Tscm）特徴を呈し、それによって該がんを処置する方法を提供する。一局面において、本発明は、がんを処置する方法であって、がんを有する対象に、（a）（i）直交性キメラサイトカイン受容体と（ii）少なくとも1つのTCRとを発現するように改変された改変細胞、および（b）直交性サイトカインをコードする核酸配列を含む腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを投与する工程を含み、該改変細胞は改良された輸送およびエフェクター機能を持つ幹細胞メモリー（Tscm）特徴を呈し、それによって該がんを処置する方法を提供する。
養子細胞治療のために免疫細胞を投与する方法は公知であり、それらは、提供される方法および組成物と共に使用しうる。例えば、養子T細胞療法は、Gruenbergらの米国特許出願公開第2003/0170238号、Rosenbergの米国特許第4,690,915号、Rosenberg（2011）Nat Rev Clin Oncol.8（10）:577-85などに記載されている。例えば、Themeli et al.（2013）Nat Biotechnol.31（10）:928-933、Tsukahara et al.（2013）Biochem Biophys Res Commun 438（1）:84-9、Davila et al.（2013）PLoS ONE 8（4）:e61338を参照されたい。いくつかの態様において、細胞治療、例えば養子T細胞治療は、自家移入によって実行され、この場合は、細胞が、細胞治療を受ける予定の対象から、またはそのような対象に由来する試料から、単離されおよび/または他の形で調製される。したがって、いくつかの局面において、細胞は、処置を必要とする対象、例えば患者に由来し、単離および処理後に、同じ対象に投与される。
いくつかの態様において、細胞治療、例えば養子T細胞治療は、同種移入によって実行され、この場合は、細胞が、細胞治療を受ける予定である対象以外または最終的に細胞治療を受ける予定である対象以外の対象、例えば第1対象以外の対象から、単離されおよび/または他の形で調製される。そのような態様では、細胞が、次に、同じ種の異なる対象、例えば第2対象に投与される。いくつかの態様において、第1対象と第2対象は遺伝的に同一である。いくつかの態様において、第1対象と第2対象は遺伝的に類似している。いくつかの態様において、第2対象は、第1対象と同じHLAクラスまたはHLAスーパータイプを発現する。
いくつかの態様において、対象は、前記細胞または前記細胞を含有する組成物の投与に先立って、前記疾患または状態、例えば腫瘍を標的とする治療剤で処置されている。いくつかの局面において、対象は、他の治療剤に対して抵抗性または非応答性である。いくつかの態様において、対象は、例えば化学治療、放射線治療および/または同種HSCTなどの造血幹細胞移植（HSCT）を含む別の治療的介入後に、持続性または再発性の疾患を有する。いくつかの態様において、前記投与は、対象が別の治療に対して抵抗性になっているにも関わらず、対象を効果的に処置する。
いくつかの態様において、対象は、前記他の治療剤に応答性であり、前記治療剤による処置は疾病負荷を低減する。いくつかの局面において、対象は前記治療剤に対して当初は応答性であるが、やがて前記疾患または状態の再発を呈する。いくつかの態様において、対象は再発していない。いくつかのそのような態様において、対象は、例えば再発のリスクが高いなど、再発のリスクがあると決定され、したがって前記細胞が、予防的に、例えば再発の可能性を低減しまたは再発を防止するために、投与される。いくつかの局面において、対象は、別の治療剤による処置を事前に受けていない。
いくつかの態様において、対象は、例えば化学治療、放射線治療および/または同種HSCTなどの造血幹細胞移植（HSCT）を含む別の治療的介入後に、持続性または再発性の疾患を有する。いくつかの態様において、前記投与は、対象が別の治療に対して抵抗性になっているにも関わらず、対象を効果的に処置する。
本発明の改変免疫細胞は、がんを処置するために動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトに投与することができる。加えて、本発明の細胞は、疾患を処置しまたは緩和することが望ましい場合に、がんに関係する任意の状態、とりわけ腫瘍細胞に対する細胞媒介性免疫応答に関係する任意の状態の処置に、使用することができる。本発明の改変細胞または薬学的組成物によって処置されるがんのタイプには、癌腫、芽細胞腫および肉腫、ならびにある一定の白血病またはリンパ系悪性疾患、良性および悪性腫瘍、および悪性疾患、例えば肉腫、癌腫および黒色腫が含まれる。他の例示的ながんには、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵がん、結腸直腸がん、腎がん、肝がん、脳のがん、リンパ腫、白血病、肺がん、甲状腺がんなどがあるが、それらに限定されるわけではない。がんは非固形腫瘍（例えば血液腫瘍）または固形腫瘍でありうる。成人腫瘍/がんおよび小児腫瘍/がんも含まれる。一態様において、がんは固形腫瘍または血液腫瘍である。一態様において、がんは癌腫である。一態様において、がんは肉腫である。一態様において、がんは白血病である。一態様において、がんは固形腫瘍である。
固形腫瘍は、嚢胞または液状の領域を通常は含まない異常な組織塊である。固形腫瘍は良性である場合も悪性である場合もある。タイプの異なる固形腫瘍はそれらを形成する細胞のタイプにちなんで命名される（例えば肉腫、癌腫およびリンパ腫）。肉腫および癌腫などの固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系悪性疾患、膵がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫 皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌、黒色腫、およびCNS腫瘍（例えば神経膠腫（例えば脳幹神経膠腫および混合性神経膠腫）、膠芽腫（多形性神経膠芽腫としても公知である）星状細胞腫、CNSリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、シュワン細胞腫 頭蓋咽頭腫（craniopharyogioma）、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（menangioma）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫および脳転移）などがある。
本明細書に開示する方法による治療の対象となりうる癌腫には、食道癌、肝細胞癌、基底細胞癌（皮膚がんの一形態）、扁平上皮癌（さまざまな組織）、移行上皮癌（膀胱の悪性新生物）を含む膀胱癌、気管支原性癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌などの肺癌、副腎皮質癌、甲状腺癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、腎細胞癌、非浸潤性乳管癌（ductal carcinoma in situ）または胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、骨原性癌（osteogenic carcinoma）、上皮癌、および鼻咽頭癌が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
本明細書に開示する方法による治療の対象となりうる肉腫には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨原性肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（lymphangioendotheliosarcoma）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、および他の軟部組織肉腫が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
ある一定の例示的態様において、本発明の改変免疫細胞は、骨髄腫または骨髄腫に関係する状態を処置するために使用される。骨髄腫またはそれに関係する状態の例としては、軽鎖骨髄腫、非分泌型骨髄腫、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（monoclonal gamopathy）（MGUS）、形質細胞腫（例えば孤立性、多発性孤立性、髄外性形質細胞腫）、アミロイドーシス、および多発性骨髄腫が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。一態様において、本開示の方法は多発性骨髄腫を処置するために使用される。一態様において、本開示の方法は抵抗性骨髄腫を処置するために使用される。一態様において、本開示の方法は、再発骨髄腫を処置するために使用される。
ある一定の例示的態様において、本発明の改変免疫細胞は、黒色腫または黒色腫に関係する状態を処置するために使用される。黒色腫またはそれに関係する状態の例としては、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、または皮膚の黒色腫（例えば皮膚黒色腫、眼黒色腫、外陰部黒色腫、膣黒色腫、直腸黒色腫）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。一態様において、本開示の方法は皮膚黒色腫を処置するために使用される。一態様において、本開示の方法は抵抗性黒色腫を処置するために使用される。一態様において、本開示の方法は再発黒色腫を処置するために使用される。
さらに別の例示的態様において、本発明の改変免疫細胞は肉腫または肉腫に関係する状態を処置するために使用される。肉腫またはそれに関係する状態の例としては、血管肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、悪性末梢神経鞘腫、骨肉腫、多形性肉腫、横紋筋肉腫、および滑膜肉腫が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。一態様において、本開示の方法は滑膜肉腫を処置するために使用される。一態様において、本開示の方法は、粘液型/円形細胞型脂肪肉腫、分化型/脱分化型脂肪肉腫、および多形型脂肪肉腫などの脂肪肉腫を処置するために使用される。一態様において、本開示の方法は粘液型/円形細胞型脂肪肉腫を処置するために使用される。一態様において、本開示の方法は抵抗性肉腫を処置するために使用される。一態様において、本開示の方法は再発肉腫を処置するために使用される。
投与される本発明の細胞は、治療を受けている対象に関して、自家でありうる。
本発明の細胞の投与は、当業者に公知の任意の好都合な方法で実行されうる。本発明の細胞は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、埋植または移植によって対象に投与されうる。本明細書に記載する組成物は、患者に、経動脈投与、皮下投与、皮内投与、腫瘍内投与、節内投与、髄質内投与、筋肉内投与するか、静脈内（i.v.）注射によって投与するか、または腹腔内投与しうる。別の例では、本発明の細胞が、対象の炎症部位、対象の局所的疾患部位、リンパ節、器官、腫瘍などに、直接注射される。
いくつかの態様において、細胞は所望の投薬量で投与され、この投薬量は、いくつかの局面では、所望の用量もしくは所望の数の細胞もしくは細胞タイプおよび/または所望の比の細胞タイプを含む。したがって、細胞の投薬量は、いくつかの態様において、細胞の総数（または体重1kgあたりの数）と、所望の比の個々の集団またはサブタイプ、例えばCD4＋対CD8＋比とに基づく。いくつかの態様において、細胞の投薬量は、個々の集団または個々の細胞タイプにおける細胞の所望の総数（または体重1kgあたりの数）に基づく。いくつかの態様において、投薬量は、そのような特徴の組合せ、例えば所望の総細胞数、所望の比、および個々の集団における細胞の所望の総数に基づく。
いくつかの態様において、細胞の集団またはサブタイプ、例えばCD8＋T細胞およびCD4＋T細胞は、所望の総細胞用量の、例えば所望のT細胞用量の、許容差または許容差内で投与される。いくつかの局面において、所望の用量は、所望の細胞数であるか、または細胞が投与される対象の単位体重あたりの所望の細胞数、例えば細胞/kgである。いくつかの局面において、所望の用量は最小細胞数または単位体重あたりの最小細胞数であるか、またはそれを上回る。いくつかの局面において、所望の用量で投与される総細胞には、個々の集団またはサブタイプが、所望のアウトプット比（例えばCD4＋対CD8＋比）で、またはその近くで、例えばそのような比の一定の許容差または許容誤差内で存在する。
いくつかの態様において、細胞は、細胞の個々の集団またはサブタイプのうちの1つまたは複数の所望の用量、例えばCD4＋細胞の所望の用量および/またはCD8＋細胞の所望の用量の、許容差で、または許容差内で、投与される。いくつかの局面において、所望の用量は、サブタイプまたは集団の所望の細胞数であるか、または細胞が投与される対象の単位体重あたりのそのような細胞の所望の数、例えば細胞/kgである。いくつかの局面において、所望の用量は、集団またはサブタイプの最小細胞数または単位体重あたりの集団もしくはサブタイプの最小細胞数であるか、またはそれを上回る。したがって、いくつかの態様において、投薬量は、総細胞の所望の固定用量および所望の比に基づき、および/または個々のサブタイプもしくは亜集団のうちの1つまたは複数の、例えばそれぞれの、所望の固定量に基づく。したがって、いくつかの態様において、投薬量は、T細胞の所望の固定用量または最小用量およびCD4＋細胞対CD8＋細胞の所望の比に基づき、ならびに/またはCD4＋および/もしくはCD8＋細胞の所望の固定用量もしくは最小用量に基づく。
一定の態様において、細胞、または細胞のサブタイプの個々の集団は、対象に、約100万個～約1000億個の範囲で、例えば100万個～約500億個の細胞（例えば約500万個の細胞、約2500万個の細胞、約5億個の細胞、約10億個の細胞、約50億個の細胞、約200億個の細胞、約300億個の細胞、約400億個の細胞、または前述の値のうち任意の2つによって定義される範囲）など、例えば約1000万個～約1000億個の細胞（例えば約2000万個の細胞、約3000万個の細胞、約4000万個の細胞、約6000万個の細胞、約7000万個の細胞、約8000万個の細胞、約9000万個の細胞、約100億個の細胞、約250億個の細胞、約500億個の細胞、約750億個の細胞、約900億個の細胞、または前述の値のうち任意の2つによって定義される範囲）、場合によっては約1億個の細胞～約500億個の細胞（例えば約1.2億個の細胞、約2.5億個の細胞、約3.5億個の細胞、約4.5億個の細胞、約6.5億個の細胞、約8億個の細胞、約9億個の細胞、約30億個の細胞、約300億個の細胞、約450億個の細胞）またはこれらの範囲の間にある任意の値で、投与される。
いくつかの態様において、総細胞用量および/または個々の細胞亜集団の用量は、1×105もしくは約1×105細胞/kg～約1×1011細胞/kg、104～1011もしくは約1011細胞/キログラム（kg）体重、例えば105～106細胞/kg体重の範囲内にあり、例えば1×105細胞/kg、1.5×105細胞/kg、2×105細胞/kg、もしくは1×106細胞/kg体重、または約1×105細胞/kg、1.5×105細胞/kg、2×105細胞/kg、もしくは1×106細胞/kg体重である。例えばいくつかの態様において、細胞は、104もしくは約104～109もしくは約109 T細胞/キログラム（kg）体重、例えば105～106 T細胞/kg体重で、例えば1×105 T細胞/kg、1.5×105 T細胞/kg、2×105 T細胞/kg、もしくは1×106 T細胞/kg体重、または約1×105 T細胞/kg、1.5×105 T細胞/kg、2×105 T細胞/kg、もしくは1×106 T細胞/kg体重で、またはそのある一定の誤差範囲内で、投与される。別の例示的態様において、本開示の方法における使用に関して改変細胞の適切な投薬量範囲としては、約1×105細胞/kg～約1×106細胞/kg、約1×106細胞/kg～約1×107細胞/kg、約1×107細胞/kg～約1×108細胞/kg、約1×108細胞/kg～約1×109細胞/kg、約1×109細胞/kg～約1×1010細胞/kg、約1×1010細胞/kg～約1×1011細胞/kgが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。例示的一態様において、本開示の方法における使用に関して適切な投薬量は約1×108細胞/kgである。例示的一態様において、本開示の方法における使用に関して適切な投薬量は約1×107細胞/kgである。別の態様において、適切な投薬量は約1×107個の総細胞～約5×107個の総細胞である。いくつかの態様において、適切な投薬量は約1×108個の総細胞～約5×108個の総細胞である。いくつかの態様において、適切な投薬量は約1.4×107個の総細胞～約1.1×109個の総細胞である。例示的一態様において、本開示の方法における使用に関して適切な投薬量は約7×109個の総細胞数である。
いくつかの態様において、細胞は、104もしくは約104～109もしくは約109個のCD4＋および/もしくはCD8＋細胞/キログラム（kg）体重、例えば105～106個のCD4＋および/もしくはCD8＋細胞/kg体重で、例えば1×105個のCD4＋および/もしくはCD8＋細胞/kg、1.5×105個のCD4＋および/もしくはCD8＋細胞/kg、2×105個のCD4＋および/もしくはCD8＋細胞/kg、または1×106個のCD4＋および/もしくはCD8＋細胞/kg体重で、または約1×105個のCD4＋および/もしくはCD8＋細胞/kg、1.5×105個のCD4＋および/もしくはCD8＋細胞/kg、2×105個のCD4＋および/もしくはCD8＋細胞/kg、または1×106個のCD4＋および/もしくはCD8＋細胞/kg体重で、またはそのある一定の誤差範囲内で、投与される。いくつかの態様において、細胞は、約1×106、約2.5×106、約5×106、約7.5×106もしくは約9×106個超の、および/または少なくとも約1×106、約2.5×106、約5×106、約7.5×106もしくは約9×106個のCD4＋細胞、および/または少なくとも約1×106、約2.5×106、約5×106、約7.5×106もしくは約9×106個のCD8＋細胞、および/または少なくとも約1×106、約2.5×106、約5×106、約7.5×106、もしくは約9×106個のT細胞で、またはそのある一定の誤差範囲内で、投与される。いくつかの態様において、細胞は、約108～1012もしくは約1010～1011個のT細胞、約108～1012もしくは約1010～1011個のCD4＋細胞、および/または約108～1012もしくは約1010～1011個のCD8＋細胞で、またはそのある一定の誤差範囲内で、投与される。
いくつかの態様において、細胞は、複数の細胞集団またはサブタイプの、例えばCD4＋およびCD8＋細胞またはサブタイプの、所望のアウトプット比で、または所望のアウトプット比の許容範囲内で、投与される。いくつかの局面において、所望の比は、特定の比であるか、または比の範囲であることができる。例えばいくつかの態様において、所望の比（例えばCD4＋細胞対CD8＋細胞の比）は、5:1もしくは約5:1～5:1もしくは約5:1（すなわち約1:5より大きく約5:1より小さい）、または1:3もしくは約1:3～3:1もしくは約3:1（すなわち約1:3より大きく約3:1より小さい）、例えば2:1もしくは約2:1～1:5もしくは約1:5（すなわち約1:5より大きく約2:1より小さい、例えば5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9:1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、もしくは1:5、または約5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9:1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、もしくは1:5である。いくつかの局面において、許容差は、所望の比の約1％、約2％、約3％、約4％約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％以内であり、これらの範囲の間の任意の値を含む。
いくつかの態様において、改変細胞の用量は、それを必要とする対象に、単回投与または複数回投与で投与される。いくつかの態様において、改変細胞の用量は、複数回投与で、例えば1週間に1回または7日ごとに1回、2週間ごとに1回または14日ごとに1回、3週間ごとに1回または21日ごとに1回、4週間ごとに1回または28日ごとに1回、投与される。例示的一態様では、改変細胞の単回投与が、それを必要とする対象に投与される。例示的一態様において、改変細胞の単回投与は、それを必要とする対象に、迅速静脈内注入によって投与される。
疾患の防止または処置に関して、適当な投薬量は、処置される疾患のタイプ、細胞または組換え受容体のタイプ、疾患の重症度および経過、細胞が防止目的で投与されるのか治療目的で投与されるのか、治療歴、対象の臨床歴および細胞に対する応答、ならびに担当医の裁量に依存しうる。組成物および細胞は、いくつかの態様において、1回で、または一連の処置で、対象に適切に投与される。
いくつかの態様において、細胞は、別の治療的介入、例えば抗体または操作された細胞または受容体または作用物質、例えば細胞傷害性の作用物質または治療作用物質との併用処置の一部として、例えばそれらと同時に、または任意の順序で逐次的に、投与される。いくつかの態様において、細胞は、1つまたは複数の追加の治療作用物質と共投与されるか、または別の治療的介入と関連して、同時に、または任意の順序で逐次的に、共投与される。いくつかの状況において、細胞は、別の治療と、その細胞集団が1つまたは複数の追加の治療作用物質の効果を強化するように、またはその逆になるように、時間的に十分な近さで、共投与される。いくつかの態様において、細胞は1つまたは複数の追加の治療作用物質に先立って投与される。いくつかの態様において、細胞は1つまたは複数の追加の治療作用物質の後に投与される。いくつかの態様において、1つまたは複数の追加の作用物質は、例えば持続性を強化するために、IL-2などのサイトカインを含む。いくつかの態様において、本方法は化学治療剤の投与を含む。
ある一定の態様において、本発明の改変細胞（例えば（i）直交性キメラサイトカイン受容体と（ii）少なくとも1つのCARまたはTCRとを含む改変細胞）は、免疫チェックポイント抗体（例えば抗PD1抗体、抗CTLA-4抗体、または抗PDL1抗体）と組み合わせて対象に投与されうる。例えば改変細胞は、PD-1（プログラム死1タンパク質）などを標的とする抗体または抗体フラグメントと組み合わせて投与されうる。抗PD-1抗体の例としては、ペンブロリズマブ（KEYTRUDA（登録商標）、旧称ランブロリズマブ、MK-3475としても公知である）、およびニボルマブ（BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538、OPDIVA（登録商標））またはそれらの抗原結合フラグメントが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ある一定の態様において、改変細胞は、抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントと組み合わせて投与されうる。抗PD-L1抗体の例としては、BMS-936559、MPDL3280A（TECENTRIQ（登録商標）、アテゾリズマブ）およびMEDI4736（デュルバルマブ、イミフィンジ）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ある一定の態様において、改変細胞は、抗CTLA-4抗体またはその抗原結合フラグメントと組み合わせて投与されうる。抗CTLA-4抗体の例としては、イピリムマブ（商品名Yervoy）が挙げられるが、それに限定されるわけではない。低分子、siRNA、miRNA、およびCRISPRシステムなどといった他のタイプの免疫チェックポイントモジュレーターも使用しうるが、それに限定されるわけではない。免疫チェックポイントモジュレーターは、CARまたはTCRを含む改変細胞の前、後、またはそれと同時に投与されうる。ある一定の態様において、免疫チェックポイントモジュレーターを含む併用処置は、本発明の改変細胞を含む治療法の治療効力を増大させうる。
細胞の投与後は、いくつかの態様における改変細胞集団の生物学的活性が、例えば多数の公知の方法のいずれかによって測定される。評価するパラメータには、インビボでの、例えばイメージングによる、またはエクスビボでの、例えばELISAもしくはフローサイトメトリーによる、改変されたもしくは天然のT細胞または他の免疫細胞の、抗原への特異的結合が含まれる。一定の態様において、改変細胞が標的細胞を破壊する能力は、例えばKochenderfer et al.,J.Immunotherapy,32（7）:689-702（2009）、およびHerman et al.J.Immunological Methods,285（1）:25-40（2004）記載の細胞傷害性アッセイなど、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使って測定することができる。一定の態様において、細胞の生物学的活性は、1つまたは複数のサイトカイン、例えばCD107a、IFNγ、IL-2およびTNFの発現および/または分泌をアッセイすることによって測定される。いくつかの局面において、生物学的活性は、臨床アウトカム、例えば腫瘍負荷または腫瘍量の低減を評価することによって測定される。
ある一定の態様において、対象には二次的処置が提供される。二次的処置には、化学治療、放射線治療、外科手術および薬物治療が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
いくつかの態様において、対象には、養子細胞治療（例えばCAR T細胞治療）に先立ってコンディショニング治療を実施することができる。いくつかの態様において、コンディショニング治療は、有効量のシクロホスファミドを対象に投与する工程を含む。いくつかの態様において、コンディショニング治療は、有効量のフルダラビンを対象に投与する工程を含む。好ましい態様において、コンディショニング治療は、シクロホスファミドとフルダラビンとの組合せを有効量で対象に投与する工程を含む。養子細胞治療（例えばCAR T細胞治療）に先立つコンディショニング治療の実施は、養子細胞治療の効力を増大させうる。T細胞治療のために患者をコンディショニングする方法は米国特許第9,855,298号に記載されており、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
いくつかの態様において、本開示の具体的投薬レジメンの一つは、改変T細胞の投与に先立つリンパ球枯渇工程を含む。例示的一態様において、リンパ球枯渇工程は、シクロホスファミドおよび/またはフルダラビンの投与を含む。
いくつかの態様において、リンパ球枯渇工程は、約200mg/m2/日～約2000mg/m2/日（例えば200mg/m2/日、300mg/m2/日または500mg/m2/日）の用量のシクロホスファミドの投与を含む。例示的一態様において、シクロホスファミドの用量は約300mg/m2/日である。いくつかの態様において、リンパ球枯渇工程は、約20mg/m2/日～約900mg/m2/日（例えば20mg/m2/日、25mg/m2/日、30mg/m2/日または60mg/m2/日）の用量のフルダラビンの投与を含む。例示的一態様において、フルダラビンの用量は約30mg/m2/日である。
いくつかの態様において、リンパ球枯渇工程は、約200mg/m2/日～約2000mg/m2/日（例えば200mg/m2/日、300mg/m2/日または500mg/m2/日）の用量のシクロホスファミドと、約20mg/m2/日～約900mg/m2/日（例えば20mg/m2/日、25mg/m2/日、30mg/m2/日または60mg/m2/日）の用量のフルダラビンとの投与を含む。例示的一態様において、リンパ球枯渇工程は、約300mg/m2/日の用量のシクロホスファミドと約30mg/m2/日の用量のフルダラビンとの投与を含む。
例示的一態様において、シクロホスファミドの投与は3日間にわたる300mg/m2/日であり、フルダラビンの投与は3日間にわたる30mg/m2/日である。
リンパ球枯渇化学治療の投与は、0日目におけるT細胞（例えばCAR-T細胞、TCR-T細胞、改変T細胞など）の注入に対して、-6日目～-4日目に予定しうる（-1日のウインドウで、-7日目～-5日目の投与）。
例示的一態様において、がんを有する対象の場合、対象は、改変T細胞の投与の3日前に、静脈内注入による300mg/m2のシクロホスファミドを含むリンパ球枯渇化学治療を受ける。例示的一態様において、がんを有する対象の場合、対象は、改変T細胞の投与に先立ち、3日にわたって静脈内注入による300mg/m2のシクロホスファミドを含むリンパ球枯渇化学治療を受ける。
例示的一態様において、がんを有する対象の場合、対象は、約20mg/m2/日～約900mg/m2/日（例えば20mg/m2/日、25mg/m2/日、30mg/m2/日または60mg/m2/日）の用量のフルダラビンを含むリンパ球枯渇化学治療を受ける。例示的一態様において、がんを有する対象の場合、対象は、30mg/m2の用量のフルダラビンを含むリンパ球枯渇化学治療を、3日にわたって受ける。
例示的一態様において、がんを有する対象の場合、対象は、約200mg/m2/日～約2000mg/m2/日（例えば200mg/m2/日、300mg/m2/日または500mg/m2/日）の用量のシクロホスファミドと約20mg/m2/日～約900mg/m2/日（例えば20mg/m2/日、25mg/m2/日、30mg/m2/日または60mg/m2/日）の用量のフルダラビンとを含むリンパ球枯渇化学治療を受ける。例示的一態様において、がんを有する対象の場合、対象は、約300mg/m2/日の用量のシクロホスファミドと30mg/m2の用量のフルダラビンとを含むリンパ球枯渇化学治療を、3日にわたって受ける。
本発明の細胞は、適当な前臨床的および臨床的実験および治験において決定される投薬量および経路で、そのようにして決定された時点で、投与することができる。細胞組成物はこれらの範囲内の投薬量で複数回投与されうる。本発明の細胞の投与は、当業者によって決定される所望の疾患または状態を処置するのに有用な他の方法と、組み合わせうる。
CAR T細胞の注入後の有害作用の一つが、サイトカイン放出症候群（CRS）として公知である免疫活性化の発現であることは、当技術分野において公知である。CRSは、炎症性サイトカインの上昇をもたらす免疫活性化である。CRSは公知のオンターゲット毒性であり、その発生はおそらく効力と相関する。臨床的および検査的尺度（clinical and laboratory measures）は、軽度CRS（全身症状および/またはグレード2の臓器毒性）から重度CRS（sCRS;グレード3以上の臓器毒性、積極的臨床介入および/または生命に関わる恐れがある）までの範囲に及ぶ。臨床的特徴には、高熱、倦怠感、疲労、筋痛症、悪心、食欲不振、頻脈/低血圧、毛細血管漏出、心機能障害、腎障害、肝不全および播種性血管内血液凝固が含まれる。CAR T細胞注入後には、インターフェロン-ガンマ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、IL-10およびIL-6を含むサイトカインの劇的上昇が示されている。CRS特徴の一つは、IL-6（重度の上昇）、IFN-ガンマ、TNF-アルファ（中等度）およびIL-2（軽度）を含むサイトカインの上昇である。フェリチンおよびC反応性タンパク質（CRP）を含む臨床的に利用できる炎症マーカーの上昇も、CRS症候群と相関することが観察されている。CRSの存在は、一般に、養子移入された細胞の拡大および漸進的免疫活性化と相関する。腫瘍量の高い患者はより重篤なsCRSを起こすので、CRS重症度が注入時の疾病負荷によって決定されることも証明されている。
したがって本発明は、CRSの診断後に、操作された細胞（例えばCAR T細胞）の抗腫瘍効力を弱めることなく、制御されない炎症の生理学的症状を和らげるための、適当なCRS管理戦略を提供する。CRS管理戦略は当技術分野において公知である。例えば、初期抗腫瘍応答を損なうことなくsCRS（例えばグレード3のCRS）を迅速に反転させるために、全身性コルチコステロイドを投与しうる。
いくつかの態様では、抗IL-6R抗体を投与しうる。抗IL-6R抗体の一例は、食品医薬品局によって承認されたモノクローナル抗体トシリズマブであり、これはアトリズマブとしても公知である（ActemraまたはRoActemraとして販売されている）。トシリズマブは、インターロイキン-6受容体（IL-6R）に対するヒト化モノクローナル抗体である。トシリズマブの投与はCRSのほぼ即時の反転を示している。
CRSは一般に観察された症候群の重症度に基づいて管理され、介入は相応に調節される。CRS管理決定は、単に検査値だけでなく、臨床的徴候および症状ならびに介入に対する応答にも基づきうる。
軽度～中等度の症例は、一般に、十分な症状緩和のために、必要に応じて、輸液療法、非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）および抗ヒスタミン薬による症状管理によって処置される。より重度の症例には、あらゆる程度の血行動態不安定を持つ患者が含まれ、血行動態不安定はいずれも、トシリズマブの投与が推奨される。CRSの第一選択管理は、いくつかの態様では60分にわたる8mg/kg IVの表示用量（800mg/回を超えない）での、トシリズマブでありうる。トシリズマブは8時間ごとに繰り返すことができる。トシリズマブの1回目の投与に対する応答が最適未満である場合は、トシリズマブのさらなる投与を考慮しうる。トシリズマブは、単独で投与するか、またはコルチコステロイド療法と組み合わせて投与することができる。継続的または漸進的なCRS症状を呈するか、12～18時間での臨床的改善が不十分であるか、またはトシリズマブに対して応答不良である患者は、高用量コルチコステロイド療法、一般的にはヒドロコルチゾン100mg IVまたはメチルプレドニゾロン1～2mg/kgで処置されうる。血行動態不安定がより重症であるか、または呼吸器症状がより重症である患者の場合、CRSの経過の初期において、患者に高用量コルチコステロイド療法を実施しうる。CRS管理ガイダンスは公表された基準に基づきうる（Lee et al.（2019）Biol Blood Marrow Transplant,doi.org/10.1016/j.bbmt.2018.12.758、Neelapu et al.（2018）Nat Rev Clin Oncology,15:47、Teachey et al.（2016）Cancer Discov,6（6）:664-679）。
CAR-T治療で処置された患者では、マクロファージ活性化症候群（MAS）または血球貪食性リンパ組織球症（HLH）と合致する特徴が、CRSの臨床所見と同時に観察されている（Henter,2007）。MASは、CRSから起こる免疫活性化に対する反応と思われ、それゆえにCRSの症状発現とみなすべきである。MASはHLH（これも免疫刺激に対する反応である）に似ている。MASの臨床症候群は、高グレードの絶え間ない発熱、3つの系譜のうちの少なくとも2つを侵す血球減少、および肝脾腫大を特徴とする。これには、高い血清中フェリチン、可溶性インターロイキン-2受容体、およびトリグリセリド、ならびに循環ナチュラルキラー（NK）活性の減少が付随する。
本明細書記載のキメラ直交性サイトカイン受容体のいずれかをCARと共に発現するように操作された本明細書記載の免疫細胞を与える養子細胞治療では、オンターゲットオフ腫瘍毒性が強くなる可能性がある。したがって、ここでは、本養子細胞治療法（すなわちがんを処置する方法）が、ある一定の態様において、患者の安全性を最大化するために、付加的な細胞操作戦略（例えばオン/オフシステム、合成回路）をさらに含むことが想定される（例えばCaliendo,et al.,Front Bioeng Biotechnol.（2019）7:43参照。
一局面において、本発明には、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、本明細書に開示する改変免疫細胞または前駆細胞を該対象に投与する工程を含む方法が含まれる。本発明のさらに別の一局面には、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、本明細書に開示する方法のいずれかによって作成された改変免疫細胞または前駆細胞を該対象に投与する工程を含む方法が含まれる。
H. 免疫細胞の供給源
ある一定の態様では、免疫細胞（例えばT細胞）の供給源が、エクスビボ操作のために、対象から得られる。エクスビボ操作のための標的細胞の供給源には、例えば自家または非相同（heterologous）ドナーの血液、臍帯血、または骨髄も含まれうる。例えば免疫細胞の供給源は、対象の血液、対象の臍帯血または対象の骨髄など、本発明の改変免疫細胞で処置される対象に由来しうる。対象の非限定的な例として、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が挙げられる。好ましくは、対象はヒトである。
免疫細胞は、血液、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、臍帯、リンパ、またはリンパ器官を含むいくつかの供給源から得ることができる。免疫細胞は、免疫系の細胞、例えば自然免疫または適応免疫の細胞、例えば骨髄系もしくはリンパ系の細胞、例えばリンパ球、典型的にはT細胞および/またはNK細胞である。他の例示的細胞としては、誘導多能性幹細胞（iPSC）を含む、複能性および多能性幹細胞などの幹細胞が挙げられる。いくつかの局面において、細胞はヒト細胞である。処置される対象に関して、細胞は、同種異系および/または自家でありうる。細胞は典型的には初代細胞、例えば対象から直接単離されたものおよび/または対象から単離され凍結されたものである。
ある一定の態様において、免疫細胞は、T細胞、例えばCD8＋T細胞（例えばCD8＋ナイーブT細胞、セントラルメモリーT細胞またはエフェクターメモリーT細胞）、CD4＋T細胞、ナチュラルキラーT細胞（NKT細胞）、制御性T細胞（Treg）、幹細胞メモリーT細胞、リンパ系前駆細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞（NK細胞）または樹状細胞である。いくつかの態様において、細胞は単球または顆粒球、例えば骨髄性細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、肥満細胞、好酸球、および/または好塩基球である。一態様において、標的細胞は、誘導多能性幹（iPS）細胞またはiPS細胞由来の細胞、例えば対象から作成され、1つまたは複数の標的遺伝子を変化させる（例えばそこでの変異を誘導する）かまたはその発現を操作するために操作され、例えばT細胞、例えばCD8＋T細胞（例えばCD8＋ナイーブT細胞、セントラルメモリーT細胞またはエフェクターメモリーT細胞）、CD4＋T細胞、幹細胞メモリーT細胞、リンパ系前駆細胞または造血幹細胞に分化させたiPS細胞である。
いくつかの態様において、細胞には、T細胞または他の細胞タイプの1つまたは複数のサブセット、例えば全T細胞集団、CD4＋細胞、CD8＋細胞およびそれらの亜集団、例えば機能、活性化状態、成熟度、分化能、拡大能、再循環能、局在化能、および/もしくは持続能、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の器官もしくはコンパートメントにおける存在、マーカーもしくはサイトカイン分泌プロファイル、ならびに/または分化度によって定義されるものが含まれる。T細胞の、および/またはCD4＋T細胞の、および/またはCD8＋T細胞の、サブタイプおよび亜集団には、ナイーブT（TN）細胞、エフェクターT細胞（TEFF）、メモリーT細胞およびそのサブタイプ、例えば幹細胞メモリーT（TSCM）細胞、セントラルメモリーT（TCM）細胞、エフェクターメモリーT（TEM）細胞または最終分化エフェクターメモリーT細胞、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、未成熟T細胞、成熟T細胞、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、粘膜関連インバリアントT（MAIT）細胞、内在性および誘導性制御性T（Treg）細胞、ヘルパーT細胞、例えばTH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾胞ヘルパーT細胞、アルファ/ベータT細胞、およびデルタ/ガンマT細胞がある。ある一定の態様において、当技術分野において入手可能ないくつものT細胞株は、いずれも使用しうる。
いくつかの態様において、本方法は、対象から免疫細胞を単離し、それらを調製し、処理し、培養し、および/または操作する工程を含む。いくつかの態様において、操作された細胞の調製は、1つまたは複数の培養工程および/または調製工程を含む。記載のように操作するための細胞は、試料、例えば生物学的試料、例えば対象から得られるものまたは対象に由来するものから、単離されうる。いくつかの態様において、細胞が単離される対象は、疾患もしくは状態を有するか、または細胞治療を必要とするか、または細胞治療が実施される対象である。いくつかの態様における対象は、特定の治療的介入、例えば養子細胞治療であってそのために細胞が単離、処理および/または操作されているものを必要とするヒトである。したがって細胞は、いくつかの態様において、初代細胞、例えば初代ヒト細胞である。試料には、対象から直接採取される組織、体液その他の試料、ならびに分離、遠心分離、遺伝子改変（例えばウイルスベクターによる形質導入）、洗浄および/またはインキュベーションなどといった1つまたは複数の処理工程の結果得られる試料が含まれる。生物学的試料は、生物学的供給源から直接取得される試料、または処理された試料であることができる。生物学的試料としては、体液、例えば血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿および汗、組織および器官の試料が挙げられ、それらに由来する処理された試料も含まれるが、それらに限定されるわけではない。
いくつかの局面において、細胞が由来するまたは細胞が単離される試料は、血液もしくは血液由来の試料であるか、またはアフェレーシス産物もしくは白血球アフェレーシス産物であるか、またはアフェレーシス産物もしくは白血球アフェレーシス産物に由来する。例示的な試料として、全血、末梢血単核球（PBMC）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、腸管関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓、他のリンパ組織、肝臓、肺、胃、腸、結腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸部、精巣、卵巣、扁桃、もしくは他の器官、および/またはそれに由来する細胞が挙げられる。細胞治療、例えば養子細胞治療との関連において、試料には、自家供給源および同種異系供給源からの試料が含まれる。
いくつかの態様において、細胞は、細胞株、例えばT細胞株に由来する。細胞は、いくつかの態様において、異種供給源、例えばマウス、ラット、非ヒト霊長類およびブタから得られる。いくつかの態様において、細胞の単離は、1つまたは複数の調製工程および/または非アフィニティーベースの細胞分離工程を含む。いくつかの例では、例えば不要な構成要素を除去し、所望の構成要素を富化し、特定の試薬に対して感受性である細胞を溶解し、または取り出すために、細胞を洗浄し、遠心分離し、および/または1つもしくは複数の試薬の存在下でインキュベートする。いくつかの例では、1つまたは複数の性質、例えば密度、付着性、サイズ、特定の構成要素に対する感受性および/または耐性に基づいて、細胞が分離される。
いくつかの例では、対象の循環血から、例えばアフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって、細胞が得られる。試料は、いくつかの局面において、T細胞、単球、顆粒球、B細胞を含むリンパ球、他の有核白血球、赤血球および/または血小板を含有し、いくつかの局面では、赤血球および血小板以外の細胞を含有する。いくつかの態様では、例えば血漿画分を除去し、後続の処理工程にとって適当な緩衝液または培地に細胞を入れるために、対象から収集された血液細胞が洗浄される。いくつかの態様において、細胞はリン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄される。いくつかの局面において、洗浄工程は、タンジェンシャルフロー濾過（TFF）により、製造者の説明書に従って遂行される。いくつかの態様において、細胞は、洗浄後に、種々の生体適合性緩衝液に再懸濁される。一定の態様では、血液細胞試料の構成要素が取り出され、細胞が培養培地に直接、再懸濁される。いくつかの態様において、本方法は、密度に基づく細胞分離方法、例えば赤血球の溶解とPercollまたはFicoll勾配による遠心分離とによる末梢血からの白血球の調製を含む。
一態様において、個体の循環血から得られる免疫細胞は、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は典型的には、T細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含有する。血漿画分を除去するためおよび細胞をリン酸緩衝食塩水（PBS）などの適当な緩衝液または培地に入れるために、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄することができ、または洗浄溶液は、後続の処理工程のために、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠いてもよく、あるいはすべてではないとしても多くの二価カチオンを欠いてもよい。洗浄後は、細胞を、さまざまな生体適合性緩衝液、例えばCa非含有Mg非含有PBSなどに再懸濁しうる。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない構成要素を除去し、細胞を培養培地に直接、再懸濁してもよい。
いくつかの態様において、単離方法は、細胞における1つまたは複数の特異的分子、例えば表面マーカー、例えば表面タンパク質、細胞内マーカーまたは核酸の、発現または存在に基づく、異なる細胞タイプの分離を含む。いくつかの態様では、そのようなマーカーに基づく公知の分離方法をいずれも使用しうる。いくつかの態様において、分離はアフィニティーまたはイムノアフィニティーに基づく分離である。例えば単離は、いくつかの局面において、1種または複数種のマーカー、典型的には細胞表面マーカーの、細胞での発現または発現レベルに基づく、例えば当該マーカーに特異的に結合する抗体または結合パートナーとのインキュベーションと、それに続く、一般的には洗浄工程および前記抗体または結合パートナーに結合している細胞の、前記抗体または結合パートナーに結合していない細胞からの分離とによる、細胞および細胞集団の分離を含む。
そのような分離工程は、試薬に結合した細胞がさらなる使用のために保持される正の選択に基づき、および/または抗体もしくは結合パートナーに結合していない細胞が保持される負の選択に基づくことができる。いくつかの例では、両方の画分がさらなる使用のために保持される。いくつかの局面において、負の選択は、不均一な集団中のある細胞タイプを特異的に同定する抗体が利用可能でない場合には、特に役立ち、分離は、所望の集団以外の細胞によって発現されるマーカーに基づいて最もうまく実行される。分離が、特定細胞集団または特定マーカーを発現する細胞の100％のエンリッチメントまたは除去をもたらす必要はない。例えば、特定タイプの細胞、例えばあるマーカーを発現する細胞についての正の選択またはエンリッチメントとは、そのような細胞の数またはパーセンテージを増加させることを指すが、そのマーカーを発現しない細胞の完全な欠如をもたらす必要はない。同様に、特定タイプの細胞、例えばあるマーカーを発現する細胞の負の選択、除去または枯渇とは、そのような細胞の数またはパーセンテージを減少させることを指すが、すべてのそのような細胞の完全な除去をもたらす必要はない。
いくつかの例では、複数ラウンドの分離工程が実行され、この場合は、ある工程からの正または負に選択された画分が、別の工程、例えば後続の正または負の選択に供される。いくつかの例では、細胞を、それぞれが負の選択のための標的となるマーカーに特異的な複数の抗体または結合パートナーと共にインキュベートすることなどにより、単一の分離工程で、複数のマーカーを発現する細胞を同時に枯渇させることができる。同様に、細胞を、さまざまな細胞タイプ上に発現する複数の抗体または結合パートナーと共にインキュベートすることにより、複数の細胞タイプを同時に正に選択することもできる。
いくつかの態様では、T細胞集団のうちの1つまたは複数に対して、1種もしくは複数種の特定マーカー、例えば表面マーカーについて陽性である（マーカー＋）細胞、または高レベルの1種もしくは複数種の特定マーカー、例えば表面マーカーを発現する（マーカーhigh）細胞、または1種もしくは複数種のマーカーについて陰性である（マーカー-）細胞、または相対的に低レベルの1種もしくは複数種のマーカーを発現する（マーカーlow）細胞についてのエンリッチメントまたは枯渇が行われる。例えば、いくつかの局面では、T細胞の特定亜集団、例えば1種または複数種の表面マーカーが陽性であるかまたはそれらを高レベルに発現する細胞、例えばCD28＋、CD62L＋、CCR7＋、CD27＋、CD127＋、CD4＋、CD8＋、CD45RA＋および/またはCD45RO＋T細胞が、正または負の選択技法によって単離される。場合により、そのようなマーカーは、T細胞のある一定の集団（例えば非メモリー細胞）には存在しないか比較的低レベルに発現するが、T細胞の別のある一定の集団（例えばメモリー細胞）には存在しまたは比較的高レベルに発現するものである。一態様において、細胞（例えばCD8＋細胞またはT細胞、例えばCD3＋細胞）には、CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127および/もしくはCD62Lについて陽性であるかまたはそれらを高い表面レベルで発現させる細胞のエンリッチメント（すなわち正の選択）、および/またはCD45RAについて陽性であるかもしくはCD45RAを高い表面レベルで発現させる細胞の枯渇（例えば負の選択）が行われる。いくつかの態様において、細胞には、CD122、CD95、CD25、CD27および/もしくはIL7-Ra（CD127）について陽性であるかまたはそれらを高い表面レベルで発現させる細胞についてのエンリッチメントまたは枯渇が行われる。いくつかの例において、CD8＋T細胞には、CD45RO陽性（またはCD45RA陰性）およびCD62L陽性である細胞についてのエンリッチメントが行われる。例えば、CD3＋、CD28＋T細胞は、CD3/CD28コンジュゲート磁気ビーズ（例えばDYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 T Cell Expander）を使って正に選択することができる。
いくつかの態様において、T細胞は、B細胞、単球、または他の白血球などの非T細胞上に発現されるマーカー、例えばCD14の負の選択によって、PBMC試料から分離される。いくつかの局面では、CD4＋またはCD8＋選択工程が、CD4＋ヘルパーT細胞およびCD8＋細胞傷害性T細胞を分離するために用いられる。そのようなCD4＋およびCD8＋集団は、1つまたは複数のナイーブ、メモリー、および/またはエフェクターT細胞亜集団上に発現されるか、または比較的高度に発現されるマーカーについての正または負の選択によって、亜集団へとさらに選別することができる。いくつかの態様において、CD8＋細胞には、例えばそれぞれの亜集団と関連する表面抗原に基づく正または負の選択などにより、ナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリー、および/またはセントラルメモリー幹細胞のさらなるエンリッチメントまたは枯渇が行われる。いくつかの態様では、セントラルメモリーT（TCM）細胞のエンリッチメントを行うことで、効力の増加、例えば投与後の長期生存率、拡大および/または生着の改良がなされ、これは、いくつかの局面では、そのような亜集団では特にロバストである。いくつかの態様では、TCMがエンリッチされたCD8＋T細胞とCD4＋T細胞とを組み合わせることにより、効力がさらに強化される。
いくつかの態様において、メモリーT細胞は、CD8＋末梢血リンパ球のCD62L＋およびCD62L-の両方のサブセット中に存在する。PBMCには、抗CD8抗体および抗CD62L抗体を使用することなどにより、CD62L-CD8＋および/またはCD62L＋CD8＋画分についてのエンリッチメントまたは枯渇を行うことができる。いくつかの態様において、CD4＋T細胞集団およびCD8＋T細胞亜集団、例えばセントラルメモリー（TCM）細胞についてエンリッチされた亜集団。いくつかの態様において、セントラルメモリーT（TCM）細胞のエンリッチメントは、CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、および/またはCD127の陽性または高い表面発現に基づき、いくつかの局面では、それは、CD45RAおよび/またはグランザイムBを発現または高発現する細胞の負の選択に基づく。いくつかの局面において、TCM細胞がエンリッチされたCD8＋集団の単離は、CD4、CD14、CD45RAを発現する細胞の枯渇、およびCD62Lを発現する細胞の正の選択またはエンリッチメントによって実行される。一局面において、セントラルメモリーT（TCM）細胞のエンリッチメントは、CD4発現に基づいて選択された細胞の陰性画分から出発して実行され、該画分は、CD14およびCD45RAの発現に基づく負の選択、ならびにCD62Lに基づく正の選択に供される。そのような選択は、いくつかの局面では、同時に実行され、別の局面では、逐次的に、いずれかの順序で実行される。いくつかの局面では、CD8＋細胞集団またはCD8＋細胞亜集団の調製に使用されるものと同じCD4発現に基づく選択工程が、CD4＋細胞集団またはCD4＋細胞亜集団の作成にも使用され、したがってCD4に基づく分離による陽性画分と陰性画分はどちらも保持されて、任意で1つまたは複数のさらなる正または負の選択後に、本方法の後続工程において使用される。
CD4＋Tヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することによってナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、およびエフェクター細胞に選別される。CD4＋リンパ球は標準的な方法によって得ることができる。いくつかの態様において、ナイーブCD4＋Tリンパ球はCD45RO-、CD45RA＋、CD62L＋、CD4＋T細胞である。いくつかの態様において、セントラルメモリーCD4＋細胞はCD62L＋およびCD45RO＋である。いくつかの態様において、エフェクターCD4＋細胞はCD62L-およびCD45ROである。一例において、負の選択によってCD4＋細胞をエンリッチするために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DRおよびCD8に対する抗体を含む。いくつかの態様では、正の選択および/または負の選択のための細胞の分離が可能になるように、抗体または結合パートナーは、固形支持体またはマトリックス、例えば磁性ビーズまたは常磁性ビーズに結合される。
いくつかの態様において、細胞は、遺伝子操作に先立ってまたは遺伝子操作に関連して、インキュベートおよび/または培養される。インキュベーション工程は、培養、育成、刺激、活性化および/または増殖を含むことができる。いくつかの態様では、組成物または細胞が、刺激条件または刺激作用物質の存在下でインキュベートされる。そのような条件には、集団中の細胞の増殖、拡大、活性化、および/もしくは生存を誘導するように、および/または抗原曝露を模倣するように、および/または遺伝子改変のために、例えば組換え抗原受容体の導入のために、細胞をプライミングするように、設計されたものが含まれる。条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、作用物質、例えば栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオンおよび/または刺激因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、および細胞を活性化するように設計された他の任意の作用物質のうちの1つまたは複数を含むことができる。いくつかの態様において、刺激条件または刺激作用物質は、TCR複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる1つまたは複数の作用物質、例えばリガンドを含む。いくつかの局面において、作用物質は、T細胞におけるTCR/CD3細胞内シグナル伝達カスケードを作動させまたは開始する。そのような作用物質としては、例えばビーズなどの固形支持体に結合された抗体、例えばTCRの構成要素および/または共刺激受容体に特異的な抗体、例えば抗CD3、抗CD28、および/または1つもしくは複数のサイトカインを挙げることができる。任意で、拡大法は、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体を培養培地に（例えば少なくとも約0.5ng/mlの濃度で）添加する工程をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、刺激作用物質は、IL-2および/またはIL-15、例えば少なくとも約10単位/mLのIL-2濃度を含む。
別の一態様では、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、例えばPERCOLL（商標）勾配による遠心分離などによって、T細胞が末梢血から単離される。あるいは、T細胞を臍帯から単離することもできる。いずれにせよ、T細胞の特定亜集団を、正または負の選択技法によって、さらに単離することができる。
そうして単離された臍帯血単核球から、ある一定の抗原を発現する細胞、例えば限定するわけではないがCD34、CD8、CD14、CD19およびCD56を発現する細胞を、枯渇させることができる。これらの細胞の枯渇は、単離された抗体、抗体を含む生物学的試料、例えば腹水、物理的支持体に結合された抗体、および細胞に結合した抗体を使って達成することができる。
負の選択によるT細胞集団のエンリッチメントは、負に選択される細胞にユニークな表面マーカーに対する抗体の組合せを使って達成することができる。好ましい方法は、負に選択される細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用する負の磁気免疫付着（negative magnetic immunoadherence）またはフローサイトメトリーによる細胞の選別および/または選択である。例えば、負の選択によってCD4＋細胞をエンリッチする場合、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DRおよびCD8に対する抗体を含む。
正の選択または負の選択によって所望の細胞集団を単離する場合、細胞および表面（例えばビーズなどの粒子）の濃度はさまざまであることができる。一定の態様では、細胞とビーズの接触が確実に最大になるように、ビーズおよび細胞を一つに混合する時の体積を著しく減少させる（すなわち細胞の濃度を増加させる）ことが望ましいだろう。例えば一態様では、20億細胞/mlの濃度が使用される。一態様では、10億細胞/mlの濃度が使用される。さらなる一態様では、1億細胞/ml超が使用される。さらなる一態様では、1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万または5000万細胞/mlの細胞濃度が使用される。さらに別の一態様では、7500万、8000万、8500万、9000万、9500万、または1億細胞/mlからの細胞濃度が使用される。さらなる態様では、1億2500万または1億5000万細胞/mlの濃度を使用することができる。高濃度の使用は、増加した細胞収量、細胞活性化、および細胞拡大をもたらすことができる。
T細胞は洗浄工程後に凍結することもでき、これは単球除去工程を必要としない。理論に束縛されることは望まないが、凍結とそれに続く解凍工程は細胞集団中の顆粒球と、ある程度は単球とを除去することによって、より一様な産物を与える。血漿および血小板を除去する洗浄工程後に、細胞を凍結溶液に懸濁しうる。数多くの凍結溶液および凍結パラメータが当技術分野では公知であり、この状況下で有用であるだろうが、限定でない一例として、ある方法では、20％DMSOおよび8％ヒト血清アルブミンを含有するPBSまたは他の適切な細胞凍結培地を使用する。次に細胞を毎分1℃の速度で-80℃まで凍結し、液体窒素貯蔵タンクの蒸気相で貯蔵する。他の制御された凍結方法も、-20℃または液体窒素中で直ちに行われる無制御な凍結と共に使用しうる。
一態様において、T細胞の集団は、末梢血単核球、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株などの細胞内に含まれる。別の一態様では、末梢血単核球がT細胞の集団を含む。さらに別の一態様では、精製されたT細胞がT細胞の集団を含む。
ある一定の態様では、制御性T細胞（Treg）を試料から単離することができる。試料としては、臍帯血または末梢血が挙げられるが、それらに限定すされるわけではない。ある一定の態様において、Tregは、フローサイトメトリー選別によって単離される。試料は、単離に先立ち、当技術分野において公知の任意の手段によって、Tregをエンリッチすることができる。単離されたTregは、使用に先立って、冷凍保存しおよび/または拡大することができる。Tregを単離するための方法は、米国特許第7,754,482号、同第8,722,400号および同第9,555,105号ならびに米国特許出願公開第13/639,927号に記載されており、それらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
I. 免疫細胞の拡大
CARまたはTCRを発現するように細胞を改変する前であれその後であれ、例えば米国特許第6,352,694号、同第6,534,055号、同第6,905,680号、同第6,692,964号、同第5,858,358号、同第6,887,466号、同第6,905,681号、同第7,144,575号、同第7,067,318号、同第7,172,869号、同第7,232,566号、同第7,175,843号、同第5,883,223号、同第6,905,874号、同第6,797,514号、同第6,867,041号および米国特許出願公開第20060121005号などに記載の方法を使って、細胞を活性化し、その数を拡大することができる。例えば本発明のT細胞は、CD3/TCR複合体関連シグナルを刺激する作用物質とT細胞表面上の共刺激分子を刺激するリガンドとが取り付けられている表面との接触によって、拡大させうる。具体的には、T細胞集団は、表面に固定化された抗CD3抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは抗CD2抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアと一緒にプロテインキナーゼC活性化因子（例えばブリオスタチン）と接触させることによって、刺激しうる。T細胞表面上のアクセサリー分子を共刺激するには、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えばT細胞を、T細胞の増殖を刺激するのに適当な条件下で、抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させることができる。抗CD28抗体の例には9.3、B-T3、XR-CD28（Diaclone、フランス・ブザンソン）などがあり、本発明では、それらを使用することができると共に、当技術分野において公知である他の方法および試薬類も同様に使用することができる。（例えばten Berge et al.,Transplant Proc.（1998）30（8）:3975-3977、Haanen et al.,J.Exp.Med.（1999）190（9）:1319-1328およびGarland et al.,J.Immunol.Methods（1999）227（1-2）:53-63を参照されたい）。
本明細書に開示する方法によるT細胞の拡大は、約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍またはそれ以上、およびそれらの間のありとあらゆる全または部分整数（whole or partial integers）倍に増殖されうる。一態様において、T細胞は、約20倍～約50倍の範囲で拡大する。
培養に続いて、T細胞は、培養装置中、細胞培地において、ある期間にわたってインキュベートするか、または最適な継代のために細胞がコンフルエントになるかもしくは高い細胞密度に達するまでインキュベートしてから、それらの細胞を別の培養装置に移すことができる。培養装置は、インビトロで細胞を培養するためによく使用される任意の培養装置であることができる。好ましくは、コンフルエンスのレベルは、別の培養装置に細胞を移す前に、70％以上である。より好ましくは、コンフルエンスのレベルは90％以上である。期間はインビトロでの細胞の培養に適した任意の時間であることができる。T細胞培地は、T細胞の培養中に、任意の時点で置き換えうる。好ましくは、T細胞培地は約2～3日ごとに置き換えられる。次に、T細胞は培養装置から収集され、その後、そのT細胞は直ちに使用するか、または後の使用に備えて貯蔵するために冷凍保存することができる。一態様において、本発明は、拡大されたT細胞を冷凍保存する工程を含む。冷凍保存されたT細胞は、T細胞中に核酸を導入する前に、融解される。
別の一態様において、本方法は、T細胞を単離する工程およびT細胞を拡大する工程を含む。別の一態様において、本発明は、T細胞を拡大前に冷凍保存する工程を、さらに含む。さらに別の一態様において、冷凍保存されたT細胞は、キメラ膜タンパク質をコードするRNAのエレクトロポレーションのために融解される。
エクスビボ拡大細胞のためのもう一つの手順は、米国特許第5,199,942号（これは参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。米国特許第5,199,942号に記載されているような拡大は、本明細書記載の他の拡大方法の代替になるか、またはそれらに追加されうる。簡単に述べると、T細胞のエクスビボ培養および拡大は、米国特許第5,199,942号記載の因子またはflt3-L、IL-1、IL-3およびc-kitリガンドなどの他の因子への添加を含む。一態様において、T細胞の拡大は、flt3-L、IL-1、IL-3およびc-kitリガンドからなる群より選択される因子と共にT細胞を培養することを含む。
本明細書記載の培養工程（本明細書記載の作用物質との接触、またはエレクトロポレーション後）は、例えば24時間未満、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23時間など、極めて短いものであることができる。本明細書においてさらに記載する培養工程（本明細書記載の作用物質との接触）は、それより長いもの、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14日またはそれ以上の日数であることができる。
培養下の細胞を記載するためにさまざまな用語が使用される。細胞培養とは、一般に、生きた生物から採取され制御された条件下で成育されている細胞を指す。初代細胞培養は、生物から直接採取された、1回目の植継ぎを行う前の、細胞、組織または器官の培養物である。細胞は、細胞の成長および/または分裂を助長して、より大きな細胞集団をもたらす条件下で、成長培地中に置かれた場合に、培養下で拡大される。細胞が培養下で拡大される場合、細胞増殖の速度は典型的には、細胞がその数を二倍にするのに必要な時間、別名、倍加時間によって測定される。
植継ぎの各回を継代という。細胞を植え継いだ場合、それらは継代されたという。特定の細胞集団または細胞株は、継代された回数によって呼ばれ、または特徴づけられる場合がある。例えば10回継代された培養細胞集団はP10培養と呼ばれうる。初代培養、すなわち組織から細胞を単離した後の最初の培養を、P0と称する。1回目の植継ぎ後は、細胞は、二次培養物（P1または継代第1代）と記載される。2回目の植継ぎ後は、細胞は三次培養物（P2または継代第2代）になるなどである。多くの集団が継代の期間中に倍加しうること、そしてそれゆえに、培養物の集団倍加数は継代数より大きいことは、当業者には理解されるだろう。継代間の期間中の細胞の拡大（すなわち集団倍加数）は、例えば限定するわけではないが播種密度、培養基、培地、および継代間の時間を含む多くの因子に依存する。
一態様において、細胞は、数時間（約3時間）～約14日間、またはその間の時間単位の整数値にわたって培養されうる。T細胞培養に取って適当な条件には、適当な培地（例えば最小必須培地またはRPMI培地1640またはX-vivo15（Lonza））が含まれ、これは、細胞の増殖と生存性にとって必要な因子、例えば血清（例えばウシ胎仔血清またはヒト血清）、インターロイキン-2（IL-2）、インスリン、IFN-ガンマ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF-ベータ、およびTNF-α、または細胞を成長させるための、当業者に公知の他の任意の添加剤を含有しうる。細胞を成長させるための他の添加剤としては、界面活性剤、プラスマネート、および還元剤、例えばN-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールなどを挙げることができるが、それらに限定されるわけではない。培地としては、無血清の、または適量の血清（または血漿）もしくは所定のホルモンセットおよび/またはT細胞の成長および拡大にとって十分な量のサイトカインを補足した、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンが添加されている、RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15およびX-Vivo 20、Optimizerを挙げることができる。抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンは実験的培養にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養には含まれない。標的細胞は、成長を支えるのに必要な条件下、例えば適当な温度（例えば37℃）および雰囲気（例えば空気＋5％CO2）に維持される。
T細胞を培養するために使用される培地は、T細胞を共刺激することができる作用物質を含みうる。例えばCD3を刺激することができる作用物質はCD3に対する抗体であり、CD28を刺激することができる作用物質はCD28に対する抗体である。本明細書に開示する方法によって単離される細胞は、およそ10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍、またはそれ以上に拡大することができる。一態様において、T細胞は、約20倍～約50倍の範囲で、またはそれ以上に、拡大する。一態様において、ヒト制御性T細胞は抗CD3抗体で被覆されたKT64.86人工抗原提示細胞（aAPC）によって拡大される。T細胞を拡大し活性化するための方法は、米国特許第7,754,482号、同第8,722,400号および同第9,555,105号に見いだすことができ、それらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
一態様において、T細胞を拡大する方法は、拡大されたT細胞をさらなる応用のために単離する工程を、さらに含むことができる。別の一態様において、拡大方法は、その後の、拡大されたT細胞のエレクトロポレーションと、それに続く培養を、さらに含むことができる。前記その後のエレクトロポレーションは、例えば拡大されたT細胞の形質導入、拡大されたT細胞のトランスフェクション、または拡大されたT細胞のエレクトロポレーションを核酸を使って行うなど、拡大されたT細胞集団中に作用物質をコードする核酸を導入する工程を含むことができ、その作用物質はT細胞をさらに刺激する。作用物質は、例えばさらなる拡大、エフェクター機能、または別のT細胞機能を刺激することなどによって、T細胞を刺激しうる。
J. 薬学的組成物および製剤
また、本発明の免疫細胞の集団、そのような細胞を含有しおよび/またはそのような細胞がエンリッチされた組成物であって、例えば直交性キメラサイトカイン受容体を発現する細胞または直交性キメラサイトカイン受容体と少なくとも1つのCARもしくはTCRとを共発現する細胞が、T細胞またはCD8＋もしくはCD4＋細胞などといったある一定のタイプの組成物または細胞中の総細胞数のうちの少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上を占めるものも、提供される。組成物には、投与のための、例えば養子細胞療法のための、薬学的組成物および製剤が含まれる。対象、例えば患者に、該細胞および組成物を投与するための治療方法も、提供される。
投与のための細胞を含む組成物、例えば薬学的組成物および製剤、例えば所与の用量またはその何分の一かの、投与される細胞数を含む単位用量型組成物なども、提供される。薬学的組成物および製剤は一般に、1つまたは複数の随意の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。いくつかの態様において、組成物は少なくとも1つの追加の治療剤を含む。
「薬学的製剤」という用語は、そこに含有される活性成分の生物学的活性が有効であることを許すような形態にあって、その製剤を投与されることになる対象にとって、許容できないほどに毒性な追加の構成要素を含有しない調製物を指す。「薬学的に許容される担体」とは、対象にとって無毒である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤または保存剤が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの局面において、担体の選択は、一つには、その特定細胞によって、および/または投与方法によって決まる。したがって、種々の適切な製剤がある。例えば薬学的組成物は保存剤を含有することができる。適切な保存剤としては、例えばメチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、および塩化ベンザルコニウムを挙げることができる。いくつかの局面では、2種以上の保存剤の混合物が使用される。保存剤またはその混合物は、典型的には、組成物全体の約0.0001重量％～約2重量％の量で存在する。担体は、例えば「Remington's Pharmaceutical Sciences」第16版,Osol,A.編（1980）に記載されている。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量および濃度において受容者にとって一般に無毒性であり、これには、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤;酸化防止剤、例えばアスコルビン酸およびメチオニン;保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えばメチルパラベンまたはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール）;低分子量（約10残基未満）のポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリ（ビニルピロリドン）;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン;単糖、二糖および他の糖質、例えばグルコース、マンノースまたはデキストリン;キレート剤、例えばEDTA;糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属錯体（例えばZn-タンパク質錯体）;および/または非イオン界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（PEG）などがあるが、それらに限定されるわけではない。
いくつかの局面では、緩衝作用物質が組成物に含まれる。適切な緩衝作用物質としては、例えばクエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、ならびに他のさまざまな酸および塩が挙げられる。いくつかの局面では、2種以上の緩衝作用物質の混合物が使用される。緩衝作用物質またはその混合物は、典型的には、組成物全体の約0.001重量％～約4重量％の量で存在する。投与可能な薬学的組成物を調製するための方法は公知である。例示的な方法は、例えば「Remington:The Science and Practice of Pharmacy」Lippincott Williams＆Wilkins;第21版（2005年5月1日）に、より詳しく記載されている。
製剤は水溶液を含むことができる。製剤または組成物は、細胞で処置される特定の適応症、疾患または状態に有用な2種以上の活性成分、好ましくは細胞にとって補完的な活性を持つものも含有してよく、この場合、各活性は互いに悪影響を及ぼさない。そのような活性成分は、適宜、意図した目的に有効な量で組み合わされて存在する。したがっていくつかの態様において、薬学的組成物は、他の薬学的に活性な作用物質または薬物、例えば化学療法剤、例えばアスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、および/またはビンクリスチンなどを、さらに含む。薬学的組成物は、いくつかの態様において、治療有効量または予防有効量など、疾患または状態を治療または予防するのに十分な量の細胞を含有する。治療効力または予防効力は、いくつかの態様では、処置対象の定期的評価によってモニターされる。所望の投薬量は、細胞の単回ボーラス投与によって、または細胞の複数回のボーラス投与によって、または細胞の持続注入投与によって、送達することができる。
製剤には、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、肺投与、経皮投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、バッカル投与、舌下投与または坐薬投与用の製剤が含まれる。いくつかの態様において、細胞集団は非経口的に投与される。本明細書において使用される場合、用語「非経口」には、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与、膣内投与および腹腔内投与が含まれる。いくつかの態様において、細胞は、静脈内注射、腹腔内注射または皮下注射による末梢全身性送達を用いて対象に投与される。いくつかの態様における組成物は、滅菌液状調製物、例えば等張性水性の溶液、懸濁液、エマルション、分散液、または粘性組成物として提供され、それらは、いくつかの局面では、選択されたpHに緩衝化されうる。液状調製物は、通常は、ゲル、他の粘性組成物、および固形組成物よりも調製が容易である。加えて、液状組成物の方が、投与、特に注射による投与には、いくらか好都合である。一方で、粘性組成物は、特定の組織に関して、より長い接触期間を提供する適切な粘性範囲内で、製剤化することができる。液状組成物または粘性組成物は担体を含むことができ、担体は、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であることができる。
滅菌注射液は、細胞を溶媒中に、例えば適切な担体、希釈剤、または賦形剤、例えば滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどと混合するなどして組み入れることによって、調製することができる。組成物は、投与の経路および所望の製剤に応じて、例えば湿潤剤、分散剤または乳化剤（例えばメチルセルロース）、pH緩衝剤、ゲル化添加剤または増粘添加剤、保存剤、香料、および/または着色料などといった補助物質を含有することができる。適切な調製物を調製するために、いくつかの局面では、標準的なテキストを参照しうる。
抗微生物保存剤、酸化防止剤、キレート剤および緩衝剤など、組成物の安定性および滅菌性を向上させるさまざまな添加剤を加えることができる。微生物の作用の防止は、さまざまな抗細菌作用物質および抗真菌作用物質、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールおよびソルビン酸によって、確保することができる。注射可能な薬学的形態の持続的吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によって生じさせることができる。
インビボ投与に使用される製剤は一般に滅菌状態にある。滅菌性は例えば滅菌濾過膜による濾過などによって容易に達成することができる。
本明細書において言及または引用された論文、特許および特許出願、ならびに他のすべての文書および電子的に利用可能な情報の内容は、個々の刊行物について参照により本明細書に組み入れられることを具体的かつ個別に示した場合と同じ程度に、参照によりそれぞれのすべてが本明細書に組み入れられる。出願人は、任意のそのような論文、特許、特許出願または他の物理的および電子的文書からのありとあらゆる資料および情報を、本願に物理的に組み入れる権利を留保する。
本発明を、その具体的態様に関して説明したが、本発明の真の要旨および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更を加えうること、および等価物を代用しうることを、当業者は理解すべきである。本明細書に開示する態様の範囲から逸脱することなく、適切な等価物を使って、本明細書記載の方法の他の適切な改変および適応を行いうることは、当業者にはすぐにわかるだろう。さらにまた、特定の状況、材料、組成物、プロセス、1つまたは複数のプロセス工程を本発明の目的、要旨および範囲に適合させるために、多くの改変を加えうる。そのような改変はいずれも添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。ある一定の態様を上に詳しく説明したが、それらは、以下の実施例を参照することによって、より明確に理解されるだろう。以下の実施例は例示のために過ぎず、限定は意図していない。
実験例
以下に実施例を挙げて本発明を説明する。これらの実施例は例示を目的として提供されるに過ぎない。本発明がこれらの実施例に限定されることはなく、むしろ、本明細書において提供される教示内容の結果として明白なバリエーションはすべて、本開示に包含される。
材料および方法
タンパク質産生
マウスおよびヒトの野生型および直交性IL-2ならびに野生型IL-9をコードするDNAを、アフィニティー精製用のC末8×HISタグを含む昆虫発現ベクターpAcGP67-A中にクローニングした。マウス血清アルブミン（MSA）をコードするDNAをIntegrated DNA Technologies（IDT）から購入し、pAcGP67-A中にN末融合物としてクローニングした。昆虫発現DNA構築物を、分泌のためにBaculoGoldバキュロウイルス発現システム（BD Biosciences）を使ってイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）（High Five）細胞（Invitrogen）にトランスフェクトし、清澄化した上清をNi-NTAによって精製した後、Superdex-200カラムによるサイズ排除クロマトグラフィーで精製し、注射用滅菌リン酸緩衝食塩水（PBS）中に製剤化した。Proteus NoEndo HCスピンカラムキットを使用し製造社の推奨（VivaProducts）に従ってエンドトキシンを除去し、Pierce LAL発色エンドトキシン定量キット（ThermoFisher）を使ってエンドトキシンの除去を確認した。タンパク質を濃縮し、使用準備が整うまで-80℃で貯蔵した。
哺乳類発現ベクター
マウス直交性IL-2RβをコードするcDNA、ならびにIL4R、IL7R、IL9RおよびIL21Rのマウス細胞内ドメイン（ICD）をコードする遺伝子ブロック（geneblock）cDNA（Integrated DNA Tech）を、レトロウイルスベクターpMSCV-MCS-IRES-YFP中に、PCRとITAによってクローニングした。同様にヒト直交性IL2Rβおよびキメラ直交性IL9RをpMSCVベクターにクローニングした。
動物
マウスは、Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Careの承認を受けた動物施設において飼育され、カリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）、ペンシルベニア大学およびスタンフォード大学の施設内動物実験委員会によって承認されたプロトコールの下で使用した。UCLAで行われた実験については、C57BL/6Jマウスの繁殖と飼育がRadiation Oncology Vivariumにおいて行われ、C57BL/6バックグラウンドを持つpmel-1 TCR/Thy1.1トランスジェニックマウス（pmelマウス）はJackson Laboratoryから入手した。ペンシルベニア大学で行われた実験については、C57BL/6JマウスおよびB6 CD45.1「Pepboy」マウスが、Jackson Labsから購入された。
細胞株および細胞培養
B16-F10マウス黒色腫細胞株はATCCから購入し、10％ウシ胎仔血清（FBS、Omega Scientific）、ペニシリン（100U/mL、Omega Scientific）、ストレプトマイシン（100μg/mL、Omega Scientific）およびアンホテリシンB（0.25μg/ml、Omega Scientific）を含むL-グルタミン含有RPMI1640（Fisher Scientific）で培養した。KPC由来マウス膵がん細胞株PDA7940bは、10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補足したRPMI1640培地で維持した。ヒト黒色腫細胞株M407およびM263は、UCLA IRB承認番号11-003254の下に患者の生検から樹立され、10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補足したRPMI1640培地で維持した。M407細胞は、生細胞イメージングアッセイにおいて使用するために、核RFP（nRFP）を発現するように安定に形質導入された（Zaretsky,et al.,The New England Journal of Medicine,2016,375:819-829）。C57BL/6またはpmelトランスジェニックマウス由来のT細胞は、10％FBS（Hyclone Characterizedウシ胎仔血清）、抗生物質、50μM 2-メルカプトエタノール（Gibco）、1％NEAA、1％NaPyrおよびHEPESを補足したL-グルタミン含有RPMI1640中で培養した。初代ヒトT細胞は、10％FBS（Hyclone Characterizedウシ胎仔血清）、抗生物質、1％NEAA、1％NaPyrおよびHEPESを補足したL-グルタミン含有RPMI1640中で培養した。HEK293T細胞はATCCから購入し、10％FBS、1×GlutaMax（Gibco）ならびにペニシリンおよびストレプトマイシンを補足したDMEMで維持した。細胞株は定期的に認証され、マイコプラズマ感染についても、マイコプラズマ検出キット（Biotool）を使って、定期的に検査された。
レトロウイルス産生
直交性サイトカイン受容体をコードするレトロウイルスの産生は、以前に記載されている（Sockolosky et al.,Science（2018）359:1037-1042）。簡単に述べると、10cm組織培養ディッシュあたり3×106細胞のHEK293T細胞を播種し、一晩接着させた。X-tremeGENE HP（Roche）、Turbofect（ThermoFisher）またはTransIT試薬（Thermofisher）を使って、pMSCVレトロウイルスベクターとpCL-Ecoパッケージングベクターを1.5:1の比で細胞にトランスフェクトし、5％FBSを含有するDMEMで一晩培養した。24時間後に、培地を新鮮な5％FBS含有DMEMで置き換え、さらに24時間培養した。培地を収集し、遠心分離によって清澄化し、-80℃で貯蔵するために液体窒素中で瞬間凍結した。細胞に新鮮な5％FBS含有DMEMを補給し、さらに24時間培養し、レトロウイルス上清を収集して、記載のように貯蔵した。pmel T細胞およびヒトT細胞の形質導入のためのレトロウイルスを作成するには、同じ手順に以下の変更を加えて使用した:トランスフェクションの18時間後に培地を、20mM HEPESおよび10mM酪酸ナトリウムを含む10％FBS含有DMEMで置き換え、8時間インキュベートした。次に培地を、20mM HEPESを含み酪酸ナトリウムを含まない10％FBS含有DMEMで置き換え、一晩インキュベートした。翌日、培地を収集し、0.45μmフィルターで濾過した。すぐに使用しない場合は、後に使用するために、ウイルスを-80℃で凍結した。キメラ抗原受容体をコードするレトロウイルスは以前に記載されているように産生した（Watanabe et al.,JCI Insight（2018）3（7）:e99573）。簡単に述べると、Lipofectamine 2000（ThermoFisher）を使ってPlat-Eパッケージング細胞（Cell Biolabs）にpMSGVベクターをトランスフェクトした。培養培地を24時間後に置き換え、さらに24時間後に、培地を収集し、遠心分離によって清澄化し、0.45μmフィルターに通してから、-80℃で貯蔵した。
アデノウイルスの構築と精製
複製欠損性E1/E3欠失アデノウイルスベクターAd5-CMV-oIL2（Ad-oIL2）およびAd5-CMV-Null（Ad-Null）は、AdEasy（商標）XLアデノウイルスベクターシステム（Agilent）を使って構築した。5'KpnI制限部位と3'HindIII制限部位を持つマウス直交性IL-2クローン3A10 cDNAを合成し（GenScript）、pShuttle-CMV（Addgene）のマルチクローニングサイトにサブクローニングした。pAdEasy-1含有BJ5183-AD-1大腸菌（E.coli）細胞を、相同組換えのために、PmeIで線状化したpShuttle-CMV-oIL2で形質転換した。その結果生じた組換えAdプラスミドを配列検証し、XL10-Gold Ultracompetent細胞中で拡大してから、PacIで線状化し、HEK293T細胞にトランスフェクトした。複数ラウンドの増幅後に、塩化セシウム（CsCl2）勾配遠心分離によって、高力価アデノウイルスを精製した。Amicon Ultra-15遠心フィルターユニット（Millipore）を使ってCsCl2をA195緩衝液（Evans et al.,J Pharm Sci（2004）93:2458-2475）に交換した。ウイルス力価（VP/ml）は分光光度法（Nanodrop、ThermoFisher）で決定した。
活性化、レトロウイルス形質導入および初代マウスT細胞の選別
C57BL/6由来マウスT細胞のウイルス形質導入は以前に記載されている（Sockolosky et al.,Science（2018）359:1037-1042）。簡単に述べると、12ウェル組織培養プレートを、滅菌PBS中、抗マウスCD3ε（クローン145-2C11、Biolegend）の2.5μg/ml溶液で一晩コーティングした。単一細胞懸濁液を、6～8週齢のC57BL/6Jマウスの脾臓およびリンパ節から、70μmセルストレーナーによる解離とそれに続くACK溶解緩衝液（Gibco）でのRBC溶解によって調製した。100IU/ml組換えマウスIL-2を含有するマウスT細胞培地に細胞を再懸濁し、プレートに結合した抗マウスCD3εおよび可溶性抗マウスCD28（5ug/ml、クローン37.51、BioXCell）で24時間活性化した。活性化マウスT細胞に、ポリブレン（10ug/ml）および100IU/ml mIL-2を含有するレトロウイルス上清を使って、スピンフェクションにより、2600rpm、32℃で90分間、形質導入を行った。100IU/ml IL-2を含有する新鮮なマウスT細胞培地でウイルス上清を置き換え、24時間培養した。穏やかなピペッティングによって細胞をプレートから収集し、100IU/ml IL-2を含有する新鮮なT細胞に1×106/mlで再懸濁し、37℃で一晩拡大してから、さらに下流の細胞アッセイを行った。
pmel T細胞のレトロウイルス形質導入のために、形質導入の1～3日前に5～10週齢のpmelマウスから脾細胞を収集し、50U/mLマウスIL-2（Peprotech）および1μg/mLマウスgp100ペプチド（Anaspec）で活性化した。形質導入の1日前に6ウェル組織培養プレートをRetronectin（Takara）でコーティングし、4℃の冷蔵庫に一晩入れておいた。翌日、プレートをPBS中の0.5％FBSで30分間ブロッキングし、PBSで洗浄した。ウイルス上清（2mL）を各ウェルに加え、2000gで2時間遠心した。活性化されたpmel T細胞（3×106個）を50U/mLマウスIL-2と共に各ウェルに加え、2000gで10分間遠心してから、37℃で18～24時間培養した。次に、Aria IIセルソーター（BD Biosciences）を使って、生存可能な形質導入細胞を、YFPの発現と7-AADの排除とに基づいて選別し、一晩休ませてから、下流のインビトロまたはインビボアッセイに使用した。
マウスCAR T細胞のレトロウイルス形質導入は以前に記載されている（Watanabe et al.,JCI Insight（2018）3（7）:e99573）。簡単に述べると、初代ドナーCD45.1マウス脾細胞には、磁性ビーズ分離（Stemcell Technologies）によって、CD3＋細胞のエンリッチメントを行った。T細胞を、50U/ml組換えヒトIL-2（Peprotech）の存在下、マウスCD3/CD28 Dynabeads（ThermoFisher）で、48時間活性化してから、retronectin被覆（Takara Bio）プレートでのスピンフェクションを行った。スピンフェクションの2日後に細胞をインビトロアッセイ用または静脈内注射用に収集した。
初代ヒトT細胞の活性化、レトロウイルス形質導入および選別
健常ヒトドナー白血球アフェレーシスから単離された初代ヒト末梢血単核球（PBMC）を融解し、一晩休ませてから、抗ヒトCD3/28磁気Dynabeads（ThermoFisher）およびヒトIL-2（500U/mL）で、2日間活性化した。Retronectin（Takara）で被覆し、1mL/ウェルの各レトロウイルス（ho2RとNYESO1-TCRクローン1G4とをコードするか、またはho9RとNYESO1-TCRクローン1G4とをコードするもの）を負荷した6ウェルプレートで、スピンフェクションによって、T細胞を48時間、共形質導入した。活性化され形質導入された細胞を収集し、EasySep細胞分離磁石上に2分間置くことでビーズを除去した。細胞を抗ヒトVβ13.1 PE抗体（Beckman Coulter、NYESO1-TCRクローン1G4のβ鎖を認識する）および7-AAD生死判定色素で染色してから、YFP、Vβ13.1の発現および7-AADの排除に基づく細胞選別を、Aria IIセルソーター（BD Biosciences）を使って行った。
ホスホフロ（Phosphoflo）シグナル伝達アッセイ
活発に成長している初代マウスまたはヒトT細胞を、IL-2を欠くRPMI-Cで24時間休ませてから、シグナル伝達アッセイを行った。細胞を、50μlの温かいRPMI-C培地中、超低接着性96ウェル丸底プレートにプレーティングした。次に、組換えサイトカインの段階希釈液50μlを37℃で20分間添加することによって細胞を刺激し、撹拌しながらの1.5％PFAによる室温（RT）で15分間の固定によって、反応を終了させた。細胞を洗浄し、150μlの氷冷100％メタノールを使って氷上で60分間、透過処理するか、または-80℃で一晩貯蔵した。細胞をFACS緩衝液で洗浄してから、Alexa647で標識された抗STAT5 pY694（BD Biosciences）、抗STAT3（BD Biosciences）または抗STAT1（Cell Signaling）で染色し、FACS緩衝液で1:100希釈し、暗所、4℃で1時間、インキュベートした。細胞を洗浄し、CytoFlex（Beckman Coulter）で解析した。データは平均蛍光強度（MFI）を表し、Prism 8.4（GraphPad）を使って、ポイントを、log（アゴニスト）対用量応答モデルに当てはめた。
ウェスタンブロット
IL-2およびFBS飢餓CAR T細胞をサイトカインで20分間刺激し、タンパク質を抽出するために、プロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤カクテル（Halt、ThermoFisher）を補足した氷冷RIPA緩衝液で溶解した。30μgの総タンパク質をSDS-PAGEゲル（NuPage Bis-Tris、ThermoFisher）にローディングし、次にPVDFメンブレン（Immobilon-FL、Millipore）に転写した。pSTAT1/pSTAT3/pSTAT5およびGAPDHの検出は、それぞれの一次抗体と、それに続くIRDye標識二次抗体またはHRP連結二次抗体で行った。メンブレンをOdyssey CLx（LI-COR Biosciences）で撮像した。
マウスT細胞増殖アッセイ
活発に成長している初代マウスT細胞を、IL-2を欠くRPMI-Cで48時間休ませてから、CellTracer Violet（CTV、ThermoFisher）で標識した。標識された細胞を、96ウェル丸底プレートに、50μl中、50,000個のT細胞/ウェルで播種した。MSA-oIL2の段階希釈液（50μl）を総体積が100μlになるように加え、37℃で2日間培養した。2日目に、新鮮希釈サイトカイン（100μl）を細胞に加え、さらに2日間培養した。4日目に、CytoFlexを使って、CTV標識細胞増殖をFACSで評価した。生細胞ゲートはFSCおよびSSCに基づく。
丸底96ウェルプレートにMSA-oIL2またはMSA-IL2の存在下で50,000細胞/ウェルを播種することにより、CAR T細胞増殖を評価した。2日目に、細胞に新鮮な培地およびサイトカインを供給した。日々の細胞数は細胞のアリコートをカルセインAM生存性色素（ThermoFisher）で染色することによって取得し、Celigoイメージサイトメーター（Nexcelom Bioscience）で解析した。
サイトカインアッセイ
Luminexアッセイのために、形質導入されたCAR T細胞を、丸底96ウェルプレート中（200μl中、50,000細胞/ウェル）、3つ一組にして、サイトカインの存在下で4日間インキュベートした後、上清をTh1/Th2/Th9/Th17/Th22/Tregサイトカイン17プレックスマウスProcartaPlex（商標）パネル（ThermoFisher）で解析した。サイトカインビーズアレイ（Cytokine Bead Array）（BD Biosciences）を使用し、B16-F10のpmel T細胞との共培養物の上清から、製造者の説明書に従って、IFNγを個別に測定した。PDA7940b細胞（10,000細胞/ウェル、96ウェルプレート）からのoIL-2発現は、Ad-NullまたはAd-oIL2（100VP/細胞）による感染後のさまざまな時点における細胞培養上清で、マウスIL-2 ELISA（Abcam）によって評価した。インビボ発現は、PDA7940bにPBS、Ad-NullまたはAd-oIL2（1e9 VP/腫瘍）を注射し、72時間後に収集することによって評価した。腫瘍を3回の凍結融解サイクルで解離させ、ホモジネートをマウスIL-2についてELISAによって分析した。終末血（terminal blood）を心臓穿刺によって収集し、遠心分離によって血清に加工した。IL-2濃度を総タンパク質含量に対して正規化した。
リアルタイム細胞キリングアッセイ
PDA7940b腫瘍細胞を、96ウェルxCELLigence E-プレート（Agilent）に、10,000細胞/ウェルで播種した。24時間後に、oIL-2の存在下で48時間プレインキュベートした形質導入CAR T細胞を2:1の比で加え、リアルタイム細胞分析（RTCA）アナライザー（Agilent）で標的細胞インデックスを15分ごとに記録した。核局在性RFPが形質導入されたB16-F10細胞株のT細胞キリングは以前に記載されている（Kalbasi et al.,Science Translational Medicine（2020）12:eabb0152）。簡単に述べると、IncuCyte生細胞解析（Essen Bioscience）のために、100ng/mLのIFNγを18時間パルスしたB16-F10-RFP＋細胞を平底96ウェルプレートに、1ウェルあたり5,000細胞ずつ、3つ一組にしてプレーティングした。pmel T細胞（o2Rまたはo9R、MSA-IL2またはMSA-oIL2で48時間前処理）を2:1のエフェクター対標的比で加え、IncuCyteライブイメージングシステムを使って2時間ごとに各ウェルの2つの位相差像および蛍光像を得て、コンフルエント率によって定量した。ヒトT細胞繰り返しキリングアッセイ（repetitive killing assay）もIncuCyte生細胞解析を使って行った。ヒト黒色腫細胞（nRFP-M407、5×105個）を6ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。非形質導入または共形質導入ヒトT細胞（ho2R/NYESO1-TCRまたはho9R/NYESO1-TCRのいずれかを共形質導入し、MSA-hoIL2と共に48時間プレインキュベートしたもの）を、2つ一組にして、1:1のエフェクター:標的比で加えた。72時間ごとに黒色腫細胞（nRFP-M407、5×105個）を各ウェルに加え、各腫瘍再負荷の24時間前に直交性サイトカイン（MSA-hoIL2）を補給した。
インビボ腫瘍研究
インビボB16-F10腫瘍成長実験には、初期継代細胞株（継代数10未満）を使用した。B16-F10細胞（5×105個）をC57BL/6マウスの右側腹部に皮下注射した。表示がある場合、T細胞を養子移入する1日前に、500cGyの全身照射でマウスのリンパ球を枯渇させた。腫瘍接種のおよそ7日後または腫瘍が触知可能になった時にT細胞を養子移入した。具体的には、マウス1匹につき5×106個の選別されたT細胞を50μlのPBSに再懸濁し、後眼窩注射（retroorbital injection）によって投与した。表示がある場合、サイトカイン、すなわちマウス血清アルブミン（MSA）結合マウスIL-2（MSA-IL2）またはMSA直交性IL2（MSA-oIL2）（1日あたり25,000単位、腹腔内）による処置を、養子移入の日に開始して5日連続して、マウスに施した。腫瘍サイズ（長さ×幅）を週に3回、カリパスでモニターし、体積を（長さ×幅2）/2）として算出した。養子移入されたpmel T細胞をフローサイトメトリーによって定量するために、指定された時点で、末梢血（10μL）を尾静脈から収集した。総腫瘍体積が2000mm3を超えたら、マウスを安楽死させた。
同系PDA腫瘍モデルは以前に記載されている（Watanabe et al.,JCI Insight（2018）3（7）:e99573）。簡単に述べると、定着した皮下PDA7940b腫瘍を、PBS 50μl中の対照ウイルスAd-Null（1e9 VP/注射）またはAd-oIL2（1e9 VP/注射）で0日目および4日目に腫瘍内処置した。1日目にPBS 200μl中のCAR T細胞（5e6個の生CAR陽性細胞）を尾静脈注射によって投与した。シクロホスファミドプレコンディショニングを腹腔内注射（120mg/kg）によって-1日目に行った。デジタルカリパスで腫瘍寸法を測定し、体積を次のように算出した:体積＝（長さ×幅2）/2。治癒したマウスに、反対側の側腹部への皮下注射によってPDA7940b細胞を再び負荷し、24日後にカリパス測定によって腫瘍サイズを記録した。同齢のナイーブマウスに同じように注射し、腫瘍成長の対照とした。
フローおよびマスサイトメトリーによる免疫表現型検査
直交性サイトカイン受容体形質導入T細胞のインビトロ免疫表現型検査のために、選別されたT細胞を、等効力量のMSA-oIL2またはMSA-IL2と共に、3つ一組にしてプレーティングした。48時間後に、T細胞を収集し、表面染色した。インビボ評価のために、表示の時点における尾静脈試料採取により、末梢血を得た。剖検時に、70μmセルストレーナー上で脾臓を粉砕し、PBSで洗浄することにより、脾細胞を収集した。脾細胞試料および末梢血試料をACK溶解緩衝液で処理してから抗体染色を行った。
マウス腫瘍解離キット（Miltenyi Biotec）およびgentleMACS Octoディソシエーター（Miltenyi Biotec）を使って、B16腫瘍を細かく刻み、解離させた。次に細胞をPBSに再懸濁し、70μmセルストレーナーで濾過することで、単一細胞懸濁液を得た。
細胞を、リン酸緩衝食塩水（PBS）、5％ウシ胎仔血清および2mM EDTA中、4℃で30分間、抗体で染色した。抗体を図20に列挙する。7-AAD生存性色素を使って生細胞を死細胞と区別した。LSRFortessa（BD Biosciences）を使って、細胞をフローサイトメトリーで分析した。データはFlowJoソフトウェア（バージョン10、BD Biosciences）を使って解析した。
PDA7940b腫瘍を切除し、重量を測定し、小刀で細かく刻み、1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補足したRPMI1640中で、ヒアルロニダーゼ（2.5U/ml）、DNAse（50U/ml）、コラーゲンI/II/IV型（それぞれ75U/ml、35U/ml、75U/ml）からなる酵素カクテルを使って、解離させた。CD45（TIL）MicroBeadsを製造者の説明書（Miltenyi Biotec）に従って使用することにより、単一細胞腫瘍懸濁液からCD45陽性細胞を単離し、液体窒素中に貯蔵した。腫瘍浸潤CAR T細胞の定量は、CountBright Beads（ThermoFisher）を使って行い、腫瘍重量に対して正規化した。
マスサイトメトリーのために、細胞をまず、室温において、1.6％PFAで5分間固定した。細胞を10mLのMaxPar細胞染色緩衝液（Fluidigm）で洗浄し、970×g、4℃で10分間遠心した。次に、細胞を、表面抗体カクテルにRTで30分間再懸濁した。細胞を5mLのPBSで洗浄し、1mLの氷冷メタノールに氷上で15分間再懸濁した。細胞をMaxPar細胞染色緩衝液で再び洗浄し、RTにおいて、細胞内抗体カクテルで30分間染色した。最後に細胞を10mL MaxPar細胞染色緩衝液で洗浄し、1.6％PFAを含有するMaxpar固定・透過処理緩衝液（Fluidigmカタログ番号201067）に1:6000希釈したインターカレーション溶液（Cell-ID（商標）インターカレーター-Ir、カタログ番号201192B）を使って、4℃で一晩染色した。Fluidigm（登録商標）Helios（商標）（カリフォルニア州サンフランシスコ）マスサイトメーターを使ってデータを取得した。解析は、生きているシングレットCD45＋白血球またはCD8＋T細胞にゲートをかけたarcsinhスケールのデータに基づき、Omiq（カリフォルニア州サンフランシスコ）を使って行った。細胞をopt-SNEを使って二次元可視化に埋め込み、ユークリッド距離を用いるエルボーメタクラスタリングによるFlowSOMを使って、クラスター化した。存在量が異なるクラスターは、edgeRを使用し、0.05のp値有意閾およびlog（倍率変化）≧1で決定した。グラフはRパッケージggplotを使って作成した。
細胞内サイトカイン染色
ヒト共形質導入T細胞（ho2R/NYESO1-TCRまたはho9R/NYESO1-TCRのいずれか）を、最後の腫瘍負荷の72時間後および培養培地に直交性サイトカインを補給した24時間後に、繰り返し腫瘍負荷共培養から収集した。T細胞（1×105個）を、96ウェルプレートにおいて、ブレフェルジンAおよびモネンシンの存在下、抗ヒトCD3/CD28 Dynabeads（ThermoFisher）と共に、または黒色腫細胞と共に1:1のエフェクター:標的比（nRFP-M407またはM263）で、培養した。4時間後に細胞をRTで30分間表面染色し、固定し、細胞内サイトカイン染色のために、RTで30分間、透過処理した。PDA740b腫瘍からエンリッチされたCD45＋TILの細胞内サイトカイン染色のために、細胞活性化カクテル（ブレフェルジンA含有）（Cell Activation Cocktail（with Brefeldin A））（Biolegend）で細胞を6時間刺激し、Cyto-Fast（商標）固定/透過処理緩衝液セット（Biolegend）中で固定/透過処理し、抗IFNγ抗体で染色した。細胞を洗浄し、LSRII（BD Biosciences）を使って、フローサイトメトリーで分析した。データは、FlowJoソフトウェア（バージョン10、BD Biosciencesを使って解析した。
マルチプレックス免疫組織化学
ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍標本を、染色のために、ガラススライド上に厚さ4μmの切片として切り出した。この研究では、免疫蛍光（IF）染色にチラミドシグナル増幅（TSA）ベースのOpal法を使用した（Opal Polaris 7色自動IHCキット（7-Color Automation IHC Kit）、Akoya Biosciences、米国マサチューセッツ州モールバラ、カタログ番号NEL871001KT）。Opal発蛍光団は、製造者の推奨に従って、150分の1希釈で使用した。各バイオマーカーについて蛍光シングルプレックスを行い、適当な発色シングルプレックスを比較することで、染色性能を評価した。各標的がシングルプレックス染色で最適化されたら、Opal 6マルチプレックスアッセイを使って、スライドのマルチプレックス染色を行った。一次抗体を、対照としてのマウス脾臓標本に、対照組織のシングルプレックス染色について前もって決定しておいた最適化された濃度で適用した。染色はBOND RXシステム（Leica Biosystems）を使って行った。マルチプレックス染色の抗体の順序はFoxp3（opal 480）、CD4（opal 520）、PD-1（opal 570）、CD8（opal 620）およびCD3（opal 690）とした。染色は、Bondエピトープ回復溶液（Epitope Retrieval Solution）2（Leica Biosystems）を用いる20分間の熱誘導抗原回復後に行った。抗体を図20に列挙する。抗体は、1:200希釈液で、1時間のインキュベーションとした。すべての蛍光標識スライドをDAPIで対比染色し、Vectra Polaris（Akoya Biosciences）で、適当な露出時間を使用し、20倍の倍率でスキャンした。マルチスペクトルカメラからのデータをイメージングInFormソフトウェア（imaging InForm software）（Akoya Biosciences）によって解析し、HALO画像解析ソフトウェア（Indica Labs）を使って定量を行った。
組織病理学、臨床化学およびRNA ISH
CO2窒息によって動物を安楽死させた。死後直ちに血液（各群n＝3）を心臓穿刺によってMicrovetteチューブ（Sarstedt）に収集し、RTで30分間凝固させてから、12,000gで10分間遠心分離した。血清を分析まで-80℃で貯蔵した。血清中のサイトカインレベルをマウス25プレックスサイトカインパネル（IDEXX Bioanalytics）で測定した。Ca、P、Kおよび尿酸の血清中レベルは、カスタム臨床化学パネル（IDEXX Bioanalytics）で測定した。
すべての動物について、肉眼による死後検査を含む完全な剖検を行い、以下の臓器/組織を試料採取して、組織病理学的検査のために10％中性緩衝ホルマリンで固定した:頭部および脳、腰髄、背部の皮膚、耳介、大腿四頭筋、胸骨、唾液腺、喉頭および気管、食道、肺、心臓、胃腸管（GI tract）、腸間膜（mesenteric ligament）、膵臓、肝臓および胆嚢、生殖器官、腎臓、膀胱、肉眼的病変を示すあらゆる器官/組織。固定する前に、肝臓、右腎臓、左腎臓および心臓の重量を記録した。ホルマリン固定組織試料をRITAガイドライン（1、2、3）に従ってトリミングしてから、パラフィン包埋、薄切およびH＆E染色のために常法によって処理した。その結果得られたスライドは、実験デザインについて盲検化された委員会認定病理学者によって分析された。
髄膜におけるメソテリン発現およびCAR T細胞浸潤の分布を、CARおよびオルソ受容体をT細胞に形質導入するために使用されたマウスレトロウイルスに対して設計されたカスタムプローブを含むマルチプレックス蛍光RNAインサイチューハイブリダイゼーション（RNAscope（登録商標）マルチプレックス蛍光アッセイ、ACD Bio）によって調べた。ホルマリン固定パラフィン包埋脳切片でアッセイを行った。結果として得られた蛍光標識切片の全スライドイメージングは、Aperio VERSA 200スライドスキャナー（Leica Biosystems）を使って行った。最後に、Aperio ImageScopeソフトウェア（Leica Biosystems）に含まれているオブジェクトカウントツールを使って、CAR T細胞およびメソテリン陽性細胞をカウントした。
RNAシーケンシングおよび解析
図7H～7Jに記載のインビトロ実験のために、o2Rおよびo9R pmel T細胞を5μM oIL-2または0.05μM oIL-2で48時間刺激した。RNeasyミニキット（Qiagen）を使ってRNAを抽出した。RNAシーケンシング（RNAseq）ライブラリーは、KAPA mRNAストランデッドライブラリー（stranded library）調製キットを使用し、製造者の推奨に従って調製した。ライブラリーをプールし、Illumina HiSeq3000プラットフォームで配列決定した（50bpシングルエンドリード）。HISAT2（v2.0.4）（Kim et al.,Nature Biotechnology（2019）37:907-915）を使ってリードをマウスリファレンスゲノム（mm9/GRCm38）にアラインメントした。HTSeq-counts（v0.6.1）（Anders et al.,Bioinformatics（2015）31:166-169）を使って遺伝子発現を定量した。DESeq2（Love et al.,Genome Biol（2014）15:550）を使って発現変動解析を行い、続く遺伝子セットエンリッチメント解析は、fgsea（Sergushichev et al.,bioRxiv,060012（2016））およびmsigdbr（Liberzon et al.,Cell Systems（2015）1:417-425）Rパッケージを使って、特にTFactSでアノテーションされた（TFactS annotated）遺伝子セット（Essaghir et al.,Nucleic Acids Res（2010）38:e120）に対して行い、ggplot2 Rパッケージを使って可視化した。発現変動遺伝子を0.01未満の調整済みp値およびlog2（倍率変化）≧1のものにフィルタリングした。正規化された遺伝子発現（DESeq2のrlog変換を使って算出し、行ごとにスケーリングした）を使用し、pheatmap Rパッケージを使って、遺伝子発現を可視化した。主成分分析および試料間ヒートマップは、それぞれR関数prcompおよびdistを使って生成させた。
図13Gに記載のインビトロ実験のために、CAR-o2R細胞およびCAR-o9R細胞をMSA-oIL2またはMSA-IL2で48時間刺激し、RNeasyミニキット（Qiagen）を使って全RNAを抽出した。nCounterマウス免疫学パネル（Immunology Panel）（Nanostring Technologies）を使ってRNA発現を解析した。解析は上述のように行った。
図20は本明細書記載の実験において使用された試薬類の表である。
実験の結果を以下に記載する。
実施例1:合成IL-9受容体シグナル伝達は、幹細胞メモリー活性とエフェクター抗腫瘍活性の組合せをT細胞に賦与する。
合成受容体シグナル伝達は、養子移入されたT細胞に、コンディショニング化学治療の必要を含む固形腫瘍の処置における大きな障壁を克服する新しい機能を賦与する潜在能力を有する。ここでは、共通γ鎖（γc）サイトカインIL-4、IL-7、IL-9およびIL-21に対する受容体の細胞内ドメイン（ICD）と融合された直交性IL-2受容体（o2R）細胞外ドメインを有するキメラ受容体を設計して、直交性IL-2サイトカインが対応するγcサイトカインシグナルを引き出すようにした。これらのうち、キメラ直交性IL-2R-ECD/IL-9-ICD受容体（o9R）によるT細胞シグナル伝達は、STAT1、STAT3およびSTAT5の同時活性化によって識別され、幹細胞メモリー（Tscm）細胞とエフェクターT細胞の特徴を呈する。o9R T細胞は、黒色腫および膵がんの2つの不応性同系マウス固形腫瘍モデルにおいて、優れた抗腫瘍効力を有し、コンディショニングリンパ球枯渇がなくても有効だった。それゆえに、キメラ直交性サイトカイン受容体を使ってIL-9Rシグナル伝達を転用することにより、T細胞は新しい機能を獲得して、処置が困難な固形腫瘍に対する改良された抗腫瘍活性をもたらす。
養子移入遺伝子操作T細胞治療は、造血悪性疾患を持つ患者では有意な抗腫瘍活性を示したが、固形腫瘍を持つ患者で得られる利益は限られている（Rosenberg and Restifo,Science（2015）348:62-68）。大きな制約の一つは、養子移入されたT細胞の不十分なインビボでの拡大と持続性であり、そのためにリンパ枯渇コンディショニング化学療法を余儀なくされるが、これは患者の適格性を制限する毒性レジメンである（Goff et al.,J Clin Oncol.（2016）34:2389-2397、Dudley et al.,J Clin Oncol.（2008）26:5233-5239、Dutcher et al.,Journal for ImmunoTherapy of Cancer（2014）2:26）。拡大し持続するT細胞でさえ、最終分化して機能障害を起こすことになる（Philip et al.,Nature（2017）545:452-456、Schietinger et al.,Immunity（2016）45:389-401）。合成サイトカイン受容体シグナル伝達は、幹細胞様表現型を持つT細胞をリプログラムすることができ、これらの制約を克服して、マウスモデルおよびヒトにおいて優れた抗腫瘍活性を呈することができるようになる（Gattinoni et al.,Nature Reviews Cancer（2012）12:671-684、Krishna et al.,Science（2020）370:1328-1334）。今まで、幹細胞様T細胞を選択しまたは拡大するための治療的操作は、細胞製造段階に限定され、インビボで行うことはできなかった。
直交性サイトカイン受容体は、ネイティブサイトカインの変異型に選択的に結合するネイティブサイトカイン受容体の変異型である。この直交性サイトカイン-受容体ペアは、ネイティブサイトカイン-受容体ペアとは、相互排他的である。したがって直交性サイトカイン受容体は、T細胞に形質導入されてから、それぞれの対応する直交性サイトカインによって刺激されると、養子移入された細胞をインビボで選択的かつ生物学的に操作する手段になる。このことは、最近、がん免疫治療のために養子移入されたT細胞のインビボ調整について、直交性マウスIL-2サイトカイン-受容体ペア（oIL2およびo2R）を使って実証された（Sockolosky et al.,Science（2018）359:1037-1042）。IL-2Rシグナル伝達はT細胞の生存、拡大および抗腫瘍機能の強化を強力に刺激するからである。
直交性マウスIL-2受容体（o2R）は、oIL-2（クローン3A10）には選択的に結合するが野生型IL-2には結合しない改変細胞外ドメインを持つIL-2Rβ鎖からなる（図1A）。同様に、oIL-2は野生型IL-2受容体に結合することができない。シグナルを伝達するために、直交性IL-2受容体と野生型IL-2受容体はどちらも野生型γcと協働する。本発明者らは、oIL-2システムのモジュラー性を使って、抗腫瘍T細胞に好都合な特徴を賦与するものもあるγcサイトカイン受容体ファミリーの他のメンバーの潜在的な機能的および治療的有用性を探求したいと考えた（Dwyer et al.,Frontiers in Immunology（2019）10:263、Leonard et al.,Immunity（2019）50:832-850）。
そうするために、o2Rの細胞内ドメイン（ICD）を、γcサイトカインIL-4、IL-7、IL-9およびIL-21に対する受容体のICDで置き換えることで、各γcサイトカインファミリー受容体の細胞内ドメイン（ICD）に融合されたマウスoIL-2結合性細胞外ドメイン（ECD）を含有するキメラ直交性受容体を作出した（図1A、SEQ ID NO:15、19、20、21）。重要なことに、キメラ直交性受容体を発現するようにレトロウイルスで形質導入された活性化初代T細胞（YFP＋）は、野生型IL-2誘導性STAT5リン酸化を失っていなかった（図1B、左図）。
マウス血清アルブミン結合型oIL-2（MSA-oIL2、クローン3A10）によるキメラ直交性受容体の刺激は、それぞれのγcサイトカインによる公知の野生型シグナル伝達と合致するホスホ-STATシグナル伝達パターン（図1B）をもたらした（Leonard,et al.,Immunity,2019,50:832-850、Demoulin,et al.,Mol Cell Biol.,1996,16:4710-4716）。o9Rによるシグナル伝達は、STAT1、STAT3およびSTAT5の強力なリン酸化を生じた。これは、o2R、o4R、o7Rおよびo21Rによるシグナル伝達とは明確に異なり（図1B、図2）、野生型IL-9受容体（CD129）による公知のシグナル伝達と合致するプロファイルである（Demoulin,et al.,J Biol.Chem.,1999,274:25855-25861）。o9Rシグナル伝達は用量依存的であり、MSA-oIL2に特異的であった（図1C）。
IL-9受容体、IL9R（CD129としても公知である）は、肥満細胞、メモリーB細胞、自然リンパ系細胞、および造血前駆細胞によって天然に発現されるが、γcサイトカイン受容体ファミリーの中ではあまり研究が進んでいないメンバーである（Demoulin,et al.,Mol Cell Biol.,1996,16:4710-4716、Knoops et al.,Growth Factors（2004）22:207-215、Bauer,et al.,J Biol Chem.,（1998）273:9255-9260、Takatsuka et al.,Nature Immunology（2018）19:1025-1034、Townsend et al.,Immunity（2000）13:573-583、Williams et al.,Blood（1990）76:906-911、Turner et al.,J Exp Med（2013）210:2951-2965）。IL-9を産生するT細胞サブセットは記載されているものの（Lu et al.,J Clin Invest（2012）122:4160-4171、Lu et al.,Proc Natl Acad Sci USA（2014）111:2265、Purwar et al.,Nat Med（2012）18:1248-1253、Liu et al.,Nat Commun.（2020）11:5902、Schanz,et al.,J Immunother Cancer（2021）9）、IL-9Rシグナル伝達がT細胞に及ぼす効果は、あまりよく特徴づけられていない（Elyaman et al.,Proc Natl Acad Sci USA（2009）106:12885-12890、Nowak et al.,J Exp Med（2009）206:1653-1660、Li et al.,Eur J Immunol（2011）41:2197-2206、Houssiau et al.,J Immunol（1993）150:2634-2640、Louahed et al.,J Immunol（1995）154:5061-5070、Lehrnbecher et al.,Cytokine（1994）6:279-284）。例えば、ナイーブT細胞はIL-9に対して非感受性であり、T細胞の発生がIL-9欠損マウスにおいて損なわれないことは文献に記載があることから、IL-9はT細胞生物学において決定的な天然サイトカインではないことが示唆される（Townsend et al.,Immunity（2000）13:573-583、Houssiau et al.,J Immunol（1993）150:2634-2640、de Heusch,et al.,Eur J Immunol（2020）50:1034-1043）。
本研究では、活性化マウスT細胞は、IL-9R発現がないために（図3A～図3B）、IL-9シグナル伝達をサポートせず（図1C）、これらの細胞におけるo9Rシグナル伝達の非正統性（unorthodoxy）が強調された（Nowak et al.,J Exp Med（2009）206:1653-1660、Druez et al.,J Immunol（1990）145:2494-2499、Cosmi et al.,Blood（2004）103:3117-3121）。o9Rシグナル伝達が野生型IL-9Rシグナル伝達の真のミミックであるかどうかを検証するために、C57BL/6マウスからのマウスT細胞とトランスジェニックpmelマウスからのマウスT細胞との両方で、野生型IL-9Rを過剰発現させた（図3A～図3B）。IL-9による野生型IL-9Rの活性化は、o9Rシグナル伝達に応答して観察されるものと類似するSTAT1、STAT3およびSTAT5リン酸化プロファイルをもたらした（図3C～図3D）。
o9R細胞は内在性野生型IL-2Rβも発現するので、本発明者らは、ネイティブシグナル伝達と直交性シグナル伝達の間の競合を評価した。飽和用量のMSA-oIL2への共曝露は、o9R T細胞におけるMSA-IL2によるピークpSTAT5リン酸化に影響を及ぼさなかった（図4A）。ただし、MSA-IL2の用量を増加させると、o9R T細胞におけるpSTAT1およびpSTAT3のMSA-oIL2誘導が、部分的に軽減された（図4B～図4C）。それでもなお、o9R T細胞のユニークなシグナル伝達は、MSA-IL2の飽和用量でさえ、活性なままだった。
次に、T細胞のメモリー表現型に対する、さまざまな直交性受容体によるシグナル伝達の効果を調べた。o9R（o21Rも同様）を介してシグナル伝達するT細胞は、CD62L＋集団に富み、FasおよびSca-1の発現が高いことが観察された。これは、養子細胞治療（ACT）のモデルおよびがん患者において優れた抗腫瘍活性を持つことで知られるサブセットであるTSCM表現型に合致する（図1D～1F）（Krishna et al.,Science（2020）370,1328-1334、Gattinoni et al.,J Clin Invest（2005）115:1616-1626、Hinrichs et al.,Proc Natl Acad Sci USA（2009）106:17469-17474、Klebanoff et al.,Proc Natl Acad Sci USA（2005）102:9571-9576）。また、o9R T細胞は、STAT5リン酸化を飽和させるMSA-oIL2濃度でさえ、o2R発現T細胞と比べて増殖が少なく、細胞分裂を起こす回数が少なかった（図1Gおよび図5A～図5B）。o9R T細胞とo2R T細胞は野生型IL-2には等しく応答したので、限られた増殖は直交性受容体特異的だった。直交性受容体の中ではo21R（これもSTAT3を介してシグナル伝達する）だけが、o9Rより少ない増殖をもたらした（図5A）。
ユニークなSTATシグナル伝達、γcサイトカイン受容体ファミリーの中ではあまり知られていない状況、およびTSCM特徴を考慮して、インビボでのo9Rシグナル伝達の影響を、固形腫瘍に対するACTのマウスモデルを使って研究した。まず、B16黒色腫において過剰発現するメラノサイト抗原であるgp100に特異的な内在性TCRを発現するトランスジェニックpmelマウスのT細胞を利用するACTモデルを使用した（Overwijk et al.,J Exp Med（2003）198:569-580）。このモデルにおけるo2Rの利益と効力を考慮して（Sockolosky et al.,Science（2018）359:1037-1042）、よりストリンジェントになるように、そして養子移入されたT細胞の恒常的増殖をγcサイトカインシグナル伝達によって誘導することでACTを増強するコンディショニングレジメン、リンパ球枯渇放射線治療を省略するために、プロトコールを改変した（Surh et al.,Immunity（2008）29:848-862）。B16腫瘍保持C57BL/6マウスを、レトロウイルスを使ってo2Rまたはo9Rのいずれかが形質導入されたpmel T細胞の静脈内投与によって処置し、MSA-IL2またはMSA-oIL2のいずれかで処置した（図7A）。C57BL/6マウスからのo2Rおよびo9R T細胞のプロファイルと同様に、MSA-oIL2は、o9R pmel T細胞では、STAT1、STAT3およびSTAT5のリン酸化を活性化したが、o2R pmel T細胞ではSTAT5だけをリン酸化した（図6A）。また、o9R pmel T細胞は、o2R pmel T細胞よりも増殖が少なかった（図6B）。
リンパ球枯渇がない場合、oIL-2で処置されたマウスにおけるACTの7日後の末梢血には、MSA-IL2で処置されたマウスと比べて高頻度のo2R pmel T細胞およびo9R pmel T細胞が観察された（図7B）。o2R pmel T細胞とo9R pmel T細胞はどちらもリンパ球枯渇なしで拡大したが、このモデルでは、より一貫した抗腫瘍効果と生存期間の延長とが、MSA-oIL2で処置されたo9R pmel T細胞で観察され（図7C、図7D、図8A、図8B）、リンパ球を枯渇させたマウスにおけるpmel T細胞に匹敵する抗腫瘍効果を達成した。MSA-oIL2で処置されたリンパ球枯渇マウスでは、o9R pmel T細胞の優れた抗腫瘍効力が、その増殖シグナルは弱いにもかかわらず、観察された（図8C）。
これらの結果から、o9R pmel T細胞の強化された抗腫瘍効果の基礎には、選択的拡大以外の因子が存在することが示唆された。o9R pmel T細胞による、o2R pmel T細胞と比べて強い腫瘍浸潤が、MSA-oIL2で処置されたマウスにおけるACTの5日後に観察された（図7E）。o2R pmel T細胞およびo9R pmel T細胞とMSA-oIL2とによるACTの7日後に、CyTOFを使って、18の腫瘍浸潤CD45＋白血球集団クラスターが同定された。これらのうち、存在量変動解析（differential abundance analysis）に基づく際だった特徴は、pmel T細胞に対応するクラスターの存在であり、これは、o9R処置マウスでは著しくエンリッチされた（腫瘍浸潤CD45＋細胞の8.9％対1.6％;図9A）。腫瘍浸潤pmel T細胞のうち、o9R pmel T細胞では、CD39、PD-1およびTBETを共発現するクラスターを含むT細胞活性化に関連するクラスターがエンリッチされ、一方、o2R pmel T細胞では、CD73を発現しPD-1発現とCD39発現を欠くクラスターがエンリッチされた（図9B）。
o9R pmel T細胞の優れた腫瘍浸潤は、マルチプレックス免疫組織化学により、CD3＋CD8＋およびCD8＋PD1＋T細胞の浸潤によって裏付けられた（図9C）。腫瘍浸潤の改良に加えて、o9R pmel T細胞はそのo2R対応物と比べて優れた細胞溶解能を示し（図7F）、インビトロで腫瘍細胞に応答してより多くのIFNγ産生を示した（図9D）。
次に、o9R pmel T細胞の改良された浸潤、エフェクター機能およびインビボ効力を担っている生物学的プログラム（biological program）を調べた。MSA-oIL2へのインビトロ曝露（48時間）は、高次元マスサイトメトリーにより、徹底的に分岐した表現型をもたらし、14中8つのクラスターは、o2R pmel T細胞とo9R pmel T細胞の間で存在量が異なった（図7G）。C57BL/6マウスからのT細胞を使った図1D、1Eおよび1Fのデータと合致して、o9R pmel T細胞は、幹細胞メモリー（TSCM）表現型のマーカー（Sca-1、CD127、FasおよびCD62L）を獲得し（図7G、図10）、一方、o2R pmel T細胞は最終分化エフェクターのマーカー（CD44、EOMESおよびTbet）を獲得した（図7G）。o9Rシグナル伝達のこれらの効果は、野生型IL-9Rシグナル伝達の効果と合致した。TSCM表現型は、野生型IL-9Rが形質導入され野生型IL-9に曝露されたpmel T細胞でも観察されたからである（図10）。
o2R pmel T細胞と比較して、MSA-oIL2に曝露されたo9R pmel T細胞のバルク集団は、インビトロでのMSA-oIL2またはMSA-IL2への曝露の48時間後に、選別されたpmel T細胞のRNA-seqによって特定される、際だった全般的な二方向性トランスクリプトーム変化を起こす（図7H、図11）。o9Rシグナル伝達によって誘導されたこれらの変化は、Tcf7、Ccr7、Cd127、SellおよびBach2を含む遺伝子のエンリッチメントによって例証されるように、TSCM表現型の獲得を、さらに裏付けている（図7I）。しかし、エフェクター機能（Ifng、Gzma、Prf1）およびT細胞活性化（Pdcd1、Icos、Entpd1、Lag3、Havcr2）と古典的に関連づけられていて、伝統的にはTSCM表現型からは除外されている遺伝子の同時エンリッチメントも観察された（図7I）。これは、T細胞におけるo9Rシグナル伝達にユニークな、新規ハイブリッド表現型または不均一な亜集団の同時存在を表しうる。IL-9R活性化によるグランザイムAの誘導は、o2R、o4R、o7Rおよびo21Rシグナル伝達とは明確に異なるo9Rシグナル伝達の特徴であるSTAT1およびSTAT3の同時活性化に依存すると報告されている（Demoulin,et al.,J Biol.Chem.,1999,274:25855-25861）。
転写因子経路エンリッチメントのトランスクリプトーム解析は、予想される転写因子STAT1およびSTAT3だけでなく、AP-1転写因子JUNに関連する遺伝子の有意な（p＜0.05）エンリッチメントを明らかにした（図7J）。これは、腫瘍が誘導する疲弊に対して抵抗性である腫瘍特異的T細胞の特徴であるJun対Fos発現の比の増加を伴った（Lynn et al.,Nature（2019）576:293-300）。並行して、o9Rシグナル伝達は、T細胞の疲弊または機能障害に関連する遺伝子をダウンレギュレートした。それらの遺伝子にはNr4a1とToxが含まれ、これらはどちらも抗腫瘍T細胞の機能障害を媒介する（図7I）（Chen et al.,Nature（2019）567:530-534、Seo et al.,Proc Natl Acad Sci USA（2019）116:12410-12415、Khan et al.,Nature（2019）571:211-218、Scott et al.,Nature（2019）571:270-274）。
o9Rシグナル伝達プログラムのインビボ活性を調べるために、養子移入されたT細胞上のCD62L発現を調べた。ACTの1日後および5日後に、MSA-oIL2で処置された腫瘍保持マウスの流入領域リンパ節および脾臓において、養子移入されたo9R pmel T細胞では、o2R pmel T細胞と比較して、CD62L発現が高かった（図12）。抗原特異的T細胞活性化がおそらく優勢であるだろう腫瘍では、CD62L発現の差は観察されなかった。
CARに基づくACTとの関連でo9Rシグナル伝達をさらに調べるために、メソテリンを発現する膵がんの免疫治療抵抗性モデルを使用した。腫瘍におけるoIL-2（クローン3A10）の高腫瘍内濃度を確保すると共にし、腫瘍微小環境におけるT細胞機能障害に対するo9Rシグナル伝達の影響を評価するために、インビボCAR T細胞研究のためのoIL-2源として誘導送達（vectored delivery）を選んだ（図13A）。このモデルは、o9Rシグナル伝達プログラムの効果がほとんど末梢組織において観察されたpmel研究とは対照的だった。アデノウイルスベクター（Ad-oIL2）からのoIL-2産生は、インビトロではPDA7940b細胞において（図13A、左下）、またインビボでは腫瘍内注射によって（図13A、右下）評価され、腫瘍限定的なoIL-2発現が確認され、末梢血ではサイトカインは検出されなかった。
第2世代の抗マウスメソテリンCARをコードするレトロウイルスを直交性受容体と一緒に初代マウスT細胞に形質導入することで、CAR-o2R T細胞およびCAR-o9R T細胞を作成した（図14A～図14B）。MSA-oIL2によるCAR-o9R T細胞の刺激は、STAT1とSTAT3、そしてそれらほどではないがSTAT5のリン酸化をもたらした。これは、MSA-oIL2で処理されたCAR-o2R T細胞のSTAT5リン酸化プロファイルとは明確に異なった（図13B）。CAR-o2R細胞とは異なり、CAR-o9R細胞はoIL-2に応答して拡大しなかった（図15A）。
CAR-o2R細胞の増殖上の利点にもかかわらず、CAR-o9R細胞は、KPC（LSL-KrasG12D/＋;LSL-Trp53R172H/＋;Pdx-1-Cre）マウスにおいて生じる自然発生腫瘍に由来するメソテリン陽性膵管腺癌（PDA）細胞株PDA7940bの排除に関して、優れた抗腫瘍効力をインビトロで示した（図13C）。
pmelモデルと同様に、CAR-o9R細胞はTSCM表現型（CD44loCD62LhiFas＋）を保ち、一方、CAR-o2R細胞はmIL-2で刺激した細胞に観察されるセントラルメモリー/エフェクター表現型（CD44hiCD62LhiFas-）にシフトした（図13D～図13Eおよび図15B）。表現型はTSCMに見えるが、CAR-o9R T細胞は、oIL-2に応答して、CAR-o2R細胞よりも高レベルのIFNγ、TNFα、IL-2、IL-9、IL-10、IL-18、IL-22およびIL-23を分泌する（図13F）。この多様なサイトカインプロファイルは、nCounterマウス免疫学パネルを使ってCAR-o9R T細胞において確証されたo9R pmel T細胞の複雑なトランスクリプトームシグネチャーを反映している（図13G）。CAR-o9R細胞では、T細胞幹細胞性へのシフト（Il7r、SellおよびBcl6のアップレギュレーションとEomes、Tox1のダウンレギュレーション）と共に、エフェクター機能に関連する遺伝子（Ifng、Prf1、Gzmb、Gzma）とT細胞活性化に関連する遺伝子（Pdcd1、Icos、Entpd1）がアップレギュレートされた。
CAR-o2R細胞およびCAR-o9R細胞の抗腫瘍特性を評価するために使用される同系インビボモデルでは、養子移入された（ドナー）T細胞を内在性（宿主）T細胞と区別することができるようにCD45アレルが異なる2つの免疫応答性マウス株（CD45.1とCD45.2）を利用する（図13H）。このモデルでは、定着した皮下PD7940b腫瘍を持つマウスを、Ad-oIL2またはCAR-o2R/CAR-o9Rのいずれか一方で処置しても、迅速に成長する腫瘍の抑制には無効である（図13I）。この実験的単独治療はモック処置（PBS注射）に対する改善を示さず、この腫瘍モデルの不応性が明示された。
にもかかわらず、Ad-oIL2＋CAR-o2RまたはAd-oIL2＋CAR-o9Rによる併用治療は、それぞれ12匹中8匹（67％CR）および12匹中6匹（50％CR）で腫瘍を排除するロバストな抗腫瘍応答をもたらした（図13J）。Ad-oIL2＋CAR-o9R群では、40％のマウス（12匹中5匹）が10日目までに死亡したので、初期毒性（early toxicity）が観察されたが、注目すべきことに、Ad-oIL2＋CAR-o2R群では12匹中4匹のマウスが再発に屈したのに対して、Ad-oIL2＋CAR-o9R群では生き残った動物に見られる腫瘍の再発が少なかった（7匹中1匹）。
リンパ球枯渇マウスにおけるAd-oIL2＋CAR-o9Rの毒性は、免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群（immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome:ICANS）の臨床徴候（振戦、せん妄、発作）を特徴とした。ICANSを持つマウスのRNAインサイチューハイブリダイゼーション（RNA ISH）解析により、脳の髄膜層におけるCAR T細胞浸潤が明らかになり、そこでは、メソテリン発現髄膜細胞も検出された（図16A～図16B）。Ad-oIL2＋CAR-o9R群ではAd-oIL2＋CAR-o2R群と比べて有意に多い髄膜浸潤CAR T細胞が観察されたことから、CARが推進するオンターゲットオフ腫瘍活性と観察されたICANSとの間の関連が示唆される（図16C）。血清分析がサイトカイン放出症候群（CRS）または腫瘍溶解症候群（TLS）の証拠を示すことはなかった（図16D～図16E）。これらの知見と、pmelモデルでは同様の毒性がないこととに基づいて、観察されたICANSは、CARの特異性に特異的であって、o9R操作T細胞に固有のものではないと思われる。それでもなお、CAR T細胞へのo9Rシグナル伝達の橋渡し研究は、潜在的なオンターゲットオフ腫瘍毒性の付加を考慮しなければならず、患者の安全を最大限にするには、追加の操作戦略（例えばオン/オフシステム、合成回路）が必要になりうる。
プレコンディショニングなしで毒性を示したのは、Ad-oIL2＋CAR-o9Rでは12匹中1匹だけだったので、それぞれ42％（12匹中5匹）および8.3％（12匹中1匹）という完全奏効率ならびに生存期間の延長（図17A）によって示唆されるように、Ad-oIL2（3A10）＋CAR-o2Rに対するAd-oIL2（3A10）＋CAR-o9Rの優位性は、シクロホスファミドプレコンディショニングがない場合には、より明白だった（図13K）。Ad-oIL2と組み合わせてもo2RなしではCAR T細胞に抗腫瘍効果はなく（図17B）、対照ウイルスAd-NullはCAR-o2R治療を増強することができなかったので（図17C）、効力はT細胞上の直交性受容体発現とAd-oIL2によるoIL-2発現とに依存した。PDA7940bを再負荷した場合、併用処置によって以前に治癒した動物では、ナイーブ動物の場合と比較して、腫瘍成長が有意に抑制された（図13L）。CRISPR/Cas9技術によってメソテリンノックアウト腫瘍細胞（PDA7940bMSLN-）を作成し（図21）、次に、過去に治癒したマウスに埋植した（図22）。24日目に、これらの腫瘍は、治癒したマウスでは、ナイーブマウスと比べて小さかったことから、腫瘍抗原（＝エピトープ）拡散の誘導が示された。CD45.1＋ドナーT細胞が、再負荷の24日後および初回注入の94日後に、動物の末梢血中に検出されたことから、インビボoIL-2刺激は免疫応答性マウスにおけるCAR-o2R/CAR-o9R T細胞の長期持続を可能にすることが示唆された。
次に、腫瘍浸潤CAR-o9RまたはCAR-o2R T細胞の腫瘍内での量および品質に対するAd-oIL2の影響を調べた。pmelモデルとは対照的に、ACTの8日後に腫瘍内に観察されるCAR-o9R T細胞はCAR-o2R T細胞より少なかった（図13M）。Ad-oIL2モデルにおいて末梢ではo9Rシグナル伝達プログラムが活性でないことを考慮すると、対照的な腫瘍浸潤結果は意外なことではなかった。腫瘍浸潤CAR T細胞のうち、CAR-o9R細胞の方がより高頻度にIFNγを発現したことから（図13M）、腫瘍浸潤よりむしろ、優れた腫瘍内機能の方が、このモデルにおけるCAR-o9R T細胞の抗腫瘍効力を推進することが示唆された。
o9Rシグナル伝達の橋渡し研究上の可能性を評価するために、ヒト直交性IL-2Rβ（ho2R）とヒト直交性キメラIL-2Rβ/IL-9R（ho9R）を作成した（SEQ ID NO:4および6）。ho2Rまたはho9R（それぞれYFPを含有する）のいずれか一方をコードするベクター、ならびにHLA＊0201にのったNY-ESO-1に特異的なT細胞受容体をコードするベクター（NYESO1-TCRクローン1G4）（Robbins,et al.,J Immunol,2008,180:6116-6131）を使って、ヒトT細胞にレトロウイルス形質導入を行った。NY-ESO-1は、滑膜肉腫、粘液性脂肪肉腫、黒色腫その他の腫瘍において過剰発現するがん精巣抗原である。NYESO1-TCRとYFPの発現に基づいて選別された形質導入T細胞（図19A）をMSAに結合したヒト直交性IL-2（MSA-hoIL2）または野生型IL-2（MSA-hIL2）に曝露した。マウスシステムでの観察結果と合致して、ho9Rを介したヒトT細胞シグナル伝達は、pSTAT1、pSTAT3およびpSTAT5シグナル伝達を活性化するが、ho2Rを介したヒトT細胞シグナル伝達は主としてpSTAT5シグナル伝達を活性化する（図18A）。ho2Rまたはho9Rを発現するヒトT細胞はMSA-hIL2への曝露後にSTAT5を同等にリン酸化することから（図18A、右端図）、内在性γcを介したネイティブIL-2-STAT5シグナル伝達は、直交性受容体発現によって異なる影響を受けないことが示された。
また、やはりマウスシステムと同様に、ho9Rシグナル伝達は、ho2Rまたは野生型IL-2シグナル伝達よりも弱い増殖シグナルをもたらした（図18B）。ho2R/NYESO1-TCR T細胞と比べて、ho9R/NYESO1-TCR T細胞は、MSA-hoIL2との培養下で2日後および6日後に、TSCM細胞（CD45RA＋CD27＋CCR7＋CD95＋）の集団に富む（図19B～図19Cおよび図18C）。また、2日目と6日目の間でのho9R/NYESO1-TCR T細胞の増殖は低減しているにも関わらず、（単なるエンリッチメントではなく）絶対量でのTSCM細胞およびセントラルメモリー（TCM、CD45RA-CD27＋CCR7＋CD95＋）細胞の拡大が観察された。
ho9R/NYESO1-TCRとho2R/NYESO1-TCR T細胞の間だT細胞表現型の相違は、MSA-hoIL2存在下での、HLA＊0201＋NY-ESO-1＋ヒト黒色腫腫瘍細胞株nRFP-M407による4回の抗原特異的負荷後でさえ、持続した（図18E～図18F）。ho2R/NYESO1 T細胞と比べて、ho9R/NYESO1 T細胞は、より高頻度のCD45RA＋CD27＋およびTSCM細胞を保ち、より高レベルのCD62LおよびCXCR3を発現した（図18D）。活性化CD3/CD28ビーズまたはコグネイト黒色腫細胞株（nRFP-M407）のどちらか一方に曝露した場合、繰り返し刺激されたho9R/NYESO1 T細胞は、より多くのIFNγ、TNFαおよびIL-2を発現し、より大きな多機能性を呈した（図18Gおよび図19D）。これらの知見は抗原特異的であった。それらが、非コグネイト黒色腫細胞株M263（HLA＊0201-NY-ESO-1-）に応答して観察されることはなかったからである。
さらに、ヒトorthoIL-2をAd5/3-D24腫瘍溶解性アデノウイルスベクターにクローニングして、これがインビトロで過剰発現することを示した。A549細胞を、Ad5/3-D24-hoIL2または同質遺伝子対照ウイルスAd5/3-D24に感染させるか、またはモック感染させた。感染の96時間後に50μlの細胞培養上清を収集し、ヒトIL-2 ELISAによって分析した（図23A）。次に、ヒトorthoIL-2をコードするファイバーキメラ腫瘍溶解性アデノウイルスAd5/3-D24-hoIL2を、塩化セシウム（CsCl2）勾配によって精製した（図23B）。感染48時間後に、ウイルスに感染したA549細胞を、11個のコンフルエントなT150細胞培養フラスコから掻き取ることによって収集し、次に凍結融解サイクルを3回行うことで、ウイルス粒子を放出させた。塩化セシウム（CsCl）勾配での超遠心分離を2回行うことによって上清を清澄化した。赤色の矢印は、無傷のウイルス粒子を含有するバンドを示しており、チューブの側面を突き刺すことにより、針とシリンジで、それが収集される。15ml限外濾過ユニットでの緩衝液交換を2回行うことによってCsClを除去した。
次に、ヒト直交性IL-2Rβ（ho2R）およびヒト直交性キメラIL-2Rβ/IL-9R（ho9R）が、ヒトT細胞においてPSMAリターゲットCARと共発現することを示した。1e5個の初代ヒトT細胞（1:1のCD4/CD8比）を、PSMA28z CARとヒト直交性受容体、完全長orthoIL2Rb受容体（図24A）またはキメラorthoIL2Rb/IL9Raスイッチ受容体（図24B）のどちらか一方とをコードするレンチウイルスベクターに、ベクターの希釈度を変えて感染させた。感染48時間後に共発現をフローサイトメトリーによって評価し、証明した。
結論として、直交性IL-2サイトカイン-受容体プラットフォームは、直交性IL-2RβのICDを他のγcサイトカインに対する受容体のICDとモジュール式に置き換えることによるシグナル伝達のリダイレクションを可能にする。ここでは、意外にも、TCRおよびCARに基づく腫瘍特異的T細胞におけるo9Rシグナル伝達の、直交性IL-2リガンド3A10による特異的インビボ刺激が、2つの免疫治療抵抗性固形腫瘍モデルにおいて改良された抗腫瘍活性をもたらし、リンパ球枯渇なしのよりストリンジェントな状況下でロバストな活性を保った。この利益は、IL-2シグナル伝達メッセージをIL-9Rα ICDによってルート変更するためにγcを流用して、STAT1、STAT3およびSTAT5の同時活性化をもたらすことによって、媒介された。T細胞内で伝えられたIL-9Rαのシグナル伝達メッセージは、幹細胞メモリーT細胞とエフェクターT細胞の有益な機能的特徴を併せ持つユニークな表現型をもたらすことで、改良されたインビボ抗腫瘍活性を与えた。
態様の列挙
以下に態様を列挙するが、その番号付けが重要性のレベルを指定していると解釈してはならない。
態様１は、以下を提供する：
細胞における受容体の選択的活性化のためのシステムであって、
（a）以下：
（i）直交性キメラサイトカイン受容体、および
（ii）少なくとも1つのキメラ抗原受容体（CAR）
を含む、改変免疫細胞と、
（b）直交性IL2サイトカインをコードする核酸配列を含む、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターと
を含み、
該直交性キメラサイトカイン受容体が、直交性IL2受容体（oIL2R）の細胞外ドメインと、IL2Rではないサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む、システム。
態様２は、以下を提供する：
oIL2Rの前記細胞外ドメインが、直交性IL2受容体ベータ（oIL2Rb）の細胞外ドメインである、態様1記載のシステム。
態様３は、以下を提供する：
前記直交性キメラサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインが、IL9R細胞内シグナル伝達ドメインを含む、態様1または2記載のシステム。
態様４は、以下を提供する：
前記IL9R細胞内シグナル伝達ドメインが、IL9R-アルファ（IL9Ra）細胞内シグナル伝達ドメインである、態様1～3のいずれか一つのシステム。
態様５は、以下を提供する：
前記CARが、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む、前記態様のいずれか一つのシステム。
態様６は、以下を提供する：
前記抗原結合ドメインが、完全長抗体またはその抗原結合フラグメント、Fab、一本鎖可変フラグメント（scFv）、または単一ドメイン抗体からなる群より選択される、前記態様のいずれか一つのシステム。
態様７は、以下を提供する：
前記抗原結合ドメインが、腫瘍抗原を標的とする、前記態様のいずれか一つのシステム。
態様８は、以下を提供する：
前記腫瘍抗原が、CD19、CD20、HER2、NY-ESO-1、MUC1、CD123、FLT3、B7-H3、CD33、IL1RAP、CLL1（CLEC12A）PSA、CEA、VEGF、VEGF-R2、CD22、ROR1、メソテリン、c-Met、糖脂質F77、FAP、EGFRvIII、MAGE A3、5T4、WT1、KG2Dリガンド、葉酸受容体（FRa）、およびWnt1抗原からなる群より選択される、前記態様のいずれか一つのシステム。
態様９は、以下を提供する：
前記抗原結合ドメインが、scFvである、前記態様のいずれか一つのシステム。
態様１０は、以下を提供する：
前記抗原結合ドメインが、抗メソテリンscFvである、前記態様のいずれか一つのシステム。
態様１１は、以下を提供する：
前記CARの細胞内ドメインが、TNFRスーパーファミリーのタンパク質、CD28、4-1BB（CD137）、OX40（CD134）、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C、およびB7-H3（CD276）、もしくはそれらの変異体からなる群より選択されるタンパク質の共刺激ドメイン、またはキラー免疫グロブリン様受容体（KIR）由来の細胞内ドメインを含む、前記態様のいずれか一つのシステム。
態様１２は、以下を提供する：
前記CARの細胞内ドメインが、ヒトCD3ゼータ鎖（CD3ζ）、FcγRIII、FcsRI、Fc受容体の細胞質テール、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を保持する細胞質受容体、TCRゼータ、FcRガンマ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66d、またはそれらの変異体からなる群より選択されるタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、前記態様のいずれか一つのシステム。
態様１３は、以下を提供する：
（a）前記直交性キメラサイトカイン受容体が、oIL2Rbの細胞外ドメインと、IL9Raの細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
（b）前記CARが、抗メソテリン抗原結合ドメインを含む、
前記態様のいずれか一つのシステム。
態様１４は、以下を提供する：
対象におけるがんを処置する方法であって、
（a）該対象に、
（i）直交性キメラサイトカイン受容体、および
（ii）少なくとも1つのCAR
を含む、有効量の改変免疫細胞またはその前駆体（改変免疫細胞の集団）を投与する工程、および
（b）該対象に、直交性IL2サイトカインをコードする核酸配列を含む、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを投与する工程
を含み、
該直交性キメラサイトカイン受容体が、直交性IL2受容体（oIL2R）の細胞外ドメインと、IL2Rではないサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、方法。
態様１５は、以下を提供する：
oIL2Rの前記細胞外ドメインが、直交性IL2受容体ベータ（oIL2Rb）の細胞外ドメインである、態様14記載の方法。
態様１６は、以下を提供する：
前記直交性キメラサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインが、IL9R細胞内シグナル伝達ドメインを含む、態様14または15記載の方法。
態様１７は、以下を提供する：
前記IL9R細胞内シグナル伝達ドメインが、IL9R-アルファ（IL9Ra）細胞内シグナル伝達ドメインである、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１８は、以下を提供する：
前記CARが、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様１９は、以下を提供する：
前記抗原結合ドメインが、完全長抗体またはその抗原結合フラグメント、Fab、一本鎖可変フラグメント（scFv）、または単一ドメイン抗体からなる群より選択される、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２０は、以下を提供する：
前記抗原結合ドメインが、腫瘍抗原を標的とする、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２１は、以下を提供する：
前記腫瘍抗原が、CD19、CD20、HER2、NY-ESO-1、MUC1、CD123、FLT3、B7-H3、CD33、IL1RAP、CLL1（CLEC12A）PSA、CEA、VEGF、VEGF-R2、CD22、ROR1、メソテリン、c-Met、糖脂質F77、FAP、EGFRvIII、MAGE A3、5T4、WT1、KG2Dリガンド、葉酸受容体（FRa）、およびWnt1抗原からなる群より選択される、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２２は、以下を提供する：
前記抗原結合ドメインが、scFvである、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２３は、以下を提供する：
前記抗原結合ドメインが、抗メソテリンscFvである、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２４は、以下を提供する：
前記CARの細胞内ドメインが、TNFRスーパーファミリー、CD28、4-1BB（CD137）、OX40（CD134）、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C、およびB7-H3（CD276）、もしくはそれらの変異体からなる群より選択されるタンパク質の共刺激ドメイン、またはキラー免疫グロブリン様受容体（KIR）由来の細胞内ドメインを含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２５は、以下を提供する：
前記CARの細胞内ドメインが、ヒトCD3ゼータ鎖（CD3ζ）、FcγRIII、FcsRI、Fc受容体の細胞質テール、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を保持する細胞質受容体、TCRゼータ、FcRガンマ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66d、またはそれらの変異体からなる群より選択されるタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２６は、以下を提供する：
（a）前記直交性キメラサイトカイン受容体が、oIL2Rbの細胞外ドメインと、IL9Raの細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
（b）前記CARが、抗メソテリン抗原結合ドメインを含む、
前記態様のいずれか一つの方法。
態様２７は、以下を提供する：
前記改変免疫細胞の集団が、改良された輸送およびエフェクター機能を持つ幹細胞メモリー（Tscm）特徴を呈し、それによってがんを処置する、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２８は、以下を提供する：
ベクターを投与する前記工程が、腫瘍内注射を含む、前記態様のいずれか一つの方法。
態様２９は、以下を提供する：
前記がんが、膵がんおよび黒色腫からなる群より選択される、前記態様のいずれか一つの方法。
態様３０は、以下を提供する：
前記膵がんが、膵管腺癌である、態様29記載の方法。
態様３１は、以下を提供する：
細胞における受容体の選択的活性化のためのシステムであって、
（a）以下：
（i）直交性キメラサイトカイン受容体、および
（ii）少なくとも1つのT細胞受容体（TCR）
を発現するように操作された、改変免疫細胞と、
（b）直交性IL2サイトカインをコードする核酸配列を含む、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターと
を含み、
該直交性キメラサイトカイン受容体が、直交性IL2受容体（oIL2R）の細胞外ドメインと、IL2Rではないサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、システム。
態様３２は、以下を提供する：
oIL2Rの前記細胞外ドメインが、直交性IL2受容体ベータ（oIL2Rb）の細胞外ドメインである、態様31記載のシステム。
態様３３は、以下を提供する：
前記直交性キメラサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインが、IL9R細胞内シグナル伝達ドメインを含む、態様31または32記載のシステム。
態様３４は、以下を提供する：
前記IL9R細胞内シグナル伝達ドメインが、IL9R-アルファ（IL9Ra）細胞内シグナル伝達ドメインである、態様31～33のいずれか一つのシステム。
態様３５は、以下を提供する：
前記TCRが、腫瘍抗原を標的とする、態様31～34のいずれか一つのシステム。
態様３６は、以下を提供する：
前記TCRが、gp100黒色腫抗原またはNYESO1を標的とする、態様31～35のいずれか一つのシステム。
態様３７は、以下を提供する：
前記TCRが、pmel-1 TCRまたはNYESO1特異的TCRである、態様31～36のいずれか一つのシステム。
態様３８は、以下を提供する：
（a）前記直交性キメラサイトカイン受容体が、oIL2Rbの細胞外ドメインと、IL9Raの細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
（b）前記TCRが、pmel-1 TCRまたはNYESO1特異的TCRである、
態様31～37のいずれか一つのシステム。
態様３９は、以下を提供する：
対象におけるがんを処置する方法であって、
（a）該対象に、
（i）直交性キメラサイトカイン受容体、および
（ii）少なくとも1つのT細胞受容体（TCR）
を発現するように改変された、有効量の改変免疫細胞またはその前駆体（改変免疫細胞の集団）を投与する工程、および
（b）該対象に、直交性IL2サイトカインをコードする核酸配列を含む、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを投与する工程
を含み、
該直交性キメラサイトカイン受容体が、直交性IL2受容体（oIL2R）の細胞外ドメインと、IL2Rではないサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、方法。
態様４０は、以下を提供する：
oIL2Rの前記細胞外ドメインが、直交性IL2受容体ベータ（oIL2Rb）の細胞外ドメインである、態様39記載の方法。
態様４１は、以下を提供する：
前記直交性キメラサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインが、IL9R細胞内シグナル伝達ドメインを含む、態様39または40記載の方法。
態様４２は、以下を提供する：
前記IL9R細胞内シグナル伝達ドメインが、IL9R-アルファ（IL9Ra）細胞内シグナル伝達ドメインである、態様39～41のいずれか一つの方法。
態様４３は、以下を提供する：
前記TCRが、腫瘍抗原を標的とする、態様39～42のいずれか一つの方法。
態様４４は、以下を提供する：
前記TCRが、gp100黒色腫抗原またはNYESO1を標的とする、態様39～43のいずれか一つの方法。
態様４５は、以下を提供する：
前記TCRが、pmel-1 TCRまたはNYESO1特異的TCRである、態様39～44のいずれか一つの方法。
態様４６は、以下を提供する：
（a）前記直交性キメラサイトカイン受容体が、oIL2Rbの細胞外ドメインと、IL9Raの細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
（b）前記TCRが、pmel-1 TCRまたはNYESO1特異的TCRである、
態様39～45のいずれか一つの方法。
態様４７は、以下を提供する：
前記改変免疫細胞の集団が、改良された輸送およびエフェクター機能を持つ幹細胞メモリー（Tscm）特徴を呈し、それによってがんを処置する、態様39～46のいずれか一つの方法。
態様４８は、以下を提供する：
ベクターを投与する前記工程が、腫瘍内注射を含む、態様39～47のいずれか一つの方法。
態様４９は、以下を提供する：
前記がんが、膵がんおよび黒色腫からなる群より選択される、態様39～48のいずれか一つの方法。
態様５０は、以下を提供する：
前記膵がんが、膵管腺癌である、態様49記載の方法。
他の態様
本明細書において言及した特許、特許出願および刊行物の開示はいずれも皆、ここに、参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。具体的態様を参照して本発明を開示したが、他の当業者が、本発明の真の要旨および範囲から逸脱することなく、本発明の他の態様および変形を工夫しうることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような態様および等価な変形をすべて包含すると解釈されるべきものとする。

Claims (50)

  1. 細胞における受容体の選択的活性化のためのシステムであって、
    （a）以下：
    （i）直交性キメラサイトカイン受容体、および
    （ii）少なくとも1つのキメラ抗原受容体（CAR）
    を含む、改変免疫細胞と、
    （b）直交性IL2サイトカインをコードする核酸配列を含む、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターと
    を含み、
    該直交性キメラサイトカイン受容体が、直交性IL2受容体（oIL2R）の細胞外ドメインと、IL2Rではないサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む、システム。
  2. oIL2Rの前記細胞外ドメインが、直交性IL2受容体ベータ（oIL2Rb）の細胞外ドメインである、請求項1記載のシステム。
  3. 前記直交性キメラサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインが、IL9R細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項1または2記載のシステム。
  4. 前記IL9R細胞内シグナル伝達ドメインが、IL9R-アルファ（IL9Ra）細胞内シグナル伝達ドメインである、請求項1～3のいずれか一項記載のシステム。
  5. 前記CARが、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む、前記請求項のいずれか一項記載のシステム。
  6. 前記抗原結合ドメインが、完全長抗体またはその抗原結合フラグメント、Fab、一本鎖可変フラグメント（scFv）、または単一ドメイン抗体からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載のシステム。
  7. 前記抗原結合ドメインが、腫瘍抗原を標的とする、前記請求項のいずれか一項記載のシステム。
  8. 前記腫瘍抗原が、CD19、CD20、HER2、NY-ESO-1、MUC1、CD123、FLT3、B7-H3、CD33、IL1RAP、CLL1（CLEC12A）PSA、CEA、VEGF、VEGF-R2、CD22、ROR1、メソテリン、c-Met、糖脂質F77、FAP、EGFRvIII、MAGE A3、5T4、WT1、KG2Dリガンド、葉酸受容体（FRa）、およびWnt1抗原からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載のシステム。
  9. 前記抗原結合ドメインが、scFvである、前記請求項のいずれか一項記載のシステム。
  10. 前記抗原結合ドメインが、抗メソテリンscFvである、前記請求項のいずれか一項記載のシステム。
  11. 前記CARの細胞内ドメインが、TNFRスーパーファミリーのタンパク質、CD28、4-1BB（CD137）、OX40（CD134）、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C、およびB7-H3（CD276）、もしくはそれらの変異体からなる群より選択されるタンパク質の共刺激ドメイン、またはキラー免疫グロブリン様受容体（KIR）由来の細胞内ドメインを含む、前記請求項のいずれか一項記載のシステム。
  12. 前記CARの細胞内ドメインが、ヒトCD3ゼータ鎖（CD3ζ）、FcγRIII、FcsRI、Fc受容体の細胞質テール、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を保持する細胞質受容体、TCRゼータ、FcRガンマ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66d、またはそれらの変異体からなる群より選択されるタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、前記請求項のいずれか一項記載のシステム。
  13. （a）前記直交性キメラサイトカイン受容体が、oIL2Rbの細胞外ドメインと、IL9Raの細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
    （b）前記CARが、抗メソテリン抗原結合ドメインを含む、
    前記請求項のいずれか一項記載のシステム。
  14. 対象におけるがんを処置する方法であって、
    （a）該対象に、
    （i）直交性キメラサイトカイン受容体、および
    （ii）少なくとも1つのCAR
    を含む、有効量の改変免疫細胞またはその前駆体（改変免疫細胞の集団）を投与する工程、および
    （b）該対象に、直交性IL2サイトカインをコードする核酸配列を含む、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを投与する工程
    を含み、
    該直交性キメラサイトカイン受容体が、直交性IL2受容体（oIL2R）の細胞外ドメインと、IL2Rではないサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、方法。
  15. oIL2Rの前記細胞外ドメインが、直交性IL2受容体ベータ（oIL2Rb）の細胞外ドメインである、請求項14記載の方法。
  16. 前記直交性キメラサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインが、IL9R細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項14または15記載の方法。
  17. 前記IL9R細胞内シグナル伝達ドメインが、IL9R-アルファ（IL9Ra）細胞内シグナル伝達ドメインである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  18. 前記CARが、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  19. 前記抗原結合ドメインが、完全長抗体またはその抗原結合フラグメント、Fab、一本鎖可変フラグメント（scFv）、または単一ドメイン抗体からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  20. 前記抗原結合ドメインが、腫瘍抗原を標的とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  21. 前記腫瘍抗原が、CD19、CD20、HER2、NY-ESO-1、MUC1、CD123、FLT3、B7-H3、CD33、IL1RAP、CLL1（CLEC12A）PSA、CEA、VEGF、VEGF-R2、CD22、ROR1、メソテリン、c-Met、糖脂質F77、FAP、EGFRvIII、MAGE A3、5T4、WT1、KG2Dリガンド、葉酸受容体（FRa）、およびWnt1抗原からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  22. 前記抗原結合ドメインが、scFvである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  23. 前記抗原結合ドメインが、抗メソテリンscFvである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  24. 前記CARの細胞内ドメインが、TNFRスーパーファミリー、CD28、4-1BB（CD137）、OX40（CD134）、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C、およびB7-H3（CD276）、もしくはそれらの変異体からなる群より選択されるタンパク質の共刺激ドメイン、またはキラー免疫グロブリン様受容体（KIR）由来の細胞内ドメインを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  25. 前記CARの細胞内ドメインが、ヒトCD3ゼータ鎖（CD3ζ）、FcγRIII、FcsRI、Fc受容体の細胞質テール、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を保持する細胞質受容体、TCRゼータ、FcRガンマ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66d、またはそれらの変異体からなる群より選択されるタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  26. （a）前記直交性キメラサイトカイン受容体が、oIL2Rbの細胞外ドメインと、IL9Raの細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
    （b）前記CARが、抗メソテリン抗原結合ドメインを含む、
    前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  27. 前記改変免疫細胞の集団が、改良された輸送およびエフェクター機能を持つ幹細胞メモリー（Tscm）特徴を呈し、それによってがんを処置する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  28. ベクターを投与する前記工程が、腫瘍内注射を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  29. 前記がんが、膵がんおよび黒色腫からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  30. 前記膵がんが、膵管腺癌である、請求項29記載の方法。
  31. 細胞における受容体の選択的活性化のためのシステムであって、
    （a）以下：
    （i）直交性キメラサイトカイン受容体、および
    （ii）少なくとも1つのT細胞受容体（TCR）
    を発現するように操作された、改変免疫細胞と、
    （b）直交性IL2サイトカインをコードする核酸配列を含む、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターと
    を含み、
    該直交性キメラサイトカイン受容体が、直交性IL2受容体（oIL2R）の細胞外ドメインと、IL2Rではないサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、システム。
  32. oIL2Rの前記細胞外ドメインが、直交性IL2受容体ベータ（oIL2Rb）の細胞外ドメインである、請求項31記載のシステム。
  33. 前記直交性キメラサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインが、IL9R細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項31または32記載のシステム。
  34. 前記IL9R細胞内シグナル伝達ドメインが、IL9R-アルファ（IL9Ra）細胞内シグナル伝達ドメインである、請求項31～33のいずれか一項記載のシステム。
  35. 前記TCRが、腫瘍抗原を標的とする、請求項31～34のいずれか一項記載のシステム。
  36. 前記TCRが、gp100黒色腫抗原またはNYESO1を標的とする、請求項31～35のいずれか一項記載のシステム。
  37. 前記TCRが、pmel-1 TCRまたはNYESO1特異的TCRである、請求項31～36のいずれか一項記載のシステム。
  38. （a）前記直交性キメラサイトカイン受容体が、oIL2Rbの細胞外ドメインと、IL9Raの細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
    （b）前記TCRが、pmel-1 TCRまたはNYESO1特異的TCRである、
    請求項31～37のいずれか一項記載のシステム。
  39. 対象におけるがんを処置する方法であって、
    （a）該対象に、
    （i）直交性キメラサイトカイン受容体、および
    （ii）少なくとも1つのT細胞受容体（TCR）
    を発現するように改変された、有効量の改変免疫細胞またはその前駆体（改変免疫細胞の集団）を投与する工程、および
    （b）該対象に、直交性IL2サイトカインをコードする核酸配列を含む、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを投与する工程
    を含み、
    該直交性キメラサイトカイン受容体が、直交性IL2受容体（oIL2R）の細胞外ドメインと、IL2Rではないサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、方法。
  40. oIL2Rの前記細胞外ドメインが、直交性IL2受容体ベータ（oIL2Rb）の細胞外ドメインである、請求項39記載の方法。
  41. 前記直交性キメラサイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインが、IL9R細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項39または40記載の方法。
  42. 前記IL9R細胞内シグナル伝達ドメインが、IL9R-アルファ（IL9Ra）細胞内シグナル伝達ドメインである、請求項39～41のいずれか一項記載の方法。
  43. 前記TCRが、腫瘍抗原を標的とする、請求項39～42のいずれか一項記載の方法。
  44. 前記TCRが、gp100黒色腫抗原またはNYESO1を標的とする、請求項39～43のいずれか一項記載の方法。
  45. 前記TCRが、pmel-1 TCRまたはNYESO1特異的TCRである、請求項39～44のいずれか一項記載の方法。
  46. （a）前記直交性キメラサイトカイン受容体が、oIL2Rbの細胞外ドメインと、IL9Raの細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
    （b）前記TCRが、pmel-1 TCRまたはNYESO1特異的TCRである、
    請求項39～45のいずれか一項記載の方法。
  47. 前記改変免疫細胞の集団が、改良された輸送およびエフェクター機能を持つ幹細胞メモリー（Tscm）特徴を呈し、それによってがんを処置する、請求項39～46のいずれか一項記載の方法。
  48. ベクターを投与する前記工程が、腫瘍内注射を含む、請求項39～47のいずれか一項記載の方法。
  49. 前記がんが、膵がんおよび黒色腫からなる群より選択される、請求項39～48のいずれか一項記載の方法。
  50. 前記膵がんが、膵管腺癌である、請求項49記載の方法。
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