CN117377682A - 使用溶瘤病毒递送正交il-2选择性刺激实体瘤中的t细胞 - Google Patents

使用溶瘤病毒递送正交il-2选择性刺激实体瘤中的t细胞 Download PDF

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Abstract

本公开内容提供了正交嵌合细胞因子受体/正交细胞因子对以及用于经修饰的免疫细胞或其前体(例如，经修饰的T细胞)的组合物和方法，所述经修饰的免疫细胞或其前体包括正交嵌合细胞因子受体(例如，oIL2R‑IL9R嵌合受体)和嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。本公开内容进一步提供了包括编码正交细胞因子(例如，oIL2)的核酸序列的溶瘤腺病毒载体，以及使用所述经修饰的细胞和所述载体治疗有需要的受试者中的癌症的方法。

Description

使用溶瘤病毒递送正交IL-2选择性刺激实体瘤中的T细胞
相关申请的交叉引用
根据35 U.S.C.§119(e)，本申请要求2021年3月9日提交的美国临时专利申请号63/158,671的优先权，其通过引用以其整体并入本文。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的U54CA244711合同的政府支持下完成的。政府对本发明享有某些权利。
背景技术
目前的免疫疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面取得了革命性的进展，如FDA批准CD19靶向CAR-T细胞用于治疗急性淋巴细胞白血病和弥漫性大B细胞淋巴瘤证明的。然而，癌症治疗的最大的未达成的障碍是实体瘤。由于大量的挑战，包括缺乏肿瘤特异性抗原、难以克服治疗耐药性障碍、肿瘤异质性、扩增性和持久性差，以及密集的、免疫抑制性肿瘤微环境(TME)造成的对T细胞浸润的外在功能障碍和物理障碍，CAR-T细胞在抗击实体瘤方面缺乏疗效。一个主要的限制是被过继转移的T细胞在体内的扩增和持久性较差，因此必须进行淋巴细胞清除条件性化疗——这是一种限制患者适当性的有毒方案。即使那些的确扩增和持续存在的T细胞也会出现终末分化和功能障碍。具有干样表型的T细胞可以克服这些限制，并且在小鼠模型和人体中表现出优异的抗肿瘤活性，但是选择或扩增干样T细胞的治疗操作限于细胞制造阶段，并且无法在体内进行。本领域需要能克服这些障碍和挑战的新型细胞疗法。本发明解决了这一需求。
发明内容
在一些方面，本发明提供了一种用于选择性激活细胞中的受体的系统，该系统包括：(a)经修饰的免疫细胞，其包括(i)正交嵌合细胞因子受体，和(ii)至少一种嵌合抗原受体(CAR)，和(b)包括编码正交IL2细胞因子的核酸序列的溶瘤腺病毒载体，其中正交嵌合细胞因子受体包括正交IL2受体(oIL2R)的胞外结构域和非IL2R的细胞因子受体的胞内信号传导结构域。
在一些实施方式中，oIL2R的胞外结构域是正交IL2受体β(oIL2Rb)的胞外结构域。
在一些实施方式中，正交嵌合细胞因子受体的胞内信号传导结构域包括IL9R胞内信号传导结构域。
在一些实施方式中，IL9R胞内信号传导结构域是IL9R-α(IL9Ra)胞内信号传导结构域。
在一些实施方式中，CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域。
在一些实施方式中，抗原结合结构域选自全长抗体或其抗原结合片段、Fab、单链可变片段(scFv)或单域抗体。
在一些实施方式中，抗原结合结构域靶向肿瘤抗原。
在一些实施方式中，肿瘤抗原选自CD19、CD20、HER2、NY-ES0-1、MUC1、CD123、FLT3、B7-H3、CD33、IL1RAP、CLL1(CLEC12A)PSA、CEA、VEGF、VEGF-R2、CD22、ROR1、间皮素(mesothelin)、c-Met、糖脂F77、FAP、EGFRvIII、MAGE A3、5T4、WT1、KG2D配体、叶酸受体(FRa)和Wnt1抗原。
在一些实施方式中，抗原结合结构域是scFv。
在一些实施方式中，抗原结合结构域是抗间皮素scFv。
在一些实施方式中，CAR的胞内结构域包括选自TNFR超家族中蛋白质、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C和B7-H3(CD276)中的蛋白质或其变体的共刺激结构域，或源自杀伤性免疫球蛋白样受体(KIR)的胞内结构域。
在一些实施方式中，CAR的胞内结构域包括选自人CD3ζ链(CD3ζ)、FcγRIII、FcsRI、Fc受体的细胞质尾部、带有细胞质受体的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)、TCRζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的蛋白质或其变体的胞内信号传导结构域。
在一些实施方式中，(a)正交嵌合细胞因子受体包括oIL2Rb的胞外结构域和IL9Ra的胞内信号传导结构域，和(b)CAR包括抗间皮素抗原结合结构域。
在一些方面，本发明提供了一种治疗受试者中的癌症的方法，其包括：(a)向受试者施用有效量的经修饰的免疫细胞或其前体(经修饰的免疫细胞群)，其包括：(i)正交嵌合细胞因子受体，和(ii)至少一种CAR，和(b)向受试者施用包括编码正交IL2细胞因子的核酸序列的溶瘤腺病毒载体；其中正交嵌合细胞因子受体包括正交IL2受体(oIL2R)的胞外结构域和非IL2R的细胞因子受体的胞内信号传导结构域。
在一些实施方式中，oIL2R的胞外结构域是正交IL2受体β(oIL2Rb)的胞外结构域。
在一些实施方式中，正交嵌合细胞因子受体的胞内信号传导结构域包括IL9R胞内信号传导结构域。
在一些实施方式中，IL9R胞内信号传导结构域是IL9R-α(IL9Ra)胞内信号传导结构域。
在一些实施方式中，CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域。
在一些实施方式中，抗原结合结构域选自全长抗体或其抗原结合片段、Fab、单链可变片段(scFv)或单域抗体。
在一些实施方式中，抗原结合结构域靶向肿瘤抗原。
在一些实施方式中，肿瘤抗原选自CD19、CD20、HER2、NY-ES0-1、MUC1、CD123、FLT3、B7-H3、CD33、IL1RAP、CLL1(CLEC12A)PSA、CEA、VEGF、VEGF-R2、CD22、ROR1、间皮素、c-Met、糖脂F77、FAP、EGFRvIII、MAGE A3、5T4、WT1、KG2D配体、叶酸受体(FRa)和Wnt1抗原。
在一些实施方式中，抗原结合结构域是scFv。
在一些实施方式中，抗原结合结构域是抗间皮素scFv。
在一些实施方式中，CAR的胞内结构域包括选自TNFR超家族中蛋白质、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C和B7-H3(CD276)中的蛋白质或其变体的共刺激结构域，或源自杀伤性免疫球蛋白样受体(KIR)的胞内结构域。
在一些实施方式中，CAR的胞内结构域包括选自人CD3ζ链(CD3ζ)、FcγRIII、FcsRI、Fc受体的细胞质尾部、带有细胞质受体的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)、TCRζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的蛋白质或其变体的胞内信号传导结构域。
在一些实施方式中，(a)正交嵌合细胞因子受体包括oIL2Rb的胞外结构域和IL9Ra的胞内信号传导结构域，和(b)CAR包括抗间皮素抗原结合结构域。
在一些实施方式中，经修饰的免疫细胞群呈现干细胞记忆(Tscm)特征以及改善的运输和效应功能，从而治疗癌症。
在一些实施方式中，施用载体包括瘤内注射。
在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌和黑素瘤。
在一些实施方式中，胰腺癌是胰腺导管腺癌。
在一些方面，本发明提供了一种用于选择性激活细胞中的受体的系统，该系统包括：(a)经修饰的免疫细胞，该细胞经工程化以表达：(i)正交嵌合细胞因子受体，和(ii)至少一种T细胞受体(TCR)，和(b)包括编码正交IL2细胞因子的核酸序列的溶瘤腺病毒载体，其中正交嵌合细胞因子受体包括正交IL2受体(oIL2R)的胞外结构域和非IL2R的细胞因子受体的胞内信号传导结构域。
在一些实施方式中，oIL2R的胞外结构域是正交IL2受体β(oIL2Rb)的胞外结构域。
在一些实施方式中，正交嵌合细胞因子受体的胞内信号传导结构域包括IL9R胞内信号传导结构域。
在一些实施方式中，IL9R胞内信号传导结构域是IL9R-α(IL9Ra)胞内信号传导结构域。
在一些实施方式中，TCR靶向肿瘤抗原。
在一些实施方式中，TCR靶向gp100黑素瘤抗原或NYESO1。
在一些实施方式中，TCR是pmel-1TCR或NYESO1特异性TCR。
在一些实施方式中，(a)正交嵌合细胞因子受体包括oIL2Rb的胞外结构域和IL9Ra的胞内信号传导结构域，和(b)TCR是pmel-1TCR或NYESO1特异性TCR。
在一些方面，本发明提供了一种治疗受试者中的癌症的方法，其包括：(a)向受试者施用有效量的经修饰的免疫细胞或其前体(经修饰的免疫细胞群)，该细胞经修饰以表达(i)正交嵌合细胞因子受体，和(ii)至少一种T细胞受体(TCR)，和(b)向受试者施用包括编码正交IL2细胞因子的核酸序列的溶瘤腺病毒载体；其中正交嵌合细胞因子受体包括正交IL2受体(oIL2R)的胞外结构域和非IL2R的细胞因子受体的胞内信号传导结构域。
在一些实施方式中，oIL2R的胞外结构域是正交IL2受体β(oIL2Rb)的胞外结构域。
在一些实施方式中，正交嵌合细胞因子受体的胞内信号传导结构域包括IL9R胞内信号传导结构域。
在一些实施方式中，IL9R胞内信号传导结构域是IL9R-α(IL9Ra)胞内信号传导结构域。
在一些实施方式中，TCR靶向肿瘤抗原。
在一些实施方式中，TCR靶向gp100黑素瘤抗原或NYESO1。
在一些实施方式中，TCR是pmel-1TCR或NYESO1特异性TCR。
在一些实施方式中，(a)正交嵌合细胞因子受体包括oIL2Rb的胞外结构域和IL9Ra的胞内信号传导结构域，和(b)TCR是pmel-1TCR或NYESO1特异性TCR。
在一些实施方式中，经修饰的免疫细胞群呈现干细胞记忆(Tscm)特征以及改善的运输和效应功能，从而治疗癌症。
在一些实施方式中，施用载体包括瘤内注射。
在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌和黑素瘤。
在一些实施方式中，胰腺癌是胰腺导管腺癌。
附图说明
基于以下对示意性实施方式的详细描述并结合附图，本发明的上述及其他特征和优点将得到更充分的理解。
图1A-图1G图解了嵌合正交IL-2受体揭示了T细胞中IL-9R信号传导特性的发现。(图1A)野生型IL2Rβ受体、正交IL2β受体或γc家族正交IL2Rβ嵌合受体复合物示意图。所有含有正交受体和正交嵌合受体的载体也都含有IRES-YFP元件。(图1B)用MSA-IL2(100nM)(未填色)或MSA-oIL2(5μM)(填色)刺激表达正交嵌合受体的(YFP+)或未转导的(UTD)T细胞20’后的pSTAT信号传导的代表性直方图和定量。数据显示为平均荧光+/-SEM，n＝3。(图1C)用MSA-oIL2、MSA-IL2或IL9刺激o2R(红色)或o9R(蓝色)转导的T细胞20’后pSTAT信号传导的剂量反应曲线。数据显示为平均荧光+/-SEM；YFP+门控(gate)；n＝3。(图1D)用MSA-IL2(100nM)或MSA-oIL2(5μM)培养2天的表达嵌合受体的T细胞的CD62L表面标志物水平。(图1E)用MSA-IL2(100nM)或MSA-oIL2(5μM)培养2天的表达嵌合受体的T细胞的Fas的表面标志物水平。(图1F)用MSA-IL2(100nM)或MSA-oIL2(5μM)培养2天的表达嵌合受体的T细胞的Sca1的表面标志物水平。图1D-图1F中数据显示为平均荧光+/-SEM，n＝3。ns，无显著性；***，p<0.001；****，p<0.0001(ANOVA)。(图1G)在MSA-oIL2或MSA-IL2中培养4天后进行了至少分裂一次的o2R或o9R细胞的剂量反应曲线。数据显示为分裂百分比，在Flowjo中计算；YFP+门控；n＝3次生物学重复。
图2图解了用MSA-orthoIL2刺激表达orthoIL2RβICD嵌合受体的T细胞20’后的pSTAT信号传导的剂量反应曲线。数据显示为平均荧光+/-SEM，n＝3。
图3A-图3D提供了与mIL9R的表达和pSTAT信号传导有关的数据。(图3A)来自C57BL6转基因小鼠的模拟转导或mIL9R转导的T细胞上的IL9R的表达。(图3B)来自pmel1TCR转基因小鼠的模拟转导或mIL9R转导的T细胞上的IL9R的表达。(图3C)用MSA-IL2(100nM)(未填色)或IL9(1μM)(填色)刺激表达mIL9R(YFP+)的C57BL6 T细胞20’后的pSTAT信号传导的代表性直方图(上图)和定量(下图)。数据显示为平均荧光+/-SEM，n＝3。(图3D)用MSA-IL2或IL9刺激IL9R转导或模拟转导的pmel T细胞中的pSTAT信号传导的剂量反应曲线。
图4A-图4C提供了在没有MSA-oIL2[5μM](开放)或有MSA-oIL2[5μM](填充)的情况下，用10倍剂量滴定的MSA-IL2(从100nM开始)处理表达o9R的C57BL/6T细胞20’的pSTAT信号传导的相关数据。数据显示为平均荧光+/-SEM，n＝3，YFP(+)门控。(图4A)提供了pSTAT5信号传导的数据。(图4B)提供了pSTAT3信号传导的数据。(图4C)提供了pSTAT1信号传导的数据。
图5A-图5B提供体外增殖数据。(图5A)在MSA-IL2(开放符号)或MSA-orthoIL2(填充符号)中培养4天的表达orthoIL2Rb ICD嵌合受体的T细胞的剂量滴定体外增殖曲线。数据代表归一化为MSA-IL2中培养的每种不同的嵌合受体表达细胞的最大生长量的CD8+YFP(+)活细胞总数。n＝2+/-SEM。(图5B)在MSA-oIL2(填充曲线)或MSA-IL2(未填充曲线)中培养4天的用o2R(红色)或o9R(蓝色)转导的CTV标记T细胞的体外增殖。YFP(+)门控；所示为3个代表图中的1个。
图6A-图6B图解了o2R和o9R pmel T细胞的信号传导和增殖。(图6A)用MSA-oIL2(5μM)刺激30分钟后，o2R与o9R pmel T细胞中的STAT1、STAT3和STAT5磷酸化。所示为生物学重复的MFI和范围，在YFP+细胞上门控。*，调整后p<0.05；**，调整后p<0.005(非配对t检验，使用Holm-Sidak方法校正多重比较)。(图6B)所示为测量o2R或o9R pmel T细胞在用MSA-oIL2培养48小时后的体外增殖(以生长倍数衡量)的七个重复实验，(每个数据点代表平均值+/-SD，n＝3)。*，P<0.05(比率配对t检验)。
图7A-图7J图解了oIL9R信号传导改变pmel T细胞的表型和功能，使其在没有淋巴细胞清除(lymphodepletion)的情况下具有抗肿瘤功效的发现。(图7A)实验示意图。植入B16-F10黑素瘤的C57BL/6只小鼠在注射5×106pmel或对照C57BL/6T细胞之前进行淋巴细胞清除(或不进行淋巴细胞清除)，然后用MSA-IL2或MSA-oIL2(2.5×104U/天，腹腔注射)处理5天。(图7B)ACT七天后被过继转移的T细胞的外周血定量(平均值±SD，n＝5-6只小鼠/组)。**，P<0.01(非配对t检验)。(图7C)用o2R pmel ACT和MSA-IL2或MSA-oIL2处理的小鼠的肿瘤生长(平均值±SEM，n＝5-6只小鼠/组)。**，p<0.01(ANOVA)。数据代表三个独立实验。(图7D)用o9R pmel ACT和MSA-IL2或MSA-oIL2处理的小鼠的肿瘤生长(平均值±SEM，n＝5-6只小鼠/组)。**，p<0.01(ANOVA)。数据代表三个独立实验。(图7E)在用MSA-oIL2处理小鼠ACT后五天，肿瘤浸润o2R或o9R pmel T细胞的定量(CD8+Thy1.1+T细胞/克)。**，p<0.01(非配对t检验)。(图7F)与用MSA-IL2(50nM)或MSA-oIL2(5μM)预处理的o2R或o9R pmelT细胞(效应物与靶标比例为2:1)共培养的nRFP+B16-F10肿瘤细胞的体外生长(平均值±SD，n＝3)，用Incucyte活细胞成像系统测量。(图7G)用MSA-oIL2(5μM)体外处理o2R和o9Rpmel T细胞(n＝3个/组)48小时的opt-SNE聚簇(clustering)(左图)，每组的单独图仅图解了不同丰富度的聚簇(中图)，以及注释了不同特征的不同丰富度的聚簇的火山图(右图)。(图7H)用MSA-oIL2(5μM)处理的o2R和o9Rpmel T细胞之间差异表达基因的热图；还显示了用MSA-IL2(50nM)处理的组。(图7I)与T细胞干性和功能障碍(左图)及T细胞活化和效应功能(右图)相关的、并在用MSA-oIL2(5μM)处理的o9R和o2R pmel T细胞之间差异表达的人工编辑(curate)基因热图。(图7J)比较用MSA-oIL2处理的o9R和o2R pmel T细胞的转录因子基因组的归一化富集图(左图)。红色显示具有统计学意义的富集(调整后的p值<0.05)。用MSA-oIL2处理的o9R和o2R pmel T细胞中Jun与Fos的表达比(右图)。**，p<0.01(非配对t检验)。
图8A-图8C图解了o2R和o9R pmel T细胞在淋巴细胞清除和淋巴细胞完全(lymphoreplete)的环境下的抗肿瘤疗效。(图8A)用o2R pmel T细胞和mIL-2或oIL-2处理的B16-F10荷瘤小鼠的存活率。(图8B)用o9R pmel T细胞和mIL-2或oIL-2处理的B16-F10荷瘤小鼠的存活率。对于图8A-图8B：用mIL-2处理的BL/6T细胞作为脱靶T细胞对照。荷瘤的淋巴细胞清除的和非淋巴细胞清除的小鼠中的未转导pmel T细胞加mIL-2作为对照。(图8C)o9R pmel T细胞对淋巴细胞清除的宿主的影响。用o9R pmel T细胞和mIL-2、oIL-2或无IL2处理淋巴细胞清除的C57BL/6只小鼠的B16-F10肿瘤的肿瘤生长(平均值+/-SEM，左图)。
图9A-图9D图解了o9R pmel T细胞的运输、表型和功能。(图9A)在过继转移o2R(左图)和o9R(中图)pmel T细胞后7天，CD45+肿瘤浸润性白细胞的opt-SNE聚簇(n＝4只小鼠/组)。用o9R与o2R pmel T细胞处理的小鼠肿瘤中不同丰富度的聚簇的火山图(右图)。(图9B)用oIL-2处理的非淋巴细胞清除宿主中肿瘤浸润o9R和o2R pmel T细胞亚群的opt-SNE聚簇(n＝4小鼠/组，左图)，每个处理组的单独图仅图解了不同丰富度的聚簇(中图)，以及注释了不同特征的不同丰富度的聚簇的火山图(右图)。(图9C)通过多重IHC(红色＝CD3，橙色＝CD8，黄色＝PD1，绿色＝CD4，蓝绿色(teal)＝FOXP3)检测用o2R和oIL-2(左图)或o9Rpmel T细胞和oIL-2(右图)处理的非淋巴细胞清除宿主中CD3+CD8+T细胞和CD8+PD1+T细胞的肿瘤浸润。定量显示如下。(图9D)与B16-F10黑素瘤体外共培养24小时的oIL2R和oIL9R pmel T细胞的IFNγ分泌。T细胞在共培养前在体外用oIL-2(5μM)预处理48小时。*，p<0.05；非配对t检验。
图10图解了o9R和野生型IL-9R信号传导驱动Tscm表型的发现。CD62L、CD95(Fas)和CD44表面表达为CD8+Thy1.1+分选的o9R pmel T细胞、o2R pmel T细胞或野生型IL-9R转导的并用mIL-2(0.05μM)、oIL-2(5μM)或IL-9(.05μM)在体外处理48小时的pmel T细胞(pmel-IL9R)的百分比。ns，无显著性；****，p<0.0001；非配对t检验。
图11图解了在体外暴露于oIL-2或mIL-2 48小时后分选的pmel-o2R(n＝3)和pmel-o9R(n＝3)T细胞的无监督转录组学分析(RNA-seq)。基于主成分分析(PC1 v PC2，左图)，样品按处理组分开。在热图(右图)中按样品-样品距离排列时，样品按处理组聚集，用oIL-2处理的o9R pmel T细胞在四组中最明显。
图12图解了小鼠的肿瘤引流淋巴结(DLN)、脾脏或肿瘤中CD62L+o2R或o9R pmel T细胞(Thy1.1+YFP+)用MSA-oIL2处理的频率。组织在过继转移后一或五天收获。每个数据点代表一只小鼠，每组n＝3-5只小鼠。**，p<0.01；***，p<0.001；****，<0.0001；非配对t检验。
图13A-图13M图解了共同表达o2R和o9R受体的CAR T细胞的正交靶向。(图13A)在组成型巨细胞病毒(CMV)启动子下编码oIL-2的复制缺陷血清型5腺病毒载体Ad-oIL2的示意图(上图)。经由Ad-oIL2在细胞培养上清液中体外表达oIL-2(左下图；平均值±SEM，n＝3)。在瘤内(IT)注射1×109Ad-oIL2的病毒颗粒或每日腹腔注射(IP)25,000单位MSA-oIL2后72小时，肿瘤匀浆和血清中oIL-2表达的定量(右下图；平均值±SEM，n＝5只小鼠/组)。LITR，左侧倒置末端重复；RITR，右侧倒置末端重复。(图13B)在用MSA-IL2(100nM)或MSA-oIL2(5μM)刺激后30分钟，对未转导的(UTD)、CAR-o2R或CAR-o9R T细胞中pSTAT1/pSTAT3/pSTAT5表达的代表性蛋白质印迹分析。(图13C)在Xcelligence活细胞成像系统上测量的CAR-o2R和CAR-o9R T细胞(效应物与靶标比例为2:1)与MSA-oIL2(5μM)预温育48小时后对间皮素阳性PDA7940b肿瘤细胞的体外细胞杀伤作用(归一化细胞指数的平均值，n＝4)。(图13D)在用MSA-IL2(100nM)或MSA-oIL2(5μM)刺激后4天CAR-o2R/CAR-o9R T细胞上的代表性CD44和CD62L表面共表达。(图13E)在用MSA-IL2(100nM)或MSA-oIL2(5μM)刺激后4天CAR-o2R/CAR-o9R T细胞上的代表性Fas表达。(图13F)在用MSA-IL2(100nM)或MSA-oIL2(5μM)刺激4天后，CAR-o2R和CAR-o9RT细胞培养上清液中分泌的细胞因子的Luminex分析(平均值±SEM，n＝3/组)。****p<0.0001(ANOVA)。(图13G)用MSA-oIL2处理的o2R和o9R CAR T细胞之间差异表达基因的热图(左图)；也显示了用MSA-IL2处理的组。与T细胞干性和功能障碍以及T细胞活化和效应功能相关的人工编辑基因的热图(中图和右图)，以及用MSA-oIL2处理的小鼠中o9R和o2RCAR T细胞之间的差异表达。(图13H)利用KPC衍生的PDA7940b肿瘤的同基因过继CAR T细胞疗法小鼠模型的示意图。Ad-oIL2剂量，1×109VP。CAR T细胞剂量，5×106个细胞。CTX剂量，120mg/kg。SC，皮下；CTX，环磷酰胺；IP，腹腔注射；IT，瘤内；IV，静脉注射。(图13I)通过指定治疗组的PDA7940b肿瘤的单个生长曲线。(图13J)通过指定治疗组的PDA7940b肿瘤的单个生长曲线。(图13K)通过未使用环磷酰胺预处理(‘无CTX’)的指定治疗组的PDA7940b肿瘤的单个生长曲线。对于图13I至图13K，黑线表示因免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)而死亡的小鼠。n＝每组6-12只小鼠。CR，完全应答。Tox，由于神经毒性导致的死亡数。疗效实验重复两次。(图13L)与年龄匹配的空白小鼠(n＝10)相比，用PDA7940b(左图)再次攻击治愈的小鼠(来自图13J)的肿瘤体积。再次攻击的小鼠的外周血中CD45.1+淋巴细胞的定量(右图)。*P＜0.05，**P＜0.01(ANOVA)。ns，不显著。(图13M)在第9天(ACT后8天)肿瘤浸润的CAR T细胞的定量(左图)。在第9天IFNγ阳性肿瘤浸润的CAR T细胞的频率(右图)。*p<0.05，****p<0.0001(ANOVA)。
图14A-图14B图解了小鼠T细胞中的CAR和orthoIL-2Rβ共表达。(图14A)表达抗间皮素CAR和o2R(CAR-o2R)或o9R(CAR-o9R)的原代小鼠CD3+T细胞的示意图。(图14B)流式细胞术测定的未转导的(UTD)或逆转录病毒转导的CAR-o2R和CAR-o9R T细胞中代表性的间皮素CAR表达(上图)、IL-2Rβ表达(中图)和CAR/IL-2Rβ共表达(下图)。中图插图，未转导的和转导的T细胞中IL-2Rβ的平均荧光强度(MFI)。
图15A-图15B图解了o2R和o9R CAR T细胞的扩增和表型。(图15A)体外CAR T细胞扩增。CAR-o2R和CAR-o9R细胞在MSA-IL2(100nM)或MSA-oIL2(5μM)的存在下温育。每天从平板中取出等量的细胞，并用Calcein AM活性染料染色，并在Celigo Image Cytometer上计数。平均值±SEM，n＝3个重复孔/组。(图15B)CD44和CD62L在CAR T细胞上的共表达。代表性流式图的完整数据参见图13D。CAR-o2R和CAR-o9R细胞在MSA-IL2(100nM)或MSA-oIL2(5μM)存在下温育4天。CD44和CD62L的表面共表达通过流式细胞术在活的CAR+细胞上测定。平均值±SEM，n＝3/组。ns，无显著性。****p<0.0001(ANOVA)。
图16A-图16E图解了第11天的RNA ISH和血清毒性标志物。(图16A)Ad-oIL2+CAR-o2R图像。(图16B)Ad-oIL2+CAR-o9R图像。图16A-图16B：用对小鼠CAR(红色，Cy3)、小鼠间皮素(绿色，FITC)特异性的荧光探针染色并用DAPI(蓝色)反染色的脑和脑膜切片的代表性图像。CAR阳性细胞(白色箭头)和间皮素阳性脑膜细胞(紫色箭头)位于脑膜的蛛网膜层。(图16C)染色脑切片中CAR T细胞的半定量。平均值±SEM，2个切片/只小鼠，3只小鼠/组。*P<0.05(经韦尔奇校正的t检验)。(图16D)在治疗第11天的血清钙、磷、钾和尿酸水平。平均值±SEM，n＝3只小鼠/组。(图16E)在治疗第11天CRS相关细胞因子的血清水平。平均值±SEM，n＝3只小鼠/组。
图17A-图17C提供了与小鼠存活率和抗肿瘤疗效相关的数据。(图17A)接受CAR-o2R+Ad-oIL2和CAR-o9R T细胞+Ad-oIL2治疗的小鼠在接受或不接受条件化疗的情况下的存活率差异。图13I-13K是各治疗组的Kaplan-Meier存活曲线。**P<0.01，****P<0.0001(对数秩Mantel-Cox检验)。(图17B)用Ad-oIL2和CAR T细胞(无正交细胞因子受体)处理的小鼠的抗肿瘤疗效。在第0天和第4天用Ad-oIL2(1×109VP/肿瘤)，并且在第0天用CAR T细胞(5×106)处理已建立的皮下PDA7940b肿瘤。平均值±SEM，n＝5只小鼠/组。ns，无显著性。(图17C)用Ad-Null(无转基因)和CAR-o2R T细胞处理的小鼠的抗肿瘤疗效。在第0天和第4天用Ad-Null(1×109VP/瘤)，并且在第0天用CAR-o2R T细胞(5×106)处理已建立的皮下PDA7940b肿瘤。平均值±SEM，n＝5只小鼠/组。ns，无显著性。
图18A-图18G图解了人嵌合正交IL-2Rβ/IL-9R驱动TCR工程T细胞的干性和多功能性的发现。(图18A)共同表达ho2R或ho9R和NY-ESO-1TCR并用MSA-hoIL2或MSA-hIL2刺激20’的人T细胞中的pSTAT信号传导。数据显示为平均荧光+/-SEM，n＝3。(图18B)经MSA-hoIL2(1μM)或MSA-hIL2(0.1μM)处理的ho2R/NYESO1-TCR和ho9R/NYESO1-TCR工程化的人T细胞在六天内的倍数扩增。(图18C)在用MSA-hoIL2(1μM)培养六天后，ho2R/NYESO1-TCR和ho9R/NYESO1-TCR工程化的人T细胞的免疫表型。显示了在YFP+T细胞上门控的CD45RA和CD27表达(上行)以及在CD45RA+CD27+群体上门控的CD95和CCR7表达(由箭头和虚线指示)的代表性图。CD45RA+CD27+CD95+CCR7+TSCM细胞作为YFP+群体百分比的定量显示在右侧条形图中。****，p<0.0001(非配对t检验，n＝3/组)。(图18D)用MSA-hoIL2(1μM)或MSA-hIL2(0.1μM)体外培养的TSCM和TCM细胞相对于第2天的倍数扩增。*，p<0.05；**，p<0.01(非配对t检验，n＝3/组)。(图18E)在MSA-hoIL2存在下，将共同表达ho2R或ho9R和与MSA-hoIL2(1μM)预温育48小时的NY-ESO-1TCR的T细胞与表达nRFP(nRFP-M407)的HLA*0201+NY-ESO-1+黑素瘤肿瘤细胞系以1:1的E:T比例共培养。将在MSA-hIL2(1nM)存在下的未转导的T细胞用作阴性对照。每隔72小时将肿瘤细胞(105)再次引入共培养物中(浅蓝色箭头)；每次肿瘤攻击前24小时将MSA-hoIL2(1μM)加入培养物中。每隔2小时采集一次活细胞图像，并基于RFP表达测定肿瘤的汇合百分比。第四次肿瘤攻击后，收获T细胞进行表型分析(见图18F)和再刺激及细胞内细胞因子染色(ICS)(参见图18G)。(图18F)定量CD45RA+CD27+和TSCM细胞占YFP+T细胞的百分比，以及CD62L和CXCR3 MFI(YFP+门控)。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001(非配对t检验，n＝2/组)。(图18G)在图18E的第四次肿瘤攻击后，用αCD3/αCD28激活抗体、黑素瘤细胞系M407(HLA*0201+NY-ESO-1+)或M263(HLA*0201-NY-ESO-1-)再次刺激T细胞4小时。通过ICS对CD8+YFP+T细胞中的IFNγ、TNFα和IL-2进行定量。圆环图(donut chart)表示每组中表达3种细胞因子中的0、1、2或3种的CD8+YFP+T细胞的比例。ns，无显著性；****，P<0.0001(双因素ANOVA，n＝3/组)。
图19A-图19D图解了人嵌合正交IL-2Rβ/IL-9R即使在重复抗原特异性肿瘤攻击后也能驱动具有干样表型的多功能T细胞的发现。(图19A)正常健康供体T细胞与ho2R和NYESO1-TCR(左)或ho9R和NYESO1-TCR(右)共转导的流式图，由识别NYESO1-TCR克隆1G4β链的抗人Vβ13.1抗体和YFP(o2R或o9R载体的内部标记)检测。显示了共转导效率。(图19B)对图18C中显示的ho2R/NYESO1-TCR和ho9R/NYESO1-TCR T细胞中YFP+群体进行免疫分型的门控策略。(图19C)ho2R/NYESO1 TCR和ho9R/NYESO1 TCR工程化的人T细胞在用MSA-hoIL2(1μM)培养两天后的免疫表型。显示了TSCM细胞占YFP+群体的百分比的条形图定量。**，p<0.01(非配对t检验，n＝3/组)。(图19D)收获图13E中的T细胞，并用αCD3/αCD28免疫磁珠、黑素瘤细胞系M407(HLA*0201+NY-ESO-1+)或M263(HLA*0201+NY-ESO-1-)重新刺激4小时。通过ICS对YFP+CD4 T细胞(CD8-)中的IFNγ、TNFα和IL-2进行定量。
图20提供了本文所述的实验中使用的试剂的表。
图21图解了间皮素基因敲除细胞系的产生。通过CRISPR/Cas9对间皮素阳性的PDA7940b肿瘤细胞进行编辑以敲除间皮素，并通过FACS分选至纯度。在实时细胞杀伤测定(RTCA)中，抗间皮素CAR T细胞能杀死野生型细胞(PDA7940bMSLN+)，但不能杀死KO细胞(PDA7940bMSLN-)。
图22图解了肿瘤抗原的扩散。用间皮素阳性(PDA7940bMSLN+)和间皮素阴性(PDA7940bMSLN-)的肿瘤细胞重新攻击先前用联合疗法治愈的小鼠。在测量肿瘤大小之前使肿瘤生长24天后。年龄匹配的空白小鼠作为肿瘤生长的对照。
图23A-图23B提供了与人orthoIL-2有关的数据。图23A提供了图解经由Ad5/3-D24-hoIL2在体外表达人orthoIL-2的图。A549细胞被Ad5/3-D24-hoIL2或同基因对照病毒Ad5/3-D24感染或模拟感染。感染后96小时，收集50ul细胞培养上清液，并用人IL-2ELISA进行分析。图23B提供了图解经由氯化铯(CsCl)梯度纯化编码人orthoIL-2的纤维嵌合溶瘤腺病毒Ad5/3-D24-hoIL2的照片。红色箭头表示含有通过用针头和注射器刺穿试管侧面收集的完整病毒颗粒的条带。通过两轮缓冲液交换去除CsCl。
图24A-图24B提供了图解人T细胞中人ortho-受体和PSMA-重新靶向的CAR共同表达的数据。图24A提供了图解在感染后48小时PSMA28z CAR和全长人orthoIL2Rb受体的共同表达的流式细胞术数据。图24B提供了图解在感染后48小时PSMA28z CAR和嵌合orthoIL2Rb/IL9Ra转换受体的共同表达的流式细胞术数据。
具体实施方式
在一个方面，本发明提供了用于包括正交嵌合细胞因子受体(例如，oIL2R-IL9R嵌合受体)和至少一种嵌合抗原受体(CAR)的经修饰的免疫细胞或其前体(例如，经修饰的T细胞)的组合物和方法。本公开内容进一步提供了包括编码正交细胞因子(例如，oIL2)的核酸序列的溶瘤腺病毒载体。还提供了使用经修饰的细胞和载体治疗癌症的方法。在一个方面，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括将(a)包括正交嵌合细胞因子受体和至少一种CAR的经修饰的细胞和(b)包括编码正交细胞因子的核酸序列的溶瘤腺病毒载体施用至患有癌症的受试者，其中经修饰的T细胞在受试者中呈现干细胞记忆(Tscm)特征以及改善的运输和效应功能，从而治疗癌症。
在另一方面，本发明提供了用于包括正交嵌合细胞因子受体(例如，oIL2R-IL9R嵌合受体)和至少一种T细胞受体(TCR)的经修饰的免疫细胞或其前体(例如，经修饰的T细胞)的组合物和方法。本公开内容进一步提供了包括编码正交细胞因子(例如，oIL2)的核酸序列的溶瘤腺病毒载体。还提供了使用经修饰的细胞和载体治疗癌症的方法。在一个方面，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括将(a)包括正交嵌合细胞因子受体和至少一种TCR的经修饰的细胞和(b)包括编码正交细胞因子的核酸序列的溶瘤腺病毒载体施用至患有癌症的受试者，其中经修饰的T细胞在受试者中呈现干细胞记忆(Tscm)特征以及改善的运输和效应功能，从而治疗癌症。
应当理解的是，本公开内容中描述的方法并不限于本文公开的特定方法和实验条件，因为这些方法和条件可能会有所不同。还应理解的是，本文中使用的术语仅用于描述特定的实施方式，并不具有限制性。
此外，本文所述的实验，除非另有说明，均采用本领域技术人员众所周知的常规分子和细胞生物学及免疫学技术。这些技术是技术人员所众所周知的，并在文献中作了充分解释。例如，参见Ausubel等人编，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons，Inc.，NY，N.Y.(1987-2008)，包括所有增刊，分子克隆：ALaboratory Manual(第四版)，MR Green and J.Sambrook and Harlow等人，抗体：ALaboratory Manual，Chapter 14，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(2013，第2版)。
A.定义
除非另有定义，否则本文所使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。如果存在任何潜在的歧义，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。除非另有说明，否则使用“或”表示“和/或”。使用术语“包括(including)”以及其他形式，如“包括(includes)”和“包括(included)”不具有限制性。
一般来说，本文所述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交有关的术语是本领域众所周知并且常用的术语。除非另有说明，否则本文提供的方法和技术通常根据本领域众所周知的常规方法以及本说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述的方法和技术进行。酶促反应和纯化技术按照制造商的说明书、本领域通常实现的或本文所述的进行。与本文所述的分析化学、合成有机化学、药物化学和制药化学结合使用的术语、实验室程序和技术均为本领域众所周知的并且常用的术语。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配方和给药以及病人治疗。
为了更容易地理解所公开的内容，下文对选择术语进行了定义。
本文中使用的冠词“一(a)”和“一(an)”是指一个或多于一个(即，至少一个)冠词的语法对象。例如，“一种元素(an element)”是指一种元素或多于一种元素。
当本文所使用的“约(about)”指可测量值，比如量、时间长度等时，是指包括与规定值相差±20％或±10％，更优选地±5％，甚至更优选地±1％，并且更优选地±0.1％的变化，因为这种变化适合于执行所公开的方法。
本文所使用的“活化(activation)”是指T细胞受到充分刺激以诱导可检测到的细胞增殖的状态。活化还可与诱导细胞因子的产生和可检测的效应功能相关联。术语“活化的T细胞(activated T cell)”指的是正在进行细胞分裂的T细胞等。
本文所使用的“缓解(alleviate)”疾病是指降低疾病的一种或多种症状的严重程度。
如本文所使用的术语“抗原(antigen)”被定义为引起免疫反应的分子。这种免疫反应可能涉及抗体的产生，或特异性免疫功能细胞的激活，或两者。熟练的技术人员会明白，任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽，都可以作为抗原。
此外，抗原还可以源自重组DNA或基因组DNA。熟练的技术人员会明白，任何DNA，包括编码能引起免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列，因此编码“抗原”(如该术语在本文所使用的)。此外，本领域的技术人员可以理解，抗原不一定仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种不同的组合方式排列，以引起所需的免疫反应。此外，熟练的技术人员会明白，抗原根本不需要由“基因(gene)”编码。显而易见的是，抗原可以是合成产生的，或者可以源自生物样品。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物液体。
如本文所使用的，术语“自体的(autologous)”指的是来源于同一个体，随后将被重新引入该个体的任何材料。
“共刺激分子(co-stimulatory molecule)”是指T细胞上的同源结合伴侣，它特异性地与共刺激配体结合，从而介导T细胞的共刺激反应，例如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。
本文所使用的“共刺激信号(co-stimulatory signal)”是指与主信号(比如TCR/CD3连接)结合可导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。
“疾病(disease)”是指动物的一种健康状态，其中动物无法维持稳态，并且其中如果疾病得不到改善，动物的健康就会继续恶化。与此相反，动物的“失调(disorder)”是一种健康状态，其中动物能够维持稳态，但其健康状况比没有失调时要差。如果不加以治疗，失调并不一定会导致动物的健康状况进一步恶化。
本文所使用的术语“下调(downregulation)”是指一个或多个基因的表达的减少或消失。
“有效量(effective amount)”或“治疗有效量(therapeutically effectiveamount)”在本文中可互换使用，并且是指有效地达到特定的生物学效果或提供治疗或预防益处的本文所述的化合物、制剂、材料或组合物的量。这种结果可包括但不限于这样的量，与不存在本发明的组合物的情况下检测到的免疫反应相比，当向哺乳动物施用时导致可检测到一定程度的免疫抑制或耐受的量。免疫反应可通过大量公认的技术方法进行评估。熟练的技术人员会明白，本文施用的组合物的量是不同的，并且可以基于许多因素来确定，比如治疗的疾病或病症、接受治疗的哺乳动物的年龄、健康和身体状况、疾病的严重程度、施用的具体化合物等。
“编码(encoding)”是指多核苷酸(比如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列在生物过程中作为合成其他聚合物和大分子的模板的固有特性，这些聚合物和大分子具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物特性。因此，如果与基因相对应的mRNA的转录和翻译能在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，那么该基因就能编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同，并且通常以序列表的形式提供)和非编码链(用作基因或cDNA的转录模板)均可称为编码蛋白质或该基因或cDNA的其他产物。
本文所使用的“内源的(endogenous)”是指来自或产生于生物体、细胞、组织或系统内部的任何物质。
本文所使用的术语“表位(epitope)”被定义为抗原上可引起免疫反应、诱导B和/或T细胞反应的的小的化学分子。抗原可以有一个或多个表位。大多数抗原具有许多表位；即，它们是多价的。一般来说，表位的大小大致约为10个氨基酸和/或糖。优选地，表位为约4-18个氨基酸，更优选地为约5-16个氨基酸，并且甚至更优选地为6-14个氨基酸，更优选地为约7-12个氨基酸，和最优选地为约8-10个氨基酸。本领域技术人员理解，一般来说，整体三维结构，而不是分子的特定线性序列，是抗原特异性的主要标准，并且因此可以将一个表位与另一个表位区分开来。基于本公开内容，本发明中使用的肽可以是表位。
本文所使用的术语“外源的(exogenous)”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或产生的任何物质。
本文所使用的术语“扩增(expand)”是指数量的增加，如T细胞数量的增加。在一个实施方式中，离体扩增的T细胞的数量相对于培养物中最初存在的数量有所增加。在另一个实施方式中，离体扩增的T细胞的数量相对于培养物中的其他细胞类型的数量有所增加。本文所使用的术语“离体(ex vivo,)”是指从活体(例如，人)中取出并在生物体外(例如，培养皿、试管或生物反应器中)繁殖的细胞。
本文所使用的术语“表达(expression)”被定义为由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
“表达载体(expression vector)”是指包括重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包括与待表达的核苷酸序列操作性的连接的表达控制序列。表达载体包括足够的顺式作用表达元件；其他表达元件可由宿主细胞或体外表达系统提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，比如并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中)和病毒(例如，仙台病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
本文所使用的“同一性(identity)”是指两个聚合分子，特别是两个氨基酸分子，如两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个氨基酸序列在相同位置上具有相同的残基时；例如，如果两个多肽分子中每一个的位置都被精氨酸占据，那么它们在该位置上是相同的。在比对中，两个氨基酸序列在相同位置上具有相同残基的同一性或程度通常表示为百分比。两个氨基酸序列之间的同一性是匹配或相同位置的数量的直接函数；例如，如果两个序列中一半的位置(例如，长度为10个氨基酸的聚合物中的5个位置)是相同的，则这两个序列有50％是相同的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配或相同的，则这两个氨基酸序列有90％是相同的。
本文所使用的术语“免疫反应(immune response)”被定义为当淋巴细胞将抗原分子识别为外来物并诱导形成抗体和/或激活淋巴细胞清除抗原时发生的对抗原的细胞应答。
术语“免疫抑制(immunosuppressive)”在本文中用于指降低整体免疫反应。
“分离的(isolated)”是指改变或脱离自然状态。例如，天然存在于活体动物体内的核酸或肽不是“分离的”，但从其天然状态的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非原生环境，诸如例如宿主细胞中。
本文所使用的“慢病毒(lentivirus)”是指逆转录病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中是独一无二的，因为它可以感染不分裂的细胞；它可以将大量遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此是基因传递载体中最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。由慢病毒衍生的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的方法。
本文所使用的“修饰的(modified)”是指本发明的分子或细胞的改变的状态或结构。分子可通过包括化学、结构和功能上的多种方式进行修饰。细胞可通过引入核酸进行修饰。
本文所使用的术语“调节(modulating)”是指与没有治疗或化合物的情况下受试者的反应水平相比，和/或与其他相同但未经治疗的受试者的反应水平相比，介导受试者反应水平的可检测的增加或减少。该术语包括扰乱和/或影响原生信号或反应，从而介导受试者(优选地是人)的有益治疗反应。
在本发明的上下文中，使用经常出现的核酸碱基的以下缩写。“A”指腺苷，“C”指胞嘧啶，“G”指鸟苷，“T”指胸苷，和“U”指尿苷。
术语“寡核苷酸(oligonucleotide)”通常指短的多核苷酸。将理解的是，当核苷酸序列由DNA序列(即，A、T、C、G)表示时，这还包括RNA序列(即，A、U、C、G)，其中“U”取代了“T”。
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列(nucleotide sequenceencoding an amino acid sequence)”包括彼此为简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质或RNA的短语核苷酸序列还可包括内含子，达到编码蛋白质的核苷酸序列在某些形式中含有内含子(一种或多种)的程度。
免疫原组合物的“肠胃外(parenteral)”施用包括皮下(s.c.)、静脉(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射或输液技术等。
本文所使用的术语“多核苷酸(polynucleotide)”被定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文所使用的核酸和多核苷酸可以互换。本领域技术人员一般都知道核酸是多核苷酸，其可以水解成单体“核苷酸(nucleotide)”。单体核苷酸可以水解成核苷。本文所使用的多核苷酸包括但不限于通过本领域任何方法获得的所有核酸序列，该方法包括但不限于重组方法，即，使用普通克隆技术和PCR等从重组文库或细胞基因组中克隆核酸序列，以及合成方法。
如本文中所使用的，术语“肽(peptide)”、“多肽(polypeptide)”和“蛋白质(protein)”可互换使用，并且是指由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或多肽必须至少包含两个氨基酸，并且不限制可包括蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量。多肽包括任何由通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的肽或蛋白质。如本文中所使用的，该术语指短链，其在本领域通常也称为例如肽、寡肽和寡聚体等，并且还指长链，其在本领域通常被称为蛋白质，有多种类型。“多肽(polypeptide)”包括例如，生物活性片段、基本同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽变体、修饰多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
如本文中相对于抗体所使用的术语“特定地结合(specifically bind)”是指能识别特异性抗原，但是基本上不能识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，与来自一个物种的抗原特异性结合的抗体也可能与来自一个或多个物种的抗原结合。但是，这种跨物种反应性本身并不会改变抗体的特异性分类。在另一个实例中，与抗原特异性结合的抗体也可能与抗原的不同等位基因形式结合。然而，这种交叉反应性本身并不会改变抗体的特异性分类。在一些情况下，术语“特异性结合(specific binding)”或“特定地结合(specifically bind)”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二种化学物质的相互作用，意指这种相互作用取决于化学物质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体可识别并结合特定的蛋白质结构，而不是一般的蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，那么在含有标记“A”和抗体的反应中，如果存在含有表位“A”的分子(或游离的、未标记的“A”)，则会减少与抗体结合的标记“A”的量。
术语“刺激(stimulation)”是指由刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体结合而诱导，从而介导信号传导事件，比如，但不限于经由TCR/CD3复合物的信号传导的初级反应。刺激可介导某些分子表达的改变，比如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的重组等。
如本文所使用的术语“刺激分子(stimulatory molecule)”是指与存在于抗原呈递细胞上的同源刺激配体特异性结合的T细胞上的分子。
如本文中所使用的，“刺激配体(stimulatory ligand)”是指这样的一种配体，当存在于抗原呈递细胞(例如aAPC、树突细胞、B细胞等)上时，可与T细胞上的同源结合伴侣(本文称为“刺激分子”)特异性结合，从而介导T细胞的初级反应，包括但不限于活化、启动免疫反应、增殖等。刺激配体在本领域是众所周知的，并且包括装载有肽的MHC I类分子、抗-CD3抗体、超级激动剂抗-CD28抗体和超级激动剂抗-CD2抗体等。
术语“受试者(subject)”包括可引起免疫反应的活生物体(例如，哺乳动物)。如本文中所使用的，“受试者(subject)”或“患者(patient)”可以是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括例如家畜和宠物，比如绵羊、牛、猪、犬、猫和鼠类哺乳动物，以及类人猿和非人灵长类哺乳动物。优选地，受试者是人。
“靶位点(target site)”或“靶序列(target sequence)”是指定义了结合分子在足以发生结合的条件下可与其特异性结合的核酸部分的核酸序列。在一些实施方式中，靶序列是指定义了结合分子在足以发生结合的条件下可与其特异性结合的核酸部分的基因组核酸序列。
如本文中所使用的，术语“T细胞受体(T cell receptor)”或“TCR”是指响应抗原递呈参与激活T细胞的膜蛋白复合物。TCR负责识别与主要组织相容性复合物分子结合的抗原。TCR由alpha(α)和beta(β)链的异二聚体组成，尽管在一些细胞中，TCR由γ和δ(γ/δ)链组成。TCR可能以α/β和γ/δ形式存在，它们在结构上相似，但是在解剖位置和功能上各不相同。每条链都由两个胞外结构域(可变结构域和恒定结构域)组成。在一些实施方式中，TCR可在包括TCR的任何细胞上进行修饰，例如包括辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、记忆性T细胞、调节性T细胞、自然杀伤性T细胞和γ-δT细胞。
本文所使用的术语“治疗的(therapeutic)”是指治疗和/或预防。治疗效果通过抑制、缓解或根除疾病状态而获得。
本文所使用的术语“转染(transfected)”或“转化(transformed)”或“转导(transduced)”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的(transfected)”或“转化的(transformed)”或“转导的(transduced)”细胞是指被外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代受试细胞及其后代。
如本文所使用的术语“治疗(treat)”疾病是指降低受试者所经历的疾病或紊乱的至少一种体征或症状的频率或严重程度。
“载体(vector)”是一种包括分离的核酸并且可用于将分离的核酸传递到细胞内部的物质组合物。很多载体在本领域是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应解释为包括非质粒和非病毒化合物，它们有助于将核酸转移到细胞，诸如例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等中。病毒载体的实例包括但不限于仙台病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
“直向同源物(ortholog)”或“正交细胞因子/受体对(orthogonal cytokine/receptor pair)”是指基因工程化的蛋白质对，其通过氨基酸的改变而被修饰，以(a)展现与原生细胞因子或同源受体显著降低的亲和力；和(b)与对应的工程化的(正交)细胞因子或受体特异性结合。在与正交细胞因子结合后，正交细胞因子受体激活信号传导，信号传导通过原生细胞元件转导以提供模拟原生反应的生物活性，但是其对表达正交受体的工程化的细胞具有特异性。工程化的正交细胞因子/受体对已在WO 2017/044464和WO 2019/173773等文献中描述，其通过引用并入本文。正交细胞因子/受体对用于将杂乱的细胞因子的活性导向感兴趣的T细胞亚群，从而通过基因工程实现对T细胞功能的精确控制。
“正交嵌合细胞因子受体(orthogonal chimeric cytokine receptor)”是指包括正交细胞因子受体的胞外结构域和与正交细胞因子受体所来自的细胞因子受体不同的细胞因子受体的胞内信号传导结构域的细胞因子受体。与正交细胞因子结合后，正交嵌合细胞因子受体激活通过原生细胞元件转导的信号以提供模拟胞内信号传导结构域所来自的受体的原生反应的生物活性，但该活性对表达正交嵌合细胞因子受体的工程化细胞具有特异性。
范围：在整篇本公开内容中，本发明的各个方面可以用范围的格式来表示。应当理解，以范围格式进行描述只是为了方便和简洁，并且不应被理解为对本发明的范围的僵化限制。因此，对范围的描述应被解释为已具体公开了该范围内所有可能的子范围以及各个数值。例如，对1至6这样的范围的描述应被解释为已具体公开了1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等子范围，以及该范围内的各个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
B.正交嵌合细胞因子受体/细胞因子对
在一个方面，本发明提供了正交嵌合细胞因子受体/细胞因子对及其使用方法。在一些实施方式中，正交嵌合细胞因子受体包括正交IL-2受体(oIL2R)的胞外结构域和IL-9受体(IL9R)的胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，正交嵌合细胞因子受体包括正交IL-2受体β(oIL2Rb)的胞外结构域和IL-9受体α(IL9Ra)的胞内信号传导结构域。正交嵌合细胞因子受体胞外结构域(即，oIL2Rb)与对应的工程化的正交细胞因子(即，oIL2)特异性地结合。
在通过oIL2R胞外结构域与正交IL2细胞因子(oIL2)结合后，正交嵌合细胞因子受体激活胞内信号传导结构域(例如，IL9R胞内信号传导结构域)的信号传导，该信号传导通过原生细胞元件转导以提供了模拟胞内信号传导结构域所源自的受体的原生反应的生物活性，但是该活性对表达正交嵌合细胞因子受体的工程化细胞具有特异性。正交嵌合细胞因子受体不与内源性对应细胞因子结合，包括正交细胞因子的原生对应物(例如，IL-2)，而正交细胞因子(例如，oIL2)不与任何内源性受体结合，包括正交胞外结构域所源自的正交受体的原生对应物(例如，IL-2R)。在一些实施方式中，正交细胞因子对正交嵌合细胞因子受体的亲和力与原生细胞因子对正交胞外结构域所源自的原生受体的亲和力相当。
下面提供了本发明的示例性正交细胞因子和正交嵌合细胞因子受体的核苷酸和氨基酸序列。
人ortho-IL2 cDNA(SEQ ID NO:1)
人ortho-IL2蛋白(SEQ ID NO:2)
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLSQLLVLLKAILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
人orthoIL2Rb cDNA(SEQ ID NO:3)
ATGGCGGCCCCTGCTCTGTCCTGGCGTCTGCCCCTCCTCATCCTCCTCCTGCCCCTGGCTACCTCTTGGGCATCTGCAGCGGTGAATGGCACTTCCCAGTTCACATGCTTCTACAACTCGAGAGCCAACATCTCCTGTGTCTGGAGCCAAGATGGGGCTCTGCAGGACACTTCCTGCCAAGTCCATGCCTGGCCGGACAGACGGCGGTGGAACCAAACCTGTGAGCTGCTCCCCGTGAGTCAAGCATCCTGGGCCTGCAACCTGATCCTCGGAGCCCCAGATTCTCAGAAACTGACCACAGTTGACATCGTCACCCTGAGGGTGCTGTGCCGTGAGGGGGTGCGATGGAGGGTGATGGCCATCCAGGACTTCAAGCCCTTTGAGAACCTTCGCCTGATGGCCCCCATCTCCCTCCAAGTTGTCCACGTGGAGACCCACAGATGCAACATAAGCTGGGAAATCTCCCAAGCCTCCGACTTCTTTGAAAGACACCTGGAGTTCGAGGCCCGGACGCTGTCCCCAGGCCACACCTGGGAGGAGGCCCCCCTGCTGACTCTCAAGCAGAAGCAGGAATGGATCTGCCTGGAGACGCTCACCCCAGACACCCAGTATGAGTTTCAGGTGCGGGTCAAGCCTCTGCAAGGCGAGTTCACGACCTGGAGCCCCTGGAGCCAGCCCCTGGCCTTCAGGACAAAGCCTGCAGCCCTTGGGAAGGACACCATTCCGTGGCTCGGCCACCTCCTCGTGGGTCTCAGCGGGGCTTTTGGCTTCATCATCTTAGTGTACTTGCTGATCAACTGCAGGAACACCGGGCCATGGCTGAAGAAGGTCCTGAAGTGTAACACCCCAGACCCCTCGAAGTTCTTTTCCCAGCTGAGCTCAGAGCATGGAGGAGACGTCCAGAAGTGGCTCTCTTCGCCCTTCCCCTCATCGTCCTTCAGCCCTGGCGGCCTGGCACCTGAGATCTCGCCACTAGAAGTGCTGGAGAGGGACAAGGTGACGCAGCTGCTCCTGCAGCAGGACAAGGTGCCTGAGCCCGCATCCTTAAGCAGCAACCACTCGCTGACCAGCTGCTTCACCAACCAGGGTTACTTCTTCTTCCACCTCCCGGATGCCTTGGAGATAGAGGCCTGCCAGGTGTACTTTACTTACGACCCCTACTCAGAGGAAGACCCTGATGAGGGTGTGGCCGGGGCACCCACAGGGTCTTCCCCCCAACCCCTGCAGCCTCTGTCAGGGGAGGACGACGCCTACTGCACCTTCCCCTCCAGGGATGACCTGCTGCTCTTCTCCCCCAGTCTCCTCGGTGGCCCCAGCCCCCCAAGCACTGCCCCTGGGGGCAGTGGGGCCGGTGAAGAGAGGATGCCCCCTTCTTTGCAAGAAAGAGTCCCCAGAGACTGGGACCCCCAGCCCCTGGGGCCTCCCACCCCAGGAGTCCCAGACCTGGTGGATTTTCAGCCACCCCCTGAGCTGGTGCTGCGAGAGGCTGGGGAGGAGGTCCCTGACGCTGGCCCCAGGGAGGGAGTCAGTTTCCCCTGGTCCAGGCCTCCTGGGCAGGGGGAGTTCAGGGCCCTTAATGCTCGCCTGCCCCTGAACACTGATGCCTACTTGTCCCTCCAAGAACTCCAGGGTCAGGACCCAACTCACTTGGTGTGA
人orthoIL2Rb蛋白(SEQ ID NO:4)
MAAPALSWRLPLLILLLPLATSWASAAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASDFFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDTIPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV
人orthoIL2Rb/IL9Ra cDNA (SEQ ID NO:5)
ATGGCCGCCCCCGCCCTGTCTTGGAGACTGCCCCTCCTGATCCTGCTGCTGCCTCTGGCTACAAGCTGGGCTTCTGCCGCTGTGAACGGCACCAGCCAATTTACCTGCTTCTACAACTCCCGGGCCAACATCTCTTGCGTGTGGTCCCAAGACGGCGCCCTGCAAGATACCAGCTGTCAGGTGCACGCCTGGCCTGATAGACGGAGATGGAACCAGACCTGCGAGCTGCTTCCAGTGTCTCAGGCCAGCTGGGCCTGTAATTTGATCCTGGGCGCTCCCGACAGCCAGAAACTGACCACCGTGGACATCGTGACCCTGAGGGTGCTTTGTAGAGAGGGCGTTAGATGGCGGGTGATGGCCATCCAGGATTTCAAACCCTTCGAAAACCTGAGACTCATGGCCCCAATCAGCCTGCAGGTGGTGCATGTGGAAACACACAGATGCAACATCAGCTGGGAGATCAGCCAGGCCAGCGACTTCTTCGAGCGGCACCTGGAATTTGAGGCCAGAACCCTGTCCCCAGGCCACACATGGGAAGAGGCCCCCCTGCTGACACTGAAGCAGAAGCAGGAGTGGATCTGCCTGGAGACACTGACCCCTGATACACAGTACGAGTTTCAGGTCAGAGTTAAGCCCCTGCAGGGAGAATTCACCACCTGGTCTCCTTGGAGCCAGCCTCTGGCCTTCAGAACCAAGCCTGCCCAGAGACAGGGTCCTCTGATTCCTCCTTGGGGCTGGCCCGGCAATACCCTGGTGGCCGTGTCTATCTTTCTGCTCCTGACAGGCCCCACCTACCTGCTGTTCAAGCTGTCCCCTAGAGTGAAGCGGATCTTCTACCAGAACGTGCCTAGCCCGGCCATGTTCTTCCAACCTCTGTACAGCGTGCACAACGGCAACTTCCAAACCTGGATGGGCGCCCACGGCGCCGGCGTGCTGCTGAGCCAGGACTGCGCCGGCACCCCTCAGGGCGCACTGGAACCTTGTGTGCAGGAGGCCACAGCCCTGCTGACATGCGGCCCTGCCCGCCCTTGGAAGAGCGTGGCCCTGGAAGAAGAGCAGGAGGGCCCCGGCACCAGACTGCCTGGAAATCTGAGCTCTGAGGACGTGCTGCCTGCTGGCTGTACCGAGTGGCGGGTGCAGACACTGGCTTATCTGCCCCAGGAGGACTGGGCCCCTACATCTCTGACTAGACCTGCCCCTCCAGACTCTGAAGGCTCTAGGTCTAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAACAACAATTACTGCGCCCTGGGCTGCTACGGCGGATGGCACCTGAGCGCCCTGCCTGGCAACACCCAGAGCAGCGGCCCCATCCCTGCCCTGGCTTGCGGCCTGTCATGCGACCACCAGGGACTGGAAACCCAGCAGGGCGTGGCTTGGGTCCTGGCCGGGCACTGCCAGCGGCCTGGACTGCACGAGGATCTGCAAGGAATGCTGCTGCCCAGCGTGCTGAGCAAGGCCAGAAGCTGGACCTTCTAA
人orthoIL2Rb/IL9Ra蛋白(SEQ ID NO:6)
MAAPALSWRLPLLILLLPLATSWASAAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASDFFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAQRQGPLIPPWGWPGNTLVAVSIFLLLTGPTYLLFKLSPRVKRIFYQNVPSPAMFFQPLYSVHNGNFQTWMGAHGAGVLLSQDCAGTPQGALEPCVQEATALLTCGPARPWKSVALEEEQEGPGTRLPGNLSSEDVLPAGCTEWRVQTLAYLPQEDWAPTSLTRPAPPDSEGSRSSSSSSSSNNNNYCALGCYGGWHLSALPGNTQSSGPIPALACGLSCDHQGLETQQGVAWVLAGHCQRPGLHEDLQGMLLPSVLSKARSWTF
小鼠ortho-IL2(克隆3A10)cDNA(SEQ ID NO:7)
ATGTATTCAATGCAGCTCGCCTCATGCGTCACCCTCACACTCGTCCTCCTCGTCAACTCAGCCCCCACCTCTTCACCAACTTCCTCACCAACCAGCTCCTCTACAGCCGAGGCTCAGCAACAACAGCAGCAGCAGCAGCACCTGGACAACCTGCTGGTGCTGCTGAAGGCCCTGCTGTCTAGGATGGAGAACTACAGAAACCTGAAGCTGCCCAGGATGCTGACCTTCAAGTTTTACCTGCCTAAGCAGGCTACAGAGCTGAAGGACCTGCAGTGCCTGGAGGATGAGCTGGGACCACTGAGGCACGTGCTGGACCTGACCCAGAGCAAGTCCTTCCAGCTGGAGGATGCCGAGAACTTTATCTCTAACATCCGCGTGACCGTGGTGAAGCTGAAGGGAAGCGATAACACATTCGAGTGTCAGTTTGACGATGAGTCCGCTACAGTGGTGGATTTTCTCAGACGGTGGATTGCCTTTTGCCAGAGCATCATCTCAACTTCCCCTCAGTAA
小鼠ortho-IL2(克隆3A10)蛋白(SEQ ID NO:8)
MYSMQLASCVTLTLVLLVNSAPTSSPTSSPTSSSTAEAQQQQQQQQHLDNLLVLLKALLSRMENYRNLKLPRMLTFKFYLPKQATELKDLQCLEDELGPLRHVLDLTQSKSFQLEDAENFISNIRVTVVKLKGSDNTFECQFDDESATVVDFLRRWIAFCQSIISTSPQ
小鼠orthoIL2Rb(又名o2R)cDNA(SEQ ID NO:9)
ATGGCAACAATCGCTCTCCCTTGGTCTCTCAGTCTCTATGTCTTTCTCCTGCTCCTCGCTACTCCCTGGGCATCTGCTGCTGTGAAGAACTGCTCCCACCTGGAGTGTTTTTACAACTCTCGCGCTAACGTGTCTTGTATGTGGAGCCACGAGGAGGCCCTGAACGTGACCACATGCCACGTGCACGCTAAGTCCAACCTGAGACACTGGAACAAGACCTGTGAGCTGACACTGGTGCGGCAGGCTAGCTGGGCTTGCAACCTGATCCTGGGATCCTTCCCTGAGAGCCAGTCCCTGACCTCTGTGGACCTGCTGGATATCAACGTGGTGTGCTGGGAGGAGAAGGGCTGGAGGAGAGTGAAGACATGCGACTTTCACCCTTTCGATAACCTGAGGCTGGTGGCTCCACACTCCCTGCAGGTGCTGCACATCGACACCCAGAGGTGTAACATCTCTTGGAAGGTGTCTCAGGTGAGCGACTTCATCGAGCCATACCTGGAGTTCGAGGCTCGGCGCAGGCTGCTGGGACACTCCTGGGAGGACGCCTCCGTGCTGTCTCTGAAGCAGAGGCAGCAGTGGCTGTTCCTGGAGATGCTGATCCCCTCTACAAGCTACGAGGTGCAGGTGAGAGTGAAGGCTCAGCGGAACAACACCGGAACATGGAGCCCCTGGTCCCAGCCTCTGACCTTTAGAACACGGCCTGCCGATCCAATGAAGGAGATCCTGCCCATGAGCTGGCTGAGATACCTGCTGCTGGTGCTGGGATGCTTCTCCGGCTTCTTTTCTTGCGTGTACATCCTGGTGAAGTGCCGGTACCTGGGCCCTTGGCTGAAGACCGTGCTGAAGTGCCACATCCCTGACCCAAGCGAGTTCTTTTCCCAGCTGAGCTCCCAGCACGGCGGAGATCTGCAGAAGTGGCTGTCTAGCCCCGTGCCTCTGAGCTTCTTTTCCCCCTCTGGACCAGCTCCCGAGATCAGCCCTCTGGAGGTGCTGGACGGCGATTCCAAGGCCGTGCAGCTGCTGCTGCTGCAGAAGGACTCCGCTCCTCTGCCAAGCCCATCCGGACACTCTCAGGCCAGCTGTTTTACCAACCAGGGCTACTTCTTTTTCCACCTGCCTAACGCCCTGGAGATCGAGTCTTGTCAGGTGTACTTCACATACGACCCATGCGTGGAGGAGGAGGTGGAGGAGGATGGATCTCGCCTGCCAGAGGGCAGCCCCCACCCACCTCTGCTGCCTCTGGCCGGAGAGCAGGACGATTACTGCGCTTTTCCACCCAGGGACGATCTGCTGCTGTTCTCTCCTAGCCTGTCCACCCCAAACACAGCTTACGGAGGAAGCCGCGCTCCAGAGGAGAGGTCCCCTCTGTCTCTGCACGAGGGACTGCCAAGCCTGGCTTCCAGGGACCTGATGGGCCTGCAGCGCCCACTGGAGAGGATGCCAGAGGGCGATGGAGAGGGCCTGTCTGCCAACTCCTCTGGCGAGCAGGCTAGCGTGCCAGAGGGAAACCTGCACGGACAGGACCAGGATAGGGGACAGGGACCCATCCTGACACTGAATACAGATGCTTACCTCTCACTCCAGGAACTCCAGGCACAGGATTCAGTCCACCTCATTTAA
小鼠orthoIL2Rb(又名o2R)蛋白(SEQ ID NO:10)
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小鼠orthoIL2Rb(又名o2R)胞外结构域(SEQ ID NO:11)
MATIALPWSLSLYVFLLLLATPWASAAVKNCSHLECFYNSRANVSCMWSHEEALNVTTCHVHAKSNLRHWNKTCELTLVRQASWACNLILGSFPESQSLTSVDLLDINVVCWEEKGWRRVKTCDFHPFDNLRLVAPHSLQVLHIDTQRCNISWKVSQVSDFIEPYLEFEARRRLLGHSWEDASVLSLKQRQQWLFLEMLIPSTSYEVQVRVKAQRNNTGTWSPWSQPLTFRTRPADPMKE
小鼠orthoIL2Rb(又名o2R)跨膜区(SEQ ID NO:12)
ILPMSWLRYLLLVLGCFSGFFSCVYILV
小鼠orthoIL2Rb(又名o2R)胞内结构域(SEQ ID NO:13)
KCRYLGPWLKTVLKCHIPDPSEFFSQLSSQHGGDLQKWLSSPVPLSFFSPSGPAPEISPLEVLDGDSKAVQLLLLQKDSAPLPSPSGHSQASCFTNQGYFFFHLPNALEIESCQVYFTYDPCVEEEVEEDGSRLPEGSPHPPLLPLAGEQDDYCAFPPRDDLLLFSPSLSTPNTAYGGSRAPEERSPLSLHEGLPSLASRDLMGLQRPLERMPEGDGEGLSANSSGEQASVPEGNLHGQDQDRGQ GPILTLNTDAYLSLQELQAQDSVHLI
小鼠orthoIL2Rb/IL9Ra(又名o9R)cDNA(SEQ ID NO:14)
ATGGCTACTATCGCTCTGCCTTGGTCCCTCTCACTCTATGTCTTCCTGCTCCTGCTGGCTACACCCTGGGCTTCTGCTGCCGTCAAAAACTGCTCCCACCTGGAGTGTTTCTACAACTCTCGCGCCAACGTGAGCTGCATGTGGTCCCACGAGGAGGCCCTGAACGTGACCACATGTCACGTGCACGCTAAGTCCAACCTGAGACACTGGAACAAGACCTGCGAGCTGACACTGGTGCGGCAGGCCTCTTGGGCTTGTAACCTGATCCTGGGAAGCTTTCCCGAGAGCCAGTCCCTGACCTCCGTGGACCTGCTGGATATCAACGTGGTGTGCTGGGAGGAGAAGGGCTGGAGGAGAGTGAAGACATGTGACTTCCACCCATTTGATAACCTGAGGCTGGTGGCTCCACACAGCCTGCAGGTGCTGCACATCGACACCCAGAGGTGCAACATCTCCTGGAAGGTGAGCCAGGTGTCCGATTTCATCGAGCCTTACCTGGAGTTTGAGGCTCGGCGCAGGCTGCTGGGACACTCCTGGGAGGACGCTTCTGTGCTGAGCCTGAAGCAGCGGCAGCAGTGGCTGTTCCTGGAGATGCTGATCCCATCTACCAGCTACGAGGTGCAGGTGCGCGTGAAGGCCCAGAGGAACAACACCGGAACATGGTCCCCTTGGAGCCAGCCACTGACCTTCCGCACAAGGCCCGCCGATCCTATGAAGGAGGCTTCTATCCTGGTGGTGGTGCCTATCTTTCTGCTGCTGACAGGCTTCGTGCACCTGCTGTTTAAGCTGTCTCCAAGACTGAAGCGGATCTTCTACCAGAACATCCCTAGCCCAGAGGCTTTCTTTCACCCCCTGTACAGCGTGTACCACGGAGACTTTCAGTCCTGGACCGGAGCTAGAAGGGCTGGACCTCAGGCTAGACAGAACGGAGTGTCTACAAGCTCCGCTGGCAGCGAGTCTAGCATCTGGGAGGCCGTGGCTACCCTGACATACTCTCCAGCCTGCCCCGTGCAGTTCGCTTGTCTGAAGTGGGAGGCCACCGCTCCTGGCTTTCCAGGACTGCCAGGAAGCGAGCACGTGCTGCCAGCTGGATGTCTGGAGCTGGAGGGACAGCCATCCGCTTACCTGCCTCAGGAGGATTGGGCTCCACTGGGATCTGCTCGGCCCCCTCCACCAGACTCCGATTCTGGATCCTCTGACTACTGCATGCTGGATTGCTGTGAGGAGTGTCACCTGAGCGCCTTCCCCGGCCACACAGAAAGCCCCGAACTCACCCTCGCACAGCCCGTCGCACTCCCAGTCTCCTCCAGAGCATAA
小鼠orthoIL2Rb/IL9Ra(又名o9R)蛋白(SEQ ID NO:15)
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小鼠orthoIL2Rb/IL9Ra(又名o9R)-orthoIL2Rb胞外结构域(SEQ ID NO:16)
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小鼠orthoIL2Rb/IL9Ra(又名o9R)-跨膜区(SEQ ID NO:17)
ASILVVVPIFLLLTGFVHLLF
小鼠orthoIL2Rb/IL9Ra(又名o9R)-IL9Ra胞内结构域与跨膜区(SEQ ID NO:18)
QRRQGLLVPRWQWSASILVVVPIFLLLTGFVHLLFKLSPRLKRIFYQNIPSPEAFFHPLYSVYHGDFQSWTGARRAGPQARQNGVSTSSAGSESSIWEAVATLTYSPACPVQFACLKWEATAPGFPGLPGSEHVLPAGCLELEGQPSAYLPQEDWAPLGSARPPPPDSDSGSSDYCMLDCCEECHLSAFPGHTESPELTLAQPVALPVSSRA
小鼠orthoIL2Rb/IL4R(又名o4R)蛋白(SEQ ID NO:19)
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小鼠orthoIL2Rb/IL7R(又名o7R)蛋白(SEQ ID NO:20)
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小鼠orthoIL2Rb/IL21R(又名o21R)蛋白(SEQ ID NO:21)
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C.嵌合抗原受体(CAR)
在本发明的一些实施方式中，表达正交嵌合细胞因子受体的经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)是一种经修饰为共同表达至少一种嵌合抗原受体的T细胞(‘CAR-T’细胞)。
抗原结合结构域
CAR的抗原结合结构域是CAR与包括蛋白质、碳水化合物和糖脂的特定靶抗原结合的胞外区域。抗原结合结构域可包括结合一种或多种抗原的任何结构域，并且可包括但不限于单克隆抗体(mAb)、多克隆抗体、合成抗体、双特异性抗体、人抗体、人源化抗体、非人抗体、单域抗体、全长抗体或其抗原结合片段、Fab和单链可变片段(scFv)。在一些实施方式中，抗原结合结构域包括无糖基化抗体或其片段或其scFv。
在一些实施方式中，通过抗原结合识别的靶抗原包括肿瘤抗原。可被CAR的抗原结合结构域靶向的肿瘤抗原的实例包括选自包括但不限于以下的一种或多种抗原：CD19、CD20、HER2、NY-ES0-1、MUC1、CD123、FLT3、B7-H3、CD33、IL1RAP、CLL1(CLEC12A)PSA、CEA、VEGF、VEGF-R2、CD22、ROR1、间皮素、c-Met、糖脂F77、FAP、EGFRvIII、MAGE A3、5T4、WT1、KG2D配体、叶酸受体(FRa)和Wnt1抗原。
如本文中所使用的，术语“单链可变片段(single-chain variable fragment)”或“scFv”是免疫球蛋白(例如，小鼠或人)的重链(VH)和轻链(VL)的可变区共价连接以形成VH：VL异源二聚体的融合蛋白。可变重链(VH)和轻链(VL)直接连接或者通过肽接头连接，肽接头连接VH的N-末端和VL的C-末端，或者VH的C-末端和VL的N-末端。在一些实施方式中，抗原结合结构域包括从N-末端到C-末端的构型为VH-接头-VL的scFv。在某些实施方式中，抗原结合结构域包括从N-末端到C-末端的构型为VL-接头-VH的scFv。本领域技术人员可以选择适当的构型用于本发明。
接头通常富含甘氨酸以提高灵活性，以及丝氨酸或苏氨酸以提高溶解性。接头可以连接细胞外抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区。接头的非限制性实例见Shen等人，Anal.Chem.80(6):1910-1917(2008)和WO 2014/087010，其内容通过引用以其整体并入。各种接头序列在本领域是已知的，包括但不限于甘氨酸丝氨酸(GS)接头，比如(GS)n、(SG)n、(GSGGS)n、(GGGS)n和(GGGGS)n，其中n代表至少1的整数。示例性接头序列可包括氨基酸序列，该序列包括但不限于GGSG、GGSGG、GSGSG、GSGGG、GGGSG、GSSSG、GGGGS、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS等。本领域技术人员能够选择适当的接头序列用于本发明。在一个实施方式中，本发明的抗原结合结构域包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH和VL被接头序列隔开。
尽管去除了恒定区并引入了接头，但是scFv蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。单链Fv多肽抗体可由包括VH和VL编码序列的核酸表达，如Huston等人(Proc.Nat.Acad.Sci.USA，85:5879-5883，1988)所描述的。另外参见美国专利号5,091,513、5,132,405和4,956,778；以及美国专利公开号20050196754和20050196754。具有抑制活性的拮抗scFvs已被描述(例如，参见Zhao等人，Hybridoma(Larchmt)2008 27(6):455-51；Peter等人，JCachexia Sarcopenia Muscle，2012年8月12日；Shieh等人，J Imunol2009 183(4):2277-85；Giomarelli等人，Thromb Haemost 2007 97(6):955-63；Fifeeta.，J Clin Invst 2006116(8):2252-61；Brocks等人，Immunotechnology 1997 3(3):173-84；Moosmayer等人，Ther Immunol 1995 2(10:31-40)。已经描述了具有刺激活性的拮抗scFv(例如，参见Peter等人，J Bioi Chem 2003 25278(38):36740-7；Xie等人，NatBiotech 1997 15(8):768-71；Ledbetter等人，Crit Rev Immunol 1997 17(5-6):427-55；Ho等人，BioChim Biophys Acta 20031638(3):257-66)。
如本文中所使用的，“Fab”是指与抗原结合但为单价且不具有Fc部分的抗体结构片段，例如，通过木瓜蛋白酶消化的抗体产生两个Fab片段和一个Fc片段(例如，重(H)链恒定区；不与抗原结合的Fc区)。
如本文中所使用的，“F(ab′)2”是指通过胃蛋白酶消化全IgG抗体产生的抗体片段，其中该片段具有两个抗原结合(ab′)(二价)区，其中每个(ab′)区包括两条单独的氨基酸链，H链的一部分和轻(L)链通过S-S键连接，用于结合抗原，并且其余的H链部分连接在一起。“F(ab′)2”片段可以分成两个单独的Fab′片段。
在一些实施方式中，抗原结合结构域可源自最终使用CAR的同一物种。例如，用于人时，CAR的抗原结合结构域可包括人抗体或其片段。在一些实施方式中，抗原结合结构域可以源自最终使用CAR的不同物种。例如，用于人时，CAR的抗原结合结构域可包括鼠类抗体或其片段，或人源化鼠类抗体或其片段。
在某些实施方式中，抗原结合结构域包括包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)的重链可变区和包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的轻链可变区。
跨膜结构域
本发明的CAR可包括连接CAR的抗原结合结构域与CAR的胞内结构域的跨膜结构域。CAR的跨膜结构域是能够跨越细胞(例如，免疫细胞或其前体)质膜的区域。跨膜结构域用于插入细胞膜，例如，真核细胞膜中。在一些实施方式中，跨膜结构域插入CAR的抗原结合结构域与胞内结构域之间。
在一些实施方式中，跨膜结构域与CAR中的一个或多个结构域天然相关。在一些实施方式中，可以通过一个或多个氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免这种结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合物其他成员的相互作用最小化。
跨膜结构域可以源自天然来源或合成来源。在来源是天然的情况下，该结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白，例如I型跨膜蛋白。在来源是合成的情况下，跨膜结构域可以是有利于CAR插入细胞膜的任何人工序列，例如，人工疏水序列。本发明中特别使用的跨膜结构域的实例包括但不限于源自T细胞受体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134(OX-40)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、CD278、Toll-样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9的α、β或ζ链的(即，包括至少跨膜区(一个或多个))的跨膜结构域或源自杀伤性免疫球蛋白样受体(KIR)的跨膜结构域。
在某些实施方式中，跨膜结构域包括CD8的跨膜结构域。在某些实施方式中，CD8的跨膜结构域为CD8α的跨膜结构域。
在某些实施方式中，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包括疏水残基，比如亮氨酸和缬氨酸。优选地苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体在合成跨膜结构域的每一端都找到。
本文所述的跨膜结构域可与本文所述的任何抗原结合结构域、本文所述的任何胞内结构域或本文所述的可能包括在CAR中的任何其他结构域相结合。
在一些实施方式中，跨膜结构域进一步包括铰链区。本发明的CAR还可包括铰链区。CAR的铰链区是位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间的亲水区域。在一些实施方式中，该结构域有助于CAR的适当蛋白质折叠。铰链区是CAR的任选组件。铰链区可包括选自抗体Fc片段、抗体铰链区、抗体CH2区、抗体CH3区、人工铰链序列或其组合的结构域。铰链区的实例包括但不限于CD8a铰链、由可小至三个甘氨酸(Gly)的多肽组成的人工铰链以及IgG(比如，人IgG4)的CH1和CH3结构域。
在一些实施方式中，CAR包括连接抗原结合结构域和跨膜结构域的铰链区，其又与胞内结构域连接。铰链区优选地能够支持抗原结合结构域识别靶细胞上的靶抗原并与其结合(参见，例如，Hudecek等人，Cancer Immunol.Res.(2015)3(2)：125-135)。在一些实施方式中，铰链区是柔性结构域，因此使抗原结合结构域具有最佳地识别细胞比如肿瘤细胞上的靶抗原的特定结构和密度的结构(Hudecek等人，同上)。铰链区的灵活性允许铰链区采用多种不同的构象。
在一些实施方式中，铰链区是免疫球蛋白重链铰链区。在一些实施方式中，铰链区是源自受体的铰链区多肽(例如，源自CD8的铰链区)。在某些实施方式中，铰链区是CD8α铰链。
铰链区的长度可以为约4个氨基酸至约50个氨基酸，例如，约4aa至约10aa、约10aa至约15aa、约15aa至约20aa、约20aa至约25aa、约25aa至约30aa、约30aa至约40aa或约40aa至约50aa。在一些实施方式中，铰链区的长度可以为大于5aa、大于10aa、大于15aa、大于20aa、大于25aa、大于30aa、大于35aa、大于40aa、大于45aa、大于50aa、大于55aa或更长。
合适的铰链区可以容易地选择，并且可以是许多合适的长度中的任何一个，比如1个氨基酸(例如，Gly)到20个氨基酸、2个氨基酸到15个氨基酸、3个氨基酸到12个氨基酸，包括4个氨基酸到10个氨基酸，5个氨基酸到9个氨基酸，6个氨基酸到8个氨基酸，或7个氨基酸到8个氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。合适的铰链区的长度可以超过20个氨基酸(例如，30、40、50、60或更多个氨基酸)。
例如，铰链区包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如，包括(GS)n、(GSGGS)n和(GGGS)n，其中n为至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物以及本领域已知的其他柔性接头。可使用甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物；Gly和Ser二者都是相对非结构化的，并且因此可作为组分间的中性系链。可以使用甘氨酸聚合物；甘氨酸可进入的phi-psi空间比丙氨酸显著更大，并且比具有较长侧链的残基所受的限制要小得多(例如，参见Scheraga，Rev.Computational.Chem.(1992)2：73-142)。示例性铰链区可包括氨基酸序列，该序列包括但不限于(GGGGS)n、GGSG、GGSGG、GSGSG、GSGG、GGGSG、GSSSG、GGGGS等。
在一些实施方式中，铰链区是免疫球蛋白重链铰链区。免疫球蛋白铰链区氨基酸序列在本领域是已知的；例如，参见Tan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87(1):162-166；和Huck等人，Nucleic Acids Res.(1986)14(4)：1779-1789。作为非限制性实例，免疫球蛋白铰链区可包括以下氨基酸序列之一：DKTHT；CPPC；CPEPKSCDTPPPCPR(参见，例如Glaser等人，J.Biol.Chem.(2005)280:41494-41503)；ELKTPLGDTTHT；KSCDKTHTCP；KCCVDCP；KYGPPCP；EPKSCDKTHTCPPCP(人IgG1铰链)；ERKCCVECPPCP(人IgG2铰链)；ELKTPLGDTTHTCPRCP(人IgG3铰链)；SPNMVPHAHHAQ(人IgG4铰链)；等。
铰链区可包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4铰链区的氨基酸序列。在一个实施方式中，与野生型(天然存在的)铰链区相比，铰链区可包括一个或多个氨基酸取代和/或插入和/或缺失。例如，人IgG1铰链中的His229可被Tyr取代，使得铰链区包括序列EPKSCDKTYTCPPCP；例如，参见Yan等人，J.Biol.Chem.(2012)287：5891-5897。在一个实施方式中，铰链区可包括源自人CD8或其变体的氨基酸序列。
胞内信号传导结构域
本发明的CAR还包括胞内信号传导结构域。术语“胞内信号传导结构域”和“胞内结构域”在本文中可互换使用。CAR的胞内信号传导结构域负责激活表达CAR的细胞(例如，免疫细胞)的至少一种效应功能。胞内信号传导结构域转导效应功能信号，并引导细胞(例如，免疫细胞)执行其专门的功能，例如，伤害和/或破坏靶细胞。
用于本发明的胞内结构域的实例包括但不限于表面受体的细胞质部分、共刺激分子、协同作用以启动T细胞内的信号传导的任何分子，以及这些元件的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何合成序列。
胞内信号传导结构域的实例包括但不限于T细胞受体复合物的ζ链或其任何同源物，例如，η链、FcsRIγ和β链、MB 1(Iga)链、B29(Ig)链等，人CD3ζ链、CD3多肽(Δ、δ和ε)、syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)以及参与T细胞转导的其他分子，比如CD2、CD5和CD28。在一个实施方式中，胞内信号传导结构域可以是人CD3ζ链、FcyRIII、FcsRI、Fc受体的细胞质尾部、带有细胞质受体的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)以及它们的组合。
在一个实施方式中，CAR的胞内信号传导结构域包括一种或多种共刺激分子的任何部分，比如来自CD2、CD3、CD8、CD27、CD28、ICOS、4-1BB、PD-1的至少一个信号传导结构域，其任何衍生物或变体，具有相同功能性能力的任何合成序列，及其任何组合。
胞内结构域的其他实例包括来自一种或多种分子或受体的片段或结构域，该分子或受体包括但不限于，TCR、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD86、常见的FcRγ、FcRβ(FcΕRIb)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10、DAP12、T细胞受体(TCR)、CD8、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX9、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、KIR家族蛋白、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CDlib、ITGAX、CD11c、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、Toll-样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、本文所述的其他共刺激分子、任何衍生物、变体或其片段、具有相同功能性能力的共刺激分子的任何合成序列，及其任何组合。
胞内结构域的另外的实例包括但不限于几种类型的其它各种免疫信号传导受体的胞内信号传导结构域，包括但不限于第一代、第二代和第三代T细胞信号传导蛋白，包括CD3、B7家族共刺激和肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族受体(参见，例如Park和Brentjens，J.Clin.Oncol.(2015)33(6)：651-653)。此外，胞内信号传导结构域可包括NK和NKT细胞使用的信号传导结构域(参见，例如Hermanson和Kaufman，Front.Immunol.(2015)6：195)，比如NKp30(B7-H6)(参见，例如Zhang等人，J.Immunol.(2012)189(5)：2290-2299)和DAP 12(参见，例如Topfer等人，J.Immunol.(2015)194(7)：3201-3212)、NKG2D、NKp44、NKp46、DAP10和CD3z的信号传导结构域。
适合用于本发明CAR的胞内信号传导结构域包括任何期望的信号传导结构域，该信号传导结构域可响应CAR的激活(即，被抗原和二聚剂激活)提供明显的并且可检测的信号(例如，细胞产生一种或多种细胞因子的增加；靶基因的转录的改变；蛋白质活性的改变；细胞行为的改变，例如，细胞死亡；细胞增殖；细胞分化；细胞存活；细胞信号传导反应的调节等)。在一些实施方式中，胞内信号传导结构域包括至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个等)如下所述的ITAM基序。在一些实施方式中，胞内信号传导结构域包括DAP10/CD28型信号传导链。在一些实施方式中，胞内信号传导结构域不与膜结合CAR共价连接，而是在细胞质中扩散。
适合用于本发明的CAR的胞内信号传导结构域包括含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的胞内信号传导多肽。在一些实施方式中，ITAM基序在胞内信号传导结构域中重复两次，其中第一个和第二个ITAM基序彼此相隔6至8个氨基酸。在一个实施方式中，CAR的胞内信号传导结构域包括3个ITAM基序。
在一些实施方式中，胞内信号传导结构域包括人免疫球蛋白受体的信号传导结构域，该结构域含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，比如但不限于FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcRL5(参见，例如Gillis等人，Front.Immunol(2014)5:254)。
合适的胞内信号传导结构域可以是含有ITAM基序的部分，该部分源自含有ITAM基序的多肽。例如，合适的胞内信号传导结构域可以是来自任何含ITAM基序的蛋白质的含ITAM基序的结构域。因此，合适的胞内信号传导结构域不必包含其源自的整个蛋白质的全部序列。合适的含ITAM基序的多肽的实例包括但不限于：DAP12、FCER1G(Fcε受体Iγ链)、CD3D(CD3δ)、CD3E(CD3ε)、CD3G(CD3γ)、CD3Z(CD3ζ)和CD79A(抗原受体复合物相关蛋白α链)。
在一个实施方式中，胞内信号传导结构域源自DAP12(也称为TYROBP；TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白；KARAP；PLOSL；DNAX-激活蛋白12；KAR相关蛋白；TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白；杀伤激活受体相关蛋白；杀伤-激活受体相关蛋白；等)。在一个实施方式中，胞内信号传导结构域源自FCER1G(也称为FCRG；Fcε受体Iγ链；Fc受体γ-链；fc-εRI-γ；fcRγ；fceRlγ；高亲和性免疫球蛋白ε受体亚基γ；免疫球蛋白E受体，高亲和性γ链；等)。在一个实施方式中，胞内信号传导结构域源自T细胞表面糖蛋白CD3δ链(也称为CD3D；CD3-DELTA；T3D；CD3抗原、δ亚基；CD3δ；CD3d抗原、δ多肽(TiT3复合物)；OKT3、δ链；T细胞受体T3δ链；T细胞表面糖蛋白CD3δ链；等)。在一个实施方式中，胞内信号传导结构域源自T细胞表面糖蛋白CD3ε链(也称为CD3e、T细胞表面抗原T3/Leu-4ε链、T细胞表面糖蛋白CD3ε链、AI504783、CD3、CD3ε、T3e等)。在一个实施方式中，胞内信号传导结构域源自T细胞表面糖蛋白CD3γ链(也称为CD3G、T细胞受体T3γ链、CD3-Γ、T3G、γ多肽(TiT3复合物)等)。在一个实施方式中，胞内信号传导结构域源自T细胞表面糖蛋白CD3ζ链(也称为CD3Z、T细胞受体T3ζ链、CD247、CD3-ZETA、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZ等)。在一个实施方式中，胞内信号传导结构域源自CD79A(也称为B细胞抗原受体复合物相关蛋白α链；CD79a抗原(免疫球蛋白相关α)；MB-1膜糖蛋白；ig-α；膜结合免疫球蛋白相关蛋白；表面IgM相关蛋白；等)。在一个实施方式中，适合用于本公开内容的CAR的胞内信号传导结构域包括DAP10/CD28型信号传导链。在一个实施方式中，适合用于本公开内容的CAR的胞内信号传导结构域包括ZAP70多肽。在一些实施方式中，胞内信号传导结构域包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的细胞质信号传导结构域。在一个实施方式中，CAR的胞内信号传导结构域包括人CD3ζ的细胞质信号传导结构域。
虽然通常可以使用整个胞内信号传导结构域，但是在许多情况下并不需要使用整条链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，只要它能转导效应功能信号，就可以用这种截短部分代替完整的链。胞内信号传导结构域包括足以转导效应功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
本文所述的胞内结构域可与本文所述的任何抗原结合结构域、本文所述的任何跨膜结构域或本文所述的可包括在CAR中的任何其他结构域相结合。
在某些实施方式中，胞内结构域包括4-1BB的共刺激结构域。在某些实施方式中，胞内结构域包括CD3ζ或其变体的胞内结构域。在某些实施方式中，胞内结构域包括4-1BB和CD3ζ结构域。
D.T细胞受体
在本发明的一些实施方式中，表达正交嵌合细胞因子受体的经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)是被修饰为共同表达至少一种T细胞受体(TCR)的免疫细胞(例如，T细胞)。
在一些实施方式中，TCR靶向(即，具有抗原特异性)抗原，例如肿瘤抗原。如本文中所使用的，短语“具有抗原特异性”或类似短语是指TCR可以特异性地结合并识别抗原或其表位。
天然TCR通常是异源二聚体。在人体中，95％的T细胞中的TCR包括alpha(α)链和beta(β)链(分别由TRA和TRB编码)，而5％的T细胞中的TCR包括γ和δ(γ/δ)链(分别由TRG和TRD编码)。天然TCR复合物是排列成四个二聚体模块的I型单跨膜蛋白组成的八聚体组合体：可变配体结合TCRαβ模块(在大多数T细胞中)(或TCRγ/δ模块)和三个不变信号传导模块CD3δε、CD3γε和CD3ζ二聚体。TCRαβ模块与APC或靶细胞表面上的pMHC配体结合，但是这些蛋白缺乏内在信号传导能力，并且因此依赖于信号传导模块以通过其基于细胞质免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)来传递信息。参见，例如Chandler等人，Int J Mol Sci(2020)21:7424，其通过引用并入本文。天然TCR可使用本领域已知的标准分子生物学和基因工程技术克隆和修饰。
各种工程化的TCR形式也是本领域已知的，包括TCR模拟抗体(Chang等人，ExpertOpin Biol Ther.(2016)16(8):979-87)、TCR-样CAR和TCR-CAR(Walseng等人，Sci Rep.(2017)7:1-10；Akatsuka等人，Front Immunol.(2020)11:257；Poorebrahim等人，CancerGene Ther.(2021)28(6):581-589。与CAR不同，TCR并不限于细胞表面抗原，但是能检测并结合MHC分子(pMHC)呈递的肽。该特征为TCR，比如肿瘤特异性新表位，提供了广泛的潜在靶标。值得注意的是，将基于TCR的CAR重定向于高度肿瘤特异性的新表位可防止通常与CAR疗法相关的“脱靶(off-tumor)”毒性。
在一些实施方式中，TCR是天然TCR。在一些实施方式中，TCR是经修饰的TCR。在一些实施方式中，TCR是工程化的TCR，如TCR模拟物或抗体样结构、CAR样TCR或CAR-TCR。在一些实施方式中，TCR是鼠类TCR。在一些实施方式中，TCR是人TCR。在一些实施方式中，TCR是具有人TCR的一个或多个部分(例如，恒定部分或可变部分)和鼠TCR的一个或多个部分(例如，恒定部分或可变部分)的混合TCR。可选地，该部分可以是人TCR的几个氨基酸，这样大部分是鼠类的TCR被“人源化”。制备这种混合TCR的方法在本领域是已知的(参见，例如Cohen等人，Cancer Res.，(2006)66:8878-8886)。
在一些实施方式中，TCR靶向(即，具有抗原特异性)gp100黑素瘤抗原，例如人gp100。在一些实施方式中，肿瘤抗原是gp100。gp100在本领域也称为SILV、SI、SIL、ME20、PMEL17或D12S53E。gp100是已知在调节哺乳动物色素沉着中起重要作用的蛋白质(Hoashi等人，J.Biol.Chem.(2005)280:14006-14016)，并且已知为人类肿瘤(包括黑素瘤和结肠直肠肿瘤)表达的癌症抗原(Tartaglia等人，Vaccine(2001)19(17-19):2571-5)。人gp100的氨基酸和核苷酸序列已以GenBank登录号NP_008859(氨基酸序列)和GenBank登录号NM_006928.3(核苷酸序列)公布在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank数据库中。
对gp100具有抗原特异性的TCR(即，抗gp100 TCR)在本领域是已知的，诸如例如在US20140219978A1中描述的TCR。在一些实施方式中，TCR是pmel-1TCR。pmel-1小鼠模型被开发为使用过继细胞疗法(ACT)治疗恶性黑素瘤的模型系统(Overwijk等人，J Exp Med.(2003)，198(4)：569-80)。靶抗原pmel-17是通常在人黑素瘤中过度表达的黑素细胞分化抗原gp100的直向同源物。
在一些实施方式中，TCR靶向(即，具有抗原特异性)NY-ESO-1抗原。NY-ESO-1是一种在滑膜肉瘤、粘液样脂肪肉瘤、黑素瘤和其他肿瘤中过度表达的癌睾丸抗原。在一些实施方式中，TCR是NYESO1-TCR克隆1G4(Robbins等人，J Immunol，2008，180:6116-6131)。在一些实施方式中，TCR靶向选自MAGE-A3/A6、MAGE-A10、AFP、PRAME、MART-1和HPV E6的抗原。
E.核酸和表达载体
本公开内容提供了(i)编码正交嵌合细胞因子受体的核酸，(ii)编码正交细胞因子的核酸，和(iii)编码CAR和/或TCR的核酸。本公开内容的核酸可包括编码本文所公开的正交嵌合细胞因子受体、正交细胞因子、CAR和/或TCR中的任一种的核酸序列(即，多核苷酸序列)。
在某些实施方式中，本公开内容的核酸包括第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列。第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列可由接头分隔。在本公开内容中使用的接头允许由相同的核酸序列(例如，多顺反子或双顺反子序列)编码多种蛋白质，这些蛋白质被翻译为解离为单独的蛋白质成分的多聚蛋白。在某些实施方式中，核酸从5’至3’包括第一多核苷酸序列、接头和第二多核苷酸序列。在某些实施方式中，核酸从5’至3’包括第二多核苷酸序列、接头和第一多核苷酸序列。
在一些实施方式中，接头包括编码内部核糖体进入位点(IRES)的核酸序列。本文所使用的“内部核糖体进入位点(an internal ribosome entry site)”或“IRES”指的是促进内部核糖体直接进入蛋白质编码区的起始密码子(例如，ATG)，从而导致基因的帽非依赖性翻译的元件。本领域技术人员已知各种内部核糖体进入位点，包括但不限于可从病毒或细胞mRNA源，例如，免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)；血管内皮生长因子(VEGF)；成纤维细胞生长因子2；胰岛素样生长因子；翻译起始因子eIF4G；酵母转录因子TFIID和HAP4获得的IRES；以及可获得自例如，心肌病毒、鼻病毒、口蹄疫病毒、HCV、弗里德小鼠白血病病毒(Friend murine leukemia virus)(FrMLV)和莫洛尼小鼠白血病病毒(Moloney murineleukemia virus)(MoMLV)的IRES。本领域技术人员可以选择适当的IRES用于本发明。
在一些实施方式中，接头包括编码自裂解肽的核酸序列。本文所使用的“自裂解肽(self-cleaving peptide)”或“2A肽”是指一种使多个蛋白质编码为多聚蛋白的寡肽，该多聚蛋白在翻译时解离为组分蛋白。使用术语“自裂解(self-cleaving)”并不意味着蛋白水解裂解反应。本领域技术人员已知各种自裂解肽或2A肽，包括但不限于在小rNA病毒科成员中发现的那些，例如，口蹄疫病毒(FMDV)、马鼻炎A病毒(ERAV0)、明脉扁刺蛾病毒(Thoseaasigna virus)(TaV)和猪捷申病毒(porcine tescho virus)-1(PTV-1)；以及卡介病毒(cariovirus)，比如泰勒病毒(Theilovirus)和脑心肌炎病毒。源自FMDV、ERAV、PTV-1和TaV的2A肽在本文中分别称为“F2A”、“E2A”、“P2A”和“T2A”。本领域技术人员可以选择适当的自裂解肽用于本发明。
在一些实施方式中，接头进一步包括编码弗林蛋白酶裂解位点的核酸序列。弗林蛋白酶是一种普遍表达的蛋白酶，它存在于反式高尔基体(trans-golgi)中，在蛋白质前体分泌前对其进行处理。弗林蛋白酶在其共有识别序列的COOH-末端进行裂解。本领域技术人员已知各种弗林蛋白酶共有识别序列(或“弗林蛋白酶裂解位点”)，包括但不限于Arg-X1-Lys-Arg或Arg-X1-Arg-Arg、X2-Arg-X1-X3-Arg和Arg-X1-X1-Arg，比如Arg-Gln-Lys-Arg，其中X1是任何天然存在的氨基酸，X2是Lys或Arg，和X3是Lys或Arg。本领域技术人员可以选择适当的弗林蛋白酶裂解位点用于本发明。
在某些实施方式中，接头包括编码弗林蛋白酶裂解位点和2A肽的组合的核酸序列。实例包括但不限于包括编码弗林蛋白酶裂解位点和F2A的核酸序列的接头、包括编码弗林蛋白酶裂解位点和E2A的核酸序列的接头、包括编码弗林蛋白酶裂解位点和P2A的核酸序列的接头、包括编码弗林蛋白酶裂解位点和T2A的核酸序列的接头。本领域技术人员能够选择适当的组合用于本发明。在这种实施方式中，接头可进一步包括弗林蛋白酶裂解位点和2A肽之间的间隔序列。在一些实施方式中，接头包括5’的弗林蛋白酶裂解位点至2A肽。在一些实施方式中，接头包括5’的2A肽至弗林蛋白酶裂解位点。各种间隔序列在本领域是已知的，包括但不限于甘氨酸丝氨酸(GS)间隔序列(也称为GS接头)比如(GS)n、(SG)n、(GSGGS)n和(GGGS)n，其中n表示至少为1的整数。示例性间隔序列可包括氨基酸序列，该序列包括但不限于GGSG、GGSGG、GSGSG、GSGGG、GGGSG、GSSSG等。本领域技术人员能够选择适当的间隔序列用于本发明。
在一些实施方式中，本公开内容的核酸可与转录控制元件，例如，启动子和增强子等可操作地连接。合适的启动子和增强子元件是本领域技术人员已知的。
对于在细菌细胞中的表达，合适的启动子包括但不限于lacI、lacZ、T3、T7、gpt、lambda P和trc。对于在真核细胞中的表达，合适的启动子包括但不限于轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；巨细胞病毒即早期启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；早期和晚期SV40启动子；存在于逆转录病毒长末端重复序列中的启动子；小鼠金属硫蛋白-I启动子；以及各种本领域已知的组织特异性启动子。合适的可逆启动子，包括可逆的诱导型启动子，都是本领域已知的。这种可逆启动子可以从许多生物体，例如，真核生物和原核生物中分离和提取。对源自第一种生物的可逆启动子进行修饰以用于第二种生物，例如，第一种原核生物和第二种真核生物、第一种真核生物和第二种原核生物等，在本领域是众所周知的。这种可逆启动子以及基于这种可逆启动子但还包括另外的控制蛋白的系统包括但不限于醇调控启动子(例如，醇脱氢酶I(alcA)基因启动子、对醇转化激活因子蛋白(A1cR)有反应的启动子等)、四环素调控启动子(例如，包括TetActivators、TetON、TetOFF等的启动子系统)、类固醇调控启动子(例如，大鼠糖皮质激素受体启动子系统、人雌激素受体启动子系统、类维生素A启动子系统、甲状腺启动子系统、蜕皮激素启动子系统、米非司酮启动子系统等)、金属调控启动子(例如，金属硫蛋白启动子系统等)、发病机制相关调控启动子(例如，水杨酸调控启动子、乙烯调控启动子、苯并噻二唑调控启动子等)、温度调控启动子(例如，热休克诱导型启动子(例如，HSP-70、HSP-90、大豆热休克启动子等)、光调控启动子、合成诱导型启动子等。
在一些实施方式中，启动子是CD8细胞特异性启动子、CD4细胞特异性启动子、中性粒细胞特异性启动子或NK特异性启动子。例如，可以使用CD4基因启动子；参见，例如Salmon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:7739；和Marodon等人，(2003)Blood101:3416。作为另一个实例，可以使用CD8基因启动子。NK细胞特异性表达可通过使用NcrI(p46)启动子来实现；参见，例如Eckelhart等人(2011)，Blood(2011)117:1565。
对于在酵母细胞中的表达，合适的启动子是组成型启动子，比如ADH1启动子、PGK1启动子、ENO启动子、PYK1启动子等；或可调控的启动子比如GAL1启动子、GAL10启动子、ADH2启动子、PHOS启动子、CUP1启动子、GALT启动子、MET25启动子、MET3启动子、CYC1启动子、HIS3启动子、ADH1启动子、PGK启动子、GAPDH启动子、ADC1启动子、TRP1启动子、URA3启动子、LEU2启动子、ENO启动子、TP1启动子和AOX1(例如，用于毕赤酵母属)。选择合适的载体和启动子完全在本领域技术人员的水平内。用于原核宿主细胞的合适的启动子包括但不限于：噬菌体T7 RNA聚合酶启动子；trp启动子；lac操作子启动子；混合启动子，例如：lac/tac混合启动子、lac/tac混合启动子、tac/trc混合启动子、trp/lac启动子、T7/lac启动子；trc启动子；tac启动子等；araBAD启动子；体内调控启动子，比如ssaG启动子或相关启动子(参见，例如美国专利公布号20040131637)、pagC启动子(Pulkkinen和Miller，J.Bacteriol.(1991)173(1)：86-93；Alpuche-Aranda等人，Proc.Natl.USA(1992)89(21)：10079-83)、nirB启动子(Harborne等人，Mol.Micro.(1992)6:2805-2813)等(参见，例如Dunstan等人，Infect.Immun.(1999)67:5133-5141；McKelvie等人，Vaccine(2004)22:3243-3255；以及Chatfield等人，Biotechnol.(1992)10:888-892)；σ70启动子，例如，共有σ70启动子(参见，例如GenBank登录号AX798980、AX798961和AX798183)；静止期启动子，例如，dps启动子、spv启动子等；源自致病性岛SPI-2的启动子(参见，例如WO96/17951)；actA启动子(参见，例如Shetron-Rama等人，Infect.Immun.(2002)70:1087-1096)；rpsM启动子(参见，例如Valdivia和Falkow Mol.Microbiol.(1996).22:367)；tet启动子(参见，例如Hillen，W.和Wissmann，A.(1989)In Saenger，W.and Heinemann，U.(编)，Topics in Molecular andStructural Biology，Protein--Nucleic Acid Interaction.Macmillan，London，UK，第10卷，第143-162页)；SP6启动子(参见，例如Melton等人，Nucl.Acids Res.(1984)12:7035)；等。用于原核生物(比如，大肠杆菌)的合适的强启动子包括但不限于Trc、Tac、T5、T7和PLambda。用于细菌宿主细胞的操作子的非限制性实例包括乳糖启动操作子(LacI抑制蛋白与乳糖接触时会改变构象，从而阻止Lad抑制蛋白与操作子结合)、色氨酸启动操作子(与色氨酸复合时，TrpR抑制蛋白具有与操作子结合的构象；在没有色氨酸的情况下，TrpR抑制蛋白具有不与操作子结合的构象)，以及tac启动操作子(参见，例如deBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1983)80:21-25)。
合适的启动子的其他实例包括即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是一种能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)或人体免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽类白血病病毒启动子、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)即早期启动子、劳斯肉瘤(Rous sarcom)病毒启动子、EF-1α启动子以及人基因启动子比如，但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应仅限于组成型启动子的使用。还考虑使用诱导型启动子作为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，当需要这种表达时，它能够开启与之可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或者当不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
在一些实施方式中，含有合适启动子的基因座或构建体或转基因通过诱导系统的诱导进行不可逆转换。诱导不可逆转换的合适系统在本领域是众所周知的，例如，不可逆转换的诱导可利用Cre-lox介导的重组(参见例如Fuhrmann-Benzakein等人，Proc.Natl.Sci.USA(2000)28:e99，其公开内容通过引用并入本文)。本领域已知的重组酶、内切核酸酶、连接酶、重组位点等的任何适当组合都可用于产生不可逆转换启动子。本文其它地方描述的进行位点特异性重组的方法、机制和要求可用于产生不可逆转换启动子，并且是本领域众所周知的，参见，例如Grindley等人，Annual Review of Biochemistry(2006)567-605；和Tropp，Molecular Biology(2012)(Jones&Bartlett Publishers，Sudbury，Mass.)，其公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，本公开内容的核酸进一步包括编码CAR诱导型表达盒的核酸序列。在一个实施方式中，CAR诱导型表达盒用于产生在CAR信号传导时释放的转基因多肽产物。参见，例如Chmielewski和Abken，Expert Opin.Biol.Ther.(2015)15(8)：1145-1154；和Abken，Immunotherapy(2015)7(5)：535-544。在一些实施方式中，本公开内容的核酸进一步包括编码与T细胞活化应答启动子可操作地连接的细胞因子的核酸序列。在一些实施方式中，与T细胞活化应答启动子可操作地连接的细胞因子存在于单独的核酸序列上。在一个实施方式中，细胞因子是IL-12。
本公开内容的核酸可存在于表达载体和/或克隆载体中。表达载体可包括选择标记、复制原点和提供复制和/或维持载体的其他特征。合适的表达载体包括例如，质粒、病毒载体等。本领域技术人员已知大量合适的载体和启动子；许多在商业上可获得用于产生重组构建体。通过举例提供以下载体，并且不应以任何方式解释为限制性的：细菌的：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene，La Jolla，Calif.，USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。真核的：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。
表达载体通常在启动子序列附近有方便的限制酶切位点，以提供插入编码异源蛋白的核酸序列。表达宿主中可能存在可操作的选择标记。合适的表达载体包括但不限于病毒载体(例如基于痘苗病毒的病毒载体；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见，例如Li等人，Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(1994)35：2543-2549；Borras等人，Gene Ther.(1999)6：515-524；Li和Davidson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：7700-7704；Sakamoto等人，H.GeneTher.(1999)5：1088-1097；WO94/12649，WO93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺相关病毒(参见，例如Ali等人，Hum.Gene Ther.(1998)9：81-86，Flannery等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94：6916-6921；Bennett等人，Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(1997)38：2857-2863；Jomary等人，Gene Ther.(1997)4:683690、Rolling等人，Hum.Gene Ther.(1999)10：641-648；Ali等人，Hum.Mol.Genet.(1996)5：591-594；WO 93/09239、Samulski等人，J.Vir.(1989)63：3822-3828中的Srivastava；Mendelson等人，Virol.(1988)166：154-165；和Flotte等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；人体免疫缺陷病毒(参见，例如Miyoshi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94：10319-23；Takahashi等人，J.Virol.(1999)73：7812-7816)；逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒和源自逆转录病毒的载体，比如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、人体免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)；等。
适合使用的另外的表达载体是例如但不限于慢病毒载体、γ逆转录病毒载体、泡沫病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体、工程化的杂交病毒载体、转座子介导的载体等。病毒载体技术在本领域是众所周知的，并且例如在Sambrook等人，2012，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第1-4卷，Cold Spring HarborPress，NY)以及其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。
一般来说，合适的载体包含在至少一种生物体中起作用的复制原点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点和一个或多个选择标记(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
在一些实施方式中，可使用表达载体(例如，慢病毒载体)将CAR或TCR导入免疫细胞或其前体(例如，T细胞)中。因此，本发明的表达载体(例如，慢病毒载体)可包括编码CAR或TCR的核酸。在一些实施方式中，表达载体(例如，慢病毒载体)将包括有助于其中编码的CAR或TCR功能性表达的附加元件。在一些实施方式中，包括编码CAR或TCR的核酸的表达载体进一步包括哺乳动物启动子。在一个实施方式中，载体进一步包括一个延伸因子-1-α启动子(EF-1α启动子)。使用EF-1α启动子可提高下游转基因(例如，编码CAR或TCR的核酸序列)的表达效率。生理启动子(例如，EF-1α启动子)不太可能诱导整合介导的遗传毒性，并且可能削弱逆转录病毒载体转化干细胞的能力。适合用于载体(例如，慢病毒载体)的其他生理启动子是本领域技术人员已知的，并且可并入本发明的载体中。在一些实施方式中，载体(例如，慢病毒载体)进一步包括可提高滴度和基因表达的非必需顺式作用序列。非必要顺式作用序列的一个非限制性实例是中心多嘌呤束和中心终止序列(cPPT/CTS)，它对有效的逆转录和核导入非常重要。其他非必要顺式作用序列是本领域技术人员已知的，并且可整合到本发明的载体(例如，慢病毒载体)中。在一些实施方式中，载体进一步包括转录后调控元件。转录后调控元件可改善RNA翻译、改善转基因表达和稳定RNA转录体。转录后调控元件的一个实例是土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。因此，在一些实施方式中，本发明的载体进一步包含WPRE序列。各种转录后调控元件是本领域技术人员已知的，并且可整合到本发明的载体(例如，慢病毒载体)中。本发明的载体可进一步包括另外的元件，比如用于RNA转运的rev反应元件(RRE)、包装序列以及5’和3’长末端重复序列(LTR)。术语“长末端重复序列(long terminal repeat)”或“LTR”是指位于逆转录病毒DNA末端的碱基对结构域，其包括U3、R和U5区域。LTR通常提供逆转录病毒基因表达(例如，基因转录体的促进、起始和多腺苷酸化)和病毒复制所需的功能。在一个实施方式中，本发明的载体(例如，慢病毒载体)包括3’U3删除的LTR。因此，本发明的载体(例如，慢病毒载体)包括本文所述的元件的任何组合，以提高转基因功能表达的效率。例如，除了编码CAR或TCR的核酸外，本发明的载体(例如，慢病毒载体)可包括WPRE序列、cPPT序列、RRE序列、5’LTR、3’U3删除的LTR’。
本发明的载体可以是自失活载体。如本文所使用的，术语“自失活载体(self-inactivating vector)”是指3’LTR增强子启动子区(U3区)已被修饰(例如，通过删除或替换)的载体。自失活载体可防止病毒转录超过第一轮病毒复制。因此，自失活载体只能感染宿主基因组(例如，哺乳动物基因组)一次，并且然后整合到其中，并且不能继续传递。因此，自失活载体可以大大降低产生具有复制能力病毒的风险。
在一些实施方式中，本发明的核酸可以是RNA，例如，体外合成的RNA。体外合成RNA的方法是本领域技术人员已知的；任何已知的方法都可用来合成包括编码本公开内容的正交嵌合细胞因子受体或其相应的正交细胞因子和/或CAR或TCR的序列的RNA。将RNA导入宿主细胞中的方法在本领域是已知的。例如，参见Zhao等人，Cancer Res.(2010)15：9053。将包括编码本公开内容的CAR或TCR的核苷酸序列的RNA导入宿主细胞中可在体外、离体或体内进行。例如，宿主细胞(例如，NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞等)可在体外或离体用包括编码本公开内容的正交嵌合细胞因子受体或其相应的正交细胞因子和/或CAR或TCR的核苷酸序列的RNA电穿孔。
为了评估多肽或其部分的表达，要导入细胞的表达载体还可含有选择标记基因或报告基因，或两者，以便于从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在一些实施方式中，选择标记可携带在单独的DNA片段上，并在共转染过程中使用。选择标记和报告基因的侧翼都可以有适当的调控序列，以实现在宿主细胞中的表达。有用的选择标记包括但不限于抗生素抗性基因。
报告基因可用于识别潜在的转染细胞和评估调控序列的功能。一般来说，报告基因是在受体生物体或组织中不存在或不被其表达并且编码多肽的基因，其表达表现为某种易于检测的特性，例如，酶活性。在DNA导入受体细胞后的适当时间对报告基因的表达进行评估。合适的报告基因可包括但不限于编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因(例如，Ui-Tei等人，2000FEBS Letters479：79-82)。
在一些实施方式中，提供本公开内容的核酸用于在例如哺乳动物细胞中生产(i)正交嵌合细胞因子受体，(ii)正交细胞因子，和/或(iii)本文所述的CAR或TCR。在一些实施方式中，本公开内容的核酸提供了核酸的扩增。
溶瘤腺病毒载体
溶瘤病毒代表治疗实体瘤的极具前景的药物，并且US FDA基于一项临床研究显示的治疗效果批准了一种表达GM-CSF的疱疹病毒用于治疗晚期黑素瘤(Andtbacka RH等人，Talimogene laherparepvec improves durable response rate in patients withadvanced melanoma.J Clin Oncol.2015；33(25):2780-2788)。溶瘤腺病毒(OAds)可通过编程特异性地靶向、复制和杀死癌细胞，同时放过正常细胞。病毒后代的释放会使病毒接种量呈指数增长，从而直接缩小(debulk)肿瘤，同时提供唤醒免疫系统所需的危险信号(Lichty BD，Breitbach CJ，Stojdl DF，Bell JC.Going viral with cancerimmunotherapy.Nat Rev Cancer.2014；14(8):559-567)。重要的是，OAds可以通过基因修饰在TME中选择性地表达治疗性转基因(Siurala M等人，Adenoviral delivery of tumornecrosis factor-αand interleukin-2enables successful adoptive cell therapy ofimmunosuppressive melanoma.Mol Ther.2016；24(8):1435-1443；Nishio N等人，Armedoncolytic virus enhances immune functions of chimeric antigen receptor-modified T cells in solid tumors.Cancer Res.2014；74(18):5195-5205；Tanoue K等人，Armed oncolytic adenovirus-expressing PD-L1 mini-body enhances antitumoreffects of chimeric antigen receptor T cells in solid tumors.Cancer Res.2017；77(8):2040-2051；Rosewell Shaw A等人，Adenovirotherapy delivering cytokine andcheckpoint inhibitor augments CAR T cells against metastatic head and neckcancer.Mol Ther.2017；25(11):2440-2451)。OAd在人患者中的可行性和安全性已在临床试验中得到证实(Kim KH等人，A phase I clinical trial of Ad5/3-Δ24，a novelserotype-chimeric，infectivity-enhanced，conditionally-replicative adenovirus(CRAd)，in patients with recurrent ovarian cancer.Gynecol Oncol.2013；130(3):518-524；Ranki T等人，Phase I study with ONCOS-102for the treatment of solidtumors-an evaluation of clinical response and exploratory analyses of immunemarkers.JImmunother Cancer.2016；4:17)。它们在局部表达治疗性转基因的同时逆转肿瘤免疫抑制的能力为与过继T细胞转移的结合提供了合理的策略。
在一些实施方式中，本公开内容的正交细胞因子，例如正交IL-2，由核酸序列编码，该核酸序列包括在溶瘤腺病毒载体中，比如有条件复制的溶瘤腺病毒载体中。有条件复制的溶瘤腺病毒载体的一个实例包括血清型5腺病毒载体(Ad5)，该载体对早期基因E1A和E3进行了修饰以分别实现癌细胞特异性复制和转基因表达。通过从CR2区域删除24个碱基对的DNA(又称D24变体)对E1A进行修饰，使病毒能够有选择性地在携带p16-Rb通路突变的癌细胞中复制。正交细胞因子(例如，oIL2)转基因可置于E3区。此外，病毒衣壳被修饰为包括嵌合5/3纤维，其确保提高肿瘤细胞的转导效率。该构建体Ad5/3-D24-orthoIL2及其同基因对照用于体外和体内研究，以评估正交细胞因子对选择性吸引和刺激慢病毒转导的orthoCAR T细胞和/或orthoTCR T细胞提高抗肿瘤疗效的能力。
F.经修饰的免疫细胞
本发明提供了经修饰的免疫细胞或其前体(例如，T细胞)，其包括(i)正交嵌合细胞因子受体和(ii)至少一种CAR。还提供了经修饰的免疫细胞或其前体细胞，其包括编码(i)正交嵌合细胞因子受体和(ii)至少一种CAR的一种或多种核酸。因此，这种经修饰的细胞具有由其中表达的CAR(一种或多种)引导的特异性。例如，本公开内容中包括CAR(一种或多种)的经修饰的细胞对靶细胞上的一种或多种抗原(例如，癌细胞上的一种或多种肿瘤抗原)具有特异性。在一个方面，本发明提供了一种治疗癌症的方法，其包括向患有癌症的受试者施用(i)包括正交嵌合细胞因子受体和至少一种CAR的经修饰的细胞和(ii)包括编码正交细胞因子的核酸的溶瘤腺病毒载体，从而治疗癌症。
本发明另外提供了经修饰的免疫细胞或其前体(例如，T细胞)，其被修饰为表达(i)正交嵌合细胞因子受体和(ii)至少一种T细胞受体(TCR)。还提供了经修饰的免疫细胞或其前体细胞，其包括编码(i)正交嵌合细胞因子受体和(ii)至少一种TCR的一种或多种核酸。因此，这种经修饰的细胞具有由其中表达的TCR(一种或多种)引导的特异性。例如，本公开内容中包括TCR(一种或多种)的经修饰的细胞对靶细胞上的一种或多种抗原(例如，癌细胞上的一种或多种肿瘤抗原)具有特异性。在一个方面，本发明提供了一种治疗癌症的方法，其包括向患有癌症的受试者施用(i)被修饰为表达正交嵌合细胞因子受体和至少一种TCR的经修饰的细胞和(ii)包括编码正交细胞因子的核酸的溶瘤腺病毒载体，从而治疗癌症。
在某些实施方式中，经修饰的细胞是经修饰的免疫细胞。在某些实施方式中，经修饰的细胞是自体细胞。在某些实施方式中，经修饰的细胞是由人受试者获得的自体细胞。在某些实施方式中，经修饰的细胞是T细胞。
G.治疗方法
本文所述的经修饰的细胞(例如，T细胞)可包括在免疫疗法的组合物中。该组合物可包括药物组合物，并进一步包括药学上可接受的载体。可以施用治疗有效量的包括经修饰的T细胞的药物组合物。
在一个方面，本发明包括一种用于过继细胞转移疗法的方法，其包括向有需要的受试者施用本发明的经修饰的T细胞。在另一方面，本发明包括治疗受试者中的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用经修饰的T细胞群。在一个方面，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括向患有癌症的受试者施用(a)包括(i)正交嵌合细胞因子受体和(ii)至少一种CAR的经修饰的细胞，和(b)包括编码正交细胞因子的核酸序列的溶瘤腺病毒载体，其中经修饰的细胞呈现干细胞记忆(Tscm)特征以及改善的运输和效应功能，从而治疗癌症。在一个方面，本发明提供了一种治疗癌症的方法，其包括向患有癌症的受试者施用(a)被修饰为表达(i)正交嵌合细胞因子受体和(ii)至少一种TCR的经修饰的细胞，和(b)包括编码正交细胞因子的核酸序列的溶瘤腺病毒载体，其中经修饰的细胞呈现干细胞记忆(Tscm)特征以及改善的运输和效应功能，从而治疗癌症。
用于过继细胞疗法的免疫细胞施用方法是已知的，并且可与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继T细胞治疗方法在例如，Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev ClinOncol.8(10):577-85)中进行了描述。参见，例如Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10)：928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1)：84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4)：e61338。在一些实施方式中，细胞疗法，例如，过继T细胞疗法是通过自体转移进行的，其中细胞是从将接受细胞疗法的受试者或从源自该受试者的样品中分离和/或以其他方式制备的。因此，在一些方面，细胞源自需要治疗的受试者，例如患者，并且细胞在分离和处理后施用至同一受试者。
在一些实施方式中，细胞疗法，例如过继T细胞疗法，是通过异体转移进行的，其中细胞是从除要接受或最终接受细胞疗法的受试者(例如第一受试者)以外的受试者分离和/或以其他方式制备的。在这种实施方式中，然后将细胞施用至同一物种的不同受试者，例如，第二受试者。在一些实施方式中，第一和第二受试者的基因相同。在某些实施方式中，第一和第二受试者的基因相似。在一些实施方式中，第二受试者与第一受试者表达相同的HLA类别或超类型。
在一些实施方式中，在施用细胞或含有细胞的组合物之前，受试者已经接受了靶向疾病或病症(例如，肿瘤)的治疗剂的治疗。在一些方面，受试者对其他治疗剂是难治的或无反应的。在一些实施方式中，例如，在用另一种治疗干预措施，包括化疗、放疗和/或造血干细胞移植(HSCT)，例如，异基因HSCT治疗后，受试者患有持续的或复发的疾病。在一些实施方式中，尽管受试者已对另一种疗法产生抗药性，但是施用仍能有效地治疗受试者。
在一些实施方式中，受试者对另一种治疗剂有反应，并且用治疗剂治疗可减轻疾病负担。在一些方面，受试者最初对治疗剂有反应，但是随着时间的推移展现疾病或病症的复发。在一些实施方式中，受试者没有复发。在一些这样的实施方式中，受试者被确定为有复发风险，比如复发风险很高，并且因此要预防性地施用细胞，例如以降低复发的可能性或防止复发。在一些方面，受试者之前没有接受过另一种治疗剂的治疗。
在一些实施方式中，例如，在用另一种治疗干预措施，包括化疗、放疗和/或造血干细胞移植(HSCT)，例如异基因HSCT治疗后，受试者患有持续的或复发的疾病。在一些实施方式中，尽管受试者已对另一种疗法产生抗药性，但是施用仍能有效地治疗受试者。
可以将本发明的经修饰的免疫细胞施用至动物，优选地哺乳动物，更优选地人，以治疗癌症。此外，本发明的细胞可用于治疗与癌症有关的任何病症，特别是针对肿瘤细胞(一种或多种)的细胞介导的免疫反应，在该肿瘤细胞中治疗或缓解疾病是期望的。用本发明的经修饰的细胞或药物组合物治疗的癌症类型包括：癌(carcinoma)、胚细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤，以及恶性肿瘤例如肉瘤、癌和黑素瘤。其他示例性癌症包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、甲状腺癌等。癌症可以是非实体瘤(比如，血液肿瘤)或实体瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。在一个实施方式中，癌症是实体瘤或血液肿瘤。在一个实施方式中，癌症是癌。在一个实施方式中，癌症是肉瘤。在一个实施方式中，癌症是白血病。在一个实施方式中，癌症是实体瘤。
实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性的或恶性的。不同类型的实体瘤因形成它们的细胞类型而命名(比如，肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤比如肉瘤和癌的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、威尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(比如神经胶质瘤(比如，脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、施万细胞瘤(Schwannoma craniopharyogioma)、室管膜细胞瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。
可通过本文所公开的方法进行治疗的癌症包括但不限于食管癌、肝细胞癌、基底细胞癌(皮肤癌的一种)、鳞状细胞癌(各种组织)、膀胱癌、包括过渡性细胞癌(一种膀胱恶性肿瘤)、支气管癌、结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌(包括小细胞癌)、膀胱癌(一种膀胱恶性肿瘤)、包括过渡细胞癌(膀胱恶性肿瘤)、支气管癌、结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、肾细胞癌、导管原位癌或胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、成骨癌、上皮癌和鼻咽癌。
可通过本文所公开的方法进行治疗的肉瘤包括但不限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、成骨肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤和其他软组织肉瘤。
在某些示例性实施方式中，本发明的经修饰的免疫细胞用于治疗骨髓瘤或与骨髓瘤相关的病症。骨髓瘤或与之相关的病症的实例包括但不限于轻链骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、意义不明的单克隆γ病(MGUS)、浆细胞瘤(例如，单发、多发单发、髓外浆细胞瘤)、淀粉样变性和多发性骨髓瘤。在一个实施方式中，本公开内容的方法用于治疗多发性骨髓瘤。在一个实施方式中，本公开内容的方法用于治疗难治性骨髓瘤。在一个实施方式中，本公开内容的方法用于治疗复发性骨髓瘤。
在某些示例性实施方式中，本发明的经修饰的免疫细胞用于治疗黑素瘤或与黑素瘤相关的病症。黑素瘤或与之相关的病症的实例包括但不限于浅表扩散性黑素瘤、结节性黑素瘤、雀斑样痣恶性黑素瘤(lentigo maligna melanoma)、肢端雀斑痣性黑色素瘤(acral lentiginous melanoma)、无黑色素性黑素瘤(amelanotic melanoma)或皮肤黑素瘤(例如，皮肤、眼、外阴、阴道、直肠黑素瘤)。在一个实施方式中，本公开内容的方法用于治疗皮肤黑素瘤。在一个实施方式中，本公开内容的方法用于治疗难治性黑素瘤。在一个实施方式中，本公开内容的方法用于治疗复发性黑素瘤。
在又其他示例性实施方式中，本发明的经修饰的免疫细胞用于治疗肉瘤或与肉瘤相关的病症。肉瘤或与之相关的病症的实例包括但不限于血管肉瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、纤维肉瘤、胃肠道间质瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、恶性周围神经鞘瘤、骨肉瘤、多形性肉瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤。在一个实施方式中，本公开内容的方法用于治疗滑膜肉瘤。在一个实施方式中，本公开内容的方法用于治疗脂肪肉瘤，比如粘液样/圆形细胞脂肪肉瘤、分化/去分化脂肪肉瘤和多形性脂肪肉瘤。在一个实施方式中，本公开内容的方法用于治疗肌样/圆形细胞脂肪肉瘤。在一个实施方式中，本公开内容的方法用于治疗难治性肉瘤。在一个实施方式中，本公开内容的方法用于治疗复发性肉瘤。
相对于接受治疗的受试者，待施用的本发明的细胞可以是自体的。
本发明细胞的施用可以本领域技术人员已知的任何方便的方式进行。本发明的细胞可以通过气溶胶吸入、注射、摄取、输血、植入或移植施用至受试者。本文所述的组合物可通过经动脉、皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌肉内、静脉(i.v.)注射或腹腔注射施用至患者。在其他情况下，本发明的细胞可直接注射到受试者的炎症部位、受试者的局部疾病部位、淋巴结、器官、肿瘤等。
在一些实施方式中，细胞以期望的剂量施用，在一些方面包括细胞或细胞类型(一种或多种)的期望剂量或数量和/或细胞类型的期望比例。因此，在一些实施方式中，细胞的剂量是基于细胞的总数(或每千克体重的细胞数)和单个群体或亚型的期望比例，比如CD4+与CD8+的比例。在一些实施方式中，细胞的剂量是基于单个群体或单个细胞类型中细胞的期望总数(或每千克体重的数量)。在一些实施方式中，剂量是基于这些特征的组合，比如期望的细胞总数、单个群体中细胞的期望比例和期望总数。
在一些实施方式中，细胞群或细胞亚型(比如，CD8+和CD4+T细胞)以总细胞的期望剂量(例如，T细胞的期望剂量)或在其可容忍差值范围内施用。在一些方面，期望剂量是指细胞的期望数量或向其施用细胞的受试者的每单位体重的期望细胞数量，例如细胞/kg。在一些方面，期望剂量为或超过最小细胞数或每单位体重的最小细胞数。在一些方面，在以期望剂量施用的总细胞中，单个群体或亚型以或接近期望的输出比例(比如，CD4+与CD8+的比例)存在，例如，在该比例的一定可容忍差值或误差范围内。
在某些实施方式中，细胞以一个或多个单个群体或亚型细胞的期望剂量或在期望剂量的可容忍差值范围内施用，比如CD4+细胞的期望剂量和/或CD8+细胞的期望剂量。在一些方面，期望剂量是细胞亚型或群体的期望数量，或向其施用细胞的受试者的每单位体重的期望的细胞数量，例如，细胞/kg。在一些方面，期望剂量为或高于细胞群或亚型的最小细胞数，或每单位体重的细胞群或亚型的最小细胞数。因此，在一些实施方式中，剂量是基于总细胞的期望固定剂量和期望比例，和/或基于一个或多个(例如，每个)单个亚型或亚群的期望固定剂量。因此，在一些实施方式中，剂量是基于T细胞的期望的固定或最小剂量以及CD4+与CD8+细胞的期望比例，和/或基于CD4+和/或CD8+细胞的期望的固定或最小剂量。
在某些实施方式中，细胞或细胞亚型的单个群体以下述范围施用至受试者：约100万至约1000亿个细胞，诸如例如，100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约50000万个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞或上述任两个值定义的范围)，比如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞或上述任两个值定义的范围)，并且在一些情况下，约10000万个细胞至约500亿个细胞(例如，约12000万个细胞、约25000万个细胞、约35000万个细胞、约45000万个细胞、约65000万个细胞、约80000万个细胞、约90000万个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)或这些范围之间的任何值。
在一些实施方式中，总细胞的剂量和/或单个细胞亚群的剂量在为或约1×105个细胞/kg至约1×1011个细胞/kg 104和为或约1011个细胞/千克(kg)体重之间，比如在105和106个细胞/kg体重之间的范围内，例如，为或约1×105个细胞/kg、1.5×105个细胞/kg、2×105个细胞/kg、或1×106个细胞/kg体重。例如，在一些实施方式中，细胞在为或约104和为或约109个T细胞/千克(kg)体重之间，比如在105和106个T细胞/kg体重之间或在其一定误差范围内施用，例如，为或约1×105个T细胞/kg、1.5×105个T细胞/kg、2×105个T细胞/kg或1×106个T细胞/kg体重。在其他示例性实施方式中，用于本公开内容的方法的经修饰的细胞的合适剂量范围包括但不限于约1×105个细胞/kg至约1×106个细胞/kg、约1×106个细胞/kg至约1×107个细胞/kg、约1×107个细胞/kg约1×108个细胞/kg、约1×108个细胞/kg约1×109个细胞/kg、约1×109个细胞/kg约1×1010个细胞/kg、约1×1010个细胞/kg约1×1011个细胞/kg。在示例性实施方式中，用于本公开内容的方法的合适剂量为约1×108个细胞/kg。在示例性实施方式中，用于本公开内容的方法的合适剂量为约1×107个细胞/kg。在其他实施方式中，合适剂量为约1×107个总细胞至约5×107个总细胞。在一些实施方式中，合适剂量为约1×108个总细胞至约5×108个总细胞。在一些实施方式中，合适剂量为约1.4×107个总细胞至约1.1×109个总细胞。在示例性实施方式中，用于本公开内容的方法的合适剂量为约7×109个总细胞。
在一些实施方式中，细胞在为或约104和为或约109个CD4+和/或CD8+细胞/千克(kg)体重之间，比如在105和106个CD4+和/或CD8+细胞/kg体重之间或在其一定误差范围内施用，例如，为或约1×105个CD4+和/或CD8+细胞/kg，1.5×105个CD4+和/或CD8+细胞/kg，2×105个CD4+和/或CD8+细胞/kg，或1×106个CD4+和/或CD8+细胞/kg体重。在一些实施方式中，细胞以大于和/或至少约1×106、约2.5×106、约5×106、约7.5×106或约9×106个CD4+细胞，和/或至少约1×106、约2.5×106、约5×106、约7.5×106或约9×106个CD8+细胞，和/或至少约1×106、约2.5×106、约5×106、约7.5×106或约9×106个T细胞或在其一定误差范围内施用。在一些实施方式中，细胞在约108和1012之间或约1010和1011个T细胞之间、约108和1012之间或约1010和1011个CD4+细胞之间，和/或约108和1012之间或约1010和1011个CD8+细胞之间或在其一定误差范围内施用。
在一些实施方式中，细胞以多种细胞群或亚型(比如，CD4+和CD8+细胞或亚型)的期望输出比例或在其可容忍范围内施用。在一些方面，期望的比例可以是特定的比例或者可以是比例范围，例如，在一些实施方式中，期望的比例(例如，CD4+与CD8+细胞的比例)在为或约5:1和为或约5:1(或大于约1:5且小于约5:1)之间，或在为或约1:3和为或约3:1(或大于约1:3且小于约3:1)之间，比如在为或约2:1和为或约1:5(或大于约1:5且小于约2:1)之间，比如为或约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9:1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。在一些方面，可容忍差值在期望比例的约1％、约2％、约3％、约4％约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％内，包括这些范围之间的任何值。
在一些实施方式中，以单剂量或多剂量向有需要的受试者施用一定剂量的经修饰的细胞。在一些实施方式中，一定剂量的经修饰的细胞以多剂量施用，例如每周一次或每7天一次，每2周一次或每14天一次，每3周一次或每21天一次，每4周一次或每28天一次。在示例性实施方式中，向有需要的受试者施用单剂量的经修饰的细胞。在示例性实施方式中，通过快速静脉输液向有需要的受试者施用单剂量经修饰的细胞。
对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可能取决于待治疗疾病的类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、细胞是用于预防还是治疗目的、先前的治疗、受试者的临床病史和对细胞的反应，以及主治医生的判断。在一些实施方式中，组合物和细胞可一次性或经过一系列治疗适当地施用至受试者。
在一些实施方式中，细胞作为联合治疗的一部分施用，比如与另一种治疗干预措施，比如抗体或工程化细胞或受体或制剂，比如细胞毒性药物或治疗剂，同时或以任何顺序依次施用。在一些实施方式中，细胞与一种或多种另外的治疗剂，或与另一种治疗干预措施结合同时或按任何顺序依次共同施用。在一些情况下，细胞与另一种疗法在足够近的时间内共同施用，使得细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的效果，反之亦然。在一些实施方式中，细胞在一种或多种另外的治疗剂之前施用。在一些实施方式中，细胞在一种或多种另外的治疗剂之后施用。在一些实施方式中，一种或多种另外的治疗剂包括细胞因子，比如IL-2，以增强持久性。在一些实施方式中，该方法包括施用化疗剂。
在某些实施方式中，本发明的经修饰的细胞(例如，包括(i)正交嵌合细胞因子受体和(ii)至少一种CAR或TCR的经修饰的细胞)可以与免疫检查点抗体(例如，抗PD1、抗CTLA-4或抗PDL1抗体)联合施用至受试者。例如，经修饰的细胞可与靶向例如PD-1(程序性死亡1蛋白)的抗体或抗体片段联合施用。抗PD-1抗体的实例包括但不限于派姆单抗(原名帕博利珠单抗(lambrolizumab)，又名MK-3475)和纳武单抗(nivolumab)(BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538、/>)或其抗原结合片段。在某些实施方式中，经修饰的细胞可与抗PD-L1抗体或其抗原结合片段联合施用。抗PD-L1抗体的实例包括但不限于BMS-936559、MPDL3280A(/>阿特珠单抗(Atezolizumab))和MEDI4736(德瓦鲁单抗(Durvalumab)，Imfinzi)。在某些实施方式中，经修饰的细胞可与抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段联合施用。抗CTLA-4抗体的实例包括但不限于伊匹单抗(Ipilimumab)(商品名Yervoy)。还可使用其他类型的免疫检查点调节剂，包括但不限于小分子、siRNA、miRNA和CRISPR系统。免疫检查点调节剂可在包括CAR或TCR的经修饰的细胞之前、之后或同时施用。在某些实施方式中，包括免疫检查点调节剂的联合治疗可提高包括本发明的经修饰的细胞的疗法的治疗效果。
在一些实施方式中，在施用细胞后，可通过多种已知方法中的任何一种测量工程化细胞群的生物活性。要评估的参数包括工程化细胞或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，在体内通过例如成像，或在体外通过例如ELISA或流式细胞术。在某些实施方式中，工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用本领域已知的任何合适的方法来测量，诸如例如在Kochenderfer等人，J.Immunotherapy，32(7)：689-702(2009)，以及Herman等人，J.Immunological Methods，285(1)：25-40(2004)中描述的细胞毒性测定。在某些实施方式中，细胞的生物活性是通过测定一种或多种细胞因子，比如CD 107a、IFNγ、IL-2和TNF的表达和/或分泌来测量的。在一些方面，生物活性是通过评估临床结果，比如肿瘤负担或负荷的减少来测量的。
在某些实施方式中，向受试者提供二次治疗。二次治疗包括但不限于化疗、放疗、手术和药物。
在一些实施方式中，受试者可在接受过继细胞疗法(例如，CAR T细胞疗法)之前施用调理疗法。在一些实施方式中，调理疗法包括向受试者施用有效量的环磷酰胺。在一些实施方式中，调理疗法包括向受试者施用有效量的氟达拉滨。在优选的实施方式中，调理疗法包括向受试者施用有效量的环磷酰胺和氟达拉滨的组合。在过继细胞疗法(例如，CAR T细胞疗法)之前施用调理疗法可提高过继细胞疗法的疗效。在美国专利号9,855,298中描述了调理T细胞疗法的患者的方法，其通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方式中，本公开内容的具体剂量方案包括在施用经修饰的T细胞之前的淋巴细胞清除步骤。在示例性实施方式中，淋巴细胞清除步骤包括施用环磷酰胺和/或氟达拉滨。
在一些实施方式中，淋巴细胞清除步骤包括施用剂量在约200mg/m2/天和约2000mg/m2/天之间(例如，200mg/m2/天、300mg/m2/天或500mg/m2/天)的环磷酰胺。在示例性实施方式中，环磷酰胺的剂量为约300mg/m2/天。在一些实施方式中，淋巴细胞清除步骤包括施用剂量在约20mg/m2/天和约900mg/m2/天之间(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天或60mg/m2/天)的氟达拉滨。在示例性实施方式中，氟达拉滨的剂量为约30mg/m2/天。
在一些实施方式中，淋巴细胞清除步骤包括施用剂量在约200mg/m2/天和约2000mg/m2/天之间(例如，200mg/m2/天、300mg/m2/天或500mg/m2/天)的环磷酰胺，和剂量在约20mg/m2/天和约900mg/m2/天之间(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天或60mg/m2/天)的氟达拉滨。在示例性实施方式中，淋巴细胞清除步骤包括施用剂量为约300mg/m2/天的环磷酰胺和剂量为约30mg/m2/天的氟达拉滨。
在示例性实施方式中，环磷酰胺的给予为300mg/m2/天，持续三天，并且氟达拉滨的给予为30mg/m2/天，持续三天。
相对于第0天的T细胞(例如，CAR-T、TCR-T、修饰的T细胞等)输液，淋巴细胞清除化疗的给予可安排在第6天至第4天(有1天窗口期，即在第7天至第5天给予)。
在示例性实施方式中，对于患有癌症的受试者，在施用经修饰的T细胞前3天，受试者通过静脉输液接受包括300mg/m2环磷酰胺的淋巴细胞清除化疗。在示例性实施方式中，对于患有癌症的受试者，在施用经修饰的T细胞前3天，受试者通过静脉输液接受包括300mg/m2环磷酰胺的淋巴细胞清除化疗。
在示例性实施方式中，对于患有癌症的受试者，受试者接受包括剂量在约20mg/m2/天和约900mg/m2/天之间(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天或60mg/m2/天)的氟达拉滨的淋巴细胞清除化疗。在示例性实施方式中，对于患有癌症的受试者，受试者接受包括剂量为30mg/m2的氟达拉滨的淋巴细胞清除化疗，持续3天。
在示例性实施方式中，对于患有癌症的受试者，受试者接受包括剂量在约200mg/m2/天和约2000mg/m2/天之间(例如，200mg/m2/天、300mg/m2/天或500mg/m2/天)的环磷酰胺，以及剂量在约20mg/m2/天和约900mg/m2/天之间(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天或60mg/m2/天)的氟达拉滨的淋巴细胞清除化疗。在示例性实施方式中，对于患有癌症的受试者，受试者接受包括剂量为约300mg/m2/天的环磷酰胺和剂量为30mg/m2的氟达拉滨的淋巴细胞清除化疗，持续3天。
本发明的细胞可以在适当的临床前和临床实验和试验中确定的剂量、途径和次数施用。细胞组合物可以在这些剂量范围内多次施用。本发明细胞的施用可与本领域技术人员确定的治疗期望的疾病或病症的其他有用的方法相结合。
本领域已知输注CAR T细胞后的不良反应之一是免疫活化的开始，被称为细胞因子释放综合征(CRS)。CRS是一种导致炎性细胞因子升高的免疫活化。CRS是一种已知的靶向毒性，其发生可能与疗效有关。临床和实验室指标的范围从轻度CRS(体征和/或2级器官毒性)到重度CRS(sCRS；≥3级器官毒性、积极的临床干预措施和/或可能危及生命)。临床特征包括：高烧、乏力、疲劳、肌痛、恶心、厌食、心动过速/低血压、毛细血管渗漏、心功能不全、肾功能损害、肝功能衰竭和弥散性血管内凝血。在CAR T细胞输注后，显示包括γ干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、IL-10和IL-6的细胞因子显著升高。一种CRS标志是包括IL-6(严重升高)、IFN-γ、TNF-α(中度)和IL-2(轻度)的细胞因子的升高。还观察到包括铁蛋白和C反应蛋白(CRP)的临床上可用的炎症标志物的升高与CRS综合征相关。CRS的出现通常与过继转移的细胞的扩增和进行性免疫活化有关。已经表明，CRS的严重程度取决于输液时的疾病负担，因为肿瘤负担重的患者会出现更多的CRS。
因此，本发明在确诊CRS后提供了适当的CRS管理策略，以减轻炎症失控的生理症状，同时不影响工程化细胞(例如，CAR T细胞)的抗肿瘤疗效。CRS管理策略是本领域已知的。例如，可以施用全身性皮质类固醇来迅速逆转sCRS(例如，3级CRS)症状，而不影响初始抗肿瘤反应。
在一些实施方式中，可以施用抗IL-6R抗体。抗IL-6R抗体的实例是美国食品和药物管理局批准的单克隆抗体托珠单抗(tocilizumab)，也称为阿替珠单抗(atlizumab)(市场名为Actemra或RoActemra)。托珠单抗是一种针对白细胞介素-6受体(IL-6R)的人源化单克隆抗体。施用托珠单抗表明几乎可以立即逆转CRS。
CRS通常基于所观察到的综合征的严重程度进行管理，并据此定制干预措施。CRS管理决策可能基于临床症状和体征以及对干预措施的反应，而不仅仅是实验室数值。
轻度至中度病例通常采用症状管理来治疗，并根据需要使用液体疗法、非甾体抗炎药(NSAID)和抗组胺药来充分缓解症状。较严重的病例包括任何程度的血流动力学不稳定的患者；如果出现任何血流动力学不稳定，推荐使用托珠单抗。在一些实施方式中，CRS的一线管理可以是标记剂量为8mg/kg IV的托珠单抗，持续60分钟(不超过800mg/剂)；可在Q8小时后重复使用托珠单抗。如果对第一剂量的托珠单抗的反应次最佳，可考虑附加剂量的托珠单抗。托珠单抗可单独施用或者可与皮质类固醇疗法联合施用。如果患者的CRS症状持续或进展，12-18小时内临床症状改善不充分或对托珠单抗的反应较差，可使用大剂量皮质类固醇治疗剂，通常为静脉注射100mg氢化可的松或1-2mg/kg的甲基强的松龙来治疗。在血流动力学不稳定或呼吸道症状较严重的患者中，可在CRS病程早期施用大剂量皮质类固醇治疗剂。CRS管理指南可基于已公布的标准(Lee等人(2019)Biol Blood MarrowTransplant，doi.org/10.1016/j.bbmt.2018.12.758；Neelapu等人(2018)Nat Rev ClinOncology，15:47；Teachey等人(2016)Cancer Discov，6(6):664-679)。
在用CAR-T疗法(Henter，2007年)的患者中观察到了与巨噬细胞活化综合征(MAS)或嗜血细胞淋巴组织细胞增多症(HLH)一致的特征，与CRS的临床表现相一致。MAS似乎是由CRS发生的免疫活化反应，并且因此应被视为CRS的表现。MAS与HLH(也是一种免疫刺激反应)相似。MAS临床综合征的特征是高热不退、影响三个系中至少两个系的细胞减少和肝脾肿大。它与高血清铁蛋白、可溶性白细胞介素-2受体和甘油三酯以及循环自然杀伤(NK)活性下降有关。
提供本文所述的被工程化为表达本文所述的任何嵌合正交细胞因子受体连同CAR的免疫细胞的过继细胞疗法有可能增强脱靶(on-target off-tumor)毒性。因此，本文考虑，在某些实施方式中，过继细胞治疗方法(即，治疗癌症的方法)进一步包括另外的细胞工程化策略(例如，开/关系统、合成路线)，以最大限度地提高患者的安全性(参见，例如Caliendo等人，Front Bioeng Biotechnol.(2019)7:43)。
在一个方面，本发明包括一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向受试者施用本文所公开的经修饰的免疫细胞或前体细胞中的任一种。本发明的又另一方面包括一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向受试者施用通过本文所公开的任一种方法产生的经修饰的免疫或前体细胞。
H.免疫细胞的来源
在某些实施方式中，免疫细胞(例如，T细胞)的来源获得自受试者，用于离体操作。用于离体操作的靶细胞的来源还可包括例如自体或异体供血、脐带血或骨髓。例如，免疫细胞的来源可以来自用本发明的经修饰的免疫细胞治疗的受试者，例如，受试者的血液、受试者的脐带血或受试者的骨髓。受试者的非限制性实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。优选地，受试者是人。
免疫细胞可从多种来源获得，包括血液、外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾脏组织、脐带、淋巴或淋巴器官。免疫细胞是免疫系统的细胞，比如先天或适应性免疫细胞，例如，髓样细胞或淋巴细胞，包括淋巴细胞，通常是T细胞和/或NK细胞。其他示例性细胞包括干细胞，比如多能(multipotent)和多能(pluripotent)干细胞，包括诱导多能干细胞(iPSC)。在某些方面，细胞是人细胞。就待治疗的受试者而言，细胞可以是异体和/或自体的。细胞通常是原代细胞，比如直接从受试者分离的细胞和/或从受试者分离并冷冻的细胞。
在某些实施方式中，免疫细胞是T细胞，例如，CD8+T细胞(例如，CD8+空白T细胞、中枢记忆T细胞或效应记忆T细胞)、CD4+T细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)、调节性T细胞(Treg)、干细胞记忆T细胞、淋巴祖细胞、造血干细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)或树突细胞。在一些实施方式中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如，髓样细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。在一个实施方式中，靶细胞是诱导多能干(iPS)细胞或源自iPS细胞的细胞，例如，由受试者产生的iPS细胞，其被操纵以改变(例如，诱导突变)或操纵一个或多个靶基因的表达，并分化成，例如T细胞，例如，CD8+T细胞(例如，CD8+空白T细胞、中枢记忆T细胞或效应记忆T细胞)、CD4+T细胞、干细胞记忆T细胞、淋巴祖细胞或造血干细胞。
在一些实施方式中，细胞包括一个或多个T细胞亚群或其他细胞类型，比如整个T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，比如通过功能、活化状态、成熟度、分化潜力、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标志物或细胞因子分泌情况和/或分化程度定义的那些。T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群包括空白T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型，比如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化的效应记忆T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关不变性T(MAIT)细胞、天然存在的和适应性调节性T(Treg)细胞、辅助性T细胞，比如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助性T细胞、α/βT细胞和δ/γT细胞。在某些实施方式中，可使用本领域现有的任何数量的T细胞系。
在一些实施方式中，方法包括从受试者体内分离免疫细胞，制备、处理、培养和/或工程化它们。在一些实施方式中，工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。所述的工程化细胞可从样品，比如生物样品中分离出来，例如，获得自或源自受试者的样品。在某些实施方式中，从中分离出细胞的受试者是患有疾病或病症或需要细胞疗法或将要施用细胞疗法的人。在一些实施方式中，受试者是需要特定治疗干预措施的人，比如细胞被分离、处理和/或工程化的过继细胞疗法。因此，在一些实施方式中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受试者的组织、液体和其他样品，以及由一个或多个处理步骤，比如分离、离心、基因工程(例如，用病毒载体转导)、洗涤和/或温育产生的样品。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品，或者是经过处理的样品。生物样品包括但不限于体液，比如血液、血浆、血清、脑脊液、滑膜液、尿液和汗液、组织和器官样品，包括从中提取的加工样品。
在一些方面，衍生或分离细胞的样品是血液或血液衍生样品，或者是或源自单采血液成分术或白细胞分离术的产品。示例样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检切片(tissue biopsy)、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠道相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾脏、其他淋巴组织、肝脏、肺、胃、肠、结肠、肾脏、胰腺、乳腺、骨骼、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法，例如，过继细胞疗法的背景中，样品来自自体和异体来源。
在一些实施方式中，细胞源自细胞系，例如，T细胞系。在一些实施方式中，细胞获得自异种来源，例如小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。在一些实施方式中，细胞的分离包括一个或多个制备和/或基于非亲和力的细胞分离步骤。在一些实例中，细胞在一种或多种试剂存在下被洗涤、离心和/或温育，例如，去除不需要的成分，富集期望的成分，裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些实例中，细胞是基于一种或多种特性，比如密度、粘附性、大小、对特定成分的敏感性和/或抗性分离的。
在一些实例中，例如通过单采血液成分术或白细胞分离术获得来自受试者的循环血液的细胞。在一些方面，样品含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板以外的细胞。在某些实施方式中，洗涤从受试者收集的血细胞，例如，以除去血浆部分，并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中，以进行后续的处理步骤。在一些实施方式中，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在一些方面，洗涤步骤是根据制造商的说明通过切向流过滤(TFF)完成的。在一些实施方式中，细胞在洗涤后被重新悬浮在各种生物相容性缓冲液中。在某些实施方式中，去除血细胞样品的成分，并直接将细胞重新悬浮在培养基中。在一些实施方式中，方法包括基于密度的细胞分离法，比如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心从外周血中制备白细胞。
在一个实施方式中，免疫细胞是通过单采血液成分术或白细胞分离术从个体循环血液中获得的。单采血液成分术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。通过单采血液成分术收集的细胞可进行洗涤，以除去血浆部分，并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中，比如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或缺乏钙和缺乏镁，或缺乏许多(例如，如果不是全部)二价阳离子的洗涤液，以进行后续的处理步骤。在洗涤后，可将细胞重新悬浮在各种生物相容性缓冲液，例如不含钙、不含镁的PBS中。可选地，也可以去除分离样品中的不期望的成分，并直接将细胞重新悬浮在培养基中。
在一些实施方式中，分离方法包括基于细胞中一种或多种特定分子，比如表面标志物(例如，表面蛋白)、细胞内标志物或核酸的表达或存在来分离不同类型的细胞。在一些实施方式中，可以使用任何已知的基于这种标志物的分离方法。在一些实施方式中，分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面中，分离包括基于细胞对一种或多种标志物(通常是细胞表面标志物)的表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如，通过与特异性结合这种标志物的抗体或结合伴侣温育，然后一般通过洗涤步骤，并将结合了抗体或结合伴侣的细胞与未结合抗体或结合伴侣的细胞分离。
这种分离步骤可以基于阳性选择，其中保留与试剂结合的细胞供进一步使用；和/或阴性选择，其中保留未与抗体或结合伴侣结合的细胞。在一些实例中，这两部分都被保留供进一步使用。在一些方面，当没有抗体可用于特异性识别异质群体中的细胞类型时，阴性选择是特别有用的，使得最好基于除期望的群体以外的细胞表达的标志物进行分离。分离不一定产生100％富集或去除特定细胞群或表达特定标志物的细胞。例如，阳性选择或富集特定类型的细胞，比如表达标志物的那些，是指增加这种细胞的数量或百分比，但不一定产生完全没有不表达标志物的细胞。同样，对特定类型的细胞(比如，表达标志物的那些)的阴性选择、去除或清除是指减少这种细胞的数量或百分比，但不一定导致完全去除所有这种细胞。
在一些实例中，进行多轮分离步骤，其中来自一个步骤的阳性或阴性选择部分要经历另一个分离步骤，比如后续的阳性或阴性选择。在一些实例中，单个分离步骤可同时清除表达多种标志物的细胞，比如通过用多种抗体或结合伴侣温育细胞，每种抗体或结合伴侣都对靶向阴性选择的标志物具有特异性。同样，通过用在不同细胞类型上表达的多种抗体或结合伴侣温育细胞，可同时对多种细胞类型进行阳性选择。
在一些实施方式中，一个或多个T细胞群富集或清除对一种或多种特定标志物(比如，表面标志物)阳性(标志物+)或表达高水平(标志物高)的细胞，或对一种或多种标志物呈阴性(标志物-)或表达相对低水平(标志物低)的细胞。例如，在一些方面，通过阳性或阴性选择技术分离出特定的T细胞亚群，比如阳性或高水平表达一种或多种表面标志物的细胞，例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞。在一些情况下，这些标志物在某些T细胞群(比如，非记忆细胞)中不存在或相对低的水平表达，但是在某些其他T细胞群(比如，记忆细胞)中存在或以相对高的水平表达。在一个实施方式中，细胞(比如，CD8+细胞或T细胞，例如，CD3+细胞)被富集(即，阳性选择)为对CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127和/或CD62L阳性或表达高表面水平的细胞，和/或被清除(例如，阴性选择)为对CD45RA阳性或表达高表面水平的细胞。在一些实施方式中，细胞被富集或清除对CD122、CD95、CD25、CD27和/或IL7-Ra(CD127)阳性或表达高表面水平的细胞。在一些实施方式中，CD8+T细胞被富集为对CD45RO(或对CD45RA阴性)和对CD62L阳性的细胞。例如，可使用CD3/CD28共轭磁珠(例如， M-450 CD3/CD28T细胞扩增仪)对CD3+、CD28+T细胞进行阳性选择。
在一些实施方式中，通过阴性选择非T细胞(例如，B细胞、单核细胞或其他白细胞)上表达的标志物(比如，CD14)将T细胞从PBMC样品中分离出来。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助性T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过对在一个或多个空白、记忆和/或效应T细胞亚群中表达或表达为相对较高程度的标志物进行阳性或阴性选择，可将这些CD4+和CD8+群体进一步分选为亚群。在一些实施方式中，比如通过基于与各亚群相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，可以将CD8+细胞进一步富集或清除空白细胞、中枢记忆细胞、效应记忆细胞和/或中枢记忆干细胞。在一些实施方式中，对中枢记忆T(TCM)细胞进行富集是为了提高疗效，比如改善在施用后的长期存活、扩增和/或移植(engraftment)，在一些方面，其在这种亚群中是特别稳健的。在一些实施方式中，将富含TCM的CD8+T细胞与CD4+T细胞结合可进一步提高疗效。
在一些实施方式中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-亚群中。比如，可使用抗CD8和抗CD62L抗体富集或清除PBMC中的CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+部分。在一些实施方式中，CD4+T细胞群和CD8+T细胞亚群，例如，富集中枢记忆(TCM)细胞的亚群。在一些实施方式中，中枢记忆T(TCM)细胞的富集基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127的阳性或高表面表达；在一些方面，它是基于表达或高表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一个方面，中枢记忆T(TCM)细胞的富集是从基于CD4表达选择的细胞的阴性部分开始的，这部分细胞要经历基于CD14和CD45RA表达的阴性选择和基于CD62L的阳性选择。这些选择在一些方面是同时进行的，而在其他方面则是按任意顺序依次进行的。在一些方面，用于制备CD8+细胞群或亚群的基于CD4表达的选择步骤也用于产生CD4+细胞群或亚群，使得基于CD4分离的阳性和阴性部分都被保留并用于方法的后续步骤中，任选地接下来的一个或多个进一步的阳性或阴性选择步骤。
通过识别具有细胞表面抗原的细胞群可将CD4+T辅助细胞分为空白细胞、中枢记忆细胞和效应细胞。可通过标准方法获得CD4+淋巴细胞。在一些实施方式中，空白CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在一些实施方式中，中枢记忆CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方式中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO。在一个实例中，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括CD14、CD20、CDl lb、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方式中，抗体或结合伴侣与固体载体或基质(比如，磁珠或顺磁珠)结合，以允许分离细胞进行阳性和/或阴性选择。
在一些实施方式中，细胞在基因工程之前或结合基因工程进行温育和/或培养。温育步骤可包括培养、培育、刺激、活化和/或繁殖。在一些实施方式中，组合物或细胞在刺激条件或刺激剂的存在下温育。这些条件包括旨在诱导群体中细胞的增殖、扩增、活化和/或存活，模拟抗原暴露，和/或启动细胞进行基因工程，比如引入重组抗原受体的条件。条件可包括特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、试剂(例如，营养物、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子，比如细胞因子、趋化因子、抗原、结合伴侣、融合蛋白、重组可溶性受体)以及其他旨在激活细胞的制剂中的一种或多种。在一些实施方式中，刺激条件或试剂包括一种或多种制剂，例如，配体，它能够激活TCR复合物的胞内信号传导结构域。在一些方面，试剂开启或启动T细胞中的TCR/CD3细胞内信号传导级联。这种试剂可包括抗体，例如对TCR成分和/或共刺激受体，例如抗CD3、抗CD28具有特异性，例如与固体载体比如珠子结合的那些，和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法可进一步包括向培养基中加入抗CD3和/或抗CD28抗体(例如，浓度至少约为0.5ng/ml)的步骤。在一些实施方式中，刺激剂包括IL-2和/或IL-15，例如，浓度至少约为10单位/mL的IL-2。
在另一个实施方式中，通过裂解红细胞并清除单核细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心法从外周血分离T细胞。可选地，可以从脐带分离T细胞。在任何情况下，可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞的特定亚群。
可以从这样分离出来的脐带血单核细胞清除表达某些抗原，包括但不限于CD34、CD8、CD14、CD19和CD56的细胞。这些细胞的清除可使用分离的抗体、包括抗体的生物样品(比如，腹水)、与物理载体结合的抗体以及与细胞结合的抗体来完成。
通过阴性选择富集T细胞群可以使用对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体组合来完成。优选的方法是使用针对阴性选择的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物经由阴性磁性免疫粘连或流式细胞术进行细胞分选和/或选择。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8抗体。
为了通过阳性或阴性选择分离出期望的细胞群，可以改变细胞和表面(例如，颗粒比如珠子)的浓度。在某些实施方式中，可能期望显著减小珠子和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)以确保细胞和珠子的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用为20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方式中，使用为10亿个细胞/ml的浓度。在进一步的实施方式中，使用大于1亿个细胞/ml的浓度。在进一步的实施方式中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在又一个实施方式中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方式中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以产生提高的细胞产率、细胞活化和细胞扩增。
也可以在洗涤步骤后冷冻T细胞，其不需要去除单核细胞的步骤。尽管不希望被理论束缚，但是冷冻和后续的解冻步骤可以通过去除细胞群中的粒细胞和一定程度上的单核细胞来提供更均匀的产品。在去除血浆和血小板的洗涤步骤后，可将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数在本领域都是已知的，并且在此背景下也有用，但是在非限制性实例中，一种方法涉及使用含有20％ DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后以每分钟1℃的速度将细胞冷冻到-80℃，并储存在液氮储存罐的气相中。也可使用其他受控的冷冻方法以及在-20℃或液氮中立即进行非受控的冷冻方法。
在一个实施方式中，T细胞群由细胞比如外周血单核细胞、脐带血细胞、纯化的T细胞群和T细胞系组成。在另一个实施方式中，外周血单核细胞包括T细胞群。在又另一个实施方式中，纯化的T细胞包括T细胞群。
在某些实施方式中，T调节细胞(Tregs)可以从样品中分离出来。样品可以包括但不限于脐带血或外周血。在某些实施方式中，Tregs是通过流式细胞术分选分离的。在分离之前，可通过本领域已知的任何方法富集样品中的Tregs。分离的Tregs在使用前可冷冻保存和/或扩增。在美国专利号7,754,482、8,722,400和9,555,105，和美国专利申请号13/639,927中描述了分离Tregs的方法。
I.免疫细胞的扩增
无论是在修饰细胞以表达CAR或TCR之前还是之后，都可以使用在例如美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国公开号20060121005中描述的方法来活化并在数量上扩增细胞。例如，本发明的T细胞可通过与在其上附有刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触而扩增。具体而言，可通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体接触，或通过与结合钙离子载体的蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑素)接触而刺激T细胞群。为了共同刺激T细胞表面上的附属分子，可使用与附属分子结合的配体。例如，在适合刺激T细胞增殖的条件下，T细胞可与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，Besancon，France)，并且这些可用于本发明，本领域已知的其他方法和试剂(例如，参见ten Berge等人，Transplant Proc.(1998)30(8)：3975-3977；Haanen等人，J.Exp.Med.(1999)190(9)：1319-1328；和Garland等人，J.Immunol.Methods(1999)227(1-2)：53-63)也可用于本发明。
通过本文所公开的方法扩增T细胞可增加约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更多，以及两者之间的任一个和所有整数或部分整数。在一个实施方式中，T细胞在约20倍至约50倍的范围内扩增。
在培养后，T细胞可在培养装置中的细胞培养基中温育一段时间或直到细胞达到汇合或高细胞密度，以获得最佳传代，然后将细胞传递到另一个培养装置中。培养装置可以是通常用于体外培养细胞的任何培养装置。优选地，在将细胞传递到另一个培养装置之前，汇合度为70％或更高。更优选地，汇合度为90％或更高。一段时间可以是适合体外培养细胞的任何时间。在T细胞培养期间，可在任意时间更换T细胞培养基。优选地，约每2到3天更换一次T细胞培养基。然后从培养装置中收获T细胞，接着T细胞可以立即被使用或冷冻保存以备日后使用。在一个实施方式中，本发明包括冷冻保存扩增的T细胞。在将核酸导入T细胞之前将冷冻保存的T细胞解冻。
在另一个实施方式中，该方法包括分离T细胞并扩增T细胞。在另一个实施方式中，本发明进一步包括在扩增前冷冻保存T细胞。在又另一个实施方式中，解冻冷冻保存的T细胞以便用编码嵌合膜蛋白的RNA进行电穿孔。
在美国专利号5,199,942(通过引用并入本文)中描述了离体扩增细胞的另一种方法。比如，在美国专利号5,199,942中所描述的扩增可作为本文所述其它扩增方法的替代或补充。简而言之，T细胞的离体培养和扩增包括添加细胞生长因子，比如在美国专利号5,199,942中描述的那些，或其他因子，比如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体。在一个实施方式中，扩增T细胞包括用选自flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体的因子培养T细胞。
本文所述的培养步骤(与本文所述的试剂接触或电穿孔后)可以很短，例如少于24小时，比如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时。本文进一步描述的培养步骤(与本文所述的试剂接触)可以更长，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天。
各种术语用于描述培养物中的细胞。细胞培养物一般是指从活体生物体中提取并在受控条件下生长的细胞。原代细胞培养物是指直接取自生物体的细胞、组织或器官在第一次继代培养之前的培养物。当在促进细胞生长和/或分裂的条件下将细胞置于生长培养基中时，细胞在培养物中扩增，产生更大的细胞群。当细胞在培养物中扩增时，细胞增殖率通常以细胞数量倍增所需的时间来衡量，也称为倍增时间。
每一轮继代培养称为一代。当细胞经继代培养时，它们被称为经过传代。特定的细胞群或细胞系有时被称为或表征为传代次数。例如，经过十次传代培养的细胞群可称为P10培养物。原代培养物，即，从组织中分离出细胞后的第一次培养物，被称为P0。在第一次继代培养后，细胞被描述为二级培养物(P1或第1代)。在第二次继代培养后，细胞成为三级培养物(P2或第2代)等。本领域技术人员可以理解，在传代期间可能会有多次群体倍增，因此培养物的群体倍增数大于传代数。细胞在传代之间的扩增(即，群体倍增数)取决于许多因素，包括但不限于接种密度、基质、培养基和传代之间的时间。
在一个实施方式中，可以将细胞培养数小时(约3小时)至约14天或其间的任何小时整数值。适合T细胞培养的条件包括合适的培养基(例如，最小必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15，(Lonza))，其可能含有增殖和存活所必需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF-β和TNF-α或技术人员已知的用于细胞生长的其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂，比如N-乙酰-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo20，优选步骤是添加氨基酸、丙酮酸钠和维生素，不含血清或添加适量血清(或血浆)或规定的激素集和/或足以促进T细胞生长和扩增的细胞因子(一种或多种)。抗生素(例如，青霉素和链霉素)仅包括在实验培养物中，不包括在将注入受试者的细胞培养物中。靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如合适的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％的CO2)。
用于培养T细胞的培养基可包括可共同刺激T细胞的试剂。例如，可刺激CD3的试剂是CD3抗体，并且可刺激CD28的试剂是CD28抗体。通过本文所公开的方法分离的细胞可扩增约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更高。在一个实施方式中，T细胞在约20倍至约50倍或更大的范围内扩增。在一个实施方式中，经由抗CD3抗体包被的KT64.86人工抗原递呈细胞(aAPC)扩增人T调节细胞。扩增和活化T细胞的方法可参见美国专利号7,754,482、8,722,400，和9,555，105，其内容以其整体并入本文。
在一个实施方式中，扩增T细胞的方法可进一步包括分离扩增的T细胞以进一步应用。在另一个实施方式中，扩增方法可进一步包括对扩增的T细胞进行后续电穿孔，然后进行培养。后续电穿孔可包括向扩增的T细胞群中导入编码试剂的核酸，比如转导扩增的T细胞、转染扩增的T细胞或用核酸电穿孔扩增的T细胞，其中试剂进一步刺激T细胞。试剂可刺激T细胞，比如通过刺激进一步的扩增、效应功能或另一种T细胞功能。
J.药物组合物和制剂
还提供了本发明的免疫细胞群、含有这种细胞和/或富集这种细胞的组合物，比如其中表达正交嵌合细胞因子受体或共同表达正交嵌合细胞因子受体和至少一种CAR或TCR的细胞至少构成某种类型比如T细胞或CD8+或CD4+细胞的组合物或细胞中的总细胞的50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。组合物中包括用于施用，例如用于过继细胞疗法的药物组合物和制剂。还提供了对受试者(例如，患者)施用细胞和组合物的治疗方法。
此外，还提供了包括用于施用的细胞的组合物，包括药物组合物和制剂，比如单位剂量形式的组合物，包括以给定剂量或其部分施用的细胞数量。药物组合物和制剂一般包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方式中，组合物包括至少一种另外的治疗剂。
术语“药物制剂(pharmaceutical formulation)”是指这样的一种制剂，其形式可使其中所含的活性成分的生物活性有效，并且不含对施用该制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。“药学上可接受的载体(pharmaceutically acceptable carrier)”是指药物制剂中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。在一些方面，载体的选择部分取决于特定的细胞和/或施用方法。因此，有多种合适的制剂。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可包括例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，可使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物的量通常为总组合物的按重量计约0.0001％至约2％。在例如Remington的Pharmaceutical Sciences，第16版,Osol,A.Ed.(1980)中描述了载体。药学上可接受的载体在使用剂量和浓度下一般对受体无毒，并且包括但不限于：缓冲剂比如磷酸盐、柠檬酸酯和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(比如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，比如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，比如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物比如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，比如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，比如EDTA；糖，比如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反离子，比如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，比如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，缓冲剂包括在组合物中。合适的缓冲剂包括柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾以及其他各种酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物的量通常为总组合物的按重量计约0.001％至约4％。用于制备可施用的药物组合物的方法是已知的。例如，在Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)中描述了示例性方法。
制剂可包括水溶液。制剂或组合物还可含有多于一种对细胞治疗的特定适应症、疾病或病症有用的活性成分，优选地是与细胞活性互补的那些，其中各自的活性不会对彼此产生不利影响。这些活性成分可以适当地以对预期目的有效的量组合。因此，在一些实施方式中，药物组合物进一步包括其他药学活性剂或药物，比如化疗剂，例如，天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、道诺霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱和/或长春新碱。在一些实施方式中，药物组合物含有有效治疗或预防疾病或病症的量，比如治疗有效量或预防有效量的细胞。在一些实施方式中，治疗或预防效果是通过对所治疗的受试者进行定期评估来监测的。期望的剂量可通过单次推注施用细胞、多次推注施用细胞或连续输注细胞来实现。
制剂包括用于口服、静脉、腹腔、皮下、肺部、透皮、肌肉内、鼻内、含服、舌下或栓剂施用的那些。在一些实施方式中，细胞群经肠胃外施用。本文所使用的术语“肠胃外(parenteral)”包括静脉、肌肉内、皮下、直肠、阴道和腹腔施用。在一些实施方式中，使用通过静脉、腹腔或皮下注射的外周全身给药法向受试者施用细胞。在一些实施方式中，组合物以无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳剂、分散液或粘性组合物，在一些方面可缓冲至选定的pH值。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。此外，液体制剂在某种程度上更便于施用，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包括载体，载体可以是含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液态聚乙二醇)及其适当的混合物的溶剂或分散介质。
无菌可注射溶液可通过将细胞并入溶剂中，比如与合适的载体、稀释剂或赋形剂，比如无菌水、生理盐水、葡萄糖、葡萄糖等混合来制备。基于施用途径和期望的制剂，组合物还可含有辅助物质，比如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝剂或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂和/或色素。在一些方面，可以参考标准文本来配制合适的制剂。
还可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗菌防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。通过各种抗菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚和山梨酸)可确保预防微生物的作用。通过使用延缓吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶可以延长可注射的药物形式的吸收。
用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌可通过无菌过滤膜过滤来轻易实现。
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虽然本发明已参照其具体实施方式进行了描述，但是本领域技术人员应理解，在不背离本发明的真实精神和范围的情况下可以进行各种改变，并且可以用等同物进行替代。对本领域技术人员来说显而易见的是，可以使用适当的等同物对本文所述的方法进行其他适当的修改和调整，而不会背离本文所公开的实施方式的范围。此外，可以进行许多修改以使具体情况、材料、物质组成、工艺、工艺步骤(一个或多个)适应本发明的目标、精神和范围。所有这些修改都在所附的权利要求书的范围内。在现在详细描述了本发明的某些实施方式之后，通过参考以下实施例可以更清楚地理解本发明。
实施例
现在参照以下实施例对本发明进行描述。提供这些实施例仅用于说明目的，并且本发明并不限于这些实施例，而是包括因本文所提供的教导而显而易见的所有变型。
材料和方法
蛋白质产生
将编码小鼠和人野生型及正交IL-2和野生型IL-9的DNA克隆到昆虫表达载体pAcGP67-A中，该载体包括用于亲和纯化的C-末端8xHIS标签。编码小鼠血清白蛋白(MSA)的DNA购买自Integrated DNA Technologies(IDT)，并作为N-末端融合体克隆到pAcGP67-A中。使用BaculoGold杆状病毒表达系统(BD Biosciences)将昆虫表达DNA构建体转染到粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(High Five)细胞(Invitrogen)中进行分泌，并经由Ni-NTA从澄清的上清液中进行纯化，然后使用Superdex-200柱进行尺寸排阻色谱，并配制在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行注射。按照生产商的建议(VivaProducts)，使用Proteus NoEndoHC旋转柱试剂盒去除内毒素，并使用Pierce LAL显色内毒素定量试剂盒(ThermoFisher)确认内毒素去除。将蛋白质浓缩并储存在-80℃备用。
哺乳动物表达载体
将编码小鼠正交IL-2Rβ的cDNA和编码小鼠IL4R、IL7R、IL9R和IL21R胞内结构域(ICD)的基因块cDNA(Integrated DNA Tech)PCR和ITA克隆到逆转录病毒载体pMSCV-MCS-IRES-YFP中。人正交IL2Rβ和嵌合正交IL9R也同样克隆到pMSCV载体中。
动物
将小鼠饲养在实验室护理评估和认证协会(Association for the Assessmentand Accreditation of Laboratory Care)认可的动物设施中，并按照加州大学洛杉矶分校(UCLA)、宾夕法尼亚大学(University of Pennsylvania)和斯坦福大学(StanfordUniversity)的动物保护和利用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee)批准的方案使用。对于在UCLA进行的实验，C57BL/6J小鼠由放射肿瘤学活体饲养室(Radiation Oncology Vivarium)饲养；C57BL/6背景的pmel-1TCR/Thy1.1转基因小鼠(pmel小鼠)获得自杰克逊实验室(Jackson Laboratory)。对于在宾夕法尼亚大学进行的实验中，C57BL/6J和B6 CD45.1“Pepboy”小鼠购买自杰克逊实验室。
细胞系和细胞培养
B16-F10小鼠黑素瘤细胞系购买自ATCC，用具有L-谷氨酰胺(Fisher Scientific)的RPMI 1640培养，该RPMI 1640含有10％胎牛血清(FBS，Omega Scientific)、青霉素(100U/mL，Omega Scientific)、链霉素(100μg/mL，Omega Scientific)和两性霉素B(0.25μg/ml，Omega Scientific)。将KPC衍生的小鼠胰腺癌细胞系PDA7940b维持在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中。人黑素瘤细胞系M407和M263是根据UCLAIRB批准号11-003254从患者活检组织中建立的，并维持在补充有10％ FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中；M407细胞经稳定转导后表达核RFP(nRFP)，用于活细胞成像测定(Zaretsky等人，The New England Journal of Medicine，2016年，375:819-829)。将源自C57BL/6或pmel转基因小鼠的T细胞在具有L-谷氨酰胺的RPMI 1640中培养，该RPMI 1640补充有10％ FBS(Hyclone Characterized Fetal Bovine Serum)、抗生素、50μM 2-巯基乙醇(Gibco)、1％ NEAA、1％ NaPyr和HEPES。原代人T细胞用具有L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养，该RPMI 1640补充有10％ FBS(Hyclone Chacterized Fetal Bovine Serum)、抗生素、1％ NEAA、1％ NaPyr和HEPES。HEK293T细胞购买自ATCC，并维持在补充有10％FBS、1xGlutaMax(Gibco)、青霉素和链霉素的DMEM中。细胞系定期进行鉴定，并使用支原体检测试剂盒(Biotool)定期检测支原体感染。
逆转录病毒产生
先前已经描述了编码正交细胞因子受体的逆转录病毒的生产(Sockolosky等人，Science(2018)359:1037-1042)。简而言之，HEK293T细胞以每10cm组织培养皿3×106个细胞的数量接种，并使其粘附过夜。使用X-tremeGENE HP(Roche)、Turbofect(ThermoFisher)或TransIT Reagent(Thermofisher)以pMSCV逆转录病毒载体与pCL-Eco包装载体1.5:1的比例转染细胞，并在含5％ FBS的DMEM中培养过夜。在24小时后，用含5％ FBS的新鲜DMEM更换培养基，并再培养24小时。收集培养基，经离心澄清，并在液氮中速冻，在-80℃下保存。用含有5％ FBS的新鲜DMEM补充细胞，并再培养24小时，并收集逆转录病毒上清液并按所描述的储存。为了产生转导pmel和人T细胞的逆转录病毒，使用了相同的程序，但有以下变化：在转染后18小时，将培养基更换为含有10％ FBS(含20mM HEPES和10mM丁酸钠)的DMEM，并温育8小时。然后将培养基更换为含10％ FBS(含20mM HEPES并且不含丁酸钠)的DMEM，并温育过夜。第二天，收集培养基并用0.45μm过滤器过滤。如果不立即使用，则将病毒冷冻在-80℃以备后用。编码嵌合抗原受体的逆转录病毒是按照之前描述的生产的(Watanabe等人，JCIInsight(2018)3(7):e99573)。简而言之，使用Lipofectamine 2000(ThermoFisher)用pMSGV载体转染Plat-E包装细胞(Cell Biolabs)。24小时后更换培养基，并且再过24小时后收集培养基，经离心澄清并通过0.45μm过滤器，然后在-80℃下储存。
腺病毒的构建和纯化
使用AdEasyTMXL腺病毒载体系统(Agilent)构建了复制缺陷的E1/E3删除型腺病毒载体Ad5-CMV-oIL2(Ad-oIL2)和Ad5-CMV-Null(Ad-Null)。用5’KpnI和3’HindIII限制酶切位点合成了小鼠正交IL-2克隆3A10 cDNA(GenScript)，并将其亚克隆到pShuttle-CMV的多重克隆位点(Addgene)中。将含有pAdEasy-1的BJ5183-AD-1大肠杆菌细胞与PmeI线性化的pShuttle-CMV-oIL2转化，进行同源重组。在PacI线性化和转染到HEK293T细胞中之前，对所得重组Ad质粒进行序列验证并在XL10-Gold Ultracompetent细胞中扩增。在多轮扩增后，通过氯化铯(CsCl2)梯度离心法纯化高滴度腺病毒。用Amicon Ultra-15离心过滤装置(Millipore)将CsCl2与A195缓冲液交换(Evans等人，J Pharm Sci(2004)93:2458-2475)。用分光光度法测定病毒滴度(VP/ml)(Nanodrop，ThermoFisher)。
原代小鼠T细胞的活化、逆转录病毒转导和分选
C57BL/6衍生的小鼠T细胞的病毒转导之前已有描述(Sockolosky等人，Science(2018)359:1037-1042)。简而言之，用2.5μg/ml抗小鼠CD3ε(克隆145-2C11，Biolegend)在无菌PBS中的溶液涂布12孔组织培养板过夜。通过穿过70μm细胞过滤网分离，随后在ACK裂解缓冲液(Gibco)中裂解RBC，从6-8周大的C57BL/6J小鼠的脾脏和淋巴结中制备单细胞悬浮液。将细胞重新悬浮在含100IU/ml重组小鼠IL-2的小鼠T细胞培养基中，并用平板结合抗小鼠CD3ε和可溶性抗小鼠CD28(5ug/ml，克隆37.51，BioXCell)活化24小时。使用含有聚凝胺(10ug/ml)和100IU/ml mIL-2的逆转录病毒上清液，在2600rpm，90’，32℃下进行旋转转染，转导活化的小鼠T细胞。将病毒上清液更换为含有100IU/ml IL-2的新鲜小鼠T细胞培养基取代，并培养24小时。经由轻柔移液从原位收获细胞，并以1×106/ml重新悬浮在含100IU/ml IL-2的新鲜T细胞培养基中，并在37℃下扩增过夜，然后进行进一步的下游细胞测定。
为了对pmel T细胞进行逆转录病毒转导，在转导前1到3天收获5到10周龄pmel小鼠的脾细胞，并用50U/mL的小鼠IL-2(Peprotech)和1μg/mL的小鼠gp100肽(Anaspec)活化。在转导前一天，用重组人纤维连接片段(Retronectin)(Takara)涂布六孔组织培养板，并置于4℃的冰箱中过夜。第二天，用0.5％ FBS的PBS溶液封闭板30分钟，然后用PBS洗涤。将病毒上清液(2mL)加入每个孔中，并在2000g下旋转2小时。将活化的pmel T细胞(3×106)连同50U/mL鼠IL-2加入每个孔中，并在2000g下旋转10分钟，并且然后在37℃下培养18-24小时。然后，使用Aria II细胞分选仪(BD Biosciences)基于YFP的表达和7-AAD的排除分选出有活力的转导细胞，并静置过夜，然后用于下游体外或体外测定。
小鼠CAR T细胞的逆转录病毒转导先前已有描述(Watanabe等人，JCI Insight(2018)3(7):e99573)。简而言之，通过磁珠分离法(Stemcell Technologies)富集原代供体CD45.1小鼠脾细胞中的CD3+细胞。用小鼠CD3/CD28免疫磁珠(ThermoFisher)在50U/ml重组人IL-2(Peprotech)存在下活化T细胞48小时，然后在涂有重组人纤维连接片段(TakaraBio)的板上进行旋转感染。在旋转感染2天后，收获细胞用于体外检测或静脉注射。
原代人T细胞的活化、逆转录病毒转导和分选
在使用抗人CD3/28磁性免疫磁珠(ThermoFisher)和人IL-2(500U/mL)活化原代人外周血单核细胞(PBMC)两天之前，将从健康人供体白细胞分离术分离的原代人外周血单核细胞(PBMC)解冻并静置过夜。T细胞在涂有重组人纤维连接片段(Takara)的六孔板上共转导48小时，并通过旋转转染装载有1mL/孔的逆转录病毒(编码ho2R和NYESO1-TCR克隆1G4或ho9R和NYESO1-TCR克隆1G4)。收集活化和转导的细胞，并通过将珠子放在EasySep细胞分离磁铁上2分钟以去除珠子。使用抗人Vβ13.1PE抗体(Beckman Coulter，识别NYESO1-TCR克隆1G4的β链)和7-AAD活/死染料对细胞进行染色，然后使用Aria II细胞分选仪(BDBiosciences)基于YFP、Vβ13.1的表达和7-AAD的排除进行细胞分选。
Phosphoflo信号传导测定
在信号传导检测之前，将生长活跃的原代小鼠或人T细胞在缺乏IL-2的RPMI-C中静置24小时。将细胞铺板在50μl温RPMI-C培养基中的超低结合力的96孔圆底板中。然后在37℃下通过加入50μl连续稀释的重组细胞因子溶液刺激细胞20’，并在室温(RT)下搅拌下用1.5％ PFA固定15’，终止反应。用150μl冰冷的100％甲醇在冰上60’洗涤细胞并透化，或在-80℃储存过夜。用FACS缓冲液洗涤细胞，然后用Alexa647标记的抗STAT5 pY694(BDBiosciences)、抗STAT3(BD Biosciences)或抗STAT1(Cell Signaling)染色，在FACS缓冲液中按1:100稀释，并在4℃下，在黑暗中温育1小时。洗涤细胞并在CytoFlex(BeckmanCoulter)上进行分析。数据代表平均荧光强度(MFI)，并使用Prism 8.4(GraphPad)将各点拟合为log(激动剂)对剂量反应模型。
蛋白质印迹
用细胞因子刺激IL-2和FBS饥饿的CAR T细胞20分钟，并且用补充有蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物(Halt，ThermoFisher)的冰冷RIPA缓冲液裂解细胞以提取蛋白质。将30μg总蛋白装载到SDS-PAGE凝胶(NuPage Bis-Tris，ThermoFisher)中，并且随后转移到PVDF膜(Immobilon-FL，Millipore)。用各自的一抗检测pSTAT1/pSTAT3/pSTAT5和GAPDH，随后用IRDye标记的二抗或HRP连接的二抗检测。膜在Odyssey CLx(LI-COR Biosciences)上成像。
小鼠T细胞增殖测定
在用CellTracer Violet(CTV，ThermoFisher)标记前，将生长活跃的小鼠原代T细胞在缺乏IL2的RPMI-C中静置48小时。将标记的细胞以50,000T细胞/孔、50μl接种在96孔圆底板中。加入MSA-oIL2的连续稀释液(50μl)至总体积为100μl，并在37℃下培养2天。第2天，向细胞中加入新稀释的细胞因子(100μl)，并再培养2天。第4天，使用CytoFlex通过FACS评估CTV标记的细胞的增殖。基于FSC和SSC门控活细胞。
在存在MSA-oIL2或MSA-IL2的96孔圆底板中，通过每孔接种50,000个细胞来评估CAR T细胞增殖。第2天，用新鲜培养基和细胞因子喂养细胞。用Calcein AM活性染料(ThermoFisher)对等分的细胞进行染色，获得每日细胞计数，并在Celigo ImageCytometer(Nexcelom Bioscience)上进行分析。
细胞因子测定
为了进行Luminex测定，在细胞因子存在下将转导的CAR T细胞在圆底96孔板(200μl，50,000个细胞/孔)中一式三份温育4天，在此之后用Th1/Th2/Th9/Th17/Th22/Treg细胞因子17-Plex小鼠ProcartaPlexTMPanel(ThermoFisher)分析上清液。根据生产商的说明，使用细胞因子珠阵列(BD Biosciences)单独测量B16-F10与pmel T细胞共培养的上清液中的IFNγ。在感染Ad-Null或Ad-oIL2(100VP/细胞)后的不同时间点，通过细胞培养上清液中的小鼠IL-2ELISA(Abcam)对PDA7940b细胞(10,000个细胞/孔，96孔板)的oIL-2表达进行评估。向PDA7940b肿瘤注射PBS、Ad-Null或Ad-oIL2(1e9 VP/肿瘤)，并在72小时后收获，来评估体内表达。通过三次冻融循环解离肿瘤，并通过ELISA分析匀浆中的小鼠IL-2。通过心脏穿刺收集终末血液，并通过离心处理成血清。将IL-2浓度归一化为总蛋白含量。
实时细胞杀伤测定
在96孔×CELLigence E-Plate(Agilen)上以10,000个细胞/孔接种PDA7940b肿瘤细胞。在24小时后，按2:1的比例加入在oIL-2存在下预温育48小时的转导CAR T细胞，并在实时细胞分析(RTCA)分析仪(Agilent)上每隔15分钟记录一次靶细胞指数。用核定位RFP转导的B16-F10细胞系的T细胞杀伤先前已有描述(Kalbasi等人，Science TranslationalMedicine(2020)12:eabb0152)。简而言之，将用100ng/mL IFNγ脉冲处理18小时的B16-F10-RFP+细胞以每孔5,000个细胞、一式三份铺板在96孔平底板中，用于IncuCyte活细胞分析(Essen Bioscience)。以2:1的效应物与靶标比加入Pmel T细胞(o2R或o9R，用MSA-IL2或MSA-oIL2预处理48小时)，并使用IncuCyte活细胞成像系统每隔2小时采集每个孔的两张相衬和荧光图像，并按汇合百分比进行定量。还使用IncuCyte活细胞分析系统进行了人T细胞重复杀伤测定。将人黑素瘤细胞(nRFP-M407，5×105)铺板在六孔板的每个孔中。以1:1的效应物:靶标比一式两份加入未转导或共转导的人T细胞(与ho2R/NYESO1-TCR或ho9R/NYESO1-TCR共转导，并与MSA-hoIL2预温育48小时)。每隔72小时，将黑素瘤细胞(nRFP-M407，5×105)加入每个孔中；每次肿瘤再攻击前24小时补充正交细胞因子(MSA-hoIL2)。
体内肿瘤研究
对于体内B16-F10肿瘤生长实验，使用早期细胞系(少于10个传代)。在C57BL/6只小鼠右侧腹部皮下注射B16-F10细胞(5×105)。在有说明的情况下，小鼠在T细胞的过继转移前一天接受500cGy全身照射进行淋巴细胞清除。肿瘤接种约七天后，或当肿瘤可触及时，进行T细胞的过继转移。具体来说，将每只小鼠5×106个分选的T细胞重新悬浮在50μl的PBS中，并且然后经由眶后注射施用。在有说明的情况下，小鼠接受细胞因子治疗：与小鼠血清白蛋白(MSA)结合的鼠IL-2(MSA-IL2)或MSA正交IL-2(MSA-oIL2)(每天25,000单位，腹腔注射)，从过继转移当天开始连续5天。每周三次用卡尺监测肿瘤大小(长×宽)，并且体积按(长×宽2)/2)计算。在指定时间点从尾静脉采集外周血(10μL)，通过流式细胞术对过继转移的pmel T细胞进行定量。当肿瘤总体积超过2000mm3时，小鼠被安乐死。
合成PDA肿瘤模型之前已有描述(Watanabe等人，JCI Insight(2018)3(7):e99573)。简而言之，在第0天和第4天，用50μl PBS中的对照病毒Ad-Null(1e9 VP/注射)或Ad-oIL2(1e9 VP/注射)对已建立的皮下PDA7940b肿瘤进行瘤内处理。第1天经由尾静脉注射施用200μl PBS中的CAR T细胞(5e6个CAR阳性活细胞)。第1天通过腹腔注射(120mg/kg)进行环磷酰胺预处理。用数字卡尺测量肿瘤大小，并且体积计算如下：体积＝(长×宽2)/2。通过向对侧腹部皮下注射PDA7940b细胞再次攻击治愈的小鼠，并在24天后通过卡尺测量记录肿瘤大小。对年龄匹配的空白小鼠进行相同的注射，并用作肿瘤生长的对照。
通过流式细胞术和质谱仪进行免疫分型
为了对正交细胞因子受体转导的T细胞进行体外免疫分型，将分选的T细胞与等剂量的MSA-oIL2或MSA-IL2一起一式三份进行铺板。在48小时后，收集T细胞并进行表面染色。为了进行体内评估，在指定时间点经由尾静脉采样获得外周血。尸体解剖时，用70μm细胞过滤网压碎脾脏并用PBS洗涤，以收集脾脏细胞。在抗体染色前，用ACK裂解缓冲液处理脾细胞和外周血样品。
使用鼠肿瘤解离试剂盒(Miltenyi Biotec)和温和的MACS Octo解离器(MiltenyiBiotec)对B16肿瘤进行粉碎和解离。然后将细胞重新悬浮在PBS中，并通过70μm细胞过滤网过滤以获得单细胞悬浮液。
在4℃下在磷酸盐缓冲盐水(PBS)、5％胎牛血清和2mM EDTA中用抗体对细胞染色30分钟。在图20中列出了抗体。7-AAD活性染料用于区分活细胞和死细胞。使用LSRFortessa(BD Biosciences)通过流式细胞术分析细胞。使用FlowJo软件(10版，BD Biosciences)分析数据。
切除PDA7940b肿瘤，称重，用手术刀剁碎，并使用补充有1％青霉素/链霉素的RPMI1640中由透明质酸酶(2.5U/ml)、DNAse(50U/ml)、胶原I/II/IV型(分别为75U/ml、35U/ml、75U/ml)组成的酶混合物解离。根据生产商的说明(Miltenyi Biotec)，用CD45(TIL)MicroBeads从单细胞肿瘤悬液中分离出CD45阳性细胞，并储存在液氮中。使用CountBrightBeads(ThermoFisher)对肿瘤浸润的CAR T细胞进行定量，并归一化为肿瘤重量。
为了进行质谱分析，首先在室温下用1.6％ PFA固定细胞5分钟。用10mL MaxPar细胞染色缓冲液(Fluidigm)洗涤细胞，并且在4℃下以970xg旋转10分钟。接下来，在RT下将细胞重新悬浮在表面抗体混合物中，持续30分钟。用5mL PBS洗涤细胞，并且重新悬浮在1mL冰凉的甲醇中，在冰上15分钟。再次用MaxPar细胞染色缓冲液洗涤细胞，并在RT下用细胞内抗体混合物染色30分钟。最后，用10mL MaxPar细胞染色缓冲液洗涤细胞，并在含1.6％ PFA的Maxpar Fix and Perm缓冲液(Fluidigm cat#201067)中以1:6000稀释的插层溶液(Cell-IDTM Intercalator-Ir，cat#201192B)进行染色，在4℃下过夜。使用HeliosTM(San Francisco，CA)质谱仪采集数据。使用Omiq(San Francisco，CA)基于活的单个CD45+白细胞或CD8+T细胞门控的反双曲正弦(arcsinh)缩放数据进行分析。使用opt-SNE将细胞嵌入二维可视化中，并使用FlowSOM进行聚类，同时使用欧氏距离进行肘元聚类(elbowmetaclustering)。使用edgeR(p-值显著性阈值为0.05，并且对数(倍数变化)≥1)确定差异丰度簇。使用R软件包ggplot生成图表。
细胞内细胞因子染色
在最近一次肿瘤攻击72小时后，以及在培养基中补充正交细胞因子24小时后，从重复肿瘤攻击共培养物中收获人共转导的T细胞(ho2R/NYESO1-TCR或ho9R/NYESO1-TCR)。在布雷非德菌素A和莫能菌素存在下，将T细胞(1×105)与抗人CD3/CD28免疫磁珠(ThermoFisher)或黑素瘤细胞(nRFP-M407或M263)以1:1的效应物：靶标比在96孔板中培养。在4小时后，在RT下对细胞进行表面染色30分钟，在RT下固定和透化细胞，进行细胞内细胞因子染色30分钟。为了对来自PDA740b肿瘤的富集CD45+TIL进行细胞内细胞因子染色，用细胞活化混合物(含Brefeldin A)(Biolegend)刺激细胞6小时，在Cyto-FastTMFix/PermBuffer Set(Biolegend)中固定/透化，并用抗IFNγ抗体染色。洗涤细胞并使用LSRII(BDBiosciences)通过流式细胞术分析。使用FlowJo软件(10版，BD Biosciences)分析数据。
多重免疫组织化学
将福尔马林固定和石蜡包埋的肿瘤标本切成4μm厚的切片，在载玻片上进行染色。本研究采用基于金字塔信号放大(TSA)的Opal方法进行免疫荧光(IF)染色(OpalPolaris7-Color Automation IHC Kit；Akoya Biosciences，Marlborough，MA，USA；目录编号：NEL871001KT)。根据制造商的建议，Opal荧光团以1:150的稀释度使用。对每种生物标志物进行荧光单路检测(single-plex)，并与适当的显色单路检测进行比较，以评估染色性能。一旦每个靶标被单路检测染色优化，使用Opal 6多路测定对载玻片进行多路染色。将一抗以先前确定的对照组织的单路染色的优化浓度施加至小鼠脾脏标本作为对照。使用BONDRX系统(Leica Biosystems)进行染色。多路染色的抗体序列为Foxp3(opal 480)、CD4(opal520)、PD-1(opal 570)、CD8(opal 620)和CD3(opal 690)。使用Bond EpitopeRetrieval Solution2(Leica Biosystems)进行热诱导抗原回收20分钟后进行染色。在图20中列举了抗原，并以1:200稀释，温育1小时。所有荧光标记的载玻片都用DAPI反染色，并使用适当的曝光时间在Vectra Polaris(Akoya Biosciences)上以20倍放大率扫描。多光谱相机的数据由成像InForm软件(Akoya Biosciences)进行分析，并使用HALO图像分析软件(Indica Labs)进行定量。
组织病理学、临床化学和RNA ISH
通过CO2窒息法对动物实施安乐死。在死后立即通过心脏穿刺将血液(每组3每组)收集到Microvette管(Sarstedt)中，并在RT下凝结30分钟，然后以12,000g离心10分钟。血清在分析前储存在-80℃下。使用小鼠25路细胞因子检测板(IDEXX Bioanalytics)检测血清中的细胞因子水平。血清中Ca、P、K和尿酸的水平用定制的临床化学分析仪(IDEXXBioanalytics)测量。
对所有动物进行完整的尸体解剖和宏观尸检，并对以下器官/组织进行取样并固定在10％的中性缓冲福尔马林中进行组织病理学检查：头部和大脑、腰部脊髓、背区皮肤、耳廓、股四头肌、胸骨、唾液腺、喉和气管、食道、肺、心脏、胃肠道、肠系膜韧带、胰腺、肝和胆囊、生殖道、肾、膀胱、任何出现宏观病变(一种或多种)的器官/组织。固定前记录肝、右肾、左肾和心脏的重量。根据RITA指南(1、2、3)对福尔马林固定的组织样品进行修剪，并且然后进行石蜡包埋、切片和H&E染色的常规处理。所得切片由一名获得兽医病理学家资格认证、对实验设计保密的医生进行分析。
通过包括针对鼠逆转录病毒设计的定制探针的多路荧光RNA原位杂交(Multiplex Fluorescent Assay，ACD Bio)研究脑膜中间皮素表达和CAR T细胞浸润的分布，该逆转录病毒用于用CAR和ortho-受体转导T细胞。检测在福尔马林固定和石蜡包埋的脑切片上进行。使用Aperio VERSA200玻片扫描仪(Leica Biosystems)对所得荧光标记的切片进行全玻片成像。最后使用Aperio ImageScope软件(Leica Biosystems)中的对象计数工具对CAR T细胞和间皮素阳性细胞进行计数。
RNA测序和分析
在图7H-7J中描述的体外实验中，用5μM oIL-2或0.05μM oIL-2刺激o2R和o9Rpmel T细胞48小时。使用RNeasy mini试剂盒(Qiagen)提取RNA。根据制造商的建议，使用KAPA mRNA链文库制备试剂盒制备RNA测序(RNAseq)文库。将文库汇集并在IlluminaHiSeq3000平台上测序(50bp单端读数)。使用HISAT2(v2.0.4)将读数与小鼠参考基因组(mm9/GRCm38)对齐(Kim等人，Nature Biotechnology(2019)37:907-915)。使用HTSeq-counts(v0.6.1)定量基因表达(Anders等人，Bioinformatics(2015)31:166-169)。使用DESeq2进行差异表达分析(Love等人，Genome Biol(2014)15:550)，并且随后使用fgsea(Sergushichev等人，bioRxiv，060012(2016))和msigdbr(Liberzon等人，Cell Systems(2015)1:417-425)进行基因组富集分析。使用R软件包，特别是TFactS注释基因集(Essaghir等人，Nucleic Acids Res(2010)38:e120)，并使用ggplot2 R软件包进行可视化。将差异表达的基因过滤为调整后的p值小于0.01且log2(倍数变化)≥1的基因。使用pheatmap R软件包，使用归一化基因表达(使用DESeq2的rlog转换计算并按行缩放)对基因表达进行可视化。主成分分析和样品间热图分别使用R函数prcomp和dist生成。
在图13G中描述的体外实验中，用MSA-oIL2或MSA-IL2刺激CAR-o2R和CAR-o9R细胞48小时，并用RNeasy mini试剂盒(Qiagen)提取总RNA。使用nCounter小鼠ImmunologyPanel(Nanostring Technologies)分析RNA表达。如上所述进行分析。
图20提供了本文所述的实验中使用的试剂的表格。
现在描述实验结果。
实施例1：合成IL-9受体信号传导赋予T细胞干细胞记忆和效应抗肿瘤活性的组合
合成受体信号传导有可能赋予被过继转移的T细胞以新的功能，其克服实体瘤治疗中的主要障碍，包括对条件化疗的需求。在这里，设计了具有正交IL-2受体(o2R)胞外结构域与常见γ-链(γc)细胞因子IL-4、IL-7、IL-9和IL-21的受体的胞内结构域(ICD)融合的嵌合受体，使得正交IL-2细胞因子激发相应的γc细胞因子信号。其中，通过嵌合正交IL-2R-ECD/IL-9-ICD受体(o9R)发出信号的T细胞因同时激活STAT1、STAT3和STAT5并具有干细胞记忆(Tscm)和效应T细胞的特征而不同。o9R T细胞在黑素瘤和胰腺癌这两种顽固的同基因小鼠实体瘤模型中具有优异的抗肿瘤疗效，并且即使在没有条件性淋巴细胞清除的情况下也有效。因此，通过使用嵌合的正交细胞因子受体重新利用IL-9R信号传导，T细胞获得了新的功能，导致提高了对难以治疗的实体瘤的抗肿瘤活性。
过继转移基因工程化的T细胞疗法已经在患有造血恶性肿瘤的患者中表明明显的抗肿瘤活性，但是在患有实体瘤的患者中具有有限的益处(Rosenberg和Restifo，Science(2015)348:62-68)。一种主要限制是过继转移T细胞的差的体内扩增和持久性，需要淋巴细胞清除条件化疗(一种限制患者适合性的有毒方案)(Goff等，J Clin Oncol.(2016)34:2389-2397；Dudley等，J Clin Oncol.(2008)26:5233-5239；Dutcher等，Journal forImmunoTherapy of Cancer(2014)2:26)。即使的确扩增并且持续的那些T细胞最终分化并且功能异常(Philip等，Nature(2017)545:452-456；Schietinger等，Immunity(2016)45:389-401)。合成细胞因子受体信号传导可用干样表型将T细胞重新编程，使得能够克服这些限制并且在小鼠模型和人中展示更优异的抗肿瘤活性(Gattinoni等，Nature ReviewsCancer(2012)12:671-684；Krishna等，Science(2020)370:1328-1334)。之前，选择或扩增干样T细胞的治疗性操作限于细胞制造阶段并且不可在体内制造。
正交细胞因子受体为选择性结合天然细胞因子的突变体形式的天然细胞因子受体的突变体形式。该正交细胞因子-受体对与天然细胞因子-受体对互相排斥。因此，当转导至T细胞中并且然后通过它们对应的正交细胞因子刺激时，正交细胞因子受体提供选择性和生物学操纵过继转移细胞体内的方式。最近通过使用正交小鼠IL-2细胞因子-受体对(oIL2和o2R)(Sockolosky等，Science(2018)359:1037-1042)用于体内调节过继转移T细胞来进行癌症免疫疗法证实了这一点，因为IL-2R信号传导有力地刺激T细胞存活、扩增和增强的抗肿瘤功能。
正交小鼠IL-2受体(o2R)由具有修饰的胞外结构域的IL-2Rβ链组成，该修饰的胞外结构域选择性结合oIL-2(克隆3A10)，但是不结合野生型IL-2(图1A)。类似地，oIL-2不能结合野生型IL-2受体。为了发信号，正交和野生型IL-2受体二者都与野生型γc配合。采用oIL-2系统的模块化特性，我们希望探索γc细胞因子受体家族的其他成员的潜在功能和治疗性效用，其中一些成员赋予抗肿瘤T细胞的有利特征(Dwyer等，Frontiers inImmunology(2019)10:263；Leonard等，Immunity(2019)50:832-850)。
为此，用γc细胞因子IL-4、IL-7、IL-9和IL-21的受体的ICD替换o2R的胞内结构域(ICD)，以产生含有小鼠oIL-2结合胞外结构域(ECD)(与每个γc细胞因子家族受体(ICD)融合的胞内结构域)的嵌合正交受体(图1A，SEQ ID:15、19、20、21)。重要地，逆转录病毒转导以表达嵌合正交受体(YFP+)的活化的原代T细胞保留了野生型IL-2-诱导的STAT5磷酸化(图1B，左图)。
用小鼠血清白蛋白结合的oIL-2(MSA-oIL2，克隆3A10)刺激嵌合正交受体产生磷酸化STAT信号传导模式(图1B)，与通过每个各自γc细胞因子的已知的野生型信号传导一致(Leonard，等，Immunity，2019，50:832-850；Demoulin，等，Mol Cell Biol.，1996，16:4710-4716)。通过o9R的信号传导生成了STAT1、STAT3和STAT5有效的磷酸化，这是与o2R、o4R、o7R和o21R的信号传导不同的特征(图1B，图2)，并且与通过野生型IL-9受体(CD129)已知的信号传导一致(Demoulin，等，J Biol.Chem.，1999，274:25855-25861)。o9R信号传导是剂量依赖性的并且对MSA-oIL2是特异性的(图1C)。
IL-9受体，IL9R(也称为CD129)，是γc细胞因子受体家族的较少研究的成员，其由肥大细胞、记忆B细胞、先天淋巴细胞和造血祖先天然表达(Demoulin，等，Mol Cell Biol.，1996，16:4710-4716；Knoops等，Growth Factors(2004)22:207-215；Bauer，等，J BiolChem.，(1998)273：9255-9260；Takatsuka等，Nature Immunology(2018)19:1025-1034；Townsend等，Immunity(2000)13:573-583；Williams等，Blood(1990)76:906-911；Turner等，J Exp Med(2013)210:2951-2965)。尽管已经描述了产生IL-9的T细胞子集(Lu等，JClin Invest(2012)122:4160-4171；Lu等，Proc Natl Acad Sci USA(2014)111:2265；Purwar等，Nat Med(2012)18:1248-1253；Liu等，Nat Commun。(2020)11:5902；Schanz，等，JImmunother Cancer(2021)9)，但是IL-9R信号传导对T细胞的效果未充分表征(Elyaman等，Proc Natl Acad Sci USA(2009)106:12885-12890；Nowak等，J Exp Med(2009)206:1653-1660；Li等，Eur J Immunol(2011)41:2197-2206；Houssiau等，J Immunol(1993)150:2634-2640；Louahed等，J Immunol(1995)154:5061-5070；Lehrnbecher等，Cytokine(1994)6:279-284)。例如，已经证实了原始T细胞对于IL-9不敏感并且IL-9缺陷小鼠中的T细胞发育不受影响，这提示IL-9在T细胞生物学中不是关键的天然细胞因子(Townsend等，Immunity(2000)13:573-583；Houssiau等，J Immunol(1993)150:2634-2640；de Heusch，等，Eur JImmunol(2020)50:1034-1043)。
在本研究中，由于缺少IL-9R表达(图3A-图3B)，活化的小鼠T细胞不支持IL-9信号传导(图1C)，强调了o9R信号传导在这些细胞中的非正常性(Nowak等，J Exp Med(2009)206:1653-1660；Druez等，J Immunol(1990)145:2494-2499；Cosmi等，Blood(2004)103:3117-3121)。为了测试o9R信号传导是否真实模拟野生型IL-9R信号传导，将野生型IL-9R在来自C57BL/6和转基因pmel小鼠二者的小鼠T细胞中过度表达(图3A-图3B)。野生型IL-9R通过IL-9的活化产生响应o9R信号传导观察到的类似的STAT1、STAT3和STAT5磷酸化特征(图3C-图3D)。
因为o9R细胞也表达内源野生型IL-2Rβ，所以我们评估了天然和正交信号传导之间的竞争。共同暴露于饱和剂量的MSA-oIL2不影响o9R T细胞中通过MSA-IL2的峰pSTAT5磷酸化(图4A)。然而，增加剂量的MSA-IL2部分缓解了o9R T细胞中pSTAT1和pSTAT3的MSA-oIL2诱导(图4B-图4C)。再次，即使在饱和剂量的MSA-IL2下，o9R T细胞的独特的信号传导程序保持活跃。
接下来，检查了通过不同正交受体的信号传导对T细胞的记忆表型的效果。观察到通过o9R(以及o21R)的T细胞信号传导富集了CD62L+群体和高表达的Fas和Sca-1，与TSCM表型(已知其在过继细胞疗法(ACT)的模型和患有癌症的患者中更优异的抗肿瘤活性)一致(图1D-图1F)(Krishna等人，Science(2020)370，1328-1334；Gattinoni等人，J ClinInvest(2005)115:1616-1626；Hinrichs等人，Proc Natl Acad Sci USA(2009)106:17469-17474；Klebanoff等人，Proc Natl Acad Sci USA(2005)102:9571-9576).)。o9R T细胞也较少增生，并且经历比表达o2R的T细胞较少的细胞分裂，即使在对于STAT5磷酸化饱和浓度的MSA-oIL2下(图1G和图5A-图5B)。受限的增殖是正交受体特异性的，因为o9R和o2R T细胞对于野生型IL-2同样应答。在正交受体中，仅仅o21R(其也通过STAT3发信号)产生比o9R更少的增殖(图5A)。
考虑到独特的STAT信号传导特征、γc细胞因子受体家族中其较少已知的状态、以及TSCM特征的采集，使用用于实体瘤的ACT的小鼠模型，研究o9R信号传导在体内的影响。首先，使用采用来自转基因pmel小鼠的T细胞的ACT模型，其表达对于gp100(B16黑素瘤中过度表达的黑素细胞抗原)特异性的内源TCR(Overwijk等人，J Exp Med(2003)198:569-580)。考虑到o2R在该模型中的益处和疗效(Sockolosky等人，Science(2018)359:1037-1042)，该方案修改为更严格的并且省略了淋巴细胞清除放疗，通过经γc细胞因子信号传导而诱导过继转移T细胞的稳态增殖的增强ACT的调整方案(Surh等，Immunity(2008)29:848-862)。用具有o2R或o9R的逆转录病毒转导的pmel T细胞静脉内处理B16荷瘤C57BL/6小鼠，并且用MSA-IL2或MSA-oIL2处理(图7A)。与来自C57BL/6小鼠的o2R和o9R T细胞的特征类似，MSA-oIL2活化o9R pmel T细胞中STAT1、STAT3和STAT5的磷酸化，但是仅仅活化o2R pmel T细胞中的STAT5的磷酸化(图6A)。o9R pmel T细胞也增生小于o2R pmel T细胞(图6B)。
在没有淋巴细胞清除的情况下，与用MSA-IL2处理的小鼠相比，在用oIL-2处理的小鼠中ACT后7天在外周血中观察到更大频率的o2R和o9R pmel T细胞(图7B)。尽管o2R和o9R pmel T细胞二者在没有淋巴细胞清除的情况下扩增，但是在用MSA-oIL2处理的o9Rpmel T细胞的该模型中观察到更一致的抗肿瘤疗效和延长的存活(图7C、图7D、图8A、图8B)，在淋巴细胞清除小鼠中实现了与pmel T细胞相当的抗肿瘤疗效。尽管其更弱的增生性信号，但是用MSA-oIL2处理的在淋巴细胞清除小鼠中也观察到了o9R pmel T细胞更优异的抗肿瘤疗效(图8C)。
这些结果表明，选择性扩增之外的因素是o9R pmel T细胞增强的抗肿瘤疗效的基础。在用MSA-oIL2处理的小鼠中，在ACT后5天，观察到与o2R pmel T细胞相比，通过o9RpmelT细胞而更大的肿瘤浸润(图7E)。使用CyTOF，用o2R和o9R pmel T细胞和MSA-oIL2，在ACT后7天，鉴定了18个肿瘤浸润CD45+白细胞群聚簇。这些当中，基于差异丰度分析的主区分特征是对应于在o9R处理的小鼠中高度富集的pmel T细胞的聚簇的存在(8.9％对1.6％的肿瘤浸润CD45+细胞；图9A)。肿瘤浸润pmel T细胞当中，o9R pmel T细胞富集与T细胞活化相关的聚簇，包括共同表达CD39、PD-1和TBET的聚簇，而o2R pmel T细胞富集表达CD73并且缺少PD-1和CD39表达的聚簇(图9B)。
经多通道免疫组织化学，通过CD3+CD8+和CD8+PD1+T细胞的浸润证实了o9R pmelT细胞的优异的肿瘤浸润(图9C)。除了改善的肿瘤浸润，与其o2R等同物相比，o9R pmel T细胞表现出更优异的溶细胞能力(图7F)和体外响应肿瘤细胞更高的IFNγ产生(图9D)。
接下来，研究了负责改善o9R pmel T细胞的浸润、效应功能和体内疗效的生物程序。通过高维质谱流式细胞仪，体外暴露(48h)于MSA-oIL2产生明显不同的表型；o2R和o9Rpmel T细胞之间，14个聚簇中的八个的丰度不同(图7G)。与使用来自C57BL/6小鼠的T细胞的图1D、图1E和图1F的数据一致，o9R pmel T细胞获取了干细胞记忆(TSCM)表型(Sca-1，CD127，Fas和CD62L)的标记(图7G、图10)，而o2R pmel T细胞获取了末端分化效应子的标记(CD44、EOMES和Tbet)(图7G)。o9R信号传导的这些效果与野生型IL-9R信号传导的效果一致，因为在用野生型IL-9R转导并且暴露于野生型IL-9的pmel T细胞中也观察到了TSCM表型(图10)。
与o2R pmel T细胞相比，暴露于MSA-oIL2的大量o9R pmel T细胞经历明显的全局双向转录组改变，如通过体外暴露于MSA-oIL2或MSA-IL2，48小时分选的pmel T细胞的RNA-seq鉴定的(图7H，图11)。通过o9R信号传导诱导的这些改变进一步支持了TSCM表型的获得，如通过富集包括Tcf7、Ccr7、Cd127、Sell和Bach2的基因所阐释的(图7I)。然而，也观察了通常从TSCM表型排除的，经典地与效应功能(Ifng，Gzma，Prf1)和T细胞活化(Pdcd1，Icos，Entpd1，Lag3，Havcr2)相关的基因的同时富集(图7I)。该可表示新的杂合表型或同时存在T细胞中o9R信号传导特有的异质亚群。已经报道了通过IL-9R活化诱导的粒酶A依赖于STAT1和STAT3的伴随活化，这是与o2R、o4R、o7R和o21R信号传导不同的o9R信号传导的特点(Demoulin等人，J Biol.Chem.，1999，274:25855-25861)。
转录因子途径富集的转录组学分析揭示了除了预期的转录因子STAT1和STAT3之外，与AP-1转录因子JUN相关的基因的明显(p<0.05)富集(图7J)。这伴随着Jun与Fos表达的比例的增加，抵抗肿瘤诱导衰竭的肿瘤特异性T细胞的特征(Lynn等人，Nature(2019)576:293-300)。同时，o9R信号传导下调了与T细胞衰竭或功能障碍相关的基因，包括Nr4a1和Tox，这二者都介导抗肿瘤T细胞的功能障碍(图7I)(Chen等人，Nature(2019)567:530-534；Seo等人，Proc Natl Acad Sci USA(2019)116:12410-12415；Khan等，Nature(2019)571:211-218；Scott等人，Nature(2019)571:270-274)。
为了检查o9R信号传导程序的体内活性，检查了在过继转移T细胞上表达的CD62L。ACT后一天和五天，用MSA-oIL2处理的荷瘤小鼠的引流淋巴结和脾中，相对于o2R pmel T细胞，过继转移o9R pmel T细胞的CD62L表达更高(图12)。在肿瘤中没有观察到CD62L表达的差异，其中抗原特异性T细胞活化可能占主导。
为了进一步研究基于CAR的ACT的背景下的o9R信号传导，使用了一种表达间皮素的免疫治疗抗性胰腺癌模型。选择载体递送作为体内CAR T细胞研究的oIL-2来源(图13A)，以确保肿瘤中oIL-2(克隆3A10)的高浓度，并评估o9R信号传导对肿瘤微环境中T细胞功能障碍的影响。该模型提供了与在外周组织中观察到o9R信号传导程序影响最多的pmel研究的对比。体外在PDA7940b细胞中和在体内通过瘤内注射(图13A，右下图)评估了由腺病毒载体(Ad-oIL2)产生的oIL-2(图13A，左下图)，确认了肿瘤限制性oIL-2表达，其中在外周血中未检测到细胞因子。
用编码第二代抗小鼠间皮素CAR与正交受体的逆转录病毒一起转导小鼠原代T细胞，以生成CAR-o2R和CAR-o9R T细胞(图14A-图14B)。用MSA-oIL2刺激CAR-o9R T细胞会导致STAT1、STAT3和较低程度的STAT5的磷酸化。这与用MSA-oIL2处理CAR-o2R T细胞的STAT5磷酸化情况不同(图13B)。与CAR-o2R细胞不同，CAR-o9R细胞对oIL-2没有扩增反应(图15A)。
尽管CAR-o2R细胞具有增殖优势，但是CAR-o9R细胞在体外清除源自KPC(LSL-KrasG12D/+；LSL-Trp53R172H/+；Pdx-1-Cre)小鼠自发产生的肿瘤的间皮素阳性胰腺导管腺癌(PDA)细胞系PDA7940b时表现出优异的抗肿瘤功效(图13C)。
与pmel模型类似，在用mIL-2刺激的细胞中观察到CAR-o9R细胞保留了TSCM表型(CD44loCD62LhiFas+)，而CAR-o2R细胞则转向了中枢记忆/效应表型(CD44hiCD62LhiFas-)(图13D-图13E和图15B)。虽然表型显示为TSCM，但是与CAR-o2R细胞对oIL-2的反应相比，CAR-o9R T细胞分泌更高水平的IFNγ、TNFα、IL-2、IL-9、IL-10、IL-18、IL-22和IL-23(图13F)。这种多样化的细胞因子谱反映了o9R pmel T细胞复杂的转录组特征，这一点已使用nCounter小鼠免疫学图在CAR-o9R T细胞中进行了验证(图13G)。与效应功能(Ifng、Prf1、Gzmb、Gzma)和T细胞活化(Pdcd1、Icos、Entpd1)相关的基因在CAR-o9R细胞中上调，同时向T细胞干性转变(Il7r、Sell和Bcl6上调，并且Eomes、Tox1下调)。
用于评估CAR-o2R和CAR-o9R细胞抗肿瘤特性的同基因体内模型，利用了两种在CD45等位基因(CD45.1与CD45.2)上不同的免疫能力小鼠品系，以实现区分被过继转移的(供体)T细胞和内源性(宿主)T细胞(图13H)。在该模型中，用Ad-oIL2或CAR-o2R/CAR-o9R治疗已建立皮下PD7940b肿瘤的小鼠对控制快速生长的肿瘤无效(图13I)。与模拟治疗(注射PBS)相比，显示实验性单一疗法没有任何改善，这突显了肿瘤模型的顽固性。
Ad-oIL2加CAR-o2R或Ad-oIL2加CAR-o9R的联合疗法仍然产生了强有力的抗肿瘤反应，分别清除了12只动物中的8只(67％ CR)和12只动物中的6只(50％ CR)的肿瘤(图13J)。在Ad-oIL2加CAR-o9R组中观察到了早期毒性，40％的小鼠(12只中的5只)在第10天前死亡，但是值得注意的是，与Ad-oIL2加CAR-o2R组12只小鼠中有4只复发相比，Ad-oIL2加CAR-o9R组中的存活动物中肿瘤复发较少(7只中的1只)。
Ad-oIL2加CAR-o9R对淋巴细胞清除的小鼠的毒性的特征在于免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)的临床症状(震颤、谵妄、癫痫发作)。对患有ICANS的小鼠进行的RNA原位杂交(RNA ISH)分析显示，CAR T细胞浸润了大脑的脑膜层，在脑膜层还检测到了表达间皮素的脑膜细胞(图16A-图16B)。与Ad-oIL2加CAR-o2R相比，Ad-oIL2加CAR-o9R组观察到显著更多的脑膜浸润CAR T细胞，这表明CAR驱动的脱靶活性与观察到的ICANS之间存在关联(图16C)。血清分析未显示细胞因子释放综合征(CRS)或溶瘤综合征(TLS)的证据(图16D-图16E)。基于这些发现以及pmel模型中类似毒性的缺失，观察到的ICANS似乎是CAR特异性所特有的，而不是o9R工程化的T细胞所固有的。仍然，将o9R信号传导转化为CAR T细胞必须考虑可能增加的脱靶毒性，并且可能需要另外的工程化策略(例如，开/关系统、合成线路)以最大化患者安全性。
在没有环磷酰胺预处理的情况下，Ad-oIL2(3A10)加CAR-o9R比Ad-oIL2(3A10)加CAR-o2R的优势更明显，如通过完全应答率分别为42％(12例中有5例)和8.3％(12例中有1例)(图13K)以及延长的存活率(图17A)所表明的，因为在没有预处理的情况下Ad-oIL2加CAR-o9R中12只小鼠中只有1只表现出毒性。疗效取决于T细胞上的正交受体表达和经由Ad-oIL2的oIL-2表达，因为不含o2R的CAR T细胞与Ad-oIL2结合使用没有抗肿瘤疗效(图17B)，并且对照病毒Ad-Null无法增强CAR-o2R疗法(图17C)。当用PDA7940b再次攻击时，与空白动物相比，先前用联合疗法治愈的动物的肿瘤生长得到了显著控制(图13L)。通过CRISPR/Cas9技术生成间皮素基因敲除肿瘤细胞(PDA7940bMSLN-)(图21)，并随后植入先前治愈的小鼠(图22)。在第24天，与空白小鼠相比，治愈的小鼠中的这些肿瘤更小，这表明诱导了肿瘤抗原(＝表位)的扩散。在再次攻击之后24天且初次输液94天，在动物外周血中检测到CD45.1+供体T细胞，这表明体内oIL-2刺激可使CAR-o2R/CAR-o9R T细胞在具有免疫能力的的小鼠体内长期存在。
接下来，研究了Ad-oIL2对肿瘤浸润的CAR-o9R或CAR-o2R T细胞的瘤内数量和质量的影响。与pmel模型相比，在ACT之后8天在肿瘤内观察到的CAR-o9R T细胞少于CAR-o2RT细胞(图13M)。鉴于在Ad-oIL2模型中，o9R信号传导程序在外周并不活跃，形成鲜明对比的肿瘤浸润结果也就不出人意料了。在肿瘤浸润的CAR T细胞中，CAR-o9R细胞表达IFNγ的频率更高(图13M)表明在该模型中优异的瘤内功能，而不是肿瘤浸润，驱动了CAR-o9R T细胞的抗肿瘤疗效。
为了评估o9R信号传导的转化潜力，生成了人正交IL-2Rβ(ho2R)和人正交嵌合IL-2Rβ/IL-9R(ho9R)(SEQ ID NO:4和6)。用编码ho2R或ho9R(每种都含有YFP)的载体以及在HLA*0201背景下编码对NY-ESO-1具有特异性的T细胞受体(NYESO1-TCR克隆1G4)的载体逆转录转导人T细胞(Robbins等人，J Immunol，2008，180:6116-6131)。NY-ESO-1是一种在滑膜肉瘤、粘液样脂肪肉瘤、黑素瘤和其他肿瘤中过度表达的癌睾丸抗原。基于NYESO1-TCR和YFP(图19A)的表达分选的转导T细胞暴露于MSA结合的人正交IL-2(MSA-hoIL2)或野生型IL-2(MSA-hIL2)。与在小鼠系统中观察到的结果一致，通过ho9R的人T细胞信号传导激活pSTAT1、pSTAT3和pSTAT5信号传导，而通过ho2R的人T细胞信号传导主要激活pSTAT5信号传导(图18A)。表达ho2R或ho9R的人T细胞在暴露于MSA-hIL2后同样会磷酸化STAT5(图18A，最右图)，这表明通过内源性γc的原生IL-2-STAT5信号传导不会受到正交受体表达的不同影响。
与小鼠系统类似，ho9R信号传导产生的增殖信号也弱于ho2R或野生型IL-2信号传导(图18B)。与ho2R/NYESO1-TCR T细胞相比，ho9R/NYESO1-TCR T细胞在用MSA-hoIL2培养2天和6天后富集了TSCM细胞群(CD45RA+CD27+CCR7+CD95+)(图19B-图19C，和图18C)。并且尽管ho9R/NYESO1-TCR T细胞在培养2到6天期间增殖减少，但是仍然观察到TSCM和中枢记忆(TCM，CD45RA-CD27+CCR7+CD95+)细胞绝对数量的扩增(而不仅仅是富集)。
在有MSA-hoIL2存在的情况下，ho9R/NYESO1-TCR和ho2R/NYESO1-TCR T细胞之间的T细胞表型的差异甚至在用HLA*0201+NY-ESO-1+人黑素瘤肿瘤细胞系nRFP-M407进行四次抗原特异性攻击后仍然存在(图18E-图18F)。与ho2R/NYESO1 T细胞相比，ho9R/NYESO1 T细胞保留了更高频率的CD45RA+CD27+和TSCM细胞，并表达更高水平的CD62L和CXCR3(图18D)。重复刺激的ho9R/NYESO1 T细胞表达更多的IFNγ、TNFα和IL-2，并且在暴露于活化的CD3/CD28珠或同源黑素瘤细胞系(nRFP-M407)时表现出更强的多功能性(图18G和图19D)。这些发现是抗原特异性的，因为在对非同源黑素瘤细胞系M263(HLA*0201-NY-ESO-1-)的反应中没有观察到这些发现。
此外，人orthoIL-2被克隆到Ad5/3-D24溶瘤腺病毒载体中，并在体外过度表达。用Ad5/3-D24-hoIL2或同基因对照病毒Ad5/3-D24感染A549细胞，或模拟感染。在感染后96小时，收集50μl细胞培养上清液，并通过人IL-2ELISA进行分析(图23A)。接着，经由CsCl2梯度纯化编码人orthoIL-2的纤维嵌合溶瘤腺病毒Ad5/3-D24-hoIL2(图23B)。在感染后48小时，从11个汇合的T150细胞培养瓶中刮取(scrap)感染病毒的A549细胞，然后进行3次冷冻/解冻循环以释放病毒颗粒。上清液在氯化铯(CsCl)梯度上进行两轮超速离心。红色箭头表示含有完整病毒颗粒的条带，通过刺穿试管侧面用针头和注射器收集病毒颗粒。在15ml超滤装置中通过两轮缓冲液交换去除CsCl。
接下来，显示人正交IL-2Rβ(ho2R)和人正交嵌合IL-2Rβ/IL-9R(ho9R)与PSMA重定向CAR在人T细胞中共同表达。将1e5原代人T细胞(CD4/CD8比例为1:1)用编码PSMA28zCAR和人正交受体(全长orthoIL2Rb受体(图24A)或嵌合orthoIL2Rb/IL9Ra转换受体(图24B))的慢病毒载体的增加的稀释液感染。在感染后48小时，通过流式细胞术对共同表达进行评估。
总之，正交IL-2细胞因子-受体平台可通过用其他γc细胞因子的受体的ICD模块化替换正交IL-2RβICD来重新定向信号传导。在这里，令人意想不到的是，通过正交IL-2配体3A10对基于TCR和CAR的肿瘤特异性T细胞中o9R信号传导的特异性体内刺激提高了两种免疫疗法难治性实体瘤模型的抗肿瘤活性，并在更严格的环境中保留了强有力的活性而无需淋巴细胞清除。这种益处是利用γc通过IL-9RαICD重新传递IL-2信号传导信息来调节的，导致同时激活STAT1、STAT3和STAT5。IL-9Rα在T细胞中传递的信号传导信息产生了一种独特的表型，它融合了干细胞记忆和效应T细胞的有益功能特性，以提供改善的体内抗肿瘤活性。
列举的实施方式
提供了以下列举的实施方式，其编号不应理解为指定重要程度。
实施方式1提供了一种用于选择性激活细胞中的受体的系统，所述系统包括：(a)经修饰的免疫细胞，其包括：(i)正交嵌合细胞因子受体，和(ii)至少一种嵌合抗原受体(CAR)，和(b)包括编码正交IL2细胞因子的核酸序列的溶瘤腺病毒载体，其中所述正交嵌合细胞因子受体包括正交IL2受体(oIL2R)的胞外结构域和非IL2R的细胞因子受体的胞内信号传导结构域。
实施方式2提供了实施方式1所述的系统，其中oIL2R的胞外结构域是正交IL2受体β(oIL2Rb)的胞外结构域。
实施方式3提供了实施方式1或2所述的系统，其中所述正交嵌合细胞因子受体的胞内信号传导结构域包括IL9R胞内信号传导结构域。
实施方式4提供了实施方式1-3中任一项所述的系统，其中所述IL9R胞内信号传导结构域是IL9R-α(IL9Ra)胞内信号传导结构域。
实施方式5提供了前述实施方式中任一项所述的系统，其中所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域。
实施方式6提供了前述实施方式中任一项所述的系统，其中所述抗原结合结构域选自全长抗体或其抗原结合片段、Fab、单链可变片段(scFv)或单域抗体。
实施方式7提供了前述实施方式中任一项所述的系统，其中所述抗原结合结构域靶向肿瘤抗原。
实施方式8提供了前述实施方式中任一项所述的系统，其中所述肿瘤抗原选自CD19、CD20、HER2、NY-ES0-1、MUC1、CD123、FLT3、B7-H3、CD33、IL1RAP、CLL1(CLEC12A)PSA、CEA、VEGF、VEGF-R2、CD22、ROR1、间皮素、c-Met、糖脂F77、FAP、EGFRvIII、MAGE A3、5T4、WT1、KG2D配体、叶酸受体(FRa)和Wnt1抗原。
实施方式9提供了前述实施方式中任一项所述的系统，其中所述抗原结合结构域是scFv。
实施方式10提供了前述实施方式中任一项所述的系统，其中所述抗原结合结构域是抗间皮素scFv。
实施方式11提供了前述实施方式中任一项所述的系统，其中所述CAR的胞内结构域包括选自TNFR超家族中蛋白质、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C和B7-H3(CD276)中的蛋白质或其变体的共刺激结构域，或源自杀伤性免疫球蛋白样受体(KIR)的胞内结构域。
实施方式12提供了前述实施方式中任一项所述的系统，其中所述CAR的胞内结构域包括选自人CD3ζ链(CD3ζ)、FcγRIII、FcsRI、Fc受体的细胞质尾部、带有细胞质受体的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)、TCRζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的蛋白质或其变体的胞内信号传导结构域。
实施方式13提供了前述实施方式中任一项所述的系统，其中：(a)所述正交嵌合细胞因子受体包括oIL2Rb的胞外结构域和IL9Ra的胞内信号传导结构域，和(b)所述CAR包括抗间皮素抗原结合结构域。
实施方式14提供了一种治疗受试者中的癌症的方法，其包括：(a)向所述受试者施用有效量的经修饰的免疫细胞或其前体(经修饰的免疫细胞群)，其包括：(i)正交嵌合细胞因子受体，和(ii)至少一种CAR，和(b)向所述受试者施用包括编码正交IL2细胞因子的核酸序列的溶瘤腺病毒载体；其中所述正交嵌合细胞因子受体包括正交IL2受体(oIL2R)的胞外结构域和非IL2R的细胞因子受体的胞内信号传导结构域。
实施方式15提供了实施方式14所述的方法，其中oIL2R的胞外结构域是正交IL2受体β(oIL2Rb)的胞外结构域。
实施方式16提供了实施方式14或15所述的方法，其中所述正交嵌合细胞因子受体的胞内信号传导结构域包括IL9R胞内信号传导结构域。
实施方式17提供了前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述IL9R胞内信号传导结构域是IL9R-α(IL9Ra)胞内信号传导结构域。
实施方式18提供了前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域。
实施方式19提供了前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域选自全长抗体或其抗原结合片段、Fab、单链可变片段(scFv)或单域抗体。
实施方式20提供了前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域靶向肿瘤抗原。
实施方式21提供了前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述肿瘤抗原选自CD19、CD20、HER2、NY-ES0-1、MUC1、CD123、FLT3、B7-H3、CD33、IL1RAP、CLL1(CLEC12A)PSA、CEA、VEGF、VEGF-R2、CD22、ROR1、间皮素、c-Met、糖脂F77、FAP、EGFRvIII、MAGE A3、5T4、WT1、KG2D配体、叶酸受体(FRa)和Wnt1抗原。
实施方式22提供了前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域是scFv。
实施方式23提供了前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域是抗间皮素scFv。
实施方式24提供了前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述CAR的胞内结构域包括选自TNFR超家族中蛋白质、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C和B7-H3(CD276)中的蛋白质或其变体的共刺激结构域，或源自杀伤性免疫球蛋白样受体(KIR)的胞内结构域。
实施方式25提供了前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述CAR的胞内结构域包括选自人CD3ζ链(CD3ζ)、FcγRIII、FcsRI、Fc受体的细胞质尾部、带有细胞质受体的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)、TCRζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的蛋白质或其变体的胞内信号传导结构域。
实施方式26提供了前述实施方式中任一项所述的方法，其中：(a)所述正交嵌合细胞因子受体包括oIL2Rb的胞外结构域和IL9Ra的胞内信号传导结构域，和(b)所述CAR包括抗间皮素抗原结合结构域。
实施方式27提供了前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞群呈现干细胞记忆(Tscm)特征以及改善的运输和效应功能，从而治疗癌症。
实施方式28提供了前述实施方式中任一项所述的方法，其中施用所述载体包括瘤内注射。
实施方式29提供了前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述癌症选自胰腺癌和黑素瘤。
实施方式30提供了实施方式29所述的方法，其中所述胰腺癌是胰腺导管腺癌。
实施方式31提供了一种用于选择性激活细胞中的受体的系统，所述系统包括：(a)经修饰的免疫细胞，所述细胞经工程化以表达：(i)正交嵌合细胞因子受体，和(ii)至少一种T细胞受体(TCR)，和(b)包括编码正交IL2细胞因子的核酸序列的溶瘤腺病毒载体，其中所述正交嵌合细胞因子受体包括正交IL2受体(oIL2R)的胞外结构域和非IL2R的细胞因子受体的胞内信号传导结构域。
实施方式32提供了实施方式31所述的系统，其中oIL2R的胞外结构域是正交IL2受体β(oIL2Rb)的胞外结构域。
实施方式33提供了实施方式31或32所述的系统实施方式，其中所述正交嵌合细胞因子受体的胞内信号传导结构域包括IL9R胞内信号传导结构域。
实施方式34提供了实施方式31-33中任一项所述的系统，其中所述IL9R胞内信号传导结构域是IL9R-α(IL9Ra)胞内信号传导结构域。
实施方式35提供了实施方式31-34中任一项所述的系统，其中所述TCR靶向肿瘤抗原。
实施方式36提供了实施方式31-35中任一项所述的系统，其中所述TCR靶向gp100黑素瘤抗原或NYESO1。
实施方式37提供了实施方式31-36中任一项所述的系统，其中所述TCR是pmel-1TCR或NYESO1特异性TCR。
实施方式38提供了实施方式31-37中任一项所述的系统，其中：(a)所述正交嵌合细胞因子受体包括oIL2Rb的胞外结构域和IL9Ra的胞内信号传导结构域，和(b)所述TCR是pmel-1TCR或NYESO1特异性TCR。
实施方式39提供了一种治疗受试者中的癌症的方法，其包括：(a)向所述受试者施用有效量的经修饰的免疫细胞或其前体(经修饰的免疫细胞群)，所述修饰的免疫细胞或其前体经修饰以表达(i)正交嵌合细胞因子受体，和(ii)至少一种T细胞受体(TCR)，和(b)向所述受试者施用包括编码正交IL2细胞因子的核酸序列的溶瘤腺病毒载体；其中所述正交嵌合细胞因子受体包括正交IL2受体(oIL2R)的胞外结构域和非IL2R的细胞因子受体的胞内信号传导结构域。
实施方式40提供了实施方式39所述的方法，其中oIL2R的胞外结构域是正交IL2受体β(oIL2Rb)的胞外结构域。
实施方式41提供了实施方式39或40所述的方法，其中所述正交嵌合细胞因子受体的胞内信号传导结构域包括IL9R胞内信号传导结构域。
实施方式42提供了实施方式39-41中任一项所述的方法，其中所述IL9R胞内信号传导结构域是IL9R-α(IL9Ra)胞内信号传导结构域。
实施方式43提供了实施方式39-42中任一项所述的方法，其中所述TCR靶向肿瘤抗原。
实施方式44提供了实施方式39-43中任一项所述的方法，其中所述TCR靶向gp100黑素瘤抗原或NYESO1。
实施方式45提供了实施方式39-44中任一项所述的方法，其中所述TCR是pmel-1TCR或NYESO1特异性TCR。
实施方式46提供了实施方式39-45中任一项所述的方法，其中：(a)所述正交嵌合细胞因子受体包括oIL2Rb的胞外结构域和IL9Ra的胞内信号传导结构域，和(b)所述TCR是pmel-1TCR或NYESO1特异性TCR。
实施方式47提供了实施方式39-46中任一项所述的方法，其中经修饰的免疫细胞群呈现干细胞记忆(Tscm)特征以及改善的运输和效应功能，从而治疗癌症。
实施方式48提供了实施方式39-47中任一项所述的方法，其中施用所述载体包括瘤内注射。
实施方式49提供了实施方式39-48中任一项所述的方法，其中所述癌症选自胰腺癌和黑素瘤。
实施方式50提供了实施方式49所述的方法，其中所述胰腺癌是胰腺导管腺癌。
其他实施方式
本文引用的每篇专利、专利申请和出版物的公开内容均通过引用以其整体并入本文。虽然本发明已参照具体实施方式进行了公开，但是显而易见的是本领域其他技术人员可以在不背离本发明的真实精神和范围的情况下设计出本发明的其他实施方式和变型。所附权利要求旨在解释为包括所有这样的实施方式等同变型。
序列表
<110> 宾夕法尼亚大学董事会
<120> 使用溶瘤病毒递送正交IL-2选择性刺激实体瘤中的T细胞
<130> 046483-7318WO1(02626)
<150> 63/158,671
<151> 2021-03-09
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 462
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人ortho-IL2 cDNA
<400> 1
atgtacagga tgcagctgct gtcttgcatc gccctgagcc tggccctggt gaccaactcc 60
gcccccacaa gctcctctac caagaagaca cagctgcagc tgtctcagct gctggtgctg 120
ctgaaggcca tcctgaacgg catcaacaat tacaagaatc ccaagctgac ccgcatgctg 180
acattcaagt tttatatgcc taagaaggcc accgagctga agcacctgca gtgtctggag 240
gaggagctga agccactgga ggaggtgctg aacctggccc agtccaagaa tttccacctg 300
cggcccagag acctgatctc taacatcaat gtgatcgtgc tggagctgaa gggcagcgag 360
accaccttca tgtgcgagta tgccgatgag accgccacaa tcgtggagtt cctgaatcgg 420
tggatcacat tttgtcagag catcatctcc accctgacat ga 462
<210> 2
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人ortho-IL2
<400> 2
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Ser Gln Leu Leu Val Leu Leu Lys Ala Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 3
<211> 1656
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人orthoIL2Rb cDNA
<400> 3
atggcggccc ctgctctgtc ctggcgtctg cccctcctca tcctcctcct gcccctggct 60
acctcttggg catctgcagc ggtgaatggc acttcccagt tcacatgctt ctacaactcg 120
agagccaaca tctcctgtgt ctggagccaa gatggggctc tgcaggacac ttcctgccaa 180
gtccatgcct ggccggacag acggcggtgg aaccaaacct gtgagctgct ccccgtgagt 240
caagcatcct gggcctgcaa cctgatcctc ggagccccag attctcagaa actgaccaca 300
gttgacatcg tcaccctgag ggtgctgtgc cgtgaggggg tgcgatggag ggtgatggcc 360
atccaggact tcaagccctt tgagaacctt cgcctgatgg cccccatctc cctccaagtt 420
gtccacgtgg agacccacag atgcaacata agctgggaaa tctcccaagc ctccgacttc 480
tttgaaagac acctggagtt cgaggcccgg acgctgtccc caggccacac ctgggaggag 540
gcccccctgc tgactctcaa gcagaagcag gaatggatct gcctggagac gctcacccca 600
gacacccagt atgagtttca ggtgcgggtc aagcctctgc aaggcgagtt cacgacctgg 660
agcccctgga gccagcccct ggccttcagg acaaagcctg cagcccttgg gaaggacacc 720
attccgtggc tcggccacct cctcgtgggt ctcagcgggg cttttggctt catcatctta 780
gtgtacttgc tgatcaactg caggaacacc gggccatggc tgaagaaggt cctgaagtgt 840
aacaccccag acccctcgaa gttcttttcc cagctgagct cagagcatgg aggagacgtc 900
cagaagtggc tctcttcgcc cttcccctca tcgtccttca gccctggcgg cctggcacct 960
gagatctcgc cactagaagt gctggagagg gacaaggtga cgcagctgct cctgcagcag 1020
gacaaggtgc ctgagcccgc atccttaagc agcaaccact cgctgaccag ctgcttcacc 1080
aaccagggtt acttcttctt ccacctcccg gatgccttgg agatagaggc ctgccaggtg 1140
tactttactt acgaccccta ctcagaggaa gaccctgatg agggtgtggc cggggcaccc 1200
acagggtctt ccccccaacc cctgcagcct ctgtcagggg aggacgacgc ctactgcacc 1260
ttcccctcca gggatgacct gctgctcttc tcccccagtc tcctcggtgg ccccagcccc 1320
ccaagcactg cccctggggg cagtggggcc ggtgaagaga ggatgccccc ttctttgcaa 1380
gaaagagtcc ccagagactg ggacccccag cccctggggc ctcccacccc aggagtccca 1440
gacctggtgg attttcagcc accccctgag ctggtgctgc gagaggctgg ggaggaggtc 1500
cctgacgctg gccccaggga gggagtcagt ttcccctggt ccaggcctcc tgggcagggg 1560
gagttcaggg cccttaatgc tcgcctgccc ctgaacactg atgcctactt gtccctccaa 1620
gaactccagg gtcaggaccc aactcacttg gtgtga 1656
<210> 4
<211> 551
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人orthoIL2Rb
<400> 4
Met Ala Ala Pro Ala Leu Ser Trp Arg Leu Pro Leu Leu Ile Leu Leu
1 5 10 15
Leu Pro Leu Ala Thr Ser Trp Ala Ser Ala Ala Val Asn Gly Thr Ser
20 25 30
Gln Phe Thr Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Ile Ser Cys Val Trp
35 40 45
Ser Gln Asp Gly Ala Leu Gln Asp Thr Ser Cys Gln Val His Ala Trp
50 55 60
Pro Asp Arg Arg Arg Trp Asn Gln Thr Cys Glu Leu Leu Pro Val Ser
65 70 75 80
Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ala Pro Asp Ser Gln
85 90 95
Lys Leu Thr Thr Val Asp Ile Val Thr Leu Arg Val Leu Cys Arg Glu
100 105 110
Gly Val Arg Trp Arg Val Met Ala Ile Gln Asp Phe Lys Pro Phe Glu
115 120 125
Asn Leu Arg Leu Met Ala Pro Ile Ser Leu Gln Val Val His Val Glu
130 135 140
Thr His Arg Cys Asn Ile Ser Trp Glu Ile Ser Gln Ala Ser Asp Phe
145 150 155 160
Phe Glu Arg His Leu Glu Phe Glu Ala Arg Thr Leu Ser Pro Gly His
165 170 175
Thr Trp Glu Glu Ala Pro Leu Leu Thr Leu Lys Gln Lys Gln Glu Trp
180 185 190
Ile Cys Leu Glu Thr Leu Thr Pro Asp Thr Gln Tyr Glu Phe Gln Val
195 200 205
Arg Val Lys Pro Leu Gln Gly Glu Phe Thr Thr Trp Ser Pro Trp Ser
210 215 220
Gln Pro Leu Ala Phe Arg Thr Lys Pro Ala Ala Leu Gly Lys Asp Thr
225 230 235 240
Ile Pro Trp Leu Gly His Leu Leu Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly
245 250 255
Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu Ile Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro
260 265 270
Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe
275 280 285
Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu
290 295 300
Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro
305 310 315 320
Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu
325 330 335
Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn
340 345 350
His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His
355 360 365
Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr
370 375 380
Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro
385 390 395 400
Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp
405 410 415
Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro
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Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser
435 440 445
Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro
450 455 460
Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro
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Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala
485 490 495
Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro
500 505 510
Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg
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Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly
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Gln Asp Pro Thr His Leu Val
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<211> 1497
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人orthoIL2Rb/IL9Ra cDNA
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人orthoIL2Rb/IL9Ra
<400> 6
Met Ala Ala Pro Ala Leu Ser Trp Arg Leu Pro Leu Leu Ile Leu Leu
1 5 10 15
Leu Pro Leu Ala Thr Ser Trp Ala Ser Ala Ala Val Asn Gly Thr Ser
20 25 30
Gln Phe Thr Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Ile Ser Cys Val Trp
35 40 45
Ser Gln Asp Gly Ala Leu Gln Asp Thr Ser Cys Gln Val His Ala Trp
50 55 60
Pro Asp Arg Arg Arg Trp Asn Gln Thr Cys Glu Leu Leu Pro Val Ser
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Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ala Pro Asp Ser Gln
85 90 95
Lys Leu Thr Thr Val Asp Ile Val Thr Leu Arg Val Leu Cys Arg Glu
100 105 110
Gly Val Arg Trp Arg Val Met Ala Ile Gln Asp Phe Lys Pro Phe Glu
115 120 125
Asn Leu Arg Leu Met Ala Pro Ile Ser Leu Gln Val Val His Val Glu
130 135 140
Thr His Arg Cys Asn Ile Ser Trp Glu Ile Ser Gln Ala Ser Asp Phe
145 150 155 160
Phe Glu Arg His Leu Glu Phe Glu Ala Arg Thr Leu Ser Pro Gly His
165 170 175
Thr Trp Glu Glu Ala Pro Leu Leu Thr Leu Lys Gln Lys Gln Glu Trp
180 185 190
Ile Cys Leu Glu Thr Leu Thr Pro Asp Thr Gln Tyr Glu Phe Gln Val
195 200 205
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Gln Pro Leu Ala Phe Arg Thr Lys Pro Ala Gln Arg Gln Gly Pro Leu
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Ile Pro Pro Trp Gly Trp Pro Gly Asn Thr Leu Val Ala Val Ser Ile
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Phe Leu Leu Leu Thr Gly Pro Thr Tyr Leu Leu Phe Lys Leu Ser Pro
260 265 270
Arg Val Lys Arg Ile Phe Tyr Gln Asn Val Pro Ser Pro Ala Met Phe
275 280 285
Phe Gln Pro Leu Tyr Ser Val His Asn Gly Asn Phe Gln Thr Trp Met
290 295 300
Gly Ala His Gly Ala Gly Val Leu Leu Ser Gln Asp Cys Ala Gly Thr
305 310 315 320
Pro Gln Gly Ala Leu Glu Pro Cys Val Gln Glu Ala Thr Ala Leu Leu
325 330 335
Thr Cys Gly Pro Ala Arg Pro Trp Lys Ser Val Ala Leu Glu Glu Glu
340 345 350
Gln Glu Gly Pro Gly Thr Arg Leu Pro Gly Asn Leu Ser Ser Glu Asp
355 360 365
Val Leu Pro Ala Gly Cys Thr Glu Trp Arg Val Gln Thr Leu Ala Tyr
370 375 380
Leu Pro Gln Glu Asp Trp Ala Pro Thr Ser Leu Thr Arg Pro Ala Pro
385 390 395 400
Pro Asp Ser Glu Gly Ser Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asn
405 410 415
Asn Asn Asn Tyr Cys Ala Leu Gly Cys Tyr Gly Gly Trp His Leu Ser
420 425 430
Ala Leu Pro Gly Asn Thr Gln Ser Ser Gly Pro Ile Pro Ala Leu Ala
435 440 445
Cys Gly Leu Ser Cys Asp His Gln Gly Leu Glu Thr Gln Gln Gly Val
450 455 460
Ala Trp Val Leu Ala Gly His Cys Gln Arg Pro Gly Leu His Glu Asp
465 470 475 480
Leu Gln Gly Met Leu Leu Pro Ser Val Leu Ser Lys Ala Arg Ser Trp
485 490 495
Thr Phe
<210> 7
<211> 510
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠ortho-IL2 (克隆3A10) cDNA
<400> 7
atgtattcaa tgcagctcgc ctcatgcgtc accctcacac tcgtcctcct cgtcaactca 60
gcccccacct cttcaccaac ttcctcacca accagctcct ctacagccga ggctcagcaa 120
caacagcagc agcagcagca cctggacaac ctgctggtgc tgctgaaggc cctgctgtct 180
aggatggaga actacagaaa cctgaagctg cccaggatgc tgaccttcaa gttttacctg 240
cctaagcagg ctacagagct gaaggacctg cagtgcctgg aggatgagct gggaccactg 300
aggcacgtgc tggacctgac ccagagcaag tccttccagc tggaggatgc cgagaacttt 360
atctctaaca tccgcgtgac cgtggtgaag ctgaagggaa gcgataacac attcgagtgt 420
cagtttgacg atgagtccgc tacagtggtg gattttctca gacggtggat tgccttttgc 480
cagagcatca tctcaacttc ccctcagtaa 510
<210> 8
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠ortho-IL2 (克隆3A10)
<400> 8
Met Tyr Ser Met Gln Leu Ala Ser Cys Val Thr Leu Thr Leu Val Leu
1 5 10 15
Leu Val Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Pro Thr Ser Ser Pro Thr Ser
20 25 30
Ser Ser Thr Ala Glu Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Leu
35 40 45
Asp Asn Leu Leu Val Leu Leu Lys Ala Leu Leu Ser Arg Met Glu Asn
50 55 60
Tyr Arg Asn Leu Lys Leu Pro Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Pro Lys Gln Ala Thr Glu Leu Lys Asp Leu Gln Cys Leu Glu Asp Glu
85 90 95
Leu Gly Pro Leu Arg His Val Leu Asp Leu Thr Gln Ser Lys Ser Phe
100 105 110
Gln Leu Glu Asp Ala Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile Arg Val Thr Val
115 120 125
Val Lys Leu Lys Gly Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys Gln Phe Asp Asp
130 135 140
Glu Ser Ala Thr Val Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp Ile Ala Phe Cys
145 150 155 160
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Ser Pro Gln
165
<210> 9
<211> 1620
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠orthoIL2Rb (又名o2R) cDNA
<400> 9
atggcaacaa tcgctctccc ttggtctctc agtctctatg tctttctcct gctcctcgct 60
actccctggg catctgctgc tgtgaagaac tgctcccacc tggagtgttt ttacaactct 120
cgcgctaacg tgtcttgtat gtggagccac gaggaggccc tgaacgtgac cacatgccac 180
gtgcacgcta agtccaacct gagacactgg aacaagacct gtgagctgac actggtgcgg 240
caggctagct gggcttgcaa cctgatcctg ggatccttcc ctgagagcca gtccctgacc 300
tctgtggacc tgctggatat caacgtggtg tgctgggagg agaagggctg gaggagagtg 360
aagacatgcg actttcaccc tttcgataac ctgaggctgg tggctccaca ctccctgcag 420
gtgctgcaca tcgacaccca gaggtgtaac atctcttgga aggtgtctca ggtgagcgac 480
ttcatcgagc catacctgga gttcgaggct cggcgcaggc tgctgggaca ctcctgggag 540
gacgcctccg tgctgtctct gaagcagagg cagcagtggc tgttcctgga gatgctgatc 600
ccctctacaa gctacgaggt gcaggtgaga gtgaaggctc agcggaacaa caccggaaca 660
tggagcccct ggtcccagcc tctgaccttt agaacacggc ctgccgatcc aatgaaggag 720
atcctgccca tgagctggct gagatacctg ctgctggtgc tgggatgctt ctccggcttc 780
ttttcttgcg tgtacatcct ggtgaagtgc cggtacctgg gcccttggct gaagaccgtg 840
ctgaagtgcc acatccctga cccaagcgag ttcttttccc agctgagctc ccagcacggc 900
ggagatctgc agaagtggct gtctagcccc gtgcctctga gcttcttttc cccctctgga 960
ccagctcccg agatcagccc tctggaggtg ctggacggcg attccaaggc cgtgcagctg 1020
ctgctgctgc agaaggactc cgctcctctg ccaagcccat ccggacactc tcaggccagc 1080
tgttttacca accagggcta cttctttttc cacctgccta acgccctgga gatcgagtct 1140
tgtcaggtgt acttcacata cgacccatgc gtggaggagg aggtggagga ggatggatct 1200
cgcctgccag agggcagccc ccacccacct ctgctgcctc tggccggaga gcaggacgat 1260
tactgcgctt ttccacccag ggacgatctg ctgctgttct ctcctagcct gtccacccca 1320
aacacagctt acggaggaag ccgcgctcca gaggagaggt cccctctgtc tctgcacgag 1380
ggactgccaa gcctggcttc cagggacctg atgggcctgc agcgcccact ggagaggatg 1440
ccagagggcg atggagaggg cctgtctgcc aactcctctg gcgagcaggc tagcgtgcca 1500
gagggaaacc tgcacggaca ggaccaggat aggggacagg gacccatcct gacactgaat 1560
acagatgctt acctctcact ccaggaactc caggcacagg attcagtcca cctcatttaa 1620
<210> 10
<211> 539
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠orthoIL2Rb (又名o2R)
<400> 10
Met Ala Thr Ile Ala Leu Pro Trp Ser Leu Ser Leu Tyr Val Phe Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Thr Pro Trp Ala Ser Ala Ala Val Lys Asn Cys Ser
20 25 30
His Leu Glu Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Val Ser Cys Met Trp
35 40 45
Ser His Glu Glu Ala Leu Asn Val Thr Thr Cys His Val His Ala Lys
50 55 60
Ser Asn Leu Arg His Trp Asn Lys Thr Cys Glu Leu Thr Leu Val Arg
65 70 75 80
Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ser Phe Pro Glu Ser
85 90 95
Gln Ser Leu Thr Ser Val Asp Leu Leu Asp Ile Asn Val Val Cys Trp
100 105 110
Glu Glu Lys Gly Trp Arg Arg Val Lys Thr Cys Asp Phe His Pro Phe
115 120 125
Asp Asn Leu Arg Leu Val Ala Pro His Ser Leu Gln Val Leu His Ile
130 135 140
Asp Thr Gln Arg Cys Asn Ile Ser Trp Lys Val Ser Gln Val Ser Asp
145 150 155 160
Phe Ile Glu Pro Tyr Leu Glu Phe Glu Ala Arg Arg Arg Leu Leu Gly
165 170 175
His Ser Trp Glu Asp Ala Ser Val Leu Ser Leu Lys Gln Arg Gln Gln
180 185 190
Trp Leu Phe Leu Glu Met Leu Ile Pro Ser Thr Ser Tyr Glu Val Gln
195 200 205
Val Arg Val Lys Ala Gln Arg Asn Asn Thr Gly Thr Trp Ser Pro Trp
210 215 220
Ser Gln Pro Leu Thr Phe Arg Thr Arg Pro Ala Asp Pro Met Lys Glu
225 230 235 240
Ile Leu Pro Met Ser Trp Leu Arg Tyr Leu Leu Leu Val Leu Gly Cys
245 250 255
Phe Ser Gly Phe Phe Ser Cys Val Tyr Ile Leu Val Lys Cys Arg Tyr
260 265 270
Leu Gly Pro Trp Leu Lys Thr Val Leu Lys Cys His Ile Pro Asp Pro
275 280 285
Ser Glu Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Gln His Gly Gly Asp Leu Gln
290 295 300
Lys Trp Leu Ser Ser Pro Val Pro Leu Ser Phe Phe Ser Pro Ser Gly
305 310 315 320
Pro Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Asp Gly Asp Ser Lys
325 330 335
Ala Val Gln Leu Leu Leu Leu Gln Lys Asp Ser Ala Pro Leu Pro Ser
340 345 350
Pro Ser Gly His Ser Gln Ala Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr Phe
355 360 365
Phe Phe His Leu Pro Asn Ala Leu Glu Ile Glu Ser Cys Gln Val Tyr
370 375 380
Phe Thr Tyr Asp Pro Cys Val Glu Glu Glu Val Glu Glu Asp Gly Ser
385 390 395 400
Arg Leu Pro Glu Gly Ser Pro His Pro Pro Leu Leu Pro Leu Ala Gly
405 410 415
Glu Gln Asp Asp Tyr Cys Ala Phe Pro Pro Arg Asp Asp Leu Leu Leu
420 425 430
Phe Ser Pro Ser Leu Ser Thr Pro Asn Thr Ala Tyr Gly Gly Ser Arg
435 440 445
Ala Pro Glu Glu Arg Ser Pro Leu Ser Leu His Glu Gly Leu Pro Ser
450 455 460
Leu Ala Ser Arg Asp Leu Met Gly Leu Gln Arg Pro Leu Glu Arg Met
465 470 475 480
Pro Glu Gly Asp Gly Glu Gly Leu Ser Ala Asn Ser Ser Gly Glu Gln
485 490 495
Ala Ser Val Pro Glu Gly Asn Leu His Gly Gln Asp Gln Asp Arg Gly
500 505 510
Gln Gly Pro Ile Leu Thr Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln
515 520 525
Glu Leu Gln Ala Gln Asp Ser Val His Leu Ile
530 535
<210> 11
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠orthoIL2Rb (又名o2R)胞外结构域
<400> 11
Met Ala Thr Ile Ala Leu Pro Trp Ser Leu Ser Leu Tyr Val Phe Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Thr Pro Trp Ala Ser Ala Ala Val Lys Asn Cys Ser
20 25 30
His Leu Glu Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Val Ser Cys Met Trp
35 40 45
Ser His Glu Glu Ala Leu Asn Val Thr Thr Cys His Val His Ala Lys
50 55 60
Ser Asn Leu Arg His Trp Asn Lys Thr Cys Glu Leu Thr Leu Val Arg
65 70 75 80
Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ser Phe Pro Glu Ser
85 90 95
Gln Ser Leu Thr Ser Val Asp Leu Leu Asp Ile Asn Val Val Cys Trp
100 105 110
Glu Glu Lys Gly Trp Arg Arg Val Lys Thr Cys Asp Phe His Pro Phe
115 120 125
Asp Asn Leu Arg Leu Val Ala Pro His Ser Leu Gln Val Leu His Ile
130 135 140
Asp Thr Gln Arg Cys Asn Ile Ser Trp Lys Val Ser Gln Val Ser Asp
145 150 155 160
Phe Ile Glu Pro Tyr Leu Glu Phe Glu Ala Arg Arg Arg Leu Leu Gly
165 170 175
His Ser Trp Glu Asp Ala Ser Val Leu Ser Leu Lys Gln Arg Gln Gln
180 185 190
Trp Leu Phe Leu Glu Met Leu Ile Pro Ser Thr Ser Tyr Glu Val Gln
195 200 205
Val Arg Val Lys Ala Gln Arg Asn Asn Thr Gly Thr Trp Ser Pro Trp
210 215 220
Ser Gln Pro Leu Thr Phe Arg Thr Arg Pro Ala Asp Pro Met Lys Glu
225 230 235 240
<210> 12
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠orthoIL2Rb (又名o2R)跨膜区
<400> 12
Ile Leu Pro Met Ser Trp Leu Arg Tyr Leu Leu Leu Val Leu Gly Cys
1 5 10 15
Phe Ser Gly Phe Phe Ser Cys Val Tyr Ile Leu Val
20 25
<210> 13
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠orthoIL2Rb (又名o2R)胞内结构域
<400> 13
Lys Cys Arg Tyr Leu Gly Pro Trp Leu Lys Thr Val Leu Lys Cys His
1 5 10 15
Ile Pro Asp Pro Ser Glu Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Gln His Gly
20 25 30
Gly Asp Leu Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Val Pro Leu Ser Phe Phe
35 40 45
Ser Pro Ser Gly Pro Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Asp
50 55 60
Gly Asp Ser Lys Ala Val Gln Leu Leu Leu Leu Gln Lys Asp Ser Ala
65 70 75 80
Pro Leu Pro Ser Pro Ser Gly His Ser Gln Ala Ser Cys Phe Thr Asn
85 90 95
Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asn Ala Leu Glu Ile Glu Ser
100 105 110
Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Cys Val Glu Glu Glu Val Glu
115 120 125
Glu Asp Gly Ser Arg Leu Pro Glu Gly Ser Pro His Pro Pro Leu Leu
130 135 140
Pro Leu Ala Gly Glu Gln Asp Asp Tyr Cys Ala Phe Pro Pro Arg Asp
145 150 155 160
Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Ser Thr Pro Asn Thr Ala Tyr
165 170 175
Gly Gly Ser Arg Ala Pro Glu Glu Arg Ser Pro Leu Ser Leu His Glu
180 185 190
Gly Leu Pro Ser Leu Ala Ser Arg Asp Leu Met Gly Leu Gln Arg Pro
195 200 205
Leu Glu Arg Met Pro Glu Gly Asp Gly Glu Gly Leu Ser Ala Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Glu Gln Ala Ser Val Pro Glu Gly Asn Leu His Gly Gln Asp
225 230 235 240
Gln Asp Arg Gly Gln Gly Pro Ile Leu Thr Leu Asn Thr Asp Ala Tyr
245 250 255
Leu Ser Leu Gln Glu Leu Gln Ala Gln Asp Ser Val His Leu Ile
260 265 270
<210> 14
<211> 1317
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠orthoIL2Rb/IL9Ra (又名o9R) cDNA
<400> 14
atggctacta tcgctctgcc ttggtccctc tcactctatg tcttcctgct cctgctggct 60
acaccctggg cttctgctgc cgtcaaaaac tgctcccacc tggagtgttt ctacaactct 120
cgcgccaacg tgagctgcat gtggtcccac gaggaggccc tgaacgtgac cacatgtcac 180
gtgcacgcta agtccaacct gagacactgg aacaagacct gcgagctgac actggtgcgg 240
caggcctctt gggcttgtaa cctgatcctg ggaagctttc ccgagagcca gtccctgacc 300
tccgtggacc tgctggatat caacgtggtg tgctgggagg agaagggctg gaggagagtg 360
aagacatgtg acttccaccc atttgataac ctgaggctgg tggctccaca cagcctgcag 420
gtgctgcaca tcgacaccca gaggtgcaac atctcctgga aggtgagcca ggtgtccgat 480
ttcatcgagc cttacctgga gtttgaggct cggcgcaggc tgctgggaca ctcctgggag 540
gacgcttctg tgctgagcct gaagcagcgg cagcagtggc tgttcctgga gatgctgatc 600
ccatctacca gctacgaggt gcaggtgcgc gtgaaggccc agaggaacaa caccggaaca 660
tggtcccctt ggagccagcc actgaccttc cgcacaaggc ccgccgatcc tatgaaggag 720
gcttctatcc tggtggtggt gcctatcttt ctgctgctga caggcttcgt gcacctgctg 780
tttaagctgt ctccaagact gaagcggatc ttctaccaga acatccctag cccagaggct 840
ttctttcacc ccctgtacag cgtgtaccac ggagactttc agtcctggac cggagctaga 900
agggctggac ctcaggctag acagaacgga gtgtctacaa gctccgctgg cagcgagtct 960
agcatctggg aggccgtggc taccctgaca tactctccag cctgccccgt gcagttcgct 1020
tgtctgaagt gggaggccac cgctcctggc tttccaggac tgccaggaag cgagcacgtg 1080
ctgccagctg gatgtctgga gctggaggga cagccatccg cttacctgcc tcaggaggat 1140
tgggctccac tgggatctgc tcggccccct ccaccagact ccgattctgg atcctctgac 1200
tactgcatgc tggattgctg tgaggagtgt cacctgagcg ccttccccgg ccacacagaa 1260
agccccgaac tcaccctcgc acagcccgtc gcactcccag tctcctccag agcataa 1317
<210> 15
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠orthoIL2Rb/IL9Ra (又名o9R)
<400> 15
Met Ala Thr Ile Ala Leu Pro Trp Ser Leu Ser Leu Tyr Val Phe Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Thr Pro Trp Ala Ser Ala Ala Val Lys Asn Cys Ser
20 25 30
His Leu Glu Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Val Ser Cys Met Trp
35 40 45
Ser His Glu Glu Ala Leu Asn Val Thr Thr Cys His Val His Ala Lys
50 55 60
Ser Asn Leu Arg His Trp Asn Lys Thr Cys Glu Leu Thr Leu Val Arg
65 70 75 80
Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ser Phe Pro Glu Ser
85 90 95
Gln Ser Leu Thr Ser Val Asp Leu Leu Asp Ile Asn Val Val Cys Trp
100 105 110
Glu Glu Lys Gly Trp Arg Arg Val Lys Thr Cys Asp Phe His Pro Phe
115 120 125
Asp Asn Leu Arg Leu Val Ala Pro His Ser Leu Gln Val Leu His Ile
130 135 140
Asp Thr Gln Arg Cys Asn Ile Ser Trp Lys Val Ser Gln Val Ser Asp
145 150 155 160
Phe Ile Glu Pro Tyr Leu Glu Phe Glu Ala Arg Arg Arg Leu Leu Gly
165 170 175
His Ser Trp Glu Asp Ala Ser Val Leu Ser Leu Lys Gln Arg Gln Gln
180 185 190
Trp Leu Phe Leu Glu Met Leu Ile Pro Ser Thr Ser Tyr Glu Val Gln
195 200 205
Val Arg Val Lys Ala Gln Arg Asn Asn Thr Gly Thr Trp Ser Pro Trp
210 215 220
Ser Gln Pro Leu Thr Phe Arg Thr Arg Pro Ala Asp Pro Met Lys Glu
225 230 235 240
Ala Ser Ile Leu Val Val Val Pro Ile Phe Leu Leu Leu Thr Gly Phe
245 250 255
Val His Leu Leu Phe Lys Leu Ser Pro Arg Leu Lys Arg Ile Phe Tyr
260 265 270
Gln Asn Ile Pro Ser Pro Glu Ala Phe Phe His Pro Leu Tyr Ser Val
275 280 285
Tyr His Gly Asp Phe Gln Ser Trp Thr Gly Ala Arg Arg Ala Gly Pro
290 295 300
Gln Ala Arg Gln Asn Gly Val Ser Thr Ser Ser Ala Gly Ser Glu Ser
305 310 315 320
Ser Ile Trp Glu Ala Val Ala Thr Leu Thr Tyr Ser Pro Ala Cys Pro
325 330 335
Val Gln Phe Ala Cys Leu Lys Trp Glu Ala Thr Ala Pro Gly Phe Pro
340 345 350
Gly Leu Pro Gly Ser Glu His Val Leu Pro Ala Gly Cys Leu Glu Leu
355 360 365
Glu Gly Gln Pro Ser Ala Tyr Leu Pro Gln Glu Asp Trp Ala Pro Leu
370 375 380
Gly Ser Ala Arg Pro Pro Pro Pro Asp Ser Asp Ser Gly Ser Ser Asp
385 390 395 400
Tyr Cys Met Leu Asp Cys Cys Glu Glu Cys His Leu Ser Ala Phe Pro
405 410 415
Gly His Thr Glu Ser Pro Glu Leu Thr Leu Ala Gln Pro Val Ala Leu
420 425 430
Pro Val Ser Ser Arg Ala
435
<210> 16
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠orthoIL2Rb/IL9Ra (又名o9R) - orthoIL2Rb胞外结构域
<400> 16
Met Ala Thr Ile Ala Leu Pro Trp Ser Leu Ser Leu Tyr Val Phe Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Thr Pro Trp Ala Ser Ala Ala Val Lys Asn Cys Ser
20 25 30
His Leu Glu Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Val Ser Cys Met Trp
35 40 45
Ser His Glu Glu Ala Leu Asn Val Thr Thr Cys His Val His Ala Lys
50 55 60
Ser Asn Leu Arg His Trp Asn Lys Thr Cys Glu Leu Thr Leu Val Arg
65 70 75 80
Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ser Phe Pro Glu Ser
85 90 95
Gln Ser Leu Thr Ser Val Asp Leu Leu Asp Ile Asn Val Val Cys Trp
100 105 110
Glu Glu Lys Gly Trp Arg Arg Val Lys Thr Cys Asp Phe His Pro Phe
115 120 125
Asp Asn Leu Arg Leu Val Ala Pro His Ser Leu Gln Val Leu His Ile
130 135 140
Asp Thr Gln Arg Cys Asn Ile Ser Trp Lys Val Ser Gln Val Ser Asp
145 150 155 160
Phe Ile Glu Pro Tyr Leu Glu Phe Glu Ala Arg Arg Arg Leu Leu Gly
165 170 175
His Ser Trp Glu Asp Ala Ser Val Leu Ser Leu Lys Gln Arg Gln Gln
180 185 190
Trp Leu Phe Leu Glu Met Leu Ile Pro Ser Thr Ser Tyr Glu Val Gln
195 200 205
Val Arg Val Lys Ala Gln Arg Asn Asn Thr Gly Thr Trp Ser Pro Trp
210 215 220
Ser Gln Pro Leu Thr Phe Arg Thr Arg Pro Ala
225 230 235
<210> 17
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠orthoIL2Rb/IL9Ra (又名o9R) -跨膜区
<400> 17
Ala Ser Ile Leu Val Val Val Pro Ile Phe Leu Leu Leu Thr Gly Phe
1 5 10 15
Val His Leu Leu Phe
20
<210> 18
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠orthoIL2Rb/IL9Ra (又名o9R) - IL9Ra胞内结构域与跨膜区
<400> 18
Gln Arg Arg Gln Gly Leu Leu Val Pro Arg Trp Gln Trp Ser Ala Ser
1 5 10 15
Ile Leu Val Val Val Pro Ile Phe Leu Leu Leu Thr Gly Phe Val His
20 25 30
Leu Leu Phe Lys Leu Ser Pro Arg Leu Lys Arg Ile Phe Tyr Gln Asn
35 40 45
Ile Pro Ser Pro Glu Ala Phe Phe His Pro Leu Tyr Ser Val Tyr His
50 55 60
Gly Asp Phe Gln Ser Trp Thr Gly Ala Arg Arg Ala Gly Pro Gln Ala
65 70 75 80
Arg Gln Asn Gly Val Ser Thr Ser Ser Ala Gly Ser Glu Ser Ser Ile
85 90 95
Trp Glu Ala Val Ala Thr Leu Thr Tyr Ser Pro Ala Cys Pro Val Gln
100 105 110
Phe Ala Cys Leu Lys Trp Glu Ala Thr Ala Pro Gly Phe Pro Gly Leu
115 120 125
Pro Gly Ser Glu His Val Leu Pro Ala Gly Cys Leu Glu Leu Glu Gly
130 135 140
Gln Pro Ser Ala Tyr Leu Pro Gln Glu Asp Trp Ala Pro Leu Gly Ser
145 150 155 160
Ala Arg Pro Pro Pro Pro Asp Ser Asp Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Cys
165 170 175
Met Leu Asp Cys Cys Glu Glu Cys His Leu Ser Ala Phe Pro Gly His
180 185 190
Thr Glu Ser Pro Glu Leu Thr Leu Ala Gln Pro Val Ala Leu Pro Val
195 200 205
Ser Ser Arg Ala
210
<210> 19
<211> 820
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠orthoIL2Rb/IL4R (又名o4R)
<400> 19
Met Ala Thr Ile Ala Leu Pro Trp Ser Leu Ser Leu Tyr Val Phe Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Thr Pro Trp Ala Ser Ala Ala Val Lys Asn Cys Ser
20 25 30
His Leu Glu Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Val Ser Cys Met Trp
35 40 45
Ser His Glu Glu Ala Leu Asn Val Thr Thr Cys His Val His Ala Lys
50 55 60
Ser Asn Leu Arg His Trp Asn Lys Thr Cys Glu Leu Thr Leu Val Arg
65 70 75 80
Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ser Phe Pro Glu Ser
85 90 95
Gln Ser Leu Thr Ser Val Asp Leu Leu Asp Ile Asn Val Val Cys Trp
100 105 110
Glu Glu Lys Gly Trp Arg Arg Val Lys Thr Cys Asp Phe His Pro Phe
115 120 125
Asp Asn Leu Arg Leu Val Ala Pro His Ser Leu Gln Val Leu His Ile
130 135 140
Asp Thr Gln Arg Cys Asn Ile Ser Trp Lys Val Ser Gln Val Ser Asp
145 150 155 160
Phe Ile Glu Pro Tyr Leu Glu Phe Glu Ala Arg Arg Arg Leu Leu Gly
165 170 175
His Ser Trp Glu Asp Ala Ser Val Leu Ser Leu Lys Gln Arg Gln Gln
180 185 190
Trp Leu Phe Leu Glu Met Leu Ile Pro Ser Thr Ser Tyr Glu Val Gln
195 200 205
Val Arg Val Lys Ala Gln Arg Asn Asn Thr Gly Thr Trp Ser Pro Trp
210 215 220
Ser Gln Pro Leu Thr Phe Arg Thr Arg Pro Ala Phe Gln Leu Pro Leu
225 230 235 240
Ile Gln Arg Leu Pro Leu Gly Val Thr Ile Ser Cys Leu Cys Ile Pro
245 250 255
Leu Phe Cys Leu Phe Cys Tyr Phe Ser Ile Thr Lys Ile Lys Lys Ile
260 265 270
Trp Trp Asp Gln Ile Pro Thr Pro Ala Arg Ser Pro Leu Val Ala Ile
275 280 285
Ile Ile Gln Asp Ala Gln Val Pro Leu Trp Asp Lys Gln Thr Arg Ser
290 295 300
Gln Glu Ser Thr Lys Tyr Pro His Trp Lys Thr Cys Leu Asp Lys Leu
305 310 315 320
Leu Pro Cys Leu Leu Lys His Arg Val Lys Lys Lys Thr Asp Phe Pro
325 330 335
Lys Ala Ala Pro Thr Lys Ser Leu Gln Ser Pro Gly Lys Ala Gly Trp
340 345 350
Cys Pro Met Glu Val Ser Arg Thr Val Leu Trp Pro Glu Asn Val Ser
355 360 365
Val Ser Val Val Arg Cys Met Glu Leu Phe Glu Ala Pro Val Gln Asn
370 375 380
Val Glu Glu Glu Glu Asp Glu Ile Val Lys Glu Asp Leu Ser Met Ser
385 390 395 400
Pro Glu Asn Ser Gly Gly Cys Gly Phe Gln Glu Ser Gln Ala Asp Ile
405 410 415
Met Ala Arg Leu Thr Glu Asn Leu Phe Ser Asp Leu Leu Glu Ala Glu
420 425 430
Asn Gly Gly Leu Gly Gln Ser Ala Leu Ala Glu Ser Cys Ser Pro Leu
435 440 445
Pro Ser Gly Ser Gly Gln Ala Ser Val Ser Trp Ala Cys Leu Pro Met
450 455 460
Gly Pro Ser Glu Glu Ala Thr Cys Gln Val Thr Glu Gln Pro Ser His
465 470 475 480
Pro Gly Pro Leu Ser Gly Ser Pro Ala Gln Ser Ala Pro Thr Leu Ala
485 490 495
Cys Thr Gln Val Pro Leu Val Leu Ala Asp Asn Pro Ala Tyr Arg Ser
500 505 510
Phe Ser Asp Cys Cys Ser Pro Ala Pro Asn Pro Gly Glu Leu Ala Pro
515 520 525
Glu Gln Gln Gln Ala Asp His Leu Glu Glu Glu Glu Pro Pro Ser Pro
530 535 540
Ala Asp Pro His Ser Ser Gly Pro Pro Met Gln Pro Val Glu Ser Trp
545 550 555 560
Glu Gln Ile Leu His Met Ser Val Leu Gln His Gly Ala Ala Ala Gly
565 570 575
Ser Thr Pro Ala Pro Ala Gly Gly Tyr Gln Glu Phe Val Gln Ala Val
580 585 590
Lys Gln Gly Ala Ala Gln Asp Pro Gly Val Pro Gly Val Arg Pro Ser
595 600 605
Gly Asp Pro Gly Tyr Lys Ala Phe Ser Ser Leu Leu Ser Ser Asn Gly
610 615 620
Ile Arg Gly Asp Thr Ala Ala Ala Gly Thr Asp Asp Gly His Gly Gly
625 630 635 640
Tyr Lys Pro Phe Gln Asn Pro Val Pro Asn Gln Ser Pro Ser Ser Val
645 650 655
Pro Leu Phe Thr Phe Gly Leu Asp Thr Glu Leu Ser Pro Ser Pro Leu
660 665 670
Asn Ser Asp Pro Pro Lys Ser Pro Pro Glu Cys Leu Gly Leu Glu Leu
675 680 685
Gly Leu Lys Gly Gly Asp Trp Val Lys Ala Pro Pro Pro Ala Asp Gln
690 695 700
Val Pro Lys Pro Phe Gly Asp Asp Leu Gly Phe Gly Ile Val Tyr Ser
705 710 715 720
Ser Leu Thr Cys His Leu Cys Gly His Leu Lys Gln His His Ser Gln
725 730 735
Glu Glu Gly Gly Gln Ser Pro Ile Val Ala Ser Pro Gly Cys Gly Cys
740 745 750
Cys Tyr Asp Asp Arg Ser Pro Ser Leu Gly Ser Leu Ser Gly Ala Leu
755 760 765
Glu Ser Cys Pro Glu Gly Ile Pro Pro Glu Ala Asn Leu Met Ser Ala
770 775 780
Pro Lys Thr Pro Ser Asn Leu Ser Gly Glu Gly Lys Gly Pro Gly His
785 790 795 800
Ser Pro Val Pro Ser Gln Thr Thr Glu Val Pro Val Gly Ala Leu Gly
805 810 815
Ile Ala Val Ser
820
<210> 20
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠orthoIL2Rb/IL7R (又名o7R)
<400> 20
Met Ala Thr Ile Ala Leu Pro Trp Ser Leu Ser Leu Tyr Val Phe Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Thr Pro Trp Ala Ser Ala Ala Val Lys Asn Cys Ser
20 25 30
His Leu Glu Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Val Ser Cys Met Trp
35 40 45
Ser His Glu Glu Ala Leu Asn Val Thr Thr Cys His Val His Ala Lys
50 55 60
Ser Asn Leu Arg His Trp Asn Lys Thr Cys Glu Leu Thr Leu Val Arg
65 70 75 80
Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ser Phe Pro Glu Ser
85 90 95
Gln Ser Leu Thr Ser Val Asp Leu Leu Asp Ile Asn Val Val Cys Trp
100 105 110
Glu Glu Lys Gly Trp Arg Arg Val Lys Thr Cys Asp Phe His Pro Phe
115 120 125
Asp Asn Leu Arg Leu Val Ala Pro His Ser Leu Gln Val Leu His Ile
130 135 140
Asp Thr Gln Arg Cys Asn Ile Ser Trp Lys Val Ser Gln Val Ser Asp
145 150 155 160
Phe Ile Glu Pro Tyr Leu Glu Phe Glu Ala Arg Arg Arg Leu Leu Gly
165 170 175
His Ser Trp Glu Asp Ala Ser Val Leu Ser Leu Lys Gln Arg Gln Gln
180 185 190
Trp Leu Phe Leu Glu Met Leu Ile Pro Ser Thr Ser Tyr Glu Val Gln
195 200 205
Val Arg Val Lys Ala Gln Arg Asn Asn Thr Gly Thr Trp Ser Pro Trp
210 215 220
Ser Gln Pro Leu Thr Phe Arg Thr Arg Pro Ala Lys Asn Gln Gly Gly
225 230 235 240
Trp Asp Pro Val Leu Pro Ser Val Thr Ile Leu Ser Leu Phe Ser Val
245 250 255
Phe Leu Leu Val Ile Leu Ala His Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys
260 265 270
Pro Val Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu Gln
275 280 285
Leu Cys Lys Lys Pro Lys Thr Ser Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu
290 295 300
Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Glu Val Lys Gly Val Glu Ala Arg
305 310 315 320
Asp Glu Val Glu Ser Phe Leu Pro Asn Asp Leu Pro Ala Gln Pro Glu
325 330 335
Glu Leu Glu Thr Gln Gly His Arg Ala Ala Val His Ser Ala Asn Arg
340 345 350
Ser Pro Glu Thr Ser Val Ser Pro Pro Glu Thr Val Arg Arg Glu Ser
355 360 365
Pro Leu Arg Cys Leu Ala Arg Asn Leu Ser Thr Cys Asn Ala Pro Pro
370 375 380
Leu Leu Ser Ser Arg Ser Pro Asp Tyr Arg Asp Gly Asp Arg Asn Arg
385 390 395 400
Pro Pro Val Tyr Gln Asp Leu Leu Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Val
405 410 415
Pro Val Pro Val Pro Gln Pro Leu Pro Phe Gln Ser Gly Ile Leu Ile
420 425 430
Pro Val Ser Gln Arg Gln Pro Ile Ser Thr Ser Ser Val Leu Asn Gln
435 440 445
Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Lys
450 455 460
<210> 21
<211> 537
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠orthoIL2Rb/IL21R (又名o21R)
<400> 21
Met Ala Thr Ile Ala Leu Pro Trp Ser Leu Ser Leu Tyr Val Phe Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Thr Pro Trp Ala Ser Ala Ala Val Lys Asn Cys Ser
20 25 30
His Leu Glu Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Val Ser Cys Met Trp
35 40 45
Ser His Glu Glu Ala Leu Asn Val Thr Thr Cys His Val His Ala Lys
50 55 60
Ser Asn Leu Arg His Trp Asn Lys Thr Cys Glu Leu Thr Leu Val Arg
65 70 75 80
Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ser Phe Pro Glu Ser
85 90 95
Gln Ser Leu Thr Ser Val Asp Leu Leu Asp Ile Asn Val Val Cys Trp
100 105 110
Glu Glu Lys Gly Trp Arg Arg Val Lys Thr Cys Asp Phe His Pro Phe
115 120 125
Asp Asn Leu Arg Leu Val Ala Pro His Ser Leu Gln Val Leu His Ile
130 135 140
Asp Thr Gln Arg Cys Asn Ile Ser Trp Lys Val Ser Gln Val Ser Asp
145 150 155 160
Phe Ile Glu Pro Tyr Leu Glu Phe Glu Ala Arg Arg Arg Leu Leu Gly
165 170 175
His Ser Trp Glu Asp Ala Ser Val Leu Ser Leu Lys Gln Arg Gln Gln
180 185 190
Trp Leu Phe Leu Glu Met Leu Ile Pro Ser Thr Ser Tyr Glu Val Gln
195 200 205
Val Arg Val Lys Ala Gln Arg Asn Asn Thr Gly Thr Trp Ser Pro Trp
210 215 220
Ser Gln Pro Leu Thr Phe Arg Thr Arg Pro Ala Gly Glu Pro Glu Ala
225 230 235 240
Gly Trp Asp Pro His Met Leu Leu Leu Leu Ala Val Leu Ile Ile Val
245 250 255
Leu Val Phe Met Gly Leu Lys Ile His Leu Pro Trp Arg Leu Trp Lys
260 265 270
Lys Ile Trp Ala Pro Val Pro Thr Pro Glu Ser Phe Phe Gln Pro Leu
275 280 285
Tyr Arg Glu His Ser Gly Asn Phe Lys Lys Trp Val Asn Thr Pro Phe
290 295 300
Thr Ala Ser Ser Ile Glu Leu Val Pro Gln Ser Ser Thr Thr Thr Ser
305 310 315 320
Ala Leu His Leu Ser Leu Tyr Pro Ala Lys Glu Lys Lys Phe Pro Gly
325 330 335
Leu Pro Gly Leu Glu Glu Gln Leu Glu Cys Asp Gly Met Ser Glu Pro
340 345 350
Gly His Trp Cys Ile Ile Pro Leu Ala Ala Gly Gln Ala Val Ser Ala
355 360 365
Tyr Ser Glu Glu Arg Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr
370 375 380
Val Thr Val Gly Asp Ala Glu Gly Leu Cys Val Trp Pro Cys Ser Cys
385 390 395 400
Glu Asp Asp Gly Tyr Pro Ala Met Asn Leu Asp Ala Gly Arg Glu Ser
405 410 415
Gly Pro Asn Ser Glu Asp Leu Leu Leu Val Thr Asp Pro Ala Phe Leu
420 425 430
Ser Cys Gly Cys Val Ser Gly Ser Gly Leu Arg Leu Gly Gly Ser Pro
435 440 445
Gly Ser Leu Leu Asp Arg Leu Arg Leu Ser Phe Ala Lys Glu Gly Asp
450 455 460
Trp Thr Ala Asp Pro Thr Trp Arg Thr Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser
465 470 475 480
Glu Ser Glu Ala Gly Ser Pro Pro Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp
485 490 495
Ser Gly Phe Ala Gly Ser Asp Cys Gly Ser Pro Val Glu Thr Asp Glu
500 505 510
Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val Val Arg Thr Pro Pro
515 520 525
Pro Val Asp Ser Gly Ala Gln Ser Ser
530 535

Claims (50)

1.一种用于选择性激活细胞中的受体的系统，所述系统包括：
(a)经修饰的免疫细胞，其包括：
(i)正交嵌合细胞因子受体，和
(ii)至少一种嵌合抗原受体(CAR)，和
(b)包括编码正交IL2细胞因子的核酸序列的溶瘤腺病毒载体，
其中所述正交嵌合细胞因子受体包括正交IL2受体(oIL2R)的胞外结构域和非IL2R的细胞因子受体的胞内信号传导结构域。
2.根据权利要求1所述的系统，其中oIL2R的胞外结构域是正交IL2受体β(oIL2Rb)的胞外结构域。
3.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述正交嵌合细胞因子受体的胞内信号传导结构域包括IL9R胞内信号传导结构域。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的系统，其中所述IL9R胞内信号传导结构域是IL9R-α(IL9Ra)胞内信号传导结构域。
5.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域。
6.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述抗原结合结构域选自全长抗体或其抗原结合片段、Fab、单链可变片段(scFv)或单域抗体。
7.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述抗原结合结构域靶向肿瘤抗原。
8.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述肿瘤抗原选自CD19、CD20、HER2、NY-ES0-1、MUC1、CD123、FLT3、B7-H3、CD33、IL1RAP、CLL1(CLEC12A)PSA、CEA、VEGF、VEGF-R2、CD22、ROR1、间皮素、c-Met、糖脂F77、FAP、EGFRvIII、MAGE A3、5T4、WT1、KG2D配体、叶酸受体(FRa)和Wnt1抗原。
9.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述抗原结合结构域是scFv。
10.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述抗原结合结构域是抗间皮素scFv。
11.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述CAR的胞内结构域包括选自TNFR超家族中蛋白质、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C和B7-H3(CD276)中的蛋白质或其变体的共刺激结构域，或源自杀伤性免疫球蛋白样受体(KIR)的胞内结构域。
12.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述CAR的胞内结构域包括选自人CD3ζ链(CD3ζ)、FcγRIII、FcsRI、Fc受体的细胞质尾部、带有细胞质受体的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)、TCRζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的蛋白质或其变体的胞内信号传导结构域。
13.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中：
(a)所述正交嵌合细胞因子受体包括oIL2Rb的胞外结构域和IL9Ra的胞内信号传导结构域，和
(b)所述CAR包括抗间皮素抗原结合结构域。
14.一种治疗受试者中的癌症的方法，其包括：
(a)向所述受试者施用有效量的经修饰的免疫细胞或其前体(经修饰的免疫细胞群)，其包括：
(i)正交嵌合细胞因子受体，和
(ii)至少一种CAR，和
(b)向所述受试者施用包括编码正交IL2细胞因子的核酸序列的溶瘤腺病毒载体；
其中所述正交嵌合细胞因子受体包括正交IL2受体(oIL2R)的胞外结构域和非IL2R的细胞因子受体的胞内信号传导结构域。
15.根据权利要求14所述的方法，其中oIL2R的胞外结构域是正交IL2受体β(oIL2Rb)的胞外结构域。
16.权利要求14或15所述的方法，其中所述正交嵌合细胞因子受体的胞内信号传导结构域包括IL9R胞内信号传导结构域。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述IL9R胞内信号传导结构域是IL9R-α(IL9Ra)胞内信号传导结构域。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域选自全长抗体或其抗原结合片段、Fab、单链可变片段(scFv)或单域抗体。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域靶向肿瘤抗原。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肿瘤抗原选自CD19、CD20、HER2、NY-ES0-1、MUC1、CD123、FLT3、B7-H3、CD33、IL1RAP、CLL1(CLEC12A)PSA、CEA、VEGF、VEGF-R2、CD22、ROR1、间皮素、c-Met、糖脂F77、FAP、EGFRvIII、MAGE A3、5T4、WT1、KG2D配体、叶酸受体(FRa)和Wnt1抗原。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域是scFv。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域是抗间皮素scFv。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CAR的胞内结构域包括选自TNFR超家族中蛋白质、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C和B7-H3(CD276)中的蛋白质或其变体的共刺激结构域，或源自杀伤性免疫球蛋白样受体(KIR)的胞内结构域。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CAR的胞内结构域包括选自人CD3ζ链(CD3ζ)、FcγRIII、FcsRI、Fc受体的细胞质尾部、带有细胞质受体的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)、TCRζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的蛋白质或其变体的胞内信号传导结构域。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：
(a)所述正交嵌合细胞因子受体包括oIL2Rb的胞外结构域和IL9Ra的胞内信号传导结构域，和
(b)所述CAR包括抗间皮素抗原结合结构域。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞群呈现干细胞记忆(Tscm)特征以及改善的运输和效应功能，从而治疗所述癌症。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用所述载体包括瘤内注射。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症选自胰腺癌和黑素瘤。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述胰腺癌是胰腺导管腺癌。
31.一种用于选择性激活细胞中的受体的系统，所述系统包括：
(a)经修饰的免疫细胞，所述细胞经工程化以表达：
(i)正交嵌合细胞因子受体，和
(ii)至少一种T细胞受体(TCR)，和
(b)包括编码正交IL2细胞因子的核酸序列的溶瘤腺病毒载体，
其中所述正交嵌合细胞因子受体包括正交IL2受体(oIL2R)的胞外结构域和非IL2R的细胞因子受体的胞内信号传导结构域。
32.根据权利要求31所述的系统，其中oIL2R的胞外结构域是正交IL2受体β(oIL2Rb)的胞外结构域。
33.根据权利要求31或32所述的系统，其中所述正交嵌合细胞因子受体的胞内信号传导结构域包括IL9R胞内信号传导结构域。
34.根据权利要求31-33中任一项所述的系统，其中所述IL9R胞内信号传导结构域是IL9R-α(IL9Ra)胞内信号传导结构域。
35.根据权利要求31-34中任一项所述的系统，其中所述TCR靶向肿瘤抗原。
36.根据权利要求31-35中任一项所述的系统，其中所述TCR靶向gp100黑素瘤抗原或NYESO1。
37.根据权利要求31-36中任一项所述的系统，其中所述TCR是pmel-1TCR或NYESO1特异性TCR。
38.根据权利要求31-37中任一项所述的系统，其中：
(a)所述正交嵌合细胞因子受体包括oIL2Rb的胞外结构域和IL9Ra的胞内信号传导结构域，和
(b)所述TCR是pmel-1TCR或NYESO1特异性TCR。
39.一种治疗受试者中的癌症的方法，其包括：
(a)向所述受试者施用有效量的经修饰的免疫细胞或其前体(经修饰的免疫细胞群)，其经修饰以表达：
(i)正交嵌合细胞因子受体，和
(ii)至少一种T细胞受体(TCR)，和
(b)向所述受试者施用包括编码正交IL2细胞因子的核酸序列的溶瘤腺病毒载体；
其中所述正交嵌合细胞因子受体包括正交IL2受体(oIL2R)的胞外结构域和非IL2R的细胞因子受体的胞内信号传导结构域。
40.根据权利要求39所述的方法，其中oIL2R的胞外结构域是正交IL2受体β(oIL2Rb)的胞外结构域。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述正交嵌合细胞因子受体的胞内信号传导结构域包括IL9R胞内信号传导结构域。
42.根据权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述IL9R胞内信号传导结构域是IL9R-α(IL9Ra)胞内信号传导结构域。
43.根据权利要求39-42中任一项所述的方法，其中所述TCR靶向肿瘤抗原。
44.根据权利要求39-43中任一项所述的方法，其中所述TCR靶向gp100黑素瘤抗原或NYESO1。
45.根据权利要求39-44中任一项所述的方法，其中所述TCR是pmel-1TCR或NYESO1特异性TCR。
46.根据权利要求39-45中任一项所述的方法，其中：
(a)所述正交嵌合细胞因子受体包括oIL2Rb的胞外结构域和IL9Ra的胞内信号传导结构域，和
(b)所述TCR是pmel-1TCR或NYESO1特异性TCR。
47.根据权利要求39-46中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞群呈现干细胞记忆(Tscm)特征以及改善的运输和效应功能，从而治疗所述癌症。
48.根据权利要求39-47中任一项所述的方法，其中施用所述载体包括瘤内注射。
49.根据权利要求39-48中任一项所述的方法，其中所述癌症选自胰腺癌和黑素瘤。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述胰腺癌是胰腺导管腺癌。
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