CN110678190A - 保护移植的组织免受排斥的方法 - Google Patents

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Abstract

本本发明包括用于HLA‑A2特异性嵌合抗原受体(CAR)的组合物和方法。在某些实施方式，HLA‑A2特异性CAR在T调节细胞上表达。在某些实施方式，HLA‑A2特异性CAR保护移植的组织免受排斥。

Description

保护移植的组织免受排斥的方法
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请享有2017年3月28日提交的美国临时专利申请号62/477,815的优先权，其全部内容通过引用并入本文
背景技术
当受体的免疫系统攻击移植的组织或器官时，会发生移植物排斥。排斥通常由受体中存在的识别供体同种异体抗原或异种抗原的同种异体反应性T细胞介导。宿主T细胞可以识别同种异体移植人白细胞抗原(HLA)或相关的结合肽。同种异体反应性T细胞由表达同种异体MHC和共刺激活性的供体抗原呈递细胞(APC)刺激。同种异体反应性CD4+T细胞产生加剧对同种异体抗原的溶细胞CD8应答的细胞因子。通常用免疫抑制药物如泼尼松、硫唑嘌呤和环孢霉素A处理患者中不期望的同种异体反应性T细胞反应(同种异体排斥、移植物抗宿主疾病)。不幸的是，这些药物通常需要在患者的生命周期内维持，并且它们具有多种危险的副作用，包括广义的免疫抑制。
外周血含有少量的T细胞淋巴细胞，这些细胞表达T调节表型(“Treg”)，即对CD4和CD25抗原均为阳性。Treg细胞有几个子集。调节细胞的一个子集在胸腺中发育。胸腺来源的Treg细胞通过不依赖细胞因子的机制起作用，该机制涉及细胞与细胞的接触。它们对于诱导和维持自我耐受性以及预防自身免疫性是必不可少的。这些调节细胞阻止了逃避胸腺缺失或识别胸腺外抗原的自身反应性T细胞的活化和增殖，因此它们对于体内稳态和免疫调节以及保护宿主抵抗自身免疫性发展至关重要。因此，免疫调节性CD4+CD25+T细胞通常被称为“专业抑制细胞”。
存在对抑制体内同种异体应答并保护移植的组织免受排斥的新的组合物和方法的需求。本发明满足了该需求。
发明内容
如本文所描述，本发明涉及利用HLA-A2特异性CAR保护移植的组织免受排斥的组合物和方法。
在一个方面，本发明包括修饰的免疫细胞或其前体细胞，其包含对HLA-A2具有亲和力的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，CAR包含HLA-A2结合结构域和CD8铰链结构域。
本发明的另一方面包括修饰的免疫细胞或其前体细胞，其包含对HLA-A2具有亲和力的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，CAR包含HLA-A2结合结构域、CD8铰链结构域、CD8信号肽、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ细胞内结构域。
本发明是基于以下发现：包含本发明的HLA-A2特异性嵌合抗原受体(CAR)的基因修饰的免疫细胞表明对HLA-A2、HLA-A28和/或HLA-A68的特异性。本发明还基于以下发现：包含主题HLA-A2特异性CAR的基因修饰的调节T细胞表明有效的免疫抑制效果。
因此，在某些方面，本发明提供修饰的免疫细胞或其前体细胞，其包含对HLA-A2具有亲和力的嵌合抗原受体(CAR)。
在一个方面，提供了修饰的免疫细胞或其前体细胞，其包含对HLA-A2具有亲和力的嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR包含HLA-A2结合结构域。
在某些示例性实施方式中，CAR进一步包含信号肽。
在某些示例性实施方式中，信号肽是CD8信号肽。
在某些示例性实施方式中，CAR进一步包含铰链结构域。
在某些示例性实施方式中，铰链结构域是CD8铰链结构域。
在某些示例性实施方式中，HLA-A2结合结构域选自抗体、Fab、或scFv。
在某些示例性实施方式中，HLA-A2结合结构域包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:3中叙述的氨基酸序列。
在某些示例性实施方式中，HLA-A2结合结构域包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:8中叙述的氨基酸序列。
在某些示例性实施方式中，HLA-A2结合结构域包含间隔区序列。
在某些示例性实施方式中，HLA-A2结合结构域包含SEQ ID NO:1中叙述的氨基酸序列。
在某些示例性实施方式中，CAR包含跨膜结构域，和细胞内结构域。
在某些示例性实施方式中，跨膜结构域包含CD28跨膜结构域。
在某些示例性实施方式中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:17中叙述的氨基酸序列。
在某些示例性实施方式中，细胞内结构域包含CD28细胞内结构域，和CD3ζ细胞内结构域。
在某些示例性实施方式中，CD28细胞内结构域包含SEQ ID NO:19中叙述的氨基酸序列。
在某些示例性实施方式中，CD3ζ细胞内结构域包含SEQ ID NO:21中叙述的氨基酸序列。
在某些示例性实施方式中，CD8铰链包含SEQ ID NO:15中叙述的氨基酸序列。
在某些示例性实施方式中，CD8信号肽包含SEQ ID NO:13中叙述的氨基酸序列。
在某些示例性实施方式中，CAR包含SEQ ID NO:23中叙述的氨基酸序列。
在某些示例性实施方式中，其中HLA-A2结合结构域与HLA-A28交叉反应。
在某些示例性实施方式中，HLA-A2结合结构域与HLA-A68交叉反应。
在某些示例性实施方式中，修饰的细胞是修饰的调节T细胞。
在某些示例性实施方式中，修饰的细胞是自体细胞。
在某些示例性实施方式中，修饰的细胞来源自人。
在另一方面，提供了修饰的细胞或其前体细胞，其包含对HLA-A2具有亲和力的嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR包含CD8信号肽、HLA-A2结合结构域、CD8铰链结构域、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、和CD3ζ细胞内结构域。
在某些示例性实施方式中，CAR包含SEQ ID NO:23中叙述的氨基酸序列。
在某些示例性实施方式中，其中HLA-A2结合结构域与HLA-A28交叉反应。
在某些示例性实施方式中，HLA-A2结合结构域与HLA-A68交叉反应。
在某些示例性实施方式中，修饰的细胞是修饰的调节T细胞。
在某些示例性实施方式中，修饰的细胞是自体细胞。
在某些示例性实施方式中，修饰的细胞来源自人。
在另一方面，提供了分离的核酸，其包含编码对HLA-A2具有亲和力的嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其中CAR包含HLA-A2结合结构域。
在某些示例性实施方式中，CAR进一步包含信号肽。
在某些示例性实施方式中，信号肽是CD8信号肽。在某些示例性实施方式中，CAR进一步包含铰链结构域。
在某些示例性实施方式中，铰链结构域是CD8铰链结构域。
在某些示例性实施方式中，提供了分离的核酸，其包含编码对HLA-A2具有亲和力的嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其中CAR包含CD8信号肽、HLA-A2结合结构域、和CD8铰链结构域。
在某些示例性实施方式中，CAR包含CD28跨膜结构域。
在某些示例性实施方式中，CAR包含CD28共刺激结构域。
在某些示例性实施方式中，CAR包含CD3ζ细胞内结构域。
在某些示例性实施方式中，分离的核酸包含SEQ ID NO:24中叙述的核酸序列。在另一方面，提供了包含本文描述的方面的分离的核酸的表达构建体。
在某些示例性实施方式中，表达构建体包含是EF-1α启动子。
在某些示例性实施方式中，表达构建体包含rev应答元件(RRE)。
在某些示例性实施方式中，表达构建体包含土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。
在某些示例性实施方式中，表达构建体包含cPPT序列。
在某些示例性实施方式中，表达构建体包含EF-1α启动子、rev应答元件(RRE)、土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)、和cPPT序列。
在某些示例性实施方式中，表达构建体是病毒载体，其选自反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、和腺伴随病毒载体。
在某些示例性实施方式中，表达构建体是慢病毒载体.
在某些示例性实施方式中，慢病毒载体是自灭活慢病毒载体。
在另一方面，提供了产生本文描述的方面的修饰的免疫细胞或其前体细胞的方法，包含将本文描述的方面的核酸，或本文描述的方面的表达构建体引入免疫细胞。
在另一方面，提供了在有需要的对象中实现免疫抑制效果的方法，包含向对象施用有效量的本文描述的方面的修饰的免疫细胞或其前体细胞。
在某些示例性实施方式中，对象遭受同种异体应答和/或自身免疫应答。
在某些示例性实施方式中，同种异体应答或自身免疫应答在组织移植之后，并且其中所述方法抑制(suppress)、阻断或压制(inhibit)对象中的移植物抗宿主疾病。
在某些示例性实施方式中，修饰的细胞是修饰的调节T细胞。
在某些示例性实施方式中，修饰的细胞是自体细胞。
在某些示例性实施方式中，修饰的细胞来源自人。
在另一方面，提供了在有需要的对象中实现预防性治疗效果的方法，其包含在同种异体应答或自身免疫应答开始之前，向对象施用有效量的本文描述的方面的修饰的免疫细胞或其前体细胞。
在某些示例性实施方式中，同种异体应答或自身免疫应答在组织移植之后，并且其中所述方法抑制、阻断或压制对象中的移植物抗宿主疾病。
在某些示例性实施方式中，修饰的细胞是修饰的调节T细胞。
在某些示例性实施方式中，修饰的细胞是自体细胞。
在某些示例性实施方式中，修饰的细胞来源自人。
在另一方面，提供了在有需要的患有同种异体应答或自身免疫应答的对象中实现免疫抑制效果的方法，包含向对象施用包含对HLA-A2具有亲和力的嵌合抗原受体(CAR)的修饰的调节T细胞，其中CAR包含CD8信号肽、HLA-A2结合结构域、CD8铰链结构域、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、CD3ζ细胞内结构域。
在某些示例性实施方式中，同种异体应答或自身免疫应答在组织移植之后，并且其中所述方法抑制、阻断或压制对象中移植物抗宿主疾病。
在某些示例性实施方式中，修饰的细胞是修饰的调节T细胞。
在某些示例性实施方式中，修饰的细胞是自体细胞。
在某些示例性实施方式中，修饰的细胞来源自人。
在另一方面，提供了治疗有需要的对象中糖尿病的方法，包含向对象施用有效量的本文描述的方面的修饰的免疫细胞或其前体细胞。
在某些示例性实施方式中，糖尿病是I型糖尿病。
在某些示例性实施方式中，修饰的细胞是修饰的调节T细胞。
在某些示例性实施方式中，修饰的细胞是自体细胞。
在某些示例性实施方式中，修饰的细胞来源自人。
在另一方面，提供了治疗有需要的对象中糖尿病的方法，包含向对象施用包含对HLA-A2具有亲和力的嵌合抗原受体(CAR)的修饰的调节T细胞，其中CAR包含CD8信号肽、HLA-A2结合结构域、CD8铰链结构域、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、和CD3ζ细胞内结构域。
在某些示例性实施方式中，糖尿病是I型糖尿病。
在某些示例性实施方式中，修饰的细胞是修饰的调节T细胞。
在某些示例性实施方式中，修饰的细胞是自体细胞。
在某些示例性实施方式中，修饰的细胞来源自人。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的具体实施方式的以下详细描述。为了说明本发明，在附图中示出了示例性实施方式。然而，应当理解，本发明不限于附图中所示实施方式的精确布置和手段。
图1是HLA-A2特异性CAR的示意图，当在人T调节细胞上表达时，其介导抗原特异性抑制。
图2是说明初级人CD8+T细胞的一组曲线，该初级人CD8+T细胞在OPTI-MEM还原的血清培养基中洗涤三次，以100x106个细胞/mL重悬浮，与10μg的编码RNA的体外转录的HLA-A2特异性CAR混合，并电穿孔。十六小时后，利用抗生物素-SP(长间隔区)AffiniPure山羊抗人IgG，F(ab')片段特异性，随后链酶亲和素-PE和抗人CD8染色细胞。在2％低聚甲醛中固定并在LSRII流式细胞仪上进行分析。
图3是描绘如图2中进行电穿孔并在GolgiPlug蛋白转运抑制剂存在的情况下以与不同HLA单元型的人供体PBMC为3:1比进行混合6小时的细胞的一组曲线。对细胞进行固定、透化并用α-IL-2和α-TNF-α抗体染色。
图4是说明经由CD4+RosetteSep，随后CD25阳性磁选择从人脐带血供体分离的调节T细胞的一对曲线。利用α-CD3/α-CD28珠刺激Treg并在具有5％的含有1X GlutaMAX和300IU/mL IL-2的人AB血清的XVIVO15中生长。在初始刺激后四十八小时，慢病毒转到Treg，以表达3PF12-28z CAR或不相关CAR。当在第14天停止处理(rest down)细胞时，通过以8:1:0.5(Teff:Treg:K562)的比例混合Treg与表达A2-SL9 WT TCR(HIV-特异性TCR)的CFSE标记的同种异体T细胞和转基因表达HLA-A2的K562细胞测定抗原特异性抑制。为了探测非特异性抑制功能，使Treg与CFSE标记的同种异体PBMC和α-CD3刺激珠以8:1:3(Teff:Treg:珠)的比混合。在5天细胞培养后，在CD8+T细胞中的CFSE稀释。
图5描绘了应答3PF12-28z或CD19-28z CAR转导的T细胞，或非转导的阴性对照T细胞的人C-肽水平。
具体实施方式
定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管在实践中可以使用与本文描述的那些相似或等同的任意方法和材料来测试本发明，但是本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。
还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，而无意于进行限制。
本文使用冠词“一个”和“一种”，指的是一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。举例而言，“一个要素”意思是一个要素或多于一个要素。
如本文使用的“约”，当指的是可测量的值诸如量、时间期间等时，意思是涵盖从规定值的±20％或±10％、更优选地±5％、甚至更优选地±1％、和还更优选地±0.1％的变化，只要这样的变化适于进行公开的方法。
如本文所用，“活化”是指已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。活化还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应物功能相关。术语“活化的T细胞”尤其是指正在进行细胞分裂的T细胞。
如本文所用，“减轻”疾病意指降低疾病的一种或多种症状的严重性。
“同种异体的”指的是源自相同物种的不同动物的移植物。
“同种异体抗原”是指仅存在于物种的某些个体中并且能够由缺乏它的个体诱导同种异体抗体产生的抗原。
如本文使用的术语“抗体”指的是与抗原特异性地结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是从自然来源或从重组来源衍生的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括，例如，多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2、以及单链抗体(scFv)和人源化抗体(Harlow等人,1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,NY；Harlow等人,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。
术语“抗体片段”指的是完整抗体的一部分，并且指的是完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段，线性抗体，scFv抗体，和由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文使用的“抗体重链”指的是以它们自然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较大的链。
如本文使用的“抗体轻链”指的是以它们自然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较小的链。α和β轻链指的是两种主要的抗体轻链同种型。
如本文使用的术语“合成抗体”的意思是使用重组DNA技术生成的抗体，比如，例如，如本文描述的由噬菌体表达的抗体。该术语也应当解释为意思是已经由DNA分子(其编码抗体并且该DNA分子表达抗体蛋白)，或规定抗体的氨基酸序列的合成生成的抗体，其中DNA或氨基酸序列已经使用本领域可获得和熟知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
如本文使用的术语“抗原”或“Ag”被定义为激发免疫应答的分子。此免疫应答可以涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或二者。技术人员将理解任意大分子(实际上包括所有蛋白质或肽)可以充当抗原。另外，抗原可以源自重组或基因组DNA。技术人员将理解任意DNA(包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列)因此编码如本文使用的该术语“抗原”。另外，本领域技术人员将理解抗原不必唯一地由基因的全长核苷酸序列编码。容易显而易见的是本发明包括但不限于多于一个基因的部分核苷酸序列的用途，并且这些核苷酸序列以不同的组合布置以引起期望的免疫应答。而且，技术人员将理解抗原完全不必由“基因”编码。容易显而易见的是抗原可以被生成、合成或可以源自生物学样品。这样的生物学样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物学流体。
如本文使用的，术语“自体的”意思是指源自相同个体的任意物质，其随后被再引入该个体。
“同种异体的”指的是源自相同物种的不同动物的任意材料。
如本文使用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”指的是被工程化以在免疫效应细胞上表达并特异性地结合抗原的人工T细胞受体。CAR可以被用作使用过继性细胞转移的疗法。T细胞从患者移出并且被修饰，使得它们表达特异于特定形式的抗原的受体。在一些实施方式中，CAR对选定目标，例如人白细胞抗原(HLA)具有特异性。CAR还可以包括细胞内活化结构域、跨膜结构域和细胞外结构域，该细胞外结构域包括抗原结合区。在一些方面，CAR包括细胞外结构域、CD28跨膜结构域和细胞内结构域、和CD3ζ结构域，该细胞外结构域包括融合至CD8铰链结构域的抗HLA结合结构域。
术语“切割”是指(诸如在核酸分子的主链中的)共价键的断裂或肽键的水解。切割可以通过多种方法引发，包括但不限于磷酸二酯键的酶促水解或化学水解。单链切割和双链切割都是可能的。双链切割可作为两个不同的单链切割事件的结果而发生。DNA切割可导致产生平头末端或交错末端。在某些实施方式中，融合多肽可用于靶向切割的双链DNA。
如本文使用的，术语“保守序列修饰”意图指的是如此氨基酸修饰，其不显著地影响或改变包含该氨基酸序列的抗体的结合特性。这样的保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术引入本发明的抗体，比如定点诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸置换是其中氨基酸残基被替换为具有类似侧链的氨基酸残基的置换。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支化侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因而，抗体的CDR区内的一种或多种氨基酸残基可以被替换为来自相同侧链家族的其它氨基酸残基，并且可以使用本文描述的功能性试验测试改变的抗体结合抗原的能力。
如本文使用的术语“共刺激配体”包括特异性地结合T细胞上的关联共刺激分子的抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等)上的分子，从而除通过例如将TCR/CD3复合体与使用肽负载的MHC分子结合提供的初级信号之外，还提供了介导T细胞应答的信号，该T细胞应答包括但不限于增殖、活化、分化等。共刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型的共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性地结合的配体。共刺激配体也涵盖，特别是与存在于T细胞上的共刺激分子特异性地结合的抗体，比如，但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性地结合的配体。
“共刺激分子”指的是与共刺激配体特异性地结合从而介导通过T细胞的共刺激应答(诸如但不限于增值)的T细胞上的关联结合配偶体。共刺激分子包括但不限于MHCC I类分子、BTLA和Toll配体受体。
如本文使用的“共刺激信号”指的是与初级信号(比如TCR/CD3连接，)组合导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。
“疾病”是动物的如此健康状态，其中动物不能维持稳态，并且其中如果不改善疾病，则动物的健康继续恶化。相比之下，动物中的“紊乱”是如此健康状态，其中动物能够维持稳态，但是其中动物的健康状态与它没有处于该紊乱时相比不太有利。保持不治疗，紊乱不必然引起动物健康状态的进一步降低。
“供体抗原”是指要移植到受体中的供体组织表达的抗原。
“受体抗原”是指对供体抗原的免疫应答的靶标。
如本文所用，术语“下调”是指减少或消除一个或多个基因的基因表达。
“有效量”或“治疗有效量”在本文可交换地使用，并且指的是对实现具体的生物学结果或提供治疗或预防益处有效的如本文描述的化合物、制剂、材料或组合物的量。这样的结果可以包括但不限于与在没有本发明组合物的情况下检测到的免疫应答相比，当施用于哺乳动物时引起可检测水平的免疫抑制或耐受性的量。免疫应答可以通过多种本领域公认的方法容易地评估。本领域技术人员将理解，本文所施用的组合物的量是变化的，并且可以基于许多因素来容易地确定，诸如所治疗的疾病或病症，所治疗的哺乳动物的年龄和健康病症以及物理病症，疾病的严重程度，所施用的特定化合物等。
“编码”指的是多核苷酸比如基因、cDNA或mRNA中的核苷酸的特异性序列充当模板来合成生物学过程中的其它聚合物和大分子的固有性质，该聚合物和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一种和由其产生的生物学性质。因而，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物学系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。其核苷酸序列同一于mRNA序列并且通常在序列表中提供的编码链，和用作基因或cDNA转录的模板的非编码链二者，可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。
如本文使用的“内源的”指的是来自生物体、细胞、组织或系统内部或在生物体、细胞、组织或系统内产生的任意物质。
如本文所用，术语“表位”定义为抗原上的小化学分子，其可引发免疫应答、诱导B和/或T细胞应答。抗原可以具有一个或多个表位。大多数抗原具有许多表位；即它们是多价的。通常，表位的大小约为10个氨基酸和/或糖。优选地，表位为约4-18个氨基酸，更优选地约5-16个氨基酸，和甚至更优选地6-14个氨基酸，更优选地约7-12个，和最优选地约8-10个氨基酸。本领域技术人员理解，通常整体的三维结构而不是分子的特定线性序列是抗原特异性的主要标准，并因此将一个表位与另一个表位区分开。基于本公开，本发明中使用的肽可以是表位。
如本文使用的，术语“外源的”指的是从生物体、细胞、组织或系统外部引入或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任意物质。
如本文使用的术语“扩展”指的是数目的增加，如T细胞数目的增加。在一个实施方式中，离体扩展的T细胞的数目相对于培养物中原始存在的数目增加。在另一个实施方式中，离体扩展的T细胞的数目相对于培养物中的其它细胞类型的数目增加。如本文使用的术语“离体”指的是已经从活的生物体(例如，人)移出，并且在生物体外(例如，在培养皿、试管或生物反应器中)繁殖的细胞。
如本文使用的术语“表达”被定义为由它的启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
“表达载体”指的是包括重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。表达载体包括所有本领域已知的那些，比如并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，仙台病毒、慢病毒、反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
“HLA-A2”是指HLA-A血清型组内的人白细胞抗原。HLA-A是MHC I类细胞表面受体的三种主要类型之一。MHC I类分子是在细胞表面上发现的主要组织相容性复合体(MHC)分子的两个主要类别之一。MHC I类分子的功能是从细胞内向免疫细胞(例如细胞毒性T细胞)展示非自身蛋白的肽片段，导致触发针对所显示的特定非自身抗原的来自免疫系统的立即应答。
“HLA-A28”是指HLA-A血清型组内的人白细胞抗原。
“HLA-A68”是指HLA-A血清型组内的人白细胞抗原。α“A”链由HLA-A*68等位基因组编码，和β链由β-2微球蛋白(B2M)基因座编码。
如本文使用的“同源的”指的是两个聚合物分子之间，例如，两个核酸分子(比如，两个DNA分子或两个RNA分子)之间，或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个分子二者中的亚基位置被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子的每个中的位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置处是同源的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置的数目的直接函数；例如，如果两个序列中的一半位置(例如，长度为十个亚单位的聚合物中的五个位置)是同源的，则两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同源的，则两个序列是90％同源的。
非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(比如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原-结合子序列)，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。就大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被替换为来自非人物种(供体抗体)比如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基，其具有期望的特异性、亲和力和能力。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被替换为对应的非人残基。另外，人源化抗体可以包括既没有在受体抗体中也没有在输入的CDR或框架序列中发现的残基。进行这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。一般而言，人源化抗体将包括基本上所有的至少一种和通常两种可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体最佳地还将包括至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的。进一步的细节参见Jones等人,Nature,321:522-525,1986；Reichmann等人,Nature,332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992。
“全人(fully human)”指的是免疫球蛋白，比如抗体，其中整个分子具有人起源或由同一于人形式的抗体的氨基酸序列构成。
如本文使用的“同一性”指的是两个聚合物分子之间，特别是两个氨基酸分子之间，比如，两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个氨基酸序列在相同的位置处具有相同的残基时；例如，如果两个多肽分子中的每个中的位置均被精氨酸占据，则它们在该位置处是同一的。在比对中，两个氨基酸序列在相同的位置处具有相同残基的同一性或程度经常表达为百分数。两个氨基酸序列之间的同一性是匹配或同一位置的直接函数；例如，如果两个序列中的一半位置(例如，十个氨基酸长度的聚合物中的五个位置)是同一的，则两个序列是50％同一的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同一的，则两个氨基酸序列是90％同一的。
如本文使用的术语“免疫球蛋白”或“Ig”被定义为起抗体作用的一类蛋白质。由B细胞表达的抗体有时被称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。包括在此类蛋白质中的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于身体分泌物，比如唾液、泪液、母乳、胃肠分泌物和呼吸道与泌尿生殖道的粘液分泌物中的初次抗体。IgG是最常见的循环抗体。IgM是在大多数对象中的初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它在凝集、补体结合、和其它抗体应答中是最有效的免疫球蛋白，并且在抵御细菌和病毒方面是重要的。IgD是不具有已知抗体功能的免疫球蛋白，但是可以充当抗原受体。IgE是在暴露于过敏原之后，通过引起从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介体，介导速发过敏性的免疫球蛋白。
如本文使用的术语“免疫应答”被定义为当淋巴细胞将抗原分子鉴定为异物并诱发形成抗体和/或活化淋巴细胞以去除抗原时发生的对抗原的细胞应答。
术语“免疫刺激性”在本文中用于指增加总体免疫应答。
术语“免疫抑制性”在本文中用于指减少总体免疫应答。
如本文使用的，“指导材料”包括出版物、记录、图表、或任意其它可以用于传达本发明的组合物和方法的有用性的表达媒介。本发明的试剂盒的指导材料可以例如被附加至包含本发明的核酸、肽和/或组合物的容器，或与包含核酸、肽和/或组合物的容器一起运送。可选地，指导材料可以与容器分开地运送，目的是指导材料和化合物由接受者配合使用。
“分离的”意思是从自然状态改变或移出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是部分或完全与它的自然状态的共存物质分开的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或可以存在于非自然环境，比如，例如，宿主细胞。
如本文所用，术语“敲低”是指一种或多种基因的基因表达降低。
如本文所用，术语“敲除”是指消除一个或多个基因的基因表达。
如本文使用的“慢病毒”指的是反转录病毒科的一种属。在反转录病毒中慢病毒是唯一能够感染非分裂细胞的；它们可以递送显著量的遗传信息进入宿主细胞的DNA，因此它们是基因递送载体的最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV是慢病毒的所有实例。源自慢病毒的载体提供了实现显著水平的基因体内转移的手段。
如本文所用，术语“有限毒性”是指在体外或体内对健康细胞、非肿瘤细胞、非患病细胞、非靶细胞或此类细胞群表现出缺乏基本上负面的生物学作用、抗肿瘤作用或基本上负面的生理症状的本发明的肽、多核苷酸、细胞和/或抗体。
如本文使用的术语“修饰的”意思是本发明的分子或细胞的改变的状态或结构。分子可以以许多方式被修饰，包括化学地、结构地和功能地。细胞可以通过引入核酸被修饰。
如本文使用的术语“调节”意思是与不存在治疗或化合物的对象中的应答水平相比，和/或与在其它方面相同但未治疗的对象中的应答水平相比，介导对象中的应答水平中的可检测的增加或减少。该术语涵盖扰乱和/或影响天然信号或应答，从而介导对象优选地人中的有益的治疗性应答。
在本发明的背景下，使用常见核酸碱基的下列缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，和“U”指的是尿苷。
除非另外规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括是彼此的简并译本并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包括内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可以在一些译本中包含内含子(一个或多个)。
免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括，例如，皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)、或胸骨内注射，或输注技术。
如本文使用的术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。另外，核酸是核苷酸的聚合物。因而，如本文使用的核酸和多核苷酸是可交换的。本领域技术人员具有核酸是可以被水解为单体“核苷酸”的多核苷酸的一般知识。单体核苷酸可以被水解为核苷。如本文使用的多核苷酸包括但不限于通过本领域可获得的任意手段(非限制性地包括重组手段，即，使用普通克隆技术和PCRTM等从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列，和通过合成手段)获得的所有核酸序列。
如本文使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可交换地使用，并且指的是由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对可以包括蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括任意肽或蛋白质，该肽或蛋白质包括通过肽键相互接合的两个或更多个氨基酸。如本文使用的，该术语指的是短链，其在本领域中也通常被称为例如肽、寡肽和寡聚物；和较长链，其在本领域中通常被称为蛋白质，其具有许多类型。“多肽”包括例如生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
如本文所用，术语“自身抗原”定义为由宿主细胞或组织表达的抗原。自身抗原可以是肿瘤抗原，但是在某些实施方式中，自身抗原在正常细胞和肿瘤细胞中表达。技术人员将容易理解，自身抗原可能在细胞中过表达。
如本文使用的关于抗体的术语“特异性地结合”意思是识别特异性抗原但是基本上不识别或结合样品中的其它分子的抗体。例如，特异性地结合至来自一个物种的抗原的抗体也结合至来自一个或多个物种的该抗原。但是，这样的跨物种反应性本身不将抗体的类别改变为特异性的。在另一个实例中，特异性地结合至抗原的抗体也可以结合至抗原的不同等位基因形式。然而，这样的交叉反应性本身不将抗体的类别改变为特异性的。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可以关于抗体、蛋白质或肽与第二化学种类的相互作用使用，意思是相互作用依赖化学种类上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别和结合至特异性蛋白质结构，而不是一般地识别和结合至蛋白质。如果抗体特异于表位“A”，则在包含标示的“A”和抗体的反应中存在包含表位A(或游离的、未标示的A)的分子将降低结合至抗体的标示的A的量。
术语“刺激”意思是通过结合刺激分子(例如，TCR/CD3复合体)与其关联配体，从而介导信号转导事件(比如，但不限于经由TCR/CD3复合体的信号转导)诱导的初次应答。刺激可以介导某些分子的改变的表达，比如TGF-β的下调、和/或细胞骨架结构的再组织等。
“刺激分子”，作为本文使用的术语，意思是与存在于抗原呈递细胞上的关联刺激配体特异性地结合的T细胞上的分子。
如本文使用的“刺激配体”意思是如下配体：其当存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等)上时，可以与T细胞上的关联结合配偶体(在本文称为“刺激分子”)特异性地结合，从而介导T细胞的初次应答，其包括但不限于活化、起始免疫应答、增殖等。刺激配体在本领域是熟知的，并且涵盖，特别是使用肽、抗CD3抗体、超激动剂抗CD28抗体、和超激动剂抗CD2抗体负载的MHC I类分子。
术语“对象”意图包括其中可以引发免疫应答的活的生物体(例如，哺乳动物)。如其中使用的“对象”或“患者”可以是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括，例如，家畜和宠物，比如羊、牛、猪、犬、猫和鼠哺乳动物。优选地，对象是人。
如本文使用的，“基本上纯化的”细胞是大体上不含其它细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞也指的是已经与其它细胞类型(在其天然存在状态中与该其它细胞类型正常地相关联)分开的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群指的是均质细胞群。在其它情况下，此术语简单地指的是已经与如下细胞分开的细胞：在其天然状态中与该细胞正常地相关联。在一些实施方式中，在体外培养细胞。在其它实施方式中，不在体外培养细胞。
“靶标位点”或“靶标序列”指的是基因组核酸序列，其限定了在足以发生结合的条件下结合分子可以特异性地结合至的核酸的部分
如本文使用的，术语“T细胞受体”或“TCR”指的是响应于抗原的呈递参与T细胞的活化的膜蛋白的复合体。TCR负责识别结合至主要组织相容性复合体分子的抗原。TCR由α(α)和β(β)链的异二聚体组成，但是在一些细胞中，TCR由γ和δ(γ/δ)链构成。TCR可以以α/β和γ/δ形式存在，其是结构上相似的，但是具有独特的解剖学位置和功能。每条链由两个细胞外结构域(可变和恒定结构域)组成。在一些实施方式中，TCR可以在包括TCR的任意细胞上被修饰，包括，例如，辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞。
如本文使用的术语“治疗性的”意思是治疗和/或预防。治疗性效果通过疾病状态的阻抑、缓解或根除获得。
“移植物”是指要移植的生物相容性晶格或供体组织，器官或细胞。移植物的实例可以包括但不限于皮肤细胞或组织，骨髓和诸如心脏、胰腺、肾脏、肺和肝脏的实体器官。移植物还可以指要施用于宿主的任意材料。例如，移植物可以指核酸或蛋白质。
如本文使用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指的是如下过程：通过该过程外源性核酸被转移或引入宿主细胞。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代对象细胞和其子代。
“治疗”疾病，作为本文使用的术语，意思是降低对象经历的疾病或紊乱的至少一种迹象或症状的频率或严重度。
“载体”是物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可以被用于递送分离的核酸至细胞内部。众多载体在本领域是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物相关联的多核苷酸、质粒和病毒。因而，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应当解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，比如，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于仙台病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体等。
“异种的”指的是源自不同物种的动物的任意物质。
范围：遍及本公开内容，本发明的多个方面可以以范围格式呈现。应当理解范围格式的描述仅仅出于方便和简洁，并且不应当解释为对本发明的范围的僵硬限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，比如1至6的范围的描述应当被认为已经具体地公开了子范围比如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度，这均适用。
描述
本发明包括利用HLA-A2特异性CAR保护移植的组织免受排斥的组合物和方法。HLA-A2特异性CAR包含与HLA-A2、HLA-A28和/或HLA-A68结合的抗原结合结构域。当在人T调节细胞(Treg)上表达时，HLA-A2特异性CAR介导抗原特异性抑制。HLA-A2特异性CAR能够将T调节细胞重定向至HLA-A2，HLA-A28和/或HLA-A68表达组织并介导耐受性。
本发明包括HLA-A2特异性CAR及其在抑制同种异体应答中的用途。同种异体应答在例如器官移植过程中被同种异体移植物中普遍表达的供体-MHC I类分子激发。本发明基于以下发现：包含HLA-A2特异性CAR的调节T细胞能够以抗原特异性方式抑制同种异体应答。
嵌合抗原受体(CAR)
本发明提供用于修饰的免疫细胞或其前体细胞(如修饰的调节T细胞，其包含对HLA-A2具有亲和力的嵌合抗原受体(CAR))的组合物和方法。本发明的主题CAR包含抗原结合结构域(如，HLA-A2结合结构域)、跨膜结构域、和细胞内结构域。本发明的主题CAR可以任选地包含铰链结构域，和或信号肽。在一些实施方式中，信号肽是CD8信号肽。因此本发明的主题CAR包含抗原结合结构域(如，HLA-A2结合结构域)、铰链结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。在一些实施方式中本发明的主题CAR包含信号肽、抗原结合结构域(如，HLA-A2结合结构域)、铰链结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。在一些实施方式中，主题CAR的结构域中每个被连接体分开。
抗原结合结构域可以可操作地连接至CAR的另一个结构域，诸如跨膜结构域或细胞内结构域，两者均在本文其他地方描述，用于在细胞中表达。在一个实施方式中，编码抗原结合结构域的第一核酸序列可操作地连接至编码跨膜结构域的第二核酸，并进一步可操作地连接至编码细胞内结构域的第三核酸序列。
本文描述的抗原结合结构域可以与本文描述的任意跨膜结构域、本文描述的任意细胞内结构域或细胞质结构域、或本文描述的可以包括在本发明的CAR中的任意其他结构域组合。
在一个方面，本发明包括分离的HLA-A2特异性嵌合抗原受体(CAR)，其包含CD8信号肽、HLA-A2 VH结构域、间隔区序列、HLA-A2 VL结构域、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3-ζ细胞内结构域。在另一方面，本发明包括编码的HLA-A2特异性CAR的分离的核酸，其中CAR包含CD8信号肽、HLA-A2 VH结构域、间隔区序列、HLA-A2 VL结构域、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、和CD3-ζ细胞内结构域。本发明的另一方面包括分离的多肽，其包含CD8信号肽、HLA-A2 VH结构域、间隔区序列、HLA-A2 VL结构域、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、和CD3-ζ细胞内结构域。
本发明的另一方面包括基因修饰的T细胞，其包含编码HLA-A2特异性CAR的分离的核酸，其中CAR包含CD8信号肽、HLA-A2 VH结构域、间隔区序列、HLA-A2 VL结构域、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、和CD3-ζ细胞内结构域。在一些实施方式中，本发明的基因修饰的免疫细胞(如，T细胞)包含HLA-A2 CAR，其中CAR包含CD8信号肽、HLA-A2 VH结构域、间隔区序列、HLA-A2 VL结构域、CD8铰链、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、和CD3-ζ细胞内结构域。在一些实施方式中，本发明的基因修饰的免疫细胞(如，T细胞)或其前体细胞包含对HLA-A2具有亲和力的嵌合抗原受体(CAR)。CAR包含HLA-A2结合结构域、CD8铰链结构域、CD8信号肽、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、CD3ζ细胞内结构域。
在本发明的某些实施方式中，CAR由SEQ ID NO:24的核酸序列编码。在其它实施方式中，CAR包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
在某些实施方式，基因修饰的T细胞是T调节(Treg)细胞。
表1中可见各个结构域的序列。
表1
Figure BDA0002288634040000151
Figure BDA0002288634040000181
因此，主题CAR可以是对HLA-A2具有亲和力的CAR，其包含HLA-A2结合结构域，该HLA-A2包含SEQ ID NO:1中叙述的氨基酸序列。主题HLA-A2 CAR可以进一步包含铰链结构域，其包含SEQ ID NO:15中叙述的氨基酸序列。主题HLA-A2 CAR可以进一步包含跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:17中叙述的氨基酸序列。主题HLA-A2 CAR可以进一步包含细胞内结构域，其包含SEQ ID NO:17中叙述的氨基酸序列。主题HLA-A2 CAR可以包含SEQ ID NO:23中叙述的氨基酸序列。
在某些实施方式，本发明的主题HLA-A2 CAR包含对HLA-A2、HLA-A28和/或HLA-A68的亲和力，其不依赖于由这些MHC I类分子呈递的肽。例如，在某些实施方式，本发明的主题HLA-A2 CAR的特异性不受任意肽由HLA-A2分子的呈递的影响。
抗原结合结构域
CAR的抗原结合结构域是CAR的细胞外区，用于与包括蛋白、碳氢化合物和糖脂的特异性靶抗原结合。在一些实施方式中，CAR包含对靶细胞上的靶抗原的亲和力。靶抗原可以包括与靶细胞相关的任意类型的蛋白，或其表位。例如，CAR可以包括对指示靶细胞的特定状态的靶细胞上的靶抗原的亲和力。
在一个实施方式中，本发明的CAR包含与HLA-A2、HLA-A28和/或HLA-A68结合的抗原结合结构域。在另一个实施方式中，本发明的抗原结合结构域包含与HLA-A2、HLA-A28和/或HLA-A68分子结合的抗体或其片段。优选地，抗原结合结构域是与HLA-A2、HLA-A28和/或HLA-A68分子结合的scFv抗体。抗原结合结构域的选择取决于靶细胞表面存在的抗原的类型和数量。例如，可以选择抗原结合结构域以识别充当靶细胞上与靶细胞的特定状态相关的细胞表面标记物的抗原。
如本文所描述，对靶细胞上的特异性靶抗原具有亲和力的本公开的CAR可以包含靶特异性结合结构域。在一些实施方式中，靶特异性结合结构域是鼠靶特异性结合结构域，如，靶特异性结合结构域是鼠起源。在一些实施方式中，靶特异性结合结构域是人靶特异性结合结构域，如，靶特异性结合结构域具有人起源。在示例性实施方式中，对靶细胞上HLA-A2具有亲和力的本公开的CAR可以包含HLA-A2结合结构域。在一些实施方式中，HLA-A2结合结构域是鼠HLA-A2结合结构域，如，HLA-A2结合结构域具有鼠起源。在一些实施方式中，HLA-A2结合结构域是人源化的HLA-A2结合结构域。在一些实施方式中，HLA-A2结合结构域是人HLA-A2结合结构域，如，HLA-A2结合结构域具有人起源。
在一些实施方式中，本公开的CAR可以具有对一种或多种靶细胞上的一种或多种靶抗原的亲和力。在一些实施方式中，CAR可以具有对靶细胞上的一种或多种靶抗原的亲和力。在此类实施方式，CAR是双特异性CAR，或多特异性CAR。在一些实施方式中，CAR包含一个或多个靶特异性结合结构域，其赋予对一种或多种抗原的亲和力。在一些实施方式中，CAR包含一种或多种靶特异性结合结构域，其赋予对相同靶抗原的亲和力。例如，包含对相同靶抗原具有亲和力的一个或多个靶特异性结合结构域的CAR可结合靶抗原的不同表位。当CAR中存在多个靶特异性结合结构域，结合结构域可以串联布置并且可以被连接肽分开。例如，在包含两个靶特异性结合结构域的CAR中，在单个多肽链上，结合结构域通过寡肽或多肽连接体、Fc铰链区、或膜铰链区彼此共价地连接。
抗原结合结构域可以包括与抗原结合的任意结构域并且可以包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体、非人抗体及其任意片段。因此，在一个实施方式中，抗原结合结构域部分包含哺乳动物抗体或其片段。在另一实施方式中，CAR的抗原结合结构域选自抗-HLA-A2抗体或其片段。在一些实施方式中，抗原结合结构域选自抗体、抗原结合片段(Fab)、和单链可变片段(scFv)。在一些实施方式中，本发明的HLA-A2结合结构域选自HLA-A2-特异性抗体、HLA-A2-特异性Fab、和HLA-A2-特异性scFv。在一个实施方式中，HLA-A2结合结构域是HLA-A2-特异性抗体。在一个实施方式中，HLA-A2结合结构域是HLA-A2-特异性Fab。在一个实施方式中，HLA-A2结合结构域是HLA-A2-特异性scFv。
如本文所使用，术语“单链可变片段”或“scFv”是共价连接以形成VH::VL异二聚体的免疫球蛋白(如，小鼠或人)的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。重链(VH)和轻链(VL)或直接或通过肽编码连接体结合，该连接体连接VH的N末端与VL的C末端，或连接VH的C末端与VL的N末端。在一些实施方式中，抗原结合结构域(如，HLA-A2结合结构域)包含scFv，其具有从N-末端至C末端的VH-连接体-VL构型。在一些实施方式中，抗原结合结构域(如，HLA-A2结合结构域)包含scFv，其具有从N-末端至C-末端的VL-连接体-VH构型。本领域技术人员应能够针对本公开中的用途选择合适的构型。
连接体通常富含在甘氨酸中用于柔性，以及富含在丝氨酸或苏氨酸中用于溶解度。连接体可以连接细胞外抗原-结合结构域的重链可变区和轻链可变区。在Shen等人,Anal.Chem.80(6):1910-1917(2008)和WO 2014/087010中公开了连接体的非限制性实例，其内容通过引用以其全部并入本文。各种连接体序列在本领域是已知的，包括但不限甘氨酸丝氨酸(GS)连接体，诸如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:25)、(GGGS)n(SEQ ID NO:26)、和(GGGGS)n(SEQ ID NO:27)，其中n代表至少1的整数。示例性连接体序列可以包括氨基酸序列，其包括但不限于GGSG(SEQ ID NO:28)、GGSGG(SEQ ID NO:29)、GSGSG(SEQ ID NO:30)、GSGGG(SEQ ID NO:31)、GGGSG(SEQ ID NO:32)、GSSSG(SEQ ID NO:33)、GGGGS(SEQ ID NO:34)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:35)等。本领域技术人员将能够针对本发明中的用途选择合适的连接体序列。在一个实施方式中，本发明的抗原结合结构域(如，HLA-A2结合结构域)包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH和VL被具有氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:35)的连接体序列分开，该氨基酸序列可以由核酸序列ggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatct(SEQ ID NO:36)编码。
尽管去除了恒定区并引入了连接体，但是scFv蛋白保留了原始免疫球蛋白的特异性。单链Fv多肽抗体可以由Huston,等人(Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883,1988)所描述的包含VH-和VL编码序列表达。也可参见美国专利号5,091,513、5,132,405和4,956,778；和美国专利申请号20050196754和20050196754。具有抑制活性的拮抗性scFv已经被描述(参见，如，Zhao等人,Hyrbidoma(Larchmt)2008 27(6):455-51；Peter等人,J CachexiaSarcopenia Muscle 2012August 12；Shieh等人,J Imunol 2009 183(4):2277-85；Giomarelli等人,Thromb Haemost 2007 97(6):955-63；Fife等人,J Clin Invst 2006116(8):2252-61；Brocks等人,Immunotechnology 1997 3(3):173-84；Moosmayer等人,Ther Immunol 1995 2(10:31-40)。具有刺激活性的激动性scFv已经被描述(参见，如，Peter等人,J Bioi Chem 200325278(38):36740-7；Xie等人,Nat Biotech 1997 15(8):768-71；Ledbetter等人,Crit Rev Immunol 1997 17(5-6):427-55；Ho等人,BioChimBiophys Acta 2003 1638(3):257-66)。
如本文所使用，“Fab”指的是与抗原结合但是单价的并且不具有Fc部分的抗体结构的片段，例如，被木瓜蛋白酶消化的抗体得到两个Fab片段和Fc片段(如，重(H)链恒定区；不与抗原结合的Fc区)。
如本文所使用，“F(ab′)2”指的是由整个IgG抗体消化产生的抗体片段，其中该片段具有两个抗原结合(ab')(二价)区，其中每个(ab')区包含两条独立的氨基酸链，用于结合抗原的由S-S键连接的一部分H链的和轻链(L)并且其中剩余的H链部分连接在一起。F(ab')2”片段可分为两个个体Fab'片段。
在一些情况中，抗原结合结构域可以来源于相同种类，其中CAR将最终被施用。例如，用于人中，CAR的抗原结合结构域可以包含如本文其他部分描述的人抗体，或其片段。
在示例性实施方式中，本发明的HLA-A2 CAR包含HLA-A2结合结构域，如，HLA-A2-特异性scFv。在一个实施方式中，HLA-A2结合结构域包含SEQ ID NO:1中叙述的氨基酸序列。
在一个实施方式中，HLA-A2结合结构域包含轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8中叙述的氨基酸序列。HLA-A2结合结构域的轻链可变区包含三条轻链互补性确定区(CDR)。如本文所使用，“互补性确定区”或“CDR”指的是与特异性抗原结合的抗原结合分子的可变链的区域。因此，HLA-A2结合结构域可以包含轻链可变区，其包含CDR1、CDR2和CDR3，CDR1包含SEQ ID NO:10中叙述的氨基酸序列；CDR2包含SEQ ID NO:11中叙述的氨基酸序列；和CDR3包含SEQ ID NO:12中叙述的氨基酸序列。
在一个实施方式中，HLA-A2结合结构域包含重链可变区，其包含SEQ ID NO:3中叙述的氨基酸序列。HLA-A2结合结构域可以包含重链可变区，其包含CDR1、CDR2和CDR3，CDR1包含SEQ ID NO:5中叙述的氨基酸序列；CDR2包含SEQ ID NO:6中叙述的氨基酸序列；和CDR3包含SEQ ID NO:7中叙述的氨基酸序列。
本领域技术人员将知晓HLA-A2结合结构域的容许偏差，同时保持与HLA-A2的特异性结合。例如，在一些实施方式中，HLA-A2结合结构域包含与SEQ ID NO:3、5-8和10-12中叙述的任意氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。例如，在一些实施方式中，HLA-A2结合结构域由与SEQID NO:2、4和9中叙述的任意核酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的核酸序列编码。
抗原结合结构域可以可操作地连接至CAR的另一结构域，诸如跨膜结构域或细胞内结构域，二者均在本文其他地方描述。在一个实施方式中，编码抗原结合结构域的核酸可操作地连接至编码跨膜结构域的核酸与编码细胞内结构域的核酸。
本文描述的抗原结合结构域，诸如与HLA-A2、HLA-A28和/或HLA-A68结合的抗体或其片段，可以与本文描述的任意跨膜结构域、本文描述的任意细胞内结构域或细胞质结构域、或本文描述的可以包括在CAR中的任意其他结构域组合。
跨膜结构域
关于跨膜结构域，本发明的CAR(如，HLA-A2 CAR)可以被设计以包含将CAR的抗原结合结构域连接至细胞内结构域的跨膜结构域。主题CAR的跨膜结构域是能够跨越细胞(如，免疫细胞或其前体)的质膜的区域。跨膜结构域用于插入细胞膜，如真核细胞膜。在一些实施方式中，跨膜结构域插入在CAR的之间抗原结合结构域和细胞内结构域之间。
在一个实施方式中，跨膜结构域自然与CAR中的结构域中的一个或多个相关联。在一些情况中，跨膜结构域可以进行选择或通过氨基酸置换进行修饰以避免这样的结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而最小化与受体复合体的其他膜的相互作用。
跨膜结构域可以来源于天然或合成源。当来源是天然的，结构域可以来源自任意膜结合或跨膜蛋白，如I型跨膜蛋白。当来源是合成的，跨膜结构域可以是任意助于CAR插入细胞膜中的人工序列，如，人工疏水序列。本发明中特定用途的跨膜区的实例包括但不限于源自T细胞受体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134(OX-40)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9的α、β或ζ链的跨膜结构域(即包含上述的至少跨膜区)。在一些实施方式中，跨膜结构域可以是合成的，其中其将主要包含疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。优选地，在合成的跨膜结构域的每个端将发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸三联体。
本文描述的跨膜结构域可以与本文描述的任意抗原结合结构域、本文描述的任意细胞内结构域、或本文描述的可以包括在CAR中的任意其他结构域组合。
在一些实施方式中，跨膜结构域进一步包含铰链区。本发明的主题CAR还可以包括铰链区。CAR的铰链区是位于亲水区。在一些实施方式中，该结构域促进了CAR的正确蛋白质折叠。铰链区是CAR的可选组分。铰链区可包括选自抗体的Fc片段、抗体的铰链区、抗体的CH2区、抗体的CH3区、人工铰链序列或其组合的结构域。铰链区的实例包括但不限于CD8a铰链、由多肽制成的可以小到三个甘氨酸(GLY)的人工铰链、以及IgG的CH1和CH3结构域(诸如人IgG4)。
在一些实施方式中,本公开的主题CAR包括铰链区，其将抗原结合结构域与跨膜结构域连接，其又连接至细胞内结构域。铰链区优选地能够支撑抗原结合结构域以识别和结合靶细胞上的靶抗原(参见，如，Hudecek等人,Cancer Immunol.Res.(2015)3(2):125-135)。在一些实施方式中，铰链区是柔性结构域，由此允许抗原结合结构域具有最佳识别特异性结构和细胞(诸如肿瘤细胞)上靶抗原的密度的结构(Hudecek等人，同上)。flexibility of铰链区的柔性允许铰链区适应许多不同构型。
在一些实施方式中，铰链区是免疫球蛋白重链铰链区。在一些实施方式中，铰链区是源自受体的铰链区多肽(如，CD8-来源的铰链区)。
铰链区的长度可以为约4个氨基酸至约50个氨基酸，如，4个aa至约10个aa、约10个aa至约15个aa、约15个aa至约20个aa、约20个aa至约25个aa、约25个aa至约30个aa、约30个aa至约40个aa、或约40个aa至约50个aa。
适合的铰链区可以容易地选择并且可以具有任意数目的适合的长度，诸如1个氨基酸(如，Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6、7个氨基酸。
例如，铰链区包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括，例如，(GS)n，(GSGGS)n(SEQ ID NO:25)和(GGGS)n(SEQ ID NO:26)，其中n是至少1的整数)，甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、和本领域已知的其他柔性连接体。可以使用甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物；Gly和Ser是相对非结构化的，并因此可以作为组分之间的中性系绳(neutral tether)。可以使用甘氨酸聚合物；甘氨酸甚至比丙氨酸还获得显著更大的
Figure BDA0002288634040000221
空间，并且比具有较长侧链的残基更不受限制(参见，如，Scheraga,Rev.Computational.Chem.(1992)2:73-142)。示例性铰链区可以包含氨基酸序列，其包括但不限于GGSG(SEQ ID NO:28)、GGSGG(SEQ ID NO:29)、GSGSG(SEQ ID NO:30)、GSGGG(SEQID NO:31)、GGGSG(SEQ ID NO:32)、GSSSG(SEQ ID NO:33)等。
在一些实施方式中，铰链区是免疫球蛋白重链铰链区。免疫球蛋白铰链区氨基酸序列在本领域是已知的；参见，如，Tan等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87(1):162-166；和Huck等人,Nnucleic Acids Res.(1986)14(4):1779-1789。作为非限制性实例，免疫球蛋白铰链区可以包括以下氨基酸序列中一个：DKTHT(SEQ ID NO:37)；CPPC(SEQ ID NO:38)；CPEPKSCDTPPPCPR(SEQ ID NO:39)(参见，如，Glaser等人,J.Biol.Chem.(2005)280:41494-41503)；ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO:40)；KSCDKTHTCP(SEQ ID NO:41)；KCCVDCP(SEQID NO:42)；KYGPPCP(SEQ ID NO:43)；EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:44)(人IgG1铰链)；ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:45)(人IgG2铰链)；ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO:46)(人IgG3铰链)；SPNMVPHAHHAQ(SEQ ID NO:47)(人IgG4铰链)；等等。
铰链区可以包括包含氨基酸序列of a人IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、铰链区。在一个实施方式中，与野生型(天然存在)铰链区相比，铰链区可以包括一个或多个氨基酸置换和/或插入和/或缺失。例如，人IgG1铰链的His229可以被Tyr置换，从而铰链区包含EPKSCDKTYTCPPCP(SEQ ID NO:48)的序列；参见，如，Yan等人,J.Biol.Chem.(2012)287:5891-5897。在一个实施方式中,铰链区可以包含源自人CD8的氨基酸序列，或其变体。
在一个实施方式中，跨膜结构域包含CD28跨膜结构域。在另一实施方式中，跨膜结构域包含CD8铰链结构域和CD28跨膜结构域。在一些实施方式中，主题CAR包含具有SEQ IDNO:15中叙述的氨基酸序列的CD8铰链区，其可以由SEQ ID NO:16中叙述的核酸序列编码。在一些实施方式中，主题CAR包含具有SEQ ID NO:17中叙述的氨基酸序列的CD28跨膜结构域，其可以由SEQ ID NO:18中叙述的核酸序列编码。在一些实施方式中，跨膜结构域包含CD8铰链区和CD28跨膜结构域。
本领域技术人员已知跨膜和/或铰链结构域的容许偏差，同时保持其预期功能。例如，在一些实施方式中，铰链结构域和/或跨膜结构域包含与SEQ ID NO:15和/或17中叙述的任意氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。例如，在一些实施方式中，铰链结构域和/或跨膜结构域由与SEQ ID NO:16和/或18中叙述的任意核酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的核酸序列编码。
跨膜结构域可以与任意铰链结构域组合和/或可以包括本文描述的一个或多个跨膜结构域。
本文描述的跨膜结构域(诸如T-细胞受体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134(OX-40)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9的α、β或ζ链的跨膜区)可以与本文描述的任意抗原结合结构域、本文描述的任意细胞内结构域或细胞质结构域、或可以包括在CAR中的本文描述的任意其他结构域组合。
在一个实施方式中，跨膜结构域可以是合成，其中其将主要包含疏水残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。优选地，在合成的跨膜结构域的每个端处将发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
在CAR的细胞外结构域和跨膜结构域之间，或CAR的细胞内结构域和跨膜结构域之间，可以并入间隔区结构域。如本文所使用，术语“间隔区结构域”通常意思是起到在多肽链中将跨膜结构域连接至细胞外结构域或细胞内结构域的功能的寡肽或多肽。间隔区结构域可以包含至多300个氨基酸，如，10至100个氨基酸，或25至50个氨基酸。在一些实施方式中，间隔区结构域可以是短寡肽或多肽连接体，如，长度在2和10个氨基酸之间。例如，甘氨酸-丝氨酸双联体提供主题CAR的跨膜结构域和细胞内信号传导结构域之间特别适合的连接体。
细胞内结构域
本发明的主题CAR还包括细胞内信号传导结构域。术语“细胞内信号传导结构域”和“细胞内结构域”在本文中可交换地使用。CAR的细胞内信号传导结构域负责其中表达CAR的细胞(如，免疫细胞)的效应功能中至少一个的活化。细胞内信号传导结构域转导效应功能信号并引导细胞细胞(如，免疫细胞)以执行其专门的功能，如，伤害和/或破坏靶细胞。
CAR的细胞内结构域或否则细胞质结构域包括与本文其他地方描述的嵌合细胞内信号传导分子类似或相同的细胞内结构域，并且负责其中表达CAR的细胞的活化。在一个实施方式中，细胞内结构域包含CD3ζ。在另一实施方式中，细胞内结构域包含CD28和CD3ζ。
用于本发明的细胞内结构域的实例包括不限于表面受体的细胞质部分、共刺激分子、和任意协同作用以起始T细胞中信号转导的分子，以及这些元件任意衍生物或变体和具有相同功能能力的任意合成序列。
细胞内信号传导结构域的实例包括但限于T细胞受体复合体的ζ链或其任意同系物，如，η链、FcsRIγ和β链、MB 1(Iga)链、B29(Ig)链等，人CD3ζ链，CD3多肽(Δ、δ和ε)，syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP 70等)，src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)，和其他参与T细胞转导的分子，诸如CD2、CD5和CD28。在一个实施方式中，细胞内信号传导结构域可以是人CD3ζ链、FcyRIII、FcsRI、Fc受体的细胞质尾、承载细胞质受体的免疫受体酪氨酸类活化基序(ITAM)，和其组合。
在一个实施方式中，CAR的细胞内结构域包括一种或多种共刺激分子的任意部分，诸如来自CD3、CD8、CD27、CD28、ICOS、4-IBB、PD-1、其任意衍生物或变体、其具有相同功能能力的任意合成序列、和其任意组合的至少一个信号传导结构域。
细胞内结构域的其他实例包括选自包括一种或多种分子或受体的片段或结构域，所述一种或多种分子或受体包括但不限于TCR，CD3ζ，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD86，普通FcRγ，FcRβ(FcεRib)，CD79a，CD79b，FcγRlla，DAP10，DAP 12，T细胞受体(TCR)，CD8，CD27，CD28，4-1BB(CD137)，OX9，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，a KIR家族蛋白，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3，与CD83特异性结合的配体，CDS，ICAM-1，GITR，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRF1)，CD127，CD 160，CD19，CD4，CD8α，CD8β，IL2Rβ，IL2Rγ，IL7Rα，ITGA4，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD1Id，ITGAE，CD 103，ITGAL，CD 11a，LFA-1，ITGAM，CD lib，ITGAX，CD 11c，ITGBl，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，TRANCE/RANKL，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244，2B4)，CD84，CD 96(触觉)，CEACAM1，CRT AM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CD100(SEMA4D)，CD69，SLAMF6(NTB-A，Lyl08)，SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD 162)，LTBR，LAT，GADS，SLP-76，PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46，NKG2D，Toll样受体1(TLR1)，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9，本文描述的其他共刺激分子，其任意衍生物、变体或片段，具有相同功能能力的共刺激分子的任意合成序列，和其任意组合。
细胞内结构域的额外实例包括但不限于若干类型的各种其他免疫信号传导受体的细胞内信号传导结构域，各种其他免疫信号传导受体包括但不限于第一代、第二代和第三代T细胞信号传导蛋白，其包括CD3，B7家族共刺激，和肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族受体(参见，如，Park和Brentjens,J.Clin.Oncol.(2015)33(6):651-653)。额外地，细胞内信号传导结构域可以包括NK和NKT细胞使用的信号传导结构域(参见，如，Hermanson和Kaufman,Front.Immunol.(2015)6:195)，诸如NKp30的信号传导结构域(B7-H6)(参见，如，Zhang等人,J.Immunol.(2012)189(5):2290-2299)，和DAP 12(参见，如，Topfer等人,J.Immunol.(2015)194(7):3201-3212)，NKG2D，NKp44，NKp46，DAP10和CD3z。
适合用于本发明的主题CAR中的细胞内信号传导结构域包括任意期望的信号传导结构域，其响应于CAR的活化(即，被抗原或二聚剂活化)提供不同的并且可检测的信号(如，通过细胞的一种或多种细胞因子的增加的产生；靶基因的转录变化；蛋白的活性变化；细胞行为的变化，如，细胞死亡；细胞增殖；细胞分化；细胞存活；细胞信号传导应答的调节；等)。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括以下描述的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个等)ITAM基序。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括DAP10/CD28型信号传导链。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域非共价附接至膜结合CAR，而是扩散到细胞质中。
适合用于本发明的主题CAR中的细胞内信号传导结构域包括含有免疫受体酪氨酸类活化基序(ITAM)的细胞内信号传导多肽。在一些实施方式中，ITAM基序在细胞内信号传导结构域中重复两次，其中ITAM基序的第一和第二例子彼此通过6至8个氨基酸分开。在一个实施方式中，主题CAR的细胞内信号传导结构域包含3个ITAM基序。
在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括人免疫球蛋白受体的信号传导结构域人免疫球蛋白受体含有免疫受体酪氨酸类活化基序(ITAM)，诸如但不限于FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcRL5(参见，如，Gillis等人,Front.Immunol.(2014)5:254)。
适合的细胞内信号传导结构域可以是含有ITAM基序的部分，其来源自含有ITAM基序的多肽。例如，适合的细胞内信号传导结构域可以是来自任意含有ITAM基序的蛋白的含有ITAM基序的结构域。因此，适合的细胞内信号传导结构域不需要含有由其衍生的整个蛋白的整个序列。适合的含有ITAM基序的多肽的实例包括但不限于：DAP12、FCER1G(Fcε受体Iγ链)、CD3D(CD3δ)、CD3E(CD3ε)、CD3G(CD3γ)、CD3Z(CD3ζ)、和CD79A(抗原受体复合体相关蛋白α链)。
在一个实施方式中，细胞内信号传导结构域来源自DAP12(也称为TYROBP；TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白；KARAP；PLOSL；DNAX-活化蛋白12；KAR-相关蛋白；TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白；杀伤活化受体相关蛋白；杀伤-活化受体-相关蛋白；等等)。在一个实施方式中，细胞内信号传导结构域来源自FCER1G(也称为FCRG；Fcε受体Iγ链；Fc受体γ-链；fc-εRI-γ；fcRγ；fceRlγ；高亲和力免疫球蛋白ε受体亚基γ；免疫球蛋白E受体，高亲和力γ链；等等)。在一个实施方式中，细胞内信号传导结构域来源自T-细胞表面糖蛋白CD3δ链(也称为CD3D；CD3-DELTA；T3D；CD3抗原，δ亚基；CD3δ；CD3d抗原，δ多肽(TiT3复合体)；OKT3，δ链；T-细胞受体T3δ链；T-细胞表面糖蛋白CD3δ链；等)。在一个实施方式中，细胞内信号传导结构域来源自T-细胞表面糖蛋白CD3ε链(也称为CD3e，T-细胞表面抗原T3/Leu-4ε链，T-细胞表面糖蛋白CD3ε链，AI504783，CD3，CD3ε，T3e，等)。在一个实施方式中，细胞内信号传导结构域来源自T-细胞表面糖蛋白CD3γ链(也称为CD3G，T-细胞受体T3γ链，CD3-Γ，T3G，γ多肽(TiT3复合体)等等)。在一个实施方式中，细胞内信号传导结构域来源自T-细胞表面糖蛋白CD3ζ链(也称为CD3Z，T-细胞受体T3ζ链，CD247，CD3-Z，CD3H，CD3Q，T3Z，TCRZ，等等)。在一个实施方式中，细胞内信号传导结构域来源自CD79A(也称为B-细胞抗原受体复合体-相关蛋白α链；CD79a抗原(免疫球蛋白-相关α)；MB-1膜糖蛋白；ig-α；膜结合免疫球蛋白-相关蛋白；表面IgM-相关蛋白；等等)。在一个实施方式中，适合用于本公开的CAR FN3的细胞内信号传导结构域包括DAP10/CD28型信号传导链。在一个实施方式中，适合用于本公开的CARFN3的细胞内信号传导结构域包括ZAP70多肽。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、或CD66d的细胞质信号传导结构域。在一个实施方式中，CAR中的细胞内信号传导结构域包括人CD3ζ的细胞质信号传导结构域。
虽然通常可以采用整个细胞内信号传导结构域，但是在许多情况中，不必须使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，只要该截短部分转导效应功能信号，就可以代替完整链使用。细胞内信号传导结构域包括任何足以1转导效应功能信号的细胞内信号传导结构域的截短部分。
本文描述的细胞内信号传导结构域可以与本文描述的任意抗原结合结构域、本文描述的任意跨膜结构域、或可以包括在CAR中的本文描述的任意其他结构域组合。
在一个实施方式中，主题CAR的细胞内结构域包含CD28细胞内结构域，CD28细胞内结构域包含SEQ ID NO:19中叙述的氨基酸序列，其可以由SEQ ID NO:20中叙述的核酸序列编码。在一个实施方式中，主题CAR的细胞内结构域包含CD3ζ结构域，CD3ζ结构域包含SEQID NO:21中叙述的氨基酸序列，其可以由SEQ ID NO:22中叙述的核酸序列编码。在一个示例性实施方式中，主题CAR的细胞内结构域包含CD28结构域和CD3ζ结构域。
本领域技术人员已知细胞内结构域的容许偏差，同时保持特异性活性。例如，在一些实施方式中细胞内结构域包含与SEQ ID NO:19和/或21中叙述的任意氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。例如，在一些实施方式中，细胞内结构域由与SEQ ID NO:20和/或22中叙述的任意核酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的核酸序列编码。
在另一实施方式中，间隔区结构域可以并入在CAR的抗原结合结构域和跨膜结构域之间，或CAR的细胞内结构域和跨膜结构域之间。如本文所使用，术语“间隔区结构域”通常意思是起到在多肽链中将跨膜结构域连接至抗原结合结构域或细胞内结构域的功能的寡肽或多肽。在一个实施方式中，间隔区结构域可以包含至多300个氨基酸，优选地10个至100个氨基酸和最优选地25个至50个氨基酸。在另一实施方式中，短的寡肽或多肽连接体(优选地长度在2和10个氨基酸之间)可以在CAR的跨膜结构域和细胞内结构域之间形成键。连接体的实例包括甘氨酸-丝氨酸二联体。
CAR序列
本发明的主题CAR可以是对HLA-A2具有亲和力的CAR。在一个实施方式中，本发明的HLA-A2 CAR包含SEQ ID NO:23中叙述的氨基酸序列，其可以由SEQ ID NO:24中叙述的核酸序列.
本领域技术人员将已知CAR的容许偏差，同时保持特异性活性。例如，在一些实施方式中，CAR包含与SEQ ID NO:23中叙述的氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性的氨基酸序列。例如，在一些实施方式中，CAR由与SEQ ID NO:24中叙述的核酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性核酸序列编码。
因此，本发明的主题CAR包含HLA-A2结合结构域和跨膜结构域。在一个实施方式中，CAR包含HLA-A2结合结构域和跨膜结构域，其中跨膜结构域包含CD8铰链区。在一个实施方式中，CAR包含HLA-A2结合结构域和跨膜结构域，其中跨膜结构域包含CD28跨膜结构域。在一个实施方式中，CAR包含HLA-A2结合结构域和跨膜结构域，其中跨膜结构域包含CD8铰链区和CD28跨膜结构域。
因此，本发明的主题CAR包含HLA-A2结合结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。在一个实施方式中，CAR包含HLA-A2结合结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域，其中细胞内结构域包含CD28结构域。在一个实施方式中，CAR包含HLA-A2结合结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域，其中细胞内结构域包含CD3ζ结构域。在一个实施方式中，CAR包含HLA-A2结合结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域，其中细胞内结构域包含CD28结构域和CD3ζ结构域。
因此，本发明的主题CAR包含HLA-A2结合结构域、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、CD28细胞内结构域、和CD3ζ细胞内结构域。
因此，本发明提供修饰的免疫细胞或其前体细胞，如修饰的调节T细胞，其包含对HLA-A2具有亲和力的嵌合抗原受体(CAR)，如本文所描述。
人抗体
优选的是，CAR的抗原结合结构域包括人抗体或其片段。完全人抗体对于人对象的治疗性处理是特别期望的。可以通过各种本领域已知的方法制造人抗体，包括使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法，包括对这些技术的改进。还参见，美国专利号4,444,887和4,716,111；PCT公开WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735、和WO 91/10741；其每篇通过引用以其全部并入本文。
还可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合体可以被随机地或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞。可选地，除人重链和轻链基因之外，人可变区、恒定区、和多变区也可以被引入小鼠胚胎干细胞。通过同源重组，可以单独地或与引入人免疫球蛋白基因座同时地，使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因非功能性。例如，已经描述了在嵌合和种系突变小鼠中纯合缺失抗体重链接合区(JH)基因导致内源性抗体产生的完全抑制。修饰的胚胎干细胞被扩展并且显微注射入胚泡以产生嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合后代。转基因小鼠以正常的方式使用选择的抗原(例如，本发明的多肽的全部或部分)进行免疫。针对选择的靶标的抗体可以使用常规的杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠获得。由转基因小鼠聚藏(harbor)的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，并且随后经历类别转换和体细胞突变。因而，使用这样的技术，可能产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体，其包括但不限于IgG1(γ1)和IgG3。对于产生人抗体的此技术的综述，参见Lonberg和Huszar(Int.Rev.Immunol.,13:65-93(1995))。对于产生人抗体和人单克隆抗体的技术用于以及生产这样的抗体的方案的详细讨论，参见，如，PCT公布号WO 98/24893、WO96/34096、和WO96/33735；和美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；和5,939,598，其每篇通过引用以其全部并入本文。此外，可以与公司比如Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)和Genpharm(SanJose,Calif.)约定以使用与上面描述的类似的技术提供针对选择的抗原的人抗体。对于在种系突变小鼠中转移人类种系免疫球蛋白基因阵列在抗原攻击之后将导致产生人抗体的具体讨论，参见，如，Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature,362:255-258(1993)；Bruggermann等人,Year in Immunol.,7:33(1993)；和Duchosal等人,Nature,355:258(1992)。
人抗体也可以源自噬菌体展示文库(Hoogenboom等人,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)；Vaughan等人,Nature Biotech.,14:309(1996))。噬菌体展示技术(McCafferty等人,Nature,348:552-553(1990))可以被用于从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因所有组成成分在体外产生人抗体和抗体片段。根据此技术，将抗体V结构域基因符合读框地克隆入丝状噬菌体比如M1 3或fd的主要或次要外壳蛋白基因，并且在噬菌体颗粒的表面上作为功能性抗体片段展示。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能性质的选择也导致选择编码展示那些性质的抗体的基因。因而，噬菌体模拟了B细胞的一些性质。噬菌体展示可以以各种形式进行；对于其综述，参见，如，Johnson,Kevin S和Chiswell,David J.,CurrentOpinionin Structural Biology 3:564-571(1993)。数种来源的V基因区段可以被用于噬菌体展示。Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)从源自未免疫小鼠脾脏的V基因的小的随机组合文库分离了抗唑酮抗体的多样化阵列。可以构建来自未免疫人供体的V基因所有组成成分，并且抗原(包括自体抗原)的多样化阵列的抗体可以大体上遵循由下列描述的技术进行分离：Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)或Griffith等人,EMBO J.,12:725-734(1993)。还参见美国专利号5,565,332和5,573,905，其每篇通过引用以其全部并入本文。
人抗体也可以通过体外活化的B细胞产生(参见，美国专利号5,567,610和5,229,275，其每篇通过引用以其全部并入本文)。人抗体也可以使用杂交瘤技术体外产生，比如，但不限于由Roder等人(Methods Enzymol.,121:140-167(1986))描述的。
人源化抗体
可选地，在一些实施方式中，非人抗体可以是人源化的，其中抗体的特异性序列或区域被修饰以增加与人中天然产生的抗体的相似性。例如，在本发明中，抗体或其片段可以包括非人哺乳动物scFv。在一个实施方式中，抗原结合结构域部分是人源化的。
可以使用本领域已知的各种技术产生人源化抗体，该技术包括但不限于CDR-移植(参见，例如，欧洲专利号EP239,400；国际公布号WO91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089，其每篇通过引用以其全部并入本文)、贴面(veneering)或表面重建(resurfacing)(参见，例如，欧洲专利号EP592,106和EP519,596；Padlan,1991,MolecularImmunology,28(4/5):489-498；Studnicka等人,1994,Protein Engineering,7(6):805-814；和Roguska等人,1994,PNAS,91:969-973，其每篇通过引用以其全部并入本文)、链改组(参见，例如，美国专利号5,565,332，其通过引用以其全部并入本文)和在如下中公开的技术：例如，美国专利申请公布号US2005/0042664、美国专利申请公布号US2005/0048617、美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、国际公布号WO9317105、Tan等人,J.Immunol.,169:1119-25(2002)、Caldas等人,Protein Eng.,13(5):353-60(2000)、Morea等人,Methods,20(3):267-79(2000)、Baca等人,J.Biol.Chem.,272(16):10678-84(1997)、Roguska等人,Protein Eng.,9(10):895-904(1996)、Couto等人,Cancer Res.,55(23Supp):5973s-5977s(1995)、Couto等人,Cancer Res.,55(8):1717-22(1995)、Sandhu JS,Gene,150(2):409-10(1994)和Pedersen等人,J.Mol.Biol.,235(3):959-73(1994)，其每篇通过引用以其全部并入本文。通常，框架区中的框架残基将被置换为来自CDR供体抗体的相应残基以改变优选地改进抗原结合。这些框架置换通过本领域熟知的方法鉴定，例如，通过建模CDR和框架残基的相互作用以鉴定对抗原结合重要的框架残基和通过序列比较鉴定特定位置处的不常见的框架残基(参见，例如，Queen等人,美国专利号5,585,089；和Riechmann等人,1988,Nature,332:323，其通过引用以其全部并入本文)。
人源化抗体具有从非人来源引入其的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。因而，人源化抗体包括来自非人免疫球蛋白分子的一个或多个CDR和来自人的框架区。抗体的人源化是本领域熟知的，并且可以大体上遵循Winter与合作者的方法进行(Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988))，其通过将啮齿动物CDR或CDR序列置换为相应的人抗体序列，即CDR-移植(EP239,400；PCT公布号WO91/09967；和美国专利号4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6,548,640，其内容通过引用以其全部并入本文)。在这样的人源化嵌合抗体中，实质上小于完整人可变结构域已经被来自非人物种的相应的序列置换。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些框架(FR)残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基置换的人抗体。抗体的人源化也可以通过贴面或表面重建(EP592,106；EP519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka等人,ProteinEngineering,7(6):805-814(1994)；和Roguska等人,PNAS,91:969-973(1994))或链改组(美国专利号5,565,332)实现，其内容通过引用以其全部并入本文。
用于制造人源化抗体的人可变结构域(轻和重二者)的选择是为了降低抗原性。根据所谓的“最佳拟合”方法，啮齿动物抗体的可变结构域的序列针对已知的人可变结构域序列的整个文库进行筛选。最接近于啮齿动物的序列的人序列然后被接受为用于人源化抗体的人框架(FR)(Sims等人,J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia等人,J.Mol.Biol.,196:901(1987)，其内容通过引用以其全部并入本文)。另一种方法使用源自特定的轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可以被用于数种不同的人源化抗体(Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993)，其内容通过引用以其全部并入本文)。
抗体可以被人源化，并且保留对靶标抗原的高亲和力和其它有利的生物学性质。根据本发明的一个方面，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和多种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。
三维免疫球蛋白模型是一般可获得的并且是本领域技术人员熟悉的。图解和展示选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可获得的。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合靶标抗原的能力的残基。以此方式，FR残基可以从接受者和输入序列选择并组合，使得实现期望的抗体特性，比如对靶标抗原的增加的亲和力。一般而言，CDR残基直接地和最实质性地参与影响抗原结合。
人源化抗体保留与原始抗体相似的抗原特异性。然而，使用人源化的某些方法，可以使用“定向进化”的方法增加抗体对靶标抗原的结合亲和力和/或特异性，如由Wu等人,J.Mol.Biol.,294:151(1999)描述的，其内容通过引用以其全部并入本文。
核酸和表达载体
本发明提供了编码对HLA-A2具有亲和力的CAR的核酸。如本文所描述，主题CAR包含抗原结合结构域(如，HLA-A2结合结构域)、跨膜结构域、和细胞内结构域。因此，本发明提供了编码主题CAR的抗原结合结构域(如，HLA-A2结合结构域)、跨膜结构域和细胞内结构域的核酸。
在示例性实施方式中，本发明的编码HLA-A2 CAR的核酸由SEQ ID NO:24中叙述的核酸序列编码。
在一些实施方式中，本发明的核酸可以可操作地连接至转录控制元件，如，启动子和增强子等。适合的启动子和增强子元件为本领域技术人员所知晓。
对于在细菌细胞中的表达，适合的启动子包括但不限于lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP和trc。对于在真核细胞中的表达，适合的启动子包括但不限于轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；巨细胞哦病毒即时早期启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；早期和晚期SV40启动子；来自反转录病毒的长末端重复中存在的启动子；小鼠金属硫蛋白-I启动子；和各种本领域已知的组织特异性启动子。适合的可逆启动子(包括可逆诱导启动子)在本领域内是已知的。这样的可逆启动子可以从有多生物体分离和来源自许多生物体，如真核生物和原核生物。来源于第一生物体用于第二生物体(如，第一原核生物和第二真核生物，第一真核生物和第二原核生物，等等)的可逆启动子的修饰，在本领域内是已知的。这样的可逆启动子，以及基于这样的可逆启动子但还包含额外控制蛋白的系统包括但不限于醇调节的启动子(如，醇脱氢酶I(alcA)基因启动子，对醇反式活化蛋白应答的启动子(A1cR)等)、四环素调节的启动子、(如，包括Tet活化剂、TetON、TetOFF等的启动子系统启动子系统)、类固醇调节的启动子(如，大鼠糖皮质激素受体启动子系统、人雌激素受体启动子系统、类视黄醇启动子系统、甲状腺启动子系统、蜕皮激素启动子系统、米非司酮启动子系统等等)、金属调节的启动子(如，金属硫蛋白启动子系统等)、致病相关调节的启动子(如，水杨酸调节的启动子、乙烯调节的启动子、苯并噻二唑调节启动子、等)、温度调节的启动子(如，热激诱导型的启动子(如，HSP-70、HSP-90、大豆热激启动子、等等)、光调节的启动子、合成诱导型的启动子等等。
在一些实施方式中，启动子是CD8细胞-特异性启动子、CD4细胞-特异性启动子、中性粒细胞-特异性启动子、或NK-特异性启动子。例如，可以使用CD4基因启动子；参见，如，Salmon等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:7739；和Marodon等人(2003)Blood101:3416。作为另一个实例，可以使用CD8基因启动子。可以通过使用NcrI(p46)启动子实现NK细胞-特异性表达；参见，如，Eckelhart等人Blood(2011)117:1565。
对于酵母细胞中的表达，适合的启动子是suitable启动子是组成启动子，诸如ADH1启动子、PGK1启动子、ENO启动子、PYK1启动子等等；或可调节启动子，诸如GAL1启动子、GAL10启动子、ADH2启动子、PHOS启动子、CUP1启动子、GALT启动子、MET25启动子、MET3启动子、CYC1启动子、HIS3启动子、ADH1启动子、PGK启动子、GAPDH启动子、ADC1启动子、TRP1启动子、URA3启动子、LEU2启动子、ENO启动子、TP1启动子和AOX1(如，用于毕赤酵母)。选择合适的载体和启动子完全在本领域普通技术人员的水平内。适用于原核宿主细胞的启动子包括但不限于噬菌体T7 RNA聚合酶启动子；trp启动子；lac操纵子启动子；混合启动子，如，lac/tac杂合启动子，tac/trc杂合启动子，trp/lac启动子，T7/lac启动子；trc启动子；tac启动子等；araBAD启动子；体内调节的启动子，诸如ssaG启动子或相关启动子(参见，如，美国专利公开号20040131637)，pagC启动子(Pulkkinen和Miller,J.Bacteriol.(1991)173(1):86-93；Alpuche-Aranda等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89(21):10079-83)，nirB启动子(Harborne等人Mol.Micro.(1992)6:2805-2813)等等(参见，如，Dunstan等人,Infect.Immun.(1999)67:5133-5141；McKelvie等人,Vaccine(2004)22:3243-3255；和Chatfield等人,Biotechnol.(1992)10:888-892)；σ70启动子，如，共有σ70启动子(参见，如，GenBank登录号AX798980、AX798961、和AX798183)；固定相启动子，如，dps启动子、spv启动子、等等；源自致病岛SPI-2的启动子(参见，如，WO96/17951)；actA启动子(参见，如，Shetron-Rama等人,Infect.Immun.(2002)70:1087-1096)；rpsM启动子(参见，如，Valdivia和Falkow Mol.Microbiol.(1996).22:367)；tet启动子(参见，如，Hillen,W.和Wissmann,A.(1989)In Saenger,W.和Heinemann,U.(eds),Topics in Molecular and StructuralBiology,Protein—Nucleic Acid Interaction.Macmillan,London,UK,Vol.10,pp.143-162)；SP6启动子(参见，如，Melton等人,Nucl.Acids Res.(1984)12:7035)；等等。用于原核生物(诸如大肠杆菌)的适合的强启动子包括但不限于Trc、Tac、T5、T7、和PΛ。用于细菌宿主细胞的操纵基因的非限制性实例包括乳糖启动子操纵基因(当与乳糖接触时，LacI阻抑蛋白蛋白改变构象，由此避免Lad阻抑蛋白结合至操作蛋白)，色氨酸启动子操纵基因(当与色氨酸复合时，TrpR阻抑蛋白具有结合操纵蛋白的构象；在不存在色氨酸的情况下，TrpR阻抑蛋白具有不结合操纵蛋白的构象)，和tac启动子操纵基因(参见，如，deBoer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1983)80:21-25)。
合适的启动子其他实例包括包括即时早期巨细胞哦病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成启动子序列，其能够驱动可操作地连接至其的任何多核苷酸序列的高表达水平。然而，还可以使用其他组成启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)，人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子，MoMuLV启动子，禽白血病病毒启动子，EB病毒即时早期启动子，劳斯肉瘤病毒启动子，EF-1α启动子，以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子、和肌酸激酶启动子。进一步，本发明不应被限于组成启动子的使用。诱导型启动子也设想为本发明的部分。使用诱导型启动子提供了一种分子开关，该分子开关能够在需要这种表达时开启其可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或者在不需要表达时关闭其表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属金属硫堇(metallothionine)启动子，糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
在一些实施方式中，通过诱导型系统的诱导来不可逆地切换基因座或构建体或含有合适启动子的转基因。用于诱导不可逆开关的合适系统在本领域中是众所周知的，例如，不可逆开关的诱导可以利用Cre-lox-介导的重组酶(参见，如，Fuhrmann-Benzakein,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)28:e99，其公开内容通过引用并入本文)。可以使用本领域内已知的重组酶、核酸内切酶、连接酶、重组位点等的任何合适的组合来产生不可逆切换的启动子。本文其他地方描述的进行位点-具体重组的方法、机制和要求可在产生不可逆切换的启动子中发现用途并且在本领域内已知，参见，如，Grindley等人Annual Review ofBiochemistry(2006)567-605；和Tropp,Molecular Biology(2012)(Jones&BartlettPublishers,Sudbury,Mass.),其公开通过引用并入本文。
在一些实施方式中，本公开的核酸进一步包含编码CAR诱导型表达弹夹的核酸序列。在一个实施方式中，CAR诱导型表达弹夹用来生产基于CAR信号传导释放的转基因多肽。参见，如，Chmielewski和Abken,Expert Opin.Biol.Ther.(2015)15(8):1145-1154；和Abken,Immunotherapy(2015)7(5):535-544。
本公开的核酸可以存在于表达载体和/或克隆载体内。表达载体可以包括选择性标记，复制起源和提供复制和/或维持载体的其他特征。适合的表达载体包括，如，质粒、病毒载体等。本领域技术人员已知大量的适合的载体和启动子；许多可以商业获得，用于产生主题重组构建体。通过举例提供下面的载体，并且决不解释为限制性的：细菌：pBs、phagescript、ΨX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、和pRIT5(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。真核：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。
表达载体通常在启动子序列附近具有方便的限制位点，以提供插入编码异源蛋白质的核酸序列。表达宿主中可能存在选择性标记。合适的表达载体包括但不限于病毒载体(如，基于痘苗病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒的病毒载体(参见，如，Li等人,Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(1994)35:2543-2549；Borras等人,Gene Ther.(1999)6:515-524；Li和Davidson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92:7700-7704；Sakamoto等人,H.GeneTher.(1999)5:1088-1097；WO 94/12649,WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺伴随病毒(参见，如，Ali等人,Hum.Gene Ther.(1998)9:81-86,Flannery等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94:6916-6921；Bennett等人,Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(1997)38:2857-2863；Jomary等人,Gene Ther.(1997)4:683690,Rolling等人,Hum.Gene Ther.(1999)10:641-648；Ali等人,Hum.Mol.Genet.(1996)5:591-594；Srivastava in WO 93/09239,Samulski等人,J.Vir.(1989)63:3822-3828；Mendelson等人,Virol.(1988)166:154-165；和Flotte等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:10613-10617)；SV40；单纯孢疹病毒；人免疫缺陷病毒(参见，如，Miyoshi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94:10319-23；Takahashi等人,J.Virol.(1999)73:7812-7816)；反转录病毒载体(如，鼠白血病病毒，脾坏死病毒，和源自反转录病毒的载体(诸如，劳斯肉瘤病毒，哈维肉瘤病毒，禽白血病病毒，人免疫缺陷病毒，骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒))；等等。
适合使用的额外的表达载体，如但不限于，慢病毒载体、γ反转录病毒载体、泡沫病毒载体、腺伴随病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体、工程化杂合病毒载体、转座子介导的载体等。病毒载体技术是本领域众所周知的，并且在例如Sambrook等人,2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,volumes 1-4,Cold Spring HarborPress,NY)中以及在其它病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。
通常，适合的载体含有在至少一个生物体中发挥功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点以及一个或多个选择性标记，(如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
在一些实施方式中，表达载体(如，慢病毒载体)可用于将CAR引入免疫细胞或其前体(如，T细胞)。因此，本发明的表达载体(如，慢病毒载体)可以包含编码CAR的核酸。在一些实施方式中，表达载体(如，慢病毒载体)将包含额外的元件，其将辅助其中编码的CAR的功能性表达。在一些实施方式中，包含编码CAR的核酸的表达载体进一步包含哺乳动物启动子。在一个实施方式中，载体进一步包含延伸-因子-1-α启动子(EF-1α启动子)。使用EF-1α启动子可以增加下游转基因(如，编码核酸序列的CAR)的表达的效率。生理启动子(如，EF-1α启动子)可以较少可能引入整合介导的遗传毒性，并且可以废除反转录病毒载体转化干细胞的能力。适合用于载体(如，慢病毒载体)中的其他生理启动子为本领域技术人员所熟知并且可以并入本发明的载体中。在一些实施方式中，载体(如，慢病毒载体)进一步包含可以提高效价和基因表达的非必须顺式作用序列。非必须顺式作用序列的一个非限制性实例是中央多聚嘌呤束和中央末端序列(cPPT/CTS)，其对于有效反转录和核输入是重要的。其他非必须顺式作用序列为本领域技术人员所熟知并且可以并入本发明的载体(如，慢病毒载体)。在一些实施方式中，载体进一步包含转录后调节元件。转录后调节元件可以提高RNA翻译、提高转基因表达和稳定RNA转录物。转录后调节元件的一个实例是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。因此，在一些实施方式中，用于本发明的载体进一步包含WPRE序列。各种转录后调节子元件为本领域技术人员所熟知并且可以并入本发明的载体(如，慢病毒载体)。本发明的载体可以进一步包括额外的元件，诸如用于RNA转运的rev应答元件(RRE)，包装序列，以及5’和3’长末端重复(LTR)。术语“长末端重复”或“LTR”指的是位于包含U3、R和U5区的反转录病毒DNA的端处的碱基对的结构域。LTR通常提供反转录病毒基因的表达和病毒复制所需的功能(如，基因转录物的促进、启动和多聚腺苷酸化)。在一个实施方式中，本发明的载体(如，慢病毒载体)包括3’U3缺失的LTR。因此，本发明的载体(如，慢病毒载体)可以包含本文描述的元件的任意组合，以增强转基因的功能性表达的效率。例如，本发明的载体(如，慢病毒载体)除了编码CAR的核酸之外还可以包含WPRE序列、cPPT序列、RRE序列、5’LTR、3’U3缺失的LTR’。
本发明的载体可以是自灭活载体。如本文所使用，术语“自灭活载体”指的是其中3’LTR增强子启动子区域(U3 region)已经被修饰(如，通过缺失或置换)的载体。自灭活载体可以防止病毒转录超出第一轮病毒复制。因此，自灭活载体可仅一次能够感染和然后整合入宿主基因组(如，哺乳动物基因组)，并且不可能进一步传递。因此，自灭活载体可极大地降低产生具有复制能力的病毒的风险。
在一些实施方式中，本发明的核酸可以是RNA，如，体外合成的RNA。体外合成RNA的方法为本领域技术人员所已知；可以使用任何已知方法合成包含编码本公开的CAR的序列的RNA。将RNA引入宿主细胞的方法在本领域内是已知的。参见，如，Zhao等人Cancer Res.(2010)15:9053。将包含编码本公开的CAR的核苷酸序列的RNA引入宿主细胞可以体外或离体或体内进行。例如，宿主细胞(如，NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞等)可以利用包含编码本公开的CAR的核苷酸序列的RNA体外或离体进行电穿孔。
为了评估多肽或其部分的表达，被引入细胞中的表达载体还可以包含选择性标记基因或报告基因，或两者，以促进从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在一些实施方式中，选择性标记可以携带在单片DNA上，并用于共转染程序。选择性标记和报告基因都可以位于合适的调节序列两翼，以使之能够在宿主细胞中表达。有用的选择性标记包括但不限于抗生素抗性基因。
报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和评估调节序列的功能。通常，报告基因是受体生物体或组织中不存在或不表达的并且编码通过一些容易可检测性质(如，酶促活性)表明其表达的多肽的基因。在将DNA引入受体细胞后的合适时间评估报告基因的表达。适合的报告基因可包括但不限于编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因(如，Ui-Tei等人,2000FEBS Letters 479:79-82)。
产生修饰的免疫细胞的方法
本发明提供生产/产生修饰的免疫细胞或其前体细胞(如，调节T细胞)的方法。一般通过引入编码主题CAR(如，HLA-A2 CAR)的核酸工程化细胞。
将核酸引入细胞的方法包括物理、生物和化学方法。用于将多核苷酸(诸如RNA)引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。可以使用市售方法将RNA引入靶细胞，市售方法包括电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(AmaxaBiosystems,Cologne,Germany))，(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或Gene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.)，Multiporator(Eppendort,HamburgGermany)。也可以使用利用脂质转染的阳离子脂质体介导的转染，使用聚合物包封，使用肽介导的转染或使用生物射弹(biolistic)颗粒递送系统(诸如“基因枪”)将RNA引入细胞(参见，例如，Nishikawa,等人Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001)。
用于将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，和尤其是反转录病毒载体，已经成为最广泛使用的方法，用于将基因插入哺乳动物，如人细胞。其他病毒载体可以源自慢病毒、痘病毒、单纯孢疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等。参见，例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。
在一些实施方式中，通过表达载体将编码本发明的主题CAR的核酸引入细胞。本文提供了包含编码主题CAR(如，HLA-A2 CAR)的核酸的表达载体。适合的表达载体包括慢病毒载体、γ反转录病毒载体、泡沫病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、腺病毒载体、工程化杂合病毒、裸DNA、包括但不限于转座子介导的载体，诸如Sleeping Beauty、Piggybak和整合酶诸如Phi31。一些其他适合的表达载体包括单纯孢疹病毒(HSV)和反转录病毒表达载体。
腺病毒表达载体基于腺病毒，其具有整合入基因组DNA的低能力但具有转染宿主细胞的高效率。腺病毒表达载体含有足以：(a)支撑表达载体的包装和(b)最终表达宿主细胞中的主题CAR的腺病毒序列。在一些实施方式中，腺病毒基因组是36kb，线性，双链DNA，其中可以将外源DNA序列(如，编码主题CAR的核酸)插入以置换大片腺病毒DNA，从而制造本发明的表达载体(参见，如，Danthinne和Imperiale,Gene Therapy(2000)7(20):1707-1714)。
另一表达载体基于腺伴随病毒，其具有腺病毒偶联系统的优势。该AAV表达载体具有整合入宿主基因组的高频率。它可以感染未分裂的细胞，因此使其可用于例如在组织培养或体内将基因递送到哺乳动物细胞中。AAV载体具有广泛的宿主感染性范围。有关AAV载体的产生和使用的详细信息在美国专利号5,139,941和4,797,368中描述。
反转录病毒表达载体能够整合入宿主基因组，递送大量的外源遗传物质，感染光谱的物种和细胞类型，并被包装在特殊的细胞系中。反转录病毒载体是通过将核酸(如，编码主题CAR的核酸)插入病毒基因组某些位置以产生复制缺陷的病毒而构建。尽管反转录病毒载体能够感染多种细胞类型，但主题CAR的整合和稳定表达都需要宿主细胞的分裂。
慢病毒载体衍生自慢病毒，其是复合反转录病毒，除了常见的反转录病毒基因gag、pol和env外，还包含其他具有调节或结构功能的基因(参见，如，美国专利号6,013,516和5,994,136)。慢病毒的一些实例包括人免疫缺陷病毒(HIV-1，HIV-2)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。慢病毒载体已经通过多倍减毒HIV毒力基因而产生，例如，基因env、vif、vpr、vpu和nef被缺失，使得载体在生物上安全。慢病毒载体能够感染非分裂细胞，并且可以用于(例如，编码主题CAR的核酸的)体内和离体基因转移和表达(参见，如，美国专利号5,994,136)。
可以通过本领域技术人员已知的任何方式将包括本公开的核酸的表达载体引入宿主细胞。如果需要，表达载体可以包括用于转染的病毒序列。可选地，表达载体可以通过融合、电穿孔、生物射弹、转染、脂质转染等被引入。可以在引入表达载体之前在培养物中培养和扩展宿主细胞，然后对其进行适当处理以引入和整合载体。然后扩展宿主细胞，并可以借助载体中存在的标记物进行筛选。可以使用的各种标记是本领域已知的，并且可以包括hprt、新霉素抗性、胸苷激酶、潮霉素抗性等。如本文所用，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换地使用。在一些实施方式中，宿主细胞是免疫细胞或其前体，例如，T细胞、NK细胞或NKT细胞。
本发明还提供了基因工程化细胞，其包括并稳定表达本公开的主题CAR。在一些实施方式中，基因工程化细胞是基因工程化T-淋巴细胞(T细胞)、幼稚T细胞(TN)、记忆T细胞(例如，中央记忆T细胞(TCM)、效应记忆细胞(TEM))、自然杀伤细胞(NK细胞)、和能够产生治疗相关后代的巨噬细胞。在一个实施方式中，基因工程化细胞是自体细胞。
修饰的细胞(如，包含主题CAR)可以通过用包括本公开的核酸的表达载体稳定转染宿主细胞而产生。产生本公开的修饰的细胞的额外的方法包括但不限于化学转化方法(如，使用磷酸钙、树状聚体(dendrimer)、脂质体和/或阳离子聚合物)、非化学转化方法(如，电穿孔、光学转化、基因电转移和/或流体动力递送)和/或基于粒子的方法(如，刺穿转染(impalefection)、使用基因枪和/或磁转染(magnetofection))。表达本公开的主题CAR的转染的细胞可以离体扩展。
将表达载体引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包括载体和或外源核酸的细胞的方法在本领域内众所周知。参见，如，Sambrook等人(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合体、纳米胶囊、微球、珠、和基于脂质的系统(包括水包油乳液、微团、混合微团和脂质体)。用作体外和体内递送运载体的示例性胶体系统是脂质体(如，人工膜囊泡)。
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从Sigma,St.Louis,MO获得；磷酸双十六烷酯(“DCP”)可以从K&K Laboratories(Plainview,NY)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)获得。氯仿或氯仿/甲醇中脂质的储备溶液可以存储在约-20℃下。由于氯仿比甲醇更容易蒸发，其被用作唯一的溶剂。“脂质体”是涵盖多种通过产生封闭的脂质双层或聚集体形成的单或多层脂质运载体的一般术语。脂质体可以表征为具有囊泡结构，该囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性培养基。多层脂质体具有由水性培养基分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水性溶液中时，他们同时形成。在形成闭合结构之前，脂质成分经历自重排并俘获脂质双层之间的水和溶解的溶质(Ghosh等人,1991Glycobiology 5:505-10)。然而，除了正常囊泡结构外在溶液中具有不同结构的组合物也被考虑。例如，脂质可以假设微团结构或仅仅作为脂质分子的非均匀聚集体存在。还考虑了脂质转染胺-核酸复合体。.
不管用于将外源核酸引入宿主细胞或以其它方式将细胞暴露于本发明的抑制剂的方法如何，为了确认在宿主细胞中存在该核酸，可以进行各种试验。这样的试验包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”试验，比如DNA印迹和RNA印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”试验，比如例如通过免疫学手段(ELlSA和蛋白质印迹)或通过本文描述的鉴定落入本发明范围内的试剂的试验来检测特定肽的存在或不存在。
而且，核酸可以通过任意方式被引入，诸如转导扩展的T细胞、转染扩展的T细胞，和电穿孔扩展的T细胞。一种核酸可以通过一种方法被引入，和另一种核酸可以通过不同的方法被引入T细胞。
RNA
在一个实施方式中，引入宿主细胞的核酸是RNA。在另一个实施方式中，RNA是包括体外转录的RNA或合成RNA的mRNA。使用聚合酶链式反应(PCR)生成的模板通过体外转录产生RNA。来自任何来源的感兴趣的DNA可以通过PCR直接转化为使用适当的引物和RNA聚合酶的体外mRNA合成的模板。DNA的来源可以是，例如，基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其它适当的DNA来源。
PCR可以被用于生成体外转录mRNA——其随后被引入细胞——的模板。用于进行PCR的方法是本领域熟知的。用于PCR的引物被设计为具有与待用作PCR模板的DNA的区域基本上互补的区域。如本文使用的“基本上互补的”指的是引物序列中的大部分或所有碱基是互补的、或一个或多个碱基是非互补的或错配的核苷酸的序列。基本上互补的序列能够与目标DNA靶标在用于PCR的退火条件下退火或杂交。引物可以被设计为与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，引物可以被设计为扩增在细胞中正常转录的部分基因(开放阅读框)，包括5'和3'UTR。引物还可以被设计为扩增编码感兴趣的特定结构域的部分基因。在一个实施方式中，引物被设计为扩增包括所有或部分5'和3'UTR的人cDNA的编码区。通过本领域熟知的合成方法生成可用于PCR的引物。“正向引物”是包含与待扩增的DNA序列上游的DNA模板上的核苷酸基本上互补的核苷酸区域的引物。本文使用的“上游”指的是待扩增的DNA序列相对于编码链的5'位置。“反向引物”是包含与待扩增的DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补的核苷酸区域的引物。本文使用的“下游”指的是待扩增的DNA序列相对于编码链的3'位置。
还可以使用具有促进RNA的稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。RNA优选地具有5'和3'UTR。在一个实施方式中，5'UTR的长度在零和3000个核苷酸之间。待添加至编码区的5'和3'UTR序列的长度可以通过不同的方法改变，其包括但不限于设计用于PCR的引物，其退火至UTR的不同区域。使用此方法，本领域普通技术人员可以修改实现转染转录的RNA之后最佳翻译效率所需要的5'和3'UTR长度。
5'和3'UTR可以是感兴趣的基因的天然存在的内源性5'和3'UTR。可选地，可以通过将UTR序列并入正向和反向引物或通过模板的任何其它修饰添加对感兴趣的基因非内源性的UTR序列。使用对感兴趣的基因非内源性的UTR序列对修改RNA的稳定性和/或翻译效率可以是有用的。例如，已知3'UTR序列中的富AU元件可以降低mRNA的稳定性。因此，3'UTR可以被选择或设计以基于本领域熟知的UTR的性质增加转录的RNA的稳定性。
在一个实施方式中，5'UTR可以包含内源基因的Kozak序列。可选地，当正在通过如上面描述的PCR添加对感兴趣的基因非内源性的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可以增加一些RNA转录物的翻译效率，但是似乎不是所有RNA能够高效翻译所必需的。许多mRNA的Kozak序列的要求是本领域已知的。在其它实施方式中，5'UTR可以源自其RNA基因组在细胞中稳定的RNA病毒。在其它实施方式中，多种核苷酸类似物可以被用于3'或5'UTR中以阻碍mRNA的核酸外切酶降解。
为了使得能够从DNA模板合成RNA而不需要基因克隆，转录的启动子应当被附加至待转录的序列上游的DNA模板。当作为RNA聚合酶的启动子起作用的序列被添加至正向引物的5'端时，RNA聚合酶启动子并入待转录的开放阅读框上游的PCR产物。在一个实施方式中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文其它地方描述的。其它有用的启动子包括但不限于T3和SP6 RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有的核苷酸序列是本领域已知的。
在一个实施方式中，mRNA具有5'端上的帽和3'聚腺苷酸尾二者，其决定核糖体结合、翻译起始和mRNA在细胞中的稳定性。在环状DNA模板例如质粒DNA上，RNA聚合酶产生不适于在真核细胞中表达的长的多联体产物(concatameric product)。在3'UTR的端处线性化的质粒DNA的转录产生正常大小的mRNA，其在真核转染中无效，即使其在转录后被聚腺苷酸化。
在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可以使转录物的3'端延伸超过模板的最后一个碱基(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003)。
将聚A/T区段整合入DNA模板的常规方法是分子克隆。然而，整合入质粒DNA的聚A/T序列可能引起质粒不稳定，这就是为什么从细菌细胞获得的质粒DNA模板经常被缺失和其它畸变高度污染。这使得克隆程序不仅费力和耗时，并且经常不可靠。这就是为什么允许构建具有聚A/T 3'区段的DNA模板而没有克隆的方法是高度期望的。
转录的DNA模板的聚A/T区段可以在PCR期间通过使用包含聚T尾——比如100个T尾(大小可以是50-5000个T)——的反向引物产生，或在PCR后通过任何其它方法产生，该方法包括但不限于DNA连接或体外重组。聚腺苷酸尾还给RNA提供稳定性并且减少它们的降解。通常地，聚腺苷酸尾的长度与转录的RNA的稳定性正相关。在一个实施方式中，聚腺苷酸尾在100和5000个腺苷之间。
可以在体外转录之后使用聚腺苷酸聚合酶比如大肠杆菌聚腺苷酸聚合酶(E-PAP)进一步延伸RNA的聚腺苷酸尾。在一个实施方式中，使聚腺苷酸尾的长度从100个核苷酸增加至300和400个之间的核苷酸导致RNA的翻译效率增加大约两倍。另外地，不同的化学基团附加至3'端可以增加mRNA稳定性。这样的附加可以包含修饰的/人工的核苷酸、适配体和其它化合物。例如，ATP类似物可以使用聚腺苷酸聚合酶并入聚腺苷酸尾。ATP类似物可以进一步增加RNA的稳定性。
5'帽也给RNA分子提供稳定性。在优选的实施方式中，通过本文公开的方法产生的RNA包括5'帽。使用本领域已知的和本文描述的技术提供5'帽(Cougot,等人,Trends inBiochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski,等人,RNA,7:1468-95(2001)；Elango,等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。
通过本文公开的方法产生的RNA还可以包含内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是起始帽-独立性核糖体结合至mRNA并且促进翻译起始的任何病毒序列、染色体序列或人工设计的序列。可以包括适于细胞电穿孔的任何溶质，其可以包含促进细胞通透性和生存力的因子，比如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
在一些实施方式中，RNA被电穿孔入细胞内，诸如体外转录的RNA。
公开的方法可适用于癌症、干细胞、急性和慢性感染和自身免疫疾病领域(包括基因修饰的宿主细胞杀伤靶标癌细胞的能力的评估)中的基础研究中的宿主细胞活性的调节。
这些方法还提供了通过改变例如，输入RNA的启动子或数量来控制宽范围内表达水平的能力，使得其可以单独调节表达水平。此外，基于PCR的mRNA生产技术极大地促进了具有不同的结构及其结构域的组合的mRNA的设计。
本发明的RNA转染方法的一个优点是RNA转染基本上是瞬时的且没有载体。RNA转基因可以被递送至淋巴细胞并在其中表达，转基因可在短暂的体外细胞活化后被递送至淋巴细胞并在其中表达，作为最小表达弹夹，而无需任何其他病毒序列。在这些条件下，不可能将转基因整合入宿主细胞。由于RNA的转染的效率和其非均匀修改整个淋巴细胞群的能力，克隆细胞不是必须的。
体外转录RNA(IVT-RNA)对宿主细胞的遗传修饰利用了两种不同的策略，两种策略均已在各种动物模型中进行了连续测试。通过脂质体转染或电穿孔，利用体外转录的RNA对细胞进行转染。使用各种修饰来稳定IVT-RNA，从而实现转移的IVT-RNA的延长表达。
一些IVT载体是文献中已知的，其以标准化方式被用作体外转录的模板并且已经以如此方式被基因修饰：该方式产生稳定的RNA转录物。当前，用于本领域的方案基于具有下列结构的质粒载体：使得能够RNA转录的5'RNA聚合酶启动子，接着是由非翻译区域(UTR)在3'和/或5'侧接的感兴趣的基因，和包含50-70个A核苷酸的3'聚腺嘌呤基盒。在体外转录之前，环状质粒在聚腺嘌呤基盒下游通过II型限制酶(识别序列对应于切割位点)线性化。聚腺嘌呤基盒因而对应于转录物中的后面的聚腺苷酸序列。作为此程序的结果，一些核苷酸在线性化后仍作为部分酶切割位点保留并且延伸或掩盖3'端处的聚腺苷酸序列。尚不清楚此非生理学突出端是否影响从这样的构建体细胞内产生的蛋白质的量。
与传统的质粒或病毒方法相比，RNA具有多个优势。RNA来源的基因表达不需要转录，并且转染后迅速产生蛋白质产物。此外，由于RNA只需要进入细胞质而不是细胞核，并因此是典型的转染方法导致极高的转染率。此外，在研究下，基于质粒的方法要求驱动感兴趣的基因的表达的启动子在细胞中是活性的。
在另一方面，RNA构建体通过电穿孔被递送入细胞。参见，例如，如在US2004/0014645、US2005/0052630A1、US2005/0070841A1、US2004/0059285A1、US2004/0092907A1中教导的将核酸构建体电穿孔入哺乳动物细胞的制剂和方法。包括电穿孔任何已知的细胞类型所需要的电场强度在内的多个参数在相关的研究文献以及该领域的众多专利和申请中通常是已知的。参见例如，美国专利号6,678,556、美国专利号7,171,264和美国专利号7,173,116。用于电穿孔的治疗性应用的设备是商业上可获得的，例如，MedPulserTMDNA电穿孔治疗系统(Inovio/Genetronics,San Diego,Calif.)，并且在专利比如美国专利号6,567,694；美国专利号6,516,223、美国专利号5,993,434、美国专利号6,181,964、美国专利号6,241,701和美国专利号6,233,482中描述；电穿孔也可以被用于细胞体外转染，例如，如在US20070128708A1中描述的。电穿孔也可以被用于将核酸体外递送入细胞。因此，利用本领域技术人员已知的许多可用的装置和电穿孔系统中的任一种将包括核酸的表达构建体电穿孔介导的施用入细胞提供了令人激动的将感兴趣的RNA递送至靶标细胞的新手段。
免疫细胞的来源
扩展前，从对象获得免疫细胞的来源以进行离体操作。用于离体操作的靶细胞的来源还可以包括，如，自体或异源供体血、脐带血或骨髓。例如，免疫细胞的来源可来自待用本发明的修饰的免疫细胞治疗的对象，如，对象的血液，对象的脐带血或对象的骨髓。对象的非限制性实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。优选地，对象为人。
免疫细胞可以从多种来源获得，包括血液、外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾脏组织、脐带、淋巴或淋巴器官。免疫细胞是免疫系统的细胞，诸如先天或适应性免疫性的细胞，如髓样或淋巴样细胞，包括淋巴细胞，通常为T细胞和/或NK细胞。其他示例性细胞包括干细胞，诸如多能(multipotent,pluripotent)干细胞，包括诱导的多能干细胞(iPSC).在一些方面，细胞是人类细胞。就治疗对象而言，细胞可能是同种异体的和/或自体的。细胞通常是原代细胞，诸如直接从对象分离和/或从对象分离并冷冻的细胞。
在某些实施方式，免疫细胞是T细胞，如，CD8+T细胞(如，CD8+幼稚T细胞，中央记忆T细胞，或效应记忆T细胞)，CD4+T细胞，自然杀伤T细胞(NKT细胞)，调节T细胞(Treg)，干细胞记忆T细胞，淋巴祖先细胞，造血干细胞，自然杀伤细胞(NK细胞)或树状细胞。在一些实施方式中，细胞是单核细胞或粒细胞，如，髓样细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，树状细胞，肥大细胞，嗜酸性粒细胞，和/或嗜碱性粒细胞。在实施方式中，靶细胞是诱导的多能干(iPS)细胞，或来源自iPS细胞的细胞，如，从对象产生的iPS细胞被操作以改变(如，诱导其中的突变)或操作一个或多个靶基因的表达，并分化为，如，T细胞，如，CD8+T细胞(如，CD8+幼稚T细胞，中央记忆T细胞，或效应记忆T细胞)，CD4+T细胞，干细胞记忆T细胞，淋巴祖先细胞或造血干细胞。
在一些实施方式中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个子集，诸如整个T细胞群，CD4+细胞，CD8+细胞，和其亚群，诸如通过功能、活化状态、成熟度、分化潜能、扩展、循环、定位和/或持久性能力、抗原-特异性、抗原受体的类型、具体器官或区室中存在、标记物或细胞因子分泌曲线、和/或分化程度。在T细胞的子类型和亚群中、和/或CD4+的和/或CD8+的子类型中，T细胞是幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞和其子类型，诸如干细胞记忆T(TSCM)、中央记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)、或末端分化的效应记忆T细胞，肿瘤深入的淋巴细胞(TIL)、不成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、黏膜相关不变T(MAIT)细胞、自然存在的和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞，诸如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞、α/βT细胞、和δ/γT细胞。在某些实施方式，可以使用本领域可获得的任意数目的T细胞系。
在一些实施方式中，方法包括从对象分离免疫细胞，制备、加工、培养和/或工程化他们。在一些实施方式中，制备工程化细胞包括一个或多个培养和/或制备步骤。如描述用于工程化的细胞可以从样品分离，诸如生物样品，如，从对象获得或从来源自对象的样品。在一些实施方式中，由其分离细胞的对象是患有疾病或病症或需要细胞疗法的对象，或将施用细胞疗法的对象。在一些实施方式中，对象是需要特定治疗干预——诸如分离、加工和/或工程化细胞的过继性细胞疗法——的人。因此，在一些实施方式中，细胞是初级细胞，如，初级人细胞。样品包括组织、流体、和从对象直接获取的其他样品，以及从一个或多个加工步骤(诸如分离、离心、基因工程化(如利用病毒载体转导)、洗涤和/或培育)获得的样品。生物样品可以是从生物来源直接获得的样品或加工的样品。生物样品包括但不限于体液，诸如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液和汗液、组织和器官样品，包括从中获得的加工样品。
在一些方面，从中衍生或分离出细胞的样品是血液或血液来源的样品，或者是单采血液成分术或白细胞分离术产物，或来源于单采血液分离术或白细胞分离术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、黏膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾脏、胰腺、乳腺、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官，和/或由此衍生的细胞。在细胞疗法(如，过继性细胞疗法)的背景下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些实施方式中，细胞来源自细胞系，如T细胞系。在一些实施方式中，细胞获得自异种来源，例如，来自小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。在一些实施方式中，分离细胞包括一个或多个制备和/或基于非亲和力细胞分离步骤。在一些实例中，在一种或多种试剂的存在下，洗涤、离心和/或培育细胞，例如，以去除不希望的成分，富集期望的成分，裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些实例中，基于一种或多种性质(诸如密度、粘附性质、大小、对特定成分的敏感性和/或耐性)，分离细胞。
在一些实例中，如，通过单采血液成分术或白细胞分离术从对象的循环血液中获得细胞。在一些方面，样品中含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞、和/或血小板，并在一些方面包含除红细胞和血小板以外的细胞。在一些实施方式中，洗涤从对象收集的血液细胞，如，去除血浆部分并将细胞放置在合适的缓冲液或培养基中，用于随后的加工步骤。在一些方面，洗涤步骤是根据制造商的说明通过切向流过滤(TFF)完成的。在一些实施方式中，将细胞在洗涤后重悬于多种生物相容性缓冲液中。在某些实施方式中，将血液细胞样品的成分去除，并将细胞直接重悬于培养基中。在一些实施方式中，方法包括基于密度的细胞分离方法，诸如通过用Percoll或Ficoll梯度裂解红细胞和离心从外周血制备白细胞。
在一个实施方式中，从通过单采血液成分术或白细胞分离术获得的个体的循环血获得免疫细胞。单采血液成分术产物通常包含淋巴细胞，其包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它成核的白细胞、红细胞和血小板。可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆部分并且将细胞放置在适当的缓冲液或培养基中，用于后续处理步骤，该缓冲液或培养基比如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或洗涤液，其缺少钙并且可能缺少镁或可能缺少很多——如果不是全部的话——二价阳离子。在洗涤后，细胞可以被重悬在各种生物相容性缓冲液中，比如，例如，无Ca、无Mg PBS。可选地，可以去除单采血液成分术样品的非期望组分，并且将细胞直接重悬在培养基中。
在一些实施方式中，分离方法包括基于细胞中一种或多种具体分子(诸如表面标记物，如表面蛋白、细胞内标记物或核酸)的表达或存在分离不同的细胞类型。在一些实施方式中，可以使用基于这类标记物的分离的任何已知方法。在一些实施方式中，分离是基于亲和力-或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，分离包括基于细胞表达或一种或多种标记物(通常为细胞表面标记物)的表达水平分离细胞和细胞群，例如，通过用与这类标记物特异性结合的抗体或结合配偶体培育，通常之后伴随洗涤步骤和分离以及结合抗体或结合配偶体的细胞与还没有结合抗体或结合配偶体的那些细胞。这类分离步骤可以基于正选择，其中已经结合试剂的细胞被保留用于以后使用，和/或负选择，其中还没有结合抗体或结合配偶体的细胞被保留。在一些实例中，两个部分被保留用于以后使用。在一些方面中，负选择可以特别有用，其中没有特异性鉴定异质群体中的细胞类型的抗体可用，使得分离基于由细胞而不是期望的群体表达的标记物最好地进行。分离不需要导致100％富集或去除特定细胞群或表达特定标记物的细胞。例如，特定类型(诸如表达标记物的那些)的细胞的正选择或富集指增加这类细胞的数目或百分比，但是不需要导致完全不存在不表达标记物的细胞。同样地，特定类型(诸如表达标记物的那些)的负选择、去除或耗尽(depletion)指的是减少这类细胞的数目或百分比，但是不需要导致完全去除所有这类细胞。
在一些实例中，进行多轮分离步骤，其中从一个步骤正或负选择的部分经历另一分离步骤，诸如随后的正或负选择。在一些实例中，单个分离步骤可以同时耗尽表达多个标记物的细胞，诸如通过用多个抗体或结合配偶体培育细胞，每个特异性针对靶向负选择的标记物。同样地，可以通过用在各种细胞类型上表达的多个抗体或结合配偶体培育细胞同时正选择多个细胞类型。
在一些实施方式中，T细胞群中一种或多种富集或耗尽对(标记物+)为正或表达高水平(标记物高)的一种或多种特定标记物(诸如表面标记物)的细胞，或者对(标记物-)为负或表达相对低水平(标记物低)的一种或多种标记物的细胞。例如，在一些方面中，T细胞的具体亚群——诸如正或表达高水平的一种或多种标记物的细胞，如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+、和/或CD45RO+T细胞——通过正或负选择技术进行分离。在一些情况中，这类标记物是在T细胞(诸如非记忆细胞)的某些群体上不存在或以相对低水平表达但是在T细胞(诸如记忆细胞)的某些其他群体上存在或以相对较高水平表达的那些。在一个实施方式中，细胞(诸如CD8+细胞或T细胞，如，CD3+细胞)富集(即，正选择)细胞，这些细胞为正或表达高表面水平的CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127、和/或CD62L，和/或耗尽(如，负选择)细胞，这些细胞为正或表达高表面水平的CD45RA。在一些实施方式中，细胞富集或耗尽为正或表达高水平的CD122、CD95、CD25、CD27、和/或IL7-Ra(CD127)的细胞。在一些实例中，CD8+T细胞富集对CD45RO为正(或对CD45RA为负)的细胞和CD62L。例如，CD3+、CD28+T细胞可以使用CD3/CD28共轭磁性珠阴性正选择(如，
Figure BDA0002288634040000441
M-450CD3/CD28 T Cell Expander)。
在一些实施方式中，通过负选择在非T细胞(诸如B细胞、单核细胞或其他白细胞，诸如CD14)上表达的标记物分离T细胞与PBMC样品。在一些方面中，CD4+或CD8+选择步骤被用于分离CD4辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞。这类CD4+和CD8+群体可以进一步通过正或负选择在一个或多个幼稚、记忆和/或效应T细胞群上表达或表达至相对较高程度的标记物被分选为亚群。在一些实施方式中，CD8+细胞进一步富集或耗尽幼稚、中央记忆、效应基因、和/或中央记忆干细胞，诸如通过与各自亚群相关的表面抗原的正或负选择。在一些实施方式中，进行中央记忆T(TCM)细胞的富集以增加效率，诸如在施用后提高长期存活、扩展和/或移入，其在一些方面中，在这类的亚群中特别坚固。在一些实施方式中，组合TCM-富集的CD8+T细胞和CD4+T细胞进一步增强效率。
在一些实施方式中，在CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-子集中均存在记忆T细胞。PBMC可以富集或耗尽CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+部分，诸如施用抗-CD8和抗-CD62L抗体。在一些实施方式中，CD4+T细胞群和/或CD8+T群体富集中央记忆(TCM)细胞。在一些实施方式中，中央记忆T(TCM)细胞的富集基于正或高表面表达CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、和/或CD 127；在一些方面，其基于负选择表达或相对高表达CD45RA和/或粒酶B的细胞。在一些方面中，通过耗尽表达CD4、CD 14、CD45RA的细胞，和正选择或富集表达CD62L的细胞进行富集TCM细胞的CD8+群体的分离。在一个方面，以基于CD4表达选择的细胞的负部分开始进行中央记忆T(TCM)细胞的富集，其经受基于CD 14和CD45RA的表达的负选择，和基于CD62L的正选择。在一些方面中，同时进行这样的选择，和在其他方面中以任一顺序顺序地进行这样的选择。在一些方面，用于制备CD8+细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于产生CD4+细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的正或负部分都保留并在方法的随后步骤中使用，任选地在一个或多个进一步正或负选择步骤。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞，将CD4+T辅助细胞分选为幼稚、中央记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可以通过标准方法获得。在一些实施方式中，幼稚CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在一些实施方式中，中央记忆CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方式中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO。在一个实例中，为了通过负选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括对CD14、CD20、CDl lb、CD16、HLA-DR、和CD8的抗体。在一些实施方式中，抗体或结合配偶体被结合至固体支持体或基体，诸如磁珠或顺磁珠，以允许分离正和/或负选择的细胞。
在一些实施方式中，在基因工程化之前或联合基因工程化培育和/或培养细胞。培育步骤可以包括培养、培育、刺激、活化、和/或增殖。在一些实施方式中，在刺激条件或刺激剂的存在下培育组合物或细胞。这样的条件包括设计以诱导群体中细胞的增殖、扩展、活化和/或存活，从而模拟抗原暴露，和/引发基因工程化的细胞，诸如用于引入重组的抗原受体的那些条件。条件可以包括特定的培养基、温度、氧气含量、二氧化碳含量、时间、试剂(如，营养素、氨基酸、抗生素、离子、和/或刺激因子——诸如细胞因子、趋化因子)、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和设计以活化细胞的任何其他试剂中的一种或多种。在一些实施方式中，刺激条件或试剂包括一种或多种试剂，如配体，其能够活化TCR复合体的细胞内信号传导结构域。在一些方面，试剂打开或开始T细胞中的TCR/CD3细胞内信号传导级联。这样的试剂可以包括抗体，诸如对TCR成分和/或共刺激受体特异性的那些抗体，如，抗-CD3、抗-CD28，例如，结合至固体支持体(诸如珠)，和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩展方法可进一步包括向培养基添加抗-CD3和/或抗CD28抗体的步骤(如，以至少约0.5ng/ml的浓度)。在一些实施方式中，刺激剂包括IL-2和/或IL-15，例如，至少约10单位/mL的IL-2浓度。
在另一实施方式中，通过裂解红细胞和耗尽单核细胞从外周血分离T细胞，例如，通过经由PERCOLLTM梯度的离心。可选地，可以从脐带分离T细胞。无论如何，可以通过正或负选择技术进一步分离T细胞的特定亚群。
如此分离的脐带血单核细胞可以被耗尽表达某些抗原——包括但不限于CD34、CD8、CD14、CD19和CD56——的细胞。可以使用分离的抗体、包括抗体的生物学样品比如腹水、结合至物理支持体(support)的抗体和细胞结合的抗体完成这些细胞的耗尽。
可以使用针对对负选择的细胞独特的表面标志物的抗体的组合完成通过负选择富集T细胞群。优选的方法是细胞分选和/或选择，其经由负磁性免疫粘附或使用针对在负选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物的流式细胞术。例如，为了通过负选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。
对于通过正或负选择分离期望的细胞群，可以改变细胞和表面(例如，颗粒比如珠)的浓度。在某些实施方式中，可能期望的是，显著地降低珠和细胞被混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方式中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在进一步的实施方式中，使用大于1亿个细胞/ml。在进一步的实施方式中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50×106个细胞/ml的细胞浓度。在又另一个实施方式中，使用75、80、85、90、95或100×106个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方式中，可以使用125或150×106个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以产生增加的细胞产率、细胞活化和细胞扩展。
在洗涤步骤后，还可以冷冻T细胞，其不需要单核细胞-去除步骤。虽然不希望被理论束缚，但是通过去除细胞群中的粒细胞和一定程度的单核细胞，冷冻和后续的解冻步骤提供了更均一的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤后，细胞可以被悬浮在冷冻液中。虽然许多冷冻液和参数是本领域已知的并且将在此背景下是有用的，但是在非限制性实例中，一种方法涉及使用包含20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或其它合适的细胞冷冻培养基。细胞然后以1℃/分钟的速率被冷冻至-80℃，并且储存在液氮储罐的蒸汽相中。可以使用受控冷冻的其它方法以及在-20℃下或在液氮中不受控的即刻冷冻。
在一个实施方式中，T细胞群包括在诸如外周血单核细胞、脐带血细胞、纯化的T细胞群和T细胞系的细胞内。在另一个实施方式中，外周血单核细胞包括T细胞群。在又另一个实施方式中，纯化的T细胞包括T细胞群。
在某些实施方式，T调节细胞(Treg)可以从样品分离。样品可以包括但不限于脐带血或外周血。在某些实施方式，Treg通过流式细胞术分选进行分离。样品可以在通过本领域内已知的任何手段分离之前富集Treg。分离的Treg可以被冷冻保存，和/或扩展，然后使用。分离Treg的方法在美国专利号7,754,482、8,722,400和9,555,105和美国专利申请号13/639,927中描述，其内容以其全部并入本文。
免疫细胞的扩展
爱修饰细胞表达主题CAR之前或者之后，可以使用例如在美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041和美国专利申请号中20060121005所描述的方法活化细胞并在数目上扩展细胞。例如，通过与已经向其附接刺激CD3/TCR复合体相关信号的试剂和刺激免疫细胞的表面上共刺激分子的配体的表面接触来扩展本发明的免疫细胞。具体地，免疫细胞群可以通过与抗-CD3抗体或其抗原结合片段，或固定在表面上的抗-CD2抗体接触，或通过与蛋白激酶C活化剂(如，苔藓抑制素)联合钙离子载体接触进行刺激。对于免疫细胞的表面上的辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，免疫细胞可以在适合刺激免疫细胞的增殖的条件下与抗-CD3抗体和抗-CD28抗体接触。抗-CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besancon,France)并且这些可以在本发明中使用，本领域已知的其他方法和试剂也可在本发明中使用(参见，如，ten Berge等人,Transplant Proc.(1998)30(8):3975-3977；Haanen等人,J.Exp.Med.(1999)190(9):1319-1328；和Garland等人,J.Immunol.Methods(1999)227(1-2):53-63)。
通过本文公开的方法扩展免疫细胞可以倍增达10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更大，和其间的任何和所有全部或部分整数。在一个实施方式中，免疫细胞以约20倍至约50倍的范围扩展。
在培养之后，在将细胞传递至另一个培养设备前，免疫细胞可以在培养设备中的细胞培养基中培育一段时间或直到细胞达到进行最佳传代的汇合或高细胞密度。培养设备可以具有一般用于体外培养细胞的任何培养设备。优选地，在将细胞传递至另一个培养设备前，汇合水平是70％或更大。更优选地，汇合水平是90％或更大。一段时间可以是适于细胞体外培养的任何时间。可以在免疫细胞培养的任何时间替换免疫细胞培养基。优选地，大约每2至3天替换免疫细胞培养基。然后从培养设备采集免疫细胞，于是免疫细胞可以被立即使用或冷藏储存以备后用。在一个实施方式中，本发明包括冷藏扩展的免疫细胞。在将核酸引入免疫细胞之前解冻冷藏的T细胞。
在另一实施方式中，方法包含分离免疫细胞和扩展免疫细胞。在另一实施方式中，本发明进一步包含在扩展之前冷藏免疫细胞。在又另一个实施方式中，冷藏的免疫细胞被解冻，用于利用编码嵌合膜蛋白的RNA进行电穿孔。
在美国专利号5,199,942中(通过引用并入本文)描述了离体扩展细胞的另一程序。诸如在美国专利号5,199,942中描述的扩展可以是可选的或除了本文描述的其他扩展的方法。简言之，离体培养和扩展免疫细胞包含添加至细胞生长因子(诸如美国专利号中描述的那些细胞生长因子)或其他因子(诸如flt3-L、IL-1、IL-3和c-试剂盒配体)。在一个实施方式中，扩展免疫细胞包含利用选自flt3-L、IL-1、IL-3和c-试剂盒配体的因子培养免疫细胞。
如本文描述的培养步骤(与如本文描述的试剂接触，或在电穿孔之后)可以非常短，例如小于24小时比如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时。如本文进一步描述的培养步骤(与试剂接触，如本文描述的)可以较长，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。
各种术语用来描述培养物中的细胞。细胞培养通常是指从活生物体中提取并在受控条件下生长的细胞。初级细胞培养物是直接从生物体中提取并在第一传代培养之前的细胞、组织或器官的培养物。当将细胞放在促进细胞生长和/或分裂的条件下的生长培养基中时，细胞在培养物中扩展，导致更大的细胞群。当细胞在培养物中扩展时，通常通过细胞数目翻倍所需的时间(也称为翻倍时间)来测量细胞增殖的速率。
每轮传代培养称为传代。当传代培养细胞时，它们被称为已经被传代。具体的细胞群，或细胞系有时被称为或表征为其已经传代的次数。例如，经过十次传代的培养的细胞群可称为P10培养物。初级培养，即从组织中分离出细胞后的第一培养物，指定为P0。在第一传代培养后，细胞被描述为第二培养物(P1或传代1)。在第二传代培养后，细胞变成第三培养物(P2或传代2)，等等。本领域技术人员将理解，在传代期期间可能存在许多群体翻倍；因此，培养物的群体翻倍的数大于传代数。传代之间的时期期间细胞的扩展(即，群体翻倍)取决于许多因素，包括但不限于播种密度、底物、培养基传代之间的时间。
在一个实施方式中，细胞可以被培养数小时(大约3小时)至大约14天或其间的任何小时的整数值。适于免疫细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo15，(Lonza))，其可以包含增殖和生存力必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF-β、和TNF-α、或技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂比如N-乙酰-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo15、和X-Vivo20、Optimizer(具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或限定的激素组)、和/或足够免疫细胞的生长和扩展的量的细胞因子(一种或多种)。抗生素例如青霉素和链霉素仅包括在实验培养物中，而不在被注入对象的细胞培养物中。靶标细胞被维持在支持生长必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。
用于培养免疫细胞的培养基可以包括可以共刺激免疫细胞的试剂。例如，可以刺激CD3的试剂是CD3的抗体，并且可以刺激CD28的试剂是CD28的抗体。这是因为，如由本文公开的数据展现的，通过本文公开的方法分离的细胞可以被扩展大约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更大。在一个实施方式中，通过培养电穿孔的群体以大约20倍至大约50倍或更大的范围扩展免疫细胞。在一个实施方式中，人T调节细胞经由包被KT64.86人工抗原呈递细胞(aAPC)的抗-CD3抗体进行扩展。可在美国专利号7,754,482、8,722,400和9,555,105中找到扩展和活化免疫细胞的方法，其内容以其全部并入本文。
在一个实施方式中，扩展免疫细胞的方法可以进一步包括分离扩展的免疫细胞以用于进一步的应用。在另一实施方式中，扩展方法可以进一步包括对扩展的免疫细胞进行随后的电穿孔，然后进行培养。随后的电穿孔可以包括引入编码试剂的核酸——例如转导扩增的免疫细胞，转染扩增的免疫细胞或用核酸电穿孔扩增的免疫细胞——进入扩展的免疫细胞群，其中试剂进一步刺激免疫细胞。试剂可刺激免疫细胞，诸如通过刺激进一步的扩展，效应功能或另一免疫细胞功能。
治疗方法
本文所述的修饰的免疫细胞(如，调节T细胞)可包括在用于免疫疗法的组合物中，尤其是抑制性免疫疗法。该组合物可包括药物组合物，并且进一步包括药学上可接受的载体。可以施用治疗有效量的包含修饰的免疫细胞的药物组合物。
在一个方面，本发明包括用于过继性细胞转移疗法的方法，包括向有需要的对象施用本发明的修饰的免疫细胞(如，调节T细胞)。在另一方面，本发明包括治疗对象中的疾病或病症的方法，包括向有需要的对象施用修饰的免疫细胞群。
在一个实施方式中，治疗有需要的对象中的疾病或病症的方法包括向对象施用治疗有效量的包含主题CAR(如，HLA-A2 CAR)的修饰的Treg。在一个实施方式中，治疗有需要的对象中的疾病或病症的方法包含向对象施用有效量的包含主题CAR(如，HLA-A2 CAR)的修饰的Treg，其中主题CAR包含与HLA-A2、HLA-A28和/或HLA-A68结合的抗原结合结构域。在一个实施方式中，HLA-A2特异性CAR包含CD8信号肽、HLA-A2 VH结构域、间隔区序列、HLA-A2VL结构域、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、和CD3ζ细胞内结构域。
本发明的HLA-A2 CAR能够将免疫细胞(如，调节T细胞)重定向至表达HLA-A2同种异体抗原的靶标。因此，本发明的主题CAR是同种异体抗原-特异性CAR。通过HLA-A2结合活化后表达本发明的HLA-A2 CAR的Treg诱导修饰的Treg的增殖并增强修饰的Treg的抑制功能。
当施用包含本发明的主题CAR的修饰的免疫细胞时，可保护移植的组织免受排斥。在一个实施方式中，包含本发明的主题CAR的修饰的免疫细胞(如，包含HLA-A2 CAR的Treg)可以介导HLA-A2特异性免疫抑制。在一个实施方式中，包含本发明的主题CAR的修饰的免疫细胞(例如，包含HLA-A2 CAR的Treg)可以抑制对同种异体抗原(如，HLA-A2)应答的T细胞增殖。在一些实施方式中，在细胞、组织和/或器官移植后，HLA-A2可能在移植的细胞、组织和/或器官上广泛表达。在这种情况下，可发生大量的免疫细胞渗入到移植的细胞、组织和或器官中，导致移植的细胞、组织和/或器官破坏。因此，在一些实施方式中，包含本发明的主题CAR的修饰的免疫细胞(如，包含HLA-A2 CAR的Treg)能够减少免疫细胞的渗入，并从而保护移植的细胞、组织和/或器官免受破坏。在一些情况下，移植的细胞、组织和/或器官可能介导毒性。因此，在一些实施方式中，包含发明的主题CAR的修饰的免疫细胞(例如，包含HLA-A2 CAR的Treg)能够减少移植的细胞、组织和/或器官介导的毒性。
因此，本发明提供了一种在有需要的对象中实现预防性治疗效果的方法，和/或在有需要的对象中实现免疫抑制效果的方法，如，在正在经历和/或遭受同种异体应答或自体免疫应答的对象中。在一些实施方式中，在有需要的对象中实现预防性治疗效果的方法，和/或在有需要的具有同种异体应答或自体免疫应答的对象中实现免疫抑制效果的方法包括向对象施用包含本发明的主题的CAR的修饰的免疫细胞。在一个实施方式中，本发明提供了在有需要的具有同种异体应答或自身免疫应答的对象中实现免疫抑制效果的方法，该方法包括向对象施用修饰的调节T细胞，该调节T细胞包含对HLA-A2具有亲和力的嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR包含HLA-A2结合结构域、CD8铰链结构、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、和CD3ζ细胞内结构域。在一个实施方式中，本发明提供了在有需要的对象中实现预防性治疗效果的方法，该方法包括向对象施用修饰的调节T细胞，该调节T细胞包括对HLA-A2具有亲和力的嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR包含HLA-A2结合结构域、CD8铰链结构域、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、和CD3ζ细胞内结构域。
1型糖尿病是T细胞介导的自体免疫疾病，导致胰岛β-细胞破坏、血内胰岛素不足和严重改变的葡萄糖体内稳态。调节T细胞(Treg)的失败可能在1型糖尿病的发展中起作用。在免疫体内稳态期间，Treg抗衡自身反应性效应T细胞的作用，从而参与外周耐受(peripheral tolerance)。因此，效应T细胞和Treg之间的失衡可能导致外周耐受的破坏，导致1型糖尿病的发展。在一些实施方式中，包含本发明的主题CAR的修饰的免疫细胞(如，包含HLA-A2CAR的Treg)能够抑制T细胞介导的自体免疫疾病，诸如1型糖尿病。因此，本发明提供了治疗有需要的对象的糖尿病的方法，该方法包括向对象施用包含本发明的主题CAR的修饰的免疫细胞。在一些实施方式中，提供治疗有需要的对象的糖尿病的方法，该方法包括向对象施用包含对HLA-A2具有亲和力的嵌合抗原受体(CAR)a的修饰的调节T细胞，其中CAR包含HLA-A2结合结构域、CD8铰链结构域、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、和CD3ζ细胞内结构域。在一些实施方式中，糖尿病是I型糖尿病。
在某些实施方式，CAR由SEQ ID NO:24的核酸序列编码。在某些实施方式，CAR包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
在某些实施方式，修饰的免疫细胞是修饰的调节T细胞(Treg)。在一些实施方式中，修饰的免疫细胞是自体细胞。在一些实施方式中，修饰的免疫细胞(如，修饰的调节T细胞)来源自人。
CAR可重定向T调节细胞至HLA-A2、HLA-A28和/或HLA-A68表达组织，由此增强保护移植的组织免受排斥。包含编码HLA-A2特异性的核酸的T细胞可以在组织移植之前、之时或之后即刻进行施用。
本发明的方法应解释为包括保护任何类型的移植的器官、组织或细胞免受排斥，包括但不限于肺、心脏、心脏瓣膜、皮肤、肝脏、手、肾脏、胰腺、肠、胃、胸腺、骨骼、肌腱、角膜、睾丸、神经、静脉、血液、骨髓、干细胞、朗格罕细胞的胰岛和造血细胞。本发明的方法还包括保护免受移植物抗宿主病(GVHD)。
在某些实施方式，除了CAR之外，还向对象施用第二治疗，诸如免疫抑制药物。免疫抑制药物的实例包括但不限于泼尼松、硫唑嘌呤、他克莫司和环孢霉素A。
药物组合物
本发明的药物组合物可以包括如本文描述的修饰的免疫细胞，其与一种或多种药学上或生理学上可接受运载体、稀释剂或赋形剂组合。这样的组合物可以包括缓冲液比如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物比如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸比如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂比如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选地配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用数量和频率将通过如下因素确定，比如患者的状况以及患者疾病的类型和严重度，但是可以通过临床试验确定适当的剂量。
相对于接受治疗的对象，待施用的本发明的细胞可以是自体的、同种异体的或异种的。
本发明的细胞可以在适当的临床前和临床实验和试验中待确定的剂量和途径和次数施用。可以以在这些范围内的剂量多次施用细胞组合物。本发明的细胞的施用可以与如本领域技术人员所确定的，用于治疗期望的疾病或病症的其他方法。
还提供了本发明的免疫细胞群、含有这类细胞和/或富集这类细胞的组合物，诸如其中表达重组受体的细胞占组合物中总细胞或某一类型的细胞(诸如调节T细胞)的至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。其中，组合物是用于施用的药物组合物和制剂，诸如用于过继性细胞疗法。还提供了向对象(如患者)施用细胞和组合物的治疗方法。
还提供了用于施用的包括细胞的组合物，包括药物组合物和制剂，诸如包括单位剂型组合物，其包括以给定剂量或其分数施用的细胞数量。药物组合物和制剂一般包括一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方式中，组合物包括至少一种额外的治疗剂。
术语“药物制剂”是指制剂，其形式应允许其中所含活性成分的生物活性有效，并且不包含对施用该制剂的对象具有不可接受的毒性的其他成分。“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分外对对象无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。在一些方面，载体的选择部分地由特定的细胞和/或通过施用方法确定。因此，存在多种合适的制剂。例如，药物组合物可以包含防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵(benzalkoniumchloride)。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或它们的混合物通常以占总组合物重量的约0.0001％至约2％的量存在。如通过Remington's PharmaceuticalSciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)描述载体。
药学上可接受的载体在所用剂量和浓度下通常对受体无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲铵氯化物；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子，诸如钠；金属复合物(如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，缓冲剂包括在组合物中。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以占组合物总重量的约0.001％至约4％的量存在。已知制备可施用的药物组合物的方法。在例如Remington:Science and Practice of Pharmacy,LippincottWilliams&Wilkins；21st ed.(2005年5月1日)中更加详细地描述了示例性方法。
制剂可包含水性溶液。制剂或组合物还可包含一种以上的活性成分，可用于用细胞治疗的特定适应症、疾病或病症，优选地那些具有与细胞互补的活性的成分，其中各自的活性不会对彼此产生不利影响。这样的活性成分以对预定目的有效的量组合合适地存在于组合物中。因此，在一些实施方式中，药物组合物进一步包括其他药学上活性剂或药物，诸如化疗剂，如，天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、阿霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、氨甲蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱和/或长春新碱。在一些实施方式中，药物组合物包含对治疗或预防疾病或病症有效的量的细胞，例如治疗有效量或预防有效量。在一些实施方式中，通过定期评估治疗的对象监测治疗或预防功效。所需剂量可以通过单次弹丸施用细胞、多次弹丸施用细胞或连续输注施用细胞进行递送。
制剂包括口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺、透皮、肌内、鼻内、颊、舌下或栓剂施用的那些制剂。在一些实施方式中，细胞群经肠胃外施用。术语“肠胃外”，如本文所用，包括静脉内、肌肉内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。在一些实施方式中，通过静脉内、腹膜内或皮下注射使用外周全身递送将细胞施用给对象。在一些实施方式中，组合物提供为无菌液体制剂，如，等渗水溶液、悬浮液、乳剂、分散液或粘性组合物，其在一些方面可以缓冲至选定的pH。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物更易于施用，特别是通过注射。另一方面，可以在适当的粘度范围内配制粘性组合物，以提供与具体组织更长的接触时间段。液体或粘性组合物可以包含载体，其可以是溶剂或分散介质，其中包含例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液态聚乙二醇)及其合适的混合物。
无菌注射溶液可通过将细胞掺入溶剂中制备，诸如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(诸如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖)等的混合物中。组合物可包含辅助物质，诸如润湿剂、分散剂或乳化剂(如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝剂或粘性增强添加剂、防腐剂、调味剂和/或色料，这取决于施用途径和所需的制备。在一些方面，可以参考标准文本进行适合的制备。
可以添加各种增强组合物稳定性和无菌性的添加剂，包括抗菌防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗菌和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸)确保防止微生物的作用。可以通过使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)实现可注射药物形式的延长吸收。
用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，可以通过无菌滤膜过滤容易地实现无菌性。
通常可以规定可以以104至109个细胞/kg体重，在一些情况中105至106个细胞/kg体重的剂量——包括那些范围内的所有整数值——施用包括本文描述的包含修饰的免疫细胞的药物组合物。也可以以这些剂量多次施用免疫细胞组合物。可以通过使用免疫疗法中公知的输注技术(参见，如，Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)施用细胞。具体患者的最佳剂量和治疗方案可以通过监测患者的疾病迹象和相应地调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
可以以本领域技术人员已知的任何方便的方式进行本发明的修饰的免疫细胞的施用。本发明的细胞可以通过吸入、注射、摄食、输血、植入或移植的方式施用给对象。可以经动脉、皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌肉内、通过静脉(i.v.)注射、或腹腔内向对象施用本文描述的组合物。在其他情况下，将本发明的细胞直接注射到对象的炎症部位中、对象的局部疾病部位、淋巴结、器官、肿瘤等。
应当理解将在本发明中有用的方法和组合物不限于在实施例中陈述的具体制剂。下列实施例被提出以便为本领域普通技术人员提供如何制造和使用细胞，扩展和培养方法，和本发明的治疗方法的完整的公开内容和描述，并且不意图限制本发明人视为其发明的范围。
除非另外指示，本发明的实践采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其充分在技术人员的见识内。这样的技术在如下文献中充分地说明，诸如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,fourth edition(Sambrook,2012)；“Oligonucleotide Synthesis”(Gait,1984)；“Culture of AnimalCells”(Freshney,2010)；“Methods in Enzymology”“Handbook of ExperimentalImmunology”(Weir,1997)；“Gene Transfer Vectors for mammalian Cells”(Miller和Calos,1987)；“Short Protocols in Molecular Biology”(Ausubel,2002)；“PolymeraseChain Reaction:Principles,Applications and Troubleshooting”,(Babar,2011)；“Current Protocols in Immunology”(Coligan,2002)。这些技术适用于产生本发明的多核苷酸和多肽，并且因此，可以考虑用于完成和实践本发明。将在下列部分中讨论具体实施方式的特别有用的技术。
本文提及或引用的文章、专利和专利申请的内容以及所有其他文件和电子可用信息均以其全部通过引用并入本文，如同每个出版物都被具体地和单独地指出通过引用并入一样的程度。申请人保留将来自任何此类文章，专利，专利申请或其他物理和电子文档的任何和所有材料和信息以物理方式并入本申请的权利。
虽然已经参照本发明的特定实施方式描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，可以做出各种改变并且可以用等同物代替。对本领域技术人员容易显而易见的是，可以在不脱离本文所公开的实施方式的范围的情况下，使用适合的等同方式对本文所述的方法进行其他适当的修改和适应。此外，可以进行多种修改以适应特定的情况、材料、物质组成、方法、方法步骤，达到本发明的目的、精神和范围。所有这些修改旨在落入所附权利要求的范围之内。现在已经详细描述了某些实施例，通过参考以下实施例将更清楚地理解这些实施例，仅出于说明目的，并非旨在进行限制包括下面的实施例。
实验实施例
现在参考以下实施例描述本发明。提供这些实施例仅出于说明的目的，并且本发明不限于这些实施例，而是涵盖由于本文提供的教导而显而易见的所有变化。
现在描述在这些实验中采用的材料和方法。
3PF12抗体来源自：Watkins等人,isolation and characterization of人monoclonal HLA-A2 antibodies from an immune V gene phage display library.(2000).doi:10.1034/j.1399-0039.2000.550305。
HLA-A2特异性CAR核苷酸序列：(SEQ ID NO:24)
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGGATCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGAGTCTCCTGTGCAGCGTCTGGGGTCACCCTCAGTGATTATGGCATGCATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGATGGCTTTTATACGGAATGATGGAAGTGATAAATATTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCAAGAAAACAGTGTCTCTGCAAATGAGCAGTCTCAGAGCTGAAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAAATGGCGAATCTGGGCCTTTGGACTACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACCGTGTCGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGATGTTGTGATGACTCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAATATAGTAGTTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTTCCGGAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCATCGATAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
HLA-A2特异性CAR氨基酸序列：(SEQ ID NO:23)
MALPVTALLLPLALLLHAARPGSQVQLVQSGGGVVQPGGSLRVSCAASGVTLSDYGMHWVRQAPGKGLEWMAFIRNDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKKTVSLQMSSLRAEDTAVYYCAKNGESGPLDYWYFDLWGRGTLVTVSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPLTFGGGTKVDIKRSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSIDRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
现在描述实验的结果。
本文中，产生HLA-A2特异性嵌合抗原受体(CAR)。HLA-A2特异性CAR包含抗原结合结构域，其可结合HLA-A2、HLA-A28、和/或HLA-A68。当在人调节细胞(Treg)上表达时，CAR可介导抗原特异性抑制。该新的CAR可以重定向Treg至HLA-A2、HLA-A28和/或HLA-A68表达组织并介导耐性。
在一个实施方式中，CAR包含细胞外结构域，其包含CD8信号肽、HLA-A2 VH结构域柔性G-S间隔区序列、HLA-A2 VL结构域、CD8铰链区、CD28跨膜/细胞内结构域、和CD3ζ结构域(图1)。在另一实施方式中，CAR由SEQ ID NO:24的核苷酸序列编码。在又另一实施方式中，CAR包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。CAR由3PF12 scFv的初级氨基酸序列组装，其在Watkins等人(2000)doi:10.1034/j.1399-0039.2000.550305中详细描述。通过柔性G-S连接体分开重链和轻链，并将其放入慢病毒载体pTRPE。载体包含CD8信号肽以定向CAR至细胞表面，用于CAR柔性的CD8铰链区，和CD28跨膜/细胞内结构域及用于信号传导的CD3ζ结构域。
本发明的CAR区别于MacDonald等人(J Clin Invest.2016；126(4):1413–142；和JImmunol May 1,2016,196(1Supplement)140.6)的CAR，其源自BB7.2杂交瘤，而不是3PF12，在scFv结构域后包含myc标签，并且不含CD8铰链结构域。同样地，与本发明的CAR相反，来自Boardman等人(American Journal of Transplantation.2016Dec 1])的CAR来源自Watkins等人((2000)doi:10.1034/j.1399-0039.2000.550305)中的3PB2序列，而不是3PF12，在scFv结构域后包含myc标签，不含CD8铰链结构域，并且在信号传导结构域之后包含eGFP。
实施例1:HLA-A2特异性T细胞
通过在室温下用RosetteSep反应物培育其20分钟，随后在淋巴细胞分离液(Lymphoprep)的顶部上分层细胞，并在室温下以400xg离心30分钟而从正常供体单采血液成分术产物分离初级人CD8+T细胞。然后在OPTI-MEM减少的血清培养基(Thermo FisherScientific)中洗涤细胞三次，以100x106个细胞/mL重悬在OPTI-MEM中，与10μg体外转录的3PF12-28z RNA混合，并在0.2cm电穿孔比色皿中在500V下用BTX830(Harvard ApparatusBTX)进行电穿孔700μs。根据制造商的说明用mMessage mMachine T7转录试剂盒(ThermoFisher Scientific)进行体外RNA转录，并用RNeasy MinElute清洁试剂盒(Qiagen)进行清洁。在37℃/5％CO2培养箱中培育细胞16小时，然后在冰上用抗-生物素-SP(长间隔区)AffiniPure山羊抗-人IgG,F(ab')2片段特异性抗体进行染色30分钟(JacksonLabs)，随后在PBS中洗涤三次，和用在PBS中稀释的1μL链酶亲和素-PE和1μL抗-人CD8-APC-H7(BD Biosciences)进行另外30分钟培育。在2％低聚甲醛固定细胞并在LSR II流式细胞仪(BD Biosciences)上进行分析(图2)。用3PF12-28z RNA电穿孔的细胞显示了细胞表面上可检测的CAR表达。
在37℃/5％CO2培育箱中，在GolgiPlug蛋白转运抑制剂(BD Biosciences)存在的情况下，以3:1比使已经如图2中电穿孔的细胞与不同的HLA单元型的解冻的同种异体人供体PBMC混合6小时。然后通过在室温下用100μL固定培养基A(ThermoFisher Scientific)培育细胞30分钟，洗涤，然后用100μL固定培养基B(ThermoFisher Scientific)中稀释的3μLα-IL-2-APC和2μLα-TNF-α-PE-Cy7抗体(BD Biosciences)染色进行细胞固定和渗透。然后用PBS洗涤细胞并在LSR II流式细胞仪上分析(图3)。CAR+CD8+T细胞被靶标PBMC的表面上的HLA-A2和HLA-A68分子活化，引起IL-2和TNF-α产生。相反，CAR+CD8+T细胞不被来自三个单独的HLA-A2-和HLA-A68-供体的PBMC活化，说明CAR对某些，但不是全部HLA分子的特异性。
实施例2:HLA-A2特异性调节T细胞
经由用CD4+RosetteSep反应物(Stem Cell)培育，在淋巴细胞分离液上分层，和以400xg进行30分钟离心30分钟，随后CD25正磁性选择(StemCell Technologies)从人脐带血供体分离调节T细胞。用α-CD3/α-CD28珠(Gibco)刺激Treg并在具有5％的含有1X GlutaMAX和300IU/mL IL-2的人AB血清(Invitrogen)的XVIVO15中生长，并放置在37℃/5％CO2培育箱中。在初始刺激后48小时，对Treg进行慢病毒转导以表达3PF12-28z CAR或不相关的CAR。在第4天去除α-CD3/α-CD28珠，和在第4、6、9和12天在上面的完全XVIVO15培养基进料细胞，同时按假设消耗需要替换IL-2。当细胞在第14天停止处理时，通过如下步骤分析抗原特异性抑制：洗涤Treg三次以除去IL-2并使他们与已经用RNA电穿孔以表达SL9 WT TCR且在十六小时前用2.5μM CFSE标记的同种异体T细胞，和转基因表达HLA-A2和SL9的K562细胞以8:1:0.5(Teff:Treg:K562)的比混合。为了探测非特异性抑制功能，使Treg与CFSE标记的PBMC和α-CD3刺激剂珠(Gibco)以8:1:3(Teff:Treg:珠)的比进行混合。在37℃/5％CO2培育箱中培育5天后，在4℃下用100μL PBS中稀释的1μL CD8-APC-H7和0.5μL CD4-BV421抗体染色细胞15分钟，然后洗涤并重悬于2％PFA进行固定。然后在LSR II流式细胞仪上分析细胞(图4)。无需任何其他干预，CFSE标记的靶细胞将由于在K562细胞上表达的MHC I类呈递的SL9WT TCR和SL9肽相互作用而分裂，导致CFSE信号的稀释。细胞分裂通过共培养HLA-A2+CARTreg与靶细胞进行抑制，如CFSE信号(蓝色)的较少稀释所证明。相反，CFSE靶细胞当与不相关CAR Treg(绿色)或非-Treg CD4+T细胞(红色)共培养时高度增殖。为了显示Treg的两个组具有相同的抑制潜力，图4的右图显示，在α-CD3刺激珠在共培养物中对CFSE标记的PBMC和Treg进行多克隆刺激后，无相关的(绿色)和HLA-A2+(蓝色)CAR Treg均受到同样的抑制，其水平远高于非Treg CD4+细胞(红色)。
实施例3:靶向HLA-A2+胰岛的HLA-A2特异性T细胞
将来自人供体的HLA-A2+胰岛移植到NSG小鼠的左肾荚膜下。三天后，静脉注射10x106个携带3PF12-28z或不相关CD19-28z CAR的慢病毒转导的T细胞。使用未转导的T细胞作为负对照。定期收集尿样，并在-80℃下保存，直至通过ELISA评估它们的人c肽水平(图5)。如图5所示，3PF12-28z CAR转导的T细胞能够耗尽人C肽水平，表明3PF12-28z CAR转导的T细胞靶向移植的HLA-A2+胰岛。
实施例4:用于治疗1型糖尿病的HLA-A2特异性Treg过继性免疫疗法
1型糖尿病是T细胞介导的自体免疫疾病，导致胰岛β细胞破坏、血内胰岛素不足和严重改变的葡萄糖体内稳态。调节T细胞(Treg)的失败可能在1型糖尿病的发展中起作用。在免疫体内稳态期间，Treg抗衡自身反应性效应T细胞的作用，从而参与外周耐受。因此，效应T细胞和Treg之间的失衡可能导致外周耐受的破坏，导致1型糖尿病的发展。
从对象中分离出自体Treg，并进行离体刺激和扩展。用HLA-A2 CAR慢病毒转导Treg，以产生HLA-A2特异性Treg。HLA-A2特异性Treg，如实施例2中产生的那些(3PF12-28zCAR转导的Treg)，将被施用至患有1型糖尿病的对象。
其他实施方式
本文对变量的任何定义中的元素列表的叙述包括将该变量定义为所列元素的任何单个元素或组合(或子组合)。本文对一个实施例的叙述包括该实施方式作为任何单个实施方式或与任何其他实施方式或其部分组合。
本文引用的每个专利、专利申请和公开的公开内容通过引用整体并入本文。尽管已经参考具体实施方式公开了本发明，但是显而易见的本发明的其他实施方式和变型可以被本领域技术人员所设想，而不脱离本发明的精神和范围。所附权利要求旨在被解释为包括所有这样的实施方式和等效变形。
序列表
<110> 宾夕法尼亚大学董事会
J•L•瑞里
G•埃利斯
<120> 保护移植的组织免受排斥的方法
<130> 046483-7151WO1(01566)
<150> 62/477,815
<151> 2017-03-28
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2 scFv
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Leu Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Asn Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Gly Glu Ser Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
145 150 155 160
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu
180 185 190
Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Val Asp Ile Lys Arg
245
<210> 2
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2 scFv
<400> 2
caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctggggggtc cctgagagtc 60
tcctgtgcag cgtctggggt caccctcagt gattatggca tgcattgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg gatggctttt atacggaatg atggaagtga taaatattat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca actccaagaa aacagtgtct 240
ctgcaaatga gcagtctcag agctgaagac acggctgtgt attactgtgc gaaaaatggc 300
gaatctgggc ctttggacta ctggtacttc gatctctggg gccgtggcac cctggtcacc 360
gtgtcgggtg gcggtggctc gggcggtggt gggtcgggtg gcggcggatc tgatgttgtg 420
atgactcagt ctccatcctc cctgtctgca tctgtaggag acagagtcac catcacttgc 480
caggcgagtc aggacattag caactattta aattggtatc agcagaaacc agggaaagcc 540
cctaagctcc tgatctacga tgcatccaat ttggaaacag gggtcccatc aaggttcagt 600
ggaagtggat ctgggacaga ttttactttc accatcagca gcctgcagcc tgaggatttt 660
gcaacttatt actgccaaca atatagtagt tttccgctca ctttcggcgg agggaccaaa 720
gtggatatca aacgt 735
<210> 3
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2 scFv重链(HC)可变区
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Leu Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Asn Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Gly Glu Ser Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr
115
<210> 4
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2 scFv重链(HC)可变区
<400> 4
caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctggggggtc cctgagagtc 60
tcctgtgcag cgtctggggt caccctcagt gattatggca tgcattgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg gatggctttt atacggaatg atggaagtga taaatattat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca actccaagaa aacagtgtct 240
ctgcaaatga gcagtctcag agctgaagac acggctgtgt attactgtgc gaaaaatggc 300
gaatctgggc ctttggacta ctggtacttc gatctctggg gccgtggcac c 351
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2 scFv HC CDR1
<400> 5
Asp Tyr Gly Met His
1 5
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2 scFv HC CDR2
<400> 6
Phe Ile Arg Asn Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2 scFv HC CDR3
<400> 7
Asn Gly Glu Ser Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2 scFv轻链(LC)可变区
<400> 8
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg
100 105
<210> 9
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2 scFv LC可变区
<400> 9
gatgttgtga tgactcagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180
aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaggattttg caacttatta ctgccaacaa tatagtagtt ttccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaaag tggatatcaa acgt 324
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2 scFv LC CDR1
<400> 10
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2 scFv LC CDR2
<400> 11
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2 scFv LC CDR3
<400> 12
Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 13
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8信号肽
<400> 13
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 14
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8信号肽
<400> 14
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 15
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8铰链
<400> 15
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 16
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8铰链
<400> 16
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 17
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28跨膜结构域
<400> 17
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 18
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28跨膜结构域
<400> 18
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 19
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28细胞内结构域
<400> 19
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 20
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28细胞内结构域
<400> 20
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 21
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ζ结构域
<400> 21
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 22
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ζ结构域
<400> 22
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 23
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2 CAR
<400> 23
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser
35 40 45
Gly Val Thr Leu Ser Asp Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Ala Phe Ile Arg Asn Asp Gly Ser Asp
65 70 75 80
Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
85 90 95
Asn Ser Lys Lys Thr Val Ser Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asn Gly Glu Ser Gly Pro Leu
115 120 125
Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
165 170 175
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
180 185 190
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
195 200 205
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
225 230 235 240
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Leu
245 250 255
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Ser Gly Thr Thr
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
275 280 285
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
290 295 300
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val
305 310 315 320
Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
325 330 335
Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser
340 345 350
Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His
355 360 365
Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Ile
370 375 380
Asp Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
385 390 395 400
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
405 410 415
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
420 425 430
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
435 440 445
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
450 455 460
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
465 470 475 480
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
485 490 495
Arg
<210> 24
<211> 1491
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2 CAR
<400> 24
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgggatccc aggtgcagct ggtgcagtct gggggaggcg tggtccagcc tggggggtcc 120
ctgagagtct cctgtgcagc gtctggggtc accctcagtg attatggcat gcattgggtc 180
cgccaggctc caggcaaggg gctggagtgg atggctttta tacggaatga tggaagtgat 240
aaatattatg cagactccgt gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa ctccaagaaa 300
acagtgtctc tgcaaatgag cagtctcaga gctgaagaca cggctgtgta ttactgtgcg 360
aaaaatggcg aatctgggcc tttggactac tggtacttcg atctctgggg ccgtggcacc 420
ctggtcaccg tgtcgggtgg cggtggctcg ggcggtggtg ggtcgggtgg cggcggatct 480
gatgttgtga tgactcagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 540
atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 600
gggaaagccc ctaagctcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 660
aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 720
gaggattttg caacttatta ctgccaacaa tatagtagtt ttccgctcac tttcggcgga 780
gggaccaaag tggatatcaa acgttccgga accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 840
ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 900
gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatttttg ggtgctggtg 960
gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc 1020
tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg cacagtgact acatgaacat gactccccgc 1080
cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc 1140
tatcgctcca tcgatagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 1200
ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 1260
gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 1320
gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1380
atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 1440
gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg c 1491
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(5)
<223> 重复n次。n是至少1的整数。
<400> 25
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 26
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(4)
<223> 重复n次。n是至少1的整数。
<400> 26
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(5)
<223> 重复n次。n是至少1的整数。
<400> 27
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 28
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体
<400> 28
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体
<400> 29
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体
<400> 30
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体
<400> 31
Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体
<400> 32
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体
<400> 33
Gly Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体
<400> 34
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体
<400> 35
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 36
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体
<400> 36
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatct 45
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 37
Asp Lys Thr His Thr
1 5
<210> 38
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 38
Cys Pro Pro Cys
1
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 39
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
1 5 10 15
<210> 40
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 40
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr
1 5 10
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 41
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 42
Lys Cys Cys Val Asp Cys Pro
1 5
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 43
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 44
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 45
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 45
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 46
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
1 5 10 15
Pro
<210> 47
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 47
Ser Pro Asn Met Val Pro His Ala His His Ala Gln
1 5 10
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 48
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Tyr Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15

Claims (50)

1.修饰的免疫细胞或其前体细胞，其包含对HLA-A2具有亲和力的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含CD8信号肽、HLA-A2结合结构域、和CD8铰链结构域。
2.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述HLA-A2结合结构域选自抗体、Fab、或scFv。
3.根据任一前述权利要求所述的修饰的细胞，其中所述HLA-A2结合结构域包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:3中叙述的氨基酸序列。
4.根据任一前述权利要求所述的修饰的细胞，其中所述HLA-A2结合结构域包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8中叙述的氨基酸序列。
5.根据权利要求3或4中任一项所述修饰的细胞，其中所述HLA-A2结合结构域包含间隔区序列。
6.根据任一前述权利要求所述的修饰的细胞，其中所述HLA-A2结合结构域包含SEQ IDNO:1中叙述的氨基酸序列。
7.根据任一前述权利要求所述的修饰的细胞，其中所述CAR包含跨膜结构域，和细胞内结构域。
8.根据权利要求7所述的修饰的细胞，其中所述跨膜结构域包含CD28跨膜结构域。
9.根据权利要求7或8中任一项所述的修饰的细胞，其中所述跨膜结构域包含SEQ IDNO:17中叙述的氨基酸序列。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的修饰的细胞，其中所述细胞内结构域包含CD28细胞内结构域，和CD3ζ细胞内结构域。
11.根据权利要求10所述的修饰的细胞，其中所述CD28细胞内结构域包含SEQ ID NO:19中叙述的氨基酸序列。
12.根据权利要求10或11中任一项所述的修饰的细胞，其中所述CD3ζ细胞内结构域包含SEQ ID NO:21中叙述的氨基酸序列。
13.根据任一前述权利要求所述的修饰的细胞，其中所述CD8铰链包含SEQ ID NO:15中叙述的氨基酸序列。
14.根据任一前述权利要求所述的修饰的细胞，其中所述CD8信号肽包含SEQ ID NO:13中叙述的氨基酸序列。
15.修饰的免疫细胞或其前体细胞，其包含对HLA-A2具有亲和力的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含CD8信号肽、HLA-A2结合结构域、CD8铰链结构域、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ细胞内结构域。
16.根据任一前述权利要求所述的修饰的细胞，其中所述CAR包含SEQ ID NO:23中叙述的氨基酸序列。
17.根据任一前述权利要求所述的修饰的细胞，其中所述HLA-A2结合结构域与HLA-A28交叉反应。
18.根据任一前述权利要求所述的修饰的细胞，其中所述HLA-A2结合结构域与HLA-A68交叉反应。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞是修饰的调节T细胞。
20.根据任一前述权利要求所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞是自体细胞。
21.根据任一前述权利要求所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞来源自人。
22.分离的核酸，其包含编码对HLA-A2具有亲和力的嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其中所述CAR包含CD8信号肽、HLA-A2结合结构域、和CD8铰链结构域。
23.根据权利要求22所述的分离的核酸，其中所述CAR包含CD28跨膜结构域。
24.根据权利要求22或23中任一项所述的分离的核酸，其中所述CAR包含CD28共刺激结构域。
25.根据权利要求22-24中任一项所述的分离的核酸，其中所述CAR包含CD3ζ细胞内结构域。
26.根据权利要求22-25中任一项所述的分离的核酸，其包含SEQ ID NO:24中叙述的核酸序列。
27.表达构建体，其包含根据权利要求22-26中任一项所述的分离的核酸。
28.根据权利要求27所述的表达构建体，其中所述表达构建体包含EF-1α启动子。
29.根据权利要求27或28中任一项所述的表达构建体，其中所述表达构建体包含rev应答元件(RRE)。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的表达构建体，其中所述表达构建体包含土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。
31.根据权利要求27-30中任一项所述的表达构建体，其中所述表达构建体包含cPPT序列。
32.根据权利要求27-31中任一项所述的表达构建体，其中所述表达构建体包含EF-1α启动子、rev应答元件(RRE)、土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)和cPPT序列。
33.根据权利要求27-32中任一项所述的表达构建体，其中所述表达构建体是病毒载体，所述病毒载体选自反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、和腺伴随病毒载体。
34.根据权利要求27-33中任一项所述的表达构建体，其中所述表达构建体是慢病毒载体。
35.根据权利要求34所述的表达构建体，其中所述慢病毒载体是自灭活慢病毒载体。
36.产生根据权利要求1-21中任一项所述的修饰的免疫细胞或其前体细胞的方法，包含将根据权利要求22-26中任一项所述核酸或根据权利要求27-35中任一项所述的表达构建体引入所述免疫细胞。
37.在有需要的对象中实现免疫抑制效果的方法，包含向所述对象施用有效量的根据权利要求1-21中任一项所述的修饰的免疫细胞或其前体细胞。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述对象遭受同种异体应答和/或自身免疫应答。
39.在有需要的对象中实现预防性治疗效果的方法，所述方法包含在同种异体应答或自身免疫应答开始之前，向所述对象施用有效量的根据权利要求1-21中任一项所述的修饰的免疫细胞或其前体细胞。
40.在有需要的患有同种异体应答或自身免疫应答的对象中实现免疫抑制效果的方法，所述方法包含向所述对象施用包含对HLA-A2具有亲和力的嵌合抗原受体(CAR)的修饰的调节T细胞，其中所述CAR包含CD8信号肽、HLA-A2结合结构域、CD8铰链结构域、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、和CD3ζ细胞内结构域。
41.根据权利要求37-40中任一项所述的方法，其中所述同种异体应答或自身免疫应答在组织移植之后，并且其中所述方法抑制、阻断或压制所述对象中的移植物抗宿主疾病。
42.根据权利要求37-41中任一项所述的方法，其中所述修饰的细胞是修饰的调节T细胞。
43.根据权利要求37-42中任一项所述的方法，其中所述修饰的细胞是自体细胞。
44.根据权利要求37-43中任一项所述的方法，其中所述修饰的细胞来源自人。
45.治疗有需要的对象中糖尿病的方法，所述方法包含向所述对象施用有效量的根据权利要求1-21中任一项所述的修饰的免疫细胞或其前体细胞。
46.治疗有需要的对象中糖尿病的方法，包含向所述对象施用包含对HLA-A2具有亲和力的嵌合抗原受体(CAR)的修饰的调节T细胞，其中所述CAR包含CD8信号肽、HLA-A2结合结构域、CD8铰链结构域、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、和CD3ζ细胞内结构域。
47.根据权利要求45或46中任一项所述的方法，其中所述糖尿病是1型糖尿病。
48.根据权利要求45-47中任一项所述的方法，其中所述修饰的细胞是修饰的调节T细胞。
49.根据权利要求45-48中任一项所述的方法，其中所述修饰的细胞是自体细胞。
50.根据权利要求45-49中任一项所述的方法，其中所述修饰的细胞来源自人。
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