CN104159923A - 双抗原诱导的双功能互补作用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一组多肽及其应用。具体地，本发明涉及一组多肽，由此该组多肽包含两个多肽，其各自包含结合抗原“A”的靶向部分“T”和功能结构域“F”的片段，其中其表面具有“A”的基底不存在时，所述两个多肽彼此没有结合，且其中当“F”二聚化时，所得的二聚体成为功能性的。而且，本文描述了该组多肽的医疗和诊断应用。此外，本发明涉及编码该组多肽的核酸分子。本发明还涉及包含编码该组多肽的核酸分子的核苷酸序列的载体。而且，本发明涉及包含该组多肽的药物组合物。此外，本发明涉及包含该组多肽的试剂盒。

Description

双抗原诱导的双功能互补作用
本发明涉及一组多肽及其应用。具体地，本发明涉及一组多肽，由此该组多肽包含两个多肽，其各自包含结合抗原“A”的靶向部分“T”和功能结构域“F”的片段，其中其表面具有“A”的基底不存在时，所述两个肽彼此没有结合，且其中当“F”二聚化时，所得的二聚体成为功能性的。此外，本文描述了该组肽的医疗和诊断应用。此外，本发明涉及编码该组多肽的核酸分子。本发明还涉及包含编码该组多肽的核酸分子的核苷酸序列的载体。此外，本发明涉及包含该组多肽的药物组合物。此外，本发明涉及包含该组多肽的试剂盒。
在过去几年，我们看到很多报道双特异抗体构建体用于体外免疫治疗肿瘤和临床前以及早期临床试验的突出功效的标志性论文。目前，可获得大量不同的双特异构建体，其大小、组成、药代动力学和直接消除肿瘤细胞或衔接用于肿瘤细胞裂解的免疫效应细胞的能力各不相同。
基于抗体的癌免疫策略是极具前景的治疗选择，因为它们对靶标结构具有优异的敏感性和特异性。
抗体模块化的结构和功能组织允许通过基因工程进行广泛的操作。不同的免疫球蛋白样结构域能够被分离和/或连接而不丧失特异性结构域相关的功能特性。此外，它们可与异源蛋白结构域以及非肽部分组合和连接。因此，有可能以合理方式研发出没有常规抗体的天然局限的融合构建体。
可产生具有新的生物学和/或药学特性的基于抗体的融合蛋白。正在进行一些充满前景的工作来通过诱变改变Fc结构域引起ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC(补体依赖性细胞毒性)的能力，根据预期的应用，减少副作用(抑制突变)或增强治疗效力(激活突变)。当考虑到抗体的抗原结合结构域时，通过基因工程变得可能的新应用甚至更多变。
抗体的重链(VH)和轻链(VL)的抗原识别可变结构域可通过基因工程由肽接头连接起来，同时保留抗原结合能力。这类抗原结合单链可变片段(scFvs)可用作具有高的组织渗透力和低的血清保留时间的小抗体替代物，用于临床成像过程和放疗以及其他应用。重要的是，这些scFv部分能够容易地在重组治疗剂研发中用作抗原特异性模块。
最近的报道显示了重组双特异抗体在抗肿瘤治疗中的巨大潜力。这类双特异抗体识别两种抗原，其中一种由肿瘤表达，而另一种通常见于免疫细胞上。在抗肿瘤治疗中大多数双特异抗体一方面靶向肿瘤相关的谱系标志物，另一方面靶向T细胞受体/CD3复合体的不变分子CD3ε，从而募集T细胞以破坏肿瘤[Müller和Kontermann,Bispecific antibodies forcancer immunotherapy:Current perspectives.BioDrugs 2010,24(2):89-98]。
尽管操纵抗体结构和功能有广泛的选择，这类基于抗体的试剂的治疗效力受限于所针对的抗原的性质，肿瘤和肿瘤相关的组织中抗原的可及性以及抗体引起或介导期望的细胞死亡诱导功能的能力。
例如，当使用针对也在组织上表达并具有重要功能的抗原的双特异构建体来治疗患者时，观察到严重的副作用。这是个严重的问题，因为在淋巴瘤的情况下，除了未知数目的单独突变的细胞表面分子和单克隆B细胞或T细胞受体，不存在将转化细胞区别于其健康祖细胞的肿瘤特异性抗原。
由于基于使用双特异抗体的治疗理念通常依赖于效应细胞的衔接，看来该工具(双特异构建体)越有效则越可能发生副作用，甚至在非转化的组织上少量表达抗原也会导致无法控制的脱靶效应。
在2008年，科学(SCIENCE)发表了第一篇关于单链双特异T细胞衔接器(BiTE)抗体MT103/blinatumomab的临床效力的报道；其以比针对单克隆抗体利妥昔单抗报道的血清水平低约5个数量级的血清水平，在复发的或标准免疫化疗难以治疗的约80％淋巴瘤患者中诱导了消退(Bargou,R.etal Science 321,974-977,2008)。该出版物和随后关于急性淋巴白血病(ALL)中验证性II期试验的报道带来了双特异抗体的新时代，直到那时，由于全身毒性以及小或无治疗活性几乎20年处于严重的停顿中。大体上紧随该篇科学(SCIENCE)论文，双特异抗体再次成为迅速发展的领域，其中共计有超过35种不同的形式(Reichert,Drug Discov Today.17(2012)954-963)。这些形式大小不同且优化了对抗原的亲和力、稳定性、募集效应细胞(大多数为T细胞)的能力和药代动力学。构建体的亲和力或亲合力使用不同技术通过亲和力成熟或简单地通过将多个scFv结构域连成一排以产生多价构建体来操纵。甚至报道了三特异抗体，其被设计为针对两个而非一个靶分子来展示增强的结合能力。这些形式的稳定性可通过以下来进行优化：添加免疫球蛋白样结构域，以便模仿天然存在的抗体，并同时提高药代动力学特性，如延长血清中的半衰期和保护免于蛋白酶的蛋白水解消化。此外，这些形式的稳定性可通过优化生产来提高。由于用于共价连接scFv结构域的接头序列通常导致聚集，已经建立了首先生产两种或三种易于重新组装的多肽的生产线，以便产生功能性药物。这类技术利用定向二硫桥或交联试剂来共价连接两种不同的多肽。其他技术利用异源或同源二聚体化结构域如亮氨酸拉链结构域、Fc-结构域和其他如结进孔(knob into hole)技术(参见，例如WO 2007/062466)。此外，可通过结合抗原来稳定的VH和VL相互作用，已经被用于所谓的开口三明治免疫测定以检测抗原(Ueda,Nature Biotechnology 14(1996),1714-1718；Ohmuro-Matsuyama(2012)Detection of Protein Phosphorylation byOpen-Sandwich Immunoassay,Integrative Proteomics,Dr.Hon-Chiu Leung(Ed.),ISBN:978-953-51-0070-6；WO 2004/016782/EP-A1 1536005.)。
然而，本领域描述的双/三特异和双或多价构建体有缺陷。首先，缺少真正的可作为靶分子处理的特异性肿瘤抗原。事实上，双特异抗体形式越有效，附带损害越严重，因为目前所针对的靶抗原为肿瘤和非恶性细胞共有的差异化抗原。结果，现有技术的双或三特异形式无法将恶性细胞与非恶性细胞区分开来。就此而言，开发高亲和力结合靶细胞的三特异构建体，结果可能是赋予高度的脱靶效应，因为通常结合一个靶分子便足以募集免疫分子以破坏表达任一靶分子的细胞。因此，三特异构建体以损失特异性来增加亲和力。最近的多参数分析表明，由于表达了异常的抗原信号，可将肿瘤细胞与其来源的各自的非转化组织区分。目前，这些发现构成了世界卫生组织(WHO)的造血组织肿瘤分类系统的不可分割的一部分，且同样适用于癌症和癌症干细胞或其他来源的癌症起始细胞。因此，有利的是，靶向同时表达一起表示恶性状态的抗原组合的细胞。现有技术公开中没有抗体能够将表达靶抗原组合的细胞与单抗原阳性细胞区分。其次，使用例如完整CD3模块(例如抗Cd3 scFv)的双特异性抗体技术的主要问题是这些蛋白固有的刺激或预刺激T细胞的能力，而与结合靶细胞上的靶抗原无关，且目前观察到的许多副作用似乎与异常的T细胞功能有关。
因此，本领域在癌症治疗方面存在对更具特异性的治疗选择的需要，尤其是需要改善的方法以更高特异性地鉴别和/或消除癌细胞并降低副作用。
在同种异体干细胞移植(即将获自另一人的干细胞移植至患者)领域也存在类似的需要。患有复发的或难治性白血病或另外的血液疾病的患者可通过化疗/放疗(以去除恶性造血细胞)结合移植来自捐献者的健康造血细胞进行治疗。如果清除恶性细胞不彻底，尽管存在移植来的健康细胞但肿瘤会从接受者的存活的恶性细胞重新生长。结果，接受肿瘤治疗和同种异体移植的患者的存活率大大降低了。
然而，很难以高的特异性来清除(和类似地鉴别)存活的恶性细胞，因此尽管有各种尝试，针对该问题的良好方案还未找到。因此，本领域存在这一需要，即提供改善的方法以特异性鉴别和/或清除接受者的这类恶性细胞，同时最小化对其它细胞的副作用。
条件疗法(放疗/化疗)后立即给予移植物(同种异体干细胞)能够替代并重塑造血作用。移植物获自骨髓或刺激后的外周血细胞且含有约1％的造血干细胞，其作为新生成血细胞的来源。此外，移植物通常含有大量的免疫细胞，尤其是T淋巴细胞，其为获得性免疫系统的一部分，且它们在这些T细胞发起对白血病细胞的免疫攻击时是有益的。这种情况已有充分的描述，并被称为移植物抗白血病作用。在另一方面，异常免疫响应引导T细胞攻击患者，其被称为移植物抗宿主病，也经常观察到。
为最大限度地减少移植物抗宿主病，通常基于HLA(人白细胞抗原)或MHC(主要组织相容性复合体)来选择移植物。捐献者和接受者间的抗原的匹配越近，发生严重移植物抗宿主病的可能性越低。然而，对许多患者来说，无法找到完全匹配的移植物。在这些情况下，会采用一种或甚至多种HLA分子不同的骨髓或外周血干细胞。这些临床情况要求移植后的严格免疫抑制方案以保持T细胞系统处于严格控制之下。
因此，本发明一个目的是提供改善的方法以特异性鉴别和/或清除特定种类的细胞。此外，本发明一个目的是提供改善的方法以特异性鉴别和/或清除在其细胞表面具有两种特异性抗原的特定组合的细胞。而且，本发明一个目的是提供改善的方法以特异性鉴别和/或清除癌细胞。而且，本发明一个目的是提供改善的方法以特异性鉴别和/或清除这样的细胞：(1)其具有某个起源(如在组织或细胞移植的情况下，细胞源自接受者或捐献者)，且(2)其属于特定的细胞类型或细胞谱系(如造血细胞)。
本发明的目的通过一组多肽来实现，该组多肽包含：
第一多肽P1，包含
(i)靶向部分T1，
其中所述靶向部分T1特异性结合抗原A1，和
(ii)功能结构域F的片段F1，
其中相对于所述结构域F的功能，所述片段F1本身和所述多肽P1本身均不具有功能，
以及
第二多肽P2，包含
(i)靶向部分T2，
其中所述靶向部分T2特异性结合抗原A2，和
(ii)所述功能结构域F的片段F2，
其中相对于所述结构域F的功能，所述片段F2本身和所述多肽P2本身均不具有功能，
其中所述抗原A1不同于所述抗原A2，
其中其表面具有抗原A1和A2的基底，更具体地其细胞表面携带抗原A1和A2的细胞不存在时，所述多肽P1和多肽P2彼此没有结合，以及
其中当所述多肽P1的片段F1和所述多肽P2的片段F2二聚化时，所得的二聚体相对于所述结构域F的功能具有功能性。
本发明的目的还通过一组多肽来实现，该组多肽包含：
第一多肽P1，包含
(i)靶向部分T1，
其中所述靶向部分T1特异性结合抗原A1，和
(ii)功能结构域F的片段F1，
其中相对于所述结构域F的功能，所述片段F1本身和所述多肽P1本身均不具有功能，
以及
第二多肽P2，包含
(i)靶向部分T2，
其中所述靶向部分T2特异性结合抗原A2，和
(ii)所述功能结构域F的片段F2，
其中相对于所述结构域F的功能，所述片段F2本身和所述多肽P2本身均不具有功能，
其中所述抗原A1不同于所述抗原A2，
其中
(a)所述片段F1包含抗体的VL结构域，且所述片段F2包含该相同抗体的VH结构域；或其中所述片段F1包含抗体的VH结构域，且所述片段F2包含该相同抗体的VL结构域；或
(b)所述片段F1包含抗体的VL结构域，且所述片段F2包含该相同抗体的VH结构域；或其中所述片段F1包含抗体的VH结构域，且所述片段F2包含该相同抗体的VL结构域；以及
其中其表面具有抗原A1和A2的基底，更具体地其细胞表面携带抗原A1和A2的细胞不存在时，所述多肽P1和多肽P2彼此没有结合，以及
其中当所述多肽P1的片段F1和所述多肽P2的片段F2二聚化时，所得的二聚体相对于所述结构域F的功能具有功能性。
本发明的目的还通过一组多肽来实现，该组多肽包含：
第一多肽P1，包含
(i)靶向部分T1，
其中所述靶向部分T1特异性结合抗原A1，和
(ii)功能结构域F的片段F1，
其中相对于所述结构域F的功能，所述片段F1本身和所述多肽P1本身均不具有功能，
以及
第二多肽P2，包含
(i)靶向部分T2，
其中所述靶向部分T2特异性结合抗原A2，和
(ii)所述功能结构域F的片段F2，
其中相对于所述结构域F的功能，所述片段F2本身和所述多肽P2本身均不具有功能，
其中所述抗原A1不同于所述抗原A2，
其中
(c)所述片段F1包含抗体的VL结构域，且所述片段F2包含该相同抗体的VH结构域；或其中所述片段F1包含抗体的VH结构域，且所述片段F2包含该相同抗体的VL结构域；
(d)其中其表面具有抗原A1和A2的基底，更具体地其细胞表面携带抗原A1和A2的细胞不存在时，所述多肽P1和多肽P2彼此没有结合，或
(e)所述片段F1包含抗体的VL结构域，且所述片段F2包含该相同抗体的VH结构域；或其中所述片段F1包含抗体的VH结构域，且所述片段F2包含该相同抗体的VL结构域；以及
其中其表面具有抗原A1和A2的基底，更具体地其细胞表面携带抗原A1和A2的细胞不存在时，所述多肽P1和多肽P2彼此没有结合，以及
其中，当所述多肽P1的片段F1和所述多肽P2的片段F2二聚化时，所得的二聚体相对于所述结构域F的功能具有功能性，且其中在基底或细胞不存在时，所述多肽P1和P2，尤其是所述片段F1和F2，彼此具有的解离常数KD范围为10-8M至10-2M。
本发明还涉及以下项目：
1.一组多肽，包含：
第一多肽P1，包含
(i)靶向部分T1，
其中所述靶向部分T1特异性结合抗原A1，和
(ii)功能结构域F的片段F1，
其中相对于所述结构域F的功能，所述片段F1本身和所述多肽P1本身均不具有功能，
以及
第二多肽P2，包含
(i)靶向部分T2，
其中所述靶向部分T2特异性结合抗原A2，和
(ii)所述功能结构域F的片段F2，
其中相对于所述结构域F的功能，所述片段F2本身和所述多肽P2本身均不具有功能，
其中所述抗原A1不同于所述抗原A2，
其中其表面具有抗原A1和A2的基底，更具体地其细胞表面携带抗原A1和A2的细胞不存在时，所述多肽P1和多肽P2彼此没有结合，以及
其中当所述多肽P1的片段F1和所述多肽P2的片段F2二聚化时，所得的二聚体相对于所述结构域F的功能具有功能性。
2.根据项目1所述的一组多肽，其中其细胞表面携带抗原A1和A2的细胞诱导所述多肽P1的片段F1和所述多肽P2的片段F2的二聚化，而其细胞表面不携带抗原A1和A2的细胞不诱导所述多肽P1的片段F1和所述多肽P2的片段F2的二聚化。
3.根据项目1或2所述的一组多肽，其中所述靶向部分T1包含免疫球蛋白模块，优选包含相连的VH结构域和VL结构域的免疫球蛋白模块I1，更优选包含抗体的scFv(单链可变片段)的免疫球蛋白模块I1，或包含美洲驼抗体、骆驼抗体或鲨鱼抗体的可变结构域VHH的免疫球蛋白模块，
和/或所述靶向部分T2包含免疫球蛋白模块，优选包含相连的VH结构域和VL结构域的免疫球蛋白模块I2，更优选包含抗体的scFv(单链可变片段)的免疫球蛋白模块I2，或包含美洲驼抗体、骆驼抗体或鲨鱼抗体的可变结构域VHH的免疫球蛋白模块，
或其中所述靶向部分T1和/或所述靶向部分T2分别包含所述抗原A1或抗原A2的适体或天然配体。
4.根据前述项目中任一项所述的一组多肽，其中所述抗原A1和/或所述抗原A2是表达于肿瘤的细胞表面或肿瘤的祖细胞/前体细胞表面的抗原，优选为表达于血液肿瘤细胞表面的抗原，或表达于非血液肿瘤细胞表面的抗原。
5.根据前述项目中任一项所述的一组多肽，其中抗原A1和抗原A2的组合仅见于癌细胞上，而未见于于非癌细胞上，且其中，优选地，抗原A1和抗原A2的组合对某种癌症的癌细胞具有特异性。
6.根据前述项目中任一项所述的一组多肽，其中所述抗原A1为MHC抗原，优选HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ、HLA-DR或HLA-DM中任一等位基因变体，更优选MHC I类分子的等位基因变体，更优选选自以下的等位基因变体：HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A25、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B35、HLA-B44、HLA-Cw3、HLA-Cw4和HLA-Cw7，和/或所述抗原A2为对某种细胞类型或细胞谱系具有特异性的抗原。
7.根据前述项目中任一项所述的一组多肽，其中所述功能结构域F为免疫球蛋白模块，优选抗体的scFv(单链可变片段)或荧光分子，优选GFP或GFP变体，或者能介导生物发光的分子，优选Gaussia荧光素酶。
8.根据前述项目中任一项所述的一组多肽，其中所述功能结构域F为特异性结合载体分子或者亲和标签的结构域，所述载体分子优选是肽或碳水化合物分子的载体分子，所述亲和标签优选选自以下的亲和标签：FLAG-标签、myc-标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-标签、血球凝集素(HA)-标签、多组氨酸(His)-标签和麦芽糖结合蛋白(MBP)-标签。
9.根据前述项目中任一项所述的一组多肽，其中所述功能结构域F为特异性结合放射性化合物的结构域、特异性结合毒素分子的结构域、特异性结合荧光分子的结构域、或特异性结合能介导生物发光的分子的结构域，所述毒素分子本身不能穿透人细胞的细胞膜而是经与人细胞的细胞膜结合而内化入所述细胞中。
10.根据前述项目中任一项所述的一组多肽，其中所述片段F1包含抗体的VL结构域，且所述片段F2包含该相同抗体的VH结构域，其中优选地，所述抗体为抗-CD3抗体，或者其中所述片段F1包含抗体的VH结构域，且所述片段F2包含该相同抗体的VL结构域，其中优选地，所述抗体为抗-CD3抗体。
11.根据前述项目中任一项所述的一组多肽，用于治疗患有肿瘤的患者或用于患有肿瘤的患者的诊断应用，优选用于治疗患有肿瘤且在接受同种异体组织或细胞移植或打算接受这类移植的患者，或者用于患有肿瘤且在接受或打算接受同种异体组织或细胞移植的患者的诊断应用，其中，优选地，将该组多肽给予所述患者。
12.核酸分子或一组核酸分子，其编码前述项目中任一项所述的一组多肽或该组多肽中的多肽之一。
13.载体，其包含项目12所述的核酸分子的核苷酸序列或项目12的一组核酸分子的核酸分子之一的序列。
14.药物组合物，其包含项目1-11中任一项所述的一组多肽或项目12所述的核酸分子/一组核酸分子或项目13所述的载体，其中优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
15.试剂盒，其包含项目1-11中任一项所述的一组多肽。
优选地，所述抗原A1为细胞表面分子。优选地，所述抗原A2为细胞表面分子。优选地，所述抗原A1对细胞的恶性状态具有特异性。优选地，所述抗原A2对某种细胞类型或细胞谱系或者对细胞的恶性状态具有特异性。优选地，所述抗原A1对恶性细胞类型具有特异性。优选地，所述抗原A2对恶性细胞类型具有特异性。
在一方面中，本发明涉及如本文定义和描述的该组多肽，然而其中，所述抗原A1与抗原A2相同。因此，在这样一组多肽P1和P2中，F1片段可连接至靶向部分T1，且F2片段可连接至靶向部分T2，然而，T1和T2特异性结合相同的抗原。在这种情况下，靶向部分T1所结合的抗原A1上的表位，可与靶向部分T2所结合的抗原A2上的表位为相同或不同的表位。在抗原A1上的表位与抗原A2上的表位相同的情况下，多肽P1可包含与P2包含的靶向部分相同的靶向部分。同样本发明的这个方面是基于该优势，即具有破坏的F结构域的该组多肽P1和P2没有展现脱靶效应(例如，没有展现CD3的T细胞的预活化，因此，例如相比常规的双特异抗体，具有更小的毒性和/或副作用)。
在一个实施方案中，所述片段F1和片段F2一起为所述功能结构域F。
在一个实施方案中，其中其表面具有抗原A1和A2的基底，更具体地其细胞表面携带抗原A1和A2的细胞不存在时，所述多肽P1和多肽P2彼此没有共价连接。
在一个实施方案中，所述多肽P1和多肽P2彼此没有共价连接。
所述多肽P1和多肽P2和/或，具体地，其中所包含的所述片段F1和片段F2，更具体地，其中可能包含的VH和VL彼此没有结合，尤其是当给予至需要医学干预即需要治疗和/或诊断的对象时。因此，本文提供的药学或诊断方法包括两种多肽P1和P2，其包括在本文所定义的处于非结合形式的“一组多肽”中。所述两种多肽的结合在所述基底或细胞存在下于体内发生。在所述基底或细胞存在下，所述两种多肽的结合可通过稳定剂(例如抗原，如本文所述的CD3、HIS或DIG)来(进一步)稳定。优选地，在所述基底或细胞不存在时它们彼此没有结合和/或在所述基底或细胞不存在时它们没有二聚化。更优选地，在所述基底或细胞不存在时它们彼此没有结合和/或在所述基底或细胞不存在时它们没有二聚化，即使存在稳定多肽P1和多肽P2和/或具体地片段F1和片段F2的结合和/或二聚化的试剂，即即使所述多肽P1和多肽P2和/或具体地所述片段F1和片段F2存在于稳定剂/P1(F1)/P2(F2)-三聚体复合体(例如在抗原/VH/VL-三聚体复合体中)中。
在一个具体实施方案中，所述多肽P1和多肽P2和/或，具体地，其中所包含的所述片段F1和片段F2，更具体地，其中可能包含的VH和VL，优选地通过稳定多肽P1和多肽P2和/或具体地片段F1和片段F2的结合和/或二聚化的试剂介导的相互作用(例如通过抗原介导的相互作用)，彼此结合和/或二聚化为三部分复合体形式。然而最优选地，该结合和/或二聚化仅在所述基底或细胞存在下发生。
例如，亮氨酸拉链和/或恒定结构域(如免疫球蛋白CH3或Fc片段)进行异源和同源二聚化的亲和力，估计处于的解离常数KD范围为～10-8至10-11M(参见，例如，Zhu(1997)Protein Sci.6,781-8；Plückthun(1997)Immunotech.3,83-105)。该KD范围明显低于所述基底或细胞不存在时，本发明的所述多肽P1和P2尤其是所述片段F1和F2可能发生的结合和/或二聚化的KD。因此，在一个实施方案中，多肽P1和多肽P2和/或，具体地，其中所包含的片段F1和片段F2，更具体地，其中可能包含的VH和VL，在所述基底或细胞不存在时彼此结合和/或二聚化的KD，大于例如，亮氨酸拉链和/或恒定结构域(如免疫球蛋白CH3或Fc片段)的异源和同源二聚化的KD。在所述基底或细胞存在时，应认识到，多肽P1和多肽P2和/或，具体地，其中所包含的片段F1和片段F2，更具体地，其中可能包含的VH和VL，以这样的KD彼此结合和/或二聚化：该KD处于例如，亮氨酸拉链和/或恒定结构域(如免疫球蛋白CH3或Fc片段)的异源和同源二聚化的KD范围内。
例如，分离的VH和VL结构域的相互作用力通常为低的亲和力。使用测热的、测荧光的或紫外差异光谱和/或圆二色谱技术，测定了解离常数KD为10-9至10-6M(参见，例如，JMB(2001)305,989-1010；Plückthun(1992)Immunological Reviews No 130)。使用表面等离子共振技术(SPR生物传感器BIAcore或BIAcore 2000,Pharmacia)和抗HEL-抗体系统(抗-鸡蛋溶菌酶抗体HyHEL-10)、Ueda(在上述引文中)和Ohmuro-Matsuyama(在上述引文中)发现，分离的VH和VL结构域完全没有二聚化(Ka<105/M，检测限以下)。然而，在同源抗原存在下，VH和VL肽的结合显著增加(Ka～109/M)，抗原/VH/VL-三聚体复合体的离解率显著降低，在存在1.4μM的抗原时计算的Kd为约2.73 x 10-5±1.43 x 10-6/s。因此，在本发明的背景下尤其应认识到，在所述基底或细胞不存在时，本发明的所述多肽P1和P2，尤其是所述片段F1和F2可能发生的结合和/或二聚化的KD仅处于或甚至大于分离的VH和VL结构域的KD或KD范围(例如，如在(在上述引文中)、Plückthun(1992；在上述引文中)、Ueda(在上述引文中)和Ohmuro-Matsuyama(在上述引文中)的上下文中所估计)，尤其是大于抗原/VH/VL-三聚体复合体的KD或KD范围(如在(在上述引文中)、Plückthun(1992；在上述引文中)、Ueda(在上述引文中)和Ohmuro-Matsuyama(在上述引文中)的上下文中所估计)。在所述基底或细胞存在时，应当认识到多肽P1和多肽P2和/或，具体地，其中所包含的片段F1和片段F2，更具体地，其中可能包含的VH和VL，彼此结合和/或二聚化的KD(远)低于分离的VH和VL结构域的KD或KD范围(例如，如在(在上述引文中)、Plückthun(1992；在上述引文中)、Ueda(在上述引文中)和Ohmuro-Matsuyama(在上述引文中)的上下文中所估计)，优选地，处于或甚至低于抗原/VH/VL-三聚体复合体的KD或KD范围(例如，如在Plückthun(1992；在上述引文中)、Ueda(在上述引文中)和Ohmuro-Matsuyama(在上述引文中)的上下文中所估计)。
在一方面中，多肽P1和多肽P2和/或，具体地，其中所包含的片段F1和片段F2，更具体地，其中可能包含的VH和VL，在所述基底或细胞不存在时没有结合和/或在所述基底或细胞不存在时没有二聚化。在所述基底或细胞不存在时，如果它们确实彼此结合和/或二聚化，则其KD仅为10-8M以上，优选10-6M以上，更优选10-5M以上和更优选10-4M以上。在另一方面中，在所述基底或细胞不存在时，如果它们确实彼此结合和/或二聚化，则其KD范围仅为10-8M至10-2M，优选10-7M至10-3M，更优选10-6M至10-3M，甚至更优选10-5M至10-3M。在另一方面中，多肽P1和多肽P2和/或，具体地，其中所包含的片段F1和片段F2，更具体地，其中可能包含的VH和VL，在所述基底或细胞存在时结合和/或在所述基底或细胞存在时二聚化。具体地，在所述基底或细胞存在时，它们彼此结合和/或二聚化的KD为10-6M以下，优选10-7M以下，更优选10-8M以下，且更优选10-9M以下。在所述基底或细胞存在时，它们彼此结合和/或二聚化的KD范围还可为10-11M至10-6M,更优选10-11M至10-7M，甚至更优选10-11M至10-8M。
在一个优选的实施方案中，以上甚至应用于在能稳定多肽P1和多肽P2和/或，具体地片段F1和片段F2的结合和/或二聚化的试剂存在的情况下。例如，根据本发明这种稳定剂可为抗原，例如，像本文所述的能结合结构域F的CD3、HIS或DIG，所述结构域F例如可包含抗体的VH和VL(分别F1和F2，或分别F2和F3)。
在本发明的上下文中，具体地，在以上的上下文中(即针对所述试剂和/或所述基底或细胞和/或所述抗原A1和A2)，“存在”尤其是指以如下浓度范围存在：0.01μM至1mM、0.1至500μM、0.1至300μM、0.1至100μM、1至500μM、10至500μM。在本发明的上下文中，具体地，在以上的上下文中(即针对所述试剂和/或所述基底或细胞和/或所述抗原A1和A2)，“不存在”尤其是指以低于以上浓度范围或低于以下浓度存在：1mM、500μM、300μM、100μM、10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM或1nM，其中优选更低的数值。
在该位置本领域技术人员容易测量具体地，P1和P2，更具体地，其中所包含的F1和F2，更具体地，其中可能包含的VH和VL的二聚化的KD。各种测量方法的实例为：x-射线结晶学；核磁共振(NMR)；等温热量测定(ITC)；冷冻电子显微镜检查(CEM)；质谱测量(MS)；表面等离子体共振(SPR)。这类方法描述于例如，Protein Surface Recognition:Approaches forDrug Discovery:Approaches for the Inhibition of Protein-Protein Interactionsfor Drug Discovery(Eds:Ernest Giralt,Mark Peczuh,Xavier Salvatella JohnWiley&Sons；12.November 2010)中。各种测量方法的其他实例为：圆二色谱分析；小区块凝胶过滤层析；荧光凝胶阻滞；沉降平衡；荧光极化分析；印迹覆膜或Far-Western印迹分析；亲和毛细管电泳分析；荧光共振能量转移(FRET)；这类方法描述于例如，Protein'Protein Interactions:Methods and Applications:261(Methods in Molecular Biology)；Haian Fu(Editor)；Humana Press；1(23.2004)中。根据本发明，测量KD的优选的方法为荧光关联谱分析(FCS)。该方法描述于例如，Douglas Magde(Physical Review Letters 29,11,1972,S.705–708)中。
在一具体的方面中，本文所指的KDs(i)适用于，(ii)处于，或(iii)要在4至38℃，优选4至20℃(例如10℃)或20至38℃(例如30℃)的温度下，和/或4.5至8(例如pH为7)pH下测量。
在本发明的上下文中，“没有结合”尤其是指相对于结构域F的功能没有功能性结合在一起，即没有使得F1和F2形成功能性F。因此，在本发明的一方面，P1和P2可彼此结合(例如共价结合)，只要F1和F2没有形成功能结构域F。然而，优选P1和P2是分开的。
在一个实施方案中，所述抗原A1和/或所述抗原A2为分子。
在一个实施方案中，所述抗原A1和/或所述抗原A2为蛋白质的。
在一个实施方案中，所述抗原A1和/或所述抗原A2为非蛋白质的。
在一个实施方案中，所述靶向部分T1非共价地结合所述抗原A1。
在一个实施方案中，所述靶向部分T2非共价地结合所述抗原A2。
在一个实施方案中，其表面具有抗原A1和A2的基底诱导所述多肽P1的片段F1和所述多肽P2的片段F2二聚化，而其细胞表面不具有抗原A1和A2的基底不诱导所述多肽P1的片段F1和所述多肽P2的片段F2二聚化。
在一个实施方案中，其细胞表面携带抗原A1和A2的细胞诱导所述多肽P1的片段F1和所述多肽P2的片段F2二聚化，而其细胞表面不携带抗原A1和A2的细胞不诱导所述多肽P1的片段F1和所述多肽P2的片段F2二聚化。在本发明的上下文中，“诱导二聚化”尤其是指“并置且随后的二聚化”。
在一个实施方案中，所述靶向部分T1包含免疫球蛋白模块和/或所述靶向部分T2包含免疫球蛋白模块。
在一个实施方案中，所述靶向部分T1包含以下：包含相连的VH结构域和VL结构域的免疫球蛋白模块I1，优选地，包含抗体的scFv(单链可变片段)、抗体的Fab或F(ab’)2(例如，具有如Fc结构域以外的部分)或完全抗体的免疫球蛋白模块I1。
和/或所述靶向部分T2包含以下：包含相连的VH结构域和VL结构域的免疫球蛋白模块I2，优选地，包含抗体的scFv(单链可变片段)、抗体的Fab或F(ab’)2(例如，具有如Fc结构域以外的部分)或完全抗体的免疫球蛋白模块I2。
在一个实施方案中，所述靶向部分T1和/或所述靶向部分T2包含免疫球蛋白模块，其包含美洲驼抗体、骆驼抗体或鲨鱼抗体的可变结构域VHH。
在一个实施方案中，所述靶向部分T1和/或所述靶向部分T2分别为所述抗原A1或抗原A2的适体或天然配体。
在一个实施方案中，所述靶向部分T1和/或所述靶向部分T2包含抗体的Fv或scFv((单链)可变片段)。
在一个实施方案中，所述靶向部分T1和T2所含的免疫球蛋白模块包含选自以下的V结构域：
(i)抗-HLA-A2抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:78和79(CDRs1和3)以及DAS(CDR2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:75-77(CDRs1-3)；
(ii)抗-HLA-Cw6抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:83和84(CDRs1和3)以及DDS(CDR2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:80-82(CDRs1-3)；
(iii)抗-EpCAM抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:88和89(CDRs1和3)以及WAS(CDR2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:85-87(CDRs1-3)；
(iv)抗-Her2抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:93和94(CDRs1和3)以及SAS(CDR2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:90-92(CDRs1-3)；
(v)抗-EGFRl抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:98和99(CDRs1和3)以及DAS(CDR2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:95-97(CDRs1-3)；
(vi)抗-CEA抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:103和104(CDRs1和3)以及SAS(CDR2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:100-102(CDRs1-3)；
(vii)抗-CD45抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:107和108(CDRs1和3)以及LAS(CDR2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:105和106(CDRs1和2)以及CDR3或SEQ ID NOS:132-134(CDRs1-3)；
(viii)抗-CD138抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:112和113(CDRs1和3)以及YTS(CDR2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:109-111(CDRs1-3)；以及
(ix)抗-CD19抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:158和159(CDRs1和3)以及DAS(CDR2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:155-157(CDRs1-3)。
在又一个优选的实施方案中，所述靶向部分T1和/或T2所含的免疫球蛋白模块包含选自以下的V结构域：
(i)抗-HLA-A2抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:52，所述VH结构域包含SEQ ID NO:51；
(ii)抗-HLA-Cw6抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:54，所述VH结构域包含SEQ ID NO:53；
(iii)抗-EpCAM抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:56，所述VH结构域包含SEQ ID NO:55；
(iv)抗-Her2抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:58，所述VH结构域包含SEQ ID NO:57；
(v)抗-EGFRl抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:60，所述VH结构域包含SEQ ID NO:59；
(vi)抗-CEA抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:62，所述VH结构域包含SEQ ID NO:61；
(vii)抗-CD45抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:64，所述VH结构域包含SEQ ID NO:63；以及
(viii)抗-CD138抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:66，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:65；
(ix)抗-CD19抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:153，所述VH结构域包含SEQ ID NO:152。
在又一个优选的实施方案中，所述靶向部分T1和/或T2所含的免疫球蛋白模块包含V结构域，其包含SEQ ID NOS:67-74和154中的任一序列。
在一个实施方案中，多肽P1具有通用结构F1-T1和/或多肽P2具有通用结构F2-T2。所述F片段和T部分可通过接头分隔(例如F1-接头-T1和/或F2-接头-T2)，和/或所述F片段和T部分侧翼可有另外的氨基酸节段1和/或2(节段-F1-(接头)-T1-节段2和/或节段1-F2-(接头)-T2-节段2)。优选上述通用结构为从所述多肽的N末端至C末端，即N-F1-T1-C和/或N-F2-T2-C，N-F1-接头-T1-C和/或N-F2-接头-T2-C，以及N-节段1-F1-(接头)-T1-节段2-C和/或N-节段1-F2-(接头)-T2-节段2-C。在所述靶向部分为或包含免疫球蛋白模块I如Fv或scFv的情况下，多肽P1可具有通用结构F1-VH1-VL1和/或多肽P2可具有通用结构F2-VH2-VL2，或者多肽P1可具有通用结构F1-VL1-VH1和/或多肽P2可具有通用结构F2-VL2-VH2。同样在这些情况下，所述F片段和T部分可通过接头分隔(例如F1-接头-VH/VL1-VL/VH1和/或F2-接头-VH/VL2-VL/VH2)，和/或所述F片段和T部分侧翼可有另外的氨基酸节段1和/或2(节段1-F1-(接头)-VH/VL1-VL/VH1-节段2和/或节段1-F2-(接头)-VH/VL2-VL/VH2-节段2)。同样在这些情况下，优选上述通用结构为从所述多肽的N末端至C末端，即N-F1-VH/VL1-VL/VH1-C和/或N-F2-VH/VL2-VL/VH2-C，N-F1-接头-VH/VL1-VL/VH1-C和/或N-F2-接头-VH/VL2-VL/VH2-C，以及N-节段1-F1-(接头)-VH/VL1-VL/VH1-节段2-C和/或N-节段1-F2-(接头)-VH/VL2-VL/VH2-节段2-C。在VH和VL，或者VL和VH之间也可存在接头。
以上描述的尤其是在V结构域之间的接头，可包含1-25个氨基酸、优选12-20个氨基酸、优选12-16个或15-20个氨基酸。以上描述的接头可包含一个或多个(G3S)和/或(G4S)基序，具体是1、2、3、4、5或6个(G3S)和/或(G4S)基序，优选3或4个(G3S)和/或(G4S)基序，更优选3或4个(G4S)基序。
在一个实施方案中，所述免疫球蛋白模块I1和所述片段F1由包含1-12个，优选3-12个氨基酸的接头分隔，和/或所述免疫球蛋白模块I2和所述片段F2由包含1-12个，优选3-12个氨基酸的接头分隔。
在一个实施方案中，I1的VL结构域通过包含12-25个氨基酸的接头，优选具有序列(G3S)3或(G3S)4或(G4S)3或(G4S)4的接头而被连接至I1的VH结构域，和/或I2的VL结构域通过包含12-25个氨基酸的接头，优选具有序列(G3S)3或(G3S)4或(G4S)3或(G4S)4的接头而被连接至I2的VH结构域。
如上所述，上述接头可包含(G3S)和/或(G4S)基序。替代性接头可包含GEGTSTGSGGSGGSGGAD基序或由GEGTSTGSGGSGGSGGAD基序组成。本领域技术人员无需进一步努力即可发现和使用其他本领域已知的(肽)接头。
所述另外的氨基酸节段1和/或2可包含1-200、1-100、1-70、1-65、1-50、1-25或1-20个氨基酸，或由1-200、1-100、1-70、1-65、1-50、1-25或1-20个氨基酸组成。
在一个实施方案中，所述抗原A1和/或所述抗原A2为表达于肿瘤的细胞表面或肿瘤的祖细胞/前体细胞表面的抗原，优选为表达于血液肿瘤的细胞表面的抗原，更优选为表达于选自以下的细胞的表面的抗原：急性髓系白血病细胞、慢性髓系白血病细胞、急性淋巴白血病细胞、慢性淋巴白血病细胞、淋巴瘤细胞、骨髓增生综合征细胞、骨髓增生异常细胞，更优选骨髓瘤细胞，或者所述抗原A1和/或所述抗原A2为表达于非血液肿瘤的细胞的表面的抗原，所述非血液肿瘤的细胞优选为选自以下的细胞：肾细胞癌细胞、膀胱癌细胞、肺癌细胞、间皮瘤细胞、前列腺癌细胞、脑癌细胞、骨癌细胞、肉瘤细胞、软组织癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、子宫内膜癌细胞、子宫癌细胞、生殖细胞瘤细胞、肛门癌细胞、直肠癌细胞、结肠癌细胞、小肠癌细胞、胃癌细胞、胃肠道间质瘤细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、胆管癌细胞、胆囊癌细胞、头颈癌细胞、下咽癌细胞、喉部癌细胞、食管癌细胞、皮肤癌细胞，优选黑素瘤细胞、儿童癌的细胞、内分泌瘤的细胞、良性肿瘤的细胞、胸腺瘤细胞、甲状腺癌细胞、胰岛细胞瘤的细胞、肾上腺瘤的细胞、神经内分泌瘤的细胞和未知原发癌的细胞(未知原发灶的癌症)。关于这些癌症的详细信息可参见相关文献，如"Cancer Medicine",JF Holland,EFrei(editors),Mcgraw-Hill Professional,8th edition(2010)和本文引用的文献。
在一个实施方案中，抗原A1和抗原A2的组合仅见于血细胞或血细胞的前体细胞，优选仅见于一种血细胞。
在一个实施方案中，抗原A1和抗原A2的组合仅见于靶标，具体地仅见于癌细胞上，且未(仅为可忽略程度的)见于非靶细胞的细胞，具体地未见于非癌细胞上。在一个优选的实施方案中，抗原A1和抗原A2的组合对某种癌的癌细胞具有特异性。
在一个实施方案中，抗原A1和抗原A2的组合能区分某种细胞优选某种癌细胞与任何其他细胞。
在本文中“某种癌”可指由在其中形成所述癌的相同器官来表征的癌类型，或者，优选由同一对(异常的)抗原A1和A2表征的癌类型。
在一个实施方案中，抗原A1和抗原A2的组合见于肿瘤祖细胞/前体细胞的祖细胞/前体细胞，而未见于非肿瘤祖细胞/前体细胞的祖细胞/前体细胞。
在一个实施方案中，所述抗原A1为对细胞的恶性状态具有特异性的抗原，所述抗原A2为对所述细胞的细胞类型或细胞谱系具有特异性的抗原。
在一个实施方案中，
a)抗原A1为EpCAM(上皮细胞粘附分子)，且抗原A2为CD10(分化簇10)、HER2/neu(人表皮生长因子受体2)、VEGF-R(血管内皮生长因子受体)、EGFR(表皮生长因子受体；也称HER1(人表皮生长因子受体1)或ErbB1)或MDR(多药抗性蛋白)，或
b)抗原A1为MCSP(黑素瘤-相关的硫酸软骨素蛋白多糖)，且抗原A2为促黑色素释放素(melanoferrin)或EpCAM，或
c)抗原A1为CA125(癌抗原125/糖抗原125)，且抗原A2为CD227(PEM(多形上皮粘蛋白)或MUC1(粘蛋白-1))，或
d)抗原A1为CD56，且抗原A2为CD140b(PDGFRβ(血小板来源的生长因子受体β))或GD3神经节苷脂，或
e)抗原A1为EGFR，且抗原2为HER2，或
f)抗原A1为PSMA(前列腺特异性膜抗原)，且抗原2为HER2，或
g)抗原1为唾液酸化路易斯寡糖，且抗原2为EGFR，或
h)抗原1为CD44，且抗原2为ESA(上皮表面抗原)(CD326、EpCAM)、CD24、CD133、MDR(多药抗性蛋白)或CD117，或
i)抗原1为CD34，且抗原2为CD19、CD79a、CD2、CD7、HLA-DR(人白细胞抗原DR)、CD13、CD117、CD33或CD15，或
j)抗原1为CD33，且抗原2为CD19、CD79a、CD2、CD7、HLA-DR(人白细胞抗原DR)、CD13、CD117或CD15，或
k)抗原1为MUC1，且抗原2为CD10、CEA或CD57，或
l)抗原1为CD38，且抗原2为CD138，或
m)抗原1为CD24，且抗原2为CD29或CD49f，或
n)抗原1为碳酸酐酶IX，且抗原2为水通道蛋白，优选地水通道蛋白-2。
在一个实施方案中，所述抗原A1和/或所述抗原A2选自以下抗原：HLA-A(HLA-A主要组织相容性复合体，I类，A[智人]；基因ID：3105，更新日期为2013年1月13日；DAQB-90C11.16-002；染色体：6；NC_000006.11(29910247..29913661)；对于HLA-A2:1.mRNA＝LOCUSNM_001242758＝Version NM_001242758.1 GI:337752169＝GenBank:AY191309.1 PRI 13-JAN-2013；2.蛋白＝P79495[UniParc]，最后修改日期为1997年5月1日，第1版；对于HLA-Cw6:mRNA＝LOCUSHUMMHCCW6A＝GenBank:VERSION M28160.1 GI:531197PRI(18-AUG-1994)；蛋白＝Q29963[UniParc]，最后修改日期为2003年8月22日，第2版)；EpCAM(EPCAM上皮细胞粘附分子[智人]；也称为ESA；KSA；M4S1；MK-1；DIAR5；EGP-2；EGP40；KS1/4；MIC18；TROP1；EGP314；HNPCC8；TACSTD1.；基因ID:4072,更新日期为2013年1月6日；mRNA＝VERSION NM_002354.2 GI:218505669PRI 2013年1月6日；蛋白＝P16422[UniParc]，最后修改日期为2007年11月13日，第2版)；CD45(PTPRC蛋白酪氨酸磷酸酶，受体类型，C[智人]；也称为LCA；LY5；B220；CD45；L-CA；T200；CD45R；GP180；基因ID:5788,更新日期为2013年1月13日；mRNA＝VERSION NM_002838.4 GI:392307006 PRI13-JAN-2013；蛋白＝P08575-1＝同种型1,最后修改日为2003年7月19日，第2版；蛋白＝P08575-2＝同种型2)；Her2(ERBB2 v-erb-b2成红细胞白血病病毒致癌基因同系物2，神经/成胶质细胞瘤来源的致癌基因同系物(鸟)[智人]；也称为NEU；NGL；HER2；TKR1；CD340；HER-2；MLN 19；HER-2/neu；基因ID:2064,更新日期为2013年1月13日；mRNA转录物变体1＝VERSION NM_004448.2 GI:54792095,PRI 2013年1月6日；mRNA转录物变体2＝VERSION NM_001005862.1 GI:54792097,PRI 2013年1月6日；蛋白＝P04626-1＝同种型1，最后修改日期为1987年8月13日，第1版；蛋白＝P04626-2＝同种型2；蛋白＝P04626-3＝同种型3；蛋白＝P04626-4＝同种型4)；EGFR(EGFR上皮生长因子受体[智人]；也称为ERBB；HER1；mENA；ERBB1；PIG61；基因ID:1956,更新日期为2013年1月13日；mRNA转录物变体1＝VERSION NM_005228.3 GI:41327737,PRI 2013年1月13日；mRNA转录物变体2＝VERSION NM_201282.1GI:41327731,PRI 2013年1月13日；mRNA转录物变体3＝VERSIONNM_201283.1 GI:41327733,PRI 2013年1月13日；mRNA转录物变体4＝VERSION NM_201284.1 GI:41327735,PRI 2013年1月13日；蛋白＝P00533-1＝同种型1,最后修改日为1997年11月1日，第2版；蛋白＝P00533-2＝同种型2；蛋白＝P00533-3＝同种型3；蛋白＝P00533-4＝同种型4)；CD138(SDC1多配体蛋白聚糖1[智人]；基因ID:6382,更新日期为2013年1月6日；mRNA转录物变体1＝VERSIONNM_001006946.1 GI:55749479,PRI 2013年1月6日；mRNA转录物变体2＝VERSION NM_002997.4 GI:55925657,PRI 2013年1月6日；蛋白＝P18827[UniParc]，最后修改日为2009年5月5日，第3版)；CEA(CEACAM5癌胚抗原相关的细胞粘附分子5[智人]；也称为CEA；CD66e；基因ID:1048,更新日期为2013年1月13日；mRNA＝VERSIONNM_004363.2 GI:98986444,PRI 2013年1月13日；P06731,最后修改日为2011年1月11日，第3版)；和CD19(CD19 CD19分子[智人]；也称为B4；CVID3；基因ID:930,更新日期为2013年1月5日；mRNA转录物1＝VERSION NM_001178098.1 GI:296010920,PRI 2013年1月6日；mRNA转录物2＝VERSION NM_001770.5 GI:296010919,PRI 2013年1月6日；蛋白＝P15391[UniParc]，最后修改日为2007年11月13日，第6版)。
在一个实施方案中，所述抗原A1和/或所述抗原A2为MHC抗原，优选为HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ、HLA-DR或HLA-DM中的任一等位基因变体，更优选为MHC I类分子的等位基因变体，更优选为选自以下的等位基因变体：HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A25、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B35、HLA-B44、HLA-Cw3、HLA-Cw4、HLA-Cw6和HLA-Cw7。
在一个实施方案中，所述抗原A1为HLA-A2。
在一个实施方案中，所述抗原A1和/或所述抗原A2选自：CD45、水通道蛋白优选水通道蛋白-2、清道夫受体B类成员1(SCARB1)、CD34、CD33、CD138、CD15、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD20、CD23、CD31、CD43、CD56、CD57、CD68、CD79a、CD146、突触泡蛋白、CD56、CD57、烟碱型乙酰胆碱受体、肌特异性激酶(MUSK)、电压门控钙通道(P/Q-型)、电压门控钾通道(VGKC)、N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA)、TSH(甲状腺刺激激素)受体、两性蛋白、HepPar-1、神经节苷脂GQ1B、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM1和血型糖蛋白-A。
在一个优选的实施方案中，所述抗原A1为MHC抗原，所述抗原A2为对某种细胞类型或细胞谱系具有特异性的抗原。
在一个实施方案中，所述功能结构域F为免疫球蛋白模块，优选为抗体的scFv(单链可变片段)，更优选为抗体的Fv(可变片段)或荧光分子，优选为双分子荧光互补分子，更优选为GFP或GFP变体或能介导生物发光的分子，优选为荧光素酶分子，更优选为Gaussia荧光素酶。
在一个实施方案中，所述功能结构域F为抗体的Fv(可变片段)。
在一个实施方案中，所述功能结构域F特异性结合抗原或能够特异性结合抗原。在一具体的方面中，所述抗原可为存在于人免疫系统的细胞上的抗原。在一个优选的实施方案中，所述结合激活了人免疫系统的细胞。
在一个实施方案中，所述功能结构域F为T细胞衔接结构域(T cellengaging domain)，优选特异性结合CD2、CD3、CD5、T细胞受体或CD28的T细胞衔接结构域,更优选特异性结合CD3ε的T细胞衔接结构域；NK细胞(自然杀伤性细胞)衔接结构域，优选特异性结合CD1a、CD16a或CD56的NK细胞衔接结构域；衔接巨噬细胞的结构域，优选衔接特异性结合CD16a、CD32a、CD32b、CD89或CD64的结构域；单核细胞衔接结构域，优选特异性结合CD32a、CD32b、CD64或CD89的单核细胞衔接结构域；粒细胞衔接结构域，优选特异性结合CD16b、CD32a、CD32b、CD64或CD89的粒细胞衔接结构域；衔接中性粒细胞的结构域，优选衔接特异性结合CD89(FcαRI)的中性粒细胞的结构域；或衔接活化的中性粒细胞、单核细胞和/或巨噬细胞的结构域，优选衔接特异性结合CD64(FcγRI)的活化的中性粒细胞、单核细胞和/或巨噬细胞的结构域。
在一个实施方案中，所述功能结构域F为特异性结合与诊断或治疗化合物连接的抗原的结构域。
在一个实施方案中，所述功能结构域F是特异性结合载体分子或亲和标签的结构域。优选地，所述载体分子被连接至诊断或治疗化合物。优选地，所述亲和标签被连接至诊断或治疗化合物。
优选地，所述亲和标签选自：FLAG-标签、myc-标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-标签、血球凝集素(HA)-标签、多组氨酸(His)-标签、洋地黄毒苷(DIG)-标签和麦芽糖结合蛋白(MBP)-标签。
优选地，所述载体分子是肽或碳水化合物分子。在一个优选的实施方案中，所述功能结构域F为特异性结合载体分子(优选为连接诊断或治疗化合物的载体分子)的结构域，其中所述载体分子选自：明胶、菊粉、葡聚糖和羟乙基淀粉。
在一个实施方案中，所述治疗化合物为放射性化合物，优选为包含90Y、177Lu、131I、32P、10B或213Bi的放射性化合物。在一个实施方案中，所述治疗化合物为毒素。优选地，所述毒素选自：炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)水肿因子、炭疽芽孢杆菌致死因子、产气荚膜梭菌(C.perfringens)微小毒素、肉毒杆菌(C.botulinum)C2毒素、艰难梭菌(C.difficile)ADP-核糖基转移酶、白喉棒状杆菌(C.diphtheria)白喉毒素片段A、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)志贺毒素(亚基A)、产气荚膜梭菌菌株13毒素pfoA菌溶素(perfringolysin)O、蓖麻毒素A链、植物RIPBouganin、人RNASE3核糖核酸酶(RNA酶A家族,3)和炭疽杆菌致死因子肽链内切酶。根据本发明的毒素的其他非限制性实例为由选自SEQ IDNOS 160-168的氨基酸序列组成的毒素或包含选自SEQ ID NOS 160-168的氨基酸序列的毒素。
在一个实施方案中，所述诊断化合物为放射性化合物，优选为包含99mTc、111In、82Rb或201T1的放射性化合物。在一个实施方案中，所述诊断化合物为荧光化合物，优选为GFP、GFP变体或荧光小分子化合物，如FITC(异硫氰酸荧光素)、PE(藻红蛋白)、Alexa Fluor染料(如AlexaFluor488或相关染料)或花菁染料(如Cy3(吲哚碳菁染料)或Cy5(吲哚双碳菁染料)或相关染料)，在一个实施方案中，所述诊断化合物为能介导生物发光的分子，优选为荧光素酶分子，更优选为Gaussia荧光素酶。
在一个实施方案中，所述片段F1包含抗体的VL结构域，且所述片段F2包含该相同抗体的VH结构域，其中，优选地，所述抗体为抗-CD3抗体，更优选为抗-CD3ε抗体，或抗-His或抗-DIG抗体；或者所述片段F1包含抗体的VH结构域，且所述片段F2包含该相同抗体的VL结构域，其中，优选地，所述抗体为抗-CD3抗体，更优选为抗-CD3ε抗体，或抗-His或抗-DIG抗体。
在另一个实施方案中，分别包含于F1和F2片段中，或者分别包含于F2和F1片段中的所述VL和VH结构域也可属于两种不同的抗体，该抗体对相同抗原(对于相同或不同的表位)或不同抗原具有特异性。例如，这预期用于要建立新的技术参数的情况中(例如在噬菌体展示方法中)。
在另一个实施方案中，包含于F结构域中的所述免疫球蛋白模块包含选自以下的V结构域：
(i)抗-CD3抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:18-20(CDRs1-3)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:15-17(CDRs1-3)；
(ii)抗-CD3抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:24-26(CDRs1-3)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:21-23(CDRs1-3)；
(iii)抗-CD3抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:30-32(CDRs1-3)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:27-29(CDRs1-3)；
(iv)抗-CD3抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:36和37(CDRs1和3)以及DTS(CDR2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:33-35(CDRs1-3)；
(v)抗-CD3抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:41和42(CDRs1和3)以及YTN(CDR2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:38-40(CDRs1-3)；以及
(vi)抗-His抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:46和47(CDRs1和3)以及KVS(CDR2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:43-45(CDRs1-3)；
(vii)抗-DIG抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:50和131(CDRs1和3)以及YSS(CDR2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:48和49(CDRs1和2)以及A(CDR3)。
在另一个优选的实施方案中，包含于F结构域中的所述免疫球蛋白模块包含选自以下的V结构域：
(i)抗-CD3抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:2，所述VH结构域包含SEQ ID NO:1；
(ii)抗-CD3抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:4，所述VH结构域包含SEQ ID NO:3；
(iii)抗-CD3抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:6，所述VH结构域包含SEQ ID NO:5；
(iv)抗-CD3抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:8，所述VH结构域包含SEQ ID NO:7；
(v)抗-CD3抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:10，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9；以及
(vi)抗-His抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:12，所述VH结构域包含SEQ ID NO:11；
(vii)抗-DIG抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:14，所述VH结构域包含SEQ ID NO:30。
在一个实施方案中，所述功能结构域F为特异性结合毒素分子的结构域，所述毒素分子优选为这样的毒素分子：其本身不能穿透人细胞的细胞膜，且优选经与人细胞的细胞膜结合而内化入所述细胞中，其中，优选地，与所述细胞的细胞膜结合是通过特异性结合由两个分子(优选与所述细胞细胞膜结合的两个分子)形成的异源二聚体来介导的，其中，优选地，所述两个分子为本文所述的多肽P1和P2。在一个实施方案中，所述功能结构域F为这样的结构域：其特异性结合细菌的双组分A-B毒素的A-组分(活性组分)。在一个实施方案中，所述功能结构域F为特异性结合选自以下的毒素的结构域：炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)水肿因子、炭疽芽孢杆菌致死因子、产气荚膜梭菌微小毒素、肉毒杆菌C2毒素、艰难梭菌(C.difficile)ADP-核糖基转移酶、白喉棒状杆菌(C.diphtheria)白喉毒素片段A、伯克霍尔德氏菌志贺毒素(亚基A)、产气荚膜梭菌菌株13毒素pfoA菌溶素O、蓖麻毒素A链、植物RIP Bouganin、人RNASE3核糖核酸酶(RNA酶A家族,3)和炭疽杆菌致死因子肽链内切酶。根据本发明的毒素的其他非限制性实例为由选自SEQ ID NOS 160-168的氨基酸序列组成的毒素或包含选自SEQ ID NOS 160-168的氨基酸序列的毒素。
在一个实施方案中，所述功能结构域F为这样的结构域：其特异性结合荧光分子，优选为本身不能穿透人细胞的细胞膜的荧光分子。优选地，所述荧光分子为GFP或GFP变体或者这样的分子；其是或者包含荧光小分子化合物如FITC(异硫氰酸荧光素)、PE(藻红蛋白)、Alexa Fluor染料(如AlexaFluor488或相关染料)或花菁染料(如Cy3(吲哚碳菁染料)或Cy5(吲哚双碳菁染料)或相关染料)。
在一个实施方案中，所述功能结构域F为这样的结构域，其特异性结合能介导生物发光的分子，优选荧光素酶分子，更优选Gaussia荧光素酶。
在一个实施方案中，所述功能结构域F为荧光分子，优选双分子荧光互补分子，更优选为GFP或GFP变体，如YFP、CFP、Venus或Cerulean。
包含于根据本发明的该组多肽中的具体多肽P1或P2的实例为，包含选自SEQ ID NOS:114-129和197的氨基酸序列的多肽。
总体来说，本发明涉及治疗或消除任何不期望的细胞群和治疗或预防伴随该不期望的细胞群的病症或疾病。为此目的，要使用本发明的该组多肽。
在一个实施方案中，该组多肽是这样的一组多肽：其用于治疗患有肿瘤或癌症的患者，或者用于患有肿瘤或癌症的患者的诊断应用，优选用于治疗患有肿瘤或癌症且在接受同种异体的组织或细胞移植或打算接受该移植的患者，或者用于患有肿瘤或癌症且在接受或者打算接受同种异体的组织或细胞移植的患者的诊断应用，其中，优选地，将该组多肽给予所述患者。
待治疗或诊断的肿瘤的实例为，本文以上针对抗原A1和/或A2描述的那些肿瘤或癌细胞。
在一个实施方案中，所述治疗涉及消除接受者的某细胞类型(优选癌细胞类型)的组织/细胞，或接受者的产生某细胞类型(优选癌细胞类型)的前体细胞，任选地，在将捐献者的所述相同细胞类型的组织/细胞或捐献者的产生所述相同细胞类型的前体细胞移植到接受者之后或与其同时进行。
在一个实施方案中，本发明的该组多肽在造血性瘤变的同种异体移植环境中使用，例如，采用不匹配的HLA抗原,尤其是在治疗上利用该不匹配的情况中使用。在该示例性情况下，接受者HLA单体型(HLA患者)和造血谱系来源(CD45)的双重信息唯一地展示在患者的白血病原始细胞和其他造血细胞上。接受者来源的所有其他细胞表达接受者单体型，而非造血谱系抗原CD45(例如接受者非造血细胞是HLA-A2阳性而CD45阴性的)。同样，所有的捐献者造血细胞表达捐献者HLA单体型分子，这意味着在不匹配移植的情况(其中患者而非捐献者是HLA-A2阳性)下，它们是CD45阳性而HLA-A2阴性的。因此，本发明还涉及针对HLA-A2的双分子和互补的单链抗体构建体(在患者而非捐献者为HLA-A2阳性的情况下)，和对造血谱系标志物CD45具有特异性从而特异性靶向患者的所有造血细胞(包括所有血液肿瘤)的第二构建体。因此，第一多肽P1可包含与F1抗CD3的VL片段(例如，片段F1)融合的针对患者的HLA的单链可变片段抗体构建体(靶向部分T1)。第二多肽P2可包含与F2抗CD3-Fv的VH分开片段(片段F2)融合的对造血谱系标志物(例如，CD45)具有特异性的单链可变片段构建体(靶向部分T2)。
在一个实施方案中，所述消除涉及通过免疫系统的细胞、通过毒素或放射性化合物来破坏所述接受者的组织/细胞或所述接受者的前体细胞。
在一个实施方案中，该组多肽是这样的一组多肽：其用于正在接受同种异体的组织或细胞移植的患者的诊断应用，其中，优选地，所述患者为患有肿瘤的患者。
在一个实施方案中，所述诊断应用涉及在接受者的不同细胞类型或细胞谱系的细胞和捐献者的相同或不同类型或细胞谱系的细胞中，特异性检测接受者的某种细胞类型或细胞谱系的细胞。
在一个实施方案中，所述诊断应用涉及在接受者的非恶性细胞的细胞和捐献者细胞中，特异性检测接受者的是恶性细胞的细胞。在一个实施方案中，将该组多肽给予患者。
优选地，所述患者为哺乳动物，更优选为人。
在一个实施方案中，所述给予通过大丸剂给药或通过连续给药来进行。
在一个实施方案中，该组多肽的多肽P1和P2为平行给药。在另一个实施方案中，该组多肽的多肽P1和P2为依次给药。
在一个实施方案中，该组多肽的多肽P1或P2中的一种通过大丸剂给药而给予，而另一种通过连续给药而给予。
在一个实施方案中，所给予的多肽的量的范围为：对于多肽P1或多肽P2或者对于多肽P1和P2中的每一种，每天0.5μg/m2至每天500μg/m2；优选地，对于多肽P1或多肽P2或者对于多肽P1和P2中的每一种，每天5μg/m2至每天200μg/m2；更优选地，对于多肽P1或多肽P2或者对于多肽P1和P2中的每一种，每天10μg/m2至每天80μg/m2。
在一个实施方案中，对于多肽P1或多肽P2或者对于多肽P1和P2中的每一种，所给予的多肽的量的范围为每天0.05μg/m2至每天0.5μg/m2。
在一个实施方案中，所给予的多肽P1的量不同于所给予的多肽P2的量。
在一个实施方案中，对于多肽P1或多肽P2或者对于多肽P1和P2中的每一种，所给予的多肽的量的范围为每天0.5μg/m2至每天50μg/m2。在一个实施方案中，对于多肽P1或多肽P2或者对于多肽P1和P2中的每一种，所给予的多肽的量的范围为每天50μg/m2至每天100μg/m2。在一个实施方案中，对于多肽P1或多肽P2或者对于多肽P1和P2中的每一种，所给予的多肽的量的范围为每天100μg/m2至每天200μg/m2。在一个实施方案中，对于多肽P1或多肽P2或者对于多肽P1和P2中的每一种，所给予的多肽的量的范围为每天200μg/m2至每天300μg/m2。在一个实施方案中，对于多肽P1或多肽P2或者对于多肽P1和P2中的每一种，所给予的多肽的量的范围为每天300μg/m2至每天400μg/m2。在一个实施方案中，对于多肽P1或多肽P2或者对于多肽P1和P2中的每一种，所给予的多肽的量的范围为每天400μg/m2至每天500μg/m2。在一个实施方案中，对于多肽P1或多肽P2或者对于多肽P1和P2中的每一种，所给予的多肽的量的范围为每天500μg/m2至每天1mg/m2。
用于得到要给予的多肽P1和P2的量的其他参考意见，也可通过用双特异抗体构建体进行的咨询研究来获得(例如，Bargou R et al.,Tumorregression in cancer patients by very low doses of a T cell-engaging antibody.Science.2008；321(5891):974-7；和Topp MS et al.Targeted therapy with theT-cell-engaging antibody blinatumomab of chemotherapy-refractory minimalresidual disease in B-lineage acute lymphoblastic leukemia patients results inhigh response rate and prolonged leukemia-free survival.J Clin Oncol.2011,29:2493-8)。
在一个实施方案中，所述给予连续地进行：至少12小时、或至少1天、或至少2天、或至少3天、或至少4天、或至少5天、或至少6天、或至少7天、或至少8天、或至少9天、或至少10天、或至少11天、或至少12天、或至少13天、或至少14天、或至少15天、或至少16天、或至少17天、或至少18天、或至少19天、或至少20天、或至少21天、或至少22天、或至少23天、或至少24天、或至少25天、或至少26天、或至少27天、或至少28天、或至少29天、或至少30天、或至少5周、或至少6周。
在一个实施方案中，该组多肽或该组多肽中一种多肽的所述给予通过静脉，优选通过静脉注射进行。
在一个实施方案中，该组多肽或该组多肽中一种多肽的所述给予通过皮下，优选通过皮下注射进行。
在一个实施方案中，该组多肽联合选自以下的一种或多种药物进行给药：免疫调节药和/或固醇类，优选泼尼松龙或强的松。
在一个实施方案中，该组多肽联合放射性化合物，优选连接抗原、载体分子或亲和标签的放射性化合物进行给药，其中所述放射性化合物、所述抗原、所述载体分子或所述亲和标签被所述功能结构域F特异性结合。
在一个实施方案中，该组多肽联合毒素，优选连接抗原、载体分子或亲和标签的毒素进行给药，其中所述毒素、所述抗原、所述载体分子或所述亲和标签被所述功能结构域F特异性结合。
在一个实施方案中，该组多肽联合荧光分子，优选连接抗原、载体分子或亲和标签的荧光分子进行给药，其中所述荧光分子、所述抗原、所述载体分子或所述亲和标签被所述功能结构域F特异性结合。
在一个实施方案中，所述功能结构域F为特异性结合抗原的结构域，所述抗原没有被给予该组多肽的所述患者的免疫系统识别为外来物。
在一个实施方案中，将如上所述的两组多肽(第一组多肽和第二组多肽)同时或依次给药。在一个优选的实施方案中，所述第一组多肽具有不同于所述第二组多肽的片段F1和F2。在一个优选的实施方案中，所述第一组多肽具有与所述第二组多肽相同的片段F1和F2。在一个优选的实施方案中，所述第一组多肽的靶向部分T1和T2分别结合与所述第二组多肽的靶向部分T1和T2相同的抗原。在一个优选的实施方案中，所述第一组多肽的靶向部分T1和T2结合与所述第二组多肽的靶向部分T1和T2不同的抗原。
在一个实施方案中，所述患者在用该组多肽治疗之前已经接受了癌症治疗，所述癌症治疗优选为化疗、放疗或手术摘除肿瘤，或者所述患者在用该组多肽治疗的同时接受癌症治疗，所述癌症治疗优选为化疗、放疗或手术摘除肿瘤。
在一个实施方案中，该组多肽或该组多肽中的一种多肽是通过原核或真核表达系统或者通过从头合成的肽合成方法制备的。
在一个实施方案中，该组多肽或该组多肽中的一种多肽是通过引入所述患者的核酸的蛋白表达而在所述患者体内产生的。
很多患者患有过敏性或自体免疫疾病。在很多这样的情况中，克隆B细胞群产生异常的抗体，其与患者组织表达的抗原反应或与过敏原复合，从而产生超敏反应。在两种情况下，理想的是特异性消除异常的B细胞克隆。
为此，可以用某种方式修饰该组合系统，以便一个臂(P1或P2，具体是T1或T2)识别B细胞相关的抗原(例如CD19、CD20、CD38或CD138)，而另一个臂(分别为P2或P1，具体是T2或T1)为引起自体免疫疾病的抗体是结合的过敏原或底物。当这两个构建体结合CD19(CD20、CD38或CD138)为阳性并同时在其表面展现克隆型抗体的B细胞时，结合的抗-CD3VH和VL能相互作用并正好在B细胞上重组CD3结合位点。该过敏原特异性或抗原特异性组装将最终产生靶标B细胞的克隆清除。
因此，根据本发明，所述抗原A1和A2中的任一种也可为B细胞(尤其是引起自体免疫病症的B细胞)表面上的克隆型抗体。
在这种情形下，例如，所述抗原A1和A2中的一种可为CD19，而另一个可为B细胞(尤其是引起自体免疫病症的B细胞)表面上的克隆型抗体。
根据本发明的这个方面，所述靶向部分T1和T2中任一种可包含这样的过敏原或底物：其结合B细胞表面上的克隆型抗体和/或在结合克隆型抗体时能够引起自体免疫病症。包含于所述靶向部分T1和T2任一种当中的过敏原的非限制性实例为毛发过敏原，例如，狗毛、猫毛(例如Fel d 1、Feld d1A、Feld d1B)或豚鼠毛过敏原；或者花粉过敏原，例如，桦木、和草花粉过敏原。其他非限制性实例为螨虫过敏原(例如Tyr p 2、Der P1、Der f 2)、猫过敏原(例如Fel d 1、Feld d1A、Feld d1B)、花生过敏原(例如蓝豆蛋白-7)、腐菌过敏原(例如Alt a 1)、狗过敏原(例如Can f 1)、口炎性腹泻小麦过敏原(例如α/β-醇溶蛋白)、德国蟑螂过敏原(例如Bla g 1.02变体过敏原)、桦木(主要)花粉过敏原(例如Cyn d 1、Pha a 1、Dac g 3、Phl p2、Phl p 1、Profilin、Bet v 1-L、Bet v 1-A)、主要苹果过敏原(例如Mal d1)、牛奶过敏原(例如α-乳白蛋白、α-S1-酪蛋白)、鸡蛋过敏原(例如溶菌酶C、卵清蛋白)和马过敏原(例如Latherin、Equ c 1)等。包含于所述靶向部分T1和T2任一种当中的过敏原的又一个非限制性且优选的实例为，人骨髓瘤细胞系U266抗体IgE-ND的抗原。包含于所述靶向部分T1和T2任一种当中的过敏原的又一个非限制性且优选的实例为这样的过敏原：其由选自SEQ ID NOS 169-195的氨基酸序列组成或包含这样的氨基酸序列。
在这种情形下，本发明还涉及本文，尤其是在以上的方面中描述的该组多肽，其用于治疗或预防选自以下的病症：
(i)自体免疫病症；以及
(ii)超敏症。
根据本发明，待治疗或预防的自体免疫病症的非限制性实例选自：
(i)过敏症；
(ii)多发性硬化症；
(iii)牛皮癣；
(iv)全身性红斑狼疮；
(v)干燥综合征；
(vi)风湿性关节炎；
(vii)特发性血小板减少紫癜；
(viii)糖尿病；
(xi)血管炎；
(x)克罗恩病；以及
(xi)淀粉样变性。
本发明要治疗或预防的超敏症的非限制性实例选自：过敏症(根据库姆斯和盖尔氏分类的I型超敏反应)、抗体依赖性细胞毒性反应(II型超敏反应)、免疫复合物病(III型超敏反应)、迟发型超敏症(IV型超敏反应)和受体介导的免疫病症(V型超敏反应)。
在一个优选的实施方案中，所述自体免疫病症或超敏症伴随同种异体干细胞移植或由其引发(即，根据库姆斯和盖尔氏分类的I-V型超敏症中的任一种)。
由病原体(例如病毒，如HIV、EBV、CMV)感染的许多细胞在其细胞表面上表达病原体-编码的蛋白。因此，根据本发明，所述抗原A1和A2中的任一种也可为这样的病原体-编码的蛋白，例如细胞表面上的HIV、EBV或CMV蛋白。在这种情形下，本发明还涉及本文描述的该组多肽，用于治疗或预防传染性疾病，例如病毒感染性疾病。病原体-编码的蛋白的具体实例可获自http://www.uniprot.org/uniprot/，其为HIV gp120(Q78706)；EBV LMP-2(P13285)；CMV gB(P06473)；HBV HBS(Q9JG36)；HCV E1(C4B751)；HCV E2(Q6TRB1)；人腺病毒C血清型2HAdV-2(P03276)。
本发明的目的还通过编码如上述实施方案中所定义的一组多肽或该组多肽中的一种多肽的核酸分子或一组核酸分子来实现，其中，优选地，所述核酸分子或该组酸分子的核酸分子包含输出信号，其介导细菌或真核细胞分泌所述编码的多肽。
本发明的核酸分子或一组组核酸分子的非限制性实例包含如SEQ IDNOS:135-150和196所示的任一序列中的一个或多个核苷酸序列。
本发明的目的还通过包含如上定义的核酸分子的核苷酸序列或如上定义的一组核酸分子中一条核酸分子的序列的载体来实现。
本发明的目的还通过包含所述核酸/该组核酸或所述载体的细胞来实现。
本发明的目的还通过包含如上定义的一组多肽、或如上定义的核酸分子/一组核酸分子、或如上定义的载体的药物组合物来实现，其中优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
本发明的目的还通过包含如上定义的一组多肽和/或本发明的核酸分子或一组核酸分子和/或本发明的载体的试剂盒来实现。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含的该组多肽的多肽容纳在单一的小瓶中。
在一个优选的实施方案中，所述试剂盒包含的该组多肽的多肽容纳在单独的小瓶中。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含的该组多肽的一种或多种多肽是冷冻干燥的。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含的该组多肽的一种或多种多肽在溶液中。
本发明的目的还通过用于治疗患有以下疾病的患者的方法来实现：
(i)肿瘤或癌症和/或正在接受同种异体细胞或组织移植的患者；
(ii)自体免疫病症；或
(iii)超敏症。
所述方法可包括以下步骤：
-获得一组多肽，该组多肽包含
第一多肽P1，包含
(i)靶向部分T1，
其中所述靶向部分T1特异性结合抗原A1，和
(ii)功能结构域F的片段F1，
其中相对于所述结构域F的功能，所述片段F1本身和所述多肽P1本身均不具有功能，
以及
第二多肽P2，包含
(i)靶向部分T2，
其中所述靶向部分T2特异性结合抗原A2，所述抗原A2为对某种细胞类型或细胞谱系具有特异性的细胞表面分子，和
(ii)所述功能结构域F的片段F2，
其中相对于所述结构域F的功能，所述片段F2本身和所述多肽P2本身均不具有功能，
其中所述抗原A1不同于所述抗原A2，
其中其表面具有抗原A1和A2的基底，更具体地其细胞表面携带抗原A1和A2的细胞不存在时，所述多肽P1和多肽P2彼此没有结合，且
其中当所述多肽P1的片段F1和所述多肽P2的片段F2二聚化时，所得的二聚体相对于所述结构域F的功能具有功能性，
-将该组多肽给予所述患者。
在该治疗方法中，该组多肽如上述实施方案所定义。
本发明的目的还通过使用如上所述的一组多肽治疗正在接受细胞或组织移植的患者的方法来实现。
本发明的目的还通过如上述实施方案所定义的一组蛋白在制备用于治疗患有以上所定义和描述的疾病或病症的患者(例如患有癌症和/或正在接受细胞或组织移植的患者)的药物中的用途来实现。
如本文所用，术语“多肽”是指含有多于30个氨基酸的氨基酸线性分子链。任选地，多肽可包含一个或多个二硫键或被化学修饰。此外任选地，非蛋白元件(如荧光团、RNA-适体、DNA-适体或小分子)可连接至所述氨基酸线性分子链。这类多肽可通过任何已知方法制备。例如，所述多肽可通过编码所述多肽的核酸的表达来制备，或通过固相合成方法来合成，或通过例如化学键缀合或连接现有分子来制备。
术语“多肽P1”用于指这样的多肽：其包含(i)靶向部分，其中所述靶向部分特异性结合抗原，和(ii)功能结构域的片段，其中相对于所述功能结构域的功能，所述片段本身和所述多肽P1本身均不具有功能。术语“多肽P2”用于指这样的多肽：其包含(i)靶向部分，其中所述靶向部分特异性结合抗原，和(ii)功能结构域的片段，其中相对于所述功能结构域的功能，所述片段本身和所述多肽P2本身均不具有功能。
如本文所用，术语“结构域”是指这样的氨基酸线性分子链：其包含整个多肽或多肽一部分的氨基酸序列。任选地，结构域可包含一个或多个二硫键或被化学修饰。此外，任选地，结构域可包含非蛋白元件(如荧光团)。然而，在一个实施方案中，术语“结构域”不包含经化学修饰的化合物或非蛋白元件。
如本文所用，“功能结构域”是这样的结构域：其能完成某种功能，如特异性结合某种结合伴侣或抗原、特异性激活某种受体、介导毒性作用或在用合适波长的光激发后的荧光反应。
术语“功能结构域F”优选还包括非蛋白化合物。然而，在一个实施方案中，其指蛋白化合物或其功能部分。
如本文所用，术语“结构域的片段”是指对应于结构域一部分而非整个结构域的氨基酸线性分子链。任选地，结构域的片段可包含一个或多个二硫键或被化学修饰。此外，任选地，结构域可包含非蛋白元件或此类非蛋白元件的一部分。
术语“片段F1”用于指功能结构域的片段。术语“片段F2”用于指功能结构域的片段。
如本文所用，成对的缩写P1、P2；T1、T2；F1、F2；A1、A2；和I1、I2分别是用于表示不同的多肽、靶向部分、片段、抗原和免疫球蛋白模块。它们分别与第一多肽、第二多肽；第一靶向部分、第二靶向部分；第一片段、第二片段；第一抗原、第二抗原；和第一免疫球蛋白模块、第二免疫球蛋白模块同义。
如本文所用，术语“部分”是指包含整个多肽或多肽一部分的氨基酸序列的氨基酸线性分子链。任选地，部分可包含一个或多个二硫键或被化学修饰。此外，任选地，部分可包含非蛋白元件(如寡核苷酸)。然而，在一个实施方案中，术语“部分”不包含经化学修饰的化合物或非蛋白元件。
术语“靶向部分T1”用于指特异性结合抗原例如抗原A1的部分。术语“靶向部分T2”用于指特异性结合抗原例如抗原A2的部分。
如本文所用，“接头”是指连接所述多肽的两个部分或所述多肽包含的两个结构域的多肽中的氨基酸序列。
如本发明所用，术语“核酸分子”定义的是由多于30个核苷酸组成的线性分子链。该术语包括DNA(如cDNA或基因组DNA)和RNA。
如本文所用，术语“构建体”是指包含一个或多个重组核苷酸序列的核酸分子。该术语还包括由重组核苷酸序列表达的多肽或人工制备的多肽、或包含两个或更多个在相同蛋白中非天然存在的氨基酸序列的重组分子。
如本发明所用，术语“特异性结合”，在特异性结合相互作用伴侣或抗原的分子或结构域的语境下，是指分子或结构域结合所述相互作用伴侣或抗原，优选通过非共价结合，或者分子或结构域能结合所述相互作用伴侣或抗原，优选通过非共价结合，但没有或基本上没有与任何其他和所述相互作用伴侣或抗原结构类似的相互作用伴侣或抗原进行交叉反应。
在靶向部分(如靶向部分T1或T2)特异性结合抗原(如抗原A1或A2)的语境下，术语“特异性结合”是指这样的情况：所述靶向部分能够特异性结合所述抗原或其实际上结合所述抗原。
在T细胞衔接结构域、NK细胞衔接结构域、衔接巨噬细胞的结构域、单核细胞衔接结构域、粒细胞衔接结构域、衔接中性粒细胞的结构域、或衔接活化的中性粒细胞、单核细胞和/或巨噬细胞的结构域的语境下，术语“特异性结合”抗原或分子是指这样的情况：各个结构域能够特异性结合所述抗原或分子或者其实际上结合所述抗原或分子。
在功能结构域为“特异性结合”抗原、分子、化合物、载体分子或亲和标签的结构域的语境下，术语“特异性结合”是指这样的情况：所述功能结构域能够特异性结合所述抗原、分子、化合物、载体分子或亲和标签或者其实际上结合所述抗原、分子、化合物、载体分子或亲和标签。
在功能结构域“特异性结合”毒素、荧光团、抗原、载体分子或亲和标签的语境下，这是指这样的情况：所述功能结构域能够特异性结合所述毒素、荧光团、抗原、载体分子或亲和标签或者其实际上结合所述毒素、荧光团、抗原、载体分子或亲和标签。
如本申请所用，如果分子或抗原由某种细胞类型/细胞谱系的细胞表达，而非(或仅有可忽略程度的)由其他细胞类型或其他细胞谱系的细胞表达，则所述分子或抗原“对所述细胞类型或所述细胞谱系具有特异性”。在某些实施方案中，如果分子或抗原由某种细胞类型/细胞谱系的细胞表达，且除了所述细胞类型/所述细胞谱系的细胞外，仅仅少数其他细胞类型或其他细胞谱系的细胞也表达所述抗原，同时除了所述细胞类型/所述细胞谱系的细胞外，大多数其他细胞类型或其他细胞谱系的细胞不(或仅有可忽略程度的)表达所述抗原，则所述分子或抗原“对所述细胞类型或细胞谱系具有特异性”。术语“对某种细胞类型或细胞谱系具有特异性”也可指，相比其他细胞类型/其他细胞谱系的细胞，所述细胞类型/所述细胞谱系的细胞以更高的比率或以更高的比例或量表达所述分子或抗原，在某种程度上，在其他细胞类型/其他细胞谱系的细胞中可能存在少量但可检测到的所述分子的表达。如本文所用，在针对某种细胞类型或细胞谱系的标志物的语境下，术语“标志物”可指分别对细胞类型或细胞谱系的细胞具有特异性的分子或抗原，如上所述。
如本文所用，术语“适体”是指由寡核酸(如RNA或DNA)或者肽或非肽的分子组成的小化合物，其以高亲和力结合特定靶分子。
如本文所用，术语“载体分子”是指这样的分子或分子的一部分：其没有被给予本发明的该组多肽的患者的免疫系统识别为外来物，或者其通过给予本发明的该组多肽的患者没有引起或仅引起很弱的免疫反应。优选地，这样的“载体分子”被或能够被另一分子如抗体结合。在某些实施方案中，“载体分子”为这样的分子或分子的一部分：在某些实施方案中，所述载体分子共价地或非共价地连接至第二分子或第二分子的一部分，例如荧光团或毒素。
术语“MHC”是指主要组织相容性复合体，其为编码包含细胞表面分子的一组分子的一组基因，所述细胞表面分子为将抗原呈递给T-细胞所需并且还负责快速移植排斥。在人类中，所述MHC包括以下基因：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-HQ和HLA-DR。在本申请中，该术语用于指主要组织相容性复合体的基因以及这些基因编码的产物。术语“HLA”是指人白细胞抗原。如本文所用，“HLA”是人的“MHC”形式。
如本文所用，术语“等位基因变体”表示占据相同染色体座位的基因的两种或更多种替代形式的任何一种。例如，HLA-A1、HLA-A2和HLA-A3为HLA-A的3种等位基因变体。术语等位基因变体在本文也用于表示由基因的等位基因变体编码的蛋白。
如本文所用，术语“抗原”是指已知被抗体或抗体的抗原结合部分特异性结合或能够被其特异性结合的分子。在其最广义的含义上，“抗原A1”是指如上所定义的抗原。在其最广义的含义上，“抗原A2”是指如上所定义的抗原。选择的“抗原A1”和“抗原A2”的命名是为了区分“抗原A1”和“抗原A2”。“MHC抗原”是这样的抗原：其也是属于主要组织相容性复合体的分子。MHC抗原包括MHC I类抗原(在人类中，抗原HLA-A、HLA-B和HLA-C)和MHC II类抗原(在人类中，抗原HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR)。词语细胞“携带抗原”或“在其细胞表面携带抗原”是指这样的情况：即细胞表达的抗原存在于所述细胞的细胞表面，并且对在所述细胞外的抗体来说是可接近的。词语基底“在其表面具有抗原”是指这样的情况：即所述抗原存在于所述基底的表面上，并且对应用于所述基底的抗体来说是可接近的。
如本文所用，术语“对细胞的恶性状态具有特异性的抗原”是指这样的抗原：某个细胞类型的恶性细胞(如恶性B-细胞肿瘤细胞)在其细胞表面携带，但相同细胞类型的非恶性细胞(如非恶性B-细胞)在其细胞表面不(或仅有可忽略程度的)携带。
如本文所用，术语“对恶性细胞类型具有特异性的抗原/分子”是指这样的抗原/分子：某个细胞类型的恶性细胞(如恶性B-细胞肿瘤细胞)在其细胞表面携带，但相同细胞类型的非恶性细胞(如非恶性B-细胞)或其他细胞类型的细胞(如T-细胞或肝细胞)在其细胞表面不(或仅有可忽略程度的)携带。在某些实施方案中，术语“对恶性细胞类型具有特异性的抗原/分子”是指这样的抗原/分子：某个细胞类型的恶性细胞(如恶性B-细胞肿瘤细胞)在其细胞表面携带，但相同细胞类型的非恶性细胞(如非恶性B-细胞)在其细胞表面不(或仅有可忽略程度的)携带，且除了该某个细胞类型以外，仅少数其他细胞类型的细胞在其细胞表面携带，同时大多数其他细胞类型的细胞不(或仅有可忽略程度的)携带。术语“对恶性细胞类型具有特异性的抗原/分子”也可指，相比相同细胞类型的非恶性细胞，某个细胞类型的恶性细胞以更高的比率或以更高的比例或量表达所述抗原/分子，在某种程度上，在相同细胞类型的非恶性细胞中可能存在少量但可检测到的所述分子表达。如本文所用，术语“标志物”在某种细胞的恶性状态或恶性细胞类型的标志物的上下文中，可指这样的分子或抗原：其分别对某种细胞的恶性状态或恶性细胞类型具有特异性，如上所述。
如本文所用，术语“免疫球蛋白结构域”是指基本上由抗体链的球状区组成的结构域。免疫球蛋白结构域的特征在于，其保留了抗体分子的免疫球蛋白折叠特性。免疫球蛋白如IgG、IgE或IgM，由不同数目的重链和轻链组成。每条重链和轻链含有恒定区和可变区。每个轻链可变区(VL)和每个重链可变区(VH)含有3个高变区，也称“互补决定区”或“CDR”。CDR主要负责免疫球蛋白与抗原的结合。
术语“VH”或“VH结构域”可互换使用且指抗体的免疫球蛋白重链的可变区。术语“VL”或“VL结构域”可互换使用且指抗体的免疫球蛋白轻链的可变区。
如本文所用，术语“免疫球蛋白模块”是指这样的分子、分子的一部分或分子组合：其包含一个或多个，优选两个或更多个免疫球蛋白结构域，且其能结合抗原。优选地，“免疫球蛋白模块”包含这样的氨基酸线性分子链：其包含一个或多个，优选两个或更多个免疫球蛋白结构域的氨基酸序列。任选地，“免疫球蛋白模块”包含一个或多个，优选两个或更多个二硫键。术语“免疫球蛋白模块”包含这样的分子或分子的一部分：其包含抗体的“单链可变片段”或由抗体的“单链可变片段”组成。术语“免疫球蛋白模块”还包含这样的分子或分子的一部分：其包含美洲驼抗体、骆驼抗体或鲨鱼抗体的VHH结构域或由美洲驼抗体、骆驼抗体或鲨鱼抗体的VHH结构域组成。
术语“免疫球蛋白模块I1”用于指包含相连的VH结构域和VL结构域的免疫球蛋白模块。优选地，所述免疫球蛋白模块I1的VL结构域和VH结构域源自相同的抗体。优选地，所述免疫球蛋白模块I1的VL结构域和VH结构域形成二聚体。优选地，所述二聚体能特异性结合抗原。所述抗原可为例如抗原A1。在一个实施方案中，所述“免疫球蛋白模块I1”包含抗体的“单链可变片段”，所述抗体能特异性结合抗原，例如抗原A1。
术语“免疫球蛋白模块I2”用于指包含相连的VH结构域和VL结构域的免疫球蛋白模块。优选地，所述免疫球蛋白模块I2的VL结构域和VH结构域源自相同的抗体。优选地，所述免疫球蛋白模块I2的VL结构域和VH结构域形成二聚体。优选地，所述二聚体能特异性结合抗原。所述抗原可为例如抗原A2。在一个实施方案中，所述“免疫球蛋白模块I2”包含抗体的“单链可变片段”，所述抗体能特异性结合抗原，例如抗原A2。
在包含相连的VH结构域和VL结构域的免疫球蛋白模块的构建体中，VL结构域可位于相应VH结构域的N-端或C-端。本领域技术人员能够确定VH和VL结构域的哪种排列更适合特定的单链可变片段结构域。
如本文所用，术语“Fv”和“可变片段”是指这样的抗体片段：其为含有完全的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区由一个重链可变区和一个轻链可变区紧密地以非共价结合而形成的二聚体(VH-VL二聚体)组成。在该结构中，VH和VL结构域一起在VH-VL二聚体的表面上限定了具有抗原结合特异性的抗原结合位点。
术语“scFv”、“单链Fv”和“单链可变片段”可互换使用且用于指抗体或抗体的一部分，其中典型的双链抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)已经连接成一条链。通常在这两条链之间插入接头，以允许合适的折叠并产生活性结合位点。
如本文所用，术语“美洲驼抗体”是指源自美洲驼的抗体或抗体的一部分。如本文所用，术语“骆驼抗体”是指源自骆驼的抗体或抗体的一部分。如本文所用，术语“鲨鱼抗体”是指源自鲨鱼的抗体或抗体的一部分。美洲驼、骆驼和鲨鱼的抗体具有由一个单独结构域VHH(而非VH和VL链)建立的抗原结合部分。
如本文所用，表述“T细胞衔接结构域”用于指这样的结构域：其特异性结合存在于T细胞的细胞表面上的抗原。优选地，所述T细胞衔接结构域结合所述抗原激活了所述T细胞。类似地，表述“NK细胞衔接结构域”是指这样的结构域：其特异性结合存在于自然杀伤性细胞的细胞表面上的抗原。优选地，所述NK细胞衔接结构域结合所述抗原激活了所述自然杀伤性细胞。表述“衔接巨噬细胞的结构域”是指这样的结构域：其特异性结合存在于巨噬细胞的细胞表面上的抗原。优选地，所述衔接巨噬细胞的结构域结合所述抗原激活了所述巨噬细胞。表述“单核细胞衔接结构域”是指这样的结构域：其特异性结合存在于单核细胞的细胞表面上的抗原。优选地，所述单核细胞衔接结构域结合所述抗原激活了所述单核细胞。表述“粒细胞衔接结构域”是指这样的结构域：其特异性结合存在于粒细胞的细胞表面上的抗原。优选地，所述粒细胞衔接结构域结合所述抗原激活了所述粒细胞。表述“衔接中性粒细胞的结构域”是指这样的结构域：其特异性结合存在于中性粒细胞的细胞表面上的抗原。优选地，所述衔接中性粒细胞的结构域结合所述抗原激活了所述中性粒细胞。表述“衔接活化的中性粒细胞、单核细胞和/或巨噬细胞的结构域”是指这样的结构域：其特异性结合存在于活化的中性粒细胞、单核细胞和/或巨噬细胞的细胞表面上的抗原。优选地，所述衔接活化的中性粒细胞、单核细胞和/或巨噬细胞的结构域结合所述抗原激活了所述单核细胞和/或巨噬细胞。
如本文所用，术语“能介导生物发光的分子”是指具有酶促活性的分子(或分子的功能部分)，所述酶促活性能在合适底物的存在下催化引起生物发光的反应。该术语包括荧光素酶，如萤火虫或Gaussia的荧光素酶。
如本文所用，术语“GFP变体”是指这样的分子：其通过引入改变而具有源自水晶果冻水母(Aequorea Victoria)的绿色荧光蛋白氨基酸序列的氨基酸序列，所述改变产生更大的荧光或发出不同颜色的荧光。该术语旨在包括YFP(黄色荧光蛋白)、CFP(蓝色荧光蛋白)、Venus(Nagai T et al.,Avariant of yellow fluorescence protein with fast and efficient maturation forcell-biological applications.Nat Biotechnol.2002 Jan；20(1):87-90)、Cerulean(带有S72A、Y145A和H148D取代的增强的CFP)等。
“增强的GFP"(和类似地，“增强的YFP”、“增强的CFP”)是指这样的GFP(YFP,CFP)：其已经如Kain et al.(1995)Biotechniques 19(4):650-55中所报道的被“人源化”。“人源化”是指改变GFP(YFP,CFP)核酸序列来优化其密码子以用于在人细胞中表达蛋白。
如本文所用，术语“双分子荧光互补分子”是指这样的荧光分子：其可作为本身不发荧光的两个片段来提供，但当这两个片段之间进行异源二聚化时形成能发荧光的二聚体。
如本文所用，术语“治疗化合物”是指适于预防、治疗、减轻或治愈疾病或疾病状况的化合物。优选地，“治疗化合物”是指当进入细胞时能够引起该细胞死亡的化合物。在某些实施方案中，治疗化合物可为化学的或放射性的化合物，其破坏重要的细胞结构或中断重要的细胞进程。
如本文所用，术语“诊断化合物”是指能够被普通检测方法(如在临床或生化或医学诊断实验室中使用的方法)检测到的化合物，例如荧光化合物、放射性化合物或介导生物发光的分子。
术语“祖细胞/前体细胞”用于指未成熟、未分化的或部分分化的细胞，其通常见于出生后的动物/人，且具有分化为一种或多种特定细胞类型的潜力。术语“肿瘤的祖细胞/前体细胞”是指产生肿瘤细胞并具有改变的特性(例如有关其增殖行为或基因表达方式)的祖细胞/前体细胞。这类肿瘤祖细胞/前体细胞的实例为，例如白血病前体细胞或祖细胞。
如本文所用，术语“癌症”是指恶性细胞、细胞群或恶性肿瘤。该术语旨在包括癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞肿瘤和胚细胞瘤。“癌细胞”是指是癌症的一部分或源自癌症的细胞。术语“肿瘤”可与术语“癌症”互换使用。
如本文所用，术语“血液肿瘤”是指血液或造血系统(如骨髓细胞、造血细胞和成熟血细胞的前体细胞)的癌症。在某些实施方案中，术语“血液肿瘤”是指形成的血液瘤。如本文所用，术语“非血液肿瘤”是指不是血液肿瘤的肿瘤。
如本文所用，术语“正在接受同种异体的组织或细胞移植的患者”是指这样的情况：患者接受或已经接受了获自另一个人的移植的细胞或组织。根据这个方面的优选情况是具有不匹配的HLA抗原的情况。如本文所用，单位“μg/m2”在所给予的多肽的量的语境下，是指给予所述多肽的患者每平米身体表面的某量的多肽(该多肽可通过任何恰当的给药途径来给予，如通过静脉注射或皮下注射)。例如，表述“对于多肽P1所给予的多肽量为每天50μg/m2”用于表示这样的情况：给予多肽P1的患者每平米身体表面每天给予的多肽P1的量为50μg。当患者身体表面为2m2时，这意味着每天给予100μg多肽P1。
本发明人出人意料地发现，使用本发明的一组多肽可克服上文指出的现有技术中的问题，并可实现以上描述的目的。此外，本发明人出人意料地发现，使用本发明的一组多肽，能够以高特异性和降低的副作用来鉴别和/或消除具有两种抗原的特定组合的细胞。
本发明的组合策略的一个优势为，没有使用预制的F单元(例如抗-CD3单元)。F1和F2(即CD3的VH和VL)本身没有异二聚化，甚至在稳定其二聚化的试剂(例如能够结合结构域F的抗原，例如CD3、HIS或DIG)存在下也没有异二聚化，因而没有产生功能性F结构域(例如没有刺激T细胞)。仅在两个互补构建体P1和P2同时结合给定细胞表面的情况下，两个元件F1和F2才重构为F结构域(例如，CD3结合位点)。因此，F结构域的功能(例如T细胞激活)仅仅在需要的地方发生而非全身性发生。因此，例如相比常规双特异抗体策略，可以想象本发明的组合策略具有更小的毒性作用。这也被所附的实施例尤其是通过同种异体移植的体内模型所证实，其中HLA-A2阳性小鼠在输注HLA-A2反应性构建体后，没有遭受任何临床效应。
具体地，对于表达预定的抗原信号的标签细胞，将两条单链多肽设计为最终的双分型(双分子)构建体(双分子/三特异抗体构建体)的部分，各自由抗原结合单链可变片段(scFv)以及抗体的可变轻链(VL)或可变重链(VH)结构域组成。当这些杂合体片段结合在单个细胞表面上的其各自的抗原时，VL和VH结构域彼此相互作用以重构最初的抗原结合位点，从而实现期望的需求。
如上所述，本发明的该组多肽的一个优势为，结合细胞表面上的两个靶抗原是功能性异源二聚化所必需的。两个互补部分的自组装和随后仅一个臂结合其抗原后的T细胞激活可被阻止，因而证明了表明VH或VL本身结合亲和力低，且VH/VL异源二聚体在没有抗原的情况下倾向于迅速解离这样的公开数据(Colman,1987,Nature 326,358-363；Amit,1986,Science 233,747-753；Law,2002,Int Immunol 14,389-400；Ueda,1996,NatBiotechnol 14,1714-1718)。
相比本领域熟知的同源或异源二聚化结构域(亮氨酸拉链、Fc结构域、结进孔等)，VH和HL相互作用具有低亲和力。然而，已显示在结合特定抗原后VH/VL相互作用可以被稳定。不受任何理论的约束，本发明的VH/VL相互作用仅在两个片段均预先结合其同源靶抗原(例如在靶细胞表面上)的情况下才发生。同样，不受任何理论的约束，在同时准确的结合后，使得所述构建体极为接近，从而它们能与所述抗原形成三聚体复合体。从而本发明的靶上互补的三特异性异源二聚体相对于结构域F的功能具有功能性，例如，如果抗CD3得以重构则衔接并刺激T细胞以用于破坏肿瘤细胞。
除了本发明的构建体P1和P2的一个优势，例如引起免疫反应的组合特性，在本发明背景下出人意料地发现，F结构域被破坏的双分子构建体例如scFv-抗CD3，没有显示出脱靶效应。
相比常规的双特异构建体如BiTE构建体，本发明的该组多肽，具体地，其中所包含的多肽P1和P2具有更稳定和/或具有改善的储存期(尤其是在4℃)的另一优势。这些常规的双特异构建体易于聚集(尤其是在4℃)。
应认识到，本发明的多肽P1和P2，更具体地，其中所包含的F1和F2，更具体地，其中可能包含的VH和VL，由于它们的疏水性表面而能够结合白蛋白。这带来了提高的保留时间，即在体内更长的生物利用度，在体外也一样，例如，在血清或血液样品中。
本发明的该组多肽包含第一多肽P1和第二多肽P2。第一多肽P1包含第一靶向部分T1(其能特异性结合抗原A1)，其融合至功能结构域F的第一片段F1(参见图1A，上部)。第二多肽P2包含第二靶向部分T2(其能特异性结合抗原A2)，其连接至功能结构域F的第二片段F2(参见图1A，底部)。重要的是，功能结构域的片段F1和F2其本身没有毒性且不能发挥任何生物功能，除非在这两条多肽P1和P2之间存在搭配。当多肽P1和P2同时结合表达抗原A1和A2的单个细胞表面上的其抗原时，使得功能结构域F的片段F1和F2极为接近，它们进行异源二聚化从而互补所需的生物功能(参见图1B)。另一方面，仅表达抗原A1(图1C)或抗原A2(图1D)或者不表达所述抗原的细胞不会引起生物功能的互补。因此，仅在其细胞表面具有抗原A1和A2的细胞存在下，当多肽P1和P2同时结合该细胞时，才以高特异性获得所述生物功能。根据功能结构域F的特性，可实现不同的目的，如特异性鉴别/检测或消除表达抗原A1和A2的细胞。
在一个示例性实施方案中，将本发明的原理适用于特异性消除肿瘤细胞：
新的组织病理学和流式细胞术分析已经揭示，不是通过单一的表面标志物而是通过异常抗原组合/谱的表达，可以检测肿瘤细胞并将其与对应的非转变细胞区分，这对于血液肿瘤和各种其他来源的癌症和癌症干细胞为已知的。因此，尽管单抗原可能不足以特异性鉴别某种肿瘤细胞，两种抗原的特定组合可允许将肿瘤细胞与任何其他细胞类型区分。
例如，本发明的该组多肽可用于特异性消除特征为在其细胞表面同时表达抗原CD33和CD19的癌细胞。该抗原组合见于急性白血病细胞的某些类型上，并将这些细胞区别于任何其他细胞(如非-恶性细胞)，其可能在其细胞表面携带CD33或CD19，但不是在其细胞表面携带CD33和CD19二者。(Ossenkoppele et al.,Review of the relevance of aberrant antigenexpression by flow cytometry in myeloid neoplasms.Br J Haematol 2011,153(4):421-36)。
为特异性消除这些在其细胞表面携带CD33和CD19二者的白血病细胞，第一多肽P1的第一靶向部分T1可为对CD33具有特异性的单链可变片段(scFv)。作为功能结构域F的片段F1，可以选择抗CD3抗体的轻链可变结构域VL。第二多肽P2的第二靶向部分T2可为对CD19具有特异性的scFv。作为功能结构域F的片段F2，可以选择该抗CD3抗体的重链可变结构域VH。抗CD3抗体的轻链可变结构域VL和重链可变结构域VH本身都无毒性。除非在多肽P1和P2之间存在搭配，否则它们不能发挥其生物功能(即有效地结合CD3抗原)。
在其细胞表面具有CD33和CD19二者的白血病细胞的存在下，多肽P1和P2同时结合该细胞。结果，功能组F的片段F1和F2(即该抗-CD3抗体的抗CD3可变结构域Fv的重链和轻链)被紧密地拉近到一起，它们进行异源二聚化从而互补出所需的生物功能，使得P1和P2的二聚体能够特异性结合CD3。
CD3是存在于T细胞表面的细胞表面分子。该分子是T细胞信号转导复合体的一部分，并且在结合CD3特异性抗体后，T细胞表面上的CD3分子的交联导致T细胞的激活。通过衔接T细胞表面上的CD3抗原，多肽P1和P2的异源二聚体能够募集T细胞并激活它们。结果，引发了细胞毒性T细胞反应的典型效应机制，导致细胞裂解：释放含有细胞毒性蛋白穿孔蛋白、颗粒酶和颗粒溶素的裂解性颗粒。穿孔蛋白在靶细胞的膜中形成孔，所述颗粒酶可穿过该孔进入细胞并诱导细胞凋亡。这些效应导致在其细胞表面携带CD33和CD19抗原的白血病细胞的特异性破坏。
除了白血病细胞外的其他细胞，在其细胞表面不具有CD33和CD19抗原。因此，它们不能募集多肽P1和P2，并且没有实现CD3结合能力的互补和CD3阳性T淋巴细胞的衔接。因此，除了白血病细胞外的其他细胞不受影响，并实现了恶性细胞的高特异性地破坏。
这与常规双特异抗体明显不同。衔接T细胞且对表达CD33的细胞具有特异性的常规双特异构建体会介导对所有CD33阳性细胞的破坏。由于CD33是在很多骨髓细胞和骨髓祖细胞上表达的骨髓谱系标志物，破坏这些细胞会导致患者长期发育不全并可能死亡。衔接T细胞且对CD19阳性细胞具有特异性的常规双特异构建体会消除其细胞表面携带CD19抗原的所有细胞。CD19表达于B-淋巴细胞的一重要子集上。破坏这些细胞会导致免疫系统的严重缺陷。因此，除了消除在其表面同时表达CD33和CD19的白血病细胞，应用对CD33和CD19具有特异性的常规双特异抗体会导致骨髓细胞和大量B-淋巴细胞子集的消除。
因此，常规双特异抗体仅识别待消除的细胞上的一种抗原，而本发明的效应物激活要求同时识别待鉴别/消除的细胞表面上的两种特异性抗原。因此，本发明实现了明显提高的特异性并降低了副作用。
本领域技术人员明白，在本发明的原理内对上述示例性实施方案进行的不同变化是可能的。
例如，仅仅通过选择合适的分别特异性结合抗原A1和A2的靶向部分T1和T2，上述示例性实施方案中描述的方法便可方便地适用于鉴别/消除除了CD33和CD19阳性急性白血病细胞外的其他类型肿瘤细胞，所述抗原A1和A2同时存在于待鉴别/消除的细胞上，而没有同时存在于其他细胞类型上。如以上所述，很多(即便不是所有)癌细胞(以及癌细胞的祖细胞/前体细胞)表达许多其本身也在正常组织上广泛表达的细胞表面分子，但是如果其以非生理上的组合表达则指示恶性表型。例如，CD34是造血干细胞的标志物，而CD7可以在淋巴细胞的子集上检测到。然而，CD34和CD7的组合则与恶性肿瘤密切相关，且在大部分的急性骨髓性白血病上可以检测到这两种抗原的异常共表达(Ossenkoppele et al.,Review of therelevance of aberrant antigen expression by flow cytometry in in myeloidneoplasms.Br J Haematol 2011,153(4):421-36.)。类似地，已经有关于卵巢癌干细胞中CD44和CD117、胰腺癌起始细胞中CD44和CD24以及结肠癌和乳腺癌干细胞中的EpCAM和CD44组合的异常共表达的记载(Natasha Y.Frank,Tobias Schatton,Markus H.Frank；The therapeutic promise of thecancer stem cell concept.J Clin Invest.2010；120:41–50)。已经发现CD24和CD29以及CD24和CD49f的表达对于乳腺癌具有特异性(Vassilopoulos Aet al.Identification and characterization of cancer initiating cells fromBRCA1 related mammary tumours using markers for normal mammary stemcells.Int J Biol Sci 2008；4:133-142)。此外，具有高度表达的抗原水平的组合是很多恶性肿瘤的指示，如骨髓瘤的CD38和CD138。
除了以上所列举的和从科学文献中了解到的癌症-特异性抗原组合，在特定肿瘤细胞上同时表达而没在其他细胞上表达的两个抗原的其它组合，本领域技术人员可以直接获得。
首先，通过将对各个细胞类型恶性状态具有特异性的抗原与合适的细胞类型标志物或细胞谱系标志物进行组合，本领域技术人员可以获得对某种癌症具有特异性的抗原组合。例如，碳酸酐酶IX是与肾细胞癌和肾细胞癌转移酶极为相关的标志物，因此，其代表了肾细胞恶性状态的标志物。然而，这种位于细胞膜上的标志物也表达于正常的肠道细胞上。通过选择肾谱系标志物如水通道蛋白作为第二抗原，所得的两种抗原的组合对肾细胞癌细胞和肾细胞癌转移产生的细胞具有特异性，而非恶性肾细胞(其不表达碳酸酐酶IX)以及来自肠道的细胞(其不表达水通道蛋白)都未用所选择的抗原对表征。
各种细胞类型的恶性状态的标志物和众多细胞类型或细胞谱系的标志物的详细信息，可从文献和基于网络的资源获得(详情参见下文)或者可通过直接进行实验获得(参见下文)。
细胞恶性状态标志物的实例包括：针对上皮细胞和导管型乳腺癌细胞的E-钙粘蛋白；针对类上皮细胞恶性肿瘤和卵巢癌细胞、腺癌细胞和乳腺癌细胞的Ca-125；针对乳腺癌细胞的Her-2/neu；针对乳腺癌细胞的巨大囊肿病液体蛋白(BRST-2蛋白)；针对肺癌和乳腺癌细胞的BCA-225(乳腺癌相关的糖蛋白)；针对胰腺癌、胆管癌和肠道癌细胞的CA 19-9(糖抗原19-9)；针对结直肠癌细胞的CEA；针对GIST(胃肠道间质瘤)细胞(以及骨髓和肥大细胞)的CD117(c-kit)；针对里德-斯泰伯格氏(Reed-Sternberg)细胞(以及Ki-1激活的T-细胞和B-细胞)的CD30；针对上皮癌细胞的上皮抗原(BER-EP4)、上皮膜抗原和上皮相关的抗原(MOC-31)；针对多种癌症细胞的上皮生长因子受体(HER1)；针对多种癌症细胞的血小板衍生的生长受体(PDGFR)α；针对黑素瘤细胞的黑素瘤相关的标志物/Mart 1/Melan-A；针对癌症干细胞群等的CD133；针对腺癌细胞的TAG72(肿瘤相关的gp72)。
细胞/细胞群恶性状态的标志物的其他实例包括：EpCAM、CD19、HER-2、HER-3、HER-4、PSMA、MUC-1(粘蛋白)、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、Lewis-Y、CD20、CD33、CD44v6、Wue-1、浆细胞抗原、(膜结合的)IgE、黑素瘤硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)、STEAP、间皮素、前列腺干细胞抗原(PSCA)、sTn(唾液酸化Tn抗原)、FAP(成纤维细胞活化抗原)、EGFRvIII、Igα、Igβ、MT-MMPs、Cora抗原、EphA2、L6和CO-29、CCR5、βHCG、神经节苷脂GD3、9-O-乙酰基-GD3、GM2、Globo H、岩藻糖基-GM1、聚SA、GD2、碳酸酐酶IX(MN/CA IX)、音猬因子(Sonic Hedgehog)(Shh)、CCR8、TNF-α前体、A33抗原、Ly-6、桥粒芯糖蛋白(desmoglein)4、E-钙粘蛋白新表位、胎儿乙酰胆碱受体、CD25、缪勒管(Muellerian)抑制物质(MIS)受体II型、内皮唾液酸蛋白(endosialin)、SAS、CD63、TF-抗原、CD7、CD22、Igα(CD79a)、Igβ(CD79b)、G250、gp100、F19-抗原和EphA2。
对某种细胞类型/细胞谱系或少数细胞类型/细胞谱系具有特异性的抗原(细胞类型标志物/细胞谱系标志物)的实例包括：针对造血细胞的CD45；针对上皮细胞、干细胞和基质细胞的CD34；针对骨髓细胞的CD33；针对浆细胞和上皮细胞的子集的CD138；针对上皮细胞、骨髓细胞和里德-斯泰伯格氏细胞的CD15；针对皮层胸腺细胞和朗格汉斯(Langerhans)细胞的CD1a；针对胸腺细胞、T-细胞和自然杀伤性(NK)细胞的CD2；针对T-细胞的CD3；针对T辅助细胞的CD4；针对T-细胞、B-细胞的子集和胸腺癌细胞的CD5；针对细胞毒性T-细胞的CD8；针对B-细胞的CD20；针对活化的B-细胞的CD23；针对上皮细胞的CD31；针对T-细胞、骨髓细胞、B-细胞的子集、组织细胞和浆细胞的CD43；针对NK细胞的CD56；针对神经内分泌细胞和NK细胞的CD57；针对巨噬细胞的CD68；针对B-细胞和浆细胞的CD79a；针对上皮细胞谱系的CD146；针对肺细胞的表面活性蛋白；针对神经内分泌细胞的突触泡蛋白、CD56或CD57；针对肌肉细胞的烟碱型乙酰胆碱受体或肌特异性激酶(MUSK)；针对肌肉细胞和神经元的电压门控钙通道(P/Q-型)或电压门控钾通道(VGKC)或N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA)；针对甲状腺的TSH(甲状腺刺激激素)受体；针对肌肉细胞的两性蛋白；针对肝细胞的HepPar-1；针对神经元细胞的神经节苷脂GQ1B、GD3或GM1；以及针对成红细胞性细胞谱系细胞的血型糖蛋白-A。
应该注意到，为了本发明的目的有这样的情况：依赖于具有比对目标细胞类型或细胞谱系的完美特异性更差的特异性的抗原可能是有利的。例如，当没有已知的仅见于目标细胞类型/细胞谱系上并且没有见于任何其他细胞类型/细胞谱系上的抗原的情况下，或者当不可能确认抗原的唯一特异性的情况下，还可以考虑目标细胞类型/细胞谱系外的其他一种或多种细胞类型/细胞谱系上存在的抗原。类似的考虑适用于针对细胞的恶性状态的标志物，甚至适用于两种抗原的组合的特异性。因此，例如存在这样的情况：即为了本发明的目的所选择的两种抗原的组合，不仅对目标细胞具有特异性，而且对于恶性细胞的一种或多种(几种)其他细胞类型/细胞谱系/种类具有特异性。
其次，本领域技术人员可通过直接进行实验来获得对某种癌症具有特异性的抗原组合。这可包括以下步骤：(1)确定待消除的肿瘤细胞上的表面抗原，和(2)从这些肿瘤细胞表面抗原中，鉴别出不同时存在于其他细胞类型上(或在某些实施方案中，仅存在于少数其他细胞类型上)的两种抗原。
通常，可能不需要进行实验来确定待消除的肿瘤细胞上的表面抗原，因为关于各种癌症的这类信息已经可以从印刷文献获得(参见，例如David J.Dabbs,Diagnostic immunohistochemistry,Churchill Livingstone,第3版(2010)；或F Lin和J Prichard,Handbook of PracticalImmunohistochemistry:Frequenaly Asked Questions,Springer,New York,第1版(2011))。甚至更广泛的信息可通过基于网络的资源来获得。例如，美国国家癌症研究所(NCI)的癌症基因组剖析计划(CGAP)已经系统地确定了各种正常细胞、癌症前期细胞和癌细胞的基因表达谱(Strausberg RL.The Cancer Genome Anatomy Project:building a new information andtechnology platform for cancer research.In:Molecular Pathology of EarlyCancer,1999,(Srivastava,S.,Henson,D.E.,Gazdar,A.,eds.IOS Press),pp.365-370)。由CGAP组织生成的资源可以免费获取(http://cgap.nci.nih.gov/)，且包括获取所有的CGAP数据和必要的分析工具。类似地，美国国家癌症研究所(NCI)的癌症基因组表征组织(Cancer Genome CharacterizationInitiative)(CGCI)主要致力于不同肿瘤所涉及的基因组变化的表征工具，例如基因组表征方法，包括使用第二代测序技术进行外显子组和转录组分析。CGCI生成的这些数据可通过可公开进入的数据库获取(http://cgap.nci.nih.gov/cgci.html)。因此，在很多情况下，关于在目标肿瘤细胞上是否存在各种已知的细胞表面蛋白的信息，可以通过简单地查询这些可公开进入的数据库来获得。如需要，可根据下文描述的方法，在第二步中通过肿瘤细胞/组织的免疫细胞化学/免疫组织化学分析来证实这些信息。
如果没有关于目标肿瘤细胞/组织表达的蛋白的可用信息，本领域技术人员可使用一组抗体通过免疫细胞化学/免疫组织化学方法来表征所述肿瘤细胞/组织上的抗原(参见，例如，"Handbook of PracticalImmunohistochemistry:Frequently Asked Questions"by F Lin and J Prichard,Springer New York,第1版(2011)；或"Using Antibodies:A LaboratoryManual"by E Harlow and D Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。简而言之，将组织学制剂或分离自肿瘤的细胞与针对可能的表面抗原的第一抗体一起孵育，经洗涤步骤以后，与针对第一抗体的Fc结构域的第二抗体一起孵育。用荧光团或酶如HRP(辣根过氧化物酶)标记该第二抗体，以便显现所靶向的抗原的表达。可用于细胞表面抗原的高通量抗原谱分析目的的抗体组可以从众多生产商商购。
此外，专门用于高通量蛋白质组细胞表征以鉴别和分析细胞表面蛋白表达的工具可商购获得，如Becton,Dickinson&Company的基于FACS(荧光激活的细胞分选)的高通量阵列技术BD FACSTMCAP(组合的抗体谱)。
以上描述的免疫细胞化学/免疫组织化学/蛋白质组分析之前可为肿瘤细胞的全基因组基因表达谱分析或目标肿瘤细胞/组织表达的蛋白的质谱分析(或，在某些情况下，由肿瘤细胞的全基因组基因表达谱分析或目标肿瘤细胞/组织表达的蛋白的质谱分析替代)。例如，可进行肿瘤细胞的全基因组基因表达谱分析以检测各种细胞表面分子的表达，然后可以通过如上所述的基于抗体的染色方法来确认肿瘤细胞细胞表面上这种抗原的存在。
关于表征(癌症)细胞的表面抗原的方法的其他信息可从相关的科学文献获得(例如，Zhou J,Belov L,Huang PY,Shin JS,Solomon MJ,ChapuisPH,Bokey L,Chan C,Clarke C,Clarke SJ,Christopherson RI.Surfaceantigen profiling of colorectal cancer using antibody microarrays withfluorescence multiplexing.J Immunol Methods.2010；355:40-51；或Carter P,Smith L,Ryan M.Identification and validation of cell surface antigens forantibody targeting in oncology.Endocr Relat Cancer.2004；11:659-87)。
在下一步骤中，本领域技术人员可从肿瘤细胞的细胞表面抗原中鉴别没有在其他细胞类型上同时表达的两种抗原的组合。
通常，文献或可公开获得的数据库可以提供关于是否存在来自其他细胞类型的抗原的详细信息：
在不同细胞类型上的各种细胞表面分子的表达，在过去几十年中已经由研究人员通过身体的几乎任何细胞类型的免疫表型分析和基因表达谱分析进行了系统的研究。例如，关于360多种抗原“分化簇”(或CD抗原)的表达的详细信息可从印刷文献(例如，"Leukocyte and Stromal CellMolecules:The CD Markers"by Zola H,Swart B,Nicholson I,and Voss E；John Wiley&Sons,第1版(2007))和在线的存储库(例如，www.hcdm.org/MoleculeInformation/tabid/54/Default.aspx)中获得，且包括关于组织分布和抗原表达水平的信息，以及关于抗原反应性抗体和这些抗体所结合的表位的信息。
此外，还有可公开获得的提供由科学界产生的大量基因组数据的数据库。例如，美国国家生物技术信息中心(NCBI)的基因表达汇编(GEO)平台(Barrett T et al.,NCBI GEO:archive for functional genomics datasets--10 years on.Nucleic Acids Res.2011；39(Database issue):D1005-10)保存并允许获取微阵列、新一代测序以及其他形式的高通量功能基因组数据的庞大集合，并进一步提供便于获取这些信息的基于网络的界面和应用(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。
一旦通过这些资源鉴别了除了目标肿瘤细胞外不存在于其他细胞类型的一对(两种)抗原，本领域技术人员可容易地证明该抗原组合用于进一步研制P1和P2-多肽构建体的适用性。这种证明，即鉴别出的两种抗原的组合确实没有同时表达于除了目标肿瘤细胞外的其他细胞类型上，可通过用针对这两种抗原的抗体分选的细胞类型和/或组织(最好为大的)集合的免疫组织化学/免疫细胞化学分析来进行。任何种类的细胞和组织可获自ATCC(美国典型培养物保藏中心)、病理科和与大学和研究所有关的组织库。合适的抗原组合被定义为仅染色肿瘤细胞而非健康组织或健康细胞的一对抗体(即，成对的两种抗体均染色肿瘤细胞，而没有其他组织/细胞被这两种抗体染色)。
应该注意到，尽管在很多情况下当然期望的是最高程度的特异性(优选绝对的特异性)，还有的情况下更低程度的特异性也是可接受的。例如，如果该组多肽是用于诊断目的，与其他细胞类型或组织一定程度的交叉反应性也是可接受的(尤其是在实体瘤的情况下，因为其他位置信息会有助于将肿瘤细胞与交叉反应的细胞区分开来)。此外，如该组多肽是用于治疗目的，与其他细胞类型或组织一定程度的交叉反应性也是可接受的，这取决于所治疗患者的疾病的严重程度和该交叉反应性对细胞类型/组织的影响。更低程度的特异性为可接受的其他情况可能会在移植设置的情形下出现(参见下文)。
在从文献或公共数据库没法获得有关合适抗原组合的提示的情况下，可通过直接进行实验来检测与其他细胞类型相比，肿瘤细胞的细胞表面抗原是否存在。为此，可从以上所述来源获得的各种细胞类型和/或组织，可进行蛋白质组的细胞表征、免疫细胞化学/免疫组织化学分析和/或基因表达谱分析。(应该注意到，这种非-肿瘤细胞/组织的分析仅可进行一次，以便获得可用于设计本发明的各种构建体的数据，该构建体可适用于多种不同的治疗或诊断情况)。将获得的结果与关于目标肿瘤细胞细胞表面抗原的信息比较后，就可以容易地鉴别出不存在于除了目标肿瘤细胞以外的任何其他细胞上的两种抗原的组合。
鉴别对肿瘤细胞具有特异性的一对(两种)抗原的类似系统性方法还描述于Balagurunathan的近期出版物中，其依靠全基因组基因表达谱分析，然后进行免疫组织化学(Yoganand Balagurunathan,Gene expressionprofiling-based identification of cell-surface targets for developing multimericligands in pancreatic cancer.Mol Cancer Ther 2008；7.3071-3080)。该文稿的作者使用DNA微阵列，产生了大量胰腺癌样本和正常组织样品的mRNA基因表达谱的数据库。通过基于多变量规则的计算方法分析了编码细胞-表面分子的基因的表达数据，以便确定优先在肿瘤细胞而非正常组织上表达的基因组合。然后采用标准的免疫组织化学技术在胰腺肿瘤组织和正常组织微阵列上确认构成肿瘤特异性抗原组合的抗原的异常共表达。
鉴别并证明了对目标肿瘤细胞具有特异性的这种抗原组合后，可通过标准的蛋白质工程技术和分子生物学方法来改造多肽P1和多肽P2的构建体(参见，例如G Howard and M Kaser,Making and Using Antibodies:APractical Handbook,CRC Press,第1版(2006)；Sambrook et al.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork(2001))。
对于多种细胞表面分子，已经表征了特异性的单克隆抗体因而可便利地获得。因此，在很多情况下，本领域技术人员可以获取对已鉴别的抗原组合的抗原具有特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞。具有从对给定抗原具有特异性的一组抗体中进行挑选的选择权后,本领域技术人员可挑选能结合靠近细胞膜的表位的反应性抗体，以便使表达该抗原的细胞与效应细胞之间的距离最小化(Bluemel C,Hausmann S,Fluhr P,Sriskandarajah M,Stallcup WB,Baeuerle PA,Kufer P.Epitope distance tothe target cell membrane and antigen size determine the potency of Tcell-mediated lysis by BiTE antibodies specific for a large melanoma surfaceantigen.Cancer Immunol Immunother.2010 Aug；59(8):1197-209)。如果无法获得针对已鉴别的抗原组合中一种或两种抗原的这类抗体，可通过标准技术来产生针对所述抗原的单克隆抗体(例如G Howard and M Kaser,Making and Using Antibodies:A Practical Handbook,CRC Press,第1版(2006))。此外，多个公司提供产生定制型单克隆抗体和杂交瘤细胞的全套服务。
编码目标单克隆抗体的可变结构域的DNA或mRNA，可通过PCR扩增或克隆从杂交瘤获得(Orlandi R,Gussow PT,Jones:Cloningimmunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chainreaction.Proc Natl Acad Sci U S A 1989,86(10):3833-3837；Wang Z,RaifuM,Howard M,Smith L,Hansen D,Goldsby R,Ratner D:Universal PCRamplification of mouse immunoglobulin gene variable regions:the design ofdegenerate primers and an assessment of the effect of DNA polymerase 3'to5'exonuclease activity.J Immunol Methods 2000,233(1–2):167-177；EssonoS,Frobert Y,Grassi J,Cremino C,Boquet D:A general method allowing thedesign of oligonucleotide primers to amplify the variable regions fromimmunoglobulin cDNA.J Immunol Methods 2003,279:251-266；G Howardand M Kaser,Making and Using Antibodies:A Practical Handbook,CRCPress,第1版(2006))，或者从已经建立的包含各种抗体的可变片段DNA序列的载体获得。通常，该序列可获自保存众多序列的公共数据库，然后该构建体甚至可通过基因合成来产生，因为多种商业服务供应商会提供该服务(例如，Creative Biolabs,Shirley,USA)。
为了形成多肽P1的构建体，将编码对已鉴别的一对抗原的第一抗原具有特异性的抗体的可变片段Fv的序列(或者，任选地，源自该序列的单链可变片段序列)用于第一靶向部分(T1)，并通过合适的接头(例如，编码小于12 aa)将其连接至编码功能结构域的第一片段F1(例如，抗CD3抗体的VL结构域)的序列。同样，为了形成多肽P2的构建体，将编码对已鉴别的一对抗原的第二抗原具有特异性的抗体的可变片段Fv的序列(或者，任选地，源自该序列的单链可变片段序列)用于第二靶向部分(T2)，并通过合适的接头将其连接至编码该功能结构域的第二片段F2(例如，抗CD3抗体的VH结构域)的序列。
对于本发明的多肽P1或P2任何构建体，包括了对构建体或用于形成构建体的序列的修饰，以便该构建体适用于具体需要。例如，可以降低或废除其针对人的免疫原性的方式来修饰构建体。当序列源自非-人亲本抗体如鼠抗体的情况下，可对该序列进行导致在人体中具有降低的免疫原性而保留或基本上保留亲本抗体的抗原-结合特性的修饰(本领域技术人员称其为“人源化”抗体/构建体)。
为了适应本申请描述的实施方案和变型，对上述方案和改编的各种修改对本领域技术人员来说是明显的。
除了针对靶向部分T1和T2所特异性结合的抗原的变异，还可能有多种其他的修饰。例如，也可使用其他种类的单价抗体或抗体样结构，以代替单链可变片段(scFv)作为靶向部分T1和/或T2。例如，可使用源自美洲驼、骆驼或鲨鱼抗体的抗体/抗体样结构。因为美洲驼、骆驼和鲨鱼的抗体具有由单个结构域(而非VH和VL链)构建的抗原结合部分，所得到的多肽P1或P2更小，并因此可以更好地渗入至肿瘤组织。
而且，由于很多肿瘤相关的抗原是细胞表面-结合受体，靶向部分T1和/或T2的单链Fv可用这种细胞表面-结合受体的天然或人工配体来代替。与抗体一样，这些天然或人工配体赋予了对靶受体的优异特异性。可选择地，所述靶向部分T1和/或T2可为适体。
此外，为了提高靶向部分对抗原的结合亲和力，所述靶向部分可通过糖基化或其他类型的翻译后修饰或化学修饰进行多聚化和/或修改，或者通过定点诱变或噬菌体展示筛选方法进行优化。
此外，所述片段F1和F2(即，在以上描述的示例性实施方案中的抗CD3Fv的VL和VH片段)可用不同功能结构域F的片段来代替，从而通过两个片段的互补来产生不同的生物效果。通过使用抗CD56、抗CD1a或抗CD16a的片段，可募集和激活自然杀伤性细胞。通过使用抗CD16的片段，可募集和激活自然杀伤性细胞、中性多形核白细胞、单核细胞和巨噬细胞。通过使用抗CD32a、抗CD32b、抗CD89、抗CD16a或抗CD64的片段，可募集和激活巨噬细胞。通过使用抗CD32a、抗CD32b、抗CD64或抗CD89的片段，可募集和激活单核细胞。通过使用抗CD16b、抗CD89、抗CD32a、抗CD32b或抗CD64的片段，可募集和激活粒细胞。此外，替代抗CD3，也可通过使用抗CD2、抗CD5、抗CD28或抗TCR(T细胞受体)的片段来募集和激活T细胞。关于通过抗体结合来募集和激活效应细胞的其他信息或其他选择，可从公开的文献获得，例如Kontermann(编者)的"BispecificAntibodies",Roland E.,Springer Berlin Heidelberg；第1版(2011)。
另一个选择是，使用具有功能结构域F的片段F1和F2的一组多肽P1和P2，通过两个片段的互补所述功能结构域F能结合效应细胞上的抗原，但其中结合效应细胞的所述抗原没有导致所述效应细胞的激活。然后将该组多肽("第一组多肽")与具有功能结构域F的片段的第二组多肽组合使用(例如给予患者)，互补后，所述功能结构域F能结合相同效应细胞上的第二种不同的抗原,但其中再次结合效应细胞的所述抗原也没有导致所述效应细胞的激活。所述第一组多肽和第二组多肽所结合的抗原是以这样的方式挑选出来的：当仅仅结合效应细胞上两个抗原之一时没有导致所述效应细胞的激活，而同时结合效应细胞上的两个抗原时导致所述效应细胞的激活。这具有以下优势：(1)可以使用效应细胞上的抗原，其不单独发挥作用而是需要共同刺激第二抗原，和(2)不同抗原(其指示将某种细胞(如癌症细胞)与其他细胞区分开来的特异性)的数目可从两种(如果第一组多肽和第二组多肽分别具有相同的靶向部分T1和T2)增加至多达4种不同的抗原(如果第一组多肽和第二组多肽没有共同的靶向部分)。
使用具有不同靶向部分但相同的功能结构域的两组多肽可以实现类似效果：这些多肽的组被设计为具有针对效应细胞抗原的功能结构域，其正常下允许每组多肽本身激活效应细胞。然而，这两组多肽的使用浓度低至不足以导致有效激活效应细胞。如果这两组多肽同时存在(例如同时给予患者)，每组多肽本身(由于其低浓度)不能激活效应细胞，而这两组多肽的组合能激活效应细胞(由于这两组多肽协同作用的效果，因而两组多肽产生的总效果足以激活效应细胞)。
作为效应细胞募集/激活的另一个选择，可采用“预靶向(pretargeting)”法，因为其已经针对双特异抗体构建体得以良好建立(Cancer Imaging andTherapy with Bispecific Antibody Pretargeting.Goldenberg DM,Chatal JF,Barbet J,Boerman O,Sharkey RM.Update Cancer Ther.2007Mar；2(1):19-31)。为此，F1和F2被对抗原、载体分子(即，没有被给予该组多肽的患者的免疫系统识别为外来物的分子/分子的一部分，或者对给予该组多肽的患者不引起或仅引起很弱的免疫反应的分子)或亲和标签具有特异性的抗体的VH和VL片段取代。在给予多肽P1和P2之后(同时)，给予与所述抗原、载体分子或亲和标签偶联的治疗或诊断化合物。只有在其表面携带抗原A1和A2两种抗原的细胞被多肽P1和多肽P2二者所结合。因此，仅在这些细胞上的功能互补作用使得产生了能够通过所述抗原、载体分子或亲和标签募集治疗或诊断化合物的结合位点。该方法允许联合治疗化合物如毒素或放射性物质或诊断化合物的精确给药和定量给药来专门地针对靶细胞，而不表达所述抗原或仅表达所述抗原之一的细胞不受影响。
合适的载体分子可为例如肽或碳水化合物分子。优选地，所述载体分子可为明胶、葡聚糖或羟乙基淀粉，其为常用的代谢惰性的血浆扩容剂，如果其以足够少的量存在于血液中可通过肾脏来排除。可选择地，所述载体分子可为菊粉，其为临床测定肾小球清除所常规使用的代谢惰性分子(此外，存在特异性识别菊粉的抗体)。
合适的亲和标签可为例如Flag-标签、myc-标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-标签、血球凝集素(HA)-标签、多组氨酸(His)-标签或麦芽糖结合蛋白(MBP)-标签、洋地黄毒苷(DIG)-标签。
偶联至抗原、载体分子或亲和标签的治疗化合物可为例如放射性化合物或毒素。
合适的放射性化合物为例如含有90Y、177Lu、131I、32P、10B或213Bi的化合物。将与放射性化合物连接的抗原、载体分子或亲和标签募集至表达第一抗原和第二抗原二者的细胞，引起放射性积累在肿瘤位点，导致特异性破坏肿瘤细胞/组织。
可选择地，偶联至抗原、载体分子或亲和标签的治疗化合物可为例如毒性化合物，其在没有预先结合细胞表面的情况下不能穿过细胞膜。
该先决条件是通过经典的AB-毒素的A组分来实现的，AB-毒素源自多种病原细菌如产气荚膜梭菌、肉毒杆菌、艰难梭菌、炭疽芽孢杆菌等。AB-毒素是干扰细胞内部功能的双组分蛋白复合体。A组分是“活性”组分(即，其通过透过细胞膜来杀死细胞)，但其本身不能穿过细胞膜。B组分是“结合”组分，其本身是非毒性的，但对于A组分的吸收及其透过细胞膜是必要的。
例如，炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)是经典的毒素B组分，其介导实际的炭疽杆菌外毒素水肿因子和致死因子(LF)的吸收。没有PA-组分的LF是非毒性的，因为LF本身不穿透细胞膜从而不能发挥其致病能力(PezardC,Berche P,Mock M."Contribution of individual toxin components tovirulence of Bacillus anthracis"1991 Infect.Immun.59(10):3472)。然而，当LF结合细胞表面分子，其被内化且对细胞具有很高的毒性。
一旦多肽P1和P2二聚化，则重构了功能结构域F的功能。通过重构的功能结构域与所述偶联至毒素的抗原、载体分子或亲和标签的相互作用，所述毒素被募集至靶细胞的细胞膜，并入细胞内并杀死该细胞。
本领域技术人员很容易将该原理适用于本发明的目的，因为其已经被广泛用于所谓的免疫毒素，其中靶向部分，多数为抗体样结构域或天然配体，被偶联至毒素组分(参见，例如，Immunotoxins for targetedcancer therapy.Kreitman RJ,AAPS J.2006 Aug 18；8(3):E532-51)。实例包括基于白喉毒素(如Denileukin diftitox(美国商标名Ontak)，其被FDA批准用于治疗一些T细胞淋巴瘤)或基于炭疽芽孢杆菌的致死因子(Pastan I,Hassan R,FitzGerald DJ,Kreitman RJ(2007)."Immunotoxin treatment ofcancer".Annu.Rev.Med.58:221–37)的免疫毒素。
合适的AB-毒素A组分可为例如，炭疽芽孢杆菌水肿因子、炭疽芽孢杆菌致死因子、产气荚膜梭菌微小毒素、肉毒杆菌C2毒素、艰难梭菌ADP-核糖基转移酶、白喉棒状杆菌白喉毒素片段A。
可选择地，治疗化合物可为例如细胞毒性化合物，其在进入细胞后具有毒性且在没有预先结合细胞表面时本身能够穿过细胞膜。在这种情况下，挑选出治疗化合物所偶联的抗原、载体分子或亲和标签，以便在所得的缀合物没有预先结合细胞表面的情况下阻止所述缀合物(即，连接至所述抗原/载体分子/亲和标签的治疗化合物)穿过细胞膜进入细胞(合适的载体分子可为例如羟乙基淀粉载体)。因此，这样的缀合物在没有预先结合其细胞表面时不进入细胞；然而，一旦该缀合物结合至细胞表面，其被内化至细胞中且该毒性化合物杀死该细胞。除非在本发明该组多肽存在下，所述缀合物被募集至在其表面同时表达抗原A1和A2的细胞，否则该缀合物不结合细胞。此类细胞结合并募集多肽P1和P2，且重构的功能结构域特异性结合并募集抗原/载体分子/亲和标签，其转而导致治疗化合物的内化。因此，实现了特异性杀死其细胞表面携带抗原A1和A2的细胞。可用于本文的毒性化合物包括，例如奥里斯他汀(auristatin)、蓖麻毒素、皂苷、异株泻根毒蛋白(Bryodin)1、Bouganin、白树毒素、美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)、抗叶酸剂、长春花碱、蒽环类、卡里奇霉素、核糖核酸酶、相思豆毒素、蒴莲根毒素或李斯特菌溶胞素O。
偶联至抗原、载体分子或亲和标签的诊断化合物可为例如，放射性化合物、荧光团或能够介导生物发光的化合物。
合适的放射性化合物为例如，含有99mTc、111In、82Rb或201Tl的化合物。这类化合物在临床上通过熟知的医学成像过程来检测。
可选择地，荧光化合物可用作诊断化合物，如GFP(绿色荧光蛋白)或GFP变体(例如BFP(蓝色荧光蛋白)、CFP(蓝色荧光蛋白)或YFP(黄色荧光蛋白))，或荧光小分子化合物如FITC(异硫氰酸荧光素)或PE(藻红蛋白)，Alexa Fluor染料(如Molecular Probes公司出售的AlexaFluor488和相关染料)或花菁染料(如Cy3(吲哚碳菁染料)或Cy5(吲哚双碳菁染料)或相关染料)。
可选择地，能够介导生物发光的化合物可用作诊断化合物，如荧光素酶例如Gaussia荧光素酶(Chopra A.Gaussia princeps luciferase.In:Molecular Imaging and Contrast Agent Database(MICAD)[在线数据库].Bethesda(MD):National Library of Medicine(US),NCBI；2004-2012.可获自:http://micad.nih.gov.)。将Gaussia荧光素酶用于体内成像已被良好地确立(参见，例如，Santos EB et al.Sensitive in vivo imaging of T cells using amembrane-bound Gaussia princeps luciferase.Nat Med.2009Mar；15(3):338-44.Epub 2009 Feb 15；或Inoue Y et al.Gaussia luciferasefor bioluminescence tumor monitoring in comparison with firefly luciferase.Mol Imaging.2011 Oct 1；10(5):377-85.doi:10.2310/7290.2010.00057.Epub2011 Apr 26；还可参见下文的其他详情)。
此外，片段F1和F2(即以上描述的示例性实施方案中的抗CD3 Fv的VL和VH片段)可用对治疗或诊断化合物具有特异性的抗体的VL和VH片段替代(即在这种情况下，功能结构域F能直接结合所述治疗或诊断化合物)。本发明还可包括在“预靶向”法背景下所述的相同治疗和诊断化合物。
而且，片段F1和F2(即以上描述的示例性实施方案中的抗CD3 Fv的VL和VH片段)可用荧光或生物发光化合物的片段替代，所述片段本身没有生物活性，但通过两个片段的结合和功能互补作用重获其功能(即其介导荧光或生物发光的能力)，因而允许特异性鉴别携带抗原A1和A2的细胞。
很多可用于本文的荧光分子为众所周知的且在本领域中已被表征，其包括但不限于，GFP(绿色荧光蛋白)、GFP衍生物(如YFP(黄色荧光蛋白)和CFP(蓝色荧光蛋白)、Venus(Nagai T et al.,A variant of yellowfluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biologicalapplications.Nat Biotechnol.2002 Jan；20(1):87-90)或Cerulean(具有S72A、Y145A和H148D取代的增强的CFP))。对于这些分子，分开的片段被描述为在称为双分子荧光互补(BiFC)的方法中于紧密接近的情况下自组装。
例如，GFP、CFP、Venus、具有M153T取代的Venus或Cerulean可在氨基酸155后分开(即例如，片段F1可包含GFP的氨基酸1-155，而片段F2可包含GFP的氨基酸156-245，或相反)。可选择地，YFP或Venus可在氨基酸173后分开。关于分开的GFP和分开的GFP变体的其他详情，可参见，Kerppola TK.,Visualization of molecular interactions using bimolecularfluorescence complementation analysis:characteristics of protein fragmentcomplementation.Chem Soc Rev.2009；38:2876-86。
介导生物发光并能用于本文中的分子的实例为分开的荧光素酶。尤其合适的为Gaussia princeps的荧光素酶，其无需辅因子即有活性并在发蓝光的反应中催化底物腔肠动物荧光素(腔肠素)的氧化；或者Gaussia荧光素酶的衍生物(Remy I and Michnick S,A highly sensitive protein-proteininteraction assay based on Gaussia luciferase.Nature Methods-3,977-979(2006))。例如，片段F1可包含从Gaussia荧光素酶的N-末端至Gly-93的片段，而片段F2可包含从Glu-94至Gaussia荧光素酶的C-末端的片段，或者相反(详情参见，Remy I and Michnick S,Nature Methods,2006)。Gaussia分开的荧光素酶系统的体内应用已被确立(Luker et al.,In vivo imaging ofligand receptor binding with Gaussia luciferase complementation.NatureMedicine 2011,doi:10.1038/nm.2590)，从而允许本领域技术人员将其直接应用于本发明的目的。
在癌细胞渗入组织且完全清除所有转化的细胞是治愈的先决条件的情况下，肿瘤病灶的活体内成像尤其重要。在手术位点寻找散布的癌细胞的外科医生可使用融合至靶向部分的分开的GFP或分开的GFP衍生物和激光辅助的荧光照相系统，来检测异常表达所针对的抗原谱的细胞，类似于在一些临床设置中已经开发的荧光或生物发光的手术应用(vanDam GM et al.,Intraoperative tumor-specific fluorescence imaging in ovariancancer by folate receptor-α targeting:first in-human results.Nat Med.2011Sep 18；17(10):1315-9；Luker et al.,In vivo imaging of ligand receptor bindingwith Gaussia luciferase complementation.Nature Medicine 2011,doi:10.1038/nm.2590)。
为了检测互补的分开的荧光素酶，必须应用荧光素酶的底物，其可为荧光素或腔肠素。优选腔肠素，因为腔肠素不依赖于ATP而发光，且已成熟地应用于体内成像和体内应用。在用多肽P1和P2标记肿瘤并静脉注射非毒性量的腔肠素以后，外科医生能看到癌细胞。
在另一个示例性实施方案中，本发明的原理被应用于患有血液肿瘤并接受从别人(捐献者)移植的健康造血细胞的患者情况。在本文中，本发明的该组多肽可用于在移植了来自捐献者的健康造血细胞后，特异性清除(或检测)接受者中残余的恶性造血细胞。
为了破坏患有血液肿瘤的患者的恶性造血细胞，患者可接受化疗和/或放疗。随后，患者接受来自捐献者的健康造血细胞的移植。
为使移植排斥或移植物抗宿主病的风险最小化，通常优选移植来自具有相同的MHC(主要组织相容性复合体)分子组的捐献者的组织/细胞(例如骨髓)。然而，通常不能鉴别出具有相同的MHC分子组的捐献者(“HLA-相同的捐献者”)。因此，在MHC变体组中具有一个或两个不匹配的移植物、具有多达3个不匹配的不相关脐带血或单倍体相同的移植的使用越来越多。因此，普遍的是，在接受者的细胞和捐献者的细胞所表达的MHC分子组之间存在至少一个区别性差异。
在根据本发明的示例性实施方案进行的移植中，所用的捐献者细胞在其HLA变体至少一种上不同于接受者细胞。这意味着接受者细胞的细胞表面上而非捐献者细胞的细胞表面上，存在至少一种“区别抗原”。例如，如果患者(即接受者)为HLA-A2阳性而捐献者为HLA-A2阴性，该区别抗原可为HLA-A2。
尽管进行化疗/放疗，接受者的个别恶性造血细胞可能已经逃脱了清除。由于存活的恶性造血细胞为接受者细胞，它们携带将接受者细胞与捐献者细胞区分开的区别抗原。同时，它们是造血谱系来源的细胞，因而其细胞表面具有该细胞谱系的标志物，如CD45。患者的白血病原始细胞和其他造血细胞是唯一同时展示该区别抗原(此处为HLA-A2)和造血细胞谱系标志物(此处为CD45)的细胞。本发明的该组多肽利用这个事实来特异性消除这些细胞。
为此，第一多肽P1的第一靶向部分T1可为对仅存在于接受者细胞上的区别抗原(此处为HLA-A2)具有特异性的scFv。作为功能结构域F的片段F1，可选择CD3ε-特异性抗体的轻链可变区(VL)。第二多肽P2的第二靶向部分T2可为对CD45具有特异性的单链可变片段(scFv)。作为功能结构域F的片段F2，可选择所述CD3ε-特异性抗体的重链可变区(VH)。(自然地，同样可能使用CD3ε-特异性抗体的重链可变区(VH)作为片段F1，以及使用CD3ε-特异性抗体的轻链可变区(VL)作为片段F2。本领域技术人员显而易见的是，这是个普遍的原理，且其通常能转换用于片段F1和片段F2的片段)。在没有VH的情况下CD3ε-特异性抗体VL不能衔接CD3ε，同样在没有VL的情况下CD3ε-特异性抗体VH也不能衔接CD3ε。因此，P1和P2本身均不能结合CD3ε。
然而，如果区别抗原(例如HLA-A2)和CD45抗原均出现在一个单细胞上，多肽P1和P2结合其各自的抗原使得它们紧密接近。结果，不成对的VH和VL结构域组装导致多肽P1和P2的异源二聚化，并由VH和VL结构域形成能结合CD3ε的功能性可变抗体片段Fv(参见图2)。
结果，通过CD3ε而募集和激活T细胞，且其细胞表面携带HLA-A2和CD45的细胞通过细胞毒性T细胞反应被特异性清除。
本领域技术人员理解，在本发明的原理之内可能存在所述示例性实施方案的不同变型。
例如，在多肽P2中，识别造血细胞谱系标志物CD45的scFv片段可被识别不同细胞谱系或细胞类型的标志物的scFv片段代替，即靶向部分T2可为这样的结构域：其特异性结合对造血细胞谱系外的细胞谱系或某个细胞类型具有特异性的抗原(对于详细列举的可用于本文的各种细胞谱系标志物和细胞类型标志物，参见David J.Dabbs,Diagnosticimmunohistochemistry,Churchill Livingstone,3rd edition(2010)；或F Linand J Prichard,Handbook of Practical Immunohistochemistry:FrequentlyAsked Questions,Springer,New York,第1版(2011))。为使该组多肽适用于替代性的细胞谱系标志物/细胞类型标志物，用对期望的替代性细胞谱系标志物/细胞类型标志物具有结合特异性的靶向部分代替多肽P2的靶向部分T2就足够了。
例如，在转移性肾细胞癌(RCC)的情况下，本领域技术人员可查询以上引用的数据库中关于肾细胞受限表达的细胞表面蛋白的信息。在很多其他分子中，本领域技术人员应了解到水通道蛋白家族某些成员的表达限于肾细胞和红细胞。获取该信息后，本领域技术人员将构建融合至CD3ε-特异性抗体的重链可变区(VH)、识别限于肾细胞和红细胞的水通道蛋白家族成员的多肽P2。在肾细胞癌患者为HLA A2阳性，来自健康捐献者的肾移植物为HLA A2阴性的情况下，治疗患者的临床医生可利用两种构建体(融合至抗-CD3(VH)的抗-水通道蛋白和融合至所述CD3ε-特异性抗体轻链(VL)的抗-HLA A2)。在这种情况下，同时表达所述水通道蛋白和HLA A2的所有细胞将被标记为用于T细胞裂解，其为肾细胞癌细胞和转移性组织。健康捐献者捐献的肾细胞为HLA A2阴性，并且不会受到攻击。由于红细胞在个体发育过程中失去了HLA表达，因此其表面不携带HLA分子，尽管表达了大量水通道蛋白其仍将得以幸免。同样，针对水通道蛋白的常规的非互补双特异抗体将介导杀死来自捐献者和接受者的所有肾细胞和红细胞。在HLA A2阳性患者中，针对HLA A2的双特异抗体很可能是致命的，因为除红细胞外的每个接受者细胞均表达HLA A2并且会受到重定向的T细胞的攻击。
另一个实例是肝细胞癌(HCC)。肝细胞与很多代谢过程包括脂蛋白转运密切相关。为此，肝细胞在其表面表达高密度脂蛋白(HDL)的受体(清道夫受体B类成员1,SCARB1)。通过多肽P2构建体(其包含融合至所述CD3ε-特异性抗体重链可变区(VH)的针对SCARB1的scFv结构域)和多肽P1(融合至所述CD3ε-特异性抗体轻链(VL)的抗-HLA A2 scFv)以及移植来自健康的HLA A2阴性捐献者的肝细胞，可实现患有HCC的HLA A2阳性患者(其在肿瘤细胞和转移肿瘤的表面上表达SCARB1)的治疗。在这种情况下，表达SCARB1和HLA A2的所有肝细胞和肝细胞衍生的恶性细胞将被标记为用于T淋巴细胞裂解。缺乏HLA A2的捐献者肝细胞以及表达HLA A2的正常SCARB1阴性捐献者细胞将得以幸免。由于参与肾上腺中类固醇合成的细胞也有SCARB1表达的报道，这些细胞很可能也会被重定向的T细胞破坏而导致艾迪生氏症(Addison’s disease)。
对某些细胞类型或细胞谱系或少数细胞类型/谱系具有特异性的各种标志物为已知的(参见上文列举的实例)。关于谱系标志物、差异化的抗原和组织标志物及其组织分布的更多信息，可从公开的来源便利地获取(参见，例如David J.Dabbs,Diagnostic immunohistochemistry,ChurchillLivingstone,3rd edition(2010)；或F Lin and J Prichard,Handbook ofPractical Immunohistochemistry:Frequently Asked Questions,Springer,NewYork,第1版(2011))和公共数据库(如欧洲生物信息研究所(EBI)的基因表达谱图库，http://www.ebi.ac.uk/gxa/；或基因表达汇编(GEO)平台，参见上文)。此外，本领域技术人员采用如上所述的鉴别抗原的肿瘤特异性组合的类似方法，可直接鉴别和/或证实这类标志物。
在某些优选的实施方案中，使用了具有比对某种细胞类型或细胞谱系的完美特异性更差的特异性的抗原(即，采用存在于超过一种但优选仅几种细胞类型或细胞谱系上的抗原)。在某些实施方案中，使用了在所述细胞类型/细胞谱系中以相比其他细胞类型/细胞谱系更高的比率或以更高的比例或量表达的抗原，在某种程度上，可能在其他细胞类型/细胞谱系中也存在所述抗原的少量但可检测的表达。
这一概念还可适用于除以上示例性实施方案中所用的HLA-A2以外的任何其他HLA单体型，只要接受者细胞对于该HLA抗原为阳性，而捐献者细胞对其为阴性即可。可能的HLA抗原包括HLA A1、HLA A2、HLA A3、HLA A25、HLA B7、HLA B8、HLA B35、HLA B44和HLACw3、HLA Cw4、HLA Cw6、HLA Cw7等。为使该组多肽适用于替代性HLA抗原，用对期望的替代性HLA抗原具有结合特异性的靶向部分替代多肽P1的靶向部分T1就足够了。通过恰当地选择靶向部分T1，当然也可能特异性消除捐献者细胞。
此外，并非是VL结构域和VH结构域组装后形成能够结合CD3ε的结构域(即分别为多肽P1和P2的片段F1和片段F2)，而是可用组装后赋予所得的二聚体不同功能的结构域/片段来替代VL结构域和VH结构域。就此而言，涉及通过两种细胞表面抗原的特定组合鉴别的肿瘤细胞的消除/检测的上述示例性实施方案的所有变型均同样适用。例如，组装后，互补的功能结构域可介导除T细胞以外的其他效应细胞的结合/激活，可适用于“预靶向”法，可结合治疗或诊断化合物，或可形成荧光分子/能介导生物发光的分子。
当然本发明还可包括，在涉及应用本发明原理特异性清除肿瘤细胞的示例性实施方案中，选择片段F1和F2以及选择靶向部分T1或T2的多样化选择。
从上述示例性实施方案及其变型中，本领域技术人员应清楚地理解，上述本发明的原理不仅可用于高度特异性鉴别/消除肿瘤细胞或细胞移植后残余的恶性接受者细胞，也可用于鉴别/消除携带两种抗原的特定组合的任何其他细胞类型，所述组合能将该细胞类型区别于其他类型细胞)。
在下文中，参考以下附图：
图1显示了本发明的原理。图1A：抗原以及多肽P1和P2的设计。图1B:如果细胞在其细胞表面表达抗原1和2二者，则多肽P1和多肽P2同时结合该细胞的表面使得P1和P2紧密接近，导致片段F1和F2结合并通过互补恢复结构域F的生物功能。如果仅抗原A1(图1C)或抗原A2(图1D)存在于该细胞表面，则不能恢复生物功能。
图2显示了在具有不匹配HLA抗原的血液肿瘤的同种异体移植情形中的本发明示例性实施方案。在这种情况下，接受者HLA单体型(HLA患者)和造血谱系来源(CD45)的双重信息仅展示于患者的白血病原始细胞和其他造血细胞。第一多肽P1包含与抗CD3的VL片段(片段F1)融合的针对患者HLA的单链可变片段抗体构建体(靶向部分T1)。第二多肽P2包含与抗CD3Fv的VH分开-片段(片段F2)融合的对造血谱系标志物CD45具有特异性的单链可变片段构建体(靶向部分T2)。
CD45：对造血细胞具有特异性的抗原。HLA患者：对患者细胞具有特异性的HLA-抗原，即存在于患者细胞(＝细胞移植接受者的细胞)表面上但不存在于捐献者细胞表面上的人MHC的等位基因变体。αCD45 scFv：对CD45具有结合特异性的scFv。αHLA患者scFv：对HLA患者具有结合特异性的scFV。CD3(VH)：对CD3具有结合特异性的抗体的免疫球蛋白重链可变区。CD3(VL)：对CD3具有结合特异性的抗体的免疫球蛋白轻链可变区。
当两个构建体分别通过其αCD45 scFv和αHLA患者scFv结合至携带CD45和HLA患者抗原的细胞后，CD3(VH)和CD3(VL)的组装导致了对CD3具有结合特异性的抗体的功能互补，从而允许通过其细胞表面的CD3分子来特异性募集和激活T细胞。
图3显示了用于图4-9描述的实验中的构建体。(构建体85与构建体71的不同在于，构建体85具有Flag标签而构建体71具有myc标签。构建体75与构建体82的不同在于，构建体75具有Flag标签，而构建体82具有myc标签。)VHCD3：抗-CD3抗体的重链可变区；VLCD3：抗-CD3抗体的轻链可变区；VHA2：抗-HLA-A2抗体的重链可变区；VLA2：抗-HLA-A2抗体的轻链可变区；VL45：抗-CD45抗体的轻链可变区；VH45：抗-CD45抗体的重链可变区；L18、L7、L15、L6、L19：分别为18、7、15、6、19个氨基酸的接头。
图4显示了用于控制分析系统的常规串联双特异单链scFv构建体。简而言之，如图所示，将对CD3和HLA A2具有特异性的双特异抗体构建体滴定至U266、HLA A2阳性、CD45阳性骨髓瘤细胞系和HLA A2阴性T细胞(单核细胞耗尽的外周血单核细胞)的共培养物，并测定了T细胞产生的白介素-2。检测两种FvCD3-HLA-A2构建体85和71实质的T细胞刺激能力，这两种构建体的差异在于各自的Flag或Myc-标签(关于构建体结构域的结构参见图3)。HLA-A2-CD3结构中的双特异串联Fv构建体效率更差些，而针对HLA-A2或CD3的单链构建体根本不刺激T细胞。采用非特异性PHA-L(植物凝集素)刺激，进行阳性对照。
图5显示，如果使用本发明的一对互补构建体，则具有极好且高度特异性的T细胞刺激能力，但是仅使用一对(两个)构建体中的一个时则不是这样。简而言之，如同所描述的，将VLCD3-scFvHLA-A2(构建体42)、VHCD3-scFvCD45(VL-VH)(构建体45)和VHCD3-scFvCD45(VH-VL)(构建体55)单独的，或者将构建体42和45或者构建体42和55的组合滴定至U266和T细胞的共培养物。42/45或42/55组合显示了高的T细胞刺激能力，如果仅单独给予这些构建体中的一种则具有极小的活性。这些结果表明，FvCD3的VL和VH结构域必需协作以重构或互补T细胞衔接功能。重要的是，scFvCD45靶向部分可由(VL-VH)转变为(VH-VL)结构，这清楚地表明构建体的模块特征允许靶向部分被具有期望的特异性的另一靶向部分替代。使用不刺激T细胞产生IL2的单链构建体CD45(VL-VH)和CD45(VH-VL)来控制该分析系统。
图6显示了3个竞争性封闭实验中的第一个。如上所述将双特异串联构建体FvCD3-HLA-A2(构建体71)给予U266和T细胞的共培养物，并通过T淋巴细胞诱导的IL2产生来测定刺激作用。该T细胞刺激作用被占据HLAA2分子上的靶向表位的单链构建体(构建体4，浓度*100)所封闭。HLA A2或CD3特异性单链构建体(构建体4，(浓度*100)或构建体36(浓度*9))对T细胞的固有刺激被阻止。将PHA-L用作阳性对照。
图7显示，“三结构域构建体”(即本发明的构建体)首先必须结合到单个细胞的表面上以二聚化并互补出T细胞衔接功能。简而言之，将构建体42和45给予U266细胞和HLA-A2阴性T淋巴细胞的共培养物，并通过T细胞产生的IL2测定刺激能力。在HLA A2或CD45分子上的表位被构建体4或46(二者浓度*100)竞争性封闭的实验情况下，T细胞刺激功能被消除。这些结果清楚地表明，两个单独的“三结构域构建体”必须同时结合到细胞表面上，以便恢复或互补出T细胞衔接功能。使用不同浓度阻止了任一种构建体(42、45、4、46和36)的固有的刺激活性。
图8显示了关于构建体42和55组合的与图7类似的实验。同样，通过竞争性封闭在HLA A2或CD45分子上的抗原表位，消除了两个“三结构域构建体”的组合的T细胞刺激能力。重要的是，这些结果再次显示，可以通过具有合适特异性的另一模块来便利地代替所述靶向模块。更重要的是，构建体42的VL-VH-VL结构和构建体55的VH-VH-VL结构，在没有预先结合表达HLA A2和CD45两种抗原的基底的情况下，阻碍了所述构建体的同源、异源二聚化或自组装。
图9显示了在包含VLCD3-scFvHLA-A2和VHCD3-scFvCD45(VH-VL)构建体(“两种构建体”)的样品中HLA A2阴性T细胞对U266细胞的裂解。在仅包含两种构建体之一的对照样品中没有观察到明显的裂解。
图10显示了多肽的准确的恢复。两种单独的多肽(P1和P2)与靶细胞上其各自的抗原的结合，每种多肽都由融合至CD3-特异性抗体的可变轻链(VL)或可变重链结构域(VH)(片段F1和F2)的特异性单链可变抗体片段(scFv,VH-VL)组成，使得VH/VL能够异源二聚化并形成功能性CD3结合位点以衔接T细胞。
图11显示，CD3 VH/VL二聚化衔接了T细胞，并且是双抗原-限制的。用HLA-A2-阴性捐献者外周血单核细胞(PBMC)和所示的多肽，来探测HLA-A2-阳性和CD45-阳性的U266骨髓瘤、原发性T细胞前淋巴细胞白血病(T-PLL)和THP-1急性骨髓白血病细胞。通过反应性白介素-2(IL-2)产生(A)和靶细胞裂解(B)来评估T细胞衔接。将双特异串联scFv(CD3(VH-VL)-HLA-A2(VH-VL)抗体用作阳性对照。(C),如图所示，通过过量的scFvCD45(左)和scFvHLA-A2(右)抑制剂(封闭靶细胞上个别的抗原表位)，竞争性封闭多肽结合THP-1细胞，并检测了捐献者PBMC的反应性IL2产生。(D),用所述多肽探测单个或两个抗原阴性细胞系RAJI和KMS-12-BM。将PHA-L用作针对PBMC的非特异性刺激物对照。
图12显示了通过体内条件性CD3VH/VL互补的靶向治疗。(A),将5×106THP-1急性白血病细胞以及1.25×105CMV-特异性HLA-A2-阴性捐献者T细胞和所示的多肽(0.5μg)经腹腔注射后，小鼠的存活率(n＝每组6只)(肿瘤细胞：T-细胞比例＝40/1)。(B),在与捐献者T细胞和所示的多肽(3nM)共培养后的HLA-A2/CD45双-阳性THP-1以及CD45-阳性但HLA-A2-阴性的旁邻细胞中，通过流式细胞术体外评估半胱天冬酶-3活化作用。将双特异串联scFv(CD3(VH-VL)-HLA-A2(VH-VL))抗体用作阳性对照。
图13显示，EGFR-和EpCAM-定向的多肽衔接T细胞用于破坏癌细胞。在所示的对EGFR(CD3(VH)-EGFR(VH-VL))和EpCAM(CD3(VL)-EpCAM(VH-VL))具有特异性的多肽存在下，用PBMC探测了EGFR和EpCAM双-阳性人结肠癌细胞系COLO-206F和黑素瘤细胞系FM-55(EGFR-阳性但EpCAM-阴性)。通过反应性干扰素-γ(IFNγ)产生(A)和靶细胞中的半胱天冬酶-3激活作用(B)评估了T细胞衔接作用。
图14显示，HLA-A2和CEA定向的多肽重新定向T细胞用于破坏肿瘤细胞。在所示的对HLA-A2(CD3(VL)-HLA-A2(VH-VL))和CEA(CD3(VH)-CEA(VH-VL))具有特异性的多肽存在下，用PBMC探测了人结肠癌细胞系COLO-206F、黑素瘤细胞系FM-55和卵巢癌细胞系OVCAR。通过反应性IFNγ产生评估了T细胞衔接作用。重复运行和分析样品。
图15显示，HLA-A2和EGFR定向的多肽重新定向T细胞用于破坏肿瘤细胞。在所示的对HLA-A2(CD3(VL)-HLA-A2(VH-VL))和EGFR(CD3(VH)-EGFR(VH-VL))具有特异性的多肽存在下，用PBMC探测了人细胞系COLO-206F、FM-55和OVCAR。通过反应性IFNγ产生评估了T细胞衔接作用。重复运行和分析样品。
图16显示，HLA-A2和Her2定向的多肽重新定向T细胞用于破坏肿瘤细胞。在所示的对HLA-A2(CD3(VL)-HLA-A2(VH-VL))和Her2(CD3(VH)-Her2(VH-VL))具有特异性的多肽存在下，用PBMC探测了人细胞系COLO-206F、FM-55和OVCAR。通过反应性IFNγ产生评估了T细胞衔接作用。重复运行和分析样品。
图17显示，CD45和HLA-A2定向的多肽重新定向T细胞用于破坏肿瘤细胞。在该实验中，与图5、7-9、11、12、14-16所用的CD45和HLA-A2多肽相比较，针对抗-CD45和抗-HLA-A2靶向部分的分开的抗CD3片段(CD3(VH)和CD3(VL))进行了互换。在所示的对CD45(CD3(VL)-CD45(VH-VL))和HLA-A2(CD3(VH)-HLA-A2(VH-VL))具有特异性的多肽存在下，用PBMC探测了人骨髓瘤细胞系U266。通过反应性IFNγ产生评估了T细胞衔接作用。重复运行和分析样品。
图18显示，EGFR和EpCAM定向的多肽重新定向T细胞用于破坏肿瘤细胞。在所示的对EpCAM(CD3(VL)-EpCAM(VH-VL))和EGFR(CD3(VH)-EGFR(VH-VL))具有特异性的多肽存在下，用PBMC探测了人结肠癌细胞系COLO-206F和CX-1以及卵巢癌细胞系OVCAR。通过反应性IFNγ产生评估了T细胞衔接作用。重复运行和分析样品。
图19显示，Her2和EpCAM定向的多肽重新定向T细胞用于破坏肿瘤细胞。在所示的对EpCAM(CD3(VL)-EpCAM(VH-VL))和Her2(CD3(VH)-Her2(VH-VL))具有特异性的多肽存在下，用PBMC探测了人卵巢癌细胞系OVCAR。通过反应性IFNγ产生评估了T细胞衔接作用。重复运行和分析样品。
图20显示，CD45和CD138定向的多肽重新定向T细胞用于破坏肿瘤细胞。在所示的对CD45(CD3(VL)-CD45(VH-VL)上图，CD3(VH)-CD45(VH-VL)下图)和CD138(CD3(VH)-CD138(VH-VL)上图，CD3(VL)-CD138(VH-VL)下图)具有特异性的多肽存在下，用PBMC探测了人骨髓瘤细胞系AMO-1。通过反应性IFNγ产生评估了T细胞衔接作用。重复运行和分析样品。
图21显示，用CD138定向的多肽靶向单抗原(CD138)重新定向T细胞用于破坏肿瘤细胞。在所示的对CD138(CD3(VL)-CD138(VH-VL)和(CD3(VH)-CD138(VH-VL))具有特异性的多肽存在下，用PBMC探测了人骨髓瘤细胞系AMO-1。通过反应性IFNγ产生评估了T细胞衔接作用。重复运行和分析样品。
图22显示，用CD45定向的多肽靶向单抗原(CD45)重新定向T细胞用于破坏肿瘤细胞。在所示的对CD45(CD3(VL)-CD45(VH-VL)和(CD3(VH)-CD45(VH-VL))具有特异性的多肽存在下，用PBMC探测了人骨髓瘤细胞系AMO-1和U266。通过反应性IFNγ产生评估了T细胞衔接作用。重复运行和分析样品。
图23显示了针对细胞表面上的单抗原的两个多肽的准确恢复，所述多肽靶向抗原上的两个不同表位(上部)或相同表位(下部)。两个单独的多肽(P1和P2)结合靶细胞上相同的抗原的各自表位。为了靶向两个不同的表位，每种多肽的靶向部分由特异性单链可变抗体片段(scFv)组成。为了靶向相同的表位，每种多肽的靶向部分由相同的单链可变抗体片段(scFv)组成。靶向部分通过肽接头融合至CD3-特异性抗体的可变轻链(VL)或可变重链结构域(VH)(片段F1和F2)，使得VH/VL能够异源二聚化并形成功能性CD3结合位点(功能结构域)以衔接T细胞。
图24显示了用多肽部分的试剂盒以不同的效应方式杀死靶细胞的可能性。为此，抗-CD3模块(F1和F2)被抗-HIS(6-组氨酸)模块替代，在同时结合多肽1和2后，所述抗-HIS模块互补出6-组氨酸结合位点从而结合组氨酸标记的载荷(例如HIS-标记的毒素)。多肽P1的靶向部分T1(VH-VL)特异性结合HLA-A2。多肽P2的靶向部分T2(VH-VL)特异性结合CD45。多肽P1的片段F1包含针对6-组氨酸-标签的抗体的VH结构域，多肽P2的片段F2包含该相同抗体的VL结构域。用组氨酸(His)标记的产气荚膜梭菌微小毒素组分Ia以0.01μg/ml组合所示的多肽探测了人骨髓白血病细胞系THP-1。48h后采用分析在培养物中测量细胞活力。结果显示，对于用该组合而非用单独的多肽探测的细胞，针对分析背景的活力降低。对照THP-1细胞同时生长于无毒素的培养物中。重复运行和分析样品。
图25显示，包含针对His-标签的分开的抗体的HLA-A2和CD45定向的多肽，用组氨酸(His)标记的志贺(Shiga)毒素亚基A以0.01μg/ml的浓度杀死肿瘤细胞。使用与图F24同样的实验设置。
图26显示，包含针对His-标签的分开的抗体的HLA-A2和CD45定向的多肽，用组氨酸(His)标记的志贺毒素亚基A以0.1μg/ml的浓度杀死肿瘤细胞。使用与图F24/25同样的实验设置。
图27显示，包含具有F1和F2的功能结构域F的EGFR和EpCAM定向的多肽是对洋地黄毒苷(aDig)具有特异性的抗体的VH和VL，用洋地黄毒苷标记的辣根过氧化物酶(HRP)分子标记肿瘤细胞。多肽P1的靶向部分T1(VH-VL)特异性结合EGFR，多肽P2的靶向部分T2(VH-VL)特异性结合EpCAM。多肽P1的片段F1包含针对洋地黄毒苷的抗体的VH结构域，多肽P2的片段F2包含该相同抗体的VL结构域。首先用所示的多肽探测人结肠癌细胞系Colo-206F，然后用洋地黄毒苷标记的HRP进行探测。用(InvitrogenTM,ELISA试剂盒)分析样品，并用BioRAD-酶标仪读取吸光度。对于分析，色原体空白样品(无洋地黄毒苷-HRP)，设置为0。重复运行和分析样品。
图28显示，CD45和HLA-CW6定向的多肽重新定向T细胞用于破坏患者细胞。采用具有已知HLA-单体型的原发性患者细胞。A51＝患有MDS(骨髓增生异常综合征)的患者细胞，对于HLA-Cw6单体型为纯合的。A49＝同种异体骨髓移植后的患者细胞，对于HLA-Cw6单体型为杂合的。在所示的对CD45(CD3(VL)-CD45(VH-VL))和HLA-Cw6(CD3(VH)-HLA-CW6(VH-VL))具有特异性的多肽存在下，将患者细胞与健康PBMC一起孵育30h。通过反应性IFNγ产生评估了T细胞衔接作用。重复运行和分析样品。
图29显示，EGFR和EpCAM定向的多肽重新定向T细胞用于破坏原发癌患者细胞。从患有转移性胰腺癌的48岁男性患者的恶性腹水中采集A44肿瘤细胞。在所示的对EpCAM(CD3(VL)-EpCAM(VH-VL))和EGFR(CD3(VH)-EGFR(VH-VL))具有特异性的多肽存在下，将患者肿瘤细胞与患者自己的PBMC(通过放血采集)一起孵育30h。通过反应性IFNγ产生评估了T细胞衔接作用。重复运行和分析样品。
图30显示，CD45和HLA-A2定向的多肽重新定向CMV限制性CD8+T细胞用于破坏肿瘤细胞。在所示的对HLA-A2(CD3(VL)-HLA-A2(VH-VL))和CD45(CD3(VH)-CD45(VH-VL))具有特异性的多肽存在下，将人肿瘤细胞THP-1和U266与来自HLA-A2阴性健康捐献者CMV限制性T-细胞一起孵育30h。将双特异串联scFv(CD3(VH-VL)x HLA-A2(VH-VL))-抗体用作阳性对照。通过反应性IFNγ产生评估了T细胞衔接作用。重复运行和分析样品。
图31显示了通过由过敏原特异性多肽和细胞类型特异性多肽组成的多肽部分的试剂盒消除引起自体免疫病症或超敏症的B-细胞克隆的原理概念。第一多肽P1在其靶向部分具有过敏原(例如Betv-1A、Der-f2、蓝豆蛋白(Conglutin)-7、Can-f1,Feld-d1)。第二多肽P2在其靶向部分具有靶向细胞表面蛋白(例如CD19、CD138、CD38)的特异性单链可变抗体片段(scFv,VH-VL)。两个靶向部分均融合至CD3-特异性抗体的可变轻链(VL)或可变重链结构域(VH)(片段F1和F2)。
在下文中，参考本说明书、所附实施例和附图以及(部分)权利要求中提到的某些(人)基因或蛋白。以下提供了相应的(示例性)基因登录号。在本说明书其他地方和所附实施例中还提供了其他登录号。
CD45：基因ID:5788,更新日期为2013年1月13日，3.蛋白＝P08575-1＝同种型1,最后修改日为2003年7月19日，第2版。
CD34：蛋白：P28906-1/2最后修改日为1998年7月15日，第2版。
CD33：基因ID:945,更新日期为2012年12月30日，蛋白：P20138[UniParc]，最后修改日为2006年10月17日，第2版，校验和：1C73E588240FBAD8
CD138：基因ID:6382,更新日期为2013年1月6日,4.蛋白＝P18827[UniParc].最后修改日为2009年5月5日，第3版。
CD15：基因ID:2526,更新日期为2013年1月5日
CD1a：基因ID:909,更新日期为2012年12月30日,P06126[UniParc]，最后修改日为2010年2月9日，第4版，校验和：C575C3C538F0AA29
CD2：基因ID:914,更新日期为2013年1月5日；P06729[UniParc]，最后修改日为2007年10月23日，第2版，校验和：A03D853C3B618917
CD3e：基因ID:916,更新日期为2013年1月5日,P07766[UniParc]，最后修改日为1996年2月1日，第2版，校验和：A1603D01CE9957D7
CD4：基因ID:920,更新日期为2013年1月13日；P01730[UniParc]，最后修改日为1988年11月1日，第1版，校验和：20ED893F9E56D236
CD5：基因ID:921,更新日期为2012年12月30日；P06127[UniParc]，最后修改日为2010年11月30日，第2版，校验和：9131AEC9683EE1D3
CD8a：基因ID:925,更新日期为2012年12月30日；同种型1/2(膜)P01732-1/2(mCD8α)[UniParc]，最后修改日为1986年7月21日，第1版，校验和：FCCA29BAA73726BB
CD20：基因ID:931,更新日期为2013年1月6日；P11836[UniParc]，最后修改日为1989年10月1日，第1版，校验和：AC5420F8B626BDD1
CD23：基因ID:2208,更新日期为2013年1月4日；P06734[UniParc]，最后修改日为1988年1月1日，第1版，校验和：F86708C0E6515B87
CD31：基因ID:5175,更新日期为2013年1月13日；长的同种型[UniParc].最后修改日为1990年4月1日，第1版，校验和：C57BBFA200A407A6,P16284-1/2/3/4/5/6＝同种型1-6
CD43：基因ID:6693,更新日期为2012年12月30日；P16150[UniParc]，最后修改日为1990年4月1日，第1版，校验和：C9C9AB8435D5E1FE
CD56：基因ID:4684,更新日期为2012年12月30日；同种型1[UniParc]，最后修改日为2008年7月22日，第3版，校验和：FD3B9DE80D802554,P13591-2/1/3/4/4/6,同种型1-6
CD57：基因ID:27087,更新日期为2013年1月5日
CD68：基因ID:968,更新日期为2013年1月6日；长的同种型(CD68.1)[UniParc].最后修改日为2007年5月15日，第2版，校验和：69E68D69EDE8EFB0,P34810-1/2,同种型1/2
CD79a：基因ID:973,更新日期为2013年1月5日；同种型1(长)[UniParc].最后修改日为1994年6月1日，第2版，校验和：6E5B837409969292,P11912-1/2,同种型1/2
CD146：基因ID:4162,更新日期为2012年12月30日；同种型1[UniParc]，最后修改日为2006年1月10日，第2版，校验和：E46CB8AC7BA0738E,P43121-1/2,同种型1/2。
表面活性蛋白(A和B)：
基因ID:6440,更新日期为2012年12月30日；基因ID:6439,更新日期为2012年12月30日,P07988[UniParc]，最后修改日为1992年5月1日，第3版，校验和：9FD7F66678A35153，且同种型1[UniParc]，最后修改日为1990年4月1日，第2版，校验和：C26A21E33C60AA78,P11686-1/2,同种型1/2
突触泡蛋白：
基因ID:6855,更新日期为2012年12月30日,P08247[UniParc]，最后修改日为1991年8月1日，第3版，校验和：592289C43B12EFA7
烟碱型乙酰胆碱受体：
基因ID:1138,更新日期为2012年12月30日,基因ID:1136,更新日期为2013年1月6日,基因ID:1139,更新日期为2013年1月13日,基因ID:1137,更新日期为2012年12月30日,基因ID:1141,更新日期为2013年1月5日
肌特异性激酶MUSK：
基因ID:4593,更新日期为2013年1月8日,同种型1[UniParc]，最后修改日为1998年1月1日，第1版，校验和：3DDC20E179FA010C,O15146-1/2,同种型1/2
电压门控钙通道(P/Q-型)：
基因ID:773,更新日期为2013年1月5日；同种型1(1A-1)(BI-1-GGCAG)[UniParc]，最后修改日为1999年7月15日，第2版，校验和：2F2F378ACE02FD56,O00555-1/2/3/4/5/6/7,同种型1-7,基因ID:25398,更新日期为2013年1月11日,J3KP41[UniParc]，最后修改日为2012年10月3日，第1版，校验和：AEDF4D2A5E49263F
电压门控钾通道(VGKC)：
基因ID:3737,更新日期为2012年12月30日,基因ID:3736,更新日期为2013年1月8日,基因ID:3742,更新日期为2013年1月8日
N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA)：
基因ID:2904,更新日期为2013年1月5日,Q13224[UniParc]，最后修改日为2001年6月20日，第3版，校验和：40AEB12BE6E50CEF；基因ID:2902,更新日期为2012年12月30日,同种型3(长)(NR1-3)[UniParc]，最后修改日为1994年6月1日，第1版，校验和：CDF5402769E530AB,Q05586-1/2/3/4/5,同种型1-5
TSHR：基因ID:7253,更新日期为2013年1月4日,长的同种型[UniParc]，最后修改日为2005年3月29日，第2版，校验和：D2EE9CEBFD64A65F,P16473-1/2/3,同种型1-3
两性蛋白：
基因ID:273,更新日期为2013年1月8日,同种型1(128 kDa)[UniParc].最后修改日为1996年2月1日，第1版，校验和：78B4F75AB75BA357,P49418-1/2,同种型1-2
神经节苷脂GQ1B：基因ID:29906,更新日期为2012年12月30日
GD3：基因ID:117189,更新日期为2012年6月22日
Ca-125：基因ID:94025,更新日期为2012年12月30日,Q8WXI7[UniParc]，最后修改日为2003年3月1日，第2版，校验和：B3E7BDF19997A440
Her-2/neu：基因ID:2064,更新日期为2013年1月13日,4.蛋白＝P04626-1/2/3/4＝同种型1-4,最后修改日为1987年8月13日，第1版，巨大囊肿病液体蛋白15；基因ID:5304,更新日期为2012年12月30日
CD117：基因ID:3815,更新日期为2013年1月6日
CD30：基因ID:943,更新日期为2013年1月6日；长的同种型[UniParc]，最后修改日为1992年12月1日，第1版，校验和：7A407CC78A6E0BC8,P28908-1/2,同种型1/2
血小板衍生的生长受体PDGFRα：
基因ID:5159,更新日期为2013年1月13日,基因ID:5156,更新日期为2013年1月13日,同种型1[UniParc]，最后修改日为1990年4月1日，第1版，校验和：5E3FB9940ACD1BE8,P16234-1/2/3,同种型1-3；P09619[UniParc]，最后修改日为1989年7月1日，第1版，校验和：038C15E531D6E89D
黑素瘤相关的标志物/Mart 1：
基因ID:2315,更新日期为2012年12月30日；Q16655[UniParc]，最后修改日为1996年11月1日，第1版，校验和：B755BFF39CFCB16E
CD133：基因ID:8842,更新日期为2013年1月13日；同种型1(AC133-1)(S2)[UniParc].最后修改日为1998年6月1日，第1版，校验和：D21CBC05ADB2DEDF,O43490-1/2/3/4/5/6/7,同种型1-7
在下文中，参考用于说明本发明而非限制本发明的实施例。
实施例
实施例1
重组抗体构建体的克隆
通过分子生物学的标准方法，将源自杂交瘤细胞和分别编码抗-CD3、抗-CD45和抗-HLA A2抗体的可变结构域的DNA序列用来产生图3所示的抗体构建体(参见，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(2001))。所述构建体被设计为携带不同的亲和标签以便于在重组蛋白表达后进行鉴别和纯化(Myc-、Flag、His-标签)。关于构建体的结构域布置、亲和标签和接头的详情，参见图3。
pelB前导序列编码的氨基酸序列将细菌中表达的蛋白引导至细菌周质。该前导序列由细菌酶切割，且该蛋白可分离。
实施例2
重组抗体的表达和纯化
周质蛋白表达:
采用合适的原核表达载体于大肠杆菌菌株TG1的周质中表达重组抗体构建体。将两升包含0.1％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2×TY培养基接种20ml转化的TG1的过夜培养物并于37℃生长至指数期(OD600 0.8–0.9)。由于所述抗体片段处在乳糖启动子的控制下，添加1mM IPTG然后在RT(室温)下再摇动孵育3h以诱导蛋白表达。于2,750×g和4℃下离心10min收集细胞，并将细胞重悬于100 ml合适的缓冲液。通过添加50μg/ml新溶解的溶菌酶[Roche Diagnostics]来进行细胞裂解，并在冰上孵育25min。然后，添加10 mM MgSO4以稳定球芽(spheroblast)，将细胞于6,200×g和4℃下离心10min。最后，将获得的包含周质蛋白的上清液于4℃在PBS中透析过夜，按如上所述再离心15min。然后，通过Ni-NTA-IMAC(镍-氨三乙酸固定化金属亲和层析)纯化重组蛋白。
固定化金属亲和层析(IMAC):
为了纯化带有His6标签的重组蛋白，通过固定化镍-氨三乙酸(NTA)琼脂糖珠[Qiagen]进行IMAC。首先，1ml Ni-NTA琼脂糖柱需要用约10ml无菌PBS或含有20mM咪唑的磷酸钠缓冲液进行平衡。然后将由细胞质表达沉淀的或由周质表达透析的粗制蛋白逐渐加载至该柱。用约20ml合适的IMAC洗涤缓冲液(含有20-35mM咪唑的磷酸钠缓冲液)洗涤至流出液中没有更多的蛋白可被检测到后，将结合蛋白从该柱洗脱至磷酸钠缓冲液(含有250mM咪唑)的500μl级分中。
将10μl各样品添加至90μl的1×Bradford溶液中，通过定性Bradford分析，对所有收集的洗涤和洗脱级分测定蛋白的存在。通过SDS-PAGE分析来验证该纯化过程。为此，在还原条件下将洗脱的级分与粗制蛋白、流出液和洗涤级分平行运行。最后，将比色反应测定的阳性级分合并至峰级分和较小的级分，于4℃在PBS中透析过夜。为了应用于刺激分析，需要将纯化的蛋白进行无菌过滤，且它们的浓度已被确定。此外，蛋白定量后，在还原和非还原条件下，还通过SDS-PAGE和蛋白质印迹来分析2μg进一步使用的级分。
在实施例2的替代性实例中，合成了编码(VH)CD3-EGFR(VH-VL)、(VH)CD3-CEA(VH-VL)、(VH)CD3-Her2(VH-VL)、(VH)CD3-HLA-A2(VH-VL)、(VH)CD3-HLA-CW6(VH-VL)(VH)CD3-CD138(VH-VL)、(VH)抗Dig-EGFR(VH-VL)、(VH)抗His-HLA-A2(VH-VL)、(VL)CD3-CEA(VH-VL)、(VL)CD3-EpCAM(VH-VL)、(VL)抗Dig-EpCAM(VH-VL)、(VL)抗His-CD45(VH-VL)、(VL)CD3-CD45(VH-VL)的DNA，并通过GenScript(Piscataway,NJ,USA)产生和分离蛋白。所述DNA为用于大肠杆菌表达(载体E3)而是密码子优化的，表达优化的，在2升标准LB-培养基中生长，通过Ni-HiTrap柱在一步中从包涵体或周质(pelB前导序列)获得蛋白。通过在5升1x磷酸缓冲盐水(PBS)中透析去除细菌内毒素。通过Bradford蛋白分析以牛血清白蛋白(BSA)为标准测量浓度。通过考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶的密度计分析估计纯度。于-80℃或+4℃保存小份样品。使用储存缓冲液1xPBS，5％甘油、0.5％十二烷基肌氨酸钠，pH7.4。
实施例3
细胞培养技术
细胞培养：
于37℃、5％CO2下将哺乳动物细胞培养于T75组织培养瓶的20ml合适培养基中。每2-3天分离细胞。首先需要用1×胰蛋白酶-EDTA来分离贴壁细胞。使用活体染料---曙红或台盼蓝进行细胞计数。对于储存，以450×g离心5min收集60-80％汇合的细胞，重悬于含有10％DMSO的FCS，等分至冷冻管中，逐渐冷冻至-80℃的温度。将细胞于37℃的水浴中快速解冻，并小心添加至5ml培养基中。为了去除DMSO，再次离心细胞，重悬于新鲜培养基中，并转移至组织培养瓶。
外周血单核细胞(PBMC)的制备：
使用基于聚蔗糖的淋巴细胞分离液LSM 1077(PAA Laboratories,Pasching,Austria)，通过密度离心从健康人捐献者的白细胞层预先分离包含淋巴细胞和单核细胞的PBMC。然而，由于在使用期间这些PBMC呈现为不均一的细胞群，按如下重复进行从剩余红细胞、粒细胞和血小板中分离。将重悬于含有10％FCS和Pen-Strep的30ml RPMI 1640培养基中的解冻的PBMC小心地层铺至10ml的LSM 1077，并不停地以800×g离心5min。弃去上层相后，将浓缩于中间相的PBMC转移至新管中，重悬于30ml培养基，并以450×g离心5min。通过在10cm组织培养平板上过夜培养PBMC使得单核细胞贴附至平板上来去除单核细胞。最后，收集剩余在溶液中的PBMC。
在实施例3的替代性实例中，患有转移性胰腺癌的患者的原发性人癌细胞获取自患者的腹水袋(图29)。将4升新收集的恶性腹水储存于几个2升的玻璃瓶中于4℃过夜。第二天将玻璃瓶底部的细胞团块在1xPBS中洗涤，并重悬于培养基(补充有200μM l-谷氨酰胺、10％热灭活的FBS、青霉素(200 U/mL)、链霉素(200μg/mL)和丙酮酸钠(1mM)的DMED())中。在培养箱中于36℃、5％CO2、90％湿度下培养贴壁细胞。同一天从患者中收集腹水，采集20ml外周血用于提取PBMC。原发性白血病细胞获自匹配的同种异体干细胞移植后32天复发的71岁T-细胞-前淋巴细胞白血病(T-PLL)男性患者(图11A)。提取白血病T-PLL细胞作为来自患者外周血的PBMC。抽取样品时，患者在常规临床诊断中在其血液计数中具有>90％的白血病原始细胞。所有患者均签订了由维尔茨堡伦理委员会(Würzburg ethical committee)的大学医院核发的知情同意书。
在实施例3的替代性实例中，产生巨细胞病毒(CMV)-特异性人T-细胞：简而言之，由来自HLA-A0201阴性、B0702+捐献者的PBMC的塑料贴壁单核细胞产生树突状细胞(DC)。在含有GM-CSF/IL4的DC培养基(Cellgenix)中培养72h后，DC在含有IL4(100ng/ml)、GM-CSF(800IU/ml)、LPS(10ng/ml)和IFNγ(100U/ml)加上2.5ug/ml CMV pp65来源的肽TPRVTGGG的培养基中成熟。16h后，将DC辐照(30Gy)并与CD45RO-、CD57-初始CD8+T-细胞以1:4的比例共培养于含有5％AB血清和IL21(10ng/ml)的培养基中。在第10-12天评估以前，于培养的第3、5和7天添加新鲜培养基IL7和IL15。细胞培养于Cellgenix DC培养基中。使用来自PAA的人AB血清。所有实验中均使用单个批次。IL4、IL7、IL15、IL21购自Peprotech或Cellgenix(具有相同的结果)。GM-CSF购自Gentaur。LPS(E.coli O:15)购自Sigma。HLA-B0702-限制的CMV-特异性肽TPRVTGGG购自jpt。对于体内实验，使用APC-标记的MHC-多聚体(Immudex)进一步纯化了CMV-特异性T-细胞。于室温下进行MHC多聚体染色，然后用抗-APC-珠(Miltenyi)分离MHC-多聚体+T-细胞。
实施例4
功能分析
流式细胞术:
通过流式细胞术检测抗体融合蛋白与抗原-呈递肿瘤细胞和/或T淋巴细胞的结合。为此目的，将2.5-5×105细胞和10μg/ml的scFv或0.004-4μg/ml的滴定融合蛋白在每孔100μl的合适缓冲液(如PBS+牛血清白蛋白，或其他可接受的缓冲液)中在96-孔V-形板上于4℃孵育2h。用150μl合适的缓冲液洗涤3次后，将细胞与FITC-缀合的抗-His6标签或抗-Flag标签或抗-myc标签抗体于室温孵育30min，并再洗涤两次。对于设门(gating)和背景染色检测，每种细胞类型制备另外两个样品，一个是未染色的细胞，一个在无任何蛋白的情况下用FITC-缀合的抗-His6标签抗体染色。最后，将细胞重悬于500μl的合适缓冲液中，转移至FACS管，并通过流式细胞术进行分析。
PBMC刺激分析：
在基于细胞的刺激分析中检测重组蛋白的刺激特性。从而根据诱导的IL-2释放通过测量PBMC刺激来测定由双特异抗体和“三结构域构建体”介导的T-细胞激活。
构建体的刺激活性的测量：
将CD45阳性/HLA A2骨髓瘤细胞系U266以每孔100μl培养基中105个细胞的密度接种于平底96-孔细胞培养板。按照指示将滴定的刺激蛋白加入至每孔的100μl培养基中，并于37℃和5％CO2下预孵育1h以确保足够的结合。然后将前一天解冻分离的未刺激的PBMC以所示的密度添加并37℃、5％CO2下孵育24h。最后，以450×g离心平板5min以收集无细胞的上清液用于在ELISA中进行IL-2定量。
IL-2夹心ELISA：
作为刺激活性的指示，双特异抗体诱导的T-细胞激活根据IL-2释放来测量。进行PBMC刺激后，通过IL-2夹心ELISA来测定上清液中的分泌的IL-2浓度。
首先用400ng/100μl每孔的小鼠抗-人IL-2抗体包被96-孔ELISA平板于4℃过夜，然后用合适的封闭缓冲液于室温下浸润非特异性结合位点2h。同时，从1,000pg/ml的最大IL-2浓度开始于试剂稀释液中一式两份制备连续1:2稀释的IL-2标准品。然后，将含有IL-2的上清液以1:3稀释在含有10％FCS和Pen-Strep(青霉素-链霉素)的RPMI 1640培养基中。将稀释的上清液和标准品均转移至ELISA平板并于室温孵育2h。然后，通过与17.5ng/100μl每孔的生物素化山羊抗-人IL-2抗体于室温孵育2h来检测IL-2。最后，将以1:200稀释于试剂稀释液中的100μl HRP-缀合的链霉亲和素添加至每孔并于室温孵育20min。每个平板用TMB底物溶液显色。为了获得背景信号，每个平板上至少2个孔用试剂稀释液或仅培养基和检测抗体加上TMB进行孵育。在每个孵育步骤之间，用含有0.05％吐温-20的PBS洗涤平板3次，用单独的PBS洗涤一次。
以每个标准样品的吸光度信号相对于IL-2浓度绘图来制作7点标准曲线。因此，每份上清液的IL-2的量能够使用GraphPad通过用于单相指数关联的拟合非线性回归方程的标准曲线的插值来测定。
IFN-γELISA(实施例4的替代性实例)：
使用人IFN-γELISA试剂盒(InvitrogenTM)按照生产商的方案测量100μl细胞培养物上清液中的IFN-γ浓度。简而言之，将50μL孵育缓冲液添加至预包被的96-孔板的每个孔中。50μL标准稀释缓冲液至调零孔。50μL标准品和样品至每个孔。50μL生物素化的人IFN-γ生物素缀合物溶液至每个孔。轻敲该平板的侧面以混合。用平板盖将平板盖上并于室温孵育1.5h。从孔中完全吸走溶液并弃除该液体。洗涤孔4次。将100μL链霉亲和素-HRP工作溶液添加至每个孔。用平板盖将平板盖上并于室温孵育45min。从孔中完全吸走溶液并弃除该液体。将100μL稳定的色原体添加至每个孔。孔中的液体变蓝。我们于室温在黑暗中孵育15-30min。将100μL终止溶液添加至每个孔。轻敲该平板的侧面以混合。孔中的溶液由蓝变黄。用BioRad酶标仪于450nm读取每个孔的吸光度。
细胞毒性分析：
用10μM CFSE(Invitrogen Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit)在350μlPBS中于室温在黑暗中将HLA-A2/CD45阳性细胞系U266或骨髓瘤细胞系U266标记10min。通过加入5ml胎牛血清(FCS)然后于室温孵育1min终止该标记反应。洗涤2两次后，按照指示将CFSE-标记的靶细胞重悬于分析培养基中，并与HLA-A2阴性健康捐献者的外周血单核细胞(PBMC)以1:10的比例(5*105U266和5*106PBMC于2ml中)和27nM的抗体构建体一起孵育。将用Triton处理的样品用作阳性对照(100％裂解)，没有抗体构建体的样品用作阴性对照(0％裂解)。24h后，通过7AAD染色(Biozol,于室温下10min)来显现凋亡的细胞，并使用流式细胞术来计算CFSE标记的U266细胞的特异性裂解％。
半胱天冬酶-3分析(实施例4的替代性实例)：
将靶细胞与T-细胞(肿瘤细胞:T-细胞的比例为2:1)在有或没有特异性多肽的条件下一起孵育4h后，进行染色。首先进行HLA-A2和CD45的表面染色，然后固定并透化(Fix+Perm,BD Biosciences)。再添加激活的半胱天冬酶-3抗体(BD Biosciences)30min。用1xPBS+5％人血清(HS,PAA Laboratories)洗涤细胞并在BD-FACS Canto-II上进行分析。特异性细胞凋亡％计算为：(实验值％-自发释放％)/(100％-自发释放％)*100。
阿尔玛蓝(Alamar Blue)分析(实施例4的替代性实例)：
分析(Abd Serotec)用于测量在暴露于毒素后细胞的增殖和活力。简而言之，细胞生长于每孔(96孔板)100μl的细胞培养基中。为进行分析，将10μl阿尔玛蓝添加至每个孔中，并在培养箱中孵育30-120min。用BioRad酶标仪于570nM和600nM读取吸光度。对于空白则仅用培养基。采用生长在无毒素培养物中的细胞作为对照，按照生厂商的指导来计算不同多肽组之间的细胞增殖减少的百分比差异。
洋地黄毒苷分析(实施例4的替代性实例)：
首先将来自辣根的过氧化物酶(HRP,Sigma-Aldrich Chemie gmbH)用洋地黄毒苷NHS-酯(Sigma-Aldrich Chemie gmbH)以1/3的摩尔比进行标记。用微型Bio-SpinTM层析柱(BioRad)净化Dig-HRP，并于4℃在黑暗中储存。首先将Colo-206F细胞与各种浓度的所述多肽孵育90min。用PBS洗涤细胞，并重悬于含有Dig-HRP的细胞培养基中孵育30min。然后用PBS洗涤细胞两次，并重悬于50μl PBS中。室温下于黑暗中添加50μL稳定的色原体(InvitrogenTM)15-30 min。添加50μL终止溶液，并用BioRad酶标仪于450nM读取吸光度。
小鼠(实施例4的替代性实例)：
按照欧洲的指导，将用于体内实验的HLA.A2转基因免疫缺陷型小鼠(NodScid IL-2rg-/-HLA.A2/B2m tg；保存号：14570,The JacksonLaboratory,Bar Harbor,Maine,USA)(图12A)维持饲养于我们的经核定的动物设备(ZEMM,维尔茨堡大学医院，实验分子医学中心)。将6-10周龄的雌鼠分为5组，每组6只(n＝30)。按照指示将5x106THP-1细胞、1.25x105CMV特异性CD8+T-细胞(肿瘤细胞:T-细胞的比例为40/1)和0.5μg的所述多肽经腹腔注射。注射后，每天检查以监测小鼠。在第13天第二次注射1.16x105CMV-特异性CD8+T-细胞/小鼠，一周每3天重复注射所述多肽。当动物体重增加80％以上或如果出现垂死状态时，根据公共机构的指导处死动物。
实施例5-9或图4-11所用的构建体或多肽的结构域结构、亲和标签和接头显示于图3。按照实施例1和2所述制备图4-30所用的这些构建体和所有构建体或多肽。按照实施例3和4所述来进行实施例5-9的细胞培养和功能分析和图4-30所示的培养、功能分析和体内工作。
实施例5
将CD45和HLA A2阳性骨髓瘤靶细胞系U266与来自健康捐献者的HLA A2阴性T细胞(单核细胞耗尽的PBMC(外周血单核细胞))，以及所示的不同量的HLA A2和CD3双特异抗体构建体(编号85、82、75和71)一起孵育。将PHA-L(植物凝集素，一种引起非特异性刺激T细胞的凝集素；1μg/ml终浓度)用作阳性对照，并检测了对HLA A2(编号4)或CD3(编号36)具有特异性的单链scFv构建体。通过ELISA技术测量T细胞产生的IL2(白介素-2)。在没有任何构建体的实验情况下没有发现IL2的产生。获得的数据描述于图4。
实施例6
将CD45和HLA A2阳性骨髓瘤靶细胞系U266与来自健康捐献者的HLA A2阴性T细胞(单核细胞耗尽的PBMC)，以及不同量的单独添加的(编号42、45、55；编号是指如图3所示的构建体)或者组合(42+45或42+55)添加的“三结构域构建体”一起孵育。将PHA-L和对CD45具有特异性的单链scFv构建体(编号46和17)用作对照。通过ELISA技术测量T细胞产生的IL2。在没有任何构建体的实验情况下没有发现IL的产生。获得的数据描述于图5。
实施例7
将CD45和HLA A2阳性骨髓瘤靶细胞系U266与来自健康捐献者的HLA A2阴性T细胞(单核细胞耗尽的PBMC)，以及单独的HLA A2和CD3双特异抗体构建体(编号71，27nM)，或者与封闭HLA A2上的抗原表位的单链scFv构建体(编号4，超过构建体71的浓度百倍，即2700nM)或CD3(编号36，超过构建体71的浓度9倍，即243nM)组合一起孵育。通过ELISA技术测量T细胞产生的IL2，并将PHA-L用作对照。获得的数据描述于图6。
实施例8
将CD45和HLA A2阳性骨髓瘤靶细胞系U266与来自健康捐献者的HLA A2阴性T细胞(单核细胞耗尽的PBMC)，以及构建体42和45的组合一起孵育。T细胞刺激功能被对HLA A2(编号4)或CD45(编号46)具有特异性的单链构建体封闭。通过分析单独的构建体42和45，或分析针对CD3的单链scFv构建体(编号36)来检测T细胞刺激功能的互补。通过ELISA技术测量T细胞产生的IL2，并将PHA-L用作对照。除非另有说明，构建体的浓度为27nM。("9x"表示浓度为243nM，"100x"表示浓度为2700nM)。获得的数据描述于图7。
实施例9
将CD45和HLA A2阳性骨髓瘤靶细胞系U266与来自健康捐献者的HLA A2阴性T细胞(单核细胞耗尽的PBMC)，以及构建体42和55的组合一起孵育。T细胞刺激功能被对HLA A2(编号4)或CD45(编号46)具有特异性的单链构建体封闭。通过分析单独的构建体42和45，或分析针对CD3的单链scFv构建体(编号36)来检测T细胞刺激功能的互补。通过ELISA技术测量T细胞产生的IL2，并将PHA-L用作对照。除非另有说明，构建体的浓度为27nM。("9x"表示浓度为243nM，"100x"表示浓度为2700nM)。获得的数据描述于图8。
以上实施例的结果清楚地表明，两种构建体(42+45)或(42+55)首先必须结合其在单个细胞表面上的配体，以便随后互补出T细胞衔接功能。
实施例10
在VLCD3-scFvHLA A2(27 nMol)或VH-scFvCD45(27 nMol)或这两种构建体的组合(分别为27 nMol)存在下，使用基于流式细胞术的技术测定HLA A2阴性T细胞(单核细胞耗尽的PBMC)对CD45和HLA A2阳性骨髓瘤靶细胞系U266的裂解。通过凋亡的U266细胞除以总U266细胞来计算裂解百分比，并减去背景细胞凋亡。获得的数据描述于图9。
实施例11
作为最终的双元构建体的部分，设计了两种多肽，其分别由抗原-结合单链可变片段(scFv)以及T细胞-激活抗-CD3抗体的可变轻链(VL)或可变重链(VH)结构域组成(图10)。当这两种多肽结合单个细胞表面上其各自的抗原，所述VL和VH结构域彼此相互作用而重构最初的抗-CD3结合位点。如此准确形成的三特异性异源二聚体衔接并激活T细胞以用于破坏肿瘤细胞。
当T淋巴细胞遭遇已经与所述两种不同多肽一起孵育的靶细胞时，该方案在体外被完全证实。作为原理的证明，主要组织相容性抗原HLA-A2和造血谱系标志物CD45被靶向为第一和第二抗原，二者均表达于U266骨髓瘤细胞、来自T细胞谱系的前淋巴细胞白血病(T-PLL)患者的原发性细胞和THP-1急性骨髓白血病原始细胞(图11)。由于以上所述的VL/VH相互作用，当前的三特异性异源二聚体能有效刺激T细胞分泌白介素-2(IL-2)(图11a)并在纳摩尔级浓度下裂解标记的肿瘤细胞(图11b)，细胞毒性效力非常类似于双特异T细胞-激活抗体，其被用作阳性对照(图11A，左图)，Mack,1995,Proc Natl Acad Sci92,7021-7025。当所述多肽被彼此分开添加时，它们没有诱导T淋巴细胞裂解靶细胞。这些结果与结构数据一致，表明VH和VL结构域二者均为赋予针对靶抗原的足够亲和力所必需的(图11A,B)，Colman,1987,Nature326,358-363；Amit,1986,Science233,747-753。此外，这些结果揭示，可能的VH或VL臂同源二聚化产生了可忽略的可测量生物效应。
为了证明对于VH/VL异源二聚化的发生，所述两种分子必需首先结合其在靶细胞表面的抗原，使用对HLA-A2和CD45具有特异性的单链可变片段来封闭在靶标上各自的表位。如图11c所示，当这些抑制剂过量存在时，其以剂量依赖的方式阻止了所述两种多肽激发T细胞。而且，当靶细胞被省略(数据未显示)或当靶细胞被探测为仅表达CD45时(RAJI细胞,图11D)或均无靶分子(KMS-12-BM,图11D)时，T细胞没有得到刺激。
实施例12
对于概念的体内证明，采用了同种异体不匹配的干细胞移植模型，其中患者的残余白血病细胞和造血细胞(均为HLA-A2和CD45-阳性)必需清除，以给予同种异体捐献者干细胞(HLA-A2-阴性，CD45-阳性)机会来植入和重建造血作用(参见图2)。为了检测该二元构建体的特异性，使用基本上在所有的有核细胞上均表达人HLA-A2转基因的免疫缺陷型小鼠，探讨HLA-A2-阳性但CD45-阴性的小鼠组织是否会受到间接损伤。在有或没有来自HLA-A2-阴性捐献者的CD8 T淋巴细胞的情况下，经腹腔注射THP-1细胞，其被挑选为对巨细胞病毒(CMV)具有特异性以避免人抗-鼠免疫反应。在没有接受所述多肽的小鼠体内和用单独分子类型或两种多肽组合但无T细胞处理的小鼠中迅速产生了腹腔内肿瘤。在所有情况下，3-4周内发展出致命的转移性疾病(图12A)。对比鲜明的是，所有用T细胞处理并重复注射两种多肽的荷瘤小鼠存活至第31天实验结束时，尽管在注射位置处有明显的肿瘤。这些结果明确显示，所述二元构建体确实重新定向了T细胞，而与其对在体内同时表达两种靶分子(HLA-A2和CD45)的肿瘤细胞的特异性无关。另外，募集T细胞的针对HLA-A2的双特异抗体，将通过重新定向针对所有HLA-A2阳性小鼠组织的T细胞而引起严重破坏。同样，CD45-结合双特异抗体将介导所有造血细胞的裂解，包括捐献者的THP-1白血病原始细胞和T细胞。然而，在我们的实验安排中，将HLA-A2-特异性多肽注射到HLA-A2转基因动物没有导致明显的毒性。
为了进一步检测对旁邻细胞的可能毒性，我们进行了对于THP-1细胞以及HLA-A2-阴性但CD45-阳性单核细胞的高度灵敏的细胞凋亡分析，后者代表健康旁邻细胞隔区。如图12B所示，我们在THP-1细胞中观察到半胱天冬酶-3激活，在相同的孔中用所述多肽或双特异阳性对照和捐献者T细胞的组合处理的单核细胞中没有观察到所述激活。与T细胞和单种多肽一起培养的THP-1细胞没有受到影响。这些观察结果再次清楚地表明，仅在双抗原阳性靶细胞群中引起细胞凋亡，而HLA-A2-阴性旁邻细胞则得以幸免。这些实验模型非常准确地模拟了具有HLA-不匹配的干细胞移植物的白血病患者的临床情况。使用特定的HLA分子和CD45的组合方法目的在于，通过重新定向捐献者的针对骨髓和淋巴起源的白血病原始细胞的T细胞来促进期望的移植物抗白血病作用。
实施例13
为了在实体瘤中试验，我们将该组合方法用于上皮细胞粘附分子(EpCAM)和上皮生长因子受体(EGFR)抗原。两种抗原均在各种肿瘤中过表达且已经在临床II和III期试验中得到广泛研究。EGFR的表达与细胞增殖密切相关，而EpCAM存在于基本上所有单层上皮基底侧的表面且最近发现其作用如同Wnt通路中的信号转导蛋白，Maetzel,2009,Nat CellBiol 11,162-171。如图13a所示，所述两种多肽诱导了从共孵育的捐献者淋巴细胞释放干扰素-γ(IFNγ)，并且在纳摩尔级浓度下介导了双阳性癌细胞系COLO-206F的细胞凋亡(图13a,b)，但仅在当组合给予且不单独用其中一部分时。作为神经上皮组织的后代，黑素瘤细胞系FM-55缺少EpCAM，因而其对所述多肽具有完全的抗性(图13a,b)。尽管EGFR和EpCAM的表达在增殖性癌细胞上广泛重叠，但非增殖性上皮细胞，例如，分别仅表达EGFR或EpCAM抗原的肝和胰的非增殖性上皮细胞，应更不易于于受到双交叉的攻击或免受双交叉的攻击。明显地，肝和胰的毒性在临床试验上已经针对高亲和力的单克隆EpCAM抗体做了剂量限制(对于综述可参见，Munz,2010,Can Cell Int 10:44)。
实施例14
使用不同多肽的组合，靶向不同人细胞系上不同的细胞表面抗原，通过广泛的体外实验进一步证明了双功能互补策略。
将HLA A2阳性人肿瘤细胞系FM-55(骨髓瘤)、Colo-206F(结肠癌)和OVCAR(卵巢癌)与来自健康捐献者的HLA-A2阴性PBMC、针对HLA-A2的多肽(CD3(VL)-HLA-A2(VH-VL))和靶向CEA(CD3(VH)-CEA(VH-VL))、EGFR(CD3(VH)-EGFR(VH-VL))或Her2(CD3(VH)-Her2(VH-VL))的第二多肽一起孵育。通过ELISA技术测量淋巴细胞产生的IL2或IFN-γ。这些数据表明，(i)抗原、抗原信号的具体组合可表达于各种来源(皮肤、神经上皮、内脏和卵巢组织)的癌症，(ii)运用我们的双功能互补策略，采用对该抗原信号具有特异性的一组多肽可接近所述抗原信号。获得的数据描述于图14、15和16。
实施例15
为了证明该功能结构域的可替换性，将一组多肽的片段F1和F2彼此互换，保留其用于精确恢复初始抗体结构域的特异性互补能力以衔接T细胞。因此，使用针对CD45和HLA-A2靶抗原的该组多肽。针对CD45的多肽具有作为片段F1的CD3(VL)，针对HLA-A2的多肽具有作为片段F2的CD3(VH)。以不同量将CD45和HLA-A2阳性骨髓瘤细胞系U266与来自健康捐献者的HLA-A2阴性T细胞以及针对CD45(CD3(VL)-CD45(VH-VL))和HLA-A2(CD3(VH)–HLA-A2(VH-VL))的多肽一起孵育。通过反应性IFNγ产生评估了T细胞衔接作用，而IFNγ产生通过ELISA技术测量。在没有任何多肽的实验情况下没有发现IFNγ产生。获得的数据描述于图17。
实施例16
通过靶向一组已经被用作癌症的抗体治疗靶标的抗原(EGFR、EpCAM和Her2)来进一步检测双功能互补策略(Her2是乳腺癌中曲妥珠单抗的靶标，EGFR是结肠直肠癌中西妥昔单抗的靶标，而EpCAM是用于肿瘤性腹水治疗的Catumazumab的靶标)。将EGFR、EpCAM和Her2阳性细胞(Colo-206F、CX-1和OVCAR)与来自健康捐献者的PBMC以及针对EGFR(CD3(VH)-EGFR(VH+VL))、EpCAM(CD3(VL)-EpCAM(VH+VL))和Her2(CD3(VH)-Her2(VH+VL))的多肽的组合一起孵育。淋巴细胞刺激作用的互补通过反应性IFNγ产生来评估，而IFNγ产生通过ELISA技术进行测量。在没有任何多肽的实验情况下没有发现IFNγ产生。获得的数据描述于图18和19。
实施例17
为了检测具有紧密临床相关性的抗原组合，使用CD45和CD138组合来靶向人多发性骨髓瘤(MM)细胞。大多数人MM细胞是CD45和CD138阳性的。针对CD45的T细胞衔接双特异抗体会杀死患者的所有造血细胞，针对CD138的T细胞衔接双特异抗体会引起严重副作用，因为其表达于多种正常组织(胃肠道的上皮细胞、内皮细胞、滋养层细胞和腺细胞，The Human Protein Atlas,Version:10.0,Atlas更新于:2012-09-12)。相比之下，CD45和CD138组合仅见于浆细胞和MM细胞，因此其为用于靶向治疗方法的良好抗原信号。将CD45和CD138阳性人多发性骨髓瘤细胞系AMO-1与来自健康捐献者的PBMC以及针对CD45(CD3(VL)-CD45(VH+VL))和CD138(CD3(VH)-CD138(VH+VL))的多肽的组合一起孵育。淋巴细胞刺激作用的互补通过反应性IFNγ产生来评估，而IFNγ产生通过ELISA技术进行测量。在具有单种多肽或没有任何多肽的实验情况下没有发现IFNγ产生。获得的数据描述于图20。
实施例18
双功能互补策略的其他应用是靶向细胞表面上的一种抗原并杀死单抗原阳性肿瘤细胞。具有功能性抗CD3结合位点的T细胞募集双特异抗体的主要缺点是，由非特异性T-细胞激活和细胞因子释放引起的严重副作用(Linke,R.et al.Catumaxomab:clinical development and futuredirections.MAbs 2,129-136(2010))。该双功能互补策略的优势在于，具有T-细胞激活抗CD3功能结构域的抗体仅在靶细胞上被恢复。没有靶细胞，就不存在T-细胞激活结构域。将CD45和CD138阳性人多发性骨髓瘤细胞AMO-1和U266与来自健康捐献者的PBMC以及针对单个靶抗原，即CD138(CD3(VH)-CD138(VH+VL)+CD3(VL)-CD138(VH+VL))或CD45(CD3(VH)–CD45(VH+VL)+CD3(VL)–CD45(VH+VL))的多肽的组合一起孵育。淋巴细胞刺激作用的互补通过反应性IFNγ产生来评估，而IFNγ产生通过ELISA技术进行测量。在具有单种多肽或没有任何多肽的实验情况下没有发现IFNγ产生。获得的数据描述于图21和22。在图23中通过使用靶向靶抗原A1上两个不同表位(上部)或相同表位(下部)的一组多肽，描述了单抗原方法。
实施例19
本实施例证明，所述功能互补策略可更精密地用于定向的载荷递送，且其不一样的效应方式可能杀死靶细胞。通过在靶标上的一组结合多肽的F1和F2片段互补，新形成的抗体结合位点可结合对其有特异性的任何分子。为了将HIS-标记的载荷精确引导至靶细胞，使用了抗-HIS(6-组氨酸)-抗体的VH和VL片段。多肽1(抗His(VL)-CD45(VH-VL)和多肽2(抗His(VH)-HLA-A2(VH-VL)同时结合其特异性靶抗原CD45和HLA-A2后，6-组氨酸结合位点在靶标上互补形成，该6-组氨酸结合位点能以高亲和力结合组氨酸标记的载荷。在该实施例中给出的载荷为HIS-标记的毒素。将CD45和HLA-A2阳性细胞THP-1与组氨酸(His)-标记的产气荚膜梭菌微小毒素组分Ia(图24)或组氨酸(His)-标记的志贺毒素亚基A(图25,26)，联合针对CD45(抗His(VL)-CD45(VH-VL))和HLA-A2(抗His(VH)-HLA-A2(VH-VL))的多肽一起孵育。通过使用分析测量细胞活力来评估His-标记的毒素结合的互补和随后的靶细胞杀伤。在所用多肽的最高浓度(80nM)下，相比单种多肽，在两种多肽组合的实验情况下发现了测量为细胞活力降低的明显不同的靶细胞杀伤。
实施例20
为了进一步证明双功能互补策略的多功能性、灵活性和可替换性，使用抗-洋地黄毒苷抗体的VH和VL片段鉴别和标记具有洋地黄毒苷-标记的HRP(辣根过氧化物酶)的双抗原阳性细胞。将EGFR和EpCAM阳性Colo-206F细胞与针对EGFR(抗Dig(VH)-EGFR(VH+VL))和EpCAM(抗Dig(VL)-EpCAM(VH+VL))的多肽一起孵育。使用标准ELISA试剂盒(InvitrogenTM)，通过测量过氧化酶活性来评估洋地黄毒苷-HRP标记Colo-206F细胞所显示的功能结构域抗-洋地黄毒苷的精确互补。相比单种多肽，在两种多肽组合的实验情况下发现了Dig-HRP标记的靶细胞中明显的差异。获得的数据描述于图27。
实施例21
使用人白细胞抗原(HLA)作为双抗原限制的双功能互补作用的一个臂，通过将多肽的功能结构域与抗-HLA-Cw6抗体的VH和VL片段互换，进一步证实了该单体型策略。将HLA-Cw6阳性原发性患者PBMC与来自健康捐献者的HLA-Cw6阴性PBMC、针对CD45(CD3(VL)–CD45(VH-VL))和HLA-Cw6(CD3(VH)–HLA-Cw6(VH-VL))的多肽一起孵育。通过ELISA技术测量淋巴细胞产生的IFNγ。这些数据证明，可通过仅仅将靶向结构域(抗HLA-A2，图5、7-9、11-12)与另一靶向结构域(抗HLA-Cw6)互换来靶向具有除HLA-A2外的其他单体型的患者造血细胞。获得的数据描述于图28。
实施例22
使用新分离的原发性患者癌细胞和已经在临床或临床试验中用于癌症治疗的抗原靶标(EGFR、EpCAM、CEA和Her2)，在体外的患者分析中进一步证实了该双抗原诱导的双功能互补策略。患有转移性胰腺癌的48岁男性患者的恶性细胞与患者自己的外周血淋巴细胞以及针对EGFR(CD3(VH)-EGFR(VH+VL))、EpCAM(CD3(VL)-EpCAM(VH+VL))、Her2(CD3(VH)-Her2(VH+VL))、CEA(CD3(VH)-CEA(VH-VL))和HLA-A2(CD3(VL)-HLA-A2(VH-VL))的多肽的组合一起孵育。淋巴细胞刺激作用的互补通过反应性IFNγ产生来评估，而IFNγ产生通过ELISA技术进行测量。在没有任何多肽的实验情况下没有发现IFNγ产生。这些数据证明了该策略使用患者自己的免疫细胞来靶向和杀死其恶性转化的细胞的潜力。获得的数据描述于图29。
实施例23
将高度富集的CD3/CD8阳性CMV限制性T-细胞群用于显示，通过该互补策略任何T细胞(无论其特异性)均可用作效应细胞来杀死双抗原阳性肿瘤细胞。以不同的量将CD45和HLA-A2阳性U266和THP-1细胞与来自HLA-A2阴性健康捐献者的巨细胞病毒(CMV)特异性T-细胞以及针对CD45(CD3(VH)-CD45(VH-VL))和HLA-A2(CD3(VL)-HLA-A2(VH-VL))的多肽一起孵育。将双特异串联scFv(CD3(VH-VL)xHLA-A2(VH-VL))-抗体用作阳性对照。通过用ELISA技术测量的反应性IFNγ产生评估了T细胞衔接作用。在具有单种多肽或没有任何多肽的实验情况下没有发现IFNγ产生。获得的数据描述于图30。将来自相同的冷冻等份批次的细胞，CMV特异性T-细胞和THP-1细胞用于体内鼠科动物模型(图12A)。
实施例24
该实施例描述了运用该双功能互补策略来靶向过敏原/自体免疫特异性B-细胞克隆的潜力。通过使用合成的过敏原作为靶向部分，连接有过敏原的多肽将特异性结合该过敏原特异性B-细胞克隆表面上表达的其克隆型B-细胞受体。该二元策略的第二臂将使用B-细胞特异性多肽(CD19、CD20、CD38、CD138)，将随后的效应结构域的互补伴随此后的靶细胞杀伤限制于过敏原特异性B-细胞克隆。该策略的最终目的是，消除引起过敏或自体免疫疾病的B细胞克隆(图31上图)，同时使具有其他特异性的B细胞或除B细胞以外的细胞(例如肥大细胞或嗜碱性细胞)得以幸免，其通过Fc-受体结合负责该疾病的抗体(图31下图)。
在本说明书、权利要求书和/或附图中公开的本发明特征可单独地或以其任何组合地作为以其各种形式实现本发明的材料。

Claims (46)

1.一组多肽，包含：
第一多肽P1，包含
(i)靶向部分T1，
其中所述靶向部分T1特异性结合抗原A1，和
(ii)功能结构域F的片段F1，
其中相对于所述结构域F的功能，所述片段F1本身和所述多肽P1本身均不具有功能，
以及
第二多肽P2，包含
(i)靶向部分T2，
其中所述靶向部分T2特异性结合抗原A2，和
(ii)所述功能结构域F的片段F2，
其中相对于所述结构域F的功能，所述片段F2本身和所述多肽P2本身均不具有功能，
其中所述抗原A1不同于所述抗原A2，
其中其表面具有抗原A1和A2的基底不存在时，所述多肽P1和所述多肽P2彼此没有结合，且其中当所述多肽P1的片段F1和所述多肽P2的片段F2二聚化时，所得的二聚体相对于所述结构域F的功能具有功能性。
2.根据权利要求1所述的一组多肽，其中其细胞表面携带抗原A1和A2的细胞不存在时，所述多肽P1和所述多肽P2彼此没有结合。
3.根据权利要求1或2所述的一组多肽，其中其细胞表面携带抗原A1和A2的细胞诱导所述多肽P1的片段F1和所述多肽P2的片段F2二聚化，而其细胞表面不携带抗原A1和A2的细胞不诱导所述多肽P1的片段F1和所述多肽P2的片段F2二聚化。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的一组多肽，其中所述基底或细胞不存在时，所述多肽P1和P2彼此的解离常数KD范围为10-8M至10-2M、10-7M至10-3M或10-6M至10-3M；和/或所述基底或细胞存在时，所述多肽P1和P2彼此的解离常数KD范围为10-6M以下、10-7M以下、10-8M以下或10-9M以下。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的一组多肽，其中所述抗原A1和/或所述抗原A2是表达于肿瘤的细胞表面或肿瘤的祖细胞/前体细胞表面的抗原。
6.根据权利要求5所述的一组多肽，其中所述抗原表达于血液肿瘤的细胞表面或非血液肿瘤的细胞表面。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的一组多肽，其中抗原A1和抗原A2的组合仅见于癌细胞上，而未见于非癌细胞上。
8.根据权利要求7所述的一组多肽，其中抗原A1和抗原A2的组合对于某种癌症的癌细胞具有特异性。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的一组多肽，其中所述抗原A1为MHC抗原；
和/或所述抗原A2为对某种细胞类型或细胞谱系具有特异性的抗原。
10.根据权利要求9所述的一组多肽，其中所述MHC抗原是HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ、HLA-DR或HLA-DM中任一个的等位基因变体。
11.根据权利要求9或10所述的一组多肽，其中所述MHC抗原是MHC I类分子的等位基因变体。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的一组多肽，其中所述MHC抗原是选自以下的等位基因变体：HLA-A2、HLA-Cw6、HLA-A1、HLA-A3、HLA-A25、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B35、HLA-B44、HLA-Cw3、HLA-Cw4和HLA-Cw7。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的一组多肽，其中所述对某种细胞类型或细胞谱系具有特异性的抗原选自：CD45；CD34；CD33；CD138；CD15；CDla；CD2；CD3；CD4；CD5；CD8；CD20；CD23；CD31；CD43；CD56；CD57；CD68；CD79a；CD146；表面活性蛋白；突触泡蛋白；CD56；CD57；烟碱型乙酰胆碱受体；肌特异性激酶MUSK；电压门控钙通道(P/Q-型)；电压门控钾通道(VGKC)；N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMD A)；TSH；两性蛋白；HepPar-1；神经节苷脂GQ1B、GD3或GM1；以及血型糖蛋白-A。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的一组多肽，其中所述抗原A1和A2中的任一种选自：
HLA-A2；HLA-Cw6；EpCAM；CD45；Her2；EGFR；CD138；CEA；CD19；E-钙粘蛋白；Ca-125；Her-2/neu；巨大囊肿病液体蛋白；BCA-225；CA19-9；CD117；CD30；上皮抗原BER-EP4、上皮膜抗原和上皮相关的抗原MOC-31；上皮生长因子受体HERl；血小板衍生的生长受体PDGFR-α；黑素瘤相关的标志物/Mart1/Melan-A；CD133；TAG72；以及B细胞表面上的克隆型抗体。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的一组多肽，其中
(i)所述抗原A1和A2之一是EpCAM，而另一种是EGFR、HER2/neu、CD10、VEGF-R或MDR；
(ii)所述抗原A1和A2之一是MCSP，而另一种是促黑色素释放素或EpCAM；
(iii)所述抗原A1和A2之一是CA125，而另一种是CD227；
(iv)所述抗原A1和A2之一是CD56，而另一种是CD140b或GD3神经节苷脂；
(v)所述抗原A1和A2之一是EGFR，而另一种是HER2；
(vi)所述抗原A1和A2之一是PSMA，而另一种是HER2；
(vii)所述抗原A1和A2之一是唾液酸化路易斯寡糖，而另一种是EGFR；
(viii)所述抗原A1和A2之一是CD44，而另一种是ESA、CD24、CD133、MDR或CD117；
(ix)所述抗原A1和A2之一是CD34，而另一种是CD19、CD79a、CD2、CD7、HLA-DR、CD13、CD117、CD33或CD15；
(x)所述抗原A1和A2之一是CD33，而另一种是CD19、CD79a、CD2、CD7、HLA-DR、CD13、CD117或CD15；
(xi)所述抗原A1和A2之一是MUC1，而另一种是CD10、CEA或CD57；
(xii)所述抗原A1和A2之一是CD38，而另一种是CD138；
(xiii)所述抗原A1和A2之一是CD24，而另一种是CD29或CD49f；
(xiv)所述抗原A1和A2之一是碳酸酐酶IX，而另一种是水通道蛋白-2；
(xv)所述抗原A1和A2之一是HLA-A2，而另一种是EpCAM；
(xvi)所述抗原A1和A2之一是HLA-A2，而另一种是CD45；
(xvii)所述抗原A1和A2之一是HLA-A2，而另一种是EGFR；
(xviii)所述抗原A1和A2之一是HLA-A2，而另一种是Her2；
(xix)所述抗原A1和A2之一是HLA-A2，而另一种是CEA；
(xx)所述抗原A1和A2之一是EpCAM，而另一种是CEA；
(xxi)所述抗原A1和A2之一是CD45，而另一种是CD138；
(xxii)所述抗原A1和A2之一是EGFR，而另一种是CEA；
(xxiii)所述抗原A1和A2之一是Her2，而另一种是CEA；或
(xxiv)所述抗原A1和A2之一是CD19，而另一种是B细胞表面上的克隆型抗体。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的一组多肽，其中所述靶向部分T1和/或T2包含免疫球蛋白模块；或
其中所述靶向部分T1和/或T2分别包含所述抗原A1或抗原A2的适体或天然配体。
17.根据权利要求16所述的一组多肽，其中所述靶向部分T1包含免疫球蛋白模块I1，所述免疫球蛋白模块I1包含相连的VH结构域和VL结构域或者包含美洲驼抗体、骆驼抗体或鲨鱼抗体的可变结构域VHH；和/或
所述靶向部分T2包含免疫球蛋白模块I2，所述免疫球蛋白模块I2包含相连的VH结构域和VL结构域或者包含美洲驼抗体、骆驼抗体或鲨鱼抗体的可变结构域VHH。
18.根据权利要求17所述的一组多肽，其中所述免疫球蛋白模块I1包含抗体的scFv(单链可变片段)、Fab或F(ab')2或完全抗体；和/或
所述免疫球蛋白模块I2包含抗体的scFv(单链可变片段)、Fab或F(ab')2或完全抗体。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的一组多肽，其中所述免疫球蛋白模块包含选自以下的V结构域：
(i)抗-HLA-A2抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:78和79(CDRs1和3)以及DAS(CDR 2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:75-77(CDRs1-3)；
(ii)抗-HLA-Cw6抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:83和84(CDRs1和3)以及DDS(CDR 2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:80-82(CDRs1-3)；
(iii)抗-EpCAM抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:88和89(CDRs1和3)以及WAS(CDR 2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:85-87(CDRs1-3)；
(iv)抗-Her2抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:93和94(CDRs1和3)以及SAS(CDR2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:90-92(CDRs1-3)；
(v)抗-EGFRl抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:98和99(CDRs1和3)以及DAS(CDR2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:95-97(CDRs1-3)；
(vi)抗-CEA抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:103和104(CDRs1和3)以及SAS(CDR2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:100-102(CDRs1-3)；
(vii)抗-CD45抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:107和108(CDRs1和3)以及LAS(CDR 2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:105和106(CDRs1和2)以及CDR3或SEQ ID NOS:132-134(CDRs1-3)；
(viii)抗-CD138抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:112和113(CDRs1和3)以及YTS(CDR 2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:109-111(CDRs1-3)；以及
(ix)抗-CD19抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:158和159(CDRs1和3)以及DAS(CDR2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:155-157(CDRs1-3)。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的一组多肽，其中所述免疫球蛋白模块包含选自以下的V结构域：
(i)抗-HLA-A2抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:52，所述VH结构域包含SEQ ID NO:51；
(ii)抗-HLA-Cw6抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:54，所述VH结构域包含SEQ IDNO:53；
(iii)抗-EpCAM抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:56，所述VH结构域包含SEQ ID NO:55；
(iv)抗-Her2抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:58，所述VH结构域包含SEQ ID NO:57；
(v)抗-EGFRl抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:60，所述VH结构域包含SEQ ID NO:59；
(vi)抗-CEA抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:62，所述VH结构域包含SEQ ID NO:61；
(vii)抗-CD45抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:64，所述VH结构域包含SEQ ID NO:63；以及
(viii)抗-CD138抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:66，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:65；
(ix)抗-CD19抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:153，所述VH结构域包含SEQ ID NO:152。
21.根据权利要求16-20中任一项所述的一组多肽，其中所述免疫球蛋白模块包含V结构域，所述V结构域包含SEQ ID NOS:67-74和154中的任一序列。
22.根据权利要求1-16中任一项所述的一组多肽，其中所述靶向部分T1和T2中任一种包含能结合B细胞表面上的克隆型抗体的过敏原或底物。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的一组多肽，其中所述功能结构域F是或者包含免疫球蛋白模块、或荧光分子、或能介导生物发光的分子。
24.根据权利要求23所述的一组多肽，其中所述功能结构域F是抗体的Fv(可变片段)或scFv(单链可变片段)。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的一组多肽，其中所述功能结构域F是特异性结合载体分子或亲和标签的结构域。
26.根据权利要求25所述的一组多肽，其中所述载体分子是肽或碳水化合物分子。
27.根据权利要求26所述的一组多肽，其中所述亲和标签选自：FLAG-标签、myc-标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-标签、血球凝集素(HA)-标签、多组氨酸(His)-标签、洋地黄毒苷(DIG)-标签和麦芽糖结合蛋白(MBP)-标签。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的一组多肽，其中所述功能结构域F是特异性结合放射性化合物的结构域、特异性结合毒素分子的结构域、特异性结合荧光分子的结构域，或特异性结合能介导生物发光的分子的结构域，所述毒素分子本身不能穿透人细胞的细胞膜而是经与人细胞的细胞膜结合而内化入所述细胞中。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的一组多肽，其中所述片段Fl包含抗体的VL结构域，且所述片段F2包含相同抗体的VH结构域；或者其中所述片段Fl包含抗体的VH结构域，且所述片段F2包含相同抗体的VL结构域。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的一组多肽，其中所述片段Fl包含抗-CD3、抗-His或抗-DIG抗体的VL结构域，且所述片段F2包含相同抗体的VH结构域，或者其中所述片段Fl包含抗-CD3、抗-His或抗-DIG抗体的VH结构域，且所述片段F2包含相同抗体的VL结构域。
31.根据权利要求23-30中任一项所述的一组多肽，其中所述免疫球蛋白模块包含选自以下的V结构域：
(i)抗-CD3抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:18-20(CDRs1-3)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:15-17(CDRs1-3)；
(ii)抗-CD3抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:24-26(CDRs1-3)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:21-23(CDRs1-3)；
(iii)抗-CD3抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:30-32(CDRs1-3)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:27-29(CDRs1-3)；
(iv)抗-CD3抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:36和37(CDRs1和3)以及DTS(CDR2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:33-35(CDRs1-3)；
(v)抗-CD3抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:41和42(CDRs1和3)以及YTN(CDR2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:38-40(CDRs1-3)；以及
(vi)抗-His抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:46和47(CDRs1和3)以及KVS(CDR2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:43-45(CDRs1-3)；
(vii)抗-DIG抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NOS:50和131(CDRs1和3)以及YSS(CDR2)，所述VH结构域包含SEQ ID NOS:48和49(CDRs1和2)以及A(CDR3)。
32.根据权利要求23-31中任一项所述的一组多肽，其中所述免疫球蛋白模块包含选自以下的V结构域：
(i)抗-CD3抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:2，所述VH结构域包含SEQ ID NO:1；
(ii)抗-CD3抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:4，所述VH结构域包含SEQ ID NO:3；
(iii)抗-CD3抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:6，所述VH结构域包含SEQ ID NO:5；
(iv)抗-CD3抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:8，所述VH结构域包含SEQ ID NO:7；
(v)抗-CD3抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:10，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9；以及
(vi)抗-His抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:12，所述VH结构域包含SEQ ID NO:11；
(vii)抗-DIG抗体的包含VL结构域和/或VH结构域的V结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:14，所述VH结构域包含SEQ ID NO:30。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的一组多肽，其中所述多肽P1和P2之一是或者包含选自SEQ ID NOS:114-129和197的氨基酸序列。
34.权利要求1-33中任一项所述的一组多肽，其用于治疗患有癌症和/或肿瘤的患者，或者用于患有癌症和/或肿瘤的患者的诊断应用。
35.根据权利要求34所述的一组多肽，其用于治疗患有癌症和/或肿瘤且在接受同种异体组织或细胞移植或打算接受这类移植的患者，或者用于患有癌症和/或肿瘤且在接受或打算接受同种异体组织或细胞移植的患者的诊断应用。
36.根据权利要求34或35所述的一组多肽，其中将该组多肽给予所述患者。
37.权利要求1-33中任一项所述的一组多肽，用于治疗或预防选自以下的病症：
(i)自体免疫病症；以及
(ii)超敏症。
38.根据权利要求37所述的一组多肽，其中所述自体免疫病症选自：
(i)过敏症；
(ii)多发性硬化症；
(iii)牛皮癣；
(iv)全身性红斑狼疮；
(v)干燥综合征；
(vi)风湿性关节炎；
(vii)特发性血小板减少紫癜；
(viii)糖尿病；
(xi)血管炎；
(x)克罗恩病；以及
(xi)淀粉样变性。
39.根据权利要求37所述的一组多肽，其中所述超敏症是过敏症(根据库姆斯和盖尔氏分类的I型超敏反应)、抗体依赖性细胞毒性反应(II型超敏反应)、免疫复合物病(III型超敏反应)、迟发型超敏症(IV型超敏反应)或受体介导的自体免疫病(V型超敏反应)。
40.根据权利要求39所述的一组多肽，其中所述自体免疫病症或超敏症与同种异体干细胞移植同时发生或由其所诱导。
41.根据权利要求1-33中任一项所述的一组多肽，其用于治疗或预防传染性疾病。
42.核酸分子或一组核酸分子，其编码权利要求1-33中任一项所述的一组多肽或该组多肽中的多肽之一。
43.根据权利要求42的核酸分子或一组核酸分子，其包含SEQ IDNOS:135-150和196中任一序列所表示的核苷酸序列。
44.载体，其包含权利要求42或43所述的核酸分子的核苷酸序列或者权利要求42或43所述的一组核酸分子中的核酸分子之一的序列。
45.药物组合物，其包含权利要求1-33中任一项所述的一组多肽、或者权利要求42或43所述的核酸分子/一组核酸分子、或者权利要求44所述的载体，其中优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
46.试剂盒，其包含权利要求1-33中任一项所述的一组多肽、权利要求42或43所述的核酸分子/一组核酸分子、或者权利要求44所述的载体。
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