CN108085333B - 一种延缓薯类植物生理性变质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种延缓薯类植物生理性变质的方法。本发明首次揭示了溶菌酶对于延缓薯类植物采后生理性变质的作用。从而可将溶菌酶应用于薯类植物的改良育种。

Description

一种延缓薯类植物生理性变质的方法
技术领域
本发明属于植物学领域，更具体地，本发明涉及一种延缓薯类植物生理性变质的方法。
背景技术
薯类植物主要指具有可供食用块根或地下茎的一类陆生作物，其产品器官是块根和块茎，生长在土壤中。
常见的薯类有木薯、甘薯、马铃薯、芋类、山药等。薯类有明显的营养优势。薯类食物能量低、水分高，含较多的碳水化合物。薯类基本不含脂肪，其脂肪含量仅为0.2％，是低脂肪食物。薯类蛋白质含量一般在1.1-2.2％之间，是不完全蛋白质，但赖氨酸的含量丰富，正好补充谷物所缺乏的赖氨酸。薯类含丰富的膳食纤维，为0.7-1.6％，是大米的1.7～4倍。膳食纤维可增加饱腹感，防止能量过剩，增加胃肠蠕动，通便防癌，预防心血管疾病、糖尿病和胆石症。薯类还含有多种维生素和矿物质。所以，薯类被公认为是兼有主食和蔬菜特性的天然健康食材是较为健康的食品。
木薯(Manihot esculenta Crantz)是热带重要薯类作物，具有高产、耐瘠薄等特性，在热带地区的发展中国家，木薯是最大的粮食作物。
但是，收获后薯类植物的储藏根不耐贮藏，易变质。例如，木薯储藏根淀粉含量高，其收获后的2-3天就发生采后生理性变质(PPD)，块根褐变，造成储藏根货架期缩短及淀粉品质下降。据统计每年由于木薯采后生理性变质导致的损失都在收获量的5％以上，直接经济损失达2亿元以上。对于少量的储藏根，在收获后可通过立即封蜡、套袋或加工成干片来抑制生理性变质，但增加了原材料成本，不适用于规模化木薯加工企业。采收前两周对木薯的茎杆进行修剪可在一定程度上延缓储藏根的采后生理性变质，但会导致储藏根的食用品质和淀粉质量大大降低，限制了该方法的应用。
至今还没有一种行之有效的方法可用于延缓薯类植物生理性变质。因此，找寻延缓薯类植物生理性变质材料和方法，是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种延缓薯类植物生理性变质的方法。
在本发明的第一方面，提供一种延缓薯类植物生理性变质的方法，所述方法包括：在薯类植物中过表达外源的溶菌酶。
在一个优选例中，所述的薯类植物包括(但不限于)：木薯、甘薯、马铃薯、山药、芋。
在另一优选例中，所述的溶菌酶包括：动物来源的溶菌酶或植物来源的溶菌酶；较佳地，所述的溶菌酶是鸡来源的溶菌酶。
在另一优选例中，所述的溶菌酶选自：
(a)如SEQ ID NO:1氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或
(c)与(a)限定的多肽序列有80％(较佳地90％；更佳地95％；更佳地98％)以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述的方法包括：将编码溶菌酶的多核苷酸转入薯类植物，获得转化入所述多核苷酸的薯类植物。在更具体的选例中，所述的方法包括：
(S1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有多核苷酸，其编码溶菌酶；
(S2)将薯类植物的细胞或组织或器官与步骤(S1)中的农杆菌接触，从而使所述的多核苷酸转入薯类植物组织、器官或种子。
在另一优选例中，所述提高植物中溶菌酶的表达方法还包括：
(S3)选择出转入了所述的多核苷酸的植物组织、器官或种子；和
(S4)将步骤(S3)中的植物组织、器官或种子再生成植物。
在本发明的另一方面，提供一种溶菌酶或其编码基因用途，用于延缓薯类植物生理性变质。
在一个优选例中，所述的薯类植物包括(但不限于)：木薯、甘薯、马铃薯、山药、芋。
在另一优选例中，所述的溶菌酶包括：动物来源的溶菌酶或植物来源的溶菌酶；较佳地，所述的溶菌酶是鸡来源的溶菌酶。
在另一优选例中，所述的溶菌酶在薯类植物内还具有选自以下的用途：
提高植物的抗氧化能力；
下调植物中多酚氧化酶的活性；
减少植物中的H2O2的积累程度；
降低植物中的MDA含量；
减少植物储藏根中的超氧自由基(ROS)的积累；和/或
降低植物中香豆素类次生代谢物(如东莨菪苷(Scoplin)和东莨菪素(Scopletin))的含量。
在本发明的另一方面，提供一种植物细胞，该植物细胞是薯类植物来源的细胞，该植物细胞表达外源的溶菌酶。
在一个优选例中，所述的植物细胞不是植物繁殖细胞，也即该植物细胞不能发育生长成为植株。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、维管束特异性启动子P54/1.0的溶菌酶基因表达载体的主要元件的结构示意图，此表达载体整合在pCAMBIA1301载体中。
图2、采后生理性变质(PPD)过程中转基因木薯储藏根溶菌酶表达量。其中，Lys-15，Lys-20，Lys-36为转基因木薯植株。
图3、采后生理性变质(PPD)过程中转基因木薯储藏根多酚氧化酶表达量(左图)和酶活(右图)。
图4、木薯叶片的DAB染色结果。“处理前”显示未经H2O2处理的叶片染色结果；WT：野生型木薯植株(C3)叶片经H2O2处理后的染色结果；Lys-15，Lys-20，Lys-33，Lys-36为转基因植株叶片经H2O2处理后的染色结果。
图5、木薯叶片经H2O2处理后的含量及抗氧化基因酶活。上左图为H2O2含量测定结果；上右图为MDA含量测定结果；下左图为PPO活性测定结果；下右图为SOD活性测定结果。
图6、木薯储藏根随着时间推移的PPD发生过程，测定时间为木薯切片后0～96小时。
图7、木薯储藏根根活性氧探针染色荧光图。
图8、木薯储藏根PPD发生过程中香豆素含量的测定结果。
具体实施方式
本发明人致力于延缓薯类植物采后生理性变质的研究，经过大量的研究和筛选，首次揭示了溶菌酶对于延缓薯类植物采后生理性变质的作用。从而，可将溶菌酶应用于薯类植物的改良育种。
如本文所用，所述的“薯”或“薯类植物”，又称为薯类作物或根茎类作物，是指具有可供食用块根或地下茎的一类陆生作物。主要包括木薯、甘薯、马铃薯、山药、芋类等。
如本文所用，所述的“外源”或“异源”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质之间的关系，或来自不同来源的蛋白质(或核酸)与宿主细胞之间的关系。例如，如果核酸与宿主细胞的组合通常不是天然存在的，则核酸对于该宿主细胞来说是异源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“异源的”。
本发明中，所述的溶菌酶可以包括：动物来源的溶菌酶或植物来源的溶菌酶；较佳地，所述的溶菌酶是鸡来源的溶菌酶鸡来源的溶菌酶。例如，所述的溶菌酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
可应用于本发明的还包括溶菌酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持溶菌酶相同的生物学功能或活性的多肽。溶菌酶片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
任何一种溶菌酶的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，溶菌酶的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的溶菌酶的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长溶菌酶的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长溶菌酶的80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
在本发明中，“溶菌酶”还包括具有与溶菌酶相同功能的、SEQ ID NO:1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
任何与所述的溶菌酶同源性高(比如与SEQ ID NO:1所示的序列的同源性为70％或更高；优选的，同源性为80％或更高；更优选的，同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有溶菌酶相同功能的蛋白也包括在本发明内。
本发明还涉及编码本发明溶菌酶或其保守性变异多肽、衍生物的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
应理解，虽然在本发明的具体实施例中，溶菌酶基因优选获自鸡，但是获自其它物种的与鸡来源的溶菌酶基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。
本发明的溶菌酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。
本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或溶菌酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞。
所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化薯类植物可使用农杆菌转化等方法。对于转化的薯类植物组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得性状发生改变的薯类植物。
本发明提供了所述的溶菌酶或其编码基因的用途，用于延缓薯类植物生理性变质。本发明人发现，通过在薯类植物中表达溶菌酶，可抑制薯类植物体内多酚氧化酶的活性，从而达到延缓储藏根采后生理性变质的目的。
本发明还涉及一种延缓薯类植物生理性变质的方法，该方法包括在所述薯类植物中表达外源的溶菌酶。所述的表达包括“过表达”。
在得知了所述的溶菌酶的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的溶菌酶的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带溶菌酶基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到薯类植物内，并使之表达活性的溶菌酶。
作为本发明的一种实施方式，将编码溶菌酶的基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述溶菌酶的植物组织或器官中，使所述的植物表达溶菌酶。可通过将所述植物组织或器官再生成植物，获得过量表达溶菌酶的植物。
优选的，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：
(1)将外源的溶菌酶的编码基因转入植物器官或组织，获得转化入所述基因的植物组织、器官或种子；和
(2)将步骤(1)获得的转入了外源溶菌酶的编码基因的植物组织、器官或种子再生成植物植株。
作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：
(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有溶菌酶的编码基因；
(s2)将植物组织、器官或种子与步骤(s1)中的农杆菌接触，使溶菌酶的编码基因转入植物，并整合到植物细胞的染色体上；
(s3)选择出转入溶菌酶的编码基因的植物组织、器官或种子；以及
(s4)将步骤(s3)中的植物组织、器官或种子再生成植物。
一些增加溶菌酶基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强溶菌酶基因或其同源基因的表达。或者通过增强子来增强该溶菌酶基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35S启动子，Ubi启动子等。
可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。
本发明还包括利用前述任一种方法获得的薯类植物，所述的薯类植物包括：转入了溶菌酶基因或其同源基因的转基因薯类植物。
本发明还包括利用前述任一种方法获得的、表达溶菌酶的植物细胞，该植物细胞并非是繁殖细胞，其不能再生成植物。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
1、载体构建和植物遗传转化
将Lysozyme(Genbank登录号：P00698.1，插入到表达载体pCAMBIA1301-p54，构建表达载体pC-p54::Lysozyme。pCAMBIA1301-p54为在商品化的pCAMBIA1301基础上，加入了P54/1.0启动子(维管束特异表达)构建而成。pC-p54::Lysozyme表达载体的主要元件的示意图如图1。
溶菌酶(Lysozyme)全长氨基酸序列如下：
MRSLLILVLCFLPLAALGKVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAAKFESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQINSRWWCNDGRTPGSRNLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVSDGNGMNAWVAWRNRCKGTDVQAWIRGCRL(SEQ ID NO:1)
木薯遗传转化：
农杆菌单克隆(抗性YEB)28℃，240rpm，摇菌过夜；取25μL菌液到50mL YEB(抗性)大量培养12-20h至OD600为0.5-1.0；6,000rpm，4℃离心10min，50mL MS培养基清洗一次，再次离心。MS(200mL乙酰丁香酮)悬浮至OD600至1.0，28℃，80rpm，2h，备用。
吸取2mL破碎过滤的悬浮培养液到10mL农杆菌菌液中，共培养45min。移走多余的菌液，将愈伤组织放到无菌滤纸上吸干残留菌液，置于包含100μmol/L乙酰丁香酮的SH固体培养基上，22℃共培养3天。从滤纸上将转化的愈伤组织转移到30mL SH培养基中，反复吸打清洗数次。
将愈伤组织转到含12.5mg/L潮霉素和500mg/L羧苄青霉素的SH培养基中，110rpm，连续光照(～50μmol m-2s-1)培养3天。将愈伤组织继代到含25mg/L潮霉素和500mg/L羧苄青霉素的SH培养基中，110rpm，连续光照(～50μmol m-2s-1)培养，每3天继代一次。
将筛选了2-3周的悬浮培养的抗性愈伤组织转到包含10mg/L潮霉素的体细胞胚胎发生固体培养基(MSN)上，26℃，16h光照培养。
2-4周后，抗性胚愈伤组织形成，从每个抗性愈伤组织簇中选择一些胚愈伤组织进行GUS检测，将阳性愈伤组织转移到包含12.5mg/L潮霉素的胚成熟培养基(CMM)上培养，使其长出子叶胚。将成熟胚转移到茎伸长培养基(CEM)上，2-4周后可以从子叶形胚发育出新芽。
将新茎段转移到MS基本培养基(CBM)上进行快繁。
2、Real time PCR检测
总RNA提取参考植物总RNA提取试剂盒(货号DP437,TIANGEN,Beijing,China)。1μg总RNA在反转录酶ReverTra Ace(货号TRT-101，TOYOBO，Shanghai)作用下于20μl反应体系中合成cDNA，并用于Real time PCR检测。
PCR反应在Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪上进行，20μl反应体系中包括2*SYBRMaster Mix(货号QPK-20，TOYOBO，Shanghai)10μl，cDNA50ng，上游和下游引物各400nmol/L。
Actin基因作为内参。
3、DAB染色
3,3’-diaminobenzidine(DAB)染液浓度为1mg/mL，溶于ddH2O，用NaOH调至pH3.8。木薯离体叶片H2O2处理后，取出叶片浸没于DAB染液，抽真空2次，每次5min。最后置于光下反应过夜。95％乙醇脱色，待脱色完全后拍照。
4、MDA含量测定
叶片膜脂过氧化的程度以丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量来表示。取木薯叶片1g，加入10mL 10％的三氯乙酸(TCA)迅速研成匀浆，然后于12,000rpm离心10min。取2mL上清液，加入2mL 0.6％硫代巴比妥酸(TBA，现用现配)，于沸水浴中反应15min，冰水浴中迅速冷却后测定600、532、450nm处的光吸收值。丙二醛(C)含量按照以下公式计算：
C(nmol/g FW)＝6.45(OD532-OD600)-0.56OD450
5、H2O2含量测定
取木薯叶片或储藏根1g加入10ml 0.1％预冷的TCA溶液，冰浴上研磨，匀浆液12,000rpm离心15min。取1mL上清，添加1mL 100mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.0)，2mL KI(1mol/L)，摇匀，静置10min，390nm测OD值。
根据标准曲线求得H2O2含量。商品化H2O2原液浓度梯度稀释10mol/L→10mmol/L→1mmol/L。
6、酶活检测
(1)SOD酶活检测
取木薯叶片或储藏根1g加入5mL酶提取缓冲液(50mmol/L磷酸缓冲液，1％PVP，1mmol/L EDTA)，冰浴上研磨，匀浆液12,000rpm 4℃离心15min。取上清置冰上。
取玻璃试管进行酶活反应，分别加入：1.8mL酶提取缓冲液，0.3mL 130mmol/L甲硫氨酸溶液，0.3mL 750μmol/L NBT溶液，0.3mL 20μmol/L核黄素，0.3mL上清。其中对照管加缓冲液代替酶液。混匀后，取1支对照管罩上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各管同时置于4000lx日光灯下反应10-20min，当对照管变蓝色，而样品管仍为黄色时，结束反应，测定各管在560nm的吸光度。以遮光的对照管作为空白，分别在560nm波长下测定各管的吸光度，按下式计算SOD活性：
SOD活性＝(OD0-ODS)×VT/OD0×0.5×FW×V1；
其中，SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；
OD0：变蓝色对照管吸光度；
ODS：样品管吸光度；
VT：样液总体积；
V1：测定时样品用量；
FW：样品鲜重。
(2)PPO酶活检测
蛋白提取过程同上，5mL反应体系加入：3.5mL 50mmol/L pH 6.6磷酸钾缓冲液，1mL 0.1mol/L邻苯二酚，0.5mL上清。于410nm波长处以时间扫描方式，在2min内测定吸光度变化。
酶活性的计算以每min内410nm吸光度变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力：
Figure BDA0001152018380000111
7、转基因植株Western Blot检测
十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：用1mL的1×Lammli缓冲液(0.25mol/L pH 6.8Tris，2％十二烷基硫酸钠，10％的甘油，1％β-巯基乙醇，0.05％溴酚蓝)，煮沸10min后以10,000rpm离心5min。使用12％分离胶5％浓缩胶的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶变性胶进行电泳。每个泳道上样量为30μL上清液，室温条件下60V恒压电泳1h，随后增加到120V直到Loading Buffer电泳至胶底部。
8、Western blot检测
Lysozyme蛋白一抗被用于进行检测，每个上样孔加入20μg叶片/储藏根总蛋白，利用SDS-PAGE电泳分离。通过湿式转印法(Mini
Figure BDA0001152018380000112
System，Code：165-8030，Bio-Rad)将蛋白转入PVDF(Amersham HybondTM-P，Code：RPN303F，GE)膜，按照1-StepTM NBT/BCIP(Code：34042，Pierce，USA)的说明进行封闭、杂交、显色操作。
9、CIAT法观察PPD发生过程
大田生长5个月的木薯储藏根收获后，洗净晾干切去两端，远轴端用保鲜膜封口包扎，近轴端暴露于空气中，置于恒温(25℃)恒湿(70％)条件下观察采后生理性变质[ReillyK,Gomez-Vasquez R,Buschmann H,Tohme J Beeching JR.Oxidative stress responsesduring cassava post-harvest physiological deterioration[J].Plant MolecularBiology,2004,56(4):625-641]。该方法为International Center for TropicalAgriculture(CIAT)国际标准。实验节点为：0h、12h、24h、48h、72h和96h。
10、储藏根荧光染料染色
木薯储藏根ROS检测所选染色剂Dihydrorhodamine123(DHR)和MitoTracker-DeepRed FM购自分子探针公司(Invitrogen，Molecular Probes，USA)，DHR为ROS特异染料，该染料本身无色，进入细胞后被ROS氧化成为荧光产物，通过共聚焦显微镜可以观察到荧光；MitoTracker-Deep Red FM为线粒体特异荧光染料。
用适量的DMSO溶解DHR配成50mmol/L母液，MitoTracker-Deep Red FM配成1mmol/L母液，-70℃保存。
将木薯储藏根切成薄片，将5mm×5mm方块浸没于磷酸缓冲液(0.1mol/L pH 7.0)，分别加入终浓为50μmol/L DHR和250nmol/L MitoTracker-Deep Red FM避光染色10min和20min。激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss LSM 510META，Germany)观察荧光信号，其中DHR Ex/Em为488nm/515nm，MitoTracker-Deep Red FM Ex/Em为635nm/680nm。
11、HPLC-MS检测
称取木薯储藏根1g在4mL无水乙醇中研磨，匀浆液10,000rpm离心15min。取上清-20℃保存，下一步用于质谱检测。
以标准品东莨菪素、东莨菪苷、七叶苷和秦皮乙素(购于源叶生物和Sigma)为标样，以Agilent HPLC 1200MS Q-TOF 6520System为检测系统，经过几轮条件摸索后，HPLC的条件为：用Zorbax Extend-C18column(3.0×50mm，1.8μm)，Solvent A:98％H2O含有20mmol/L Acetic amonium，Solvent B：2％ACN，t0min＝98:2，t2min＝95:5，t5min＝90:10，t15min＝85:15，t18min＝45:55，t20min＝0:100；0.2mL/min flow rate。
一级质谱条件为：Mass Range 40-500m/z(MS Scan Rate 1.4spectra/s)，Postive Scan，Gas(N2)Temp 345℃，Gas Flow 9L/min，VCap 3400V，Fragmentor 160V，Skimmer 64V，Octopole RF 750V，Ext Dyn Standard2GHz(1700)。
实施例1、载体构建及转基因植物的建立
根据已公布的溶菌酶(鸡来源)基因序列(EC.3.2.1.17)，克隆全长序列，插入到P54启动子(维管束特异表达)驱动的载体(pCAMBIA1301-p54)中，获得重组表达载体pC-p54::Lysozyme，其主要元件示意图如图1，转化木薯。
将含有上述载体的农杆菌转化木薯脆性愈伤，利用胚胎发生和器官发生途径再生得到转基因植株。
利用Western blot方法，从蛋白质水平检测在PPD发生过程中转基因和野生型木薯储藏根中溶菌酶的表达量。
检测结果显示，溶菌酶在野生型木薯中无表达，而在转基因木薯中表达，如图2。
实施例2、转基因木薯植株在采后生理性变质(PPD)过程中的检测
为了探讨溶菌酶在植物体内的工作机制，本实施例中，验证溶菌酶对木薯多酚氧化酶(MePPO)的抑制作用。本发明人利用qRT-PCR的方法检测PPD发生过程中MePPO的表达量，并测定酶活。
结果显示，随着时间的推移，无论在转录水平还是酶活水平，转基因植株中MePPO的表达量及酶活均显著下降，如图3。该结果提示，溶菌酶可能通过下调植株中的MePPO发挥延缓PPD的作用。
实施例3、转基因木薯抗氧化能力检测
(1)H2O2处理24小时观察H2O2的积累程度
为了探讨溶菌酶在植物体内的工作机制，本实施例中，验证溶菌酶是否改变6木薯叶片中的H2O2的含量。本发明人将转基因植株和野生型植株经0.5mol/L的H2O2处理24小时，之后，利用DAB染色观察叶片中H2O2的积累程度。
结果显示，经H2O2处理的野生型叶片显示深褐色，积累大量的H2O2；而转基因植株叶片的颜色明显较浅，说明H2O2积累量更低，转基因植株叶片的抗氧化能力显著高于野生型，如图4。
(2)处理前后叶片中的H2O2含量、MDA含量、PPO酶活变化
本发明人测定了H2O2处理前后叶片中的H2O2含量、MDA含量、PPO酶活变化。
结果显示，处理后野生型叶片H2O2含量升高，而转基因植株叶片H2O2含量显著低于野生型。同样，处理后野生型叶片的MDA含量升高，而转基因植株叶片的MDA含量显著低于野生型，与处理前差异不大。处理后转基因植株叶片中的PPO酶活显著低于野生型，而与活性氧清除机制相关的SOD酶活则显著高于野生型，如图5。
这些结果进一步证明，转基因植株叶片的抗氧化能力比野生型有了显著提高。
实施例4、转基因木薯PPD发生延缓能力观察
(1)CIAT方法观察木薯PPD发生过程
本发明人使用CIAT方法观察木薯PPD发生过程。木薯收获后立即将其储藏根的两端切去，远轴端用保鲜膜封口，近轴端暴露于空气中。将块根放置室温，每隔一定时间取样观察。
结果显示，野生型木薯从48小时开始出现变质现象，到96小时已出现腐烂，而转基因木薯的变质现象较轻，尤其是Lys-33和Lys-36株系的储藏根基本没有发生变质，如图6。
(2)ROS积累量观察
本发明人通过利用特异选择性的ROS探针DHR和线粒体氧化探针Mito Tracker-Deep Red FM，标记储藏根的氧化程度和ROS积累量。从荧光染色结果来看，24小时后野生型储藏根已积累大量ROS，而转基因储藏根中几乎未积累，如图7。
(3)香豆素类次生代谢物检测
本发明人还对与PPD发生相关的香豆素类次生代谢物东莨菪苷(Scoplin)和东莨菪素(Scopletin)含量进行LC-MS检测。
结果显示，在每个时间点，各个转基因木薯株系储藏根中的香豆素类次生代谢物含量都显著低于野生型，如图8，说明PPD发生过程的延缓也会降低次生代谢物的积累。
以上结果均表明，在木薯储藏根中表达溶菌酶基因能降低储藏根中氧化物的积累，延缓木薯采后生理性变质(PPD)的发生。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 一种延缓薯类植物生理性变质的方法
<130> 167419
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 147
<212> PRT
<213> 鸡
<400> 1
Met Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys Phe Leu Pro Leu Ala Ala
1 5 10 15
Leu Gly Lys Val Phe Gly Arg Cys Glu Leu Ala Ala Ala Met Lys Arg
20 25 30
His Gly Leu Asp Asn Tyr Arg Gly Tyr Ser Leu Gly Asn Trp Val Cys
35 40 45
Ala Ala Lys Phe Glu Ser Asn Phe Asn Thr Gln Ala Thr Asn Arg Asn
50 55 60
Thr Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Leu Gln Ile Asn Ser Arg Trp
65 70 75 80
Trp Cys Asn Asp Gly Arg Thr Pro Gly Ser Arg Asn Leu Cys Asn Ile
85 90 95
Pro Cys Ser Ala Leu Leu Ser Ser Asp Ile Thr Ala Ser Val Asn Cys
100 105 110
Ala Lys Lys Ile Val Ser Asp Gly Asn Gly Met Asn Ala Trp Val Ala
115 120 125
Trp Arg Asn Arg Cys Lys Gly Thr Asp Val Gln Ala Trp Ile Arg Gly
130 135 140
Cys Arg Leu
145

Claims (5)

1.一种延缓薯类植物生理性变质的方法，其特征在于，所述方法包括：在薯类植物中过表达外源的溶菌酶；所述的溶菌酶是鸡来源的溶菌酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；所述的薯类植物为木薯。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：将编码溶菌酶的多核苷酸转入薯类植物，获得转化入所述多核苷酸的薯类植物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，包括：
(S1) 提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有多核苷酸，其编码溶菌酶；
(S2) 将薯类植物的细胞或组织或器官与步骤(S1)中的农杆菌接触，从而使所述的多核苷酸转入薯类植物组织、器官或种子。
4. 一种溶菌酶或其编码基因的用途，其特征在于，用于通过在薯类植物中过表达外源的溶菌酶，以延缓薯类植物生理性变质；所述的溶菌酶是鸡来源的溶菌酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；所述的薯类植物为木薯。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的溶菌酶在薯类植物内还具有选自以下的用途：
提高植物的抗氧化能力；
下调植物中多酚氧化酶的活性；
减少植物中的H2O2的积累程度；
降低植物中的MDA含量；
减少植物储藏根中的超氧自由基的积累；和/或
降低植物中香豆素类次生代谢物的含量。
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木薯采后生理性变质与淀粉特性研究;姚庆群;《热带农业科学》;20121231;第32卷(第12期);第12-15页 *

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