CN106831966A - 增强植物耐盐碱胁迫能力的基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及增强植物耐盐碱胁迫能力的基因及其应用。首次分离获得一个新的功能基因——OsKEA1，其编码的多肽参与叶绿体钾离子外排，平衡叶绿体钠离子和pH，是在盐碱胁迫条件下维持植物有效光合作用所必需的。可以将OsKEA1基因应用于植物的培育中，选育出具有耐盐碱胁迫能力或产量提高的植物品种。

Description

增强植物耐盐碱胁迫能力的基因及其应用
技术领域
本发明属于基因技术及植物学领域，更具体地，本发明涉及增强植物耐盐碱胁迫能力的基因及其应用。
背景技术
土壤盐碱化通常是由于灌溉不当、用水过量等原因引起地下水位上升，从而造成土壤中盐分积聚的过程。这主要发生在干旱、半干旱、半湿润气候区及受海水侵灌的海滨低地区域。中国盐渍土地总面积惊人，主要分布在新疆、河西走廊、柴达木盆地、河套平原、银川平原、黄淮海平原、东北平原西部，以及滨海地区。在中国的盐碱耕地中，大约73％属轻度盐碱化，对农业生产影响不严重，其余27％为中强度盐碱化。
尽管对于土壤盐碱化的治理是一个重要的课题，正在被越来越多的人员研究和重视，但是目前土壤盐碱化仍然有越来越严重的趋势，且短时间内难以扭转。
盐胁迫与碱胁迫常常同时发生，也常被称为盐碱胁迫。盐碱对植物造成的伤害表主要现在以下两个方面：一是细胞质中金属离子(主要是Na+)的大量积累，它会破坏细胞内离子平衡并抑制细胞内生理生化代谢过程，使植物光合作用能力下降，最终因碳饥饿而死亡；二是盐碱土壤是一个高渗环境，它能阻止植物根系吸收水分，从而使植物因“干旱”而死亡。同时盐碱土壤pH值较高，这使得植物体与外界环境酸碱失衡，进而破坏细胞膜的结构，造成细胞内溶物外渗而使植物死亡。因而，受盐碱胁迫的植物一方面要降低细胞质中离子积累，另一方面还通过积累过程产生某些特殊的产物，如蛋白质、氨基酸、糖类等来增强细胞的渗透压，阻止细胞失水，稳定质膜及酶类的结构。多数植物不宜生长在盐碱地上。而盐碱植物在形态和生理上都与其生长环境相适应。
不同的植物对于盐碱的耐受能力有所差异，植物体内也可能存在一些对于抵抗环境胁迫有效的基因。鉴于传统的育种方法筛选的成功率低，耗时长，开发一些新的选育技术是重要的。通过分析和鉴定出与植物抵抗环境胁迫有效的基因来对植物进行改造或筛选。
尽管目前已经鉴别出一些抗逆相关的基因，然而还需要通过大量的努力进一步开发和寻找新的基因，从而可为植物品种的改良提供更多、更有效的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供增强植物耐盐碱胁迫能力的基因及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种OsKEA1多肽或编码该多肽的多核苷酸的用途，用于增强植物耐盐碱胁能力或提高植物产量；或用于制备耐盐碱胁迫的植物或产量提高的植物。
在一个优选例中，所述的植物包括但不限于：禾本科植物。
在另一优选例中，所述OsKEA1多肽是：
(a)如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或
(b)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有增强植物耐盐碱胁迫能力的由(a)衍生的多肽；或
(c)氨基酸序列与(a)限定的氨基酸序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳地95％以上；更佳地99％以上)相同性且具有增强植物耐盐碱胁迫能力的多肽；或
(d)具有(a)多肽功能的SEQ ID NO:2的多肽片段(较佳地，其与SEQ IDNO:2的序列相同性高于70％；更佳地高于75％；更佳地高于80％；更佳地高于85％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％或99％)。
在另一优选例中，所述的OsKEA1多肽或编码该多肽的多核苷酸：
提高植物根部的Na+离子流，K+离子流或H+离子流，从而增强植物耐盐碱能力；
促进叶片细胞的叶绿体或根部细胞原生质体中钠离子、钾离子的外排；
促进对植物的光保护作用(特别是在盐碱胁迫条件下或在大田栽培条件下)，从而增强植物耐盐碱能力；或
提高植物的光合作用效率(特别是在盐碱胁迫条件下或在大田栽培条件下)，从而增强植物耐盐碱能力或提高植物产量。
在本发明的另一方面，提供一种增强植物耐盐碱胁迫能力或提高植物产量的方法，所述方法包括：提高植物中OsKEA1多肽的表达或活性。
在本发明的另一方面，提供一种制备具有耐盐碱胁迫能力的植物或产量提高的植物的方法，所述方法包括：提高植物中OsKEA1多肽的表达或活性。
在一个优选例中，，所述的方法包括：将编码OsKEA1多肽的多核苷酸转入植物中。
在另一优选例中，所述的方法包括步骤：
(i)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含编码OsKEA1多肽的多核苷酸；
(ii)将植物细胞、组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述编码OsKEA1多肽的多核苷酸转入植物。
在另一优选例中，所述方法还包括：(iii)选择出转入了编码OsKEA1蛋白的多核苷酸的植物。
在本发明的另一方面，提供一种具有耐盐碱胁迫能力以及耐大田综合环境因素胁迫能力的植物或其种子，其是由前述方法制备获得的转基因植物。
在本发明的另一方面，提供一种OsKEA1多肽或编码其的多核苷酸的用途，用作鉴定植物的耐盐碱胁迫能力的分子标记物，或用作鉴定植物产量高低的分子标记物。
在本发明的另一方面，提供一种鉴定植物耐盐碱胁迫能力或产量高低的方法，包括：检测待测植物中OsKEA1多肽的表达；若待测植物中该多肽的表达量高于(较佳地为在统计学上高于，如高50％以上)该类植物中OsKEA1多肽表达的常规值(或平均值)；则该种植物是具有耐盐碱胁迫能力或或产量提高的植物；若待测植物中该多肽的表达量低于(较佳地为在统计学上低于，如低80％以上)该类植物中OsKEA1多肽表达的常规值(或平均值)；则该种植物是不具有耐盐碱胁迫能力或产量不高的植物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、突变体(oskea1)和野生型(WT)的表型比较。
A：在培养箱(光强为100μmol photonsm-2s-1)中生长30天的野生型(左)和突变体(右)；
B：野生型(左)和突变体(右)叶片中脉近轴面的比较；
C：野生型(左)和突变体(右)叶片中脉远轴面的比较；
D：野生型和突变体中脉附近的细胞比较(左为野生型，右为突变体)(Bar＝50μm)；
E：野生型和突变体中脉附近的细胞大小的比较；
F：野生型和突变体中脉附近的细胞数目的比较。(左为野生型，右为突变体)。
图2、选取30d水稻小苗的叶片作超薄切片，置于透射电子显微镜下观察叶绿体类囊体。
图3、OsKEA1的鉴定。
A：OsKEA1基因的图位克隆，OsKEA1基因的定位区段。
B：突变体oskea1的互补植株Com-oskea1与野生型、突变体的表型比较。Com-oskea1是使用自身启动子转化突变体oskea1获得的互补株系。
C：sKEA1的免疫印迹分析，10天的野生型、突变体和互补幼苗的叶片提取的叶绿体蛋白，每个泳道上10μg总蛋白，经7％SDS凝胶电泳分离后，进行免疫印迹鉴定(上)，SDS凝胶电泳后考马斯亮蓝染色(Coom.)的Rubisco大亚基(Rubisco L)，作为上样对照。
图4、野生型的RNAi转基因植株。
A：叶片中脉近轴面表型比较。
B：野生型的RNAi转基因植株RT-PCR。转基因株系RI3-3表现为突变体oskea1的叶片近轴面特异变白表型，其他株系仍表现为野生型表型或差异很不明显。
图5、A：OsKEA1基因的组织定位(Bar＝1mm)；
B：水稻OsKEA1基因的表达模式RT-PCR，其中，C，愈伤组织(callus)；R，根(root)；S，芽(shoot)；F，花(flower)；L，叶(leaf)；LS，叶鞘(leaf sheath)；
C：OsKEA1的亚细胞定位。OsKEA1-N-GFP融合蛋白的黄绿荧光信号与叶绿素自发荧光信号共定位于叶绿体中(Merged)，eGFP：空载体。
图6、水稻不同组织中(A)以及叶绿体不同组分(B)中OsKEA1的免疫印迹实验。
A：分离10天幼苗的根、茎、叶和叶脉(主脉)，提取总蛋白，SDS电泳后进行免疫印迹检测，每个泳道含有5μg总蛋白。
B：从10天幼苗分离完整叶绿体组分，每个泳道含有10μg总蛋白，经7％SDS电泳后进行免疫印迹检测，箭头指的是OsKEA1免疫信号。SDS凝胶电泳后考马斯亮蓝染色(Coom.)作为上样对照。WT，野生型；oskea1，突变体；Com，使用自身启动子转化突变体oskea1获得的互补株系。
图7、野生型与突变体根部原生质体Na+/H+和K+/H+交换活性的比较。WT，野生型；oskea1，突变体。
图8、野生型与突变体类囊体膜ATPase活性(A)、Na+/H+和K+/H+交换活性(B和C)以及叶片、根、叶绿体(Chl)和类囊体膜钾钠离子含量的比较(D-G)。WT，野生型；oskea1，突变体；Com，使用自身启动子转化突变体oskea1获得的互补株系。
图9、野生型(WT)、突变体(oskea1)和互补植株(Com-oskea1)根部K+离子流(A)，Na+离子流(B)，H+离子流(C)的比较。
图10、野生型(WT)、突变体(oskea1)和互补植株(Com-oskea1)在额外添加NaCl和KCl培养基中的生长表型。上图(A和C)为生长5天的表型，下图(B和D)为生长3周的表型。
图11、野生型(WT)、突变体(oskea1)和互补植株(Com-oskea1)在不同pH下的生长表型，上图为生长5天的表型，下图为生长3周的表型。
A、B：pH4.0；
C、D：pH5.7；
E、F：pH7.0。
图12、野生型(WT)、突变体(oskea1)和互补植株(Com-oskea1)在不同生长条件下的光系II最大光化学效率的比较。
图13、OsKEA1过表达水稻在25mM NaCl下的生长表型(A)以及正常条件下幼苗表型(B)、类囊体膜蛋白积累水平(C)以及维管束组织(D)蛋白水平的比较。WT，野生型；oskea1，突变体；Ov-OsKEA1，是使用Ubiquitin启动子转化野生型获得的株系。Com，是使用Ubiquitin启动子转化突变体oskea1获得的株系。
图14、OsKEA1过表达水稻在的筛管纳离子下载速度(A)、光系统II最大光化学效率(Fv/Fm)(B)、毫秒级延迟发光慢相(C)和田间单株产量(D)分析。
WT：野生型水稻(9522)；
oskea1：突变体；
Over12、Over23：OsKEA1在野生型中的过表达株系，即：利用自身启动子将OsKEA1转化野生型水稻，获得的OsKEA1过表达转基因株系；
Over1、Over2、Over3：OsKEA1在突变体中的过表达株系，即：使用ubiquitin强启动子将OsKEA1转化突变体，获得的OsKEA1过表达转基因株系；
Com：是使用Ubiquitin启动子转化突变体oskea1获得的过表达株系。
Com12：是使用自身启动子将OsKEA1转化突变体获得的互补株系。
具体实施方式
本发明人首次分离了一个叶片白脉的水稻突变体，获得了控制该性状的一个新的功能基因——OsKEA1，该基因编码一个假定的钾离子外排蛋白，OsKEA1定位于叶绿体被膜。本发明人证明了OsKEA1参与叶绿体钾离子外排，平衡叶绿体钠离子和pH，是在盐碱胁迫条件或在大田栽培条件下维持植物有效光合作用所必需的，因此过表达OsKEA1的转基因水稻能在大田条件下具有较高的光合能力和经济产量。可以将OsKEA1基因应用于植物的培育中，选育出具有特定品质性状的品种，如耐盐碱的或产量提高的植物。
OsKEA1蛋白是一个十次跨膜的钾离子外排逆向转运蛋白，有一个很保守的Na+/H+交换子结构域，而亚细胞定位显示，OsKEA1蛋白定位在叶绿体和细胞膜上。为了验证OsKEA1是否具有Na+(K+)/H+转运活性，本发明人分别测定其在叶绿体和细胞膜上的Na+/H+和K+/H+交换活性。利用QD(喹吖因)结合H+发生荧光淬灭的特性，来指示跨膜H+的梯度，从而反映Na+/H+和K+/H+的交换活性。分别提取水稻幼苗的原生质体(质膜)和完整叶绿体(再进一步分离出叶绿体被膜和类囊体膜)，进行Na+/H+和K+/H+交换活性的测定。结果发现，突变体叶绿体类囊体膜的K+/H+和Na+/H+交换活性明显地降低，表明OsKEA1在维管组织或叶绿体钾或钠离子外排中发挥重要的作用。另一方面，本发明人也观察到突变体oskea1的根部质膜的Na+/H+和K+/H+交换活性与野生型9522相比都明显降低，暗示着该基因突变导致细胞质钠、钾离子的外排受到抑制。为了证明这一猜想，本发明人分析了突变体和野生型根部离子流的变化，结果发现，突变体的钾、钠、氢离子的外排活性明显地低于野生型的，离子含量分析进一步说明了，OsKEA1基因的突变，导致叶片中钠、钾离子的积累。这结果提示，OsKEA1参与了叶绿体和细胞外离子的外排。为了获得进一步的证据，本发明人分别比较了突变体和野生型在高盐和不同酸碱度的培养液中的生长表型和光合作用效率，发现突变体oskea1在盐或碱胁迫下生长缓慢、最终叶片受到严重的伤害、甚至死亡，光合作用效率降低为了探讨OsKEA1基因在水稻抗盐碱的应用，本发明人在水稻野生型中过表达OsKEA1基因，获得了过表达OsKEA1基因的转基因水稻，该转基因水稻呈现耐受高盐、高pH，在盐碱胁迫条件下具有较高的光合作用效率，在大田栽培条件下，具有较高的光合能力和经济产量。
如本文所用，所述的“盐碱胁迫”包括“盐胁迫”和“碱胁迫”。本发明中划分某一环境术语盐碱胁迫环境还是正常环境的准则与现有公知技术相符。例如，对于大多数植物，通常“耐盐胁迫能力”是指耐受盐浓度0.1％-0.2％(如NaCl为20～50mM，较佳地25～40mM)的能力。对于大多数植物，通常，“耐碱胁迫能力”是指耐受pH6.8～8.0，较佳地7.0～8.0。
如本文所用，对于适用于本发明的植物(或作物)可以是适合进行基因的转化操作，如农作物、花卉植物、或林业植物等。作为一种优选方式，所述的“植物”包括：禾本科植物。比如，所述的“植物”包括：禾本科的水稻、小麦、大麦、玉米、黑麦、高粱、大豆等。
如本文所用，所述的“该类植物中OsKEA1蛋白(多肽)表达的常规值(平均值)”当是一种用于判定OsKEA1蛋白表达的“阈值”，OsKEA1蛋白作为一种已知蛋白，本领域人员可以方便地了解这种常规值。比较蛋白表达差异的方法也是人们熟知的，例如通过简单的免疫印迹试验得知。
本发明中，选择合适的“对照植物”是实验设计的例行部分，可以包括对应的野生型植物或无目的基因的相应植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同的品种。对照植物也可以是因分离而丢失转基因植物的个体。如本文所用的对照植物不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。
本发明还包括OsKEA1蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的OsKEA1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
任何一种OsKEA1蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，OsKEA1蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的OsKEA1蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长OsKEA1蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长OsKEA1蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
在本发明中，术语“OsKEA1蛋白”指具有OsKEA1蛋白活性的SEQ IDNO:2序列的多肽。该术语还包括具有与OsKEA1蛋白相同功能的、SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端(特别是N末端)添加或缺失一个或数个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端(特别是N末端)添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括OsKEA1蛋白的活性片段和活性衍生物。
多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与OsKEA1蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗OsKEA1蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含OsKEA1蛋白或其片段的融合蛋白。
任何与所述的OsKEA1蛋白同源性高(比如与SEQ ID NO:2所示的序列的同源性为50％或更高；优选的，同源性为60％或更高；优选的，同源性为70％或更高；优选的，同源性为80％或更高；更优选的，同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有OsKEA1蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。这些蛋白包括但不限于来源于其它物种的同源蛋白。
本发明还涉及编码本发明OsKEA1蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
应理解，虽然本发明的OsKEA1基因优选获自禾本科植物，但是获自其它植物的与水稻OsKEA1基因高度同源(如具有70％以上，如80％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。
本发明的OsKEA1蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或OsKEA1蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞。
本发明中，OsKEA1蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。
所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。
本发明提供了所述的OsKEA1蛋白或其编码基因的用途，用于增强植物耐盐碱胁迫能力或提高植物的产量；并且，所述的OsKEA1蛋白还可用于：提高植物根部的Na+离子流，K+离子流或H+离子流；促进叶片细胞的叶绿体中钠离子、钾离子的外排；在盐碱胁迫条件下发挥对植物的光保护作用；或在盐碱胁迫条件下或大田栽培条件下维持植物的有效的光合作用效率。
本发明还涉及一种提高植物的耐盐碱胁迫能力或提高植物产量的方法，所述的方法包括：提高植物中OsKEA1蛋白的表达或活性；或使所述植物过量表达OsKEA1蛋白。
在得知了所述的OsKEA1蛋白的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的OsKEA1蛋白的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带OsKEA1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的OsKEA1蛋白。
作为本发明的一种实施方式，将编码OsKEA1蛋白的基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述OsKEA1蛋白的植物。
优选的，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：
(1)将外源的OsKEA1蛋白的编码多核苷酸转入植物细胞、组织、器官或组织，获得转化入OsKEA1蛋白的编码多核苷酸的植物细胞、组织、器官或种子；和
(2)将步骤(1)获得的转入了外源OsKEA1蛋白的编码多核苷酸的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物植株。
作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：
(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有OsKEA1蛋白的编码多核苷酸；
(s2)将植物细胞、组织、器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使OsKEA1蛋白的编码多核苷酸转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；
(s3)选择出转入OsKEA1蛋白的编码多核苷酸的植物细胞、组织、器官或种子；以及
(s4)将步骤(s3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。
其它增加OsKEA1基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强OsKEA1基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该OsKEA1基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子，水稻、玉米的Ubi启动子等。
本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物包括：转入了OsKEA1基因或其同源基因的转基因植物；或者OsKEA1蛋白表达量(包括低表达或不表达)降低的植物等。
可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。
此外，本发明还涉及利用OsKEA1蛋白或其编码基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用OsKEA1蛋白或其编码基因作为一种分子标记，通过检测植物中OsKEA1蛋白的表达情况，鉴定植物的耐盐碱能力。
本发明还涉及利用OsKEA1蛋白或其编码基因进行改良品种的筛选。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
1.1植物材料
粳稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)品种：9522。
籼稻(Oryza sativa L.ssp.indica)品种：广陆矮4号。
水稻突变体Oskea1：来自上海交通大学张大兵实验室，60Coγ射线突变体库。
水稻过表达OsKEA1株系Ov-OsKEA1：本实验室构建、筛选、种植保存。
以上材料和转基因植物种植于本实验室光照培养箱、本所人工气候室或于6-10月种植于上海市中科院上海生命科学研究院植物生理生态研究所松江农场。用于提取DNA、RNA、蛋白以及表型观察和生理生化分析。
1.2载体构建和遗传转化
(1)以ProUbiquitin作为启动子构建过表达植株
将编码OsKEA1基因的3465bp的全长cDNA序列(SEQ ID NO:1，编码SEQ ID NO:2所示的多肽)片段通过SpeI和SacI插入改造过带有Ubiquitin启动子的用于转化水稻的双元载体pCAMBIA1300中，构建得到p1300:ProUbiquitin:OsKEA1载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法，转化到水稻的突变体(Oskea1)和野生型(9522)的愈伤组织中，分别得到互补植株(Com)以及过表达转基因植株(Ov-OsKEA1)，利用OsKEA1多克隆抗体进行免疫印迹检测，挑选在叶绿体被膜、类囊体膜以及维管束筛管组织表达量2倍以上的过表达植株进行实验。
(2)以自身启动子作为启动子构建过表达植株
以基因组DNA中OsKEA1基因启始密码子ATG前3018bp的基因组序列片段作为自身启动子，来构建自身启动子启动的过表达植株。采用以下引物：
COM-F：5’cgggatcccgAATGTTTGTATTTCTATGCTGTTGGTT 3’(SEQID NO:3)；和
COM-R：5’gtcgacTACGGGATGGTAGAAATGGAT 3’(SEQ ID NO:4)；
从水稻日本晴BAC克隆(OsJNBa0032F06)中扩增出OsKEA1基因11977bp(包括启始密码子ATG前3018bp的自身启动子序列)的基因组序列片段。将该片段通过BamHI和SalI插入到用于转化水稻的双元载体pCAMBIA1301载体中；测序验证正确，该载体通过电击导入农杆菌EHA105，使用遗传转化手段转化突变体Oskea1和野生型9522成熟胚愈伤，T0代获得互补植株及自身启动子启动的过表达植株。
1.3 RT-PCR
利用Clontech Nucleobond试剂盒(Clontech；Palo Alto，CA，USA)，根据产品说明书提取总RNA，使用Invitrogen公司的cDNA合成试剂盒，从5μg的总RNA中合成高质量的cDNA，首先利用ACTIN基因的特异引物做RT-PCR，根据比较ACTIN基因的表达量调整cDNA产物的模板量，然后根据调整后的均一化的模板量，利用分析基因的特异引物进行PCR。
1.4水稻钾、钠含量的测定
将水稻用自来水清洗干净，选取需要测定的组织材料，先在纯水中快速洗一次，在双蒸水中快速洗三次，然后用吸水纸把组织上的水分吸干，装入牛皮纸袋里，放到90℃烘箱，烘至恒重。材料烘好后，用电子天平称重，然后放到50ml离心管里，加入0.1M的醋酸溶液，90℃水浴3h，水浴时颠倒混匀5-6次。将提取液倒入2ml离心管，12,000rpm离心5～10min，取上清，用双蒸水稀释到合适的浓度。用于钾钠离子分析的叶绿体和类囊体膜按照上述的方法，使用的缓冲液是不含NaCl的，分离后得到的叶绿体或类囊体膜使用蒸馏水洗三遍。用Thermo Elemental Sokaar AA型原子吸收分光光度计测定K+、Na+含量。每个样品重复测定两次。取两次的平均值，计算每毫克干重的K+、Na+含量。
1.5农杆菌介导转化水稻幼胚愈伤组织及转基因植株的再生
1.5.1水稻幼胚愈伤组织的诱导和培养
取授粉后12-15天的水稻未成熟种子经70％乙醇浸泡1分钟后，于NaClO溶液中(与水1:1--1:3视情况而定，加2-3滴吐温20)消毒90分钟以上，用无菌水冲洗4-5次，然后用解剖刀和摄子挑出幼胚并接种于N6D2培养基上诱导愈伤组织，在26±1℃、避光条件下培育，4天后可用于转化。
1.5.2根癌农杆菌的培养
从YEB平板上挑取农杆菌单菌落接种到3ml含抗生素的YEB液体培养基中于28℃振摇培养过夜，第2天按1％接种量转接入50ml含抗生素的LB液体培养基中，200rpm继续振摇培养至OD600为0.6至0.8左右时，将新鲜的农杆菌菌液于5,000rpm、4℃离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的AAM液体培养基中，此时即可用于转化水稻各种受体材料。
1.5.3水稻转化受体材料与根癌农杆菌的共培养
于6cm培养皿中将水稻幼胚愈伤浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到N6D2C培养基上，于26℃共培养3天。在转化材料转入前，事先在N6D2C培养基上铺一层无菌滤纸，并用少量新鲜AAM液体培养基湿润。共培养时，在共培养培养基中加入乙酰丁香酮(AS)作为农杆菌Vir基因活化物，使用浓度为100μM。
1.5.4抗性愈伤组织的筛选及转基因植株的再生
幼胚愈伤与农杆菌共培养3天后，从共培养培养基上取出，用无菌滤纸吸干菌液和水分；切去胚芽并转入选择培养基N6D2S1进行选择培养。7-12天后将抗性愈伤组织转到N6D2S2选择培养基上继续筛选。10-12天后生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上培养一周左右，再移至分化培养基上分化(12小时光照/天)。再生的小苗在1/2MS0H或1/2MSENH上生根壮苗，随后移入人工气候室或大田。
1.5.5转基因植株的鉴定
载体为pCAMBIA1300-Ubi的T0代转基因植株用基因的特异引物做PCR反应检测阳性植株，然后将阳性植株进行RT-PCR和Western Blot进一步鉴定验证。
1.6水稻原生质体的制备(不含Na和K)
1)水稻种子浸种3天(d)后，水培于人工气候室中，培养条件为28℃，12h光照/24℃，12h黑暗。
2)取发芽后7～14d的水稻幼苗(10～25cm高)，将其叶片用锋利的刀片切成0.5mm细条，立即置于酶解液(0.6M mannitol，10mM MES(pH 5.7)，1.5％Cellulase RS，0.75％Macerozyme，0.1％BSA，1mM CaC12，5mMβ-mercaptoethanol and 50μg/ml carbenicillin)中，确保酶液浸没叶片，黑暗条件下在摇床上40rpm酶解过夜；
3)酶解液用35μm孔径尼龙膜过滤，用50ml圆底离心管收集过滤后的液体；
4)室温，100～200g，离心2～3min，沉淀原生质体；
5)小心吸去上清，加入含有2mM MES(pH 5.7)的0.6M mannitol溶液重悬，室温，100～200g，离心5min；
6)重复步骤5两次；
7)用适量含有2mM MES(pH 5.7)的0.6M mannitol溶液重悬；待用。
1.7水稻原生质体和类囊体膜Na+/H+和K+/H+交换活性的测定
类囊体膜提取参照徐敏等(2014)的方法，Na+/H+或K+/H+交换活性参照已报道的(Apse et al/，1999)pH依赖的吖啶荧光猝灭方法进行测定。将含终浓度为每毫升20μg的叶绿素的类囊体膜或20μg总蛋白的原生质体加入到0.8ml的反应液中，反应缓冲液含有0.3M的甘露醇，5mM Tris/MES(pH8.0)，2mMDTT，5mM D-Glucose，1.5mM ATP，5μM quinacridine(QA)，1ml反应缓冲液，放入比色杯中，使用带有US-370发射光和375nm检测光装置的叶绿素荧光调制仪器，在激发和发射波长分别是422nm和503nm的条件下进行活性的测定。
(1)比色杯中加入900μl QA反应液；
(2)荧光读数稳定后加入100μl Mg2SO4(30mM，Mg2+)，加入50～100μg类囊体膜，混匀，荧光迅速降低；
(3)加入100μl EDTA(pH8.0，300mM)，混匀，荧光趋于稳定；
(4)荧光读数稳定后加入12.5μl NaCl(4M)或25μl KCl(2M)，混匀，荧光升高；
(5)加入0.1μl莫能菌素(monensin，50mM，一种人工Na+/H+antiporter)或尼日利亚菌素(nigericin，5mM，一种人工K+/H+antiporter)，荧光得到恢复。
其中，QA反应液：5mM Tris/MES(pH 8.0)，0.3M mannitol，2mM DTT，5mM D-Glucose，30mM TAMC，1.5mM ATP，5μM QA(quinacrine)。
1.8水稻根部离子流的测定
利用非损伤微测技术：扫描离子选择电极技术(NMT100：Younger USALLC，Amherst，MA)1002，USA)]测定5天幼苗根部的K+、H+、Na+离子流变化。将根部侵在含有0.5mM KCl，0.5mM NaCl，0.3mM MES，pH6.0的基础溶液中30分钟后，对根尖300微米的位置进行扫描，通过将离子选择性的微电极在30微米之间的距离进行移动，在预先设定的可编程频率为0.3Hz偏移测定离子的浓度梯度。离子流按照菲克扩散定律进行计算：J＝-D0(DC/DX)(Sun et al.，2009)。
其中，J表示在x方向上的离子流，dc/dx为离子的浓度梯度，和D0是在特定介质中的离子扩散常数。稳定离子流测定30分钟，以确保到达一个稳定状态。瞬态的Na+，K+和H+的动力学再继续测定30分钟。离子流数据使用iFluxes1.0(YoungerUSA，有限责任公司，阿默斯特，MA01002，USA)软件获取，使用JCAL V3.2.1(一个免费的MS Excel电子表格，youngerusa.com或ifluxes.com)最终转换成特定的离子流(pmol/cm2/s)。
1.9水稻完整叶绿体的制备
1)取新鲜水稻叶片10g，冰上剪碎，加入约40ml STN缓冲液[0.4Msucrose，50mM Tris-Cl(pH 7.6)，10mM NaCl(如需特殊用途，可不加NaCl)]；
2)匀浆机快速匀浆，匀浆液经孔径100μm的尼龙膜过滤将残渣滤去；
3)4℃1,000g离心5分钟；
4)收集沉淀，用少量(约1ml)STN缓冲液在冰上轻轻悬浮沉淀；
5)配80％和40％的Percoll不连续梯度，80％Percoll 2ml，40％Percoll3ml，小心用胶头滴管加入悬浮的沉淀；
6)4℃3,000g离心7分钟，离心机的加速和减速调至最慢；
7)收集离心后40％Percoll和80％Percoll界面处的部分即为完整叶绿体；
8)加入STN缓冲液稀释所得完整叶绿体，然后4℃2,000g离心5分钟，收集沉淀重新用STN缓冲液悬浮，叶绿素浓度定量，待用。
1.10叶绿素浓度的测定
称取少量的叶片剪碎置于Eppendorf管中，加入1ml 80％丙酮溶液，4℃冰箱避光浸泡过夜。待叶片发白后，混匀静置，吸取上清分别于波长645nm和663nm处比色，所得的光密度(OD)值代入下列公式可计算出溶液中的叶绿素a，b的量，C为叶绿素浓度，以μg/μl表示：
Ca＝0.0127×OD663-0.00269×OD645
Cb＝0.0229×OD645-0.00468×OD663
Ca+b＝0.00802×OD663+0.202×OD645
总的叶绿素含量可以简单用如下公式计算：Ca+b＝OD652/34.5。
1.11植物总蛋白的提取
SDS法——将液氮冻存的植物材料研磨粉碎，按100μl/100mg组织的比例加入蛋白提取缓冲液(100mM NaPO4(pH 7.0)，5mM DTT，1％SDS)混匀，沸水浴5min后13,000rpm室温下离心10min。吸取上清后与等体积的2×SDS加样缓冲液混匀，沸水浴5分钟后得到的样品可用来进行SDS-PAGE和Western-blotting。
1.12叶绿素荧光参数的测定
利用调制式叶绿素荧光成像系统(Walz，Effeltrich，德国)测定生长10天的幼苗叶片绿素荧光参数的变化(Schreiber et al.，1986)。水稻幼苗平放在测定专用的平板上，暗适应30分钟后，使用450nm的激发蓝光作为饱和脉冲光，进行测定，成像信号使用ImagingWin软件记录在计算机屏幕上，选取直径为100μm的面积测量叶绿素荧光参数Fv/Fm等。
实施例1、突变体的筛选与基因克隆、鉴定
本发明人从交通大学构建的60Coγ射线诱变γ的背景为粳稻9522的突变体库中筛选获得了一个叶片表现为中脉近轴面特异变白的稳定遗传的突变体，命名为oskea1(oryza sativa K+efflux antiporters)，见图1A右图，其中左图为野生型对照。
与野生型9522相比，突变体oskea1表现出明显的叶片中脉近轴面特异变白的叶片表型(图1B)，而叶片的远轴面及其它部位的表型与野生型没有明显的差异(图1C)。
与野生型9522相比，突变体oskea1的株高略低于野生型(图1A)，剑叶叶片宽度高于野生型。本发明人统计在大田生长四个月的野生型和突变体的株高和剑叶叶片宽度，野生型的平均高度为1007±12cm，平均剑叶叶片宽度为14.5mm(n＝10)，突变体的平均高度为971±21cm，平均剑叶叶片宽度为15.9mm(n＝10)(n＝10)。与野生型相比，突变体的叶片中脉附近的细胞变大，但数目减少(图1D-F)。
为了检查该突变是否影响叶绿体的结构，本发明人选取30d水稻小苗的叶片作超薄切片，置于透射电子显微镜下观察发现，与野生型相比，突变体的叶绿体类囊体膜结构并没有受到影响(图2)。
由于筛选到的突变体是γ射线诱变的突变体，所以本发明人采用了图位克隆的策略对突变体进行基因定位。本发明人定位的群体是通过将粳稻9522背景的oskea1与籼稻广陆矮四号杂交，得到一个有4956个突变体单株的定位群体。最后本发明人将突变位点锁定在四号染色体分子标记SN10和分子标记SN11之间46kb的范围(图3A)。根据TIGR数据库(www.tigr.org)的预测，在这个46kb的区域共有7个候选基因，其中有3个基因预测是叶绿体定位基因，包括1个钾离子外排逆向转运蛋白、1个分裂和聚合腺苷酸特异性因子5和1个DNA错配修复蛋白；另外还有3个预测的反转座子蛋白和1个假定蛋白。本发明人认为前三个基因比较可能是引起oskea1突变表型的基因。通过对oskea1的这三个基因进行测序，发现在钾离子外排逆向转运蛋白基因的第11个外显子处(2284～2287bp)缺失4个碱基(ATTG)(图3A)，从而导致该基因移框，从而使翻译提前终止。根据TIGR数据库记载，OsKEA1基因全长9230bp，共有21个外显子，cDNA长为3465bp，是一个控制水稻K+逆向转运蛋白编码1154个氨基酸的蛋白质，该基因在数据库中的登录号为Os04g0682800。通过TargetP v1.1和ChloroP v1.1预测KEA1在N端有41aa的信号肽；通过TMHMM预测，该蛋白是一个十次跨膜的钾离子外排逆向转运蛋白，有一个很保守的Na+/H+交换子结构域，属于CPA(Cation/H+Antiporter)转运体中的CPA2家族。而在拟南芥中则存在6个成员AtKEA1～6，属于CPA2家族中的KEA亚家族。通过分析同源蛋白序列发现，水稻OsKEA1多肽与拟南芥AtKEA2多肽的氨基酸序列有69％的相似性。
为了验证定位结果，本发明人对突变体oskea1做互补实验。将一段包含OsKEA1基因的11977bp的基因组序列片段通过BamHI和SalI插入到用于转化水稻的双元载体pCAMBIA1301后(p1301-com)，利用农杆菌介导的遗传转化方法转化到突变体oskea1的愈伤中，得到了一百多株的转基因植株，得到的阳性转基因植株(com-oskea1)都恢复了野生型的表型(图3B)。本发明人使用OsKEA1重组蛋白制作抗体，进行免疫印迹分析，在野生型和互补植株中能观察到一条分子量约为124kDa的条带，但在突变体中缺失该蛋白(图3C)，表明了定位的正确性。
将编码OsKEA1基因cDNA序列的361bp的特异性序列片段(RI1)和437bp处于Na+/H+交换子结构域的保守性片段(RI3)分别通过BamHI/KpnI和SacI/SpeI正反向插入到用于RNAi的pTCK309载体中，利用农杆菌介导的遗传转化方法转化到野生型中，得到的转基因植株经GUS染色为阳性的植株，表现出不同程度的突变表型，最为严重的植株白化死掉，部分植株呈现白化表型，比较多的植株呈现出突变体oskea1的白色中脉表型(图4)。
实施例2、OsKEA1基因的表达模式RT-PCR
以上结果验证了定位的正确性，接着本发明人研究了OsKEA1基因在水稻中的表达模式。将一段包含OsKEA1基因启动子序列的3018bp的基因组序列片段通过BamHI和NcoI插入到用于转化水稻的带有GUS基因的双元载体pCAMBIA1301中，构建得到p1301:ProOsKEA1:GUS，利用农杆菌介导的遗传转化方法转化野生型9522的愈伤，得到7株转基因植株，通过GUS活性的组织化学染色分析发现，OsKEA1基因在水稻的分蘖芽、根、茎、茎节、叶、叶鞘、枝梗、花中的维管束均有表达(图5A)。本发明人分别提取水稻野生型9522开花时期不同组织以及愈伤组织的RNA，以ACTIN作为内参，用OsKEA1基因的特异引物做RT-PCR，发现水稻OsKEA1基因在愈伤、根、茎、花、叶、叶鞘等不同组织中均有表达(图5B)。
实施例3、水稻OsKEA1基因的定位
根据预测OsKEA1在N端有41aa的信号肽，为了证明OsKEA1是定位于叶绿体的，本发明人将OsKEA1基因cDNA序列的前300bp的特异性序列片段融合到eGFP的N端(OsKEA1-N-GFP)，将由花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动的OsKEA1-N-GFP构建分别转染到水稻原生质体中，48h后通过激光共聚焦显微镜观察GFP的荧光与叶绿素自发荧光情况。
结果发现，OsKEA1-N-GFP融合蛋白的黄绿荧光信号与叶绿素自发荧光信号共定位于叶绿体中(图5C)。这就证明了OsKEA1的确是定位于叶绿体的。
并且，发明人利用实验室制作的OsKEA1多克隆抗体对水稻不同组织进行了免疫印迹实验，结果显示，OsKEA1在水稻根、茎、叶和叶脉中都有积累，但在突变体Oskea1中检测不到该信号(图6A)，而作为对照的光系统II蛋白D2在绿色组织中均有积累，野生型和突变体之间没有差异。
为了进一步了解OsKEA1在水稻叶绿体中不同部分的分布，发明人提取了完整叶绿体后，通过蔗糖密度梯度离心方法，分离到叶绿体不同的组分，进行免疫印迹检测，结果发现，OsKEA1主要分布在类囊体膜，在叶绿体被膜上也有少量分布，但不存在于基质中(图6B)。
实施例4、OsKEA1提供叶绿体K+/H+交换活性
通过TMHMM预测，OsKEA1蛋白是一个十次跨膜的钾离子外排逆向转运蛋白，有一个很保守的Na+/H+交换子结构域，为了证明OsKEA1是具有Na+(K+)/H+转运活性，本发明人利用反映跨膜H+梯度的喹吖橙结合H+发生荧光淬灭的特性，来检测原生质体和叶绿体类囊体膜依赖Na+或K+的H+移动活性。
结果发现，突变体Oskea1的质膜的Na+/H+和K+/H+交换活性都明显地低于野生型的。尤其是在低浓度范围，突变体Oskea1的K+/H+交换活性与野生型相比明显降低(图7)。
另一方面，在突变体Oskea1类囊体膜中，与离子交换活性相关的ATP合酶的活性低于野生型(图8A)。K+/H+交换活性在低浓度范围内与野生型没有差别，在KCl浓度高于50mM以上，最大降低40％(图8B)，而Na+/H+交换活性明显地低于野生型的，最大降低幅度为81％(图8C)。
本发明人认为，OsKEA1能提供原生质体和叶绿体类囊体膜K+/H+或Na+/H+交换活性。
实施例5、OsKEA1突变导致根部Na+，K+，H+离子流受到抑制
为了检查OsKEA1的突变是否影响到离子流，本发明人利用非损伤微测定技术来测定根部表面的离子流。
图9A-C显示，与野生型相比，突变体Oskea1根部的Na+，K+离子流下降了50％，H+离子流甚至变为负值。而互补植株(Com-Oskea1)则呈现为接近野生型的性状。
这些结果表明，OsKEA1对于根部离子流是不可缺少的。
实施例6、突变体叶片的Na+，K+含量提高
为了知道突变体Oskea1的K+/H+交换活性和根部离子流的降低是否影响到这些离子的含量，本发明人分析了培养10天的幼苗叶片和根部的离子含量，与野生型相比，突变体叶片的钠离子含量提高了2倍左右，叶绿体钠离子含量增加了1.4倍左右，另一方面，叶片的钾离子含量增加了30％左右，叶绿体中增加了17％，类囊体膜增加了80％，但根中这些离子含量却变化不大(图8D-G)。
这些结果表明，OsKEA1的突变导致叶绿体钾钠离子外排受阻，从而导致这些离子积累于叶片、叶绿体和类囊体膜中。
实施例7、突变体对NaCl和碱性敏感
一般土壤的pH值为5.7-6.0是适合水稻植物生长的，而pH高于7.0则属于高pH碱性土壤。
根据OsKEA1参与离子外排和调节植物pH的性质，首先，本发明人检查突变体的生长是否对额外添加钾和钠离子的培养基敏感，当在正常的培养基(1/2的MS培养基)中额外添加75mM的NaCl，培养5天后，突变体Oskea1的幼苗明显地比野生型的矮小，而互补植株则能够回复到接近野生型的表型(图10A)。在正常的培养基中添加较低浓度的NaCl(25mM)培养3周后，突变体的叶片变黄、甚至坏死(图10B)。与此形成对照，额外添加30mM KCl却不影响突变体的生长(图10C-D)。这些结果说明，突变体对NaCl敏感，但对KCl不敏感。
接着，本发明人检查了不同pH对突变体生长的影响，在pH4.0或5.7培养基的培养条件下，突变体的生长并不受到影响(图11A-D)，然而，在pH7.0的培养条件下培养5天后，突变体幼苗明显地比野生型和互补植株矮小，培养3周后，突变体的叶片呈现漂白表型(图11E、F)。
上述结果表明，OsKEA1在应对高pH条件发挥作用。
实施例8、突变体在盐碱胁迫条件下光系统II的最大光化学效率降低
根据OsKEA1定位于叶绿体和突变体在pH7.0生长时叶子被轻微地漂白，本发明人认为该基因在光合作用中发挥作用，分析比较了在不同条件生长的野生型，突变体和互补植株的光系统II的最大光化学效率(Fv/Fm)。图12显示，与野生型和互补植株相比，生长在pH4.0条件下，突变体的Fv/Fm值没有明显的变化，而在pH5.7条件下，Fv/Fm稍微降低，当生长在pH7.0条件下，三者的Fv/Fm值都显著地降低，突变体降低得更显著。
另一方面，当生长在pH5.7，额外增加30mM KCl条件下，突变体的Fv/Fm值没有明显的变化，但在外加25mM NaCl的条件下，Fv/Fm值就稍微降低。
这些结果表明，OsKEA1在盐碱胁迫条件下，起光保护作用。
实施例9、过表达OsKEA1转基因水稻的表型
为了进一步验证OsKEA1基因的功能，将编码OsKEA1基因的3465bp的全长cDNA序列片段通过SpeI和PacI插入到带有Ubiquitin启动子的用于转化水稻的双元载体pCAMBIA1300中，构建得到p1300:ProUbiquitin:OsKEA1载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法转化到突变体oskea1和野生型9522(WT)的愈伤中，得到的一百多株转基因植株(Ov-OSKEA1)也都表现出野生型表型；同时，将转基因植株提取RNA反转录后，以ACTIN作为内参，用OsKEA1基因的特异引物做RT-PCR，结果证明转基因植株中OsKEA1基因表达水平远远高于野生型的水平。本发明人进一步利用免疫印迹分析实验证明了过表达OsKEA1的植株的OsKEA1的含量无论是在叶片中还是在维管组织中显著高于野生型(图13C-D)。
这些实验证明，本发明人得到了OsKEA1基因的过表达植株，这对于将OsKEA1的功能应用到生产实践中，提供了很好的改良植物。
为了检查过表达OsKEA1的转基因植株是否能耐受盐胁迫，在正常的培养基(1/2的MS培养基)中额外添加25mM的NaCl，培养3周后，观察生长表型。
本发明人发现，无论是在盐胁迫条件下，还是在正常条件下，过表达转基因水稻的生长明显的好于野生型(图13A-B)。
实施例10、过表达OsKEA1转基因水稻的排盐能力、光合能力和产量
为了评估OsKEA1过表达的效果，本发明人首先比较了转基因株系、突变体和野生型的钠离子通过筛管流的下载速度，结果发现，过表达转基因水稻的叶片中钠离子由维管系统筛管流下载的速度比野生型强，相反，OsKEA1突变使得钠离子的维管束筛管流下载速度变慢(图14A)。
接着本发明人检测了正常条件和碱胁迫条件下光系统II最大光化学效率，图14B显示，虽然在培养箱条件下，水稻适合的pH范围内(酸性条件下pH4.0-5.7)，反映光系统II最大光化学效率的叶绿素荧光参数Fv/Fm与野生型没有差异，但在碱性条件下(pH7.0)条件下，Fv/Fm比野生型高大约16％。
本发明人还比较了大田栽培条件下，最大展开功能叶片中反映跨类囊体膜质子梯度的毫秒级延迟发光慢相的比值，结果发现，过表达株系的毫秒级延迟发光慢相的比值高于野生型的12％，相反，OsKEA1突变导致该值大约下降14％(图14C)，说明在田间条件下，过表达转基因株系具有较高的光合能力。
本发明人还评估了大田栽培条件下的单株水稻种子产量，除了一个过表达转基因株系的单株产量比野生型略有增加以外，两个过表达转基因株系的单株产量均高于野生型的20％左右(图14D)。
以上结果说明，发明人构建和筛选到的过表达OsKEA1转基因水稻具有较强的抗盐碱胁迫能力，在盐碱胁迫条件下以及在大田栽培条件下，能维持较高的光合作用效率，具有较高的经济产量。本发明为水稻等农作物改良提供了新的思路、以及提供具有显著的增产潜力和应用价值的育种材料。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种OsKEA1多肽或编码该多肽的多核苷酸的用途，用于增强植物耐盐碱胁能力或提高植物产量；或用于制备耐盐碱胁迫的植物或产量提高的植物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的植物包括：禾本科植物。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述OsKEA1多肽是：
(a)如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或
(b)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有增强植物耐盐碱胁迫能力的由(a)衍生的多肽；或
(c)氨基酸序列与(a)限定的氨基酸序列有70％以上相同性且具有增强植物耐盐碱胁迫能力的多肽；或
(d)具有(a)多肽功能的SEQ ID NO:2的多肽片段。
4.如权利要求1-3任一所述的用途，其特征在于，所述的OsKEA1多肽或编码该多肽的多核苷酸：
提高植物根部的Na+离子流，K+离子流或H+离子流，从而增强植物耐盐碱能力；
促进叶片细胞的叶绿体或根部细胞原生质体中钠离子、钾离子的外排；
促进对植物的光保护作用，从而增强植物耐盐碱能力；或
提高植物的光合作用效率，从而增强植物耐盐碱能力或提高植物产量。
5.一种增强植物耐盐碱胁迫能力或提高植物产量的方法，其特征在于，所述方法包括：提高植物中OsKEA1多肽的表达或活性。
6.一种制备具有耐盐碱胁迫能力的植物或产量提高的植物的方法，所述方法包括：提高植物中OsKEA1多肽的表达或活性。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：将编码OsKEA1多肽的多核苷酸转入植物中。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(i)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含编码OsKEA1多肽的多核苷酸；
(ii)将植物细胞、组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述编码OsKEA1多肽的多核苷酸转入植物。
9.一种OsKEA1多肽或编码其的多核苷酸的用途，用作鉴定植物的耐盐碱胁迫能力的分子标记物，或用作鉴定植物产量高低的分子标记物。
10.一种鉴定植物耐盐碱胁迫能力或产量高低的方法，包括：检测待测植物中OsKEA1多肽的表达；若待测植物中该多肽的表达量高于该类植物中OsKEA1多肽表达的常规值；则该种植物是具有耐盐碱胁迫能力或或产量提高的植物；若待测植物中该多肽的表达量低于该类植物中OsKEA1多肽表达的常规值；则该种植物是不具有耐盐碱胁迫能力或产量不高的植物。
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