CN108949806A - 转基因植物细胞及生产转基因植物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及转基因植物细胞及生产转基因植物的方法。具体地，本发明涉及转基因植物细胞，其引入了编码m⁶A去甲基酶(FTO蛋白)的核酸分子，所述m⁶A去甲基酶具有两个结构域：AlkB氧化去甲基酶功能的N端结构域（NTD）和C端结构域（CTD）。本发明还涉及生产转基因植物的方法，包括将编码所述m⁶A去甲基酶的基因引入可再生的植物细胞，以及从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物。

Description

转基因植物细胞及生产转基因植物的方法

技术领域

本发明涉及转基因植物细胞及生产转基因植物的方法。具体地，本发明涉及将编码m⁶A去甲基酶的核酸分子引入植物，从而增加植物的生物量和/或产量。

背景技术

鉴于世界人口不断增长，可获得的用于农业的土地面积不断减少，提高农业效率和增加园艺植物的多样性仍然是研究的主要目标。用于农作物和园艺植物改良的常规方法利用选择育种技术鉴定具有期望特性的植物。然而，此类选择育种技术具有几个缺点，即这些技术通常是劳动密集型的和导致产生通常包含异质遗传补充物的植物，所述异质遗传补充物可能并不总是导致从亲本植物传递期望的性状。

分子生物学的进展已使人类能够操作动物和植物。植物的基因工程需要分离和操作遗传物质(通常以DNA或RNA的形式存在)和随后将遗传物质导入植物。这样的技术已导致产生具有各种改良的经济、农艺或园艺性状的植物。具有特别经济意义的性状是生长特征例如高产量。

种子产量是特别重要的性状，因为许多植物的种子对于人和动物的营养是非常重要的。无论是通过直接的种子本身的消费还是通过建立在加工的种子上的肉产品的消费，农作物例如玉米、水稻、小麦和大豆占据了总的人热量摄入的一半以上。它们还是糖、油和许多种类的用于工业加工的代谢产物的来源。基于对发现种子产量增加基因的持续需要，现有技术公开了：通过操控植物激素水平(WO03/050287)，通过操控细胞周期(WO2005/061702)，通过操控参与盐胁迫反应的基因(WO 2004/058980)进行的几种方法。除了种子产量之外，千粒种子大小、单株植物重量、分蘖数和/或株高也是衡量植株产量的重要性状。此外，需要明确的一点是，植株体本身的生长快慢和产量之间没有必然联系，如水稻在肥料足的情况下容易使植株前期生长过快过高，后期容易产生倒伏现象，从而使水稻产量降低。

转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰。植物转基因生物技术的研究，大多分布在抗虫基因工程、抗病基因工程、抗逆基因工程、品质基因工程等领域。目前已经商品化的转基因植物主要为抗虫和抗除草剂品种，这些品种的种植，使化学农药的使用减少了37%，作物产量增加了22%，农民利润增加了68%。但是目前的转基因技术都是通过抗虫、抗除草剂等特性间接提高产量。

以往对于表观遗传学的研究往往集中在DNA和组蛋白的可逆修饰，近年来，研究人员逐渐将目光转向了RNA修饰领域。N6-甲基腺嘌呤（m⁶A）是所有真核生物的mRNA上含量最多的RNA化学修饰。m⁶A已经被发现有四十多年，但是具体的功能一直未知。直到2011年本专利发明人首次发现m⁶A的去甲基酶FTO蛋白（Jia et al, N6-methyladenosine in nuclearRNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nat Chem Biol, 2011,7 (12): 885-887），首次报道了RNA修饰的可逆性，并揭开了“RNA表观遗传学”研究的序幕。在2012年研究人员开发出了m⁶A抗体辅助的全转录组m⁶A高通量测序技术m⁶A-seq（或MeRIP），测序结果表明在人类和老鼠细胞中，约有12000个m⁶A位点，主要分布在7000个编码基因转录的mRNA和300个非编码基因转录的非编码RNA（Non-coding RNA，ncRNA）上（Dominissini et al, Topology of the human and mouse m6A RNA methylomesrevealed by m6A-seq. Nature, 2012, 485 (7397): 201-206; Meyer et al,Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3′ UTRs andnear stop codons. Cell, 2012, 149 (7): 1635-1646）。到目前为止，在哺乳动物中已经发现m⁶A的甲基转移酶主要组分为METTL3、METTL14和WTAP（liu et al, A METTL3-METTL14complex mediates mammalian nuclear RNA N6-adenosine methylation. Nat Chem Biol, 2014, 10 (2): 93-95; Ping et al, Mammalian WTAP is a regulatory subunitof the RNA N6-methyladenosine methyltransferase. Cell Res, 2014, 24 (2): 177-189）。m⁶A去甲基酶有两种，分别为FTO（fat mass and obesity associated）和ALKBH5（Jiaet al, N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nat Chem Biol, 2011, 7 (12): 885-887；Zheng et al, ALKBH5 is amammalian RNA demethylase that impacts RNA metabolism and mouse fertility.Mol Cell, 2013, 49 (1): 18-29）。m⁶A通过m⁶A结合蛋白，调控mRNA的代谢加工，包括剪接、出核、稳定性和蛋白翻译。

而在植物领域，研究人员发现在所有植物的mRNA上广泛含有m⁶A，它由m⁶A修饰酶（目前已经报道的修饰酶组分为MTA（METTL3同源基因）和FIP37（WTAP同源基因））产生，对植物生长发育具有重要的调控功能。研究发现在植物拟南芥中敲除MTA或FIP37，种子不能正常发芽，在种子萌发阶段部分回补MTA或FIP37越过种子萌发后，拟南芥缺失m⁶A会抑制植物正常生长发育（Zhong, S., Li, H., Bodi, Z., Button, J., Vespa, L., Herzog, M.,and Fray, R.G. (2008). MTA is an Arabidopsis messenger RNA adenosinemethylase and interacts with a homolog of a sex-specific splicing factor.Plant Cell 20, 1278-1288；Shen, L., Liang, Z., Gu, X., Chen, Y., Teo, Z.W.,Hou, X., Cai, W.M., Dedon, P.C., Liu, L., and Yu, H. (2016). N(6)-Methyladenosine RNA Modification Regulates Shoot Stem Cell Fate inArabidopsis. Dev Cell 38, 186-200）。

本专利发明人在之前的研究中发现FTO在去除RNA上m⁶A的甲基化过程中会产生两个相对稳定的新的修饰hm⁶A（N6-羟甲基腺嘌呤）和f⁶A（N6-醛基腺嘌呤），对RNA加工具有潜在的调控功能（Fu et al, FTO-mediated formation of N6-hydroxymethyladenosineand N6-formyladenosine in mammalian RNA. Nat Commun, 2013, 4 :1798）。本专利发明人最新的实验数据表明FTO在体内也可以去除tRNA上m¹A的甲基化修饰（实验数据未发表）。

如何在有限的土地面积上让农作物高产增收养活日益增多的人口，如何直接有效地提高植物生物量和产量，一直是所有农业科学家研究攻关的课题。对于农作物（比如水稻、小麦、玉米）来说，传统的转基因技术或杂交育种技术可以优化某个单一基因，产量通常增加10%～30%。要想获得超高产，需要很多基因协同作用。而通过RNA甲基化修饰调控mRNA的代谢水平为调控单一基因获得高效增产或增加生物量的方法提供了可能。

发明概述

本发明人出乎意料地发现可以通过在植物中引入m⁶A去甲基酶FTO，在mRNA的代谢水平进行调控，从而为调控单一基因获得高效增产或增加生物量的方法提供了可能。为了高效提高植物产量和/或生物量，本发明通过转基因技术引入异源m⁶A去甲基酶，在植物体内动态调控植物mRNA上m⁶A的含量，进而调控mRNA剪接、出核、稳定性和蛋白翻译。与传统杂交育种技术将产量增加20-30%相比，使用本发明所述的方法，通过单基因的调控可以使得植株产量增加4倍，生物量增加4倍，真正通过单基因调控实现了植物的高产量和高生物量。

具体地，本发明涉及以下方面：

一方面，本发明涉及转基因植物或植物细胞，其引入了编码m⁶A去甲基酶的核酸分子，所述m⁶A去甲基酶具有以下两个结构域：

i) 具有AlkB氧化去甲基酶功能的N端结构域（NTD）;和

ii) C端结构域（CTD）。

在一个实施方案中，本发明的植物细胞不是繁殖材料。

另一方面，本发明涉及生产具有增加的生物量、增加的产量(例如，增加的种子/谷粒产量、增加的块茎产量、增加的叶产量、增加的茎产量、增加的根产量、增加的籽棉产量)或其组合的转基因植物的方法，该方法包括：

a) 将编码m⁶A去甲基酶的基因引入可再生的植物细胞，所述m⁶A去甲基酶由核定位序列（NLS）、具有AlkB氧化去甲基酶功能的N端结构域（NTD）和C端结构域（CTD）组成；以及

b) 从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述编码m⁶A去甲基酶的核酸分子；并且在与不包含编码m⁶A去甲基酶的核酸分子的对照植物比较时表现出增加的生物量、增加的产量或其组合。

在一个实施方案中，所述方法还包括以下步骤：

c) 获得源自步骤（b）的转基因植物的后代植物，其中所述后代植物在其基因组中包含所述编码m⁶A去甲基酶的核酸分子；并且在与不包含编码m⁶A去甲基酶的核酸分子的对照植物比较时表现出增加的生物量、增加的产量或其组合。

在一个实施方案中，上文所述m⁶A去甲基酶是FTO蛋白。所述FTO蛋白可以是脊椎动物或藻类的FTO蛋白。

在一个实施方案中，所述FTO蛋白与SEQ ID NOs:1-4中的任意一个具有至少40%，优选至少50%,优选至少60%,优选至少70%,优选至少80%,优选至少90%,优选至少95%，更优选至少99%，最优选100%的同一性。

在一个实施方案中，所述编码m⁶A去甲基酶的核酸分子与SEQ ID NOs:5-12中的任意一个具有至少90%，优选至少95%，更优选至少99%，最优选100%的同一性。

本发明的转基因植物在与不包含编码m⁶A去甲基酶的核酸分子的对照植物比较时表现出增加的生物量、增加的产量或其组合。

在一个实施方案中，本发明的植物选自水稻、玉米、大豆、烟草、马铃薯、苜蓿、油菜、俄罗斯蒲公英、棉花、小麦、粟、亚麻、向日葵和亚麻芥。

本发明还涉及上文所述转基因植物的组织、器官、花粉、种子、谷粒、果实及其后代植物。

附图和序列表说明

图1 显示引入了编码FTO的核酸分子的pCAmbia 1307质粒图谱。

SEQ ID NO:1是人FTO蛋白的序列。

SEQ ID NO:2是猪FTO蛋白的序列。

SEQ ID NO:3是牛FTO蛋白的序列。

SEQ ID NO:4是Ostreococcus lucimarinus FTO蛋白的序列。

SEQ ID NO:5和6是编码人FTO蛋白的核酸序列。SEQ ID NO:5是分离自人的天然序列，SEQ ID NO:6是为了在植物中表达而进行了密码子优化的序列。

SEQ ID NO:7和8是编码猪FTO蛋白的核酸序列。SEQ ID NO:7是分离自猪的天然序列，SEQ ID NO:8是为了在植物中表达而进行了密码子优化的序列。

SEQ ID NO:9和10是编码猪FTO蛋白的核酸序列。SEQ ID NO:9是分离自猪的天然序列，SEQ ID NO:10是为了在植物中表达而进行了密码子优化的序列。

SEQ ID NO:11和12是编码猪FTO蛋白的核酸序列。SEQ ID NO:11是分离自Ostreococcus lucimarinus 的天然序列，SEQ ID NO:12是为了在植物中表达而进行了密码子优化的序列。

发明详述

m⁶A去甲基酶或其同源物和编码所述m⁶A去甲基酶或此类同源物的核酸可用于生产本发明的转基因植物。本发明选用的m⁶A去甲基酶可以存在于任何脊椎动物和海藻中。该酶由核定位序列（NLS）和以下两个结构域组成：i)具有AlkB氧化去甲基酶功能的N端结构域（NTD）和ii)C端结构域（CTD）组成。

如本文所使用的，“同源物”指执行相同生物学功能的蛋白质群中的蛋白质。同源物由同源基因表达。同源基因包括天然存在的等位基因和人工生成的变体。遗传密码的简并提供下列可能性：不导致基因产生的多肽氨基酸序列的改变而用不同碱基置换该基因的蛋白质编码序列的至少一个碱基。已根据遗传密码简并置换进行改变的任何碱基序列。同源物是在最佳比对时在全长蛋白质上具有至少60%同一性的蛋白质，更优选约70%或更高，更优选至少80%并且甚至更优选至少90%的同一性，所述全长蛋白质被鉴定为在植物细胞中表达时赋予增加的产量和/或生物量。

通过氨基酸序列比较鉴别同源物，例如人工或通过使用基于计算机的工具，所述工具使用基于同源性的已知搜索算法，例如通常已知并称为BLAST、FASTA和Smith-Waterman的那些。局部序列比对程序例如BLAST，可以用于搜索序列数据库以找到相似序列，并且汇总的期望值（E值）用于测量序列碱基相似性。因为具有特定生物的最佳E值的蛋白质命中不必是直向同源物或唯一的直向同源物，所以在本发明中使用交互查询以过滤对于直向同源物鉴别具有显著E值的命中序列。交互查询需要搜索针对来自基础生物的氨基酸序列数据库的显著命中，它类似于查询蛋白质的序列。当交互查询的最佳命中是查询蛋白质自身或由物种形成后的重复基因编码的蛋白质时，命中的可能是直向同源物。本发明的进一步的方面包括功能性同源物蛋白质，作为保守氨基酸置换的结果它们在一个或多个氨基酸方面不同于公开的蛋白质的那些，例如在下列氨基酸中的置换：酸性（带负电荷的）氨基酸例如天冬氨酸和谷氨酸；碱性（带正电荷的）氨基酸例如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；中性极性氨基酸例如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；中性非极性（疏水）氨基酸例如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；具有脂族侧链的氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族-羟基侧链的氨基酸例如丝氨酸和苏氨酸；具有包含酰胺的侧链的氨基酸例如天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸例如半胱氨酸和甲硫氨酸；天然保守的氨基酸例如缬氨酸-亮氨酸、缬氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、天冬氨酸-谷氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。在本发明转基因植物中有用的DNA编码的同源物的进一步方面是作为在天然序列中一个或多个氨基酸缺失或插入的结果与公开的蛋白质不同的那些蛋白质。

如本文所使用的，“百分比同一性”指2个最佳比对的DNA或蛋白质区段在组分例如核苷酸序列或氨基酸序列比对窗口自始自终不变的程度。关于测试序列和参考序列的比对区段的“同一性分数”是通过比对窗口由2个比对区段序列共有的相同组分的数目除以参考区段中序列组分的总数目，所述总数目是完整的测试序列或完整的参考序列中的较小者。“百分比同一性”（“同一性%”）是同一性分数乘100。

本发明使用的m⁶A去甲基酶可以是SEQ ID NO：1、2、3或4或其同源物。所述同源物与SEQ ID NOs：1-4的任意一个具有至少40%、41%、42%、43%、 44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、 55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、 66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、 77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%的序列同一性。

本发明使用的编码m⁶A去甲基酶的核酸分子可以是SEQ ID NO:5-12中的任意一个或其同源基因。所述同源基因与SEQ ID NO：5-12中的任意一个具有至少40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、 55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、 66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、 77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%的序列同一性。

本文定义的m⁶A去甲基酶的编码核酸可以不是全长核酸。如本文所定义的m⁶A去甲基酶的编码核酸的部分可以通过对全长核酸进行一个或多个缺失来制备。

用于本发明的另一核酸变体是在严格条件下，能够与本文所定义的m⁶A去甲基酶的编码核酸或与本文所定义的m⁶A去甲基酶的编码核酸的部分杂交的核酸。

能促进DNA杂交的合适的严格条件是，例如，大约45℃下，6.0 x 氯化钠/柠檬酸钠（SSC），接着在50℃用2.0 x SSC洗涤，这是本领域技术人员已知的，或者可在CurrentProtocols in Molecular Biology (1989)中找到。例如，洗涤步骤中的盐浓度可选自：50℃下大约2.0 x SSC的低严格性，至50℃下大约0.2 x SSc的高严格性。此外，洗涤步骤的温度可以从室温，即约22℃下的低严格性条件至约65℃下的高严格性条件。温度和盐可都改变，或者，温度或者盐浓度可以保持恒定，其它变量改变。用于本发明的核酸可以在所述条件下与编码FTO蛋白的核酸分子，如SEQ ID NO:5-12的任一个或其部分特异性杂交。

本发明核酸的全部或部分可以是使用选则的宿主偏好的密码子来合成的。物种偏好的密码子可以通过，例如，从在特定宿主物种中表达的蛋白中使用最频繁的密码子来确定。因此，本发明的核酸包括了为了在植物中表达而对天然FTO蛋白编码核酸进行了密码子优化得到的核酸。对核苷酸序列的其它修饰可以得到具有轻微改变的活性的突变体。

本发明涉及引入了编码上文所述的m⁶A去甲基酶FTO或其同源物的基因的转基因植物或其后代植物。本发明还涉及所述植物的细胞、组织、器官、花粉、种子、谷粒或果实。

有关将核酸片段（例如重组DNA构建体）插入细胞内的“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可整合进细胞的基因组（如染色体、质粒、质体或线粒体DNA）内，转变成自主的复制子或瞬时表达（如转染的mRNA）。

“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株的后代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。“后代”包括植物的任何后续世代。

本发明的植物按用途可以是粮食作物、经济作物、蔬菜作物、果类、花、草、树木、工业原料作物、饲料作物或药材作物。进一步地，所述粮食作物包括水稻、玉米、大豆、豆类、薯类如木薯、马铃薯、青稞、蚕豆、小麦、大麦、粟、黑麦、燕麦、高粱等；所述经济作物包括油茶、油菜、油籽、亚麻、亚麻芥、花生、胡麻、大麻、向日葵、烟草、棉花、甜菜、甘蔗等；所述蔬菜作物包括萝卜、白菜、西红柿、黄瓜、辣椒、胡萝卜等；所述果类包括梨、苹果、核桃、樱桃、草莓、红枣或桃；所述花包括观赏性花卉，如兰花、菊花、康乃馨、玫瑰、绿植等；所述草和树木包括杨树、橡胶树、红豆杉和用于城市绿化或者沙漠中及干旱等恶劣条件下的草和树木；所述工业原料作物包括俄罗斯蒲公英、银胶菊、麻疯树等；所述饲料作物包括牲畜的食料如苜蓿等；所述药材作物包括人参、当归和灵芝等。

“转基因植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。优选的是，异源多核苷酸被稳定地整合进基因组中，使得该多核苷酸传递至连续的世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。

针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。

本发明制备了重组DNA构建体，其包含编码本文描述的FTO蛋白的核酸分子。该构建体可以包含任选与在宿主细胞中起作用的启动子序列可操作地连接的编码本文描述的FTO蛋白的核酸分子。其他构建体组分可以包括另外的调节元件，例如用于增强转录的5’前导序列和内含子、3’非翻译区（例如多腺苷酸化信号和位点）、用于转运的DNA、信号肽或一种或多种选择标记基因。

如本文所使用的“启动子”指用于起始转录的调节DNA。“植物启动子”是无论其起源是否是植物细胞都能够在植物细胞中起始转录的启动子，例如众所周知的是土壤杆菌属启动子在植物细胞中起作用。因此，植物启动子包括从植物、植物病毒和细菌例如土壤杆菌属和慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）细菌获得的启动子DNA。在发育控制下的启动子的实例包括优先起始在特定组织例如叶、根或种子中的转录的启动子。此类启动子称为“组织优选的”。只起始在特定组织中的转录的启动子称为“组织特异性的”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动在一种或多种器官的特定细胞类型，例如根或叶中的血管细胞中的表达。“诱导型”或“阻抑型”启动子是在环境控制下的启动子。可以影响通过诱导型启动子的转录的环境条件的实例包括缺氧条件、或特定化学药品、或光的存在。组织特异性的、组织优选的、细胞类型特异性、和诱导型启动子构成“非组成型”启动子类别。“组成型”启动子是在大多数条件下有活性的启动子。可以用于本发明的启动子没有特别的限制。本领域技术人员可以根据常识选择合适的启动子。

如本文所使用的，“可操作地连接”指在DNA构建体中结合2个或更多个DNA片段，从而使得一种例如编码蛋白质的DNA的功能受另一种例如启动子的控制。

DNA构建体通常含有选择标记基因。选择标记基因用于提供鉴别细胞的有效系统，所述细胞通过在其基因组中接受和整合转基因DNA构建体稳定转化。优选的标记基因提供选择标记，所述选择标记赋予针对选择试剂，例如抗生素或除草剂的抗性。潜在转化的细胞暴露于选择剂。在存活细胞群体中的将是其中抗性赋予基因一般以足够水平整合并表达以允许细胞存活的那些细胞。可以测试细胞以进一步证实外源DNA的稳定整合。通常使用的选择标记基因包括赋予对抗生素抗性的那些，所述抗生素例如卡那霉素和巴龙霉素（nptII）、潮霉素B（aph IV）和庆大霉素（aac3和aacCA），或针对除草剂例如草铵膦（bar或pat）和草甘膦（aroA 或EPSPS）的抗性。此类选择标记的实例在美国专利 5,550,318；5,633,435；5,780,708和 6,118,047中说明，所有专利引入本文作为参考。提供视觉鉴别转化体的能力的选择标记也可以采用，例如表达有色或荧光蛋白质例如萤光素酶或绿色荧光蛋白（GFP）的基因，或表达β葡糖醛酸糖苷酶的基因或其各种显色底物是已知的uidA基因（GUS）。

将所述DNA构建体引入植物可通过任何合适的技术来进行，这些技术包括但不限于DNA直接摄取、化学处理、电穿孔、显微注射、细胞融合、感染、病毒介导的DNA转移、轰击或农杆菌介导的转化。对于基于农杆菌的植物转化系统，在转化构建体上存在的另外元件将包括T-DNA左和右边界序列以促进重组多核苷酸整合到植物基因组中。

一般而言，在靶植物系的基因组中随机即在非特异性位置导入重组DNA是有用的。在特殊情况下，靶向重组DNA插入片段可以是有用的，以实现位点特异性整合，例如代替基因组中的现有基因，使用植物基因组中现有的启动子，或在已知对于基因表达有活性的预定位点插入重组多核苷酸。现有的已知在植物中起作用的几种位点特异性重组系统包括如美国专利 4,959,317中公开的cre-lox，以及如美国专利 5,527,695中公开的FLP-FRT，两个所述专利都引入本文作为参考。

本发明的转化方法优选在培养基上和控制环境中的组织培养中实践。“培养基”指众多营养物混合物，它们用于体外培养细胞，即在完整活生物之外。受体细胞靶包括，但不限于，分生组织细胞，愈伤组织，未成熟胚和配子细胞例如小孢子、花粉、精子和卵细胞。预期的是由其可以再生能育植物的任何细胞用作受体细胞。愈伤组织可以从组织来源开始，包括，但不限于，未成熟胚、幼苗顶端分生组织、小孢子等。能够作为愈伤组织增殖的细胞也是用于遗传转化的受体细胞。用于制备本发明转基因植物的实际转化方法和材料，例如各种培养基和受体靶细胞，未成熟胚细胞的转化和后续能育的转基因植物的再生例如公开于美国专利6,194,636和6,232,526中，它们引入本文作为参考。

含有编码所关注蛋白质的外来的外源性分离核酸片段的植物的发育或再生是本领域所熟知的。将再生的植物进行自花授粉以产生纯合的转基因植物。或者，将得自再生植物的花粉与农学上重要的品系的产生种子的植株进行杂交。然后，将来自这些重要品系植物的花粉用于给再生植物授粉。利用本领域技术人员所熟知的方法培育含有编码FTO蛋白的核酸分子的本发明的转基因植物。

可以从能育的转基因植物收获转基因植物的种子并且可以用于培育本发明的转化植物的后代，包括用于选择具有增强的性状的植物的杂交植物系。除了用编码FTO蛋白的核酸分子直接转化植物外，通过使具有编码FTO蛋白的核酸分子的第一种植物与缺乏该核酸分子的第二种植物杂交可以制备转基因植物。例如，编码FTO蛋白的核酸分子可以导入顺应转化以生产转基因植物的第一种植物系中，所述第一种植物系可以与第二种植物系杂交以使编码FTO蛋白的核酸分子渐渗到第二种植物系中。

将来源于本发明植物细胞的转基因植物培育至产生与对照植物相比具有提高的生物量和/或产量。如本文所使用的，“对照植物”指不包含编码FTO蛋白的核酸分子的植物。对照植物用于鉴别并选择具有提高的生物量和/或产量的转基因植物。适当的对照植物可以是用于产生转基因植物的亲本系的非转基因植物，即缺乏编码FTO蛋白的核酸分子。适当的对照植物在某些情况下是半合子转基因植物系的后代，它不包含编码FTO蛋白的核酸分子，称为阴性分离子。

本发明所述的转基因植物的“产量”是指栽培目的所需要产品的收获量。评价不同植物的产量的标准不同。例如，禾谷类作物(水稻、小麦、玉米等)、豆类和油料作物(大豆、花生、油菜等)的产量评价对象是种子（籽粒）；棉花为籽棉或皮棉；薯类作物(甘薯、马铃薯、木薯等)为块根或块茎；麻类作物为茎纤维或叶纤维；甘蔗为茎秆；甜菜为根；烟草为叶片；绿肥作物(苜蓿、三叶草等)为茎和叶等。同一植物，因栽培目的不同，其产量的概念也不同。如玉米，作为粮食和精饲料作物栽培时，产量是指籽粒收获量，而作为青贮饲料时，产量则包括茎、叶和果穗的全部收获量。

本发明转基因植物增加的产量可以以多种方法测量，包括测试重量、每株植物的种子数目、种子重量、块茎重量、每单位面积的种子数目( 即，每英亩的种子、或种子重量)、每英亩的蒲式耳、每英亩的公吨、每英亩的吨、每公顷的公斤。

本领域技术人员能够根据现有技术确定每种植物产量的含义及其评价标准。

生物量（biomass）, 指现存生物有机物的总质量。本发明中用植物干种、鲜重、分蘖数等表示。本发明转基因植物增加的生物量可以以多种方法测量，包括测试重量、每株植物地上部分的干重、鲜重、分蘖数，每单位面积的植物地上部分的干重、鲜重 ( 即，每英亩的植物的干重、鲜重)、每英亩的蒲式耳、每英亩的公吨、每英亩的吨、每公顷的公斤。

实施例

本发明将在下面的实施例中进一步说明。应该理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实施例，本领域的技术人员可以确定本发明的基本特征，并在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明做出多种改变和修饰，以使其适用于多种用法和条件。因此，除了那些本文所示和描述的那些之外，根据前文所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些修改形式也旨在属于所附的权利要求书的范围内。

在下述每一实施例中，使用的材料如下：

1、农杆菌生长的YEP液体培养基配方（每升含量）：酵母提取物10g/L+蛋白胨10g/L+NaCl 5g/L，PH 7.2。固体培养基加入15g/L琼脂。

2、农杆菌重悬液AAM培养液：50ml 20×AA大量元素，10ml 100×FeEDTA，10ml 100×B5大量元素，10 ml 100×B5维生素，100 ml 10×AA氨基酸，1 ml 100 mM 乙酰丁香酮，68.5 g蔗糖，36 g葡萄糖，0.5 g水解酪蛋白，定容至1000 ml，调节pH至5.2，过0.22 mm醋酸纤维素膜灭菌。

3、20×AA大量元素：59g KCl，3g CaCl₂· 2H₂O，10g MgSO₄·7H₂O和3g NaH₂PO₄·H₂O蒸馏水定容至1L，4℃保存。

4、10×AA氨基酸：8.76 g Gln，2.66 g Asp，1.74 g Arg和75 mg Gly用蒸馏水定容至1L，过0.22 mm醋酸纤维素膜除菌，4℃保存。

5、100×B5维生素：10 g肌醇，1 g盐酸硫胺素，100 mg盐酸吡哆醇和100 mg烟酸蒸馏水定容至1L，4℃保存。

6、100×B5大量元素：1.320 mg MnSO₄·4H₂O，200 mg ZnSO₄·7H₂O，2.5 mgCuSO₄·5H₂O，25 mg Na₂MoO₄·2H₂O，2.5 mg CoCl₂·6H₂O，300 mg H₃BO₃和75 mg KI蒸馏水定容至1L，4℃保存。

7、NB培养基：N6培养基大量元素和微量元素，B5培养基的有机元素，300mg/L水解酪蛋白，500mg/L谷氨酰胺，30g/L蔗糖和8g/L琼脂。

实施例1：m⁶A去甲基酶基因cDNA的获得

利用美国国立生物技术信息中心 (NCBI)的数据库，搜索FTO基因，分别获得人FTO（Homo sapiens (human)）、猪FTO（Sus scrofa (pig)）、牛FTO（Bos Taurus（cattle））和海藻FTO（Ostreococcus lucimarinus CCE9901）的蛋白氨基酸序列（SEQ ID NO:1-4）和核酸序列（SEQ ID NO:5、7、9和11）。根据搜索结果购买相应基因的cDNA，没有商品化的委托GenScript公司进行基因序列合成，同时也在GenScript将SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列优化到植物密码子，合成了优化密码子的核酸序列SEQ ID NO:6、8、10和12。

用于以下实施例的FTO基因cDNA为SEQ ID NO:5、7、9和11。

实施例2：m⁶A去甲基酶的克隆

通过PCR，将FTO基因cDNA（SEQ ID NO:5、7、9、11）克隆至植物双元载体pCAMBIA1307。插入基因序列平均大小是1.5 kb。得到的质粒如图1所示。

实施例3 植物转化

3.1利用转基因技术将实施例2的FTO基因导入水稻

一、以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织

1．消毒：

取水稻(日本晴（japonica Nipponbare）)成熟种子，人工脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，将种子放入100ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒2分钟；倒去酒精，加入20%次氯酸钠（NaClO）溶液，浸泡30分钟；倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后用无菌蒸馏水浸泡种子30分钟。

2．诱导培养（需无菌操作）：

将消毒后的种子放在无菌滤纸上吸干表面水分后，置入含2.0mg/L 2，4-D的NB培养基（PH5.8）中，每皿12~14颗；为保证诱导率，接种时最好保持种子发芽方向与培养基平行或者稍微向下，不要让发芽方向向上或者垂直向下。操作完毕用封口膜封好培养皿，在30℃、湿度约50%的光照培养箱中，暗诱导培养20~30天直到出现明显松散的愈伤组织，进行继代培养。

3．继代培养（需无菌操作）：

在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂、生长旺盛、质地坚硬、色泽嫩黄、颗粒直径3mm左右的愈伤组织置入含2.0mg/L 2,4-D和0.5mg/L 6-BA的NB培养基（PH5.8）中，每皿放置10颗愈伤组织，于30℃，暗培养；如果发现愈伤组织变软严重，推荐放在光下继代。继代时长约为10~15天（根据愈伤组织生长多少，决定下次继代时间），共继代两次。

二、农杆菌培养

将图1所示的携带FTO基因和潮霉素抗性基因Hygromycin的pCambia 1307载体转入农杆菌LBA4404中，接种到含20mg/L利福平（Rif）和50mg/L卡那霉素（Kan）的YEP固体培养基上。28℃培养2天后，挑取农杆菌单克隆做菌落PCR验证FTO是否已转入农杆菌内，并选择阳性单克隆于4ml YEP（含50 mg/L Kan和20 mg/L Rif）培养液中，28℃，220rpm振荡培养20-36h至菌液OD₆₀₀为0.8~1.0。

三、侵染与共培养

1、培养好的农杆菌菌液于4℃，4000 rmp，离心10 min，去上清。用含100μmol/L 乙酰丁香酮的AAM培养液制成悬浮液，使菌液OD₆₀₀的终浓度为0.2左右。

2、将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染20-30 min。

3、将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干20-30 min，以免共培养的时候农杆菌生长过多，对愈伤组织损害过度。

4、将愈伤组织置于含2.0mg/L 2,4-D和100μmol/L乙酰丁香酮的NB培养基（PH5.2），25℃暗培养48-72h。

四、抗性愈伤的筛选

将愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次，其间需不停的振荡。然后将愈伤组织放置在灭菌滤纸上吹晾，均匀的放在含50mg/L潮霉素的NB培养基（PH 5.8）上进行第一轮选择筛选。28℃暗培养，发现有霉菌或农杆菌生长及时将长菌的愈伤组织转到新的筛选平板上。

筛选30天左右新的愈伤组织长出后，转移到新的50mg/L潮霉素的NB培养基（PH5.8）上再筛选7~10天，如果明显生长，则为阳性愈伤组织，如果不生长即使不出现变褐死亡现象也可能为假阳性。

五、抗性愈伤组织的诱导分化和生根

将第二次筛选生长旺盛，黄色的愈伤组织颗粒（保证用于分化的愈伤组织是没有瑕疵的）放置到含2.0mg/L 6-BA、0.5mg/L激动素，50mg/L潮霉素的NB培养基（PH 5.8）上，每瓶放置2-3个阳性克隆，每个克隆放置少量的愈伤组织即可，放置的愈伤组织要质量高，而不在乎数量多。27℃暗培养10天，后光照分化10-20天长出绿叶后就可以进行生根，光强4000lux，14h/d。

将每个克隆分化出的健壮苗至于含0.5mg/L萘乙酸、50mg/L潮霉素的1/2N6培养基（PH5.8）中诱导生根，每瓶放置2-3棵苗。27-30℃光照培养，光强4000lux，14h/d，7~10天后打开封口膜加入适量的无菌水。2~3天后移栽。

六、转基因苗的锻炼和移栽

将根部和茎叶分化得较完好的水稻小苗挑出（苗长至试管顶部，就要及时开盖），打开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水（防止培养基长菌），炼苗3天至一周左右，然后洗去琼脂，移栽到温室的土钵中生长，检测。

实施例4 转化苗的检测验证

1、PCR检测：设计FTO基因引物

人源FTO（hFTO）使用的检测引物：

hFTO-F：5'-ATGAAGCGCACCCCGACTG-3' (SEQ ID NO:13)；

hFTO-R：5'-GGGTTTTGCTTCCAGAAGCTGA-3' (SEQ ID NO:14)；

牛源FTO（cFTO）使用的检测引物：

cFTO-F: 5'-ATGAAGCGGACCCCGACG-3' (SEQ ID NO:15)；

cFTO-R: 5'-GGGCCTGGTTTCCAGAAGCAG-3' (SEQ ID NO:16)；

猪源FTO（pFTO）使用的检测引物：

pFTO-F: 5'-ATGAAGCGAACCCCAACCGC-3' (SEQ ID NO:17)；

pFTO-R: 5'- GGGTTTGGCTTCCAGAAGCAGAC -3' (SEQ ID NO:18)；

海藻源FTO（olFTO）使用的检测引物：

olFTO-F: 5'-ATGTCGCCGTCATCCTCCG-3' (SEQ ID NO:19)；

olFTO-R: 5'-CACTTTGTTTTGCTCCTCCTCGAGAAA-3' (SEQ ID NO:20)；

PCR 反应程序为：95℃ 5min，95℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 30s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。反应结束后，PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。

2、潮霉素快速检测转基因幼苗的方法：剪取并收集待检测苗1cm左右长的新鲜绿色叶片（两端均留有切口），平放于检测培养基（0.7% agar，1ml/L的6-BA，50mg/L的潮霉素）上，28℃，16h光/8h暗培养48h，叶片依旧保持鲜绿的即为阳性植株，而阴性幼苗的叶片出现块状坏死。

实施例5 来自多个物种的FTO基因在水稻中的效果评价

来自实施例3的水稻中的实验结果（未引入FTO基因的日本晴（japonica Nipponbare）品种为对照）如表1所示。统计数据来自于成熟期的50株转基因和对照水稻。干重为105摄氏度烘箱杀青20 min，80 摄氏度烘箱烘20小时后称取获得的数据。

表1 人、牛、猪和海藻的FTO引入水稻的效果评价（转基因植物/对照）

由表1可见，将多个物种的天然FTO编码核酸分子引物水稻中，导致了生物量和种子产量的提高。

发明人还用同样的方法测试了密码子优化的FTO编码核酸分子(SEQ ID NOs:6,8, 10和12)，数据与上述结果类似，因此未单独显示。

实施例6 FTO在多种植物中的效果评价

将编码人FTO的核酸分子转化多种植株，获得多种引入了FTO编码核酸的转基因植物细胞和植物。方法如下：

烟草遗传转化法：

1 实验材料

材料：K326烟草种子, 农杆菌菌株为根癌农杆菌LBA4404，HF（人FTO）基因克隆到35S启动子驱动的载体pCAMBIA2300。

药品：MS大量元素，MS微量元素，MS铁盐,吲哚乙酸（IAA），6-苄氨基腺嘌呤（6-BA），烟肌醇(B₁B₆),蔗糖，琼脂，头孢霉素（Cef），羧苄青霉素（Carb），卡那霉素（Kn）、庆大霉素、利福平；

MS培养基(1L)：大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe²⁺(100x)10ml、蔗糖30g、琼脂8g，PH值约为6.0

预培养基(1L)：大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe²⁺(100x)10ml、6-BA(1000x)2ml、B₁B₆(200x)5ml、甘氨酸(1000x)1ml、琼脂8g，PH值约为6.0。高温灭菌后加IAA(0.2mg/L)1ml

分化培养基(1L)：预培养基的基础上加入头孢霉素2ml，羧苄青霉素1ml，卡那霉素1ml.

生根培养基(1L)：1/2MS、IAA 2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.8g/L，pH=5.8

LB液体培养基(1L)：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCI 10g

MS₀培养基：为不加琼脂的只含大量元素MS培养基。

2. 烟草转化（叶圆盘法）

按叶圆盘法转化烟草。将剪切好的烟草叶盘(leaf discs)放置在预培养基上培养1-2天后，置于农杆菌悬菌液中（MS_O悬浮，可以稀释50—100倍）浸泡3-5分钟。然后取出，用无菌滤纸吸去其表面的液体。将浸染过的叶盘分接种在覆有两层滤纸的预培养基上号，26℃下暗培养20-24h。用加头孢霉素，羧苄青霉素(母液1000倍)的无菌水清洗10分钟，最后用无菌水清洗10分钟，然后用无菌滤纸吸去其表面的液体再转入分化培养基进行分化培养，前期2-3天继代一次，每次继代需在无菌条件下进行，连续继代3次后就每隔两周继代一次。共培养至第一个小芽长出。转入组培瓶培养。待芽长至2厘米时，在超净台上切去芽基部的所有愈伤组织及基部叶片，植于生根培养基上。待根长至3厘米时，取出无菌苗，轻轻打碎固体培养基，洗去残留的培养基。然后将无菌苗置入土壤，套上透明塑料袋（扎孔），培养大约一周，移到室外。（最初的3天在阴暗处生长）。

马铃薯遗传转化法

1. 实验材料

马铃薯品种东农303的脱毒微型薯为外植体，农杆菌菌株LBA4404，HF（人FTO）基因克隆到35S启动子驱动的载体pCAMBIA2300。

2. 马铃薯遗传转化

采用马铃薯品种东农303的脱毒微型薯为外植体。农杆菌菌株LBA4404含HF基因质粒。将马铃薯用蒸馏水冲洗干净，用75%酒精浸泡30秒、0.1%的升汞浸泡10分钟、无菌水清洗5次后，去皮切成厚度为1毫米左右的薄片，与农杆菌菌液混合，轻轻摇动使菌液与外植体充分接触。无菌滤纸吸去多余菌液，装入共培养基上黑暗培养。共培养结束后，将薯块用无菌水和液体MS培养基各清洗3次，洗去多余菌液，转入薯块再生培养基中。待芽长至1.5～2.0毫米时剪下转入生根培养基中，进行生根筛选扩繁。

大豆遗传转化

1. 材料

农杆菌菌株为 LBA4404；大豆东农 L13 球形期体细胞胚团块；转基因质粒为HF基因克隆到35S启动子驱动的载体PCAMBIA2300，在真核植物中的筛选抗性为卡纳霉素抗性。

植物组织培养培养基以及培养条件:

继代培养基：MS +15mg/L)-20mg/L 2 , 4 -D +0 .8 %琼脂 +3 %蔗糖 pH =5 .8 自然光

重悬培养基：继代培养基(液体)+AS(0 -100μmol/ L)pH =5 .8 自然光

共培养培养基：感染培养基 +AS (0 -100μmol/ L)pH =5 .6

脱菌筛选培养基： 继代培养基 +(50 -300mg/L)头孢霉素 +25 -50mg/ L 卡那霉素

萌发培养基 1 :M S +1 %活性炭 +0 .8 %琼脂+10 %蔗糖 光照 16h/d

萌发培养基 2 :MS +0 .8 %琼脂 +10 %蔗糖 光照 16h/d

壮苗培养基： MSB +0 .8 %琼脂 +3 %葡萄糖pH =7 光照 16h/d

(最后三种培养基同时加入卡那霉素 0 -50mg/L L 和头孢霉素(0 -300mg/L)。

2. 农杆菌侵染转化以及植株再生

大豆的体细胞胚团块直径3mm 左右, 侵入预备好的农杆菌感染液中侵染, 然后倒掉菌液, 用无菌滤纸吸干后接种到共培养培养基上, 再接种到含有卡那霉素50 mg/L 、头孢霉素浓度300 mg/L(根据情况依次降低, 以不长菌为宜)的脱菌筛选培养基上。侵染时间10min，共培养时间2-3天，乙酰丁香酮100μmol/L，农杆菌浓度OD600在0.5-0.7 。每隔15 -20天继代一次, 3 个月内调查产生的抗性体细胞胚团块数(直径3mm 左右), 计算转化率(抗性体细胞胚块数/接种的体细胞胚块×100), 然后抗性体细胞胚块转入萌发培养基1 中。萌发20 天以后, 再转入萌发培养基2 中。直到长成再生抗性小植株, 再转入壮苗培养基得到转化植株。

苜蓿遗传转化

1. 材料

苜蓿品种：公农-1号；农杆菌：LBA4404；克隆HF基因的植物双元表达载体(binaryexpression vector) pCAMBIA2300，抗卡那霉素。

培养基为MS培养基附加各种生长调节物质，pH值为5.8。培养温度23~25℃，光照强度2 000 lx，光照时间18 h/d，约20d继代一次。

2. 愈伤组织制备

以下胚轴为外植体，经过愈伤组织诱导、体胚分化。当体胚成熟后，将体胚转到MS0中进行萌发试验。

3. 胚性愈伤组织悬浮培养

别将3 g 的愈伤组织接种到盛有40 m L 悬浮培养液的150 m L 三角锥瓶中进行悬浮培养，每隔 7 d 换一次新鲜的培养基，摇床转速150 r/min，自然散光照射。15 d 后，测定细胞生长速度。将合适的愈伤组织接种到已筛选出的最佳胚性愈伤组织诱导液体培养基中，摇床转速分别设定为 120 r/min。每隔7 d换一次新鲜的培养基，自然散光照射约 30d。

4. 农杆菌转化

将胚性愈伤组织装到2.0 m L盛有600 μL液体共培养培养基的小离心管中，用参数为100m Hz的超声波处理8 s，然后共培养4d。将浸染后的悬浮胚性愈伤平放在含有100μmol/L乙酰丁香酮的半固体共培养基中，暗培养4 d。

5. 转化植株的筛选与再生

将共培养后的胚性愈伤组织接种到分化培养基中培养50~60 d，胚性愈伤组织经过4个胚期生长成成熟的体胚。然后，将其转入体胚萌发培养基中。约20~30 d 左右，当植株长到10 cm左右时炼苗移栽。其中使用的卡那霉素筛选浓度为30 mg/L。

油菜遗传转化

1. 材料

用于遗传转化的甘蓝型油菜品种CY2，农杆菌菌株EHA105，克隆HF基因的植物双元表达载体pCAMBIA1301。

2. 农杆菌转化

用牙签挑取新鲜菌落在含 Km 50 mg/L 及 Rif 50 mg/L 的 YEB 液体培养基中 28℃振荡培养，至对数分裂中期(OD600=0.3)。取菌液于 12 000 r/min 离心1 min，用 MS 培养基离心洗涤一次后稀释 10 倍，将受体亲本 CY2 种子灭菌后接种在 1/2 MS 培养基上培养无菌苗，5~7 d 后将下胚轴切成 1 cm 左右长的小段，作为外植体用于携带有HF基因的质粒pCAMBIA1301的根癌农杆菌的介导转化。

转化按王伏林等(核农学报, 5(26): 1129-1134(2011))的方法进行。转化子采用潮霉素(Hyg) 10 mg/L 进行筛选，筛选出的 Hyg 抗性苗生根后在温室盆钵中驯化一段时间，随后移栽于大田。

棉花遗传转化

1. 材料与试剂

棉花品种：中521，农杆菌菌株 GV3101，克隆HF基因的植物双元表达载体pCAMBIA2300，抗卡那霉素。

MSB培养基 ：以ＭＳ无机成分＋Ｂ5有机成分为基本培养基，并附加不同的激素成分；

侵染液：ＭＳ无机盐＋Ｂ5有机物＋0.1 mg/L 2,4-D＋0.1 mg/L ＫＴ＋100 μmol/LＡＳ（乙酰丁香酮）＋30 g/L葡萄糖；

共培养：ＭＳ无机盐＋Ｂ5有机物＋0.1 mg/L 2,4-D＋0.1 mg/L ＫＴ＋100 μmol/LＡＳ（乙酰丁香酮）＋30 g/L葡萄糖＋2.5 g/L植物凝胶；

筛选培养基：ＭＳ无机盐＋Ｂ5有机物＋0.1 mg/L 2,4-D＋0.1 mg/L ＫＴ＋30 g/L葡萄糖＋2.5 g/L植物凝胶＋卡那霉素50 mg/L＋150 mg/L羧苄青霉素。

2. 外植体培养

浓硫酸脱绒后的棉子用自来水冲净，剥出种仁，然后在超净工作台内将脱绒后的种子置于灭菌后的三角瓶中，用70% ～75%的酒精浸泡1min，无菌水冲洗后，再用2% 次氯酸钠浸泡60 min，倒掉次氯酸钠，经无菌水多次冲洗后，于无菌水浸泡24 h。露白后，剥去种皮，接种于1/2ＭＳ种苗培养基中，28 ℃暗培养。取苗龄5d左右幼苗切成0.5~0.6 cm小段做外植体。

3. 外植体与农杆菌共培养

将无菌苗下胚轴切成0.5 cm左右的小段，浸于农杆菌菌液中30~40 min，取无菌滤纸吸干菌液，置于MSB固体培养基上共培养48h。

4. 愈伤组织的诱导、选择及植株再生

将共培养的下胚轴切段转接到含卡那霉素50 mg/L、羧苄青霉素500 mg/L的MSB固体筛选培养基上。培养至60 d时，选择抗卡那霉素的阳性愈伤块，转入不含抗生素的上述培养基上继代培养。以后根据愈伤组织状态，通过调整培养基中

的激素浓度，获得颗粒状胚性愈伤，继而分化胚状体培养出再生植株。

小麦（胚性愈伤组织）遗传转化

1. 试验材料

采用幼胚组织培养，实验品种为河农827。农杆菌菌株Ｃ58，克隆HF基因的植物双元表达载体pCAMBIA2300，抗卡那霉素。

小麦遗传转化过程所用培养基包括:

愈伤组织诱导培养基MSW0：ＭＳ基本培养基＋2mg/L2,4-Ｄ＋4mg/L毒莠定＋0.5g/L谷氨酰胺＋0.75g/L MgCl2＋0.1g/L水解酪蛋白＋1.95 g/L MES ＋100 mg/L抗坏血酸＋40g/L麦芽糖＋4.5g/L琼脂，pH5.8；

侵染液PCM：ＭＳ基本培养基＋2mg/L 2,4-Ｄ＋4mg/L毒莠定＋0.5g/L谷氨酰胺＋0.75g/L MgCl2＋0.1g/L水解酪蛋白＋1.95 g/L MES ＋100 mg/L抗坏血酸＋200μmol/L乙酰丁香酮＋40g/L麦芽糖＋4.5g/L琼脂，pH5.8；

愈伤组织筛选培养基SM：ＭＳ基本培养基＋2mg/L 2,4-Ｄ＋4mg/L毒莠定＋0.5g/L谷氨酰胺＋0.75g/L MgCl2＋0.1g/L水解酪蛋白＋1.95 g/L MES ＋100 mg/L抗坏血酸＋250mg/L羧苄青霉素＋25 mg/L G418＋40g/L麦芽糖＋4.5g/L琼脂，pH5.8；

抗性愈伤组织分化培养基RSM：ＭＳ基本培养基＋2mg/L 2,4-Ｄ＋4mg/L毒莠定＋0.5g/L谷氨酰胺＋0.75g/L MgCl2＋0.1g/L水解酪蛋白＋1.95 g/L MES ＋100 mg/L抗坏血酸＋250 mg/L羧苄青霉素＋25 mg/L G418＋0.5 mg/L激动素＋0.2 mg/L萘乙酸＋40g/L麦芽糖＋4.5g/L琼脂，pH5.8。

2. 未成熟籽粒灭菌与幼胚接种

取小麦开花授粉后12～15d的未成熟籽粒，用70%酒 精 表 面 消 毒3

0ｓ，0．1% 升 汞 消 毒8ｍｉｎ，无菌水清洗4～5次。用解剖针挑出幼胚，盾片朝上分别接种在ＭＳＷ0愈伤组织诱导培养基上，25℃暗培养2周。然后转入分化培养基，25℃光照16h，黑暗8h培养4～6周。

3. 农杆菌介导的遗传转化程序

将含有HF的的农杆菌C58用涂棒均匀接种在ＬＢ固体培养基上（pH7.0，含50 mg/L 卡那霉素＋50 mg/L利福平），28℃ 培养3d，然后23℃培养1d。从培养基上刮取少量农杆菌转接到含上述抗生素的ＹＥＰ液体培养基中28℃过夜培养，摇床转速250 r/min。OD600达到1.0收集农杆菌，用 PCM侵染液重悬农杆菌，重悬液浸泡愈伤组织3h，然后倒去菌液，将愈伤组织转入铺有无菌滤纸的培养皿中共培养3d，转移到筛选培养基上25℃暗培养2周，再转移到分化培养基上25℃光照培养。

粟遗传转化

采用与小麦相同的方法。

亚麻遗传转化

1. 材料

亚麻：黑亚7号。根癌农杆菌(A grobacteriumtum efaciens) 菌 株 EHA 105 和 克隆HF基因的植物双元表达载体pCAMBIA1301，抗卡那霉素。

2. 外植体的制备

选择饱满度好,有光泽的黑亚7号种子,用75%的乙醇浸5分钟后,用20%的漂白粉上清液浸20分钟,然后再用无菌水冲洗3次,接种到MS培养基上,在25℃黑暗条件下培养5- 7天,在使用前2天使其置于22℃,每天16小时光照条件下备用。

3. 农杆菌菌液的制备

含有目的基因的菌株EHA105的繁殖,采用YEP培养基,蛋白胨10g/L,酵母提物10g/L,NaCl5g/L,卡那霉素50mg/L。接种后在28℃条件下摇振培养2天。3000转/分离心10分钟后去除上相,将菌体用1/2MS液体培养基悬浮后(OD600= 0.5)用于转化。

4. 选择压力试验

将无菌的亚麻下胚轴剪成0.3-0.5mm的小段,用无菌水浸10分钟,再用无菌滤纸吸干后分别接种到50mg/L卡那霉素的MS培养基上,在24- 26℃条件下培养,光照周期为每天16小时。

5. 共培养

将亚麻下胚轴剪成0.3- 0.5mm的小段,然后用农杆菌EHA105悬浮液浸10- 20分钟,用无菌滤纸吸干后分别接种到附加KT2mg/L、IAA3.5mg/L、HL150mg/L的MS、B5、N6培养基上。培养条件同上。

6. 筛选培养与生根

筛选培养基与共培养的培养基相同,只是在其中加入了50mg/L的卡那霉素和1000mg/L的头孢霉素。将与农杆菌共培养3天的外植体,用2000mg/L的头孢霉素溶液中浸10- 20分钟,用无菌滤纸吸干后接种到筛选培养基上。在与上述相同培养条件下培养。分别在接种后一周和二周调查脱菌及愈伤组织形成情况。将选择的抗性芽移到生根培养基上，诱导生根。

向日葵遗传转化

1.1 材料

向日葵(H elianthusannuus)新葵杂6号，根癌农杆菌(A grobacteriumtum efaciens)菌 株 EH A 105 和 克隆HF基因的植 物 表 达 载 体pCAMBIA1301。

1.2 菌株培养

挑取新鲜根癌农杆菌单菌落接种到 Y EP(1%yeastextract+1% tryptone+0.5% 牛肉浸膏) 液体培养基中，28度振荡培养过夜， 次日以1%的接种量转接于20 m L 含抗生素的YEP液体培养基中继续振荡培养至对数生长期离心收集菌体 MES 液体稀释至 O D₆₀₀为0.8作为工作浓度备用。

1.3 培养基

MS₀培养基：M S 基本成分+2%蔗糖+0.8%琼脂, pH 5.8;

GBA 基础培养基：MS₀+0.5 m g/L BA P+0.25 m g/L IAA +0.1 m g/LGA₃+30 g/L 蔗糖+0.8%琼脂，pH 5.8;

共培养培养基(M C)：GBA + 乙酰丁香酮(A CS)(100m ol/L)+30 g/L 蔗糖+0.8% 琼脂,pH 5.8;

筛选培养基(M B)：GBA +Carb 400 m g/L+ 潮霉素 10 m g/L+30 g/L 蔗糖+0.8% 琼脂,pH 5.8;

生根培养基 (M R)：1/2M S₀+0.2 m g/L N A A +250 m g/LCarb +5 m g/L 潮霉素 +30 g/L 蔗糖+0.8% 琼脂, pH5.8。

1.4 外植体的制备

挑选饱满、大小均匀和无病虫害的种子，剥壳，70%乙醇浸润 1 min，无菌水冲洗2次，1%AgNO₃消毒 3 min，无菌水冲洗3次；将种子播种于 M S0固体培养基上，28 度黑暗中发芽，培养 36~48 h 后获得无菌苗；切去无菌苗的根、子叶和叶原基露出茎尖，然后纵向切，所获得的外植体含有一半的茎尖分生组织和2个一半的子叶腋芽。

1.5 侵染

将制备的茎尖外植体置于菌液中充分浸润 10min，取出后用无菌滤纸充分吸干外植体表面多余的菌液，置于M C共培养培养基上，在28度黑暗条件下共培养3 d，并设对照。

1.6 转化体的筛选和植株再生

将共培养 3 d 后的外植体移至含 10 m g/m L 潮霉素(Hyg)的筛选培养基 MB 上培养2周，然后再经过 2~3 轮筛选(每轮2周)。将选择的抗性芽移到生根培养基 M R上，诱导生根。

橡胶草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）（又称俄罗斯蒲公英）的遗传转化

1. 材料

橡胶草，农杆菌菌株：GV3101，质粒（pCAMBIA2300-35S-HF）为带有HF基因的双元载体pCAMBIA2300，卡那霉素抗性。

2. 橡胶草遗传转化与再生

(1) 选取长势良好的的组培幼苗，去掉叶边缘，将橡胶草的茎剪成 2cm 的长度，叶剪成 1cm²的大小，将他们放于添加有植物激素 6-BA 和 NAA 的 MS 培养基上暗培养 2d；

(2) 将-70℃保存含有pCAMBIA2300-35S-HF 质粒的农杆菌 GV3101 甘油管取 200μl接种于 50ml 的 LB（50 mg/L Gen+100 mg/L Rif+50 mg/L Kan）液体，过夜培养；

(3) 将过夜培养的菌液在 LB（50 mg/L Gen+100 mg/L Rif+50 mg/L Kan）固体培养基上划线，28℃倒置培养 2d；

(4) 挑取单克隆菌落接种于 LB（50mg/L Gen+100 mg/L Rif+50 mg/L Kan）的液体培养基，28℃摇床培养 2d；

(5) 将 培 养 好 的 菌 液 分 别 以 1 ： 100 比 例 接 种 于 100ml 的 LB（50mg/L Gen+100 mg/L Rif+50 mg/L Kan）液体进行扩大培养，活化至 OD260为 0.6 左右用于浸染；

(6) 将上述的两种菌液分别分装于 2 个 50ml 的灭菌大离心管，5000rpm 离心10min；

(7) 弃上清，用 100ml 的 MS 液体培养基悬起菌体，并在 28℃培养 5min；

(8) 将上述暗培养 2d 的外植体放在选好的菌液中在 28℃摇床培养 20min；

(9) 将浸染好的外植体平铺在灭菌干燥的滤纸上，将多余的菌液吸干，暗培养 2d；

(10) 2d 后将外植体取出放在 MS（1mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+400 mg/L Cb（羧苄青霉素）+50 mg/L Kan （卡那霉素））固体培养基上，每隔半个月倒一次平板；

(11) 当丛生芽长到 2cm 时，掰下单个的芽插入到生根培养基 1/2MS（0.2 mg/L NAA+50 mg/L Kan +400 mg/L Cb）上生长；

(12) 1个月后将生长健壮的组培苗练苗 1d，然后移栽到营养土中（草炭土：蛭石=3：1），覆膜一周，放在栽培室进行后续培养。

玉米遗传转化

1. 材料与试剂

玉米品种齐319，农杆菌菌株：GV3101，质粒（pCAMBIA2300-35S-HF）为带有HF基因的双元载体pCAMBIA2300，卡那霉素抗性。

D-培养基：NaFeEDTA 10ml/L+N6大量元素 50ml/L +B5微量元素 10ml/L +Dicomba(2,4-D) 1ml/L(5ml/L) +RTV 10ml/L+Casamina acids(酪蛋白水解酶) 0.5g/L +L-Prine 700mg/L+肌醇 100mg/L+Sucrose 20g/L，PH 5.8

D-Inf培养基：NaFeEDTA 10ml/L+N6大量元素 50ml/L +B5微量元素 10ml/L +Dicomba(2,4-D)1ml/L+RTV 10ml/L+Casamina acids(酪蛋白水解酶) 0.5g/L +L-Prine700mg/L+肌醇 100mg/L+Sucrose 68.5g/L+葡萄糖36g/L，PH 5.2

D-AS培养基：D-培养基+葡萄糖10g/L+琼脂粉8g/L+AS(0.5M) 200μl+AgNO₃ 1ml/L（AS和AgNO₃ 终浓度均为100 μM，且在培养基灭菌后稍凉时加入混匀）。

D-Cef培养基：D-培养基+ 1ml/LAgNO₃ + cef1ml/L。

2. 玉米遗传转化与再生

（1）玉米幼胚的准备：剥去苞叶、丝及一些多余部分，用刀插入上部，放入70%的乙醇，进入超净台，30s，拿出，超净台上吹干约15-20min，剥去玉米粒的2/3的表面部分，剥幼胚。

（2）将加入到D-inf（含AS）的菌液稀释到OD600为0.3-0.5放置1h以上，将幼胚用D-inf（不含AS）洗一次，再浸入菌液中，用手 上下颠倒30s，并放置5min，观察幼胚无明显伤口时，取出，用无菌滤纸吸干，放到D-AS固体培养基上，25℃黑暗条件下共培养3d。

（3）恢复培养的阶段：将共培养3d后的幼胚在灭菌水（加1‰的cef）中洗3次，每次20min，然后用滤纸吸干，转入D-cef固体培养基上，25℃，暗处，恢复培养7d。之后进行加压筛选阶段：分4次，每轮间隔均为2周。

第一轮 D培养基+cef（1‰）+PPT（5mg/ml）

第二轮 D培养基+cef（1‰）+PPT（10mg/ml）

第三轮 D培养基+cef（1‰）+PPT（10mg/ml）

第四轮 D培养基+cef（1‰）+PPT（10mg/ml）。

（4）筛选后的恢复阶段：D培养基+6-BA（5mg/L），其中2,4-D或Dicamba浓度稀释5倍，蔗糖30g/L（或蔗糖20g/L，葡萄糖10g/L），时间为2周，暗培养。

（5）筛选后的诱导阶段：D培养基+6-BA（5mg/L），其中2,4-D或Dicamba浓度稀释5倍，蔗糖50g/L，不加葡萄糖+cef1ml/L，暗培养。

（6）分化阶段：D培养基，但不加任何激素，蔗糖浓度30mg/L不加葡萄糖，+cef1ml/L，光照培养。

（7）生根阶段：1/2MS培养基。

亚麻芥（Camelina sativa）遗传转化，采用滴花法

1. 材料与试剂

亚麻芥，农杆菌菌株：GV3101，质粒（pCAMBIA2300-35S-HF）为带有HF基因的双元载体pCAMBIA2300，卡那霉素抗性。

2. 亚麻芥滴花法遗传转化

（1）将野生型亚麻荠播种于营养土（腐殖质∶蛭石∶珍珠岩＝4∶2∶1）中，5粒／盆（9 cm直径），置于培养室中培养。培养室温度为16～20℃，相对湿度为60%，光照强度为4 000 1x，光周期为16 h光照／8h黑暗。待亚麻荠植株的主茎长至5 cm，且侧枝刚刚呈花芽状的时候去除顶端花序，以促进次级分枝的生长和发育。植株生长至盛花期时准备转化，转化前2d将已形成的果荚剪掉。

（2）将含有pCAMBIA2300-35S-HF质粒的农杆菌GV3101培养至OD600值为0.8时，用等体积渗入培养基（1/2 MS、5%蔗糖、200 μL/L Silwet L-77）重悬菌体转化亚麻荠。转化时用移液器吸取农杆菌重悬渗入培养基滴在亚麻荠花蕾上，确保每一个花蕾都被滴上，之后用保鲜膜把转化过的植株包罩起来以保持湿度，将其避光直立放置于培养室中培养1d，而后于正常条件下培养。

（3）植株成熟后收取种子记为T0代种子。采用50 mg/L卡那霉素对收获的T0代亚麻荠种子进行筛选，获得阳性转基因植株。

对由上文所述方法获得的含有FTO编码核酸的转基因植物和不含FTO编码核酸的对照植物进行产量和生物量的统计，结果见表2。

表2 将编码人FTO的核酸引入多种植物后产量和生物量的改变

由表2可见，将FTO引入多个植物物种，均导致了生物量和产量的提高。

序列表

<110> 北京光元立方生物科技有限公司

<120> 转基因植物细胞及生产转基因植物的方法

<130> CPCH1760051N

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 505

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Lys Arg Thr Pro Thr Ala Glu Glu Arg Glu Arg Glu Ala Lys Lys

1 5 10 15

Leu Arg Leu Leu Glu Glu Leu Glu Asp Thr Trp Leu Pro Tyr Leu Thr

20 25 30

Pro Lys Asp Asp Glu Phe Tyr Gln Gln Trp Gln Leu Lys Tyr Pro Lys

35 40 45

Leu Ile Leu Arg Glu Ala Ser Ser Val Ser Glu Glu Leu His Lys Glu

50 55 60

Val Gln Glu Ala Phe Leu Thr Leu His Lys His Gly Cys Leu Phe Arg

65 70 75 80

Asp Leu Val Arg Ile Gln Gly Lys Asp Leu Leu Thr Pro Val Ser Arg

85 90 95

Ile Leu Ile Gly Asn Pro Gly Cys Thr Tyr Lys Tyr Leu Asn Thr Arg

100 105 110

Leu Phe Thr Val Pro Trp Pro Val Lys Gly Ser Asn Ile Lys His Thr

115 120 125

Glu Ala Glu Ile Ala Ala Ala Cys Glu Thr Phe Leu Lys Leu Asn Asp

130 135 140

Tyr Leu Gln Ile Glu Thr Ile Gln Ala Leu Glu Glu Leu Ala Ala Lys

145 150 155 160

Glu Lys Ala Asn Glu Asp Ala Val Pro Leu Cys Met Ser Ala Asp Phe

165 170 175

Pro Arg Val Gly Met Gly Ser Ser Tyr Asn Gly Gln Asp Glu Val Asp

180 185 190

Ile Lys Ser Arg Ala Ala Tyr Asn Val Thr Leu Leu Asn Phe Met Asp

195 200 205

Pro Gln Lys Met Pro Tyr Leu Lys Glu Glu Pro Tyr Phe Gly Met Gly

210 215 220

Lys Met Ala Val Ser Trp His His Asp Glu Asn Leu Val Asp Arg Ser

225 230 235 240

Ala Val Ala Val Tyr Ser Tyr Ser Cys Glu Gly Pro Glu Glu Glu Ser

245 250 255

Glu Asp Asp Ser His Leu Glu Gly Arg Asp Pro Asp Ile Trp His Val

260 265 270

Gly Phe Lys Ile Ser Trp Asp Ile Glu Thr Pro Gly Leu Ala Ile Pro

275 280 285

Leu His Gln Gly Asp Cys Tyr Phe Met Leu Asp Asp Leu Asn Ala Thr

290 295 300

His Gln His Cys Val Leu Ala Gly Ser Gln Pro Arg Phe Ser Ser Thr

305 310 315 320

His Arg Val Ala Glu Cys Ser Thr Gly Thr Leu Asp Tyr Ile Leu Gln

325 330 335

Arg Cys Gln Leu Ala Leu Gln Asn Val Cys Asp Asp Val Asp Asn Asp

340 345 350

Asp Val Ser Leu Lys Ser Phe Glu Pro Ala Val Leu Lys Gln Gly Glu

355 360 365

Glu Ile His Asn Glu Val Glu Phe Glu Trp Leu Arg Gln Phe Trp Phe

370 375 380

Gln Gly Asn Arg Tyr Arg Lys Cys Thr Asp Trp Trp Cys Gln Pro Met

385 390 395 400

Ala Gln Leu Glu Ala Leu Trp Lys Lys Met Glu Gly Val Thr Asn Ala

405 410 415

Val Leu His Glu Val Lys Arg Glu Gly Leu Pro Val Glu Gln Arg Asn

420 425 430

Glu Ile Leu Thr Ala Ile Leu Ala Ser Leu Thr Ala Arg Gln Asn Leu

435 440 445

Arg Arg Glu Trp His Ala Arg Cys Gln Ser Arg Ile Ala Arg Thr Leu

450 455 460

Pro Ala Asp Gln Lys Pro Glu Cys Arg Pro Tyr Trp Glu Lys Asp Asp

465 470 475 480

Ala Ser Met Pro Leu Pro Phe Asp Leu Thr Asp Ile Val Ser Glu Leu

485 490 495

Arg Gly Gln Leu Leu Glu Ala Lys Pro

500 505

<210> 2

<211> 505

<212> PRT

<213> 猪（Sus scrofa）

<400> 2

Met Lys Arg Thr Pro Thr Ala Glu Glu Arg Glu Arg Gly Ala Lys Lys

1 5 10 15

Leu Arg Leu Leu Glu Glu Leu Glu Asp Thr Trp Leu Pro Tyr Leu Thr

20 25 30

Pro Lys Asp Asp Glu Phe Tyr Gln Gln Trp Gln Leu Lys Tyr Pro Lys

35 40 45

Leu Ile Leu Arg Glu Ala Gly Ser Val Pro Glu Gly Leu His Lys Glu

50 55 60

Val Gln Glu Ala Phe Leu Ala Leu His Lys His Gly Cys Leu Phe Arg

65 70 75 80

Asp Leu Val Arg Ile Gln Gly Lys Asp Leu Leu Thr Pro Val Ser Arg

85 90 95

Leu Leu Ile Gly Asn Pro Gly Cys Thr Tyr Lys Tyr Leu Asn Thr Arg

100 105 110

Leu Phe Thr Val Pro Trp Pro Val Lys Gly Ser Asp Ala Lys Tyr Asn

115 120 125

Glu Ala Glu Ile Gly Ala Ala Cys Gln Thr Phe Leu Lys Leu Asn Asp

130 135 140

Tyr Leu Gln Ile Glu Thr Ile Gln Ala Leu Glu Glu Leu Ala Ala Lys

145 150 155 160

Glu Lys Ala Asn Ile Asp Thr Val Pro Ala Cys Ile Gly Pro Asp Phe

165 170 175

Pro Arg Val Gly Met Gly Ser Ser Phe Asp Gly His Asp Glu Val Asp

180 185 190

Arg Lys Ser Arg Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Leu Leu Ser Phe Met Asp

195 200 205

Pro Gln Lys Met Pro Tyr Leu Lys Glu Glu Pro Tyr Phe Gly Met Gly

210 215 220

Lys Met Ala Val Ser Trp His His Asp Glu Asn Leu Val Asp Arg Ser

225 230 235 240

Ala Val Ala Val Tyr Asn Tyr Ser Cys Glu Gly Pro Glu Glu Glu Ser

245 250 255

Glu Asp Asp Pro Gln Leu Glu Gly Arg Asn Pro Asp Val Trp His Val

260 265 270

Gly Phe Lys Ile Ser Trp Asp Ile Glu Thr Pro Gly Leu Ala Ile Pro

275 280 285

Leu His Gln Gly Asp Cys Tyr Phe Met Leu Asp Asp Leu Asn Ala Thr

290 295 300

His Gln His Cys Val Leu Ala Gly Leu Pro Pro Arg Phe Ser Ser Thr

305 310 315 320

His Arg Val Ala Glu Cys Ser Thr Gly Ala Leu Asp Tyr Ile Leu Gln

325 330 335

Arg Cys Gln Leu Ala Leu Gln Asn Val Arg Asp Glu Ala Asp Ser Gly

340 345 350

Glu Val Ser Leu Lys Ser Leu Glu Pro Ala Val Leu Lys Gln Gly Glu

355 360 365

Glu Ile His Asn Glu Val Glu Phe Glu Trp Leu Arg Gln Phe Trp Phe

370 375 380

Gln Gly Asn Arg Tyr Lys Lys Cys Thr Asp Trp Trp Cys Gln Pro Met

385 390 395 400

Thr Gln Leu Glu Glu Leu Trp Lys Lys Met Glu Gly Ala Thr His Ala

405 410 415

Val Leu Arg Glu Val Arg Arg Glu Gly Ala Pro Val Glu Gln Ser Ser

420 425 430

Asp Ile Leu Thr Ala Ile Leu Ala Val Leu Thr Thr Arg Gln Asn Leu

435 440 445

Arg Arg Glu Trp His Ala Arg Cys Gln Ser Arg Ile Ala Arg Thr Leu

450 455 460

Pro Val Asp Gln Lys Pro Glu Cys Arg Pro Tyr Trp Glu Lys Asp Asp

465 470 475 480

Pro Ser Met Pro Leu Pro Phe Asp Leu Thr Asp Thr Val Ala Glu Leu

485 490 495

Arg Gly Leu Leu Leu Glu Ala Lys Pro

500 505

<210> 3

<211> 505

<212> PRT

<213> 牛（Bos taurus）

<400> 3

Met Lys Arg Thr Pro Thr Ala Glu Glu Arg Glu Arg Glu Ala Lys Lys

1 5 10 15

Leu Arg Leu Leu Glu Glu Leu Glu Asp Thr Trp Leu Pro Tyr Leu Thr

20 25 30

Pro Lys Asp Asp Glu Phe Tyr Gln Gln Trp Gln Leu Lys Tyr Pro Lys

35 40 45

Leu Ile Leu Arg Glu Ala Ala Ser Val Pro Glu Leu Leu His Lys Glu

50 55 60

Val Gln Gln Ala Phe Leu Thr Leu His Lys His Gly Cys Leu Phe Arg

65 70 75 80

Asp Leu Val Arg Ile Gln Gly Lys Asp Leu Leu Thr Pro Val Ser Arg

85 90 95

Ile Leu Ile Gly Asn Pro Gly Cys Thr Tyr Lys Tyr Leu Asn Thr Arg

100 105 110

Leu Phe Thr Val Pro Trp Pro Val Lys Gly Ser Asp Ala Lys Tyr Asn

115 120 125

Glu Ala Glu Ile Ala Ala Ala Cys Gln Thr Phe Leu Lys Leu Asn Ser

130 135 140

Tyr Leu Gln Val Glu Thr Ile Gln Ala Leu Glu Glu Leu Ala Ala Lys

145 150 155 160

Glu Lys Ala Asn Ile Asp Ala Val Pro Val Cys Ile Gly Pro Asp Phe

165 170 175

Pro Arg Val Gly Met Gly Ser Ser Phe Asp Gly His Asp Glu Ile Asp

180 185 190

Met Lys Asn Arg Ala Ala Tyr Asn Val Thr Leu Leu Asn Phe Met Asp

195 200 205

Pro Gln Lys Met Pro Tyr Leu Lys Glu Glu Pro Tyr Phe Gly Met Gly

210 215 220

Lys Met Ala Val Ser Trp His His Asp Glu Asn Leu Val Asp Arg Ser

225 230 235 240

Ala Val Ala Val Tyr Ser Tyr Ser Cys Glu Gly Pro Glu Glu Glu Ser

245 250 255

Glu Asp Asp Pro Gln Leu Glu Gly Arg Asp Pro Asp Ile Trp His Val

260 265 270

Gly Phe Lys Ile Ser Trp Asp Ile Glu Thr Pro Gly Leu Ala Ile Pro

275 280 285

Leu His Gln Gly Asp Cys Tyr Phe Met Leu Asp Asp Leu Asn Ala Thr

290 295 300

His Gln His Cys Val Leu Ala Gly Leu Pro Pro Arg Phe Ser Ser Thr

305 310 315 320

His Arg Val Ala Glu Cys Ser Thr Gly Thr Leu Glu Tyr Ile Leu Gln

325 330 335

Arg Cys Gln Val Ala Leu Gln Asn Val Arg Glu Glu Ala Asp Asn Gly

340 345 350

Glu Ile Ser Leu Lys Ser Leu Glu Ser Val Val Leu Lys Gln Gly Glu

355 360 365

Glu Ile His Asn Glu Val Glu Phe Glu Trp Leu Arg Gln Phe Trp Phe

370 375 380

Gln Gly Ser Arg Tyr Lys Lys Cys Thr Asp Trp Trp Cys Gln Pro Met

385 390 395 400

Ser Gln Leu Glu Glu Met Trp Arg Lys Met Glu Trp Leu Thr Ser Ala

405 410 415

Val Leu Arg Glu Val Arg Arg Glu Gly Val Pro Met Glu Gln Lys Asn

420 425 430

Glu Met Leu Thr Ser Ile Leu Ala Ser Ile Thr Thr Arg Gln Asn Leu

435 440 445

Arg Arg Glu Trp His Ala Arg Cys Gln Ser Arg Ile Ala Arg Thr Leu

450 455 460

Pro Ala Asp Gln Lys Pro Glu Cys Arg Pro Tyr Trp Glu Lys Gly Asp

465 470 475 480

Pro Ser Met Pro Leu Pro Phe Asp Leu Thr Glu Ile Val Ser Glu Leu

485 490 495

Arg Gly Leu Leu Leu Glu Thr Arg Pro

500 505

<210> 4

<211> 419

<212> PRT

<213> Ostreococcus lucimarinus

<400> 4

Met Ser Pro Ser Ser Ser Val Leu Glu Pro Glu Asp Gly Glu Pro Phe

1 5 10 15

Ala Arg Val His Arg Ala His Tyr Arg Gly Phe Val Val Asp Ala Pro

20 25 30

Ser Val Leu Pro Ala Ser Leu His Asp Asp Val Glu Arg Ala Phe Asp

35 40 45

Asp Met Arg Ser Arg Gly Glu Phe Thr His Asp Val Val Ser Ala Gly

50 55 60

Asn Lys Val Ser Thr Thr Tyr Val Arg Arg Cys Leu Leu Gly Glu Asp

65 70 75 80

Gly Met Thr Tyr His Tyr Gln Lys Leu Arg Leu Phe Ala Gln Pro Trp

85 90 95

Arg Gly Arg Glu Ala Tyr Glu Val Val Arg Arg Leu Asn Glu Thr Leu

100 105 110

Thr Arg Ser Ala Arg Glu Arg Cys Glu Lys Leu Gly Gly Ala Phe Ala

115 120 125

Glu Ser Glu Cys Glu Tyr Asn Val Thr Leu Ile Asn Tyr Met Glu Thr

130 135 140

Glu Gly Glu Ser Glu Ile Glu Leu Arg Asn Glu Glu Lys Phe Asp Leu

145 150 155 160

Gly Thr Thr Ser Val Ser Trp His Ser Asp Ser Ser Leu Arg Glu Asn

165 170 175

Ser Thr Val Ala Val Tyr His Thr Tyr Glu Ala Pro Glu Arg Lys Asp

180 185 190

Trp Arg Val Ala Leu Arg Ala Leu Asn Ala Glu Cys Glu Val Leu Cys

195 200 205

Val Pro Leu Glu Asp Lys Ala Thr Tyr Tyr Met Cys Gly Glu Phe Asn

210 215 220

Ala Thr His His His Ala Val Leu Thr Gly Ser Ser Ala Arg Tyr Ser

225 230 235 240

Ser Thr His Arg Val Ala Val Val Ala Lys Asp Thr Phe Gln Tyr Ile

245 250 255

Lys Arg Arg Cys Ile Asp Ala Leu Ala Ile Val Pro Asp Leu Glu Arg

260 265 270

Glu Asn Lys Pro Leu Asp Ala Lys Gln Ile Gln Phe Leu Ala Asp Val

275 280 285

His Arg Glu Val Glu Phe Gln Trp Ile Arg Met Phe His Leu Gln Gly

290 295 300

Glu Ala His Ala Ala Trp His Asp Thr Tyr Trp Thr Arg Lys Ile Ala

305 310 315 320

Glu Leu Thr Glu Ala Trp Asp Arg Met Glu Ala Cys Phe Arg Val Ile

325 330 335

Leu Ser Lys Leu Lys Arg Ser Ser Arg Ser Pro Glu Ser Pro Pro Arg

340 345 350

Ala Tyr Ala Met Leu Leu Tyr Ala Leu Lys Thr Val Lys Glu Leu Arg

355 360 365

Asp Glu Tyr Thr Lys Arg Thr Lys Ala Ser Ala Tyr Ala Ser Leu Pro

370 375 380

Pro Ser Gln Arg Pro Val Asp Leu Pro Ala Tyr Asp Asn Thr Ser Pro

385 390 395 400

Leu Pro Phe Glu Leu Lys Pro Val Ile Tyr Phe Leu Glu Glu Glu Gln

405 410 415

Asn Lys Val

<210> 5

<211> 1518

<212> DNA

<213> 人

<400> 5

atgaagcgca ccccgactgc cgaggaacga gagcgcgaag ctaagaaact gaggcttctt 60

gaagagcttg aagacacttg gctcccttat ctgaccccca aagatgatga attctatcag 120

cagtggcagc tgaaatatcc taaactaatt ctccgagaag ccagcagtgt atctgaggag 180

ctccataaag aggttcaaga agcctttctc acactgcaca agcatggctg cttatttcgg 240

gacctggtta ggatccaagg caaagatctg ctcactccgg tatctcgcat cctcattggt 300

aatccaggct gcacctacaa gtacctgaac accaggctct ttacggtccc ctggccagtg 360

aaagggtcta atataaaaca caccgaggct gaaatagccg ctgcttgtga gaccttcctc 420

aagctcaatg actacctgca gatagaaacc atccaggctt tggaagaact tgctgccaaa 480

gagaaggcta atgaggatgc tgtgccattg tgtatgtctg cagatttccc cagggttggg 540

atgggttcat cctacaacgg acaagatgaa gtggacatta agagcagagc agcatacaac 600

gtaactttgc tgaatttcat ggatcctcag aaaatgccat acctgaaaga ggaaccttat 660

tttggcatgg ggaaaatggc agtgagctgg catcatgatg aaaatctggt ggacaggtca 720

gcggtggcag tgtacagtta tagctgtgaa ggccctgaag aggaaagtga ggatgactct 780

catctcgaag gcagggatcc tgatatttgg catgttggtt ttaagatctc atgggacata 840

gagacacctg gtttggcgat accccttcac caaggagact gctatttcat gcttgatgat 900

ctcaatgcca cccaccaaca ctgtgttttg gccggttcac aacctcggtt tagttccacc 960

caccgagtgg cagagtgctc aacaggaacc ttggattata ttttacaacg ctgtcagttg 1020

gctctgcaga atgtctgtga cgatgtggac aatgatgatg tctctttgaa atcctttgag 1080

cctgcagttt tgaaacaagg agaagaaatt cataatgagg tcgagtttga gtggctgagg 1140

cagttttggt ttcaaggcaa tcgatacaga aagtgcactg actggtggtg tcaacccatg 1200

gctcaactgg aagcactgtg gaagaagatg gagggtgtga caaatgctgt gcttcatgaa 1260

gttaaaagag aggggctccc cgtggaacaa aggaatgaaa tcttgactgc catccttgcc 1320

tcgctcactg cacgccagaa cctgaggaga gaatggcatg ccaggtgcca gtcacgaatt 1380

gcccgaacat tacctgctga tcagaagcca gaatgtcggc catactggga aaaggatgat 1440

gcttcgatgc ctctgccgtt tgacctcaca gacatcgttt cagaactcag aggtcagctt 1500

ctggaagcaa aaccctag 1518

<210> 6

<211> 1515

<212> DNA

<213> 人

<400> 6

atgaagcgca cccctactgc tgaggagaga gagagggagg ccaagaagct cagactcctg 60

gaggagctgg aggatacctg gctcccttac ctgactccca aggatgacga gttctaccag 120

caatggcagc tcaagtaccc caagctcatt ctgagggagg cttcctctgt ttccgaggag 180

ctgcacaagg aggtgcaaga ggccttcctt actttgcaca agcatggatg ccttttcaga 240

gatttggtta ggatccaggg caaggacctt ttgacccccg tgagcaggat tctcatcgga 300

aacccaggtt gcacttacaa gtacctcaat actcgcctgt tcacagtgcc atggcctgtt 360

aagggctcaa acattaagca tactgaggct gagatcgccg ctgcctgcga gacattcctc 420

aagctgaatg attacctcca gattgagaca atccaagctc ttgaggagtt ggctgccaag 480

gagaaggcta acgaggatgc cgttccactg tgcatgtccg ccgacttccc tagagtgggc 540

atgggaagct catacaatgg ccaagatgag gttgacatta agtctagggc tgcctacaac 600

gtgaccctcc tgaatttcat ggacccacag aagatgcctt accttaagga ggagccatac 660

ttcggtatgg gcaagatggc tgtttcctgg caccatgatg agaacttggt ggacaggtct 720

gctgtggccg tttacagcta ctcatgcgag ggacctgagg aggagagcga ggatgactca 780

cacctggagg gtcgcgatcc cgacatttgg catgttggct tcaagatttc ttgggatatc 840

gagacccctg gccttgccat ccccttgcac cagggagact gctacttcat gctcgatgac 900

ctgaatgcta cacaccagca ttgcgttctt gccggttccc aaccacgctt ctcctctacc 960

catagagtgg ctgagtgctc tacaggcacc ctcgattaca ttctgcagag atgccaactt 1020

gccttgcaaa acgtgtgcga tgacgttgac aatgatgacg tttcccttaa gtctttcgag 1080

cctgctgtgt tgaagcaggg agaggagatc cacaacgagg ttgagttcga gtggctgcgc 1140

cagttctggt tccaaggtaa tcgctacaga aagtgcactg attggtggtg ccagccaatg 1200

gctcaacttg aggccttgtg gaagaagatg gagggcgtga caaacgccgt tctccacgag 1260

gtgaagaggg agggactgcc tgtggagcaa cgcaacgaga ttcttacagc tatcctcgcc 1320

agcctgaccg ctagacagaa tttgaggcgc gagtggcatg ccaggtgcca atcaaggatt 1380

gctcgcaccc ttccagctga ccagaagcca gagtgcaggc catactggga gaaggatgac 1440

gctagcatgc cccttccatt cgatttgact gacatcgtgt cagagttgag aggccagctt 1500

ttggaggcca agcca 1515

<210> 7

<211> 1518

<212> DNA

<213> 猪

<400> 7

atgaagcgaa ccccaaccgc cgaggaacga gagcgcggag ctaagaaact gaggcttctt 60

gaagagctgg aagacacttg gcttccttat ctgaccccca aagatgatga attctatcag 120

cagtggcagc tgaaataccc taagctaatt ctccgagaag caggcagcgt ccctgaggga 180

ctccacaaag aggttcaaga agccttcctc gcactgcaca agcatggctg cttatttcgg 240

gacctggtca ggatccaagg caaagatttg ctcacgccag tatctcgcct cctcattggt 300

aaccccggct gcacctacaa gtacctgaac accaggctct tcacggtccc ctggccagtg 360

aagggctctg atgcaaagta caatgaggcc gagataggcg ccgcctgcca gaccttcctc 420

aagctcaacg actacctgca gattgagacc atccaggcgc tggaggaact cgctgccaag 480

gagaaagcca atatcgacac cgtgccggcg tgtataggtc cagatttccc cagggtcggc 540

atggggtcat cctttgacgg ccatgacgag gtggacagga agagcagagc cgcctacaac 600

ctaactttgt tgagcttcat ggatccccag aaaatgccgt acctgaaaga ggagccctac 660

tttggcatgg ggaagatggc tgtgagctgg catcacgatg aaaatctggt ggacaggtca 720

gcggtggcag tgtacaatta tagctgtgaa ggccctgaag aggaaagcga ggatgatccc 780

cagctcgaag gcagaaatcc cgatgtgtgg catgttggct ttaagatctc atgggacata 840

gagacccctg gtttggcgat accccttcac caaggagact gctactttat gctggatgat 900

ctcaatgcca cccaccaaca ctgtgttttg gctggtttac caccccggtt tagttccacc 960

caccgagtgg ccgagtgctc gacgggagcc ttggattaca tcttacagcg ctgccagttg 1020

gccctgcaga atgtccgtga tgaggcggac agtggtgaag tctctttgaa atccttggag 1080

cctgcggttt tgaaacaagg agaagaaatc cacaacgagg tcgagtttga gtggctgaga 1140

cagttttggt ttcaaggcaa tcgatacaaa aagtgcaccg attggtggtg tcaacccatg 1200

actcagctgg aagagctttg gaagaagatg gaaggtgcga cccatgctgt gcttcgtgaa 1260

gttagaagag agggggcccc tgtggaacag agcagtgaca tcctgactgc catcctagcc 1320

gtgctcacca ctcgccagaa cctgaggagg gagtggcatg ccaggtgcca gtcccgaatt 1380

gcccgaactc tgcctgtgga ccagaagcca gaatgccggc cgtattggga aaaggatgat 1440

ccctccatgc ctctgccgtt tgatctcaca gacactgtgg ctgaactcag aggtctgctt 1500

ctggaagcca aaccctag 1518

<210> 8

<211> 1515

<212> DNA

<213> 猪

<400> 8

atgaagagaa caccaaccgc tgaggagagg gagagaggag ctaagaagtt gaggctcctg 60

gaggagctgg aggacacatg gttgccctac ctcaccccaa aggatgacga gttctaccag 120

caatggcaat tgaagtaccc caagttgatt ctcagggagg ctggatctgt gccagaggga 180

ctgcacaagg aggttcaaga ggccttcctg gctcttcaca agcatggctg cctgttccgc 240

gaccttgtta gaattcaggg aaaggatctt ttgactccag tgtctcgcct cctgatcgga 300

aaccctggtt gcacatacaa gtacttgaat accagactct tcactgtgcc ctggccagtt 360

aagggtagcg acgccaagta caacgaggct gagatcggcg ccgcttgcca gacattcttg 420

aagctcaatg attacctgca gattgagacc atccaagctc tggaggagct tgccgctaag 480

gagaaggcca acattgacac tgttcctgct tgcatcggcc cagatttccc tagggtgggc 540

atgggatcct ctttcgatgg acatgacgag gttgatagga agtcacgcgc cgcttacaat 600

ttgacacttt tgtccttcat ggatcctcaa aagatgccct acctcaagga ggagccctac 660

ttcggtatgg gcaagatggc cgtgtcatgg caccatgacg agaaccttgt tgatagatcc 720

gccgtggctg tttacaatta ctcttgcgag ggccctgagg aggagagcga ggatgaccct 780

cagctggagg gaaggaaccc cgacgtgtgg cacgttggtt tcaagattag ctgggatatc 840

gagacccccg gtctggctat tccacttcat caaggcgact gctacttcat gttggatgac 900

ctcaatgcca ctcaccagca ttgcgttctg gctggacttc cacctaggtt cagctcaact 960

caccgcgtgg ccgagtgctc tacaggtgct ttggattaca ttctccagcg ctgccaactg 1020

gcccttcaaa acgtgagaga cgaggctgat agcggcgagg ttagcttgaa gtccctggag 1080

ccagctgtgc tgaagcaggg agaggagatc cataacgagg tggagttcga gtggcttaga 1140

cagttctggt tccaaggcaa taggtacaag aagtgcaccg actggtggtg ccagccaatg 1200

actcaactgg aggagctttg gaagaagatg gagggagcca cacacgctgt gctcagggag 1260

gttaggcgcg agggtgctcc tgttgagcag tcctctgaca ttctgaccgc catcttggct 1320

gtgctcacca ctaggcagaa tcttagaagg gagtggcatg cccgctgcca atcaagaatc 1380

gctaggaccc tgcctgttga tcagaagcca gagtgcaggc cttactggga gaaggatgac 1440

ccctccatgc ctctgccctt cgaccttact gatacagtgg ccgagcttcg cggactcctg 1500

cttgaggcta agcct 1515

<210> 9

<211> 1518

<212> DNA

<213> 牛

<400> 9

atgaagcgga ccccgacggc cgaggaacga gagcgcgaag ctaagaaact gaggcttctt 60

gaagagcttg aagacacgtg gcttccctac ctgaccccca aagacgatga attctatcag 120

cagtggcaac tgaaatatcc taaactaatt ctccgagaag ctgccagcgt gcctgagttg 180

ctccataaag aggttcaaca agcctttctc acgctgcaca agcacggctg tttatttcgg 240

gatctggtga ggatccaggg caaagacttg ctcactccag tctctcgcat cctcatcggt 300

aaccccggct gcacctacaa gtacctgaac accaggctct tcacggtacc ctggcccgtg 360

aaaggctctg atgcaaagta caatgaggcc gaaatagctg ccgcctgtca aacgttcctc 420

aagctcaaca gctacctgca ggtagagacc atccaggctt tggaagagct tgctgccaag 480

gagaaagcca acatcgatgc cgtgccagtg tgcataggtc cagatttccc cagggttggc 540

atggggtcct cctttgacgg gcacgatgag attgacatga agaaccgagc agcgtacaac 600

gtcactttgt tgaatttcat ggatccccag aagatgccat acctgaaaga ggaaccgtat 660

tttggcatgg ggaaaatggc cgtgagctgg catcatgatg aaaatctggt ggacaggtca 720

gcggtggcag tgtacagtta tagctgtgaa ggccctgaag aggaaagtga ggacgaccct 780

cagcttgaag gcagagatcc tgatatttgg cacgttggtt ttaagatctc gtgggacata 840

gagacacctg gtttggcgat accccttcac caaggagact gctattttat gcttgatgat 900

ctcaatgcca cccaccaaca ctgtgttttg gctggtttac cacctcggtt tagttccacc 960

caccgagtgg cagagtgctc aacagggacc ttggagtaca tcttacagcg ctgccaggtg 1020

gccctgcaga atgtccgcga ggaggcagac aacggtgaaa tctctttgaa atccttggag 1080

tcagtggttt tgaaacaagg agaagaaatc cacaacgagg tcgagtttga atggctgaga 1140

cagttttggt ttcaaggcag tcgatacaaa aagtgcactg actggtggtg tcagcccatg 1200

agtcagctgg aagagatgtg gagaaagatg gagtggttga caagcgctgt gcttcgcgaa 1260

gttagaagag agggggtccc catggaacaa aagaatgaga tgttgacatc catcctcgcc 1320

tcgatcacca ctcgccagaa cctgaggaga gaatggcatg ccaggtgcca gtctcgaatt 1380

gcccgaactt tacccgctga tcagaagcca gaatgccggc cgtactggga aaagggtgat 1440

ccttcgatgc ctctgccatt tgatctcaca gagatcgttt ctgaactcag aggtctgctt 1500

ctggaaacca ggccctag 1518

<210> 10

<211> 1515

<212> DNA

<213> 牛

<400> 10

atgaagcgca caccaaccgc tgaggagcgc gagagagagg ccaagaagct gagactcctg 60

gaggagcttg aggacacatg gctgccctac cttaccccaa aggatgacga gttctaccag 120

caatggcaac ttaagtaccc caagttgatt ctcagggagg ccgctagcgt gccagagctt 180

ttgcacaagg aggttcagca ggccttcctc acccttcaca agcatggatg cttgttcaga 240

gacctcgtga ggatccaggg caaggatctc ctgaccccag tttcaaggat tctgatcgga 300

aatcctggtt gcacttacaa gtacctgaac acccgccttt tcactgtgcc ctggccagtt 360

aagggaagcg acgctaagta caatgaggcc gagattgccg ctgcctgcca gactttcttg 420

aagctcaact cataccttca ggtggagaca atccaggccc tggaggagct cgctgccaag 480

gagaaggcta atattgacgc cgtgcctgtt tgcatcggcc cagatttccc tagagtgggc 540

atgggatcct ctttcgatgg acatgacgag attgatatga agaacagggc tgcctacaat 600

gttactcttt tgaacttcat ggatcctcaa aagatgccct acttgaagga ggagccctac 660

ttcggtatgg gcaagatggc cgtgtcatgg caccatgacg agaatctcgt tgatcgctcc 720

gctgtggccg tttactccta ctcttgcgag ggccctgagg aggagtccga ggatgaccct 780

cagctggagg gtagagatcc cgacatttgg cacgttggct tcaagatttc ttgggacatc 840

gagacacccg gcttggctat cccactccat caaggagatt gctacttcat gctggatgac 900

cttaacgcta ctcaccagca ttgcgtgttg gccggactcc cacctcgctt cagctcaaca 960

cacagagttg ccgagtgctc cactggtaca ctggagtaca tccttcagcg ctgccaagtg 1020

gctttgcaaa atgttagaga ggaggccgac aacggtgaaa ttagcctgaa gtcacttgag 1080

tccgtggttt tgaagcaggg cgaggagatc cataacgagg tggagttcga gtggctcaga 1140

cagttctggt tccaaggttc aaggtacaag aagtgcaccg attggtggtg ccagccaatg 1200

tcccaactgg aggagatgtg gagaaagatg gagtggttga cttctgctgt gctcagggag 1260

gttaggaggg agggcgttcc tatggagcag aagaatgaga tgttgacatc tattctcgct 1320

agcatcacca ctaggcagaa cctgagaagg gagtggcacg cccgctgcca atctaggatt 1380

gctcgcaccc ttcctgccga tcagaagcca gagtgccgcc cttactggga gaagggcgac 1440

ccctctatgc ctctgccctt cgatcttaca gagatcgtga gcgagctgag gggactcctg 1500

cttgagaccc gccca 1515

<210> 11

<211> 1260

<212> DNA

<213> Ostreococcus lucimarinus

<400> 11

atgtcgccgt catcctccgt gctcgaaccc gaggacggcg aaccgttcgc gcgcgtccat 60

cgagcgcact accgcggttt cgtcgtggac gcgccctcgg tgcttcccgc gtcgcttcac 120

gacgacgtcg aacgcgcgtt cgacgacatg cgcagccgag gcgaattcac gcacgacgtc 180

gtttccgccg gaaataaagt gtccacgacg tacgtgcggc gctgcctgct cggtgaggac 240

ggaatgacgt atcattatca gaagttacgc ctgtttgcgc aaccgtggcg cggacgggag 300

gcgtacgaag tggtgagacg gttgaacgag acgctgacga ggagcgcgcg agagcgatgc 360

gaaaagctcg gcggagcgtt cgcggagagt gagtgcgaat acaacgtgac gctgattaat 420

tacatggaaa cagagggtga gagcgaaata gagctacgga atgaggagaa gttcgatctc 480

gggacgacgt cggtgagttg gcacagcgat tcgtcgttgc gagaaaactc caccgtggcg 540

gtgtatcaca catacgaggc gccagagaga aaagactggc gagtggcgct gagggcgttg 600

aacgcggagt gcgaggtgct ttgcgtgcct ttggaggata aagcgacgta ttacatgtgt 660

ggtgagttca acgccactca ccatcacgcc gtgctcaccg gctcgagtgc gagatattct 720

tcgacacatc gagtcgccgt ggtggccaag gatacgttcc agtacatcaa aaggcggtgt 780

atcgatgcgc tcgcaattgt accagactta gagcgcgaga ataaaccttt ggatgcgaaa 840

cagatacagt tcttagccga cgtccatcgc gaggttgaat ttcaatggat tagaatgttt 900

cacctgcaag gcgaagcaca cgcggcgtgg cacgatacgt attggacgag aaaaatcgcc 960

gagctcaccg aggcgtggga tcgcatggag gcttgctttc gagtgatttt gtccaagctc 1020

aagcgttcat ctcgctcgcc cgagtcgccg cctcgagcgt acgcgatgct gctttacgcg 1080

ctgaaaaccg tcaaggagtt gcgagacgag tacacgaagc gaaccaaggc gtcggcgtac 1140

gcgtcgctac cgccgtcgca acgtccagtt gatctgcccg cgtacgacaa tacttctccc 1200

cttccgttcg agctcaaacc cgtgatttac tttctcgagg aggagcaaaa caaagtgtga 1260

<210> 12

<211> 1257

<212> DNA

<213> Ostreococcus lucimarinus

<400> 12

atgagcccat cctctagcgt gctggagcct gaggatggcg agcccttcgc cagggttcat 60

cgcgctcact acaggggatt cgtggttgac gccccaagcg tgcttcctgc ttcattgcat 120

gatgacgttg agcgcgcctt cgatgacatg aggtcacgcg gagagttcac ccacgatgtg 180

gtttccgctg gtaacaaggt gtctaccact tacgttaggc gctgcctcct gggcgaggac 240

ggcatgactt accattacca gaagctccgc ctgttcgccc aaccttggag aggcagggag 300

gcttacgagg tggttagaag gctcaatgag actctgacaa gatccgcccg cgagagatgc 360

gagaagctcg gaggagcctt cgctgagtct gagtgcgagt acaacgtgac cctgatcaat 420

tacatggaga ctgagggaga gtccgagatt gagcttagaa acgaggagaa gttcgatttg 480

ggtacaacct cagtttcctg gcatagcgac tcatccctta gggagaattc aactgtggcc 540

gtttaccaca catacgaggc tcccgagcgc aaggattgga gagtggctct tagggccttg 600

aacgctgagt gcgaggtgct ttgcgttcca ttggaggaca aggccactta ctacatgtgc 660

ggcgagttca atgccacaca ccatcacgct gtgctgaccg gctctagcgc tcgctactca 720

tccactcaca gagttgccgt ggttgctaag gatacattcc agtacattaa gcgcagatgc 780

atcgatgccc ttgctattgt gccagacttg gagagggaga acaagcctct cgatgccaag 840

cagatccaat tcctggctga cgtgcatcgc gaggttgagt tccagtggat tagaatgttc 900

caccttcaag gagaggccca tgccgcttgg cacgatacct actggactag gaagatcgcc 960

gagttgaccg aggcttggga caggatggag gcttgcttcc gcgttattct ctccaagctg 1020

aagagatcta gcaggtctcc tgagagccca cctcgcgcct acgctatgct tttgtacgcc 1080

ctcaagacag tgaaggagct gagagacgag tacacaaaga ggaccaaggc ctcagcttac 1140

gcctcccttc ccccatctca gaggcccgtt gatttgccag cttacgacaa cacctctcct 1200

ctccccttcg agctgaagcc cgtgatctac ttcctggagg aggagcaaaa taaggtt 1257

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

atgaagcgca ccccgactg 19

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

gggttttgct tccagaagct ga 22

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

atgaagcgga ccccgacg 18

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

gggcctggtt tccagaagca g 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

atgaagcgaa ccccaaccgc 20

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

gggtttggct tccagaagca gac 23

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

atgtcgccgt catcctccg 19

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

cactttgttt tgctcctcct cgagaaa 27

Claims (12)

1. 植物细胞，其引入了编码m⁶A去甲基酶的核酸分子，所述m⁶A去甲基酶具有以下两个结构域：

i) 具有AlkB氧化去甲基酶功能的N端结构域（NTD）;和

ii) C端结构域（CTD）。

2.权利要求1的植物细胞，其中所述m⁶A去甲基酶是FTO蛋白。

3.权利要求2的植物细胞，其中所述FTO蛋白是脊椎动物或藻类的FTO蛋白。

4. 权利要求3的植物细胞，其中所述FTO蛋白与SEQ ID NOs:1-4中的任意一个具有至少40%，优选至少50%,优选至少60%,优选至少70%,优选至少80%,优选至少90%,优选至少95%，更优选至少99%，最优选100%的同一性。

5. 权利要求1-4的任一项的植物细胞，其中所述编码m⁶A去甲基酶的核酸分子与SEQ IDNOs:5-12中的任意一个具有至少90%，优选至少95%，更优选至少99%，最优选100%的同一性。

6.生产具有增加的生物量、增加的产量或其组合的转基因植物的方法，该方法包括：

a) 将编码m⁶A去甲基酶的基因引入可再生的植物细胞，所述m⁶A去甲基酶以下两个结构域：

i) 具有AlkB氧化去甲基酶功能的N端结构域（NTD）;和

ii) C端结构域（CTD）；以及

b) 从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述编码m⁶A去甲基酶的核酸分子；并且在与不包含编码m⁶A去甲基酶的核酸分子的对照植物比较时表现出增加的生物量、增加的产量或其组合。

7.权利要求6的方法，所述方法还包括以下步骤：

c) 获得源自步骤b）的转基因植物的后代植物，其中所述后代植物在其基因组中包含所述编码m⁶A去甲基酶的核酸分子；并且在与不包含编码m⁶A去甲基酶的核酸分子的对照植物比较时表现出增加的生物量、增加的产量或其组合。

8.权利要求6或7的方法，其中所述m⁶A去甲基酶是FTO蛋白。

9.权利要求8的方法，其中所述FTO蛋白是脊椎动物或藻类的FTO蛋白。

10. 权利要求9的方法，其中所述FTO蛋白与SEQ ID NOs:1-4中的任意一个具有至少40%，优选至少50%,优选至少60%,优选至少70%,优选至少80%,优选至少90%,优选至少95%，更优选至少99%，最优选100%的同一性。

11. 权利要求6-10的任一项的方法，其中所述编码m⁶A去甲基酶的核酸分子与SEQ IDNOs:5-12中的任意一个具有至少90%，优选至少95%，更优选至少99%，最优选100%的同一性。

12.权利要求6-11的任一项的方法，其中所述植物选自水稻、玉米、大豆、烟草、马铃薯、苜蓿、油菜、俄罗斯蒲公英、棉花、小麦、粟、亚麻、向日葵和亚麻芥。