CN113308489A - 一种耐盐燕麦新种质的创制方法 - Google Patents

一种耐盐燕麦新种质的创制方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐盐燕麦新种质的创制方法，属于植物基因工程技术领域。本发明公开的一种耐盐燕麦新种质的创制方法，将外源基因GUS和PeNAC1转入六倍体燕麦中，得到转基因植株。经检测表明，外源基因在不同转基因株系中得到了不同程度的表达，赋予转基因株系耐盐性，并成功获得具有目的性状的转基因新种质。这表明本发明建立的燕麦遗传转化方法可以用于燕麦基因功能研究及燕麦转基因新品种培育。

Description

一种耐盐燕麦新种质的创制方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种耐盐燕麦新种质的创制方法。
背景技术
燕麦因其不与主要粮食作物争耕地的特性成为农业种植结构调整中重要的特色小宗作物。同时，燕麦主要种植在干旱少雨、土壤瘠薄的干旱半干旱荒漠地区，因此，选育抗旱耐盐品种对扩大燕麦种植面积，提高土地利用效率有重要意义。转录因子(TFs)因其具有调控多种胁迫途径应答基因表达操纵复杂性状的功能成为利用基因工程改善植物非生物胁迫耐受性的重要候选基因。NAC蛋白是最大的植物特异性TF家族之一。迄今为止，已经从水稻，小麦，玉米，大麦，杨树等植物中鉴定出一定数量的与非生物胁迫相关的NAC蛋白并成功地开发了同源/异源表达的转基因植物，这些植物经过改造后可以提高非生物胁迫耐受性。例如，过表达水稻NAC基因ONAC5/6/9和ONAC10提高了水稻干旱胁迫条件下耐旱性并减少了谷物损失。过表达ONAC14提高了水稻耐旱性，转基因植物在干旱条件下具有更高的穗数和充实率。水稻SNAC1改造的转基因棉花植株对干旱和盐分胁迫表现出增强的耐受性。通过在玉米泛素启动子的控制下将SNAC1引入小麦，提高了小麦对干旱和盐胁迫的耐受性。这表明来源于高度耐盐的“盐生植物”或耐盐种质/品种中的NAC基因具有通过基因工程改善植物非生物胁迫耐受性的潜力。
因此，提供一种耐盐燕麦新种质的创制方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种耐盐燕麦新种质的创制方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种耐盐燕麦新种质的创制方法，具体步骤如下：
(1)将胡杨NAC蛋白PeNAC1的全长编码区插入表达载体pCAMBIA1304，与mgfp5和gus基因形成pCAMBIA：PeNAC1-mgfp5-gus融合构建体质粒；所述PeNAC1的全长编码区序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)用PeNAC1启动子取代所述pCAMBIA：PeNAC1-mgfp5-gus中的35S启动子，获得重组表达载体pCAMBIA-ProNAC1:PeNAC1-mgfp5-gus；所述PeNAC1启动子序列如SEQ ID NO.2所示；
(3)将所述重组表达载体pCAMBIA-ProNAC1:PeNAC1-mgfp5-gus转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，划线培养，挑取单菌落培养，提取质粒；
(4)在燕麦自花授粉前将步骤(3)所述质粒刷在柱头上，具体操作如下：在扬花前雄蕊微黄未散粉时选择燕麦主穗进行整穗，每穗保留8-10个小穗；搓开燕麦小穗的颖壳，让柱头露出，将不同浓度的质粒溶液用锋径2mm的毛笔刷在柱头上，每次柱头上的用量为10μl；刷完质粒后，不需要去除雄蕊，套袋，做标记，自然结实后按照质粒转化的不同浓度收获种子；
(5)转基因燕麦筛选鉴定，具体操作如下：对T0代种子表面进行灭菌，在添加有潮霉素的1/2MS培养基上生长；将抗潮霉素的转基因燕麦种质移植到土壤中，使其自花授粉以生产T1；通过PCR鉴定，培育至T2代；盐胁迫处理筛选得T3代种子进行GUS染色，Northern杂交鉴定燕麦转基因株系。
进一步，步骤(3)在含100μg/ml Kan的LB培养基上划线培养，37℃恒温培养16-20h；挑取单菌落37℃，200rpm摇菌7-8h，使用TIANprep微型质粒试剂盒提取质粒。
进一步，步骤(4)所述质粒浓度为15，10，7.5，5.0，3.75，3.0，2.5，2.25，2，1.5ng/μl。
进一步，步骤(4)每一个柱头重复刷2次质粒溶液。
进一步，步骤(5)所述潮霉素浓度为25μg/ml。
进一步，步骤(5)所述盐胁迫为用250mM NaCl溶液处理。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种耐盐燕麦新种质的创制方法，成功将外源基因GUS和PeNAC1转入六倍体燕麦中，得到转基因植株。经检测表明，外源基因在不同转基因株系中得到了不同程度的表达，赋予转基因株系耐盐性，并成功获得具有目的性状的转基因新种质。这表明本发明建立的燕麦遗传转化方法可以用于燕麦基因功能研究及燕麦转基因新品种培育。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作出说明。下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明用于燕麦转化的表达质粒表达框结构图；
图2附图为本发明转基因燕麦不同组织器官中的GUS染色结果；
其中，c，芽；d，胚芽鞘；e，子叶和根；f，叶；g，花器官和种子；
图3附图为本发明Northern杂交鉴定结果；
图4附图为本发明WT和燕麦转基因株系(OEn)在含有不同浓度NaCl的1/2MS培养基上萌发生长表型；
图5附图为本发明转基因株系和WT在不同NaCl浓度下的发芽率；
图6附图为本发明转基因株系和WT在盐胁迫下苗期耐盐性；
图7附图为本发明转基因株系和WT幼苗在250mM NaCl浓度下存活率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1用于燕麦转化的表达载体
选用pCAMBIA1304构建外源基因表达载体。将胡杨NAC蛋白PeNAC1的全长编码区(SEQ ID NO.1)插入表达载体pCAMBIA1304多克隆位点中的Spe I和Bgl II之间，与mgfp5和gus基因形成pCAMBIA：PeNAC1-mgfp5-gus融合构建体质粒。将PeNAC1启动子(SEQ ID NO.2)插入Sal I和Bgl II位点，取代pCAMBIA：PeNAC1-mgfp5-gus中的35S启动子，获得重组表达载体pCAMBIA-ProNAC1:PeNAC1-mgfp5-gus。PeNAC1-GFP-GUS融合蛋白在PeNAC1启动子(ProNAC1)的控制下表达(图1)。
atgacggcggcaacattagagttaccaccgggtttcaggttccatccaacggatgaggagctcgttctgcactatctctgccgtaaatgctcgtcgcagcccattgctgtgcctattattgctgaaattgatctctacaagtttgacccatgggatctccccggtatagccttgtatggagaaaaggaatggtacttttttaccccgagagacaggaagtaccctaacggatcgagaccgaatcgtgctgcagggaggggctactggaaagccacgggagccgacaagccgattgggcagccgaagacagttggaatcaagaaagctttggtcttttacgcggggaaagctcctaagggagagaaaaccaactggattatgcacgagtatcgtctagcagacgtggatcgctcggctcgcaagaagaacagcttaaggctggatgattgggtactctgtcgcatatacaacaagaaaggtacagttgagaagcaagaacagcatcttagcgtcaagaaagcgaatccgacggagattgaggaggatgagaagaagcaggttgttttgctgccgccgcaaccagctccgtcctcggcgacaggaacggtgaatgattacatgcactttgacacgtcagactccgtgccgaggctgcacacggattcgagctgctcggagtatgtggtgtcgccggaattcacgtgcgaggtgcagagtgaacctaggtggaaggaatggggaaacgtaaatgccctcgataatccttacaattacctggatgccacaatggatattccatttgcgtctcagttgcagggggttaatcagatgtcgcctcttcaggatatatttatgcacctgcagaagccgttt；SEQ ID NO.1。
aacttgactccttgtctggtcaaaatttaaaatttaactatatatatatatatctcaacggaaaatgtttagtacagcagggtaaattatttcatacatgttcagttaacaaaattgattaccccatcgaataattaatctaatggttcaagtttatcgctcgttattaatgctacaggttctcctcttcattttcgttttatttcttcccaactagagagaagcacattgtcttatataacaagaacaaaaaacatgatcttaaagatccataaacagagcagtcctctgacagtccacccaaatccagcggttcgtgctctcgatcttcgttttcaagcccgtgccctgtgcctgaacatgaaatcaggtgggcggtcttcccggagattgaaaacacatatttatcctttgcttatgatttagccaaaaacgcaataaattttacaagaagcaatgaatctccaacgattatcgtcatgtgtcgcaaggacaacaattaaattgactagtcaataccatgaatctctcccttgtttttctaccatatcaggatgcaccaaatcccccttgtttatccacaattttaattttgttcacacacattcatgcactttcatggtcaccaatacactgaatcatttatccctttccttagctcactcttttctcattgccaaaattcacccgtcctagcatgctcgcgctcgcacgtgggtcttcccctctctgcccacctaccgtttaactggaggctcctccactctctgcccacctaccgtttaactggaggctccctatccaagagagcgctaagaagcaagagatttataaaaactcggccgatcccaataagatagatcccagggaccaagattttttttttttttttttccgctcggtcgcctgggtgtatggatagctacactaacaccacagtccaaaacaagtgtcgtaagcagtgaccaaatcacccccactgtgagccattgacacgcacgcatccccacttcgttagctgccacgtctcacgccagagtggaaaggaaagaaaaaactgatcactcacgtgtattctagaaatcatccctgccacgtgcccctcaatttctcttataaattcatgcttctccctcgaaatttgaagtttcaagcgccgtcactgcattagaccaccaacagcagacaagaagagcgaccaagtataatagagaagg；SEQ ID NO.2。
实施例2质粒的制备
将重组表达载体pCAMBIA-ProNAC1:PeNAC1-mgfp5-gus转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含100μg/ml Kan的LB培养基上划线培养，37℃恒温培养16-20h。挑取单菌落37℃，200rpm摇菌7-8h，使用TIANprep微型质粒试剂盒(TIANGEN，北京)提取质粒。用灭菌的去离子水溶解质粒后，1％琼脂糖凝胶电泳检测质粒完整性，使用Qubit3(Invitrogen，US)测定质粒浓度。依照质粒浓度梯度为15，10，7.5，5.0，3.75，3.0，2.5，2.25，2，1.5ng/μl，用去离子水稀释质粒原液。制备好的质粒放置于4℃冰盒上备用田间转化。
实施例3田间转化
选取春季大田正常播种生长的坝莜1号六倍体燕麦栽培品种为受体品种。
具体转化步骤如下:
a.在扬花前雄蕊微黄未散粉时选择生长健壮的燕麦植株对主穗进行整穗，一般保留8-10个小穗，不需要去除雄蕊；
b.搓开燕麦小穗的颖壳，让柱头露出，将实施例2稀释的质粒用锋径2mm的毛笔刷在柱头上，每个柱头上质粒的用量约为10μl，刷2次；
c.刷完质粒后，套袋，做好标记，同时做好田间管理，自然结实后收获、晒干、脱粒，得到T0代转化燕麦种子，重复两年。在田间转化过程中，质粒始终保持在4℃冰盒上。
实施例4转基因燕麦植物的生产
(1)将两年收获的T0代种子1625个，用灭菌的蒸馏水清洗两遍后，用3％的双氧水消毒1.5h后再用灭菌蒸馏水冲洗3-4次。转移至含25μg/ml潮霉素1/2MS培养基上，放置在光照10h，光强8500lux，温度22℃，70％相对湿度培养条件培养，选择能够正常生根的幼苗在长出第一片真叶后移植到土壤中，温室培养。温室培养条件设置为：光照/暗培养时间：14h/10h；光照培养温度22℃，暗培养18℃。采1-2片叶片做PCR鉴定。
PCR鉴定方法如下：使用CTAB法从燕麦叶片中提取DNA，使用引物P1和P2通过PCR扩增PeNAC1基因。其中，P1和P2的引物序列如下：
P1：5’-ATGACGGCGGCAACATTAGAG-3’；SEQ ID NO.3；
P2：5’-AAACGGCTTCTGCAGGTGCAT-3’；SEQ ID NO.4。
保留PCR鉴定阳性株培养至成熟，收获T1代转基因燕麦种子；相同筛选条件下自交繁育至T2代。
实施例5转化效率分析
两年田间转化后，共收获1625个不同转化浓度的T0代燕麦种子，在对1625粒燕麦种子通过潮霉素筛选和PCR鉴定后，获得45个阳性株，编号为Ba1-Ba45。
分析不同质粒浓度对转化率的影响显示，转化效率和质粒浓度密切相关，其中质粒浓度为7.5ng/μl时，转化效率最高(表1)为5.97％。
表1不同质粒浓度转化率
Figure BDA0003121714520000061
实施例6转基因燕麦筛选鉴定
每一个T2代转基因株系筛选30粒种子播种在直径22cm的花盆中，放置在光照/暗培养时间：14h/10h，光照温度为22℃，暗培养18℃温室中培养。在长出第二片真叶后，每5天浇一次盐水(250mM NaCl溶液)，持续至灌浆期，收获能够在250mM盐胁迫处理下正常成熟的T3代种子。
实施例7转基因燕麦分子检测
以盐胁迫处理下收获的T3代燕麦转基因株系为材料，进行GUS染色和Northern杂交分析。选择GUS染色以及Northern杂交结果阳性的转基因株系自交繁育至T5代。
(1)GUS染色步骤：
a.在燕麦生长的各个阶段分别取样后，将样品浸入GUS染色液中，放于抽真空容器中室温染色12h；
b.染色结束后使用梯度浓度酒精脱色；
c.观察GUS染色情况，相机照相，结果见图2。图2结果发现，GUS基因在转基因燕麦芽(c)、胚芽鞘(d)、花器官和种子(g)中表达，但不在叶(f)、子叶和根(e)中表达。
(2)Northern杂交分析
a.使用Fruit/SeedPlant Total RNA Mini Kit(目录号：R513-50，GeneBetter，北京，中国)根据说明书分别从Ba7、Ba11、Ba23、Ba32、Ba38、Ba41六个转基因燕麦株系和野生型燕麦的100mg种子样品中分离总RNA；
b.在1.5％甲醛-琼脂糖凝胶上分离30μg总RNA，并转移到尼龙膜上；使用32P-dCTP标记的DNA作为探针，按照分子克隆实验指南Northern杂交方法转膜杂交；
c.探针从PeNAC1的3’末端扩增，扩增引物为Probe-F和Probe-R，具体引物序列如下：
Probe-F：5’-ACGGATTCGAGCTGCTCGGAG-3’；SEQ ID NO.5；
Probe-R：5’-AAACGGCTTCTGCAGGTGCAT-3’；SEQ ID NO.6。
Northern杂交分析结果见图3。图3结果发现，外源基因PeNAC1在不同的转基因株系中得到了不同程度的表达。
GUS染色以及Northern杂交结果表明，PeNAC1基因已经整合到燕麦基因组中，可以在燕麦中正常表达。
实施例8转基因燕麦耐盐性分析
将T5转基因(OEn)和非转基因(WT)燕麦种子种植在添加0、100、150、200和250mMNaCl 1/2MS培养基上培养，生长10天后观察其表型，统计发芽率。部分表型结果见图4，发芽率统计结果见图5。图4和图5结果显示，萌发3天后，非转基因和转基因燕麦在1/2MS加0mMNaCl培养基上显示出正常的萌发状态；在100mM NaCl处理下，野生燕麦和转基因燕麦的种子发芽率分别为70％和100％；在250mM NaCl处理下，非转基因的燕麦发芽被完全抑制，但转基因燕麦仍显示出50％的发芽率。表明转基因燕麦比非转基因燕麦在盐胁迫处理下具有更高的萌发率。
非转基因和转基因燕麦在0mM NaCl处理下均显示正常萌发生长；在100mMNaCl处理下，非转基因燕麦的萌发生长未受到明显抑制；在盐浓度超过100mM时，WT的生长被完全抑制，而转基因燕麦在250mM NaCl处理下仍然可以生长。表明转基因燕麦在种子萌发阶段有更强的耐盐性。
进一步，分析转基因燕麦在苗期的耐盐性。筛选WT和每一个T3代转基因株系的T5代种子(OE1-OE3)，分别播种在直径22cm的花盆中，每盆30粒，放置在光照/暗培养时间：14h/10h，光照温度为22℃，暗培养18℃温室中培养生长15天，然后每5天浇一次盐水(250mMNaCl溶液)，对照用等体积的水浇灌。10天后，观察幼苗表型，恢复浇水5天后评估存活率。幼苗表型结果见图6，图6结果显示，WT幼苗显著失绿，生长受到抑制，40-50％的植物枯萎，而70-80％的转基因燕麦幼苗保持绿色并继续生长。存活率统计结果见图7，图7结果显示，58％的WT植物死亡，而只有20-28％的转基因燕麦死亡。图6和图7结果显示，在正常条件下，转基因和WT幼苗的表型无明显差异；在250mM NaCl处理后，表型差异是可辨别的。上述结果表明，与WT植物相比，转基因燕麦植物在苗期对盐胁迫同样具有更强的耐受性。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所 新疆农业科学院粮食作物研究所
<120> 一种耐盐燕麦新种质的创制方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 873
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atgacggcgg caacattaga gttaccaccg ggtttcaggt tccatccaac ggatgaggag 60
ctcgttctgc actatctctg ccgtaaatgc tcgtcgcagc ccattgctgt gcctattatt 120
gctgaaattg atctctacaa gtttgaccca tgggatctcc ccggtatagc cttgtatgga 180
gaaaaggaat ggtacttttt taccccgaga gacaggaagt accctaacgg atcgagaccg 240
aatcgtgctg cagggagggg ctactggaaa gccacgggag ccgacaagcc gattgggcag 300
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
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Claims (6)

1.一种耐盐燕麦新种质的创制方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)将胡杨NAC蛋白PeNAC1的全长编码区插入表达载体pCAMBIA1304，与mgfp5和gus基因形成pCAMBIA：PeNAC1-mgfp5-gus融合构建体质粒；所述PeNAC1的全长编码区序列如SEQID NO.1所示；
(2)用PeNAC1启动子取代所述pCAMBIA：PeNAC1-mgfp5-gus中的35S启动子，获得重组表达载体pCAMBIA-ProNAC1:PeNAC1-mgfp5-gus；所述PeNAC1启动子序列如SEQ ID NO.2所示；
(3)将所述重组表达载体pCAMBIA-ProNAC1:PeNAC1-mgfp5-gus转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，划线培养，挑取单菌落培养，提取质粒；
(4)在燕麦自花授粉前将步骤(3)所述质粒刷在柱头上，具体操作如下：在扬花前雄蕊微黄未散粉时选择燕麦主穗进行整穗，每穗保留8-10个小穗；搓开燕麦小穗的颖壳，让柱头露出，将不同浓度的质粒溶液用锋径2mm的毛笔刷在柱头上，每次柱头上的用量为10μl；刷完质粒后，不需要去除雄蕊，套袋，做标记，自然结实后按照质粒转化的不同浓度收获种子；
(5)转基因燕麦筛选鉴定，具体操作如下：对T0代种子表面进行灭菌，在添加有潮霉素的1/2MS培养基上生长；将抗潮霉素的转基因燕麦种质移植到土壤中，使其自花授粉以生产T1；通过PCR鉴定，培育至T2代，盐胁迫筛选得T3代种子进行GUS染色，Northern杂交鉴定燕麦转基因株系。
2.根据权利要求1所述的一种耐盐燕麦新种质的创制方法，其特征在于，步骤(3)在含100μg/ml Kan的LB培养基上划线培养，37℃恒温培养16-20h；挑取单菌落37℃，200rpm摇菌7-8h，使用TIANprep微型质粒试剂盒提取质粒。
3.根据权利要求1所述的一种耐盐燕麦新种质的创制方法，其特征在于，步骤(4)所述质粒浓度为15，10，7.5，5.0，3.75，3.0，2.5，2.25，2，1.5ng/μl。
4.根据权利要求1所述的一种耐盐燕麦新种质的创制方法，其特征在于，步骤(4)每一个柱头重复刷2次质粒溶液。
5.根据权利要求1所述的一种耐盐燕麦新种质的创制方法，其特征在于，步骤(5)所述潮霉素浓度为25μg/ml。
6.根据权利要求1所述的一种耐盐燕麦新种质的创制方法，其特征在于，步骤(5)所述盐胁迫为用250mM NaCl溶液处理。
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