CN101955929A

CN101955929A - 胡杨nac1基因启动子

Info

Publication number: CN101955929A
Application number: CN2009101581646A
Authority: CN
Inventors: 王俊英; 尹伟伦; 夏新莉
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2009-07-14
Filing date: 2009-07-14
Publication date: 2011-01-26

Abstract

本发明公布了胡杨(Ammopiptanthus mongolicus)PeNAC1基因1217bp启动子序列，命名为PeNAC1P，PLACE数据库分析预测PeNAC1P含有多处与干旱、高盐和ABA、GA、JA、SA、MeJA等激素诱导相关的顺式作用元件；与病菌，盐诱导相关的元件；响应钙离子的顺式元件；参与糖信号传导的顺式元件。瞬时表达实验分析，PeNAC1P启动子活性受盐、GA、IAA诱导。本研究提供的胡杨PeNAC1P启动子属诱导型启动子，在研究其功能的基础上也为产生正常的耐受转基因植株提供可选择的启动子。

Description

胡杨NAC1基因启动子

技术领域

本发明涉及胡杨(Populus euphratica)NAC1基因启动子PeNAC1P的分离鉴定，序列分析，诱导活性分析、其全长及缺失片断植物表达载体的构建及该启动子的应用。

背景技术

NAC转录因子是近十年来新发现的植物特有的转录调控因子，在植物的生长发育、器官建成、激素调节和防御抵抗多种生物和非生物胁迫等方面发挥着重要作用。但对NAC类转录因子的研究还刚处于起步阶段，无论是它们的上游调控因子还是其调控的下游靶基因，都不是很清楚。目前只报道有AP3/PI(MADS box)调控NAP的表达(Sablowski et al.，1998)，STM(KNOX)和MP(ARF)正调控CUC1/CUC2的表达，但它们也受到MYB类转录因子AS1(ASYMMETRIC)和AS2的负调节(Hibara et al.，2003)；拟南芥的另外一基因NAC1过量表达促进生长素应答基因AIR3(AUXIN-INDUCED IN ROOT CULTURES 3)和DBP(DNA-BINDINGPROTEIN)的增强表达，表明它们可能为NAC1的下游基因(Neuteboom et al.，1999)。但这些基因都是与发育相关的，在逆境诱导相关的NAC类转录因子中，拟南芥胁迫诱导转录因子ANAC019，ANAC055，和ANAC072能够与早期应答脱水胁迫基因ERD1(EARLY RESPONSIVE TODEHYDRATION STRESS 1 gene)的启动子区域的一段顺式作用元件CATGTG序列结合，正调控脱水胁迫基因ERD1的表达，增强植物的耐旱性(Tran LS et al.，2004)，表明胁迫应答基因ERD1是NAC类转录因子的下游调节基因。对逆境诱导相关的NAC类转录因子的上游调控研究中，还没有报道过它们的上游调节因子。

胡杨长期生长在我国西北荒漠、半荒漠地区，在起到防风固沙、改善生态环境作用的同时，也形成了极强地耐极端环境能力，其丰富的逆境基因资源也受到越来越多的研究者的关注。我们从胡杨中分离得到一种与干旱、高盐等逆境相关的NAC转录因子蛋白，命名为PeNAC1，在应答非生物胁迫同时也受到赤霉素、生长素(IAA)等激素的调节。前人的研究表明，拟南芥AtNAC2对盐胁迫影响植物根发育的应答需要乙烯和生长素信号途径参与，说明AtNAC2可能是一个整合环境和内源激素信号的转录因子(He et al.，2005)。对胡杨中PeNAC1基因上游启动子的分离鉴定、可能包含的顺式作用元件及其功能的研究为进一步研究胡杨PeNAC1基因的上游调控因子以及PeNAC1基因调控植物抗逆性的调控机制提供可能。

同时，前人的研究表明利用组成型启动子启动胁迫诱导DREB类转录因子的表达，在提高受体植物的耐受性的同时，也会造成受体植物的生长受抑，植株生长缓慢，植株矮小；而在选用了一个胁迫诱导型启动子rd-29A启动子与DREB类转录因子连接转化受体植物，能够产生不影响植物生长的胁迫耐受植物(JP专利公开No.2000-116260)。本研究提供的胡杨PeNAC1基因启动子PeNAC1P属诱导型启动子，在研究其功能的基础上也为产生正常的耐受转基因植株提供可选择的启动子。

发明内容

本发明的一个目的是发现一种在耐逆木本植物例如胡杨中能有效发挥作用的胁迫诱导启动子，并提供利用该启动子适应新的环境胁迫的耐逆植物。

本发明涉及一种来源于胡杨的胁迫诱导启动子，该启动子由如下的DNA核苷酸序列组成：

1)序列表中SEQ ID No：1所示的DNA核苷酸序列。

2)能够在严谨条件下与序列表SEQ ID No：1中限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

序列表中的SEQ ID No：1由1217个碱基组成。

利用PLACE数据库分析PeNAC1启动子序列，预测其顺式作用元件(如表1所示)。根据数据库预测，发现PeNAC1启动子序列上主要存在一些环境因子应答元件和激素应答元件。此外，还发现与病菌，盐诱导相关的元件GT1GMSCAM4(GAAAAA)，这个元件存在于大豆CaM4基因启动子中，介导病菌，盐信号。SUSIBA2蛋白在大麦中与WBOXHVISO1位点结合，参与糖信号传导。ABRERATCAL是响应钙离子的顺式元件，在162个钙离子上调基因上游皆存在ABRERATCAL元件。在启动子序列中还发现一些和激素诱导相关的同源元件，GAREAT和WRKY71OS与GA诱导相关。W-BOX在拟南芥NPR1启动子中发现，能被受SA诱导的WRKY蛋白特异性识别。在启动子中还存在许多于光信号相关的同源元件，如GT1，GATABOX等。

综上所述，我们推测该启动子为诱导型启动子，受钙离子、多种逆境因素和激素的调控。

本发明提供了一种包含该启动子的重组载体。在本发明的启动子的控制下，该载体可以含有其它的逆境相关结构基因或者调节基因。该植物表达载体可以通过农杆菌介导的方法转化植物宿主，也可通过基因枪方法转化植物宿主。植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，培育抗寒、抗旱、耐盐的植物品种。

通过本发明的启动子导入到植物体中，本发明进一步提供了一种方法用于加强植物体的胁迫耐性。

本发明的启动子表现了一种潜在的胁迫诱导启动子活性。

附图说明

图1PeNAC1P启动子活性分析

(a-c)Transformed cell expressing PeNAC1P-GFP

(d-f)Transformed cell expressing the 35S-GFP

图2PeNAC1P启动子活性受盐、GA、IAA诱导

(a)PeNAC1P启动子活性受盐诱导

(b)PeNAC1P启动子活性受GA诱导

(c)PeNAC1P启动子活性受IAA诱导

具体实施方式

实施例1、胡杨PeNAC1基因启动子分离

胡杨PeNAC1基因启动子片段是从胡杨基因组DNA中使用PCR Walking的方法分离获得，具体操作方法依照Genome Walking Kit method(TaKaRa，Japan)试剂盒说明书进行。

胡杨DNA的提取采用CTAB法，其步骤如下：

(1)在2mL的离心管中加入800μL的2×CTAB提取缓冲液[2g/100ml CTAB，1.4mol/LNaCl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris·Cl(pH8.0)]，8μL巯基乙醇(1％，v/v)，65℃预热。

(2)取约0.15g叶片，在液氮中研磨成冻粉。

(3)将冻粉转入离心管中，65℃保温约30min，其间轻柔摇动两次。

(4)取出离心管，冷至室温。加入等体积氯仿/异戊醇，轻柔混匀10min。

(5)10000r/min离心10min。

(6)转移上清，加入2倍体积的无水乙醇，混匀，室温放置10min。

(7)将DNA絮状沉淀用枪头挑出，或10000rpm/min离心10min，弃上清，70％乙醇洗涤沉淀3次，37℃烤至微干。

(8)将沉淀溶于25μL TE缓冲液中，加入0.75μL(终浓度50μg/mL)RNase，37℃保温1h。

以胡杨基因组DNA为模板，经过二次PCR Walking，获得了1217bp的5’侧翼序列。

实施例2、胡杨PeNAC1基因启动子活性分析

通过洋葱表皮细胞瞬时表达实验检测所获得的胡杨PeNAC1基因1217bp的5’侧翼序列的启动活性。

将获得的胡杨PeNAC1基因1217bp的5’侧翼序列取代植物表达载体pCAMBIA-1304中的35S启动子，插入报告基因CUS和GFP的上游，获得新的植物表达载体pCAMBIA：PeNAC1P-GFP质粒，电击转入农杆菌LBA4404中，由农杆菌介导侵染洋葱表皮细胞，通过瞬时表达实验检测所获得的胡杨PeNAC1基因1217bp的5’侧翼序列是否具有启动子活性。

利用NEB网站中酶切位点分析系统(http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php)分析获得的胡杨PeNAC1基因1217bp的5’侧翼序列中包含的全部酶切位点，植物表达载体pCAMBIA-1304多酶切位点中选取胡杨PeNAC1基因5’侧翼序列中没有的俩个酶切位点PstI和BgI II双酶切。

构建表达载体所用引入酶切位点扩增胡杨PeNAC1基因5’侧翼序列引物设计如下：加下划线的部分为PstI和BgI II酶切位点序列，之前的碱基作为保护碱基。

正向引物：

5’-AAA CTG CAG AAC TTG ACT CCT TGT CTG GTC-3’

反向引物：

5’-CAA GAT CTC CTT CTC TAT TAT ACT TGG TCG C-3’

实施例2、胡杨PeNAC1P启动子受盐、GA、IAA诱导

通过瞬时表达实验检测胡杨PeNAC1P启动子在烟草叶片中的活性受盐、GA、IAA诱导。

(1)工程菌的制备

将含pCAMBIA：PeNAC1P-GUS质粒的农杆菌接种于5ml YEB液体培养基(利福平50μg/ml，卡那50μg/ml)；200rpm，28℃，摇至对数生长期(OD600约为0.6-0.8)；转移1ml菌液于50ml YEB液体培养基(利福平50μg/ml，卡那50μg/ml，乙酰丁香酮20μM)，200rpm，28℃，培养过夜；取适量菌液，5000rpm，离心5分钟，倒掉上清，用YEB液体培养基(10mM氯化镁，100μM乙酰丁香酮)重悬菌体。

(2)转化烟草叶片

用一次性注射器取1ml制备好的工程菌，注射到活体烟草叶片中，培养48小时后，分别喷施250mM盐溶液、100μM GA溶液、100μM IAA溶液。分别在处理后0h，1h，2h时取材，进行GUS染色。通过GUS染色结果分析PeNAC1P启动子在盐、GA、IAA处理后活性的变化。

序列表

<110>王俊英、尹伟伦、夏新莉

<120>胡杨NAC1基因启动子

<141>2009-6-19

<160>1

<210>1

<211>1217

<212>DNA

<213>胡杨(Populus euphratica)

<220>

<221>启动子

<222>(1)...(1217)

<223>

<400>1

aacttgactc cttgtctggt caaaatttaa aatttaacta tatatatata tatctcaacg 60

gaaaatgttt agtacagcag ggtaaattat ttcatacatg ttcagttaac aaaattgatt 120

accccatcga ataattaatc taatggttca agtttatcgc tcgttattaa tgctacaggt 180

tctcctcttc attttcgttt tatttcttcc caactagaga gaagcacatt gtcttatata 240

acaagaacaa aaaacatgat cttaaagatc cataaacaga gcagtcctct gacagtccac 300

ccaaatccag cggttcgtgc tctcgatctt cgttttcaag cccgtgccct gtgcctgaac 360

atgaaatcag gtgggcggtc ttcccggaga ttgaaaacac atatttatcc tttgcttatg 420

atttagccaa aaacgcaata aattttacaa gaagcaatga atctccaacg attatcgtca 480

tgtgtcgcaa ggacaacaat taaattgact agtcaatacc atgaatctct cccttgtttt 540

tctaccatat caggatgcac caaatccccc ttgtttatcc acaattttaa ttttgttcac 600

acacattcat gcactttcat ggtcaccaat acactgaatc atttatccct ttccttagct 660

cactcttttc tcattgccaa aattcacccg tcctagcatg ctcgcgctcg cacgtgggtc 720

ttcccctctc tgcccaccta ccgtttaact ggaggctcct ccactctctg cccacctacc 780

gtttaactgg aggctcccta tccaagagag cgctaagaag caagagattt ataaaaactc 840

ggccgatccc aataagatag atcccaggga ccaagatttt tttttttttt ttttccgctc 900

ggtcgcctgg gtgtatggat agctacacta acaccacagt ccaaaacaag tgtcgtaagc 960

agtgaccaaa tcacccccac tgtgagccat tgacacgcac gcatccccac ttcgttagct 1020

gccacgtctc acgccagagt ggaaaggaaa gaaaaaactg atcactcacg tgtattctag 1080

aaatcatccc tgccacgtgc ccctcaattt ctcttataaa ttcatgcttc tccctcgaaa 1140

tttgaagttt caagcgccgt cactgcatta gaccaccaac agcagacaag aagagcgacc 1200

aagtataata gagaagg 1260

Claims

1.从胡杨(Populus euphratica)中鉴定的NAC1基因的启动子，是下述核苷酸之一：

1)序列表中SEQ ID No：1所示的DNA核苷酸序列。

2.权利要求1所述的序列，其特征是：含有多处与干旱，高盐和激素诱导相关的顺式作用元件的同源序列，如MYB和MYC识别的作用元件，此元件和水分胁迫和ABA诱导相关；G-box与JA诱导相关；W-BOX与SA诱导相关；GAREAT与GA诱导相关。与病菌，盐诱导相关的元件GT1GMSCAM4，响应钙离子的顺式元件ABRERATCAL，参与糖信号传导的WBOXHVISO1。

3.权利要求1所述的序列，瞬时表达分析它是诱导型启动子，受盐和GA、IAA诱导。

4.根据权利要求1所述的启动子片段全部或部分序列构建的植物表达载体。

5.根据权利要求1所述的启动子片段全部或部分序列构建的宿主菌。

6.权利要求4所述的植物表达载体在改良植物抗旱，耐盐性中的应用。